ES2250962T3 - Nuevas cepas de bacillus thuringiensis y sus proteinas insecticidas. - Google Patents

Nuevas cepas de bacillus thuringiensis y sus proteinas insecticidas.

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ES2250962T3 ES93915882T ES93915882T ES2250962T3 ES 2250962 T3 ES2250962 T3 ES 2250962T3 ES 93915882 T ES93915882 T ES 93915882T ES 93915882 T ES93915882 T ES 93915882T ES 2250962 T3 ES2250962 T3 ES 2250962T3
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Abstract

SE PRESENTAN CUATRO NUEVAS ESTIRPES DE "BACILLUS THURINGIENSIS", QUE SE HAN DEPOSITADO EN EL BCCM-LMG BAJO LOS NUMEROS DE ACCESO LMG P-12592, LMG P-12593, LMG P-12594, Y LMG P-13493, QUE PRODUCEN NUEVAS PROTEINAS DE CRISTAL DURANTE LA ESPORULACION QUE SON TOXICAS PARA LOS LEPIDOPTERA, MAS PARTICULARMENTE CONTRA LOS NOCTUIDAE, TALES COMO "SPODOPTERA SPP." Y "AGROTIS IPSILON", CONTRA LOS PYRALIDAE TALES COMO "OSTRINIA NUBILALIS", Y CONTRA LOS YPONOMEUTIDAE, TALES COMO "PLUTELLA XYLOSTELLA", Y QUE ESTAN CODIFICADAS POR UN NUEVO GEN. LAS PROTEINAS DE CRISTAL CONTIENEN PROTOXINAS, QUE PUEDEN DAR COMO RESULTADO UNA TOXINA COMO PRODUCTO DE DIGESTION DE LA TRIPSINA. UNA PLANTA, CUYO GENOMA HA SIDO TRANSFORMADO CON UNA SECUENCIA DE DNA QUE PROVIENE DE CUALQUIERA DE LAS ESTIRPES Y QUE CODIFICA SU TOXINA RESPECTIVA, ES RESISTENTE A LOS LEPIDOPTERA. CADA ESTIRPE, MISMA, O SUS CRISTALES, PROTEINAS DE CRISTAL, PROTOXINAS O TOXINAS PUEDE UTILIZARSE COMO INGREDIENTE ACTIVO EN UNA COMPOSICION INSECTICIDA PARA COMBATIR LOS LEPIDOPTERA.

Description

Nuevas cepas de Bacillus thuringiensis y sus proteínas insecticidas.
Esta invención se refiere a cuatro nuevas cepas de Bacillus thuringiensis (la "cepa BTS02617A", la "cepa BTS02618A", la "cepa BTS02654B" y la "cepa BTS02652E"), cada una de las cuales produce proteínas cristalinas (las "proteínas cristalinas BTS02617A", las "proteínas cristalinas BTS02618A", las "proteínas cristalinas BTS02654B" y las "proteínas cristalinas BTS02652E", respectivamente) que se empaquetan en cristales (los "cristales BTS02617A", los "cristales BTS02618A", los "cristales BTS02654B" y los "cristales BTS02652E", respectivamente) durante la esporulación. Las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E se depositaron de acuerdo con las estipulaciones del Tratado de Budapest en las Colecciones Coordinadas de Microorganismos de Bélgica - Collection Laboratorium voor Microbiologie Belgium ("BCCM-LMG"), R.U.G., K. Ledeganckstraat 35, B-9000, Gante.
Esta invención se refiere también a una composición insecticida que es activa contra Lepidópteros y que comprende la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, como tales, o preferiblemente los cristales de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, proteínas cristalinas o el o los componentes activos de las mismas como ingrediente activo.
Esta invención se refiere adicionalmente a un gen (el "gen bTS02618A"), que está presente en el genoma de las cepas o BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E y que codifica una proteína insecticida (la "protoxina BTS02618A") que se encuentra en los cristales de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E. La protoxina BTS02618A es la proteína que es producida por las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E antes de empaquetarse en sus cristales respectivos de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E.
Esta invención se refiere adicionalmente a una toxina (la "toxina BTS02618A") que puede obtenerse (v.g., por digestión con tripsina) a partir de la protoxina BTS02618A. La toxina BTS02618A es una proteína activa como insecticida que puede liberarse a partir de los cristales de BTS02617A, los cristales de BTS02618A, los cristales de BTS02654B y los cristales de BTS02652E, que son producidos por la cepa BTS02617A, la cepa BTS02618A, la cepa BTS02654B y la cepa BTS02652E, respectivamente. Esta toxina y su protoxina tienen una actividad alta contra una extensa gama de insectos Lepidópteros, particularmente contra Noctuidae, especialmente contra Spodoptera y Agrotis spp., pero también contra otros insectos Lepidópteros importantes tales como Pyralidae, particularmente el perforador del maíz europeo, Ostrinia nubilalis, e Yponomeutidae tales como Plutella Xylostella. Esta nueva característica de la protoxina y la toxina BTS02618A ("(pro)toxina"), es decir, la combinación de actividad contra familias de insectos Lepidópteros económicamente importantes diferentes tales como Noctuidae, Yponomeutidae y Pyralidae, hace de esta (pro)toxina un compuesto idealmente adecuado para combatir una extensa gama de plagas de insectos por contacto de estos insectos con la (pro)toxina, v.g., por pulverización o por expresión del gen bTS02618A en bacterias asociadas a las plantas o en las propias plantas. Se cree que la toxina BTS02618A representa la porción más pequeña de la protoxina BTS02618A que es activa como insecticida contra los Lepidópteros.
Esta invención se refiere todavía adicionalmente a un gen quimérico que puede utilizarse para transformar una célula vegetal y que contiene los fragmentos de DNA siguientes enlazados operativamente:
1)
una parte del gen bTS02618A (la "parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida") que codifica una porción eficaz como insecticida de la protoxina BTS02618A, preferiblemente una parte truncada del gen bTS02618A (el "gen bTS02618A truncado") que codifica precisamente la toxina BTS02618A;
2)
un promotor adecuado para transcripción de la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida en una célula vegetal; y
3)
señales adecuadas de formación y poliadenilación del transcrito del extremo 3' para expresar la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida en una célula vegetal.
A este gen quimérico se hace referencia generalmente en lo sucesivo como el "gen quimérico bTS02618A".
Esta invención se refiere también a:
1)
una célula (la "célula vegetal transformada") de una planta, tal como maíz o algodón, cuyo genoma está transformado con la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, preferiblemente el gen quimérico bTS02618A; y
2)
una planta (la "planta transformada") que se regenera a partir de la célula vegetal transformada o es producida por la planta así regenerada y sus semillas, cuyo genoma contiene la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, preferiblemente el gen quimérico bTS02618A, y que es resistente a los Lepidópteros.
Esta invención se refiere todavía adicionalmente a:
1)
un organismo microbiano, tal como B. thuringiensis o Pseudomonas spp., cuyo genoma está transformado con la totalidad o una parte del gen bTS02618A; y
2)
una espora microbiana, que contiene un genoma que está transformado con la totalidad o partes del gen bTS02618A.
Antecedentes de la invención
B. thuringiensis ("Bt") es una bacteria Gram-positiva que produce cristales endógenos por esporulación. Los cristales están compuestos de proteínas que son específicamente tóxicas contra larvas de insectos. Estas proteínas cristalinas y los genes correspondientes han sido clasificados basándose en su estructura y espectro insecticida (Höfte y Whiteley, 1989). Las cuatro clases principales son genes específicos de Lepidópteros (cryI), específicos de Lepidópteros y Dípteros (cryII), específicos de Coleópteros (cryIII), y específicos de Dípteros (cryIV).
El hecho de que pueden utilizarse técnicas convencionales de fermentación sumergida para producir esporas de Bt en gran escala hace que las bacterias Bt sean comercialmente atractivas como fuente de composiciones insecticidas.
Hasta ahora han sido identificados e integrados en genomas de plantas fragmentos de gen de algunas cepas de Bt, que codifican proteínas insecticidas, a fin de hacer las plantas resistentes a los insectos. Sin embargo, la obtención de la expresión de tales fragmentos de gen de Bt en las plantas no es un proceso simple. A fin de conseguir la expresión óptima de una proteína insecticida en células vegetales, se ha encontrado necesario modificar por ingeniería genética cada fragmento de gen Bt de una manera específica a fin de que el mismo codifique una parte de una protoxina de Bt que retiene toxicidad sustancial contra sus insectos diana (Solicitud de Patente Europea ("EPA") 86/300.291.1 y 88/402.115.5; Solicitud de Patente de los Estados Unidos 821.582, presentada el 22 de enero de 1986).
Sumario de la invención
De acuerdo con esta invención, se proporcionan cuatro nuevas cepas de Bt, a saber, las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E. Los cristales y las proteínas cristalinas de BTS02617A, BTS02618A,
BTS02654B y BTS02652E, la protoxina y la toxina BTS02617A producidas por las cepas durante la esporulación, y porciones eficaces como insecticidas de la protoxina BTS02618A, así como equivalentes de estas proteínas cristalinas, protoxina, toxina y porciones de protoxina eficaces como insecticidas en donde algunos aminoácidos han sido delecionados, reemplazados o añadidos sin afectar significativamente a la actividad insecticida de la proteína, poseen cada uno actividad insecticida y pueden formularse por tanto en composiciones insecticidas contra Lepidópteros en general, y particularmente contra Noctuidae, tales como Agrotis spp. (orugas nocturnas tales como Agrotis ipsilon), Mamestra spp. (v.g., la polilla de la col, Mamestra brassica) y Spodoptera spp. (larvas de esciara, tales como Spodoptera exigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis y Spodoptera litura), contra Pyralidae (v.g., el perforador del maíz europeo, Ostrinia nubilalis) e Yponomeutidae (tales como Plutella xylostella) que son plagas principales de diversas cosechas económicamente importantes, tales como maíz, algodón, y muchas hortalizas tales como Brassicas.
También de acuerdo con esta invención, un genoma de una célula vegetal se transforma con la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, preferiblemente el gen bTS02618A truncado, o un equivalente del mismo tal como un gen bTS02618A sintético modificado. Se prefiere que esta transformación se lleve a cabo con el gen quimérico bTS02618A. La célula vegetal transformada resultante puede utilizarse para producir plantas transformadas, semillas de plantas transformadas y cultivos de células vegetales constituidos esencialmente por las células transformadas. Las células transformadas en algunos o la totalidad de los tejidos de las plantas transformadas: 1) contienen la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida como una inserción estable en su genoma, y 2) expresan la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida por producción de una porción eficaz como insecticida de su protoxina BTS02618A, preferiblemente su toxina BTS02618A, haciendo con ello la planta resistente a los Lepidópteros. Las células vegetales transformadas de esta invención pueden utilizarse también para producir, con objeto de su recuperación, tales proteínas insecticidas de Bt.
Adicionalmente de acuerdo con esta invención, se proporciona un proceso para hacer una planta resistente a los Lepidópteros por transformación del genoma de la célula vegetal con la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, preferiblemente el gen bTS02618A truncado, o un equivalente del mismo. A este respecto, se prefiere que la célula vegetal esté transformada con el gen quimérico bTS02618A.
Todavía adicionalmente de acuerdo con esta invención, se proporcionan la protoxina BTS02618A, las porciones eficaces como insecticida de dicha protoxina y la toxina BTS02618A, así como partes funcionales de la toxina BTS02618A, el gen bTS02618A, la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, el gen bTS02618A truncado y el gen bTS02618A quimérico, y sus equivalentes, en donde tales equivalentes son DNAs equivalentes que codifican la (pro)toxina BTS02618A en donde el uso de codones de la secuencia codificante se ha modificado con respecto al preferido por una planta, y DNAs equivalentes que codifican una proteína con la actividad insecticida de la proteína BTS02618A, que se hibridan en condiciones severas al DNA que codifica la protoxina o toxina BTS02618A.
También de acuerdo con esta invención, se proporciona una secuencia de DNA, natural o artificial, que codifica la protoxina BTS02618A o porciones eficaces como insecticidas de la misma, tales como la toxina.
Asimismo de acuerdo con esta invención, se proporcionan una composición insecticida contra Lepidópteros, particularmente Noctuidae, Pyralidae e Yponomeutidae, y un método para reprimir Lepidópteros, particularmente Noctuidae, Pyralidae e Yponomeutidae, con la composición insecticida, en donde la composición insecticida comprende la cepa, los cristales y/o las proteínas cristalinas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E, o la protoxina, toxina y/o porciones de la protoxina BTS02618A eficaces como insecticidas o sus equivalentes en donde tales equivalentes son equivalentes de la proteína BST02618A en donde algunos aminoácidos han sido delecionados, reemplazados o añadidos sin afectar significativamente a la actividad insecticida de la proteína.
Descripción detallada de la invención
La protoxina BTS02618A de esta invención puede aislarse de manera convencional a partir de la cepa BTS02617A, depositada en fecha 2 de julio en el BCCM-LMG bajo el número de acceso LMG P-12592, la cepa BTS02618A, depositada en fecha 2 de julio de 1992 en el BCCM-LMG bajo el número de acceso LMG P-12593, la cepa BTS02654B, depositada en fecha 2 de julio de 1992 en el BCCM-LMG bajo el número de acceso LMG P-12594, o la cepa BTS02652E depositada en fecha 1 de marzo de 1993 en el BCCM-LMG bajo el número de acceso LMG P-13493. Por ejemplo, los cristales de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E pueden aislarse a partir de cultivos esporulados de su cepa respectiva (Mahillon y Delcour, 1984), y posteriormente, la protoxina BTS02618A puede aislarse a partir de los cristales de acuerdo con el método de Höfte et al. (1986). Las protoxinas pueden utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la protoxina de una manera convencional (Höfte et al., 1988). La toxina BTS02618A puede obtenerse por digestión con proteasas (v.g., tripsina) de la protoxina BTS02618A.
El gen bTS02618A puede aislarse de manera convencional. El gen bTS02618A puede identificarse en la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E, utilizando el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 821.582, presentada el 22 de enero de 1986, y en los documentos EPA 86/300.291.1 y 88/402.115.5 (que se incorporan en esta memoria por referencia). El gen bTS02618A fue identificado por: digestión del DNA total procedente de una de las cepas anteriores con enzimas de restricción; fraccionamiento por tamaños de los fragmentos de DNA, así producidos, en fracciones de DNA de 5 a 10 Kb; ligación de estas fracciones a vectores de clonación; escrutinio del E. coli, transformado con los vectores de clonación, con una sonda de DNA que se construyó a partir de una región del gen cryIG (Smulevitch et al., 1991; Gleave et al., 1992).
El término "gen bTS02618A", tal como se utiliza en esta memoria, incluye una secuencia de DNA que codifica la protoxina o toxina BTS02618A o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. De hecho, debido a la degeneración del código genético, algunos codones de aminoácidos pueden reemplazarse con otros sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. Adicionalmente, algunos aminoácidos pueden sustituirse por otros amino-ácidos equivalentes sin cambiar significativamente la actividad insecticida de la proteína. Asimismo, cambios en la composición de aminoácidos en regiones de la molécula, diferentes de las responsables de la fijación y toxicidad tienen menos probabilidad de causar una diferencia en la actividad insecticida de la proteína. Tales equivalentes del gen incluyen secuencias de DNA que se hibridan a la secuencia de DNA de la toxina o protoxina BTS02618A de SEQ ID No. 4 y que codifica una proteína con las mismas características insecticidas que la (pro)toxina BTS02618A, de esta invención. En este contexto, el término "hibridación" hace referencia a condiciones de hibridación convencionales, muy preferiblemente condiciones de hibridación severas.
El término "partes funcionales de la toxina BTS02618A", tal como se utiliza en esta memoria, significa cualesquiera parte(s) o dominio(s) de la toxina con una estructura específica que pueden transferirse a otra proteína (Bt) para proporcionar una nueva proteína híbrida que tiene al menos una característica funcional (v.g., las características de fijación y/o toxicidad) de la toxina BTS02618A (Ge et al., 1991). Dichas partes pueden constituir una característica esencial de la proteína Bt híbrida con las características de fijación y/o toxicidad de la proteína BTS02618A. Dicha proteína híbrida puede tener una gama de hospedadores aumentada, una toxicidad mejorada y/o puede utilizarse en una estrategia para prevenir el desarrollo de resistencia a los insectos (Publicación de Patente Europea ("EP") 408 403; Visser et al., 1993).
Alternativamente, los fragmentos de 5 a 10 Kb, preparados a partir del DNA total de la cepa BTS02617A o BTS02618A o BTS02654B o BTS02652E, pueden ligarse en vectores de expresión adecuados y transformarse en E. coli, y los clones pueden escrutarse luego por métodos convencionales de inmunosondeo de colonias (French et al., 1986) para expresión de la toxina con anticuerpos monoclonales o policlonales generados contra la toxina BTS02618A.
Asimismo, los fragmentos de 5 a 10 Kb, preparados a partir del DNA total de la cepa BTS02617A o BTS02618A o BTS02654B o BTS02652E, pueden ligarse en vectores lanzadera de Bt adecuados (Lereclus et al., 1992) y transformarse en un mutante de Bt cristal-menos. Los clones se escrutan luego respecto a producción de cristales (detectada por microscopía) o proteínas cristalinas (detectada por SDS-PAGE).
El gen bTS02618A así identificado se secuenció de manera convencional (Maxam y Gilbert, 1980) para obtener la secuencia de DNA. La hibridación en transferencias Southern y la comparación de secuencias indicaron que este gen es diferente de los genes descritos previamente que codifican protoxinas y toxinas con actividad contra Lepidópteros (Höfte y Whiteley, 1989).
Una parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A, que codifica una porción eficaz como insecticida de su protoxina, y una parte truncada del gen, que codifica exactamente su toxina, pueden producirse de una manera convencional después del análisis de la secuencia del gen. La secuencia de aminoácidos de la protoxina y toxina BTS02618A se determinó a partir de la secuencia de DNA del gen bTS02618A y el gen bTS02618A truncado. Por "una parte eficaz como insecticida" o "una parte" del gen bTS02618A se da a entender una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene menos aminoácidos que la protoxina BTS02618A pero que es todavía tóxico para los Lepidópte-
ros.
Con objeto de expresar la totalidad o una parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A o un gen equivalente en E. coli, pueden introducirse en otras cepas de Bt y en plantas sitios de restricción adecuados, que flanquean cada gen o parte de gen. Esto puede hacerse por mutagénesis orientada, utilizando procedimientos bien conocidos (Stanssens et al, 1989; White et al., 1989). Con objeto de obtener una expresión mejorada de plantas, puede ser preferible modificar el uso de codones del gen bTS02618A o parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A para formar un gen o parte de gen equivalente, modificado o artificial de acuerdo con las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218; EP 0.358.962 y EP 0.359.472. Para obtener una expresión mejorada en plantas monocotiledóneas tales como el maíz, puede añadirse también un intrón de monocotiledónea al gen quimérico bTS02618A, y la secuencia de DNA de la parte del gen bTS02618A puede cambiarse ulteriormente de una manera neutra en cuanto a la traducción, para modificar secuencias de DNA posiblemente inhibidoras presentes en la parte del gen por medio de inserción orientada de intrones y/o por introducción de cambios respecto al uso de codones, v.g., por adaptación del uso de codones al más preferido por la planta específica (Murray et al., 1989) sin cambiar significativamente la secuencia de aminoácidos codificada.
La parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida o su equivalente, preferiblemente el gen quimérico
bTS02618A, que codifica una porción eficaz como insecticida de la protoxina BTS02618A, puede insertarse establemente de manera convencional en el genoma nuclear de una célula vegetal aislada, y la célula vegetal así transformada puede utilizarse de manera convencional para producir una planta transformada que es resistente a los insectos. A este respecto, puede utilizarse un plásmido Ti desactivado, que contiene la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, en Agrobacterium tumefaciens a fin de transformar la célula vegetal, y después de ello, puede regenerarse una planta transformada a partir de la célula vegetal transformada utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en los documentos EP 0.116.718, EP 0.270.822, la publicación PCT WO 84/02.913 y la Solicitud de Patente Europea ("EPA") 87/400.544.0 (que se incorpora también en esta memoria por referencia), y en Gould et al. (1991). Los vectores del plásmido Ti preferidos contienen cada uno la parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida, entre las secuencias limitantes, o localizado al menos a la izquierda de la secuencia del límite derecho, del T-DNA del plásmido Ti. Por supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para transformar la célula vegetal, utilizando procedimientos tales como la transferencia directa de genes (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.233.247), transformación mediada por el polen (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.270.356, la publicación PCT WO 85/01856, y la Patente US 4.684.611), transformación del RNA vegetal mediada por virus (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.067.553 y la Patente US 4.407.956), transformación mediada por liposomas (como se describe, por ejemplo en la patente US 4.536.475), y otros métodos tales como los métodos descritos recientemente para transformación de ciertas líneas de maíz (Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990) y del arroz (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990) y el método recientemente descrito para transformación de monocotiledóneas en general (publicación PCT WO 92/09696).
La planta transformada resultante puede utilizarse en un esquema de reproducción convencional de plantas para producir más plantas transformadas con las mismas características o para introducir la parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A en otras variedades de la misma especie vegetal o especies afines. Las semillas que se obtienen a partir de las plantas transformadas, contienen la parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A como una inserción genómica estable. Células de la planta transformada pueden cultivarse de manera convencional para producir la porción eficaz como insecticida de la protoxina BTS02618A, preferiblemente la toxina BTS02618A, que puede recuperarse para uso en composiciones insecticidas convencionales contra Lepidópteros (Solicitud de Patente U.S. 821.582; documento EPA 86/300291.1.).
La parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A, preferiblemente el gen bTS02618A truncado, se inserta en un genoma de célula vegetal de tal manera que el gen insertado está situado aguas abajo (es decir, 3') de, y bajo el control de, un promotor que puede dirigir la expresión de la parte del gen en la célula vegetal. Esto se realiza preferiblemente por inserción del gen quimérico bTS02618A en el genoma de la célula vegetal. Promotores preferidos incluyen: los promotores constitutivos 35S fuertes (los "promotores 35S") del virus del mosaico de la coliflor de aislados CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) y CabbB-JI (Hull y Howell, 1987); y el promotor TR1' y el promotor TR2' (el "promotor TR1'" y el "promotor TR2'", respectivamente) que impulsan la expresión de los genes 1' y 2', respectivamente, del T-DNA (Velten et al., 1984). Alternativamente, puede utilizarse un promotor que no es constitutivo sino que es más bien específico para uno o más tejidos u órganos de la planta (v.g., hojas y/o raíces) con lo cual la parte del gen bTS02618A insertada se expresa únicamente en células del o de los tejidos u órganos específicos. Por ejemplo, la parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A podría expresarse selectivamente en las hojas de una planta (v.g., maíz, algodón) poniendo la parte del gen eficaz como insecticida bajo el control de un promotor inducible por la luz, tal como el promotor del gen de la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa de la propia planta o de otra planta tal como el guisante, como se describe en la Solicitud de Patente U.S. 821.582 y EPA 86/300.291.1. Otra alternativa consiste en utilizar un promotor cuya expresión es inducible (v.g., por temperatura o factores químicos).
La parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A se inserta en el genoma de la planta de tal manera que la parte del gen insertada se encuentra aguas arriba (es decir, 5') de las señales de regulación de la transcripción del extremo 3' adecuadas (es decir, señales de formación y poliadenilación del transcrito). Esto se realiza preferiblemente por inserción del gen quimérico bTS02618A en el genoma de la célula vegetal. Señales de poliadenilación y formación del transcrito preferidas incluyen las del gen de la octopina-sintasa (Gielen et al., 1984) y del gen 7 del T-DNA (Velten y Schell, 1985), que actúan como secuencias de DNA no traducidas en 3' en células vegetales transformadas.
La parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A puede insertarse opcionalmente en el genoma de la planta como un gen híbrido (documento EPA 86/300.291.1; Vaeck et al., 1987) bajo el control del mismo promotor como gen marcador seleccionable, tal como el gen neo (documento EP 0.242.236) que codifica resistencia a la kanamicina, de tal modo que la planta expresa una proteína de fusión.
La totalidad o una parte del gen bTS02618A, que codifica una proteína anti-lepidópteros, puede utilizarse también para transformar otras bacterias, tales como una B. thuringiensis que tiene actividad insecticida contra Lepidópteros o Coleópteros. De este modo, puede producirse una cepa de Bt transformada que es útil para combatir un amplio espectro de plagas de insectos Lepidópteros y Coleópteros o para combatir plagas de insectos Lepidópteros adicionales. La transformación de bacterias con la totalidad o una parte del gen bTS02618A, incorporadas en un vehículo de clonación adecuado, puede realizarse de manera convencional, preferiblemente utilizando técnicas convencionales de electroporación como las descritas en Mahillon et al. (1989) y en la Publicación de Patente PCT WO 90/06999.
La cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, puede transformarse también con la totalidad o una parte eficaz como insecticida de uno o más genes de Bt extraños tales como: el gen bt18 (documento EP 0.358.557) u otro gen de Bt que codifica una proteína anti-Lepidópteros; y el gen bt109P (publicación PCT WO 91/16433), que codifica una proteína anti-Coleópteros. De este modo, puede producirse una cepa de Bt transformada que es útil para combatir una diversidad mayor aún de plagas de insectos (v.g., Coleópteros y/o Lepidópteros adicionales).
La transformación de la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, con la totalidad o parte de un gen de Bt extraño, incorporado en un vector de clonación convencional, puede llevarse a cabo de una manera bien conocida, utilizando preferiblemente técnicas convencionales de electroporación (Chassy et al., 1988) u otros métodos, v.g., como ha sido descrito por Lereclus et al. (1992).
Cada una de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, puede fermentarse por métodos convencionales (Dulmage, 1981; Bernhard y Utz, 1993) para proporcionar altos rendimientos de células. En condiciones apropiadas que son bien conocidas (Dulmage, 1981), las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E, esporulan cada una para producir proteínas cristalinas que contienen la protoxina BTS02618A con rendimientos altos.
Una composición insecticida, particularmente anti-Lepidópteros, de esta invención puede formularse de manera convencional utilizando la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, o preferiblemente sus cristales respectivos, proteínas cristalinas o la protoxina o toxina BTS02168A o porción eficaz como insecticida de la misma como ingrediente activo, junto con vehículos, diluyentes, emulsionantes y/o dispersantes adecuados (v.g., como ha sido descrito por Bernhard y Utz, 1993). Esta composición insecticida puede formularse como un polvo humectable, pelets, gránulos o polvo fino o como una formulación líquida con disolventes acuosos o no acuosos como una espuma, gel, suspensión, concentrado, etc. La concentración de la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, cristales, proteínas cristalinas, o la protoxina BTS02618A, toxina o porciones eficaces como insecticida de la misma en una composición de este tipo dependerá de la naturaleza de la formulación y su modo de uso propuesto. Generalmente, puede utilizarse una composición insecticida de esta invención para proteger un campo durante 2 a 4 semanas contra Lepidópteros con cada aplicación de la composición. Para una protección más extendida (v.g., durante una estación de cultivo entera), deberían aplicarse periódicamente cantidades adicionales de la composición.
Un método para la represión de insectos, particularmente Lepidópteros, de acuerdo con esta invención comprende preferiblemente aplicar (v.g., pulverizar), en un lugar (área) a proteger, una cantidad insecticida de la cepa, esporas, cristales, proteínas cristalinas o la protoxina BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, toxina o porciones eficaces como insecticida de la protoxina BTS02618A, preferiblemente la toxina BTS02168A. El locus a proteger puede incluir, por ejemplo, el hábitat de las plagas de insectos o la vegetación en crecimiento o un área en la que debe cultivarse la vegetación.
Para obtener la protoxina o toxina BTS02618A, pueden cultivarse células de la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, de una manera convencional en un medio de cultivo adecuado y lisarse luego utilizando medios convencionales tales como degradación enzimática o detergentes o análogos. La protoxina puede separarse y purificarse luego por técnicas estándar tales como cromatografía, extracción, electroforesis, etcétera. La toxina puede obtenerse luego por digestión de la protoxina con tripsina.
Las células de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, pueden cosecharse y aplicarse también después intactas, vivas o muertas, preferiblemente desecadas, al locus a proteger. En este sentido, es preferible utilizar una cepa de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, purificada (viva o muerta), particularmente una masa de células que está constituida en un 90,0 a 99,0% por la cepa BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E.
Las células, cristales o proteínas cristalinas de BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E o la protoxina, toxina, o porción eficaz como insecticida de la protoxina BTS02618 pueden formularse en una composición insecticida de una diversidad de modos, utilizando cualquier número de aditivos convencionales, húmedos o secos, dependiendo del uso particular. Los aditivos pueden incluir agentes humectantes, detergentes, estabilizadores, agentes de adherencia, agentes de propagación y extendedores. Ejemplos de una composición de este tipo incluyen pastas, polvos para espolvoreo, polvos humectables, gránulos, cebos y pulverizaciones de aerosol. Otras células Bt, cristales, proteínas cristalinas, protoxinas, toxinas, y porciones eficaces como insecticida de la protoxina y otros insecticidas, así como fungicidas, biocidas, herbicidas y fertilizantes, pueden emplearse junto con las células, cristales o proteínas cristalinas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E o la protoxina, toxina o porciones eficaces como insecticida de la protoxina BTS02618 para proporcionar ventajas o beneficios adicionales. Una composición insecticida de este tipo puede prepararse de manera convencional, y la cantidad de células, cristales o proteínas cristalinas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E o la porción eficaz como insecticida de la protoxina empleada depende de una diversidad de factores, tales como la plaga de insectos considerada como diana, la composición utilizada, el tipo de área al que debe aplicarse la composición, y las condiciones climáticas prevalecientes. Generalmente, la concentración de la protoxina BTS02618A, porciones de la protoxina o toxina eficaces como insecticida serán al menos aproximadamente 0,1% en peso de la formulación hasta aproximadamente 100% en peso de la formulación, con mayor frecuencia desde aproximadamente 0,15% a aproximadamente 0,8% en peso de la formulación.
En la práctica, algunos insectos pueden comer la protoxina, toxina, porción de protoxina eficaz como insecticida BTS02618A o mezclas de las mismas en el área protegida, es decir el área en la que se ha aplicado dicha protoxina, toxina y/o porción de la protoxina eficaz como insecticida. Alternativamente, algunos insectos pueden comer células vivas e intactas de la cepa BTS02617A, BTS0218A, BTS02654B o BTS02652E o transformantes de las mismas, de tal modo que los insectos ingieren algo de la protoxina de la cepa y mueren o se deterioran.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención. La figura y el listado de secuencias a que se hace referencia en los ejemplos son como sigue:
Figura 1
Análisis por transferencia Southern de DNA total de la cepa HD127 de Bt digerido con AluI (pista 1), la cepa BTS02618A (pista 2), la cepa Bt BTS02459 (que contiene cryIA(c), 81k, cryIC y cryIE, pista 3), y la cepa de Bt BTS02489E (que contiene los mismos genes que HD-127, pista 4), utilizando una mezcla de sondas de DNA para genes de la proteína cristalina cryI, con inclusión de la sonda cryIG (SEQ ID No. 1). Cada banda corresponde a un gen de proteína cristalina particular. Con estas sondas, se encuentra que la cepa BTS02618A contiene el gen cryIA(b) y un nuevo gen, que es el gen bTS02618A, identificado por un fragmento AluI de aproximadamente 530 pb, que se hibrida a la sonda cryIG de SEQ ID No. 1. Se indican Los nombres de los genes cryI reconocidos, así como el tamaño de algunos fragmentos. El gen bTS02618A se indica con tres asteriscos; "?" indica un fragmento de gen desconocido.
Listado de secuencias
SEQ ID No. 1 - Secuencia de nucleótidos de la sonda de DNA utilizada para aislar el gen bTS02618A. Esta sonda se deriva de parte de la secuencia de DNA cryIG y es complementaria a los nucleótidos 2732-2750 de la secuencia de DNA descrita por Smulevitch et al. (1991).
SEQ ID No. 2 - La secuencia de nucleótidos parcial 5' del gen bTS02618A, que comprende el codón de iniciación de la traducción supuesto en la posición de los nucleótidos 195-197.
SEQ ID No. 3 - La secuencia de nucleótidos parcial 3' del gen bTS02618A (N: nucleótido desconocido), que comprende el codón supuesto de parada de la traducción en la posición de los nucleótidos 1146-1148.
SEQ ID No. 4 - La secuencia de nucleótidos del gen bTS02618A y la secuencia de aminoácidos traducida de la protoxina BTS02618A. El marco de lectura abierto de la protoxina alcanza desde el nucleótido 668 al nucleótido 4141. El codón de iniciación de la traducción se encuentra en la posición de los nucleótidos 668-670, y el codón de parada de la traducción se encuentra en la posición de los nucleótidos 4139-4141.
A no ser que se indique otra cosa en los ejemplos, todos los procedimientos para producción y manipulación del DNA recombinante se llevan a cabo por los procedimientos normalizados descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989).
Ejemplo 1 Caracterización de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E
Las cepas BTS02617A, BTS02618A y BTS02654B se aislaron a partir de polvo fino de cereal tomado como muestra en Cadlan, provincia de Bicol, Filipinas, y se depositaron en el BCCM-LMG en fecha 2 de julio de 1992 bajo los Núms. de acceso LMG P-12592, LMG P-12593 y LMG P-12594, respectivamente. La cepa BTS02652E se aisló también a partir de polvo fino de cereal de Filipinas, y fue depositada en el BCCM-LMG en fecha 1 de marzo de 1993 bajo el número de acceso No. LMG P13493.
Cada cepa puede cultivarse sobre medios estándar convencionales, preferiblemente medio T_{3} (tristona 3 g/l, triptosa 2 g/l, extracto de levadura 1,5 g/l, 5 mg MnCl_{2}, Na_{2}PO_{4} 0,05 M, pH 6,8 y 1,5% agar), preferiblemente a 28ºC. Para almacenamiento a largo plazo, es preferible mezclar un volumen igual de una suspensión de esporas-cristales con un volumen igual de glicerol al 50% y guardar ésta a -70ºC o liofilizar una suspensión de esporas-cristales. Para la esporulación, se prefiere el crecimiento sobre medio T_{3} durante 48 horas a 28ºC, seguido por almacenamiento a 4ºC. Durante su fase vegetativa, cada una de las cepas puede desarrollarse también en condiciones anaerobias facultativas, pero la esporulación ocurre únicamente en condiciones aerobias.
La esterilización de cada cepa se realiza por tratamiento en autoclave a 120ºC (presión de 1 bar) durante 20 minutos. Dicho tratamiento desactiva totalmente las esporas y las protoxinas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E. La radiación UV (254 nm) desactiva también las esporas.
Después de cultivo en Agar Nutriente ("NA", Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) durante un día, las colonias de cada una de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E forman colonias opacas blancas con bordes irregulares. Células de cada cepa (bastoncillos Gram-positivos de 1,7-2,4 x 5,6-7,7 \mum) esporulan después de 48 horas de cultivo a 28ºC en agar T_{3}. Las proteínas cristalinas producidas durante la esporulación están empaquetadas en cristales de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E. Es muy notable que el cristal se mantiene unido a la espora después de la esporulación.
Se determinó que el serotipo de Bt de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E, era el serotipo tolworthi H9 de todas estas cepas que se determinó por métodos de serotipificación convencionales como los conducidos por el WHO Collaborating Center for Entomopathogenic Bacillus.
Ejemplo 2 Actividad insecticida de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E y de la protoxina BTS02618A contra Noctuidae spp., Yponomeutidae spp. y Pyralidae spp
Se realizaron ensayos de toxicidad sobre larvas recién nacidas (para Plutella xylostella, se utilizaron larvas de la tercera etapa en entre mudas) alimentadas con una dieta artificial estratificada con mezclas espora-cristal de una de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E, o la protoxina o toxina BTS02618A. La dieta artificial se suministró en pocillos de placas Costar de 24 pocillos. Se omitió el formaldehído de la dieta. Se aplicaron 50 \mul de una dilución de la muestra en la superficie de la dieta y se secaron en un flujo de aire laminar. Para los ensayos de CL_{50}, las diluciones se hicieron en un tampón PBS-BSA, y se aplicaron 5 diluciones. Se pusieron 2 larvas en cada pocillo y se utilizaron 24 larvas por cada dilución de la muestra. Se contaron las larvas muertas y vivas de M. brassica, S. frugiperda, H. virescens, O. nubilalis, Plutella xylostella y S. exigua el quinto día, y se contaron las larvas muertas y vivas de A. ipsilon y S. littoralis el sexto día. Se calcularon los valores CL_{50} y CL_{95} (las concentraciones requeridas para matar respectivamente el 50% o el 95% de los insectos ensayados, expresadas en número de espora-cristales/cm^{2} o ng (pro)toxina/cm^{2}) utilizando análisis Probit (Finney, 1971), y los resultados se presentan a continuación.
Spodoptera littoralis
Experimento/cepa I CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-mx}^{b} Pendiente
Experimento 1
\hskip0.5cm BTS02618A 2,4 7,7 1,5-3,4 3,2
\hskip0.5cm HD127^{c} 2,5 168 1,2-7,4 1,0
Experimento 2
\hskip0.5cm BTS02618A 1,1 4 0,8-1,6 3,0
\hskip0.5cm HD127 21,2 133,7 14,4-31,9 2,0
^{a} 10^{5} espora-cristales por cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
^{c} \begin{minipage}[t]{158mm} Procedente de la colección Howard Dulmage, alojada en el Northern Region Research Center, 1815 North University, Peoria, Ill, EE.UU. El director es el Dr. L. Nakamura.\end{minipage}
Los experimentos con la protoxina BTS02618A purificada exhiben también una toxicidad significativa de esta protoxina contra las larvas de S. littoralis.
Spodoptera exigua 1. Mezclas cristal/espora
Experimento/cepa CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
Experimento 1
\hskip0.5cm BTS02618A 1,4 7,9 0,48-3,9 2,2
\hskip0.5cm HD127 8,2 163,5 5,1-15,7 1,3
Experimento 2
\hskip0.5cm BTS02618A 1,2 3,56 0,91-1,57 3,5
\hskip0.5cm BTS02617A 0,79 2,12 0,61.1,03 3,81
\hskip0.5cm HD127 3,5 44,2 1,36-11,5* 1,5
\hskip0.5cm Florbac 4,1 53,9 1,5-17,0* 1,47
\hskip0.5cm BTS00170U^{c} 5,1 46,5 1,83-24,4* 1,71
Experimento 3
\hskip0.5cm Javelin^{d} 23,12 195,7 14,6-56,7 1,77
Experimento 4
\hskip0.5cm BTS02618A 1,07 2,91 0,83-1,39 3,8
\hskip0.5cm BTS02617A 0,87 4,7 0,59-1,21 2,22
\hskip0.5cm HD127 4,7 56,9 1,85-18,7* 1,52
\hskip0.5cm Florbac^{e} 2,53 48,1 0,79-6,71* 1,29
\hskip0.5cm BTS00170U 1,94 56,3 0,55-5,4* 1,12
^{a} 10^{5} espora-cristales por cm^{2}
^{b} \begin{minipage}[t]{158mm} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}, los valores marcados con * son límites de confianza del 90% de los valores CL_{50}\end{minipage}
^{c} Publicación de patente PCT WO 90/06999
^{d} Cepa aislada de Javelin® (Sandoz, Lichtstrasse, Basilea, Suiza)
^{e} Cepa procedente de Florbac® (Novo Nordisk, Novo All\theta, Bagsvaerd, Dinamarca)
2. Ensayos toxina/protoxina
ICP CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
BTS02618A Protoxina 26,6 100,6 20,9-33,9 2,8
CryIC Toxina 68,9 313,2 50,5-94,1 2,5
CryID Toxina 118,6 870,6 82,7-170,0 1,9
^{a} ng/cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
Mamestra brassica 1. Mezclas cristal/espora
Experimento/cepa CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
\hskip0.5cm HD127 37,8 297,6 17,8-91,1 1,8
\hskip0.5cm BTS02618A 8,6 59,6 6,0-12,2 1,9
\hskip0.5cm BTS02617A 5,2 25,8 3,7-7,1 2,4
\hskip0.5cm BTS02652E 12,9 44,2 9,7-17,2 3,0
\hskip0.5cm BTS02654B 14,2 60,5 10,8-19,9 2,6
^{a} 10^{5} espora-cristales por cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
2. Ensayos de protoxina
ICP CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
BTS02618A Protoxina 25,3 125,1 19,3-33,2 2,4
CryIC Protoxina 22,0 62,9 16,3-29,6 3,6
CryIA (b) Protoxina 162,4 7169 93,2-283,1 1,0
^{a} ng/cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
Agrotis ipsilon 1. Mezclas cristal/espora
Cepa Mortalidad^{a} Genes^{b}
Btgall.^{c} 1/20 cryIF, cryIG, cryII, 81k
HD127^{d} 2/20 cryISa, cryIAb, cryIC, cryID, cryII, 81k
BTS02618A 16/20^{e} cryIAb, cryII, bTS02618A
Tampón 1/20 Ninguno
^{a} Número de larvas de la primera etapa entre mudas muertas después de 6 días (10^{7} espora-cristales por cm^{2})
^{b} Genes que se sabe están presentes en estas cepas
^{c} Btgall. como ha sido descrita por Smulevitch et al (1991)
^{d} HD127 está disponible en la Howard Dulmage Collection (NRRC, véase arriba)
^{e} Las larvas supervivientes exhiben una inhibición severa del crecimiento
CEPA CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
BTS02618A 84,4 207,9 65,9-109,6 4,2
HD127 >250
BTS02617A 53,4 261,0 27,7-112,3 2,4
^{a} 10^{5} esporas/cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
2. Ensayo toxina/protoxina
ICP CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
CryIAc Toxina >1350
BTS02618A Protoxina 212,2 1973 168,1-267,9 1,7
^{a} ng/cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
Dado que MacIntosh et al. (1990) describieron cierta actividad de la toxina CryIAc frente a A. ipsilon, se ensayó la toxina purificada CryIAc sobre este insecto para comparación, pero no causaba mortalidad significativa alguna de A. ipsilon.
Heliothis virescens 1. Cristal/esporas
Experimento/cepa CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
\hskip0.5cm BTS02617A 1,69 14,99 0,67-2,89 1,73
\hskip0.5cm BTS02618A 2,71 25,4 0,88-6,99 1,69
\hskip0.5cm BTS00170U^{c} 15,1 398,7 8,3-41,2 1,15
\hskip0.5cm Dipel^{d} 2,99 14,11 1,25-7,76 2,45
^{a} 10^{3} espora-cristales por cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
^{c} Publicación de patente PCT WO 90/06999
^{d} Cepa aislada de Dipel™ (Abbott Laboratories, North Chicago, Ill., EE.UU.)
2. Ensayo toxina/protoxina
ICP CL_{50}^{a} FL_{min-max}^{b} CL_{95}^{a} Pendiente I
BTS02618A Protoxina 31,6 20-50 182,7 2,1
CryIAb Toxina 7,2 4,9-10,5 169,1 1,2
^{a} ng/cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
Ostrinia nubilalis 1. Mezclas cristal/espora
Experimento/cepa CL_{50}^{a} CL_{95}^{a} FL_{min-max}^{b} Pendiente
\hskip0.5cm BTS02617A 4,92 12,49 2,45-6,81 4,0
\hskip0.5cm BTS02618A 6,17 39,7 2,93-9,74 2,0
\hskip0.5cm Dipel^{c} >30
^{a} 10^{3} espora-cristales por cm^{2}
^{b} Límites de confianza del 95% de los valores CL_{50}
^{c} Cepa aislada de Dipel™ (Abbott Laboratories)
2. Ensayo de protoxina purificada
ICP Mortalidad 100%^{a}
CryIAb Toxina 1350
CryIB Toxina 1350
BTS02618A Protoxina 100
^{a} Concentración para la cual se observó 100% de mortalidad (en ng/cm^{2})
La protoxina BTS02618A purificada exhibía también una toxicidad significativa frente a las larvas de Ostrinia nubilalis, en comparación con las toxinas CryI que son muy activas frente a Ostrinia.
Plutella xylostella
Las larvas de Plutella xylostella exhibían también una mortalidad significativa después de la aplicación de la toxina BTS02618A purificada a su dieta artificial en varios experimentos.
Spodoptera frugiperda
Se encontró también que mezclas cristal/espora de una cepa de Bt cristal-menos transformada por el gen
bTS02618A (Mahillon et al., 1989) inhiben también significativamente el crecimiento larvario de las larvas de S. frugiperda en pruebas de alimentación de los insectos.
En conclusión, las cepas de esta invención y la proteína BTS02618A de esta invención tienen una actividad insecticida fuerte contra una extensa gama de insectos que no son sensibles a ninguna proteína de Bt individual disponible actualmente y tienen actividad contra al menos tres Spodoptera spp. y contra otras Noctuidae, tales como A. ipsilon, M. brassica y H. virescens, así como contra Pyralidae, tales como O. nubilalis e Yponomeutidae tales como Plutella xylostella. Estos resultados se resumen y se comparan con los resultados para otros genes CryI (Van Frankenhuyzen, 1993) en la Tabla 1 que muestra la gama única de insectos sensibles a la proteína BTS02618A.
Ejemplo 3 Identificación del gen bTS02618A
Se identificó el gen bTS02618A en la cepa BTS02618A por análisis mediante transferencia Southern (Fig. 1) de DNA total digerido con AluI de la cepa utilizando, como sonda de DNA, la secuencia de DNA del gen cryIG (Gleave et al., 1992) de SEQ ID No. 1 y utilizando condiciones de hibridación estándar. Las secuencias parciales de DNA del gen bTS02618A, que muestran sus porciones de los extremos 5' y 3', se representan en SEQ ID Núms. 2 y 3, respectivamente, y la secuencia de DNA total del gen Bts02618A y la secuencia completa de aminoácidos de la proteína BTS02618A se muestran en SEQ ID No. 4.
Las secuencias parciales de SEQ ID Núms. 2 y 3 permiten reconocer el gen bTS02618A en las cepas BTS02617A, BTS02654B y BTS02652E y permiten la construcción de sondas para identificar y aislar la secuencia completa del gen en estas y otras cepas de Bt. El codón de iniciación de la traducción del gen bTS02618A se identifica en la posición de los nucleótidos 195-197 en SEQ ID No. 2, correspondiente a la posición de los nucleótidos 668-670 en SEQ ID No. 4. El codón de parada de la traducción se identifica en la posición de los nucleótidos 1146-1148 en SEQ ID No. 3, correspondiente a la posición de los nucleótidos 4139-4141 en SEQ ID No. 4.
Se identificó también el gen bTS02618A en las cepas BTS0217A, BTS02654B y BTS02652E utilizando la secuencia de DNA de SEQ ID No. 1 como sonda, así como otras sondas de DNA de fragmentos de DNA conservados en genes cryI.
Se encontró que el gen de longitud total bTS02618A codifica una protoxina de 129,9 kD. Una comparación de la secuencia de aminoácidos con otras proteínas CryI conocidas demostró que la parte C-terminal (C-terminal del bloque conservado de secuencia 5) era homóloga con CryIG (88%). La homología óptima para la parte N-terminal (la toxina) se encontró con la toxina CryIB, pero se encontró que ésta era menor que 50% (la homología se expresa como el número de coincidencias perfectas dividido por el número de aminoácidos del fragmento más
largo).
Se cree que la proteína insecticida más pequeña es una proteína de 69 kD (615 aminoácidos) que se extiende desde el aminoácido número 44 al aminoácido número 658 en SEQ ID No. 4. Un fragmento tríptico más pequeño de 55 kD (494 aminoácidos), que se extiende desde el aminoácido número 165 al aminoácido número 658 en SEQ ID No. 4, tiene todavía actividad insecticida frente a S. exigua, pero esta actividad está reducida significativamente. Así pues, un gen bTS02618A truncado o un gen truncado equivalente codifica preferiblemente la proteína de 69 kD de la protoxina BTS02618A de SEQ ID No. 4 como se ha descrito arriba.
Ejemplo 4 Clonación y expresión del gen bTS02618A
Con objeto de aislar el gen bTS02618A, se preparó DNA total a partir de la cepa bTS02618A y se digirió parcialmente con Sau3A. El DNA digerido se fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa y los fragmentos que comprendían desde 7 kb a 10 kb se ligaron al vector de clonación pUC19 digerido con BamHI y tratado con BAP (Yannisch-Perron et al., 1995). Los clones recombinantes de E. coli que contenía el vector se escrutaron luego con la sonda de DNA cryIG de SEQ ID No. 1 que se describe en el Ejemplo 2, para identificar clones que contenían el gen bTS02618A.
Los fragmentos de DNA así identificados se secuenciaron luego de acuerdo con Maxam y Gilbert (1980). Las secuencias parciales del gen bTS02618A se muestran en SEQ ID Núms. 2 y 3, y una secuencia completa del gen bTS02618A y la proteína BTS02618A se muestra en SEQ ID No. 4. Basándose en el análisis de la secuencia de DNA, se corta el gen con enzimas de restricción apropiadas para dar el gen bTS02618A truncado que codifica la toxina BTS02618A. La expresión del gen en E. coli se indujo utilizando procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989, supra).
El gen bTS02618A se introduce también por procedimientos de rutina en una cepa BT cristal-menos, utilizando los plásmidos de Bt PGI2 o PGI3 (Mahillon y Seurinck, 1988; Mahillon et al., 1988).
Ejemplo 5 Inserción del gen bTS02618A y el gen bTS02618A truncado en E. coli e inserción del gen bTS02618A truncado en plantas
Con objeto de expresar el gen bTS02618A y el gen bTS02618A truncado del Ejemplo 4 en E. coli y en plantas, se construyen diferentes casetes génicas en E. coli de acuerdo con el procedimiento descrito en los documentos EPA 86/300291.12 y EPA 88/402115.5.
Para permitir una expresión significativa en plantas, casetes que contienen a) el gen truncado o b) un gen híbrido que es una fusión de i) el gen truncado y ii) el gen neo se tratan cada una como sigue: se insertan entre las secuencias límite de T-DNA de vectores de expresión intermedios de plantas como se describe en el documento EPA 86/300291.1; se fusionan a señales de formación de transcritos y poliadenilación en los vectores de expresión de plantas; se ponen bajo el control del promotor constitutivo del virus del mosaico de la coliflor que impulsa el transcrito 35S3 (Hull y Howell, 1987) o el promotor 2' del TR-DNA del plásmido Ti de octopina (Velten et al., 1984); y se fusionan a señales de formación de transcritos del extremo 3' y poliadenilación del gen de la octopina-sintasa (Gielen et al., 1984).
Utilizando procedimientos estándar (Deblaere et al., 1985), los vectores de expresión intermedios de plantas, que contienen el gen bTS02618A truncado, se transfieren a la cepa C58C1Rif® de Agrobacterium (Solicitud de Patente U.S. No. 821.582; documento EPA 86/300.291.1) que lleva el plásmido Ti pGV2260 desactivado (Vaeck et al., 1987). La selección para resistencia a la espectinomicina produce plásmidos co-integrados, constituidos por pGV2260 y los vectores de expresión intermedios de plantas respectivos. Cada una de estas cepas recombinantes de Agrobacterium se utiliza luego para transformar diferentes plantas de algodón de tal modo que el gen bTS02618A truncado está contenido en, y es expresado por, células de plantas diferentes.
Ejemplo 6 Expresión en plantas del gen bTS02618A truncado
La actividad insecticida contra Lepidópteros de los productos de expresión del gen bTS02618A truncado en hojas de plantas transformadas, generadas a partir de las células vegetales transformadas del Ejemplo 5, se evalúa por registro de la velocidad de crecimiento y mortalidad de larvas de Agrotis y Spodoptera spp. que se alimentan sobre estas hojas. Estos resultados se comparan con la tasa de crecimiento de larvas que se alimentan de hojas de plantas no transformadas. Los ensayos de toxicidad contra Agrotis y Spodoptera spp. se realizan como se describe en los documentos EP 0.358.557, la Solicitud de Patente U.S. 821.582 y EPA 86/300.291.1. Se obtiene una tasa de mortalidad significativamente mayor entre las larvas que se alimentan en las hojas de plantas transformadas que contienen el gen bTS02618A truncado y el gen híbrido bTS02618A-neo que entre las larvas que se alimentan de las hojas de plantas no transformadas. Se encuentra también que las plantas transformadas resisten el ataque de Ostrinia nubilalis, Mamestra brassica, Heliothis virescens y Plutella xylostella por su expresión de la proteína bTS02618A.
Ni que decir tiene que esta invención no se limita a la cepa bTS02618A (BCCM-LMG P-12592), la cepa
BTS02618A (BCCM-LMG P-12593), la cepa BTS02654B (BCCM-LMG P-12594) y la cepa BTS02652E (BCCM-LMG P-13493). Por el contrario, la invención incluye también cualquier mutante o variante de las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B, y BTS02652E que produce cristales, proteínas cristalinas, protoxina o toxina que tienen sustancialmente las mismas propiedades, particularmente propiedades anti-Lepidópteros, muy particularmente anti-Noctuidae, anti-Yponomeutidae y anti-Pyralidae, especialmente anti-Spodoptera, anti-Plutella, anti-Ostrinia y anti-Mamestra; y propiedades anti-Heliothis y anti-Agrotis, como los respectivos cristales o proteínas cristalinas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B o BTS02652E, o la protoxina o toxina BTS02618A. Esta invención incluye también el gen bTS02618A y cualesquiera partes eficaces como insecticida del mismo, al igual que el gen bTS02618A truncado. A este respecto, el término "gen bTS02618A" tal como se utiliza en esta memoria, significa el gen aislado a partir de la cepa bTS02617A, bTS02618A, BTS02654B o BTS02652E e hibridación a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 y cualquier gen equivalente que codifique una protoxina que tenga sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos y actividad insecticida que la protoxina BTS02618A y que contenga preferiblemente las secuencias parciales de nucleótidos que se muestran en SEQ ID Núms. 2 y 3, o la secuencia total que se muestra en
SEQ ID No. 4.
Esta invención no se limita tampoco a plantas de algodón transformadas con el gen bTS02618A truncado. La misma incluye cualquier planta, tal como tomate, tabaco, colza, alfalfa, girasol, lechuga, patata, maíz, arroz, soja, especies de Brassica, remolacha azucarera y otras leguminosas y hortalizas, transformadas con una parte eficaz como insecticida del gen bTS02618A o un gen equivalente.
Tampoco está limitada esta invención al uso de plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens para transformar células vegetales con una parte del gen bTS02618A eficaz como insecticida. Otras técnicas conocidas para transformaciones de células vegetales, tales como por medio de liposomas, por electroporación o por sistemas vectores basados en virus de plantas o polen, pueden utilizarse para transformar monocotiledóneas y dicotiledóneas con una parte de gen de este tipo.
Adicionalmente, secuencias de DNA distintas de las presentes naturalmente en las cepas BTS02617A, BTS02618A, BTS02654B y BTS02652E y que codifican la protoxina y toxina BTS02618A pueden utilizarse para transformar plantas y bacterias. A este respecto, la secuencia de DNA natural de estos genes puede modificarse por: 1) reemplazamiento de algunos codones con otros que codifican los mismos o diferentes aminoácidos, preferiblemente los mismos; 2) deleción o adición de algunos codones; y/o 3) recombinación recíproca como ha sido descrito por Ge et al. (1991); con tal que dichas modificaciones no alteren sustancialmente las propiedades, particularmente las propiedades insecticidas, especialmente las propiedades anti-lepidópteros, de las porciones codificadas, eficaces como insecticidas de la protoxina BTS02618A (v.g., la toxina). Por ejemplo, un gen bTS02618A artificial o parte de gen de esta invención, como se ha descrito arriba, que tiene un uso de codones modificado, podría utilizarse en ciertas circunstancias en lugar de una parte del gen bTS02618A natural eficaz como insecticida en un gen quimérico bTS02618A de esta invención para transformación de plantas.
Asimismo, están abarcados por esta invención otros DNA recombinantes que contienen la totalidad o parte del gen bTS02618A en asociación con otro DNA extraño, particularmente el DNA de vectores adecuados para transformación de plantas y microorganismos distintos de E. coli,.
En este sentido, esta invención no se limita a los plásmidos específicos que contienen el gen bTS02618A, o partes del mismo, que han sido descritos hasta ahora, sino que esta invención abarca más bien cualesquiera DNA recombinantes que contienen secuencias de DNA que son sus equivalentes. Adicionalmente, la invención se refiere a todos los recombinantes de DNA que incluyen la totalidad o parte del gen bTS02618A y que son adecuados para transformación de microorganismos (v.g., bacterias asociadas con plantas tales como otras cepas de Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Pseudomonas, y Xanthomonas o levaduras tales como Streptomyces cerevisiae) en condiciones que permiten que la totalidad o parte del gen se exprese y pueda recuperarse a partir de dichos microorganismos o sea transferido a una célula vegetal.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
\begin{minipage}[t]{158mm} Actividad de las proteínas CryI frente a varias plagas de insectos lepidópteros: + y - indica la presencia o ausencia de actividad insecticida, +/- indica actividad baja (de acuerdo con Van Frankenhuyzen (1993)), NA indica la ausencia de datos disponibles, la proteína bTS02618A se abrevia como 2618A (datos de Van Frankenhuyzen (1993) y de esta invención (para A. ipsilon y 2618A))\end{minipage}
2618A IAb IAc IB IC IF
S. exigua + +/- - - + +
S. littoralis + - - - + NA
H. virescens + + + - +/- +
A. ipsilon + NA - NA NA NA
TABLA 1 (continuación)
2618A IAb IAc IB IC IF
O. nubilalis + + + NA NA +
P. xylostella + + + + + NA
N. brassica + + - - + NA
Referencias
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Yannisch-Perron, C., Vierra, J. and Messing, J., Gene 33, 103-119 (1985)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: PLANT GENETIC SYSTEMS N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Plateaustraat 22
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Gante
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 9000
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 32 9 2358454
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 32 9 2240694
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TÉLEX: 11361 Pgsgen
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas cepas de Bacillus thuringiensis y sus proteínas insecticidas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 19 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO DE SECUENCIA: sonda de ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA: la sonda es una parte de la cadena codificante de DNA del gen cryIG, descrito por Smulevitch et al. (1991)
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
PROPIEDADES: esta sonda se utiliza para aislar el gen bTS02618A de la cepa que lo contiene
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
5'-TTCTGTACTATTGATTGTA-3'
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1561 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: BTS02618A
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: característica mixta
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /función="contiene el codón de iniciación de la traducción del gen bTS02618A"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No.: 2:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1554 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: BTS02618A
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: característica mixta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1146..1148
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /función= "codón supuesto de parada de la traducción del gen bTS02618A"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
2
3 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4344 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 668..4141
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: abarca la secuencia completa de SEQ ID NO 2: desde la posición del nucleótido 474 al 2034 en SEQ ID NO 4; abarca también parte de la secuencia de SEQ ID NO 3: desde la posición del nucleótido 2994 a la posición del nucleótido 4344 en SEQ ID NO 4; SEQ ID NO 3 muestra nucleótidos adicionales, localizados aguas abajo (3') de la secuencia que se muestra en SEQ ID NO 4 (posición del nucleótido 1352 a posición del nucleótido 1554 en SEQ ID NO 3)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
4
5
6
7
8
9

Claims (37)

1. Una proteína insecticida que comprende una porción eficaz como insecticida de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4, o un mutante o variante de la misma en donde algunos aminoácidos han sido delecionados, reemplazados o añadidos sin afectar significativamente a la actividad insecticida de la proteína.
2. La proteína de la reivindicación 1, que es insecticida para Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Mamestra brassica, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis y Plutella xylostella.
3. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.
4. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, que comprende una porción eficaz como insecticida de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4.
5. La proteína de la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 desde la posición del aminoácido 44 a la posición del aminoácido 658.
6. La proteína de la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 desde la posición del aminoácido 165 a la posición del aminoácido 658.
7. La proteína de la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 desde la posición del aminoácido 1 a la posición del aminoácido 658.
8. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, que puede obtenerse a partir de la cepa BTS02618A depositada en el BCCM-LMG bajo el número de acceso P-12593.
9. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente la secuencia de aminoácidos de una proteína marcadora seleccionable.
10. Un DNA que comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un DNA que comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de SEQ ID No. 4 desde la posición del aminoácido 44 a la posición del aminoácido 658.
12. Un DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 desde la posición del nucleótido 797 a la posición del nucleótido 2641.
13. La secuencia de DNA de la reivindicación 10, que puede obtenerse a partir de la cepa BTS02618A con el número de depósito P-12953 en el BCCM-LMG y que codifica una proteína con actividad insecticida frente a Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Mamestra brassica, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis y Plutella xylostella.
14. Un DNA que codifica una proteína que tiene la actividad insecticida de la proteína de SEQ ID No. 4, en donde dicho DNA se hibrida en condiciones severas al DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No.4 desde la posición del nucleótido 668 a la posición del nucleótido 4138.
15. Un DNA que codifica una proteína que tiene la actividad insecticida de la proteína de SEQ ID No. 4 desde la posición del aminoácido 44 a la posición del aminoácido 658, en donde dicho DNA se hibrida en condiciones severas al DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 desde la posición del nucleótido 797 a la posición del nucleótido 2641.
16. El DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el uso de codones de la secuencia codificante se ha modificado para el preferido por una planta.
17. El DNA de la reivindicación 16, en donde dicha planta es maíz.
18. El DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que comprende adicionalmente un intrón de monocotiledónea.
19. Un gen quimérico que comprende el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 y un promotor que puede dirigir la expresión en las células de una planta.
20. El gen quimérico de la reivindicación 19, en donde dicho DNA comprende la secuencia de DNA de SEQ ID No. 4 desde la posición del nucleótido 668 a la posición del nucleótido 2641 o la secuencia de DNA de SEQ ID No. 4 desde la posición del nucleótido 797 a la posición del nucleótido 2641.
21. Una cepa de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo siguiente: la cepa BTS02617A de número de depósito BCCM-LMG P-12592, la cepa BTS02618A de número de depósito BCCM-LMG P-12593, la cepa BTS02654B de número de depósito BCCM-LMG P-12594, y la cepa BTS02652E de número de depósito BCCM-LMG P-13493.
22. Una mezcla cristales-esporas de la cepa de la reivindicación 21.
23. Una composición insecticida que comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo de: la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la cepa de la reivindicación 21, y la mezcla cristales-esporas de la reivindicación 22.
24. La composición de la reivindicación 23 que es activa contra un insecto seleccionado del grupo siguiente: Agrotis spp., Spodoptera spp., Plutella spp., Mamestra spp., Heliothis spp. y Ostrinia spp., Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassica, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis y Plutella xylostella.
25. Un microorganismo transformado para contener el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18.
26. Una célula vegetal, que comprende el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de la reivindicación 19 ó 20.
27. Una planta, que comprende DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de la reivindicación 19 ó 20.
28. La planta de la reivindicación 27 que se selecciona de las siguientes: algodón, tomate, tabaco, colza, alfalfa, girasol, lechuga, patata, maíz, arroz, soja, especies de Brassica y remolacha azucarera.
29. Un tejido vegetal, que comprende la célula vegetal de la reivindicación 26.
30. Una semilla de una planta, que comprende el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de las reivindicaciones 19 ó 20.
31. Un proceso para hacer una planta resistente a los Lepidópteros, caracterizado por:
proporcionar a una planta el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de las reivindicaciones 19 ó 20.
32. El proceso de la reivindicación 31, en donde dichos Lepidópteros se seleccionan del grupo de: Agrotis spp., Spodoptera spp., Plutella spp., Mamestra spp., Heliothis spp., Ostrinia spp., Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassica, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis y Plutella xylostella.
33. Un proceso para producir plantas y material reproductivo de dichas plantas resistente a los Lepidópteros, que comprende los pasos de:
a)
producir células vegetales transformadas que comprenden el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de las reivindicaciones 19 ó 20,
b)
regenerar plantas o material reproductivo de las mismas que comprende el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o el gen quimérico de las reivindicaciones 19 ó 20 a partir de dichas células vegetales transformadas, y opcionalmente,
c)
replicar biológicamente dichas plantas regeneradas o dicho material reproductivo.
34. Un proceso para reprimir una plaga de insectos, que comprende el paso de poner en contacto dicha plaga con la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
35. Un proceso para reprimir una plaga de insectos, que comprende el paso de poner en contacto dicha plaga con la composición insecticida de las reivindicaciones 23 ó 24.
36. El proceso de la reivindicación 34 ó 35, en donde dicha plaga de insectos se selecciona de las siguientes: Spodoptera spp., Mamestra spp., Heliothis spp., Ostrinia spp., Plutella spp., Agrotis spp., Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassica, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis y Plutella xylostella.
37. La planta de la reivindicación 27 ó 28, que es heterocigótica para el DNA introducido.
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