ES2251016T3 - Un antigeno combinado de citomegalovirus humano y su uso. - Google Patents
Un antigeno combinado de citomegalovirus humano y su uso.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN ANTIGENO COMBINADO QUE PRESENTA AL MENOS TRES PORCIONES DE PROTEINAS DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO (HCMV), Y QUE SE CARACTERIZA POR UNA CAPACIDAD AUMENTADA PARA UNIRSE A ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE HCMV, PARA SU USO EN ENSAYOS PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE HCMV, Y COMO VACUNA PARA CONFERIR INMUNIDAD PROTECTORA FRENTE A ENFERMEDADES MEDIADAS POR EL HCMV.
Description
Un antígeno combinado de citomegalovirus humano y
su uso.
La presente invención se refiere al campo de la
virología, específicamente, al citomegalovirus humano y a la
respuesta inmunitaria a su infección
El citomegalovirus humano (HCMV) pertenece a la
familia de los herpesvirus. La infección con HCMV se produce
frecuentemente, tal como se pone en evidencia por el alto porcentaje
(alrededor del 50%) de adultos que tienen anticuerpos de este virus.
La infección en el individuo inmunocompetente normal es leve o
asintomática. Sin embargo, en recién nacidos y en huéspedes
inmunodeprimidos tales como receptores de transplante de órgano o de
médula ósea y pacientes con SIDA, se desarrolla la enfermedad grave
(revisado por Ho (1991) en: Cytomegalovirus: Biology and
infection, (2ª ed.), Plenum Med. Press, Nueva York).
Como otros herpesvirus, el HCMV puede establecer
una latencia durante toda la vida después de la infección inicial
(Stevens (1989) Microbiol. Rev. 53:318-332;
Bruggeman (1993) Virchows Arch, B cell Pathol.
64:323-333). Se desconoce el sitio de latencia. Hay
algunos datos que indican que varios órganos y tejidos tales como el
riñón, el corazón y la pared vascular de grandes vasos son sitios de
latencia. Además, las células sanguíneas tales como macrófagos
pueden contener virus latente (Hendrix et al. (1989) Am.
J. Pathol. 134:1151-1157; Yomashiroya et
al. (1988) Am. J. Pathol. 130:71-79;
Tanake et al. (1992) J. Vasc. Surg.
16:274-279; Stanier et al. (1989) Br. Med.
J. 299:897-898; Bevan et al. (1991)
Br. J. Haematol. 78:94-99;
Taylor-Wiedeman et al. (1991) J. Gen.
Virol.
72:2059-2064).
72:2059-2064).
A partir de la infección latente, el virus puede
reactivarse dando como resultado una infección endógena que supone
un riesgo en el huésped inmunodeficiente. Tanto la infección
primaria como las reinfecciones (ya sean endógenas, mediante la
reactivación de virus latente dentro del huésped, o exógenas,
mediante la reinfección con un nuevo virus del exterior) pueden
conducir a una infección aguda (o activa). Especialmente, las
infecciones primarias pueden dar como resultado una enfermedad
potencialmente mortal (Rubin (1990) Rev. Infect. Dis. 12
(supl. 7):S754-S766; Schooley (1990) Rev. Infect.
Dis. 12 (supl. 7):S811-S819).
A pesar de que la inmunidad celular es la parte
más importante de la respuesta inmunitaria para aclarar o reducir la
infección por HCMV en el huésped, resulta claro a partir de estudios
en seres humanos y modelos de animales que la inmunidad humoral
también tiene un efecto sobre el curso de la infección reduciendo o
evitando los síntomas asociados con el CMV (Meyers et al.
(1983) Ann. Intern. Med. 98:442-446; Snijdman
et al. (1987) New Engl. J. Med.
317:1049-1054; Stals et al. (1994)
Antiviral Res. 25:147-160).
Recientemente, experimentos en modelos de
animales han mostrado que pueden evitarse síntomas clínicos mediante
la vacunación, apoyando el descubrimiento de que la presencia de
anticuerpos reduce la infección por CMV y, como consecuencia, la
enfermedad.
A pesar de que la quimioterapia antiviral ha
tenido éxito para algunos herpesvirus, especialmente para Herpes
simplex, la prevención y tratamiento de la infección por HCMV
sigue siendo difícil. Los mejores resultados para el tratamiento de
HCMV se obtienen cuando se empieza el tratamiento en un momento muy
temprano de la infección (Whitley & Gnann (1992) New Engl. J.
Med. 327:782- 789; Meyers et al. (1988) New Engl. J.
Med. 318:70-75; Grupo de estudio de tratamiento
con DHPG en colaboración (1986) New Engl. J. Med.
314:801-806; Walmsley (1988) J. Infect. Dis.
157:569; Goodrich et al. (1991) New Engl. J. Med.
325:1601-1607; Merigan et al. (1992) New
Engl. J. Med. 326:1182-1186). Por lo tanto, la
detección temprana de la infección por HCMV activo es importante.
Para la detección temprana de la infección por HCMV aguda (ya sea
infección primaria o por reactivación o latente) hay una creciente
necesidad de nuevas técnicas específicas y sensibles. Además de la
detección del virus, antígenos virales y genoma viral, es importante
la detección de anticuerpos anti-HCMV, especialmente
IgM (y en menor grado IgA) (Landini (1993) Prog. Med. Virol.
4:157-177; Bij vd W et al. (1988) J. Med.
Virol. 25:179-188; Genna et al. (1991)
J. Inf. Dis. 164:488-498; Nielsen et
al. (1980) J. Clin. Microbiol. 26:654 661; Sarov et
al. (1982) Clin. Exp. Immunol.
48:321-328).
El documento WO 96/01321 y Landini et al.
((1995), J. Clin. Microbiol. 33:2535-2542)
dan a conocer una mezcla que comprende una proteína de fusión que
comprende dos epítopos de pp150 (UL32) y un epítopo de pp52 (UL44)
combinados con un antígeno de pp65 (UL83) y un antígeno de pp38
(UL80) necesarios para remplazar el virus CMV en un ensayo para
anticuerpos anti-CMV.
La presente invención trata la necesidad de una
detección temprana de HCMV mediante el aporte de una proteína
sintética útil en un ensayo para la detección temprana de
anticuerpos anti-HCMV. La presente invención además
proporciona una vacuna para el HCMV.
La invención muestra una proteína de
citomegalovirus humano, también llamado un "antígeno
combinado", que comprende en una única cadena de aminoácidos
inmunógena partes de la secuencia de aminoácidos de tres proteínas
de HCMV codificadas por UL32, UL80 y UL83, útiles como vacuna de
HCMV y en un ensayo para la detección temprana de la infección por
HCMV. Además la invención muestra un método para preparar el
antígeno combinado de la invención mediante técnicas de ADN
recombinante.
En una realización específica, el antígeno
combinado de la invención es una proteína de fusión que tiene la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. En esta realización, el
antígeno combinado se compone de seis residuos de histidina y
porciones definidas de las proteínas UL32, UL83 y UL80 de HCMV. El
tipo o número de antígenos de HCMV incluidos en el antígeno
"combinado" no está limitado, y puede incluir más de tres
epítopos. Los antígenos (epítopos) utilizados en este ensayo
muestran una capacidad mejorada para unirse a IgM, mostrando un
aumento de 2 a 3 veces en la unión al anticuerpo IgM en comparación
con un único antígeno.
Se incluyen en la invención las secuencias de
nucleótidos que codifican para el antígeno combinado de la
invención. Estas secuencias de nucleótidos incluyen secuencias de
ADN, ADNc y ARN que codifican para el antígeno combinado de la
invención. En una realización específica, la invención incluye
secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos SEQ
ID NO: 11. También se entiende que las secuencias de nucleótidos de
la invención incluyen modificaciones menores de las secuencias de
nucleótidos que codifican para el antígeno combinado de la
invención, siempre que las proteínas resultantes tengan la misma
actividad y función in vitro y/o in vivo que la
proteína codificada por la secuencia SEQ ID NO: 11.
Además, la invención incluye además vectores que
contienen las secuencias de nucleótidos de la invención y las
células huésped transformadas con los vectores de la invención.
La presente invención muestra un ensayo para
detectar la presencia y la cantidad de anticuerpos frente a
antígenos codificados por HCMV en tejidos y fluidos biológicos de
seres humanos infectados. Este ensayo alcanza una sensibilidad
mejorada de inmunodetección mediante la combinación de las regiones
inmunodominantes de proteínas formadas precozmente en una única
proteína. Además, el antígeno combinado de la invención puede unirse
a una fase sólida para su uso en un ensayo de fase sólida tal como
un inmunoensayo o ensayos similares ampliamente utilizados para
detectar tanto antígenos como anticuerpos (IgG, IgM e IgA) en
muestras corporales. La capacidad mejorada del antígeno combinado de
la invención para unirse a anticuerpos específicos frente a HCMV
proporciona un ensayo sensible que puede detectar enfermedades
mediadas por HCMV en una fase temprana de infección, permitiendo por
tanto un tratamiento temprano para empezar.
En un aspecto, la invención muestra el uso del
antígeno combinado como una vacuna para el citomegalovirus humano.
El antígeno combinado útil como vacuna contiene porciones de las
proteínas codificadas por las secuencias ppUL32, ppUL80 y ppUL83 de
HCMV, en una única cadena de aminoácidos constituida tal como se
describe a continuación. La vacuna de la invención es útil al
conferir inmunidad protectora a sujetos humanos con riesgo de
enfermedad mediada por HCMV.
Estos y otros objetos, ventajas, y
características de la invención resultarán evidentes para las
personas expertas en la técnica con la lectura de los detalles de
los métodos, ensayos, y péptidos de la invención tal como se
describen más detalladamente a continuación.
Las figuras 1A y 1B muestran la secuencia de
ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos del
antígeno combinado ejemplar de la invención.
Antes de describir las presentes proteínas,
ensayos y métodos de uso, debe entenderse que esta invención no se
limita a los métodos, ensayos o proteínas particulares descritos,
dado que tales métodos, ensayos y proteínas pueden, desde luego,
variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el
presente documento lo es únicamente con el propósito de describir
realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitativa, ya
que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por
las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento
tienen el mismo significado como se entiende normalmente por un
experto común en la técnica a la que pertenece esta invención. A
pesar de que pueden utilizarse cualquier método y material similares
o equivalentes a los descritos en el presente documento en la
práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los
métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas
en el presente documento dan a conocer y describen los métodos y/o
materiales en conexión con los cuales se citan las
publicaciones.
La presente invención muestra un "antígeno
combinado" que tiene una porción de las secuencias de aminoácidos
de la cepa Towne del citomegalovirus humano. Por el término
"antígeno combinado" se entiende una proteína que no se produce
en la naturaleza que comprende en una única cadena de aminoácidos,
todas o una parte inmunógena de las secuencias de aminoácidos de las
proteínas codificadas por UL32 (ppUL32), UL30 (ppUL80), y UL83
(ppUL83). Estas secuencias de aminoácidos definen epítopos que
reaccionan de manera eficaz con inmunoglobulinas humanas. La
proteína UL32 intacta que se produce en la naturaleza codifica para
una fosfoproteína básica de 150 kDa que se une al suero de pacientes
infectados con HCMV. UL83 y UL80 codifican para la proteína de
matriz y proteína de unión de HCMV principales, respectivamente. La
proteína del antígeno combinado de la invención se une al IgM
específico de HCMV con una afinidad aumentada de 2 a 3 veces en
comparación con un único epítopo que se produce en la naturaleza. El
antígeno combinado de la invención tiene la secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO: 12.
Por "capacidad mejorada para unirse" o
"afinidad de unión aumentada" se quiere decir una unión
mejorada del antígeno combinado de la invención a anticuerpos
específicos frente a HCMV en comparación con un único epítopo. Por
lo tanto, la presencia de los múltiples epítopos en una única
molécula proporciona un efecto sinérgico de unión a anticuerpos
específicos frente a HCMV. Los términos "sinérgico", "efecto
sinérgico" y similares se utilizan en el presente documento para
describir una unión mejorada a anticuerpos específicos frente a HCMV
del antígeno combinado de la invención en comparación con un único
epítopo. A pesar de que un efecto sinérgico en algunos campos se
refiere a un efecto que es más que aditivo (por ejemplo, 1 + 1 = 3),
en el campo médico un efecto sinérgico puede ser aditivo (1 + 1 = 2)
o menos que aditivo (1 + 1 = 1,6). Por lo tanto, se considera que la
presencia de múltiples dominios antigénicos en una única molécula
proporciona un efecto sinérgico en la unión de anticuerpos
específicos de HCMV (por ejemplo, > 1,0) en comparación con un
único dominio (1,0).
El antígeno combinado de la invención se compone
de dominios antigénicos de proteínas de la cepa Towne de HCMV que
pueden detectar de manera eficaz anticuerpos
anti-HCMV en muestras biológicas. El antígeno
combinado de la invención se compone además de una cola residuo de 6
histidinas utilizada para purificar el antígeno. La cola de
histidina no es inmunógena y no interfiere con la detección de
anticuerpos.
La invención incluye secuencias de nucleótidos
que codifican para el antígeno combinado de la invención. Estas
secuencias de nucleótidos pueden expresarse en células huésped ya
sean procariotas o eucariotas, que incluyen organismos microbianos,
levaduras, insectos y mamíferos no humanos. Los métodos para
expresar secuencias de ADN se conocen en la técnica. Vectores de ADN
plásmidos y virales biológicamente funcionales que pueden expresarse
y replicarse en un huésped se conocen en la técnica. Tales vectores
se utilizan para incorporar secuencias de ADN de la invención.
La transformación de una célula huésped con
vectores que contienen ADN que codifica para el antígeno combinado
de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas
convencionales tal como conocen bien los expertos en la técnica.
Tales células huésped transformadas pueden expresar el antígeno
combinado. El aislamiento y purificación del antígeno combinado
expresado puede llevarse a cabo mediante medios convencionales bien
conocidos en la técnica.
El antígeno combinado de la presente invención
presenta ventajas sobre preparaciones de antígenos de la técnica
anterior, que incluyen una unión mejorada de 2 a 3 veces a
anticuerpos IgM. Esta unión a IgM mejorada proporciona un ensayo más
preciso y sensible para la detección de anticuerpos frente a HCMV
presentes durante una infección mediada por HCMV temprana en un
sujeto humano.
Por "infección mediada por HCMV" o
"enfermedad mediada por HCMV" se quiere decir cualquier
condición patológica que resulte de una infección de un ser humano
con citomegalovirus humano, incluyendo infecciones congénitas.
Los expertos en el desarrollo de técnicas
inmunorreactivas entenderán que hay numerosos procedimientos bien
conocidos para la detección de anticuerpos y usos de antígenos con
este propósito. Por lo tanto, mientras que en el presente documento
sólo se describen algunos métodos de ensayo, la invención no se
limita a aquellos ensayos descritos específicamente. Se incluye en
el ensayo de detección de la invención los métodos de ensayo tanto
competitivo como no competitivo. Ejemplos de métodos de ensayos en
los que puede utilizarse el antígeno combinado de la invención
incluyen radioinmunoensayo (RIA), inmunotransferencia (western
blotting), ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) y
ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IF).
Para la detección de infecciones por HCMV agudas
son posibles dos enfoques. El primero se basa en la detección del
virus o partes de él (antígenos o genoma). A pesar de que en general
este enfoque da buenos resultados, necesita equipamiento y
conocimiento específicos y normalmente sólo puede aplicarse en
centros académicos o grandes laboratorios.
El segundo enfoque se basa en la detección de
anticuerpos IgM en el suero del paciente y en un aumento de
anticuerpos de clase IgG. La detección de anticuerpos puede
conseguirse fácilmente utilizando técnicas tales como la técnica
ELISA. En principio, esta técnica es relativamente simple de manejar
y puede utilizarse en laboratorios de rutina (Kraat et al.
(1992) J. Clin. Microbiol. 30:522-524;
Lazzaroto et al. (1992) J. Clin. Lab. Anal.
6:216-218; Stagno et al. (1985) J. Clin.
Microbiol. 21:930-935; Smith & Shelley
(1988) J. Virol. Meth. 21:87-96; Marsano
et al. (1990) J. Inf. Dis.
161:454-461).
A pesar de que desde un punto de vista teórico
ELISA es una técnica simple para la detección de anticuerpos IgM,
hay muchos problemas asociados con el uso de kits ELISA comerciales.
Los métodos de detección de anticuerpos IgM frente a CMV disponibles
actualmente se ven afectados por variaciones considerables de
especificidad y sensibilidad. Esto se debe en gran parte a las
diferencias en las composiciones de antígenos y la falta de
normalización de antígenos.
Estos problemas se resuelven mediante la
combinación de tres proteínas virales recombinantes (ppUL80 (p38),
ppUL83 (pp65) y ppUL32 (pp150)) en una única proteína sintética
adecuada para la detección de anticuerpos IgM. Estas proteínas
virales se emplearon para desarrollar un método sensible para la
detección temprana de infecciones por HCMV agudas en pacientes
"con riesgo" tales como receptores de órganos, bebés prematuros
y pacientes que padecen síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA).
La vacunación con organismos inactivados o
atenuados o sus productos ha demostrado ser un método eficaz para
aumentar la resistencia del huésped y ha conducido en última
instancia a la erradicación de ciertas enfermedades infecciosas
graves y comunes. El uso de vacunas se basa en la estimulación de
respuestas inmunitarias específicas dentro de un huésped.
El antígeno combinado descrito en esta invención
genera una respuesta inmunitaria. El término "respuesta
inmunitaria" se refiere a una respuesta de la célula T citotóxica
o niveles séricos aumentados de anticuerpos específicos frente a un
antígeno, o a la presencia de anticuerpos neutralizantes frente a un
antígeno. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es suficiente
para hacer que el antígeno combinado de la invención sea útil como
vacuna para proteger a los sujetos humanos de la infección por
citomegalovirus humano. Además, los anticuerpos generados por el
antígeno combinado de la invención pueden extraerse y utilizarse
para detectar un virus en una muestra de fluido corporal. El término
"protección" o "inmunidad protectora" se refieren en el
presente documento a la capacidad la respuesta de los anticuerpos
séricos y de la célula T citotóxica inducida durante la inmunización
de proteger (parcial o totalmente) frente a una enfermedad provocada
por un agente infeccioso, por ejemplo, el citomegalovirus humano. Se
espera que el uso del antígeno combinado como vacuna proporcione
inmunidad protectora a seres humanos frente a infecciones por HCMV
graves mediante la inducción de anticuerpos frente a HCMV que se
sabe previenen síntomas clínicos graves.
La invención incluye un método para proporcionar
una respuesta inmunitaria e inmunidad protectora a un ser humano
frente a enfermedades mediadas por el citomegalovirus humano. El
método incluye administrar el antígeno combinado de la invención a
un ser humano. El antígeno combinado de la invención se administra
preferiblemente como una formulación que comprende un vehículo
fisiológicamente aceptable y una cantidad eficaz del antígeno
combinado. Se conocen una variedad de vehículos fisiológicamente
aceptables en la técnica, que incluyen, por ejemplo, solución
salina. Las vías de administración, cantidades y frecuencia de
administración se conocen por aquellos expertos en la técnica para
proporcionar inmunidad protectora a un paciente receptor. Las vías
de administración incluyen cualquier método que confiere inmunidad
protectora al receptor humano, que incluyen, pero no se limitan a,
inhalación, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,
intradérmica, y subcutánea. Preferiblemente, se proporciona el
antígeno combinado de la invención a un sujeto humano mediante
inyección subcutánea o intramuscular. Un intervalo de cantidades y
frecuencia de administración es aceptable, siempre que se obtenga la
inmunidad protectora del receptor. Por ejemplo, pueden administrarse
de 5 a 20 \mug mediante inyección intramuscular entre 2 y 4 veces
a lo largo de un periodo de tres meses.
Los siguientes ejemplos se presentan de manera
que se proporcione a aquellos expertos habituales en la técnica una
divulgación y descripción completas de cómo realizar y utilizar los
ensayos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que
los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos
para garantizar una precisión con respecto a los números utilizados
(por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero deberán
explicarse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos
que se indique lo contrario, la temperatura está en grados
centígrados, el peso molecular es peso molecular promedio, y la
presión es o está cerca de la presión atmosférica.
Ejemplo
1
Cepas bacterianas. Todos los estudios de
clonación de ADN se hicieron utilizando la cepa Escherichia
coli DH5\alpha. Se realizaron los experimentos de expresión de
proteínas con E. coli BL21 (DE3) plysS.
Expresión y purificación de proteínas. Se
hicieron crecer las bacterias en un medio TB que contiene ampicilina
y cloramfenicol hasta una DO_{600} (densidad óptica de 600 nm) de
1,0, tras lo cual se indujo la expresión de proteínas mediante la
adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) a 0,1 mM. Se llevó a cabo cromatografía de afinidad en una
etapa de proteínas de fusión de 6 histidinas (6 H) sobre Ni2+ -
Sepharose quelante (Probond, Invitrogen) esencialmente tal como se
describe por los fabricantes del material de la columna. Se
realizaron experimentos de inmunotransferencia y ELISA utilizando
técnicas convencionales.
Fragmento de ADN. Se generó el fragmento
de ADN que codifica para parte de la proteína ppUL80 de HCMV (cepa
Towne) mediante amplificación por PCR. Para desarrollar
oligonucleótidos para la PCR, primero tuvimos que determinar la
secuencia de ADN de parte del gen UL80 de la cepa Towne. Con este
fin, se generaron dos oligonucleótidos que eran homólogos a las
secuencias de UL80 de la cepa AD169 de HCMV. Estos oligonucleótidos
son de la secuencia:
Estas secuencias en negrita son idénticas a los
nucleótidos 116475 a 116493 para
ppUL80-N-EI, y complementarias a los
nucleótidos 117363 a 117386 para
ppUL80-C-EI de AD169 de HCMV. Las
secuencias en cursiva representan un sitio de reconocimiento para la
endonucleasa de restricción EcoRI. Se utilizaron los
nucleótidos en la PCR
(1 ciclo: 5 min a 94ºC; 30 ciclos: 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC; 1 ciclo: 10 min a 72ºC) con ADN de la cepa Towne de HCMV como molde. Se clonó el producto de PCR resultante y se secuenció. Basándose en esta secuencia, se diseñaron oligonucleótidos específicos a la cepa Towne que se emplearon para amplificar parte del gen UL80 de Towne. Para facilitar la clonación, se introdujeron sitios de escisión de la endonucleasa de restricción EcoRI en los cebadores de ADN; estos sitios de EcoRI se indican a continuación en cursiva. Las secuencias de los ceba-
dores son:
(1 ciclo: 5 min a 94ºC; 30 ciclos: 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC; 1 ciclo: 10 min a 72ºC) con ADN de la cepa Towne de HCMV como molde. Se clonó el producto de PCR resultante y se secuenció. Basándose en esta secuencia, se diseñaron oligonucleótidos específicos a la cepa Towne que se emplearon para amplificar parte del gen UL80 de Towne. Para facilitar la clonación, se introdujeron sitios de escisión de la endonucleasa de restricción EcoRI en los cebadores de ADN; estos sitios de EcoRI se indican a continuación en cursiva. Las secuencias de los ceba-
dores son:
Los nucleótidos en negrita corresponden a los
nucleótidos 116497 a 116515 para
ppUL80-N2-EI y los nucleótidos
117259 a 117278 para ppUL80-C2-EI de
AD169 de HCMV. Tras la amplificación, se purificó el producto de
PCR, se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI
del vector pRSET B (Invitrogen). En el plásmido resultante, el
fragmento del gen UL80 está presente en el extremo 3' dentro del
marco con un fragmento que codifica para seis histidinas (6 H).
Ejemplo
2
Se generó el fragmento de ADN que codifica para
parte de la proteína ppUL83 de HCMV (cepa Towne) mediante PCR. Se
desarrollaron oligonucleótidos que eran homólogos a la secuencia del
gen UL82 de Towne (Pande et al. (1991) Virology
182:220-228). Se introdujeron sitios de escisión de
la endonucleasa de restricción BamHI en los cebadores de ADN;
estos sitios se indican a continuación en cursiva. Las secuencias de
los cebadores
son:
son:
Las secuencias en negrita de
ppUL83-N-BI son idénticas a los
nucleótidos 855 a 871 de la secuencia del gen ppUL83. La secuencia
en negrita de ppUL83-C-BI es
complementaria a los nucleótidos 1380 a 1396 de la secuencia del gen
ppUL83. Tras la amplificación por PCR, se purificó el producto de
PCR, se digirió con BamHI y se clonó en el sitio BglII
del vector pRSET C (Invitrogen). En el plásmido resultante, el
fragmento del gen UL82 está presente en el extremo 3' dentro del
marco de un fragmento que codifica para seis histidinas (6 H).
Ejemplo
3
Se generó el fragmento de ADN que codifica para
parte de la proteína ppUL32 de HCMV (cepa Towne) mediante PCR, de
manera similar a como se describe para la clonación de parte del gen
UL80 (véase anteriormente). Sólo se desarrollaron los nucleótidos
para la PCR tras la secuenciación de parte del gen UL32 de la cepa
Towne. Con este fin, se generaron dos oligonucleótidos que son
homólogos a las secuencias UL32 de la cepa AD169 de HCMV. Las
secuencias de estos nucleótidos son:
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias en cursiva representan sitios de
escisión de HindIII. Las secuencias en negrita son
complementarias a los nucleótidos 40288 a 40306 para
ppUL32-N-HIII, e idénticas a los
nucleótidos 39783 a 39804 para
ppUL32-C-HIII de AD169 de HCMV. Se
llevó a cabo la PCR con ADN de la cepa Towne de HCMV como molde. Se
clonó y secuenció el producto de PCR resultante. Basándose en esta
secuencia, se desarrollaron oligonucleótidos específicos para la
cepa Towne que se utilizaron posteriormente para amplificar parte
del gen UL32 de Towne. Se introdujeron sitios de escisión de la
endonucleasa de restricción HindIII en los cebadores, estos
sitios se muestran en cursiva en las secuencias siguientes. Las
secuencias de los cebadores son:
\vskip1.000000\baselineskip
Los nucleótidos en negrita corresponden a los
nucleótidos 40244 a 40262 para
ppUL32-N2-HIII y nucleótidos 39850 a
39874 para ppUL32-C2-HIII de AD169
de HCMV. Tras la amplificación, se purificó el producto de PCR, se
escindió con HindIII y se clonó en el sitio HindIII
del vector pRSET B (Invitrogen). En el plásmido resultante, el
fragmento del gen UL32 está presente en el extremo 3' dentro del
marco de un fragmento que codifica para seis histidinas (6 H).
Ejemplo
4
Para generar un plásmido que expresa una proteína
de fusión de 6 H y partes de ppUL83, ppUL80 y ppUL32, se insertaron
los fragmentos de ADN que codifican para ppUL80 y ppUL32 en los
sitios EcoRI y HindIII, respectivamente, del plásmido
que contiene el marco de lectura abierto 6 H - ppUL83 (véase el
ejemplo 2 anterior). El constructo de ácido nucleico resultante
contiene una fusión dentro del marco del marco de lectura abierto 6
H - ppUL83 y partes de los genes ppUL80 y ppUL32 que se describieron
anteriormente. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) que
corresponden al constructo de ácido nucleico del antígeno combinado
(SEQ ID NO 11) de la invención se muestran en las figuras 1A -
1B.
Ejemplo
5
Puede utilizarse el antígeno combinado en un
ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) como antígeno
adsorbido en una fase sólida vehículo o en un ensayo de competición
en el que anticuerpos específicos conocidos compiten con anticuerpos
presentes en el suero del paciente por epítopos específicos en el
antígeno combinado. También puede conjugarse el antígeno combinado a
un sistema de detección, tal como enzimas, para detectar anticuerpos
séricos que pueden estar presentes en el suero del paciente. Una
ventaja importante proporcionada por el uso del antígeno combinado
de la invención es que hay las mismas cantidades molares de cada uno
de estos tres antígenos inmunodominantes presentes simultáneamente
en el sistema de detección, dando como resultado la sensibilidad
mejorada del presente ensayo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bruggeman, Catharina A.
\hskip4cmVink, Cornelis
\hskip4cmRamon, Albert
\hskip4cmStals, Frans
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: UN ANTÍGENO COMBINADO DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO Y SU USO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2200 Sand Hill Road, Suite 100
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Menlo Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94025
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: AscIII
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Valeta Gregg
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.127
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 07532 / 003001
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 322-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (415) 854-0875
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTGAATTC CAGTTGGCGG CACGTCAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGAATTC TTTATTAGGG TATCACGGTA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGTGAATT CGCGGACTAC GTGGATCCCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGAATT CCACCATGTC TTTGGGCGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGATCCGG CTTTTACCTC ACACG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCCCG TTGTCGGAAT CCTCG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTCAAGCT TCGTCGGTGT TCCTTCCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTCAAGCT TTCCCGACAC GTCACTATCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCAAAGCT TTGGTAGGTC GACCGCCCTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGTCAAGCT TCCTCCGTGT TCTTAATCTT CTCG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1896 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 631 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Antígeno combinado que comprende en una única
cadena de aminoácidos una parte inmunógena de la secuencia de
aminoácidos de tres proteínas del citomegalovirus humano (HCMV)
codificadas por UL32, UL80 y UL83.
2. Antígeno combinado según la reivindicación 1,
que además comprende seis residuos de histidina.
3. Antígeno combinado según la reivindicación 1 ó
2, en el que dicho antígeno tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO 12.
4. Antígeno combinado según la reivindicación 1,
en el que dicho antígeno tiene una capacidad de unión a anticuerpos
específicos frente a HCMV mejorada de 2 a 3 veces.
5. Antígeno combinado según la reivindicación 4,
en el que dichos anticuerpos específicos frente a HCMV son
anticuerpos IgM.
6. Dispositivo de ensayo, que comprende:
una superficie de soporte; y
un antígeno combinado unido a dicha superficie,
en el que el antígeno combinado comprende en una única cadena de
aminoácidos una parte inmunógena de la secuencia de aminoácidos de
tres proteínas del citomegalovirus (HCMV) codificadas por UL32, UL80
y UL83.
7. Método para detectar y cuantificar anticuerpos
específicos frente a citomegalovirus humano (HCMV) en una muestra de
tejido o fluido corporal humano, comprendiendo dicho método:
- a)
- poner en contacto una muestra de tejido o fluido corporal humano con un antígeno combinado, en el que dicho antígeno combinado comprende una parte inmunógena de la secuencia de aminoácidos de tres proteínas del citomegalovirus humano (HCMV) codificadas por UL32, UL80 y UL83; y
- b)
- detectar la cantidad de antígeno combinado unido a los anticuerpos específicos frente a HCMV,
en el que la cantidad de antígeno combinado unido
es indicativa de la presencia de anticuerpos específicos frente a
HCMV.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dicho antígeno combinado está marcado.
9. Vacuna para conferir inmunidad protectora
frente a enfermedades mediadas por citomegalovirus, comprendiendo
dicha vacuna el antígeno combinado según la reivindicación 1.
10. Ácido nucleico que codifica para el antígeno
combinado según la reivindicación 1.
11. Ácido nucleico según la reivindicación 10 que
codifica para el antígeno combinado de la SEQ ID NO 12, o versiones
modificadas del mismo que codifican para una proteína que tiene la
misma actividad y función in vitro y/o in vivo que la
proteína codificada por la SEQ ID NO 11.
12. Ácido nucleico según la reivindicación 10 ó
11 que es ADN, ADNc o ARN.
13. Vector que comprende un ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. Célula huésped que comprende el ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o que
comprende el vector según la reivindicación 13.
15. Célula huésped según la reivindicación 14,
que es una célula huésped procariota o eucariota.
16. Célula huésped procariota o eucariota según
la reivindicación 15, que es una célula microbiana, de levadura, de
insecto o de mamífero.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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