ES2251910T3 - Procedimiento para la determinacion de la actividad de la proteasa activadora del factor vii en soluciones proteinicas. - Google Patents
Procedimiento para la determinacion de la actividad de la proteasa activadora del factor vii en soluciones proteinicas.Info
- Publication number
- ES2251910T3 ES2251910T3 ES00111738T ES00111738T ES2251910T3 ES 2251910 T3 ES2251910 T3 ES 2251910T3 ES 00111738 T ES00111738 T ES 00111738T ES 00111738 T ES00111738 T ES 00111738T ES 2251910 T3 ES2251910 T3 ES 2251910T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protease
- activity
- determination
- procedure
- factor vii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96447—Factor VII (3.4.21.21)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/966—Chemistry: molecular biology and microbiology involving an enzyme system with high turnover rate or complement magnified assay, e.g. multi-enzyme systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento para la determinación de la actividad de la proteasa activadora del factor de coagulación sanguínea VII en soluciones proteínicas, caracterizado porque - la solución proteínica que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, a la que se ha acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa y - después del lixiviado de la fase sólida la proteasa fijada a la misma y/o su proenzima se incuban con reactivos, que permiten su determinación de actividad.
Description
Procedimiento para la determinación de la
actividad de la proteasa activadora del factor VII en soluciones
proteínicas.
El objeto de la invención es un procedimiento
para la determinación cualitativa y cuantitativa de la proteasa
activadora del factor VII en soluciones proteínicas complejas como
plasma.
De la solicitud de patente alemana 199 03 693.4
se conocen ya sistemas de pruebas y procedimientos para la
comprobación cualitativa y cuantitativa de una proteasa, que activa
el factor de coagulación de la sangre VII. Estos comprenden
procedimientos de pruebas cromógenos, que se basan en el
desdoblamiento de sustratos peptídicos marcados, de bajo peso
molecular y en la determinación fotométrica de la extinción que con
ello se produce, además de procedimientos de pruebas en los que se
aprovechan las características biológicas de la citada proteasa. Con
ello puede verificarse la proteasa o su proenzima, por medio de que
presenta
- a)
- una acción inactivadora de los factores de coagulación sanguínea VIII/VIIIa o V/Va o
- b)
- en pruebas de coagulación globales una acción reductora de los tiempos de coagulación sanguínea o
- c)
- una acción activadora de activadores de plasminógenos o
- d)
- una acción activadora del FVII.
Sin embargo, la determinación de la actividad del
activador de FVII conduce en el caso de los factores de
determinación usados hasta ahora a resultados fiables, sólo si la
proteasa se presenta en estado limpio o enriquecido y ninguna
influencia perturbadora de impurezas falsea el resultado de la
medición. Evidentemente, las mezclas proteínicas muy complejas como
plasma o fluidos de tejido contienen ahora una multitud de
proteínas, que pueden impedir o al menos perturbar una determinación
específica del activador del factor VII. Aparte de esto la proteasa
se presenta en el plasma sobre todo como proenzima, según el estado
actual de la ciencia, de tal modo que es necesaria una activación
para conseguir una proteasa activa, con el fin de obtener a
continuación una determinación de la actividad.
La proteasa activadora del factor VII es una
proteína del plasma, que participa en la regulación de la
hemostasia, sobre todo mediante la contribución en procesos de
coagulación y fibrinólisis. Por ello tiene un gran interés la
investigación del funcionamiento y de la actividad biológica de la
proteasa. De este modo, por ejemplo, un menor contenido de antígenos
y/o una perturbación de la actividad biológica, por ejemplo a causa
de una mutación genética, podría indicar un mayor riesgo de
trombosis. Por ello se ha impuesto la misión de desarrollar un
procedimiento que haga posible la determinación más sencilla y
específica posible de una o más actividades biológicas de la
proteasa activadora del factor VII. Debido a que la tarea
fisiológica de esta proteasa sigue sin estar clara hasta ahora, este
método debería permitir principalmente la determinación de varias
actividades.
Ahora se ha descubierto que estos requisitos se
cumplen mediante un procedimiento para determinar la actividad de la
proteasa activadora del factor de coagulación sanguínea VII en
soluciones proteínicas, en el que
- -
- la solución proteínica que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, a la que se ha acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa y
- -
- después del lixiviado de la fase sólida las proteasas fijadas a la misma y/o su proenzima se incuban con reactivos, que permiten su determinación de actividad.
Este procedimiento de determinación no sólo puede
aplicarse, de forma sorprendente, a la proteasa en su forma
activada. Aunque de los resultados investigativos actuales puede
concluirse que la proteasa en el plasma circula fundamentalmente
como proenzima y por tanto cabía esperar que ésta, después de
enlazar con la fase sólida antes citada, tuviera todavía que
activarse para poder desplegar después sus actividades biológicas,
ha quedado ahora demostrado de forma sorpresiva que una activación
de este tipo no es necesaria, sino que la proenzima procedente del
plasma ligada a la fase sólida desarrolla su actividad biológica en
forma inmovilizada en la misma forma que la enzima activa. Por medio
de esto puede prescindirse de un paso de activación específico y se
hace posible una determinación mucho más rápida y sin
perturbaciones.
Sin embargo puede conectarse todavía
perfectamente una activación específica de la proenzima, para
garantizar que se ha activado la proenzima ligada.
Como fase sólida entran en consideración las
matrices conocidas por el especialista como Sepharose® o Fraktogel®
activadas. De forma ventajosa se recubren placas microtiter con
anticuerpos dirigidas hacia la proteasa, que pueden tener una
procedencia policlonal o monoclonal. También pueden utilizarse
fragmentos de anticuerpos como F(ab) o
F(ab)_{2}. Al contrario que en la prueba de
antígenos, en la que se utiliza un anticuerpo secundario marcado
para detección y después también para cuantificación, se adicionan
conforme a la invención sustratos cromogénicos, que permiten la
determinación de actividad de la proteasa. Un sustrato cromogénico
especialmente preferido es S22888 de cromogenix AB
(H-D-isoleucil-L-prolil-L-arginin-pNA
x 2 HCI) que, al igual que enlaces similares, muestra un aumento
significativo dependiente de la concentración y de la duración de la
absorción mediante amidólisis del sustrato. La proteasa mantiene
sorpresivamente sus actividades y características biológicas
incluso tras enlazarse con los anticuerpos, precisamente la
capacidad de activar FVII y activadores de plasminógenos. Por medio
de esto se hace posible la determinación específica de la
funcionalidad de la proteasa a partir de una solución proteínica
compleja.
Aparte de los sustratos cromogénicos, para la
determinación de actividad son también adecuados los restantes
sustratos citados en la solicitud de patente alemana 199 03 693.4,
es decir, la inactivación de los factores de coagulación sanguínea
VIII/VIIIa o V/Va y también la activación del FVII y de los
activadores de plasminógenos. Con ello puede determinarse por
ejemplo la porción así activada de factor VII mediante una
amidólisis directa de un sustrato cromogénico específico para el
FVII o mediante una reacción acoplada como la llamada prueba
FVIIa-rTF. La activación de los activadores de
plasminógenos monocadena scuPA (single chain urokinase plasminogen
activator) o del sctPA (single chain tissue plasminogen activator)
puede proseguirse sencillamente mediante adición de sustratos como
por ejemplo S2444
(piroGlu-Gli-Arg-pNA
x HCI). Como se ha descrito en la solicitud de patente alemana 199
03 693.4, para la verificación también pueden adicionarse sustancias
que estimulen la actividad de la proteasa, por ejemplo sales de
calcio solubles y/o heparina o sustancias derivadas de la heparina
como dextransulfato.
Ulteriores investigaciones de soluciones, fluidos
corporales y extractos de células o tejidos con ayuda del
procedimiento descrito han mostrado su adecuación para la detección
o cuantificación de la proteasa activadora del FVII. Dentro de los
mismos deben entenderse las soluciones que contienen esta proteasa,
como producto intermedio para preparar la proteasa, sobrantes de
cultivos celulares, que aparecen también en el caso de la
fermentación de células correspondientes para la expresión
recombinadora. Dentro de los mismos deben entenderse también
soluciones que aparecen en el caso de la producción transgénica de
la proteasa o de la proenzima, como leche.
Aparte de esto el procedimiento es apropiado para
determinar la actividad de la proteasa activadora del FVII en
extractos de tejidos o células, que ofrece una impresión sobre la
presencia de la actividad de la proteasa o sobre estados patológicos
potenciales en caso de sobre o sub-expresión.
Tiene un interés especial la verificación de las
actividades de la proteasa en fluidos corporales, como sangre y
plasma, plasma seminal, orina, líquido de la espina cerebral, lavado
bronquioalveolar, líquido amniótico, saliva o fluido lacrimal. El
sistema de determinación de antígenos citado en la solicitud de
patente alemana 199 03 693.4 (por ejemplo ELISA) representa con ello
un valioso complemento a la prueba de actividad, ya que con ayuda de
ambos parámetros puede obtenerse un cuadro más amplio, por ejemplo
en el caso de una enfermedad.
Mediante la investigación de donantes de sangre
sanos quedó demostrado que aproximadamente el 5-10%
de los plasmas investigados presentan una actividad de proteasa
claramente inferior (aproximadamente el 30-50% del
"valor promedio") con relación a un patrón (plasmas de
agrupación), como se ha explicado con más detalle en el ejemplo 1.
Esta información se ha complementado por medio de que casi todos
estos donantes presentaron contenidos de antígenos dentro de un
margen normal. Esto podría indicar por ejemplo mutación o mutaciones
(heterozigóticas), que influiría(n) de forma correspondiente
en la actividad, aunque no en el contenido de antígenos, de una
muestra de plasma. En consecuencia, estos donantes podrían
representar un grupo de riesgo para determinadas enfermedades y,
dado el caso, podrían tomarse a tiempo medidas profilácticas. Esto
es aplicable para personas que presentan un nivel de actividad tanto
aumentado como reducido. Hemos encontrado actividades
significativamente aumentadas de esta proteasa (en el caso de un
contenido de antígenos parcialmente normal o ligeramente aumentado)
en plasmas de pacientes con infartos de miocardio (véase también el
ejemplo 2) y anginas de pecho estables o inestables en comparación
con un colectivo de donantes sanos. Hasta ahora todavía no se ha
aclarado si un aumento de la actividad de la proteasa puede
valorarse como una causa de esta enfermedad o si ésta se corresponde
más bien con una contra-reacción del cuerpo, en el
sentido de una trombolisis aumentada.
Con independencia de la relevancia fisiológica de
las mayores actividades de la proteasa, este parámetro puede
utilizarse para una detección temprana y como criterio de una
modificación del cuadro de la enfermedad. Esto engloba el
diagnóstico de otras complicaciones asociadas a la circulación
coronaria.
Más allá de estas indicaciones, el sistema de
pruebas descrito (también en combinación con una determinación de
antígenos) puede utilizarse para el diagnóstico y el seguimiento de
terapias incluso en el caso de enfermedades malignas, inflamaciones,
enfermedades auto-inmunes, vasculitis, defectos
respiratorios o para un diagnóstico de hemostasia (coagulación y
fibrinolisis), además de en caso de sepsis y reacciones asociadas,
como la coagulación intravasal diseminada. Otros campos aplicativos
comprenden el diagnóstico de defectos orgánicos como enfermedades
cerebrales, respiratorias y renales. En pacientes con cirrosis
hepática hemos encontrado actividades significativamente reducidas
de la proteasa que, en la mayoría de los casos, estaban ligadas a
niveles de antígenos reducidos.
Otras investigaciones han mostrado que, aparte de
un moderado ascenso del nivel de antígenos en el plasma de
embarazadas sanas, puede observarse un claro aumento de la actividad
de proteasa en el transcurso de embarazos, con valores máximos en el
tercer trimestre. La falta de un aumento de este tipo de la proteasa
puede estar ligada a un riesgo para la madre y el bebé durante el
embarazo, como complicaciones tromboembólicas, etc. hasta llegar a
partos prematuros y defectuosos o bien malformaciones del feto.
La invención se explica mediante los siguientes
ejemplos:
Las placas de microtitulación (96 pocillos) se
recubrieron con un anticuerpo monoclonal con relación al activador
de FVII, pipeteando en cada pocillo 150 \mul de una solución con
contenido de 10 \mug/ml. Después de una incubación de 16 horas a
temperatura ambiente se lavó la placa varias veces. En los pocillos
se pipetearon en cada caso 100 \mul de concentraciones en aumento
de proteasa limpia o diferentes diluciones de un plasma humano
estándar (SHPL). Después de la incubación a 37ºC se eliminaron las
soluciones mediante varios lavados y se determinaron las
actividades.
En cada pocillo se pipetearon 50 \mul de una
solución de prouroquinasa (10 \mug/ml, American Diagnostica,
EE.UU.) y 50 \mul de tampón, que contenía CaCl_{2} 30 mM de y
100 UI/ml de heparina. Dos minutos más tarde se añadieron otros 100
\mul de tampón y 25 \mul del sustrato S2444 (3 mM). Se
estableció el aumento de la absorción en 405 nm por minuto.
| Proteasa, purificada | \Delta mOD/min | SHPL (dilución) | \Delta mOD/min |
| (\mug/ml) | |||
| 0 | 0,4 | Tampón | 0,4 |
| 0,1 | 7 | 1:200 | 0,4 |
| 0,2 | 12 | 1:100 | 0,9 |
| 0,4 | 18 | 1:50 | 7,5 |
| 0,6 | 22 | 1:33,3 | 8,4 |
| 0,8 | 24 | 1:25 | 15,2 |
| 1,0 | 27 | 1:20 | 24,8 |
| 2,0 | 34 | 1:10 | 31,2 |
El recubrimiento de las placas de microtitulación
y la incubación con las soluciones de muestra se llevaron a cabo
como se ha descrito en el Ejemplo 1. En lugar de la activación de la
pro-uroquinasa se determinó la activación del factor
VII. Para esto se añadieron a los pocillos de la placa en cada caso
50 \mul de tampón, conteniendo CaCl_{2} 30 mM y 100 UI/ml de
heparina, durante 2 minutos a temperatura ambiente. Después de la
adición de otros 100 \mul de tampón y 25 \mul de
Spectrozym\registrado Vila (3 mM, American Diagnostica/EE.UU.) se
determinó el \Delta mOD/min.
| Proteasa, purificada | \Delta mOD/min | SHPL (dilución) | \Delta mOD/min |
| (\mug/ml) | |||
| 0 | 0,3 | Tampón | 0,3 |
| 0,2 | 1,8 | 1:100 | 0,3 |
| 0,4 | 2,8 | 1:50 | 0,3 |
| 0,6 | 3,0 | 1:33,3 | 0,8 |
| 0,8 | 3,6 | 1:25 | 3,2 |
| 1,0 | 4,7 | 1:20 | 7,2 |
| 1,5 | 7,1 | 1:13,3 | 8,4 |
| 2,0 | 7,9 | 1:10 | 11,5 |
Con ayuda de estas series de diluciones es
posible comparar plasmas individuales y determinar la funcionalidad
de la proteasa. Mediante la comparación con un plasma humano
estándar, que representa una agrupación de cientos de plasmas
aislados, pueden detectarse importantes desviaciones de la norma. La
actividad así establecida debería disponerse idealmente en relación
al contenido de antígenos, que puede determinarse por ejemplo por
medio de ELISA.
Si se conoce la cantidad de proteasa puede
determinarse la actividad específica de la proteasa contenida en la
solución proteínica y su proenzima.
Se investigaron 190 plasmas de citrato de
personas sanas, de ellas 140 hombres y 50 mujeres, con ayuda de la
prueba de actividad descrita. Para determinar si las actividades que
varían potencialmente respecto al valor promedio de todos los
plasmas investigados están ligadas a una modificación
correspondiente del nivel de antígenos de la proteasa, se utilizó
una ELISA como se describe en la solicitud de patente alemana 199
03 693.4. Un ELISA de este tipo para verificar la proteasa como
antígenos puede ejecutarse con ayuda de anticuerpos específicos
monoclonales o policlonales contra esta proteasa.
La figura (1) muestra las actividades de la
proteasa de los hombres (A) y mujeres (B) sanos investigados. Queda
claro que el 5-10% tanto de hombres como mujeres
presenta una actividad claramente reducida con respecto a la
media.
Las actividades de la proteasa (eje y) y el nivel
de antígenos perteneciente a las mismas de las personas
correspondientes (eje x) se han representado en la figura. Los
"márgenes normales" arbitrarios del nivel de antígenos y
actividad se muestran en cada caso mediante líneas horizontales y
verticales como límites superiores e inferiores de los parámetros.
Los rectángulos que se obtienen de ello (en cada caso en el centro
de la figura) representan según esto los "márgenes normales"
de donantes sanos. Aquí queda de nuevo especialmente claro que la
mayoría de las muestras con actividad reducida no estaban ligadas a
una reducción correspondiente del nivel de antígenos. Esto podría
indicar una reducción correspondiente del nivel de antígenos, es
decir, por ejemplo podría estar modificado aproximadamente el 50%
de las moléculas de proteasa mediante una o varias mutaciones, de
tal modo que ya no queda garantizada una reacción con sustratos
biológicos. En el caso de un significado fibrinolítico de la
proteasa esto podría estar ligado a un riesgo de trombosis (o para
otras enfermedades, etc.) de esta población actualmente todavía
"sana". Aunque en la menor parte de las muestras investigadas
los valores de la menor actividad de proteasa, que están acompañados
perfectamente de un menor contenido de antígenos, pueden valorarse
como no menos interesantes, ya que se produce visiblemente una
desregulación de la disponibilidad plasmática de la proteasa, que
puede estar ligada a un riesgo comparable al descrito.
La detección de la actividad de la proteasa,
incluso en unión a la determinación de antígenos, debe verse de
forma correspondiente como un parámetro para la detección temprana y
el control de la profilaxis/terapia.
Se ensayaron plasmas de citrato de mujeres
embarazadas, como se ha descrito en el Ejemplo 3. Se obtuvieron
muestras en diferentes momentos del embarazo y se investigaron a
continuación.
Los desarrollos de dos embarazos no problemáticos
se han representado en la tabla 1. Puede reconocerse un aumento
claro de la actividad de la proteasa conforme en el transcurso del
embarazo, mientras que por el contrario los contenidos de antígenos
de la proteasa no han aumentado o sólo lo han hecho moderadamente.
La falta de esta mayor actividad podría estar ligada a problemas
para la madre y el feto.
Las mujeres sanas (no embarazadas) muestran por
el contrario un desarrollo continuo de las actividades de la
proteasa (ni mayor ni menor, en el marco de las oscilaciones de la
prueba) durante un periodo de observación correspondiente (no
representado).
Los datos porcentuales se refieren a los valores
promedio de mujeres sanas (no embarazadas).
| Antígenos (%) | Actividad (%) | |||
| Trimestre del embarazo | Embarazadas | Embarazadas | ||
| 1 | 2 | 1 | 2 | |
| I | 103 | 105 | 110 | 115 |
| II | 118 | 123 | 158 | 176 |
| III | 126 | 143 | 215 | 280 |
Se obtuvieron plasmas de 54 pacientes con infarto
de miocardio agudo durante su ingreso (antes del tratamiento
intensivo) en el centro de urgencias y se utilizaron para la
analítica de rutina. Posteriormente se utilizaron restos de plasma
(partes alícuotas no descongeladas) para cuantificar las actividades
de la proteasa (y contenidos de antígenos).
La figura (2) reúne los resultados de la
investigación. Con respecto a un colectivo de donantes sanos (B)
pueden medirse en los plasmas de pacientes con infarto de miocardio
agudo (A) unas actividades de proteasa significantemente mayores (y
también de los contenidos de antígenos).
Estos parámetros para la detección temprana de un
infarto pueden utilizarse de forma correspondiente, es decir,
también en el caso de angina de pecho estable o inestable. En el
caso de pacientes con estas enfermedades coronarias del corazón
encontramos igualmente como promedio actividades significativamente
mayores. La magnitud de los valores medidos puede hacer posible una
valoración del grado de gravedad de la enfermedad o bien, en el
transcurso de una profilaxis y terapia de infarto y angina de pecho,
ofrecer valiosas indicaciones sobre el estado del paciente. Aparte
de esto, estos parámetros pueden utilizarse para evaluar otras
complicaciones asociadas al sistema circulatorio del corazón.
Claims (4)
1. Procedimiento para la determinación de la
actividad de la proteasa activadora del factor de coagulación
sanguínea VII en soluciones proteínicas, caracterizado
porque
- -
- la solución proteínica que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, a la que se ha acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa y
- -
- después del lixiviado de la fase sólida la proteasa fijada a la misma y/o su proenzima se incuban con reactivos, que permiten su determinación de actividad.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la actividad de la proteasa se mide
mediante una determinación fotométrica de la extinción que se
produce al influir en los sustratos cromogénicos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la actividad de la proteasa se mide
mediante
- -
- su acción inactivadora de los factores de coagulación sanguínea VIII/VIIIa o V/Va o
- -
- su acción acortadora de los tiempos de coagulación sanguínea en pruebas de coagulación globales o
- -
- su acción activadora de activadores de plasminógenos o
- -
- su acción activadora del FVII.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque el anticuerpo dirigido contra la
proteasa es un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento de
anticuerpos F(ab) o F(ab)_{2}.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19926531 | 1999-06-10 | ||
| DE19926531 | 1999-06-10 | ||
| DE10023923 | 2000-05-17 | ||
| DE10023923A DE10023923A1 (de) | 1999-06-10 | 2000-05-17 | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2251910T3 true ES2251910T3 (es) | 2006-05-16 |
Family
ID=26005695
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00111738T Expired - Lifetime ES2251910T3 (es) | 1999-06-10 | 2000-06-02 | Procedimiento para la determinacion de la actividad de la proteasa activadora del factor vii en soluciones proteinicas. |
| ES05023845.0T Expired - Lifetime ES2467091T3 (es) | 1999-06-10 | 2000-06-02 | Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII a partir de soluciones de proteínas |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05023845.0T Expired - Lifetime ES2467091T3 (es) | 1999-06-10 | 2000-06-02 | Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII a partir de soluciones de proteínas |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030124622A1 (es) |
| EP (2) | EP1059359B1 (es) |
| JP (2) | JP4782911B2 (es) |
| KR (1) | KR100788177B1 (es) |
| AT (1) | ATE315100T1 (es) |
| AU (1) | AU782577B2 (es) |
| CA (1) | CA2311479C (es) |
| DE (2) | DE10023923A1 (es) |
| DK (1) | DK1624072T3 (es) |
| ES (2) | ES2251910T3 (es) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19903693A1 (de) * | 1998-04-24 | 1999-10-28 | Centeon Pharma Gmbh | Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII |
| DE10023923A1 (de) * | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen |
| DE10036641A1 (de) * | 2000-07-26 | 2002-02-14 | Aventis Behring Gmbh | Monoklonale Antikörper für die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease (FSAP)und ihre Verwendung |
| ATE318315T1 (de) | 2000-07-26 | 2006-03-15 | Zlb Behring Gmbh | Mutanten der den faktor vii aktivierenden protease und nachweisverfahren mit spezifischen antikörpern |
| DE10238429A1 (de) * | 2002-03-19 | 2003-10-30 | Aventis Behring Gmbh Intellect | Marburg I Mutante der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) als Risikofaktor für Atherosklerose |
| US7153679B2 (en) | 2000-07-26 | 2006-12-26 | Aventis Behring Gmbh | Marburg I mutant of factor VII activating protease (FSAP) as risk factor for arterial thrombosis |
| DE10148037A1 (de) * | 2001-09-28 | 2003-04-17 | Aventis Behring Gmbh | Verwendung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease zur Prophylaxe und Therapie von vaso-proliferativen Erkrankungen |
| DE10205520A1 (de) * | 2002-02-08 | 2003-08-14 | Aventis Behring Gmbh | Inhibitorischer, monoklonaler Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease |
| US7473548B2 (en) * | 2003-04-25 | 2009-01-06 | Medtronic, Inc. | Optical detector for enzyme activation |
| DE102005026163A1 (de) | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Dade Behring Marburg Gmbh | Gegen den Marburg I Polymorphismus der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung |
| ATE446377T1 (de) | 2005-12-22 | 2009-11-15 | Siemens Healthcare Diagnostics | Diagnostisches verfahren zur erkennung von trägern der marburg l-variante der faktor vii- aktivierenden protease (fsap) anhand differenzieller modulation der fsap-aktivität |
| AT504443B1 (de) * | 2006-10-19 | 2008-11-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 |
| EP2077119A1 (de) * | 2007-12-21 | 2009-07-08 | Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. | Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen |
| EP2333555A1 (de) * | 2009-12-09 | 2011-06-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heterogener Gerinnungstest |
| EP2386652A1 (de) | 2010-05-12 | 2011-11-16 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Homogenes Verfahren zur Bestimmung der Plasminogenaktivator-aktivierenden Aktivität der FSAP |
| EP3486656A1 (en) * | 2011-07-07 | 2019-05-22 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Assay |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2504921A1 (fr) | 1981-04-30 | 1982-11-05 | Choay Sa | Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine et procede de preparation de ce nouveau complexe |
| GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US5175087A (en) * | 1987-07-06 | 1992-12-29 | Biopool International, Inc. | Method of performing tissue plasminogen activator assay |
| WO1990003577A1 (en) * | 1988-09-30 | 1990-04-05 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Immunoassays for catalytically-active, serine proteases |
| JP3055933B2 (ja) | 1989-07-20 | 2000-06-26 | アナリティカル・コントロール・システムズ・インコーポレーテッド | 改良された安定な凝固対照 |
| JPH04361986A (ja) * | 1991-06-11 | 1992-12-15 | Ohbayashi Corp | タワークレーンの据付構台 |
| US6159938A (en) * | 1994-11-21 | 2000-12-12 | Cortech, Inc. | Serine protease inhibitors comprising α-keto heterocycles |
| DE19538716A1 (de) * | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Quantifizierung von aktiviertem Gerinnungsfaktor VII (FVIIa) |
| US5874256A (en) * | 1995-06-06 | 1999-02-23 | Rijks Universiteit Leiden | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same |
| DE19903693A1 (de) | 1998-04-24 | 1999-10-28 | Centeon Pharma Gmbh | Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII |
| DE19937219A1 (de) * | 1999-08-06 | 2001-02-08 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie |
| DE10023923A1 (de) | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen |
| DE19937218A1 (de) * | 1999-08-06 | 2001-02-08 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Affinitätschromatographie |
| ATE318315T1 (de) * | 2000-07-26 | 2006-03-15 | Zlb Behring Gmbh | Mutanten der den faktor vii aktivierenden protease und nachweisverfahren mit spezifischen antikörpern |
| EP1226829B1 (de) * | 2001-01-08 | 2008-06-11 | CSL Behring GmbH | Stabilisierte Flüssigzubereitung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms |
| DE10148037A1 (de) * | 2001-09-28 | 2003-04-17 | Aventis Behring Gmbh | Verwendung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease zur Prophylaxe und Therapie von vaso-proliferativen Erkrankungen |
| DE10205520A1 (de) * | 2002-02-08 | 2003-08-14 | Aventis Behring Gmbh | Inhibitorischer, monoklonaler Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease |
-
2000
- 2000-05-17 DE DE10023923A patent/DE10023923A1/de not_active Withdrawn
- 2000-06-02 DE DE50012002T patent/DE50012002D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-02 EP EP00111738A patent/EP1059359B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-02 EP EP05023845.0A patent/EP1624072B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-02 ES ES00111738T patent/ES2251910T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-02 ES ES05023845.0T patent/ES2467091T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-02 AT AT00111738T patent/ATE315100T1/de active
- 2000-06-02 DK DK05023845.0T patent/DK1624072T3/da active
- 2000-06-09 AU AU39410/00A patent/AU782577B2/en not_active Ceased
- 2000-06-09 KR KR1020000031726A patent/KR100788177B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-12 JP JP2000174893A patent/JP4782911B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-12 CA CA2311479A patent/CA2311479C/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-11-04 US US10/287,047 patent/US20030124622A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-06-06 US US12/155,619 patent/US7892842B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-03-04 JP JP2011047373A patent/JP4825316B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011103902A (ja) | 2011-06-02 |
| DE50012002D1 (de) | 2006-03-30 |
| CA2311479A1 (en) | 2000-12-10 |
| ATE315100T1 (de) | 2006-02-15 |
| EP1059359B1 (de) | 2006-01-04 |
| ES2467091T3 (es) | 2014-06-11 |
| EP1059359A3 (de) | 2002-08-14 |
| EP1624072A1 (de) | 2006-02-08 |
| EP1624072B1 (de) | 2014-04-02 |
| AU782577B2 (en) | 2005-08-11 |
| US20030124622A1 (en) | 2003-07-03 |
| DE10023923A1 (de) | 2000-12-14 |
| DK1624072T3 (da) | 2014-06-30 |
| US20090087864A1 (en) | 2009-04-02 |
| KR20010049517A (ko) | 2001-06-15 |
| KR100788177B1 (ko) | 2007-12-26 |
| JP2001029098A (ja) | 2001-02-06 |
| AU3941000A (en) | 2000-12-14 |
| JP4782911B2 (ja) | 2011-09-28 |
| CA2311479C (en) | 2011-05-10 |
| JP4825316B2 (ja) | 2011-11-30 |
| EP1059359A2 (de) | 2000-12-13 |
| US7892842B2 (en) | 2011-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4825316B2 (ja) | タンパク質溶液からｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼの活性を測定する方法 | |
| Merskey et al. | Quantitative estimation of split products of fibrinogen in human serum, relation to diagnosis and treatment | |
| Seligsohn et al. | Activation of human factor VII in plasma and in purified systems: roles of activated factor IX, kallikrein, and activated factor XII | |
| ES2262264T3 (es) | Proteasa para activar el factor de coagulacion vii. | |
| US20100324114A1 (en) | Methods and kits to detect hereditary angioedema type III | |
| AU2008315938B2 (en) | Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them | |
| Josso et al. | Congenital abnormality of the prothrombin molecule (factor II) in four siblings: prothrombin Barcelona | |
| US20080268483A1 (en) | Methods for a Global Assay of Coagulation and Fibrinolysis | |
| Geng et al. | A sequential mechanism for exosite-mediated factor IX activation by factor XIa | |
| Holmberg et al. | Studies of the blood plasminogen activator induced by 1-desamino-8-D-arginine vasopressin with observations in von Willebrand's disease | |
| Dempfle et al. | Comparison of immunological and functional assays for measurement of soluble fibrin | |
| España et al. | Assay of protein C in human plasma: comparison of amidolytic, coagulation, and immunochemical assays | |
| EP1962091B1 (en) | Methods and kits for detecting and measuring ADAMTS13/FX1 complexes | |
| EP1774327B1 (en) | Methods and kits for measuring adamts13/fxi complexes | |
| Faioni et al. | Type II protein C deficiency: identification and molecular modelling of two natural mutants with low anticoagulant and normal amidolytic activity | |
| Gentry et al. | Human ovarian follicular fluid has functional systems for the generation and modulation of thrombin | |
| Iijima et al. | Hemostatic studies in patients with carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome | |
| ES2217739T3 (es) | Prueba de coagulacion de sangre mejorada. | |
| ES2239388T3 (es) | Procedimiento para la deteccion funcional de trastornos en el sistema de la proteina c. | |
| Kusch et al. | High sensitivity detection of activated factor IX: application to the analysis of different therapeutical factor IX concentrates and prothrombin complexes | |
| Giddings et al. | Laboratory support in the diagnosis of coagulation disorders | |
| Niewiarowski et al. | Blood clotting factors in cerebrospinal fluid | |
| US4469788A (en) | Process of in vitro diagnosis of cystic fibrosis | |
| Vendramin | Pathophysiology of Thrombotic Thrombocytopenic Purpura: Interplay Between ADAMTS13 and VWF | |
| AU2013204966A1 (en) | Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them |