ES2264128T3 - Vacuna para la peritonitis infecciosa felina. - Google Patents
Vacuna para la peritonitis infecciosa felina.Info
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Abstract
LA INVENCION COMPRENDE LAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE COMPRENDEN EL GEN FIPV S, O UN FRAGMENTO DE ESTE GEN, MODIFICADO EN UNA AL MENOS DE LAS REGIONES ANTIGENICAS A1 Y A2 IMPLICADAS EN EL MEJORAMIENTO, ASI COMO LA UTILIZACION DE ESTAS SECUENCIAS PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS MODIFICADAS, Y PARA LA CONSTRUCCION DE VIRUS RECOMBINANTES O DE PLASMIDOS DE EXPRESION Y LA UTILIZACION DE LOS VIRUS RECOMBIANTES COMO VACUNAS CONTRA LA PERITONITIS INFECCIOSA FELINA, LA UTILIZACION DE LOS PLASMIDOS DE EXPRESION COMO COMPOSICION INMUNIZANTE POR INYECCION DIRECTA DE DICHOS PLASMIDOS EN EL GATO, Y LA UTILIZACION DE LAS PROTEINAS MODIFICADAS COMO VACUNA.
Description
Vacuna para la peritonitis infecciosa
felina.
La presente invención hace referencia a vacunas
contra la Peritonitis Infecciosa Felina (PIF), preparadas a partir
de la glucoproteína SPIKE (S) del virus de la PIF cuyos principales
epítopos de potenciación han sido modificados por mutagénesis.
Estas vacunas permiten proteger a los gatos vacunados contra la PIF
sin producir en estos últimos el fenómeno de potenciación que lleva
una evolución acelerada de la enfermedad.
El virus de la Peritonitis Infecciosa Felina
infecciosa (Feline Infectious Peritonitis Virus, FIPV) es un
virus de ARN de cadena simple de polaridad positiva, envuelto, que,
dentro de la familia Coronaviridae, pertenece al grupo antigénico
que comprende el coronavirus entérico felino (FECV), el coronovirus
canino (CCV), el virus de la gastroenteritis transmisible porcina
(TGEV) y el coronavirus respiratorio porcino (PRCV) (Sanchez C. y
otros, Virology, 1990; 174, 410-417). Este virus
provoca una enfermedad compleja y siempre mortal en gatos, que se
conoce con el nombre de Peritonitis Infecciosa Felina (PIF). El
virus de la PIF destaca dentro de los coronavirus porque induce en
el gato la aparición de anticuerpos que facilitan la infección por
parte del virus y aceleran la evolución de la enfermedad. Los gatos
que poseen anticuerpos neutralizantes anti-FIPV
tras una infección natural anterior por parte de este virus, tras
una transferencia pasiva de anticuerpos o tras una vacunación,
desarrollan muy frecuentemente una enfermedad mucho más intensa y
mucho más rápida que la de los gatos que simplemente se han
infectado por primera vez en ausencia de anticuerpos específicos
(Pedersen N. y Boyle J., Am. J. Vet. Res. 1980, 41,
868-876; Weiss R. y otros, Comp. Immunol. Microb.
Infect. Dis. 1981, 4, 175-189; Weiss R. y otros, Am.
J. Vet. Res. 1980, 41, 663-671). Se cree que la
unión de los complejos inmunitarios
anticuerpo-virus a los receptores Fc presentes en la
superficie de los macrófagos constituye el mecanismo que potencia
la aceleración de la entrada de virus en las células y su rápida
difusión dentro del organismo (Portefield, J. Advances in Virus
research, 1986, 31, 335-355; Weiss y otros, 1981).
Este fenómeno de potenciación en el seno de los coronavirus sólo se
ha observado con el virus de la
PIF.
PIF.
El virus de la PIF comprende tres proteínas
estructurales. La más importante en cuanto a tamaño es la proteína
"SPIKE" o espícula (S). Esta proteína S se halla fuertemente
glucosilada y es responsable de inducir en el gato tanto
anticuerpos neutralizantes como anticuerpos potenciadores. Estudios
in vitro realizados con anticuerpos monoclonales
neutralizantes dirigidos contra el virus de la PIF han mostrado que
los principales epítopos neutralizantes se hallan todos situados
sobre la glucoproteína S y se corresponden, en un mayor grado, con
los epítopos que intervienen en el fenómeno de potenciación (Corapi
W. y otros, J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C.
y otros, J. Virol. 1992, 66, 956-965).
Una vacunación eficaz contra la PIF debe llevar
a la aparición de anticuerpos neutralizantes sin que haya inducción
de anticuerpos potenciadores. Hasta ahora no ha sido posible
preparar tal vacuna. Las vacunas recombinantes que no contienen la
glucoproteína S probablemente pueden constituir la mejor
alternativa para las futuras vacunas contra la PIF, pero estos
antígenos sólo contribuyen parcialmente a la inducción de la
respuesta neutralizante contra el virus de la PIF. De los tres
antígenos virales estructurales, solo la glucoproteína S puede
inducir una respuesta neutralizante importante. Lamentablemente,
esta glucoproteína también induce la aparición concomitante de
anticuerpos potenciadores. A pesar de su importancia en la
inducción de una buena respuesta neutralizante (y por tanto en la
respuesta protectora), la glucoproteína S natural desempeña al
parecer un papel esencial en el fenómeno de potenciación de la PIF
y por lo tanto por ahora no puede utilizarse para la fabricación de
vacunas que respondan a los criterios expuestos más arriba.
La localización y la caracterización de los
epítopos presentes en S y, en particular, de aquellos responsables
de la neutralización y la potenciación es por tanto necesaria para
determinar las modificaciones que hay que proporcionar a la
glucoproteína S (o al gen que codifica esta proteína) para
convertirla en un inmunógeno eficaz para la vacunación de los gatos
contra la PIF.
La secuencia nucleotídica y la secuencia
proteica de la glucoproteína S del virus de la PIF han sido
determinadas (de Groot R., y otros,
EP-A-0264979). Esta solicitud de
patente no muestra cómo identificar los epítopos neutralizantes y/o
los epítopos potenciadores en S. Este documento tampoco muestra
cómo utilizar la secuencia S para fabricar una vacuna eficaz y no
potenciadora contra la PIF.
La solicitud de patente PCT
WO-A-93/23421 reivindica la
utilización de una glucoproteína S truncada o de una secuencia de
ácido nucleico que sólo codifique para una parte de S. En
particular, se reivindica la región muy conservada situada en el
extremo carboxiterminal de S (124 últimos aminoácidos) para la
preparación de una vacuna "universal" contra los coronavirus.
Este documento es muy general y no muestra cómo realizar una vacuna
contra la PIF que no induzca anticuerpos potenciadores en el gato.
Es el mismo caso que la solicitud de patente PCT
WO-A-23422 en la que se describen
elaboraciones mixtas de glucoproteína S híbrida
FECV-FIPV que incluyen los fragmentos de FIPV S
542-597, 594-1454 ó
651-1454.
La solicitud de patente PCT
W0-A-92/08487 reivindica la
utilización de diversos péptidos seleccionados de las proteínas S, o
codificados por los genes S, de diversas cepas de virus FIPV o por
la secuencia del gen S de FECV, con fines diagnósticos,
terapéuticos o preventivos de la PIF en el gato. En particular, se
reivindica el péptido 598-615 de la secuencia
proteica de S del virus FIPV cepa 79-1146 para
utilizarlo bajo la forma de una proteína de fusión con la
galactoquinasa, proteína recombinante que puede utilizarse luego
para el diagnóstico de los anticuerpos anti-PIF en
los gatos infectados o como vacuna recombinante para inducir
protección contra la PIF en los gatos. Aunque tiene en cuenta
variaciones en las secuencias de los péptidos reivindicados, este
documento no muestra precisamente cuáles deben ser los cambios en
las secuencias propuestas ni tampoco muestra cómo realizar una
vacuna PIF no potenciadora, ni cuáles son las regiones de la
glucoproteína S implicadas en este fenómeno.
La solicitud de patente
GB-A-2 282 601, publicada después
de la fecha de prioridad de la presente solicitud, propone realizar
una vacuna a base de una proteína S modificada para evitar la
potenciación, mediante cambio o deleción de por lo menos uno de los
sitios antigénicos denominados D (correspondiente a los aminoácidos
496-524), A1 (corresponde a los aminoácidos
531-555) y A2 (correspondiente a los aminoácidos
584-604), de tal manera que estos sitios permanezcan
antigénicamente inactivos.
Se han realizado esfuerzos importantes para
identificar los principales sitios antigénicos presentes en las
proteínas S del virus TGEV (Transmissible
Gastro-Enteritis Virus) (Correa I. y otros, J.
Gen. Virol. 1990, 71, 271-279; Delmas B. y otros, J.
Gen. Virol. 1990, 71, 1313-1323), del BCV (Bovine
CoronaVirus) (Yoo D. y otros, Virology 1991, 183,
91-98), MHV (Mouse Hepatitis Virus)
(Takase-Yoden S. y otros, Virus Res. 1990, 18,
99-108; Stuhler A. y otros, J. Gen. Virol. 1991,
72, 1655-1658) y FIPV (Corapi W. y otros, J. Virol.
1992, 66, 6695-6705; Olsen C. y otros, J. Virol.
1992, 66, 956-965; Olsen C. y otros, J. Gen. Virol.
1993, 74, 745-749). En todos los casos, se han
identificado múltiples dominios neutralizantes y en general los
dominios inmunodominantes se han localizado en la parte S1 de la
proteína.
Los estudios que tratan específicamente del
virus de la PIF han mostrado la existencia en la proteína S de
epítopos que inducen a la vez una respuesta neutralizante y una
respuesta potenciadora frente a la infección con FIPV (Corapi W. y
otros, J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. y
otros, J. Virol. 1992, 66, 956-965; Olsen C. y
otros, J. Gen. Virol. 1993, 74, 745-749). Estos
mismos autores han mostrado que los anticuerpos monoclonales
neutralizantes y potenciadores de especificidad
anti-S podían distribuirse en 6 grupos principales
según su capacidad para reconocer distintas cepas de virus PIF y
distintos mutantes resistentes a la neutralización por parte de
estos monoclonales ("mar" mutantes (anticuerpo
monoclonal resistente)). De todos modos, no se han caracterizado
los epítopos que corresponden a las principales regiones
antigénicas del FIPV S. Todos los anticuerpos monoclonales no
neutralizantes descritos por estos autores (Olsen C. y otros, J.
Virol. 1992, 66, 956-965) son también no
potenciadores según una prueba de potenciación in vitro, lo
que refuerza la hipótesis de una estrecha relación entre la
neutralización y la potenciación en el caso del virus de la PIF. La
potenciación de la infección viral por parte de los anticuerpos
tiene lugar cuando los monocitos o los macrófagos son infectados de
un modo más eficaz por los inmunocomplejos, por una endocitosis
dependiente de receptores específicos, que por el virus solo. A
pesar de todos los estudios realizados sobre el fenómeno de
potenciación dependiente de los anticuerpos, numerosas preguntas
siguen sin respuesta. En particular, no se sabe cuáles son los
componentes virales específicos responsables de la potenciación
para cada virus. Los estudios realizados hasta ahora con el FIPV
indican que la potenciación depende básicamente de epítopos
presentes en S (Olsen C. y otros, 1993; Vennema H. y otros, J.
Virol. 1990, 64, 1407-1409).
Hohdatsu T. y otros (Arch Virol. 1991, 120,
207-217) han visto que los anticuerpos monoclonales
anti-FIPV M podían inducir potenciación de la
infección in vitro. Esto no se ha confirmado in vivo
con los estudios realizados con los recombinantes vacuna/FIPV M y
vacuna/FIPV N. La inmunización de gatos con estos dos recombinantes
no ha permitido observar una potenciación inducida por una u otra
de estas dos proteínas (Vennema H. y otros, 1990). Si M y N
desempeñan un papel importante en la potenciación, éste es
claramente en un grado muy inferior al que desempeña S. A lo largo
de los estudios realizados con los distintos sistemas virales en
los que puede observarse la potenciación, se ha puesto en evidencia
un hecho constante: epítopos independientes pueden inducir al mismo
tiempo anticuerpos neutralizantes y anticuerpos potenciadores. Esto
se ha demostrado para el FIPV (Corapi W. y otros, J. Virol. 1992,
66, 6695-6705; Olsen C. y otros, J. Virol. 1992,
66, 956-965; Hohdatsu T. y otros, Arch. Virol. 1991,
120, 207-217), para el virus del dengue (Morens D.
y Halstead S., J. Gen. Virol. 1990, 71, 2909-2917)
y para el VIH {Robinson W. Jr., J. Virol. 1991, 65,
4169-4176).
Los resultados recientes de las pruebas
realizadas con las vacunas PIF experimentales proporcionan al
parecer el argumento más sólido hasta el momento sobre la
existencia de una relación directa entre la potenciación observada
in vitro y la enfermedad acelerada in vivo en el
gato. La inoculación de gatos con recombinantes del virus de la
vacuna que expresa la proteína S de la cepa 79-1146
sensibiliza los gatos e induce tras la prueba una enfermedad
acelerada en los gatos vacunados respecto de los gatos control no
vacunados (Vennema H. y otros, J. Virol. 1990, 64,
1407-1409). La inoculación de recombinantes de la
vacuna que expresa la proteína M, o la proteína N, no ha
predispuesto a los gatos a sufrir una enfermedad acelerada. Estos
resultados in vivo deben compararse con los resultados in
vitro que demuestran una localización mayoritaria de los
epítopos potenciadores en S (Corapi W. y otros, J. Virol. 1992, 66,
6695-6705; Olsen C. y otros, J. Virol. 1992, 66,
956-965). Además, experiencias recientes realizadas
para estudiar la eficacia de otra vacuna candidato contra la PIF
han demostrado una asociación estadísticamente significativa entre
la capacidad de un suero de gato para inducir potenciación in
vitro y el desarrollo en el mismo gato de una enfermedad
acelerada (Olsen C., Vet. Microb. 1993, 36,
1-37).
La presente invención tiene por objeto la
caracterización de los epítopos implicados en la potenciación de la
infección por el virus de la PIF. El conocimiento preciso de las
estructuras moleculares responsables del mecanismo de potenciación
permite concebir antígenos que no inducen la aparición de
anticuerpos potenciadores. Estos antígenos son los componentes
esenciales de una vacuna PIF eficaz.
De manera sorprendente, se ha descubierto,
mediante análisis de la secuencia del gen S de virus FIPV mutantes
resistentes a la neutralización por parte de anticuerpos
monoclonales neutralizantes y potenciadores, o resistentes a
anticuerpos monoclonales únicamente neutralizantes y no
potenciadores, que era posible evitar el mecanismo de inducción de
la potenciación por parte de la glucoproteína S. Con los anticuerpos
monoclonales estudiados se han caracterizado dos sitios antigénicos
principales: A1 y A2. Estos dos sitios se hallan situados
sorprendentemente en la misma región de la proteína S. Parece que
los anticuerpos fuertemente neutralizantes y potenciadores
reconocen los dos sitios al mismo tiempo. Esta información sugiere
que la unión simultánea de los dos epítopos por parte de un mismo
anticuerpo desempeña un papel directo en la potenciación. En
efecto, paralelamente a este primer descubrimiento, se ha
descubierto que los anticuerpos neutralizantes, pero no los
potenciadores, sólo reconocen el sitio A2. La potenciación sería
debida por tanto a un cambio conformacional por acercamiento de los
dos epítopos A1 y A2. La región A2 incluye los aminoácidos
637-662 en la secuencia proteica de S (De Groot R.
y otros, J. Gen Virol. 1987, 68, 2639-2646). La
naturaleza hidrófila de esta región y el hecho de que los 3
anticuerpos monoclonales probados reconocen todos ellos este
pequeño dominio sugieren que A2 es un epítopo neutralizante
dominante de la proteína S. Por otro lado, la estrecha homología
puesta en evidencia entre el sitio Al y una parte del subsitio Aa
identificado en la proteína S de TEGV (Gebauer F. y otros, Virology
1991, 183, 225-238) sugiere que A, que comprende
los aminoácidos 562-598 es también un importante
epítopo neutralizante para el virus FIPV.
El acercamiento o la unión simultánea, por parte
de un mismo anticuerpo, de los sitios A1 y A2 es necesario para
inducir la potenciación por parte del intermediario de los
anticuerpos.
La presente invención tiene por objeto la
modificación por ingeniería genética de la secuencia del gen FIPV S
en la región de los sitios A1 y/o A2, en particular para modificar
por lo menos uno de los dos sitios, preferentemente el sitio A de
manera que la proteína expresada presente un epítopo modificado, de
tal modo que no inducen más anticuerpos potenciadores y/o el sitio
A2. La región A1 puede ser modificada de diversas maneras con
medios bien conocidos por el experto en la materia. Pueden
modificarse los sitios A1 o A2 independiente o simultáneamente.
La modificación del sitio A2 puede consistir en
una modificación, tal como una deleción total, que causa una
pérdida de antigenicidad del sitio, pero se prefiere que, como para
el sitio A1, la modificación exprese un epítopo modificado de tal
modo que la proteína no induzca más anticuerpos potenciadores.
La región A1 tiene una parte en común con la
región denominada "A2" en la solicitud de patente
GB-A-2 282 601
(WO-A-95/07987) mencionada más
arriba, pero contrariamente a la invención, ésta prevé mutaciones
(modificaciones) o deleciones que causan una pérdida de la
antigenicidad de la región modificada o eliminada.
La invención tiene pues en particular por objeto
una secuencia nucleotídica que comprende el gen S completo, que
presenta por lo menos una modificación, preferiblemente una
mutación y/o deleción limitada, en la región antigénica A2 que
codifica los aminoácidos 637 a 662 y/o en la región antigénica Al
que codifica los aminoácidos 562 a 598, con excepción, por lo menos
en el sitio A1, de una deleción total o de una mutación importante
que tiene las mismas consecuencias que una deleción total, es decir
una pérdida de la antigenicidad de la región modificada.
La presente solicitud se limita por tanto ahora
a la parte de la invención que hace referencia a las modificaciones
que permiten suprimir la inducción de anticuerpos potenciadores sin
suprimir la antigenicidad, por lo menos en lo que respecta al sitio
A1.
Naturalmente la expresión de una secuencia
nucleotidica que comprende el gen FIPV S completo abarca las cepas
de FIPV de los tipos 1 y 2, así como las variantes y las secuencias
que presentan variaciones secundarias, es decir que no afectan a la
inmunogenicidad de la proteína S, lo que incluye también mutaciones
y deleciones secundarias fuera de los sitios A1 y A2.
Preferiblemente, las variaciones de la secuencia no deben modificar
la funcionalidad de la glucoproteína S.
Esto incluye pues las secuencias que poseen un
grado elevado de homología con las secuencias precedentes, incluso
teniendo en cuenta la degeneración del código genético, siendo esta
homología suficientemente elevada para que el polipéptido expresado
permita inducir una protección vacunal eficaz.
Por deleción limitada, se entiende de
preferencia una deleción puntual (correspondiente a un aminoácido)
o una microdeleción (hasta 6 aminoácidos).
En general se evitarán las deleciones o
mutaciones de los codones que codifican las cisteínas situadas en
A1 y A2.
Además, serán preferibles las mutaciones
puntuales y, en segundo lugar, las deleciones puntuales (excepto
Cys) a las mutaciones y deleciones más extensas.
Para el sitio A1, las modificaciones comprenden
como mínimo una mutación de al menos uno, y preferiblemente los
dos, de los dos codones que codifican Asp 568 y para Asp 591, para
tener cualquier otro aminoácido en estas posiciones. Con la
condición de que los aminoácidos 568 y 591 no sean de Asp, cualquier
otro aminoácido de la región 562-598 puede ser
sustituido por el aminoácido natural de la posición
considerada.
Las modificaciones del sitio A1 también
comprenden las deleciones limitadas de esta región que comprende
los aminoácidos 568 y/o 59.
Para el sitio A2, las modificaciones comprenden
como mínimo una mutación de al menos uno, y preferiblemente los
tres, de los dos codones que codifican Asp 643, Arg 649 y Arg 656,
para tener cualquier otro aminoácido en estas posiciones. Las
modificaciones del sitio A2 comprenden también la deleción total o
las deleciones parciales de esta región que comprende los
aminoácidos 643, 649 y/o 656.
La presente invención también tiene por objeto
la utilización de los genes así modificados para la expresión
in vitro de proteínas S recombinantes y para la preparación
de vacunas subunidades purificadas para la vacunación de los gatos
contra la PIF.
La presente invención también tiene por objeto
la utilización de los genes S así modificados para la elaboración
de vectores virales recombinantes que expresen estos genes
modificados. Estos vectores virales pueden ser virus recombinantes
replicativos o no replicativos y más concretamente poxvirus
(ejemplo: virus de la vacuna y sus derivados, virus canarypox...),
herpesvirus (en particular el herpesvirus felino) o adenovirus.
La presente invención tiene por objeto la
preparación, con estos virus recombinantes, de vacunas contra la
PIF.
La presente invención también tiene por objeto
la inmunización de gatos contra la PIF, con plásmidos que contienen
los genes S, modificados según la presente invención, y bajo el
control de un promotor fuerte (por ejemplo, HCMV IE, SV40, etc.) y
de señales de regulación para la transcripción y la traducción. Los
plásmidos se hallan en un vehículo susceptible de permitir la
inyección directa en el gato, en particular por vía intramuscular.
Se trata sobre todo de plásmidos desnudos tales como los que se
describen en la solicitud de patente internacional WO 90/11092.
La presente invención tiene finalmente por
objeto la preparación de vacunas contra la PIF que comprendan una
proteína o proteínas S, modificada o modificadas según la presente
invención, preferiblemente asociada o asociadas a otras proteínas
del virus, tales como por ejemplo la proteína M.
Otra solución vacunal consiste en utilizar
células (en particular de origen felino) que expresen
constitutivamente la glucoproteína S según la invención.
Ejemplo
1
Con el objetivo de localizar la región del gen
FIVP S responsable de la neutralización y potenciación, la clonación
de los fragmentos que se encabalgan del gen FIPV S se ha llevado a
cabo de tal manera que se expresen estos fragmentos en forma de
proteínas de fusión con la proteína del gen 10 del fago T7. La
secuencia de los oligonucleótidos para la amplificación de los
distintos fragmentos se ha elegido de tal manera que se cubra el
conjunto de la región codificante del gen S en tres grandes
fragmentos de aproximadamente 1.600 pares de bases (pb) y 12
subfragmentos más pequeños de aproximadamente 400 a 500 pb. Estos
oligonucleótidos contienen los sitios de restricción BamHI, XbaI o
XhoI para facilitar su clonación. La transcripción inversa del ARN y
la amplificación del ADN complementario mediante una reacción de
amplificación en cadena por polimerasa se han realizado según
técnicas estándar (Sambrook J. y otros, Molecular Cloning: a
laboratory manual, 2.ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY). El ADN amplificado ha sido digerido por las
enzimas apropiadas y clonado en el vector pBluescript (Stratagene,
La Jolla, CA).
A continuación se indican los límites de los
distintos fragmentos clonados a partir del gen S de la cepa
79-1146 del virus FIPV: todas las posiciones hacen
referencia a la secuencia del gen S de la cepa FIPV
79-1146 publicada por De Groot R. y otros (J. Gen.
Virol. 1987, 68, 2639-2646).
Fragmento F1: nucleótidos 70 a 1736.
Fragmento F2: nucleótidos 1519 a 3160.
Fragmento F3: nucleótidos 2773 a 4428.
Fragmento S1: nucleótidos
70-535.
Fragmento S2: nucleótidos
394-862.
Fragmento S3: nucleótidos
742-1221.
Fragmento S4: nucleótidos
1045-1539.
Fragmento S5: nucleótidos
1339-1734.
Fragmento S6: nucleótidos
1594-2089.
Fragmento S7: nucleótidos
1963-2443.
Fragmento S8: nucleótidos
2296-2838.
Fragmento S9: nucleótidos
2743-3004.
Fragmento S10: nucleótidos
2890-3506.
Fragmento S11: nucleótidos
3352-4063.
Fragmento S12: nucleótidos
3895-4428.
A continuación se han aislado los distintos
fragmentos FIPV clonados de los clones Bluescript por digestión
NotI y XhoI, después se han vuelto a clonar en el vector
pTOPE-SX para la etapa de transcripción y de
traducción in vitro.
A continuación se describe la elaboración de
pTOPE-SX:
El plásmido pTOPE-1b(+)
(Novagen) contiene el promotor T7 y una parte del gen 10 del fago
T7 seguida de un polienlazador. Este polienlazador ha sido
eliminado por completo por digestión junto con las enzimas de
restricción SacII/SacII y XhoI y sustituido por el fragmento
SacII-XhoI de 82 pb aislado del polienlazador
contenido en pBluescript. A este fragmento se le ha añadido un
nucleótido suplementario de tal manera que todos los fragmentos
FIPV clonados en pBluescript se sitúen en fase con la fase del gen
10. El nuevo plásmido se ha denominado pTOPE-SX. La
transcripción y la traducción in vitro con la ARN polimerasa
del fago T7 de los insertos contenidos en pTOPE-SX
permite obtener proteínas de fusión que contienen 260 aminoácidos
de la proteína del gen 10 seguidos de aminoácidos codificados por
los insertos FIPV.
Ejemplo
2
Con el objetivo de localizar la región general
del gen S del virus FIPV responsable de la neutralización y de la
potenciación, se han clonado fragmentos encabalgados de este gen
mediante PCR en el vector pBluescript bajo la forma de tres grandes
fragmentos (F1, F2 y F3; figura 1) y 12 pequeños subfragmentos (S1
a S12). A continuación se han subclonado estos insertos FIPV en el
vector pTOPE-SX para su transcripción y traducción
in vitro.
Las reacciones acopladas de transcripción y
traducción in vitro se han realizado utilizando el sistema
"TNT Reticulocyte Lisate" (Promega, Madison, WI) según la
técnica recomendada por el fabricante en presencia de
S^{35}-metionina (Amersham France). Para estudiar
el efecto de la maduración postraduccional de las proteínas, las
reacciones también se han realizado en presencia de membranas
microsomales pancreáticas de perro (Promega). Los productos de
traducción se han separado mediante electroforesis sobre un gel de
pliacrilamida-SDS y se han visualizado mediante
autorradiografía.
Los ensayos de radioinmunoprecipitación (RIPA)
se han efectuado mezclando 5 \mul de mezcla de traducción de la
proteína de fusión con 5 \mul de anticuerpo monoclonal o de suero
de gato en 200 \mul de tampón TNE Triton X-100
(NaCl 150 mM, Tris (pH 8,0) 50 mM, Triton X-100 al
0,1%) y agitando esta mezcla a +4°C durante una hora. Los sueros
de gato positivos y negativos para FIPV, así como un monoclonal
dirigido contra los 10 primeros aminoácidos de la proteína del gen
10 de T7 (anticuerpo monoclonal T7 Tag, Novagen), se han utilizado
como controles. Los inmunocomplejos son adsorbidos mediante la
adición de 50 \mul de un conjugado
agarosa-proteína A recombinante (Boehringer
Mannheim) en las muestras que contienen los sueros de gatos. Los
inmunocomplejos fijados en la agarosa han sido centrifugados
durante 30 s y se han lavado dos veces en tampón RIPA (NaCl 150 mM,
Tris 50 mM (pH 8,0), Triton X-100 al 1%,
desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS 5 0,1%) y una vez con el tampón
Tris-Triton (Tris 10 mM (pH 8,0), Triton
X-100 al 0,1%). A continuación se separan las
muestras centrifugadas mediante electroforesis. Los geles son
fijados y tratados con una solución de amplificación (Amersham) y
visualizados mediante
autorradiografía.
autorradiografía.
Los fragmentos grandes F1, F2 y F3 tienen un
tamaño aproximado de 62 kDa, lo que proporciona proteínas de
fusión de aproximadamente 90 kDa que se corresponden efectivamente
con los tamaños observados. Los fragmentos pequeños S1 a S12 tienen
tamaños aproximados de 18 kDa, lo que proporciona proteínas de
fusión de aproximadamente 46 kDa.
Para optimizar las condiciones de reconocimiento
de los péptidos de fusión FIPV S por parte de los anticuerpos
monoclonales, las proteínas de fusión también se han traducido en
presencia de membranas microsomales de páncreas de perro. La
glucosilación del extremo N-terminal de S (fragmento
F1) se traduce mediante un cambio del tamaño de la proteína de
fusión F1 de 90 kDa a 98 kDa o 145 kDa correspondientes
respectivamente a un crecimiento de 8 o de 55 kDa. También se
observa un aumento de 8 kDa para el tamaño del subfragmento S1, que
pasa de 48 a 54 kDa. El tamaño de los otros fragmentos FIPV S no se
modifica por la traducción efectuada en presencia de membranas
microsomales.
Los anticuerpos monoclonales específicos
anti-FIPV 23F4.5, 24H5.4 y 18A7.4 (Corapi W. y
otros, J. Virol. 1992, 66, 6695-6705) reconocen el
fragmento F2 y el subfragmento S6 que tienen en común una secuencia
de 165 aminoácidos (posiciones 509 a 673 en la secuencia de la
proteína S de la cepa 79-1146 (De Groot R. y otros,
J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646)). El
reconocimiento del fragmento F2 no mejora por la utilización de
proteínas traducidas en presencia de membranas microsomales, lo que
sugiere que la glucosilación no es necesaria para el reconocimiento
de los epítopos buscados.
Ejemplo
3
Para localizar los sitios antigénicos
localizados en el fragmento S6, se ha amplificado la región S6 de
algunos mutantes FIPV mar mediante PCR y se ha clonado en el
vector pBluescript SK+ y se ha secuenciado. La secuencia de
mutantes mar se ha establecido sobre mutantes mar
independientes obtenidos con el mismo monoclonal, así como con
clones obtenidos de amplificaciones PCR independientes con el mismo
mutante mar. La secuencia de cada clon se ha establecido en
las dos cadenas utilizando el kit Sequenase (Amersham) según la
técnica recomendada por el fabricante.
Las secuencias obtenidas se han comparado con la
secuencia homóloga del virus paterno 79-1146. Los
mutantes mar analizados son los mutantes identificados
mar 23F4.5, mar 18A7.4 y mar 24H5.4. Estos
mutantes se han obtenido respectivamente con los anticuerpos
monoclonales 23F4.5, 18A7.4 y 24H5.4 descritos por C. Olsen (Olsen
C. y otros, J. Virology 1992, 66, 956-965) y W.
Corapi (Corapi W. y otros, J. Virology 1992, 66,
6695-6705).
El monoclonal 23F4.5 posee un título
neutralizante de 20480 (Corapi, 1992) e induce una potenciación de
la infección in vitro de por lo menos 100 veces el nivel
normal (Olsen, 1992). El mutante mar 23F4.5 presenta
mutaciones en las posiciones 1840 y 2014 que inducen cambios de
aminoácidos en la secuencia de la proteína S para los restos 591
(Asp\rightarrowTyr) y 649 (Arg\rightarrowGly). El monoclonal
18A7.4 posee un título neutralizante de 5120 e induce una
potenciación de la infección in vitro de por lo menos 100
veces el nivel normal. El mutante mar 18A7.4 presenta
mutaciones en las posiciones 1772 y 2036 que inducen cambios de
aminoácidos por los restos 568 (Asp\rightarrowVal) y 656
(Arg\rightarrowLys).
El monoclonal 24H5.4 posee un título
neutralizante de 96 y tiene la particularidad que no induce
potenciación de la infección (Olsen, 1992). El mutante mar
24H5.4 presenta una sola mutación en la posición 1996 que induce
un cambio de aminoácido por el resto 643 (Asp\rightarrowTyr).
Ejemplo
4
El fragmento central del gen FIPV S
HindIII-HindIII de 1.723 pb (nucleótidos 1696 a
3418) se clona en el vector pBS-SK+ para dar el
plásmido pFIPV-S2. El sitio A1 se sitúa en el
subfragmento HindIII-SspI (posiciones 1696 a 1845)
de este fragmento. La mutagénesis del sitio A1 se lleva a cabo con
PCR utilizando la estrategia siguiente:
Se sintetizan los siguientes
oligonucleótidos:
OLIGO A11 (95 mer) (SEQ ID NO: 1) =
- 5'ATGAAGCTTAGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCGACACTAAGTAACATCACACTACCAATG CAGGATAACAATACTGTTGTGTACTGTATTCG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
OLIGO A12 (88 mer) (SEQ ID NO: 2) =
- 5'AAAAATATTGTACCATAAAGAACTTTTGCAAGTGGAATGAACATAAACTGAGAATTGGTTAGA ACGAATACAGTACACAACAGTATTG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
OLIGO A13 (20 mer) (SEQ ID NO: 3) =
- 5' ATGAAGCTTAGTGGTTATGG 3'
OLIGO A14 (20 mer) (SEQ ID NO: 4) =
- 5' AAAAATATTGTACCATAAAG 3'
Los oligonucleótidos A11 y A12 son híbridos
entre sí gracias a su secuencia complementaria en común de 23 pares
de bases. El híbrido obtenido así sirve entonces, tras la
elongación de sus extremos 3', de matriz para una reacción PCR
utilizando los oligonucleótidos A13 y A14. esta reacción de
amplificación con PCR permite obtener un fragmento de 159 pb. Este
fragmento es entonces digerido con las enzimas de restricción
HindIII y SspI para producir un fragmento
HindIII-SspI de 149 pb (fragmento A). Este
fragmento contiene el sitio Al modificado en dos posiciones (Val en
lugar de Asp en la posición 568 y Tyr en lugar de Asp en la posición
591). El plásmido pFIPV-S2 es digerido por HindIII
y digerido parcialmente por SspI para aislar el fragmento
SspI-HindIII de 1.569 pb (fragmento B) con
Geneclean (BI0101 Inc., La Jolla, Ca). El vector
pBS-SK+ es digerido por HindIII y desfosforilado
para producir el fragmento C (2.960 pb).
Entonces se ligan conjuntamente los fragmentos
A, B y C para producir el plásmido pFIPSA1*. Este plásmido
contiene el fragmento HindIII-HindII del gen FIPV S
modificado por dos aminoácidos del sitio A1.
A continuación se reconstituye el gen FIPV S
sustituyendo por simple clonación el fragmento natural
HindIII-HindIII (posiciones 1696 a 3418) por el
fragmento HindIII-HindIII contenido en el plásmido
pFIPSA1*. El gen completo FIPV S modificado en el sitio A puede
utilizarse entonces para la elaboración de plásmidos de expresión o
de virus recombinantes.
Ejemplo
5
Se sintetizan los oligonucleótidos
siguientes:
OLIGO A21 (20 mer) (SEQ ID NO: 5) =
- 5' GGACAATATTTTTAATCAAG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
OLIGO A22 (36 mer) (SEQ ID NO: 6) =
- 5' TTTAACAACCTGCTCATTGGTTCCTGTACGTGCAGC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
OLIGO A23 (36 mer) (SEQ ID NO: 7) =
- 5' AAGTTTTATGTTGCTGCACGTACAGGAACCAATGAG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
OLIGO A24 (20 mer) (SEQ ID NO: 8) =
- 5' ATCACTAACATTTTTAAAGC 3'
Se realiza una reacción PCR (PCR A) con los
oligonucleótidos A21 y A22 y con el plásmido
pFIPV-S2 como matriz para sintetizar un fragmento
PCR de 199 pb (fragmento A).
Se realiza una reacción PCR (PCR B) con los
oligonucleótidos A23 y A24 y con el plásmido
pFIPV-S2 como matriz para obtener un fragmento PCR
de 273 pb (fragmento B).
Los fragmentos PCR A y B son híbridos entre sí
gracias a su región complementaria de 46 pb y el producto de esta
hibridación, tras elongación de los extremos 3', es amplificado por
una reacción PCR (PCR C) con los oligonucleótidos A21 y A24 para
obtener un fragmento PCR de 424 pb. Este fragmento PCR es entonces
digerido por SspI y DraI para obtener el fragmento de restricción
SspI-DraI de 402 pb (fragmento C).
El plásmido pFIPV-S2 es digerido
por HindIII y SspI para aislar el fragmento
HindIII-SspI de 140 pb (fragmento D).
El plásmido pFIPV-S2 es digerido
por HindIII y DraI para aislar el fragmento de restricción
DraI-HindIII de 1.170 pb (fragmento E). El vector
pBS-SK+ es digerido por HindIII y desfosforilado
para obtener el fragmento F (2.960 pb).
Los fragmentos C, D, E y F se ligan
conjuntamente para obtener el plásmido pFIPSA2*. El fragmento
central HindIII-HindIII de 1.723 pb del gen FIPV S
contenido en pFIPSA2* posee un sitio A2 modificado a nivel de tres
aminoácidos (Tyr en lugar de Asp en la posición 643, Gly en lugar de
Arg en la posición 649, y Lys en lugar de Arg en la posición
656).
A continuación se reconstituye el gen FIPV S
sustituyendo por simple clonación el fragmento natural
HindIII-HindIII (posiciones 1696 a 3418) por el
fragmento HindIII-HindIII contenido en el plásmido
pFIPSA2*. El gen completo FIPV S modificado en el sitio A2 puede
utilizarse entonces para la elaboración de plásmidos de expresión o
de virus recombinantes.
Ejemplo
6
Los fragmentos A (ejemplo 4), C y E (ejemplo 5)
se ligan con el vector pBS-SK+, previamente
digerido por HindIII y desfosforilado, para obtener el plásmido
pFIPSA1*A2*. El fragmento central HindIII-HindIII de
1.723 pb del gen FIPV S contenido en pFIPSA1*A2* presenta dos
cambios de aminoácidos a nivel del sitio Al (ver ejemplo 4) y tres
cambios de aminoácidos a nivel del sitio A2 (ver ejemplo 5).
A continuación se reconstituye el gen FIPV S
sustituyendo por clonación simple el fragmento natural
HindIII-HindIII por el fragmento
HindIII-HindIII de 1.723 pb contenido en
pFIPSA1*A2*. El gen completo FIPV S que comprende modificaciones a
nivel de los sitios A y A2 puede utilizarse entonces para la
elaboración de plásmidos de expresión o de virus recombinantes.
Ejemplo
7
Según la estrategia de clonación descrita
anteriormente (mutagénesis mediante utilización de reacciones PCR),
pueden introducirse deleciones que respeten la fase de lectura del
gen FIPV S a nivel de los sitios A y/o A2. Según el mismo esquema
descrito anteriormente (ver ejemplo 6), puede elaborarse un
fragmento central HindIII-HindIII del gen FIPV S que
presente una deleción en el sitio A1 y/o una deleción en el sitio
A2.
<110> MERIAL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna peritonitis infecciosa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FIPV
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 95 929 143.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
28-08-1995
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 94/103739
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-08-1994
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión 3.2 de la patente
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaagctta gtggttatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaatattg taccataaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacaatatt tttaatcaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttaacaacc tgctcattgg ttcctgtacg tgcagc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagttttatg ttgctgcacg tacaggaacc aatgag
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido como cebador de la
PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcactaaca tttttaaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Ácido nucleico que codifica una proteína S
del virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), modificada
para que no induzca anticuerpos potenciadores, que comprende:
- (a)
- por lo menos una deleción parcial que comprende los aminoácidos Asp 568 y/o Asp 591 de la región antigénica A1 de la proteína S, región delimitada por los aminoácidos Met 562 a Cys 598 y por lo menos una modificación en los nucleótidos que codifican para la región antigénica A2 de la proteína S, región delimitada por los aminoácidos Gly 637 a Tyr 622, o
- (b)
- una mutación de por lo menos uno, y preferentemente los dos, de los codones que codifican Asp 568 y Asp 591 de dicha región antigénica A1 para tener cualquier otro aminoácido en esta posición y por lo menos una modificación en los nucleótidos que codifican dicha región antigénica A2, o
- (c)
- por lo menos una mutación de cualquier aminoácido de dicha región antigénica A1, con la condición de que los aminoácidos Asp 568 y Asp 591 ya no sean Asp, y por lo menos una modificación en los nucleótidos que codifican dicha región antigénica A2, o
- (d)
- una deleción parcial de la región antigénica A1 que comprende el aminoácido Asp 568, o
- (e)
- una deleción parcial de la región antigénica A1 que comprende los aminoácidos Asp 568 y Asp 591, o
- (f)
- una mutación para el codón que codifica Asp 568 y Asp 591 de dicha región antigénica A, o
- (g)
- por lo menos una mutación de cualquier aminoácido de dicha región antigénica A1, con la condición de que los aminoácidos Asp 568 y Asp 591 ya no sean Asp, o
- (h)
- por lo menos una modificación en los nucleótidos que codifican dicha región antigénica A2 prevista en a), b), c) o h) que comprende como mínimo una mutación de por lo menos uno, y preferiblemente los tres, de los codones para Asp 643, Arg 649 y Arg 656 para tener cualquier otro aminoácido en estas posiciones, es decir una deleción parcial que comprende los aminoácidos Asp 643, Arg 649 y/o Arg 656.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que los nucleótidos que codifican la región antigénica A2 son
eliminados.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2,
que comprende una mutación de por lo menos uno de los codones que
codifican Asp 568 y Asp 591, el codón mutado que codifica otro
aminoácido.
4. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 3, que comprende una deleción de por lo
menos uno de los codones que codifican Asp 568 y Asp 591.
5. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende por lo menos una deleción que
incluye por lo menos uno de los codones que codifican Asp 568 y Asp
591.
6. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3 a 5, que comprende una mutación de por lo
menos uno de los codones que codifican Asp 643, Arg 649 y Arg 656,
el codón mutado que codifica para otro amino-
ácido.
ácido.
7. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3 a 5, que comprende una deleción de por lo
menos uno de los codones que codifican Asp 643, Arg 649 y Arg
656.
8. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3 a 5, que comprende por lo menos una deleción
que incluye por lo menos uno de los codones que codifican Asp 643,
Arg 649 y Arg 656.
9. Polipéptido codificado por una secuencia
nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Virus recombinante o un plásmido que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica y expresa el
polipéptido de la reivindicación 9.
11. Vacuna que comprende un virus recombinante
que contiene y expresa una secuencia nucleotídica según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, para la vacunación de un gato contra
el FIPV.
12. Vacuna según la reivindicación 11, en la que
el virus recombinante es un poxvirus, un herpesvirus o un
adenovirus recombinante.
13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que
el poxvirus recombinante es un virus de la vacuna recombinante o
un virus canarypox recombinante.
14. Vacuna según la reivindicación 12, en la que
el herpesvirus recombinante es un herpesvirus felino
recombinante.
15. Vacuna que comprende un plásmido que
contiene y expresa una secuencia nucleotídica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en un vehículo susceptible de permitir
la inyección directa del plásmido en el gato, para la vacunación de
un gato contra el FIPV.
16. Vacuna según la reivindicación 15, en la que
el plásmido comprende dicha secuencia nucleotídica bajo el control
del promotor HCMV IE y/o de un promotor SV40.
17. Vacuna que comprende un polipéptido según la
reivindicación 9.
18. Vacuna según la reivindicación 17, que
comprende además otra proteína de FIVP.
19. Vacuna según la reivindicación 17, que
comprende además la proteína M de FIPV.
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