ES2252301T3 - Anticuerpos monoclonales dirigidos contra virus de la hepatitis b. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales dirigidos contra virus de la hepatitis b.Info
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Abstract
Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un antígeno HBsAg de tipo salvaje y al menos a una, preferentemente al menos a dos y ventajosamente a más de dos, formas mutantes del antígeno HBsAg, uniéndose dicho anticuerpo monoclonal a una secuencia peptídica que consiste en al menos 6 aminoácidos contiguos en la región 199-208 del antígeno HBsAg, y uniéndose ventajosamente a la secuencia peptídica constituida por la región 199-208 del antígeno HBsAg, según el numerado definido en la figura 1.
Description
Anticuerpos monoclonales dirigidos contra virus
de la hepatitis B.
En la actualidad son bastante conocidos cinco
tipos de hepatitis viral, las hepatitis A, B, C, D, E. En cada
caso, el virus invade el hígado y provoca un estado inflamatorio y
una destrucción de las células hepáticas.
La hepatitis B es causada por un virus, el virus
de la hepatitis B humana (HBV). El virus HBV fue descubierto por
Blumberg et al. A "new" antigen in leukemia sera, JAMA
191:541, (1965). El virus se transmite por vía sanguínea, por
contacto sexual o por vía perinatal.
La infección por HBV en la mayoría de los casos
no provoca ningún síntoma y es responsable de hepatitis agudas
asintomáticas. La hepatitis aguda se caracteriza por desordenes
digestivos, dolores abdominales, coloración en la orina y
decoloración anormal de las heces, astenia e ictericia. La
hepatitis aguda puede evolucionar hacia una forma fulminante con
una necrosis rápida del hígado.
La infección viral puede también evolucionar
hacia una forma crónica, o bien en pacientes que ha presentado una
hepatitis aguda, o bien en individuos para los que la infección era
asintomática. Los portadores crónicos presentan lesiones hepáticas
de importancia variable y un riesgo elevado de evolución hacia una
cirrosis y el desarrollo de un cáncer primitivo de hígado. En Asia
y en África donde es frecuente que las infecciones sean crónicas,
los cánceres primitivos de hígado representan un problema crucial
para la sanidad pública. Por otra parte, los portadores crónicos
representan depósitos para el virus y permiten su propagación
transponiendo el problema de salud pública a nivel mundial.
La infección por HBV es una de las infecciones
virales más corrientes en el hombre. Es una enfermedad ubiquitaria
con una incidencia geográfica distinta. En Europa y en América del
Norte está infectada entre aproximadamente 0,1% y 1% de la
población, mientras que en Asia y en África hasta el 20% de la
población es portadora del HBV. Se estiman aproximadamente en 350
millones el número de personas infectadas por el HBV en el
mundo.
La jerarquización de las infecciones virales a
consecuencia de las transfusiones muestra que la transmisión del
HBV es la primera, seguida del HCV y del HIV
El HBV es un pequeño virus con ADN de 42 nm de
diámetro que pertenece al grupo de los virus con ADN hepatótropos
(hepadnavirus) y pertenece a la familia de los Hepadnaviridae
Su estructura genómica es destacablemente compacta. El virus
presenta una envolvente externa y una nucleocápside. La envolvente
está compuesta principalmente por tres antígenos de superficie
(HB_{s}Ag_{s}: hepatitis B surface antigens) que desarrollan
una función principal en el diagnóstico de infecciones por HBV. La
nucleocápside contiene el antígeno del núcleo (HBcAg), una ADN
polimerasa/transcriptasa inversa, así como el genoma viral. El
núcleo viral constituye el elemento infeccioso del virus y la
membrana externa lleva el principal determinante antigénico del
virus, el antígeno HBs. El núcleo viral permanece en el interior de
la nucleocapside. Su diámetro es de aproximadamente 28 nm.
Pese a su pequeño tamaño (3200 pares de bases) el
ADN circular, parcialmente de doble filamento, de HBV codifica
para cuatro tipos de productos virales a partir de sus genes que se
superponen S, C, P y X.
El gen S codifica para la proteína de envolvente
HBsAg expresada en la superficie externa del virión. La proteína
de envolvente HBsAg está constituida por dos polipéptidos mayores,
un polipéptido de 24 kDa y su forma glicosilada de 28 kDa. El
HBsAg contiene el epítopo principal neutralizador del HBV,
denominado determinante "a", que corresponde a los aminoácidos
124 a 147 y es común a todos los aislados de HBV. El determinante
"a" es la diana más importante para el diagnóstico y la
vacunación. El desarrollo de anticuerpos anti-HBs
después de una infección aguda o crónica está generalmente asociado
a un restablecimiento y a un pronóstico favorable. Los
anticuerpos anti-HBs están también asociados a la
producción de anticuerpos neutralizantes después de la vacunación.
La mayoría de los anticuerpos anti-HBs encontrados
en el suero de individuos convalecientes o después de la
vacunación se unen a la región del determinante "a". Aunque la
estructura tridimensional del antígeno HBs no está todavía
definida, unos estudios de estructura-función
indican que el determinante "a" está localizado en la
principal región hidrófila del antígeno HBsAg (residuos 99 a 169).
Está claro que el determinante "a" está muy estructurado
porque la desnaturalización de esta zona por alquilación o
reducción proporciona unas partículas HBsAg cuya antigenicidad
está fuertemente reducida. Es probable que estén implicados en una
conformación correcta unos puentes disulfuro entre unas cisteínas.
Una estructura potencial del determinante "a" (residuos 124 a
147), que comprende cinco cisteínas, implicaría la existencia de
puentes disulfuro entre los aminoácidos 124 y 137, formando un
primer bucle, y entre los aminoácidos 139 y 147, formando un
segundo bucle. La totalidad de la secuencia del determinante
"a" contribuye probablemente a la estructura antigénica.
Además, el antígeno HBsAg contiene o bien el determinante d o
y que corresponden respectivamente a la presencia o bien de
una lisina o una arginina en la posición 122 y, o bien el
determinante w o r que corresponde respectivamente a
la presencia o bien de una lisina o de una arginina en la posición
160. Existen por lo tanto cuatro subtipos antigénicos principales
del HBsAg, el adw, el ayw, el adr y el
ayr, estando asociado cada uno a una distribución
geográfica. Corriente arriba del gen S, los genes pre-S codifican para diversos antígenos de superficie del HBV.
geográfica. Corriente arriba del gen S, los genes pre-S codifican para diversos antígenos de superficie del HBV.
El gen P codifica para la ADN
polimerasa/transcriptasa inversa, muy importante en el mecanismo de
la replicación viral.
El gen C codifica para dos proteínas de la
nucleocápside, la HBeAg que es una proteína secretada soluble y la
HBcAg, la proteína del núcleo intracelular. El HBeAg es un marcador
serológico de una replicación viral elevada.
El gen X codifica para el HBxAg que tiene
diferentes efectos biológicos y que puede en particular
transactivar la transcripción de los genes virales y celulares.
Cuando el HBV infecta un individuo, el ADN viral
se replica totalmente en el interior de las células hepáticas del
huésped.
Después de la infección por HBV, el primer
marcador detectable en el suero del paciente es el antígeno HBsAg,
pero este marcador persiste raramente más allá de los seis meses.
Después que el antígeno HBs haya desaparecido en el suero, se
hacen detectables los anticuerpos anti-HBsAg y
persisten. Debido a que el antígeno HBc ha sido secuestrado por el
antígeno de envolvente HBs, éste no es detectable rutinariamente en
los sueros de los pacientes, pero la presencia de anticuerpos
anti-HBc es fácilmente puesta en evidencia en las
primera a segunda semanas siguientes a la aparición del antígeno
HBs.
Sin embargo en la actualidad es cierto que las
pruebas serológicas convencionales, que emplean los marcadores
citados anteriormente, no permiten detectar las variantes de HBV.
Ahora bien, el hecho de que existen pacientes portadores del HBV y
que han desarrollado una hepatitis B crónica, sin que haya sido
posible evidenciar una infección por HBV con ayuda de los
marcadores serológicos tradicionales, es de capital importancia y
muestra la necesidad de desarrollar pruebas mejores.
Se sospecha desde hace años la existencia de
variantes de HBV. Esta presunción se basa en la detección de ADN
viral en el suero y/o en el hígado de los pacientes que presentan
una hepatitis crónica, en ausencia de la puesta en evidencia de
los marcadores serológicos convencionales (HBsAg y
anti-HBc).
La incapacidad para detectar el HBsAg en los
pacientes portadores de secuencias de ADN del virus podría tener
varias explicaciones, tales como una débil expresión del antígeno de
superficie o la presencia de mutaciones a nivel del determinante
antigénico de la proteína S. En el primer caso, una coinfección
viral podría suprimir la replicación de HBV (Jilg W et al.,
J.Hepatol, 1995, 23: 14-20, Jylberberg el al.,
Clinical infection diseases, 1996, 23: 1117-1125,
Ushida et al., J. of Med. Virol. 1997, 52:
399-405, Holfer et al., Eur. J.Clin;
Microbiol. Infect. Dis., 1998, 17: 6-13. Otra
explicación podría ser que el antígeno HBs esté enmascarado en el
momento de la formación in vivo de complejos inmunes con los
anticuerpos anti-HBs.
Pero, más recientemente, se ha observado la
presencia del HBsAg en sueros anti-HBs de los
pacientes. La presencia del antígeno HBsAg en estos pacientes
podría estar relacionada con el hecho de que no ha sido
neutralizado por los anti-HBs presentes, lo que
sugiere la presencia de variantes.
Se ha asociado la presencia de variantes o
mutantes a la vacunación y a la terapia que utiliza unos
anticuerpos policlonales o monoclonales. El análisis de los
mutantes parece demostrar que han sido seleccionados partiendo de
una población mezclada y presentan unas mutaciones puntuales que
causan unas sustituciones en aminoácidos en el determinante
"a". Los mutantes parecen ser el producto de mutaciones al
azar en el gen que conducen a un "pool" de genotipos. Se
piensa por otra parte que la respuesta inmune es el factor
predominante en la selección de los mutantes. Por lo general, la
adición de anticuerpos monoclonales a células infectadas por un
virus in vitro conduce a una selección de aislados que no son
neutralizados por el anticuerpo. Por lo tanto no sorprende que
unos anticuerpos monoclonales, dados a unos pacientes con una
replicación activa puedan tener como resultado una selección de
mutantes de escape. Se han encontrado varios mutantes de escape
separados de importancia clínica en individuos vacunados. En varios
casos, presentaban una mutación puntual a nivel del codón que
codifica para el aminoácido 145 en el determinante "a" del
antígeno del HBsAg, con el cambio de una glicina en una arginina
como resultante. La administración de suero que contenía un mutante
de este tipo a un chimpancé ha demostrado que estos agentes son
transmisibles. Se ha encontrado asimismo en los sujetos vacunados
otra mutación puntual que induce la sustitución de una lisina por
un ácido glutámico en la posición 141 del determinante "a". Es
importante por lo tanto poder detectar de manera segura y fiable,
no solo el HBV de tipo salvaje, sino también los mutantes o
variantes. En efecto, si una mutación significativa aparece a
nivel del epítopo del HBsAg y no es reconocida por los anticuerpos
anti-HBs, entonces, o bien el mutante no será
detectado, o bien la prueba no será suficientemente sensible. Ahora
bien, el hecho de no poder detectar un mutante de escape incide no
solo en la persona portadora, sino que puede también conducir a la
transmisión de la infección por donaciones de sangre, de productos
sanguíneos y de órganos. Por otra parte, un mutante HBsAg puede
infectar unos individuos aunque éstos hayan sido anteriormente
inmunizados y presenten una respuesta del tipo
anti-HBs. Se ha descrito, en la solicitud de patente
internacional WO 94/26904, un anticuerpo monoclonal que permite
discriminar la forma HBsAg salvaje de un mutante de escape que
comprende una mutación en la posición 122. Pero existe una
necesidad seria de caracterizar unos anticuerpos monoclonales que
sean capaces de detectar a la vez el tipo salvaje y las formas
mutantes del antígeno HBsAg para el desarrollo de pruebas de
diagnostico fiables (Coleman et al. (1999), Journal of
Medical Virology 59: 19-24; Ireland et al.
(2000), Hepatology 31:1176-1181).En efecto, en
ciertos casos, unas formas mutantes de HBV que afectan la región
de gen del envolvente que codifica para el determinante "a" no
son reconocidas por los anticuerpos monoclonales utilizados en las
pruebas de diagnóstico comerciales (Carman et al. (1990),
Lancet 336: 325-329;
Seddigh-Tonekaboni et al. (2000), Journal of
Medical Virology 60: 113-121; Weinberger et
al. (2000), Journal of General Virology 81:
1165-1174).
El documento US nº 6.030.616 describe unos
anticuerpos anti-HBsAg capaces de unirse a la forma
salvaje de la proteína HBs así como a una forma mutante de esta
proteína portadora de la sustitución de la glicina en la posición
145 por la arginina.
El documento WO 95/16704 describe unos fragmentos
peptídicos inmunogénicos de la proteína HBs que poseen la
propiedad de ser unos epítopos de linfocitos T.
Así, la presente invención tiene por objeto un
anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse a un antígeno HBsAg
de tipo salvaje y a al menos una, preferentemente al menos dos y
ventajosamente más de dos, formas mutantes del antígeno HBsAg,
uniéndose dicho anticuerpo a una secuencia peptídica que consiste
en al menos 6 aminoácidos contiguos en la región
199-208 del antígeno HbsAg, y uniéndose
ventajosamente a la secuencia peptídica constituida por la región
199-208 del antígeno HBsAg, según la numeración
definida en la figura 1.
Asimismo, la presente invención tiene por objeto
un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente a
un antígeno HBsAg de tipo salvaje y a al menos una, preferentemente
al menos dos y ventajosamente más de dos, formas mutantes del
antígeno HBsAg, uniéndose dicho anticuerpo monoclonal
específicamente a la región 199-208 del antígeno
HBsAg.
La capacidad del anticuerpo monoclonal de la
presente invención para unirse específicamente a unas formas
salvaje y mutantes del antígeno HBsAg está unida al hecho de que
reconoce una región del antígeno de superficie muy conservada,
como han demostrado por primera vez los inventores por
"mapping" de epítopos, a la vez en las formas salvaje y
mutantes de HBV que corresponde a la región o epítopo localizado
entre los aminoácidos 199 y 208 del antígeno HBsAg y esto
independientemente de la presencia de otras mutaciones o
substituciones en aminoácidos que pueden sobrevenir a nivel del
determinante "a" o en la proximidad del determinante "a"
del antígeno HBsAg. Así el anticuerpo monoclonal de la invención es
capaz de reconocer y de unirse específicamente a al menos una
forma mutante del antígeno HBsAg que comprende al menos una
sustitución de un aminoácido en el determinante "a" del
antígeno HBsAg y, en particular, unas formas mutantes del antígeno
HBsAg que presentan al menos una sustitución en aminoácidos en las
posiciones 127, 133, 134, 142, 143, 144 y 145 del determinante
"a" del antígeno HBsAg y eventualmente al menos otra
sustitución en aminoácidos en las posiciones 100, 118, 120, 122
del antígeno HBsAg. Las mutaciones o sustituciones identificadas
están posicionadas con respecto a la secuencia en aminoácidos del
antígeno HBsAg de tipo salvaje.
Las formas mutantes que son específicamente
reconocidas por los anticuerpos monoclonales de la invención son
identificadas en los siguientes ejemplos. Se trata más precisamente
de los mutantes:
- -
- 1043 Sp en el que una serina en la posición 143 del antígeno HBsAg está reemplazada por una leucina,
- -
- AP 3.1 en el que un ácido aspártico en la posición 144 del antígeno HBsAg está reemplazado por una alanina,
- -
- Arg 1.2 en el que una glicina en la posición 145 del antígeno HBsAg está reemplazada por una arginina,
- -
- 1157 Sp en el que una prolina en la posición 127 del antígeno HBsAg está reemplazada por una alanina y una serina en la posición 143 del antígeno HBsAg es reemplazada por una leucina,
- -
- 1056 Sp en el que una prolina en la posición 120 del antígeno HBsAg está reemplazada por una serina y una serina en la posición 143 del antígeno HBsAg está reemplazada por una leucina, y
- -
- M5 en el que una tirosina en la posición 100 del antígeno HBsAg está reemplazada por una serina, una treonina en la posición 118 del antígeno HBsAg está reemplazada por una valina, una arginina en la posición 122 del antígeno HBsAg está reemplazada por una lisina, una metionina en la posición 133 del antígeno HBsAg está reemplazada por una isoleucina, una tirosina en la posición 134 del antígeno HBsAg está reemplazada por una asparagina, una prolina en la posición 142 del antígeno HBsAg está reemplazada por una serina, una serina en la posición 143 del antígeno HBsAg está reemplazada por una leucina y una glicina en la posición 145 del antígeno HBsAg está reemplazada por una lisina.
Los mutantes citados anteriormente pueden ser
utilizados para el cribado de anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos de la invención, pueden ser, por ejemplo, cribados
contra el antígeno HBsAg de tipo salvaje y contra uno o varios
mutantes de los tipos descritos anteriormente. En particular, los
anticuerpos de la invención pueden ser cribados contra el antígeno
HBsAg de tipo salvaje y contra uno o varios mutantes HBsAg teniendo
cada uno de ellos una o varias sustituciones en al menos una de las
posiciones 127, 133, 134, 142, 143, 144 y 145 del antígeno HBsAg,
más particularmente en al menos una de las posiciones 143, 144 y
145 del antígeno HBsAg y eventualmente otra sustitución en al menos
una de las posiciones 100, 118, 120, 122 del antígeno HBsAg.
En particular los anticuerpos monoclonales de la
invención son capaces de unirse a un antígeno HBsAg de tipo
salvaje y a al menos un mutante HBsAg portador de un determinante
"a" codificado por unas secuencias que presentan unas
mutaciones puntuales a nivel de uno o varios codones que codifican
para los aminoácidos 127, 133, 134, 142, 143, 144 y 145 del
antígeno HBsAg. Los anticuerpos preferidos de la invención son los
anticuerpos referenciados 2G2G10 y 8B4H7 que pertenecen a la clase
de las inmunoglobulinas G. El anticuerpo monoclonal 2G2G10
pertenece a la clase de las inmunoglobulinas IgG2b. El anticuerpo
monoclonal 8B4H7 pertenece a la clase de las inmunoglobulinas Ig2a
y ha sido obtenido por tratamiento con UV del anticuerpo 2G2G10.
La presente invención engloba también los
fragmentos y derivados de los anticuerpos monoclonales de la
invención, en particular los fragmentos Fab, Fab', F (ab)2 y
scFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159:
5821-5833 y Bird et al., 1988, ciencia 242:
423-426), así como los conjugados. Los derivados de
los anticuerpos monoclonales de la invención comprenden entre
otros, los anticuerpos humanizados. Los métodos para producir
fragmentos de anticuerpos monoclonales y derivados de anticuerpos
monoclonales, incluyendo los derivados humanizados, son bien
conocidos por el experto en la materia. Las formas
"humanizadas" de anticuerpos no humanos, por ejemplo murinos,
son unos anticuerpos quimeras que comprenden una secuencia mínima
derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los
anticuerpos humanizados son unas inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que unos residuos de una región
hipervariable del receptor son reemplazados por unos residuos de
una región hipervariable de una especie donante (anticuerpo
donante) no humana, tal como el ratón, rata, conejo o primate no
humano, que tenga la especificidad, la afinidad y la capacidad
deseadas. En ciertos casos, los residuos (FR) de la región Fv de la
inmunoglobulina humana son reemplazados por unos residuos
correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados
pueden comprender unos residuos que no se encuentran en el
anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones
son realizadas para mejorar las prestaciones del anticuerpo. Por
lo general, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos y
preferentemente dos dominios variables, en los que todos o casi
todos los bucles hipervariables corresponden a una inmunoglobulina
no humana y todas o casi todas las regiones FR serán de una
inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados podrán también
facultativamente comprender al menos una parte de una región
constante (Fc) de una inmunoglobulina, tal como una
inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:
522-525 (1986); Reichmann et al., Nature
332: 323-329 (1988); y Presta et al. Curr.
Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Los anticuerpos monoclonales de la invención y,
en particular los anticuerpos 2G2G10 y 8B4H7, son producidos por
unas descendencias de hibridomas según el protocolo descrito en el
siguiente ejemplo 1 o según un protocolo derivado del descrito en
el ejemplo 1 y la invención tiene también por objeto dicho
procedimiento de producción de los anticuerpos monoclonales de la
invención que consiste en producir una descendencia de hibridoma
inmunizando una animal mamífero, preferentemente murino, con un
antígeno HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante de un antígeno
HBsAg, eventualmente en forma de un fragmento o de un derivado
antigénico apropiado, inmortalizando las células productoras de
anticuerpos para formar hibridomas, cribando los cultivos de
hibridomas contra el antígeno HBsAg de tipo salvaje y al menos una
forma mutante del tipo definido anteriormente, eventualmente en
forma de un fragmento o derivado antigénico apropiado, y
seleccionando los hibridomas que producen unos anticuerpos que se
unen al antígeno HBsAg de tipo salvaje y al menos a una forma
mutante del tipo definido anteriormente.
La invención engloba también un hibridoma capaz
de producir un anticuerpo monoclonal de la invención y un
procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal de la
invención, que consiste en cultivar un hibridoma o susceptible de
ser obtenido según un procedimiento del tipo definido anteriormente
in vitro o in vivo y en recuperar el anticuerpo
monoclonal a partir del medio de cultivo; así como el anticuerpo
monoclonal susceptible de ser obtenido por el procedimiento de
cultivo de un hibridoma.
Los anticuerpos monoclonales de la invención son
utilizables en un inmunoensayo para la detección y/o cuantificación
del antígeno HBsAg en una muestra que se presume lo contiene y por
lo tanto para la detección del virus HBV (salvaje y/o
mutantes).Ensayos de este tipo son aplicables al diagnóstico
clínico y al cribado de productos sanguíneos. Asimismo, la presente
invención se refiere a un procedimiento de detección y/o de
cuantificación del antígeno HBsAg en una muestra, que consiste en
poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo monoclonal
de la invención, o un fragmento o derivado de un anticuerpo
monoclonal de este tipo y en poner en evidencia la presencia de al
menos un complejo antígeno/anticuerpo, fragmento o derivado.
En un modo de realización del procedimiento de la
invención, la muestra es puesta en contacto con un anticuerpo
monoclonal de la invención, o un fragmento o un derivado de éste y
con al menos otro anticuerpo seleccionado de entre los anticuerpos
policlonales o monoclonales anti-HBsAg dirigidos
contra una región o epítopo diferente del reconocido por los
anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de la
invención.
Procedimientos de este tipo son realizados según
la técnica denominada de sándwich o de competición bien conocidas
por el experto en la materia, en una o dos etapas, en fase homogénea
o heterogénea. Además, los procedimientos de la invención pueden
ser emparejados, en un mismo ensayo, con la detección del
anticuerpo anti-HBsAg en la muestra a analizar.
Las composiciones de diagnóstico correspondientes
comprenden al menos un anticuerpo monoclonal de la invención, o un
fragmento o derivado de éste, eventualmente en asociación con al
menos un reactivo para la detección del anticuerpo
anti-HBc y pueden comprender además al menos otro
anticuerpo monoclonal o policlonal para la detección del antígeno
HBsAg que reconoce una región o epítopo diferente del reconocido
por los anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de la
invención. Los anticuerpos, fragmentos o derivados de la invención
pueden ser inmovilizados sobre una fase sólida, como anticuerpos de
captura del antígeno HBsAg o utilizados en detección cuando están
marcados con cualquier marcador apropiado. Se ha previsto asimismo
utilizar los anticuerpos, fragmentos o derivados de la invención
como fase de captura del antígeno HBsAg y utilizar al menos otro
anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un epítopo
diferente al reconocido por los anticuerpos de la invención como
conjugado de detección, o inversamente. Asimismo, los anticuerpos,
fragmentos o derivados de la invención y al menos otro anticuerpo
monoclonal o policlonal dirigido contra un epítopo diferente al
reconocido por los anticuerpos de la invención pueden ser
inmovilizados sobre una misma fase sólida. Además, un reactivo
capaz de capturar los anticuerpos anti-HBc en la
muestra puede ser inmovilizado sobre esta misma fase sólida o ser
incluido en una composición de la invención pero estando
inmovilizado sobre una fase sólida diferente a aquélla en la que
están inmovilizados los anticuerpos, fragmentos o derivados de la
invención y eventualmente al menos otro anticuerpo monoclonal o
policlonal anti-HBsAg que reconoce un epítopo
diferente al reconocido por los anticuerpos de la invención.
La invención se refiere asimismo a un antisuero
apropiado para una utilización terapéutica o profiláctica para la
inmunización pasiva contra el HBV que comprende un anticuerpo
monoclonal de la invención o un fragmento o derivado de dicho
anticuerpo o sus combinaciones. El antisuero puede comprender
además al menos un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal
o una mezcla de anticuerpos monoclonales y policlonales
anti-HBsAg, diferentes del anticuerpo monoclonal,
fragmento o derivado de la invención.
Una composición farmacéutica apropiada para una
utilización terapéutica o profiláctica para una inmunización
pasiva contra HBV comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento
o derivado de la invención o sus combinaciones, en mezcla con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por "vehículo farmacéuticamente aceptable"
se entienden los soportes y vehículos administrables al ser humano
o a un animal, de los tipos descritos por ejemplo en el Remington's
Pharmaceutical Sciences 16^{th} ed., Mack Publishing Co.
La invención permite por lo tanto además un
método de inmunización pasiva con objetivo terapéutico o
profiláctico contra HBV que consiste en administrar a un individuo
una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un
anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado de la invención o sus
combinaciones. También se pueden administrar uno o varios
anticuerpos monoclonales o policlonales diferentes
anti-HBSAg y dirigidos contra un epítopo diferente
del reconocido por los anticuerpos, fragmentos o derivados de la
invención.
La invención comprende también un anticuerpo
anti-idiotipo o un anti-idiotípico
a un anticuerpo de la invención del tipo definido anteriormente. El
anticuerpo anti-idiotipo es un anticuerpo producido
contra otro anticuerpo y que reacciona con el lugar específico de
enlace antigénico de este último o idiotipo. Los anticuerpos
anti-idiotipo funcionan como el antígeno reconocido
por el idiotipo. Anticuerpos de este tipo son particularmente
útiles en el caso de epítopos conformacionales. Los anticuerpos
anti-idiotipo que representan la imagen interna de
patógenos externos, tales como los tipo virus, son utilizados como
"substitutos" de unos antígenos para la vacunación. Se ha
demostrado la importancia de los anticuerpos
anti-idiotipos in vivo en numerosos
experimentos. La administración de anticuerpos
anti-idiotipos in vivo provoca o bien una
supresión o un aumento de las respuestas al idiotipo específico.
Los anticuerpos anti-idiotipos de la invención son
capaces de inducir en el animal una repuesta por producción de
anticuerpos anti-anti-idiotipos que
reconocen el epítopo 199-208 del antígeno HBsAg y a
este título son capaces de inmunizar un animal contra el HBV,
incluso neutralizar una infección por HBV. Asimismo, la presente
invención tiene por objeto una composición vacunante que comprende
una cantidad suficiente, para inmunizar un animal contra HBV, de una
composición activa que comprende un anticuerpo monoclonal
anti-idiotipo que induce en el animal la producción
de un anticuerpo anti-anti-idiotipo
que reconoce la región 199-208 del antígeno HBsAg o
un fragmento Fab de dicho anticuerpo anti-idiotipo
o su mezcla y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, por
ejemplo hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. Los adyuvantes
farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por el experto en
la materia y se puede dar a título de referencia los adyuvantes
citados en Remignton's Pharmaceutical Sciences 16^{th} ed., Mack
Publishing Co. Si se desea, la vacuna puede contener cantidades
menores de sustancias auxiliares como unos agentes humectantes o
emulsificnantes, agentes que taponan el pH. El procedimiento para
inmunizar un animal contra HBV consiste en administrarle, en una o
varias administraciones, una composición vacunante del tipo
definido anteriormente. Obviamente, después de los ensayos in
vivo en los animales, el objetivo final de una vacunación
contra el virus HBV es prevenir una infección en el hombre. Por
ello, el término "animal" tal como es utilizado anteriormente
hace referencia a la vez a los animales y al ser humano. La vacuna
se prepara mezclando el anticuerpo anti-idiotipo
de la invención o su fragmento Fab en un diluyente apropiado, que
puede ser un tampón fosfato acuoso o de otro tipo, de manera que
se obtenga una concentración final del orden 1 mg por ml de
proteína. Para una administración a un hombre de talla normal, por
ejemplo, 50 \mul (50 \mug) a 100 \mul (100 \mug) de
solución se diluyen en 4 500 \mul y se mezclan con 500 \mul de
un adyuvante farmacéuticamente aceptable (pH 6,0+0,1). La dosis
variará en función del animal, de su edad y de su peso.
Los anticuerpos nomoclonales idiotipo de la
invención son producidos por unas técnicas bien conocidas por el
experto en la materia. El epítopo o región 199-205
del antígeno HBsAg es obtenido y purificado mediante cualquier
técnica actualmente disponible. El anticuerpo idiotipo (Ab1) es
producido inmunizando un animal, preferentemente murino, y en
particular un ratón, con el epítopo citado anteriormente, como
antígeno. Las células del bazo del animal son identificadas,
aisladas y fusionadas a continuación con unas células de linfoma o
de mieloma en presencia de un agente de fusión del tipo
polietilenglicol (Köhler y Milstein, Nature 256:459 (1975)). Las
células fusionadas son incubadas a continuación en un medio
selectivo que inhibe el crecimiento de las células malignas no
fusionadas. Las células de hibridoma son clonadas por dilución
limitante y ensayadas para la secreción de un anticuerpo monoclonal
de una especificidad buscada. Los anticuerpos monoclonales pueden
también ser obtenidos por crecimiento de ascitis in vivo. El
anticuerpo idiotipo Ab1 es utilizado para producir un anticuerpo
anti-idiotipo (Ab2) que posee las propiedades de
inmunización, incluso de neutralización, contra HBV. Los
anticuerpos anti-idiotipo Ab2 son obtenidos por los
mismos procedimientos que los utilizados por la producción de
unos anticuerpos Ab1, pero el anticuerpo Ab1 es entonces el
inmunógeno utilizado.
La invención tiene asimismo por objeto el epítopo
conservado del antígeno HBsAg puesto en evidencia por los
inventores cuya secuencia peptídica, representada en el
identificador se secuencias SEC ID nº: 1, empieza en el aminoácido
199 y termina en el aminoácido 208 del antígeno HBsAg y su
utilización como péptido inmunógeno, así como unos péptidos
inmunógenos caracterizados porque su secuencia peptídica consiste
en el epítopo referenciado como SEC ID nº: 1, o los péptidos
inmunógenos ilustrados como SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3. En la
comparación de las secuencias SEC ID nº: 1 y SEQ ID NO: 2
ilustrada en la figura anexa, la secuencia SEC ID nº: 2 comprende
tres aminoácidos, W (triptofano), P (prolina), S (serina) que son
estrictamente homólogos o idénticos a los aminoácidos
correspondientes de SEC ID nº: 1 y un aminoácido I (isoleucina) que
es equivalente a L (leucina) de SEC ID nº: 1. En la comparación de
las secuencias SEC ID nº: 1 y SEC ID nº: 3 ilustrada en la figura
anexa, la secuencia SEC ID nº: 3 comprende cuatro aminoácidos que
son estrictamente homólogos o idénticos a los de SEC ID nº: 1, se
trata de los aminoácidos, W (triptofano), P (prolina), Y
(tirosina), S (serina) y dos aminoácidos T (treonina) y L (leucina)
que son equivalentes respectivamente a S(serina) e I
(isoleucina) de SEC ID nº: 1. Los aminoácidos denominados
equivalentes son unos aminoácidos que pueden sustituirse unos a
los otros sin afectar el poder inmunogénico de los péptidos. Son
utilizados dichos péptidos inmunógenos para la producción de
anticuerpos monoclonales, de fragmentos de anticuerpos monoclonales
o derivados de anticuerpos monoclonales que responden a las
definiciones dadas anteriormente y capaces de reconocer a la vez la
forma salvaje y al menos una forma mutante del antígeno HBsAg. La
producción de anticuerpos monoclonales, de fragmentos o derivados
de anticuerpos monoclonales es bien conocida por el experto en la
materia. Se pueden citar a título de ejemplo Köhler y Milstein,
Nature 256:45-47 (1975) y European Journal of
Immunology 6:511-519 (1976) así como Galfre G.
et al. Nature, 266: 522-550 (1977). El
epítopo puede ser producido por síntesis química o por
recombinación genética o por combinación de diferentes métodos. La
secuencia que codifica para el epítopo de la invención puede ser
así expresada en una célula huésped apropiada bajo el control de un
promotor apropiado. Las células huésped comprenden cualquier
organismo unicelular capaz de transcribir y traducir unas moléculas
de ADN recombinante, tales como las células salidas de un
organismo procariota o eucariota incluyendo las células de
mamíferos, levaduras y bacterias, y que permiten la expresión del
fragmento del gen S que codifica para el epítopo de la invención,
siendo colocado el fragmento del gen bajo el control de los
elementos necesarios para su expresión. Por otra parte, los
péptidos inmunogénicos SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3 pueden ser
fácilmente obtenidos por síntesis química.
La invención se refiere por último a una sonda
nucléica o iniciador capaz de hibridarse, en unas condiciones de
astringencia determinadas, en particular astringentes, con una
secuencia nucleotídica de ADN que codifica para el epítopo
representado en SEC ID nº: 1 o la secuencia nucleotídica ADN
complementaria de dicha secuencia nucleotídica que codifica para
el epítopo representado en SEC ID nº: 1 o al producto de
transcripción ARN de dichas secuencias nucleotídicas ADN.
La invención se refiere asimismo a una sonda
nucléica o iniciador capaz de hibridarse, en unas condiciones de
astringencia determinadas, en particular astringentes, con unas
secuencia nucleotídica ADN representada como SEQ ID nº: 4 que
codifica para el epítopo representado en SEC ID nº: 1 o con la
secuencia nucleotídica ADN complementaria de SEC ID nº: 4 o al
producto de transcripción ARN de dichas secuencias nucleotídicas
ADN; una composición para diagnostico que comprende al menos una
sonda o al menos un iniciador del tipo definido anteriormente para
la detección y/o cuantificación del virus HBV (salvaje y/o
mutantes) en una muestra biológica y un procedimiento de
diagnóstico del ADN y/o ARN del virus HBV (salvaje y/o mutantes) en
una muestra biológica, según el que se toma una muestra biológica,
tal como suero, plasma o muestra de tejido de un paciente
sospechoso de estar infectado por al menos un virus HBV, se trata
si es necesario dicha muestra para extraer el ADN y/o el ARN, se
pone en contacto dicha muestra con al menos una sonda o al menos un
iniciador, en unas condiciones de astringencia determinadas y se
detecta y/o cuantifica el ADN y/o ARN viral en la muestra, o bien
por puesta en evidencia de una hibridación de dicho ADN y/o ARN
viral con al menos una sonda, o bien por amplificación de dicho
ADN y/o ARN. En el caso de la utilización de sondas nucleotídicas,
la puesta en evidencia de la formación del complejo de hibridación
puede ser realizada directamente mediante la utilización de una
sonda complementaria o sustancialmente complementaria de la
secuencia de la diana y marcada por cualquier marcador apropiado o
incluso por el empleo de la técnica denominada "sándwich" en
una o dos etapas que consiste en utilizar una sonda de captura
complementaria o sustancialmente complementaria de una parte de la
secuencia de la diana y una sonda marcada por cualquier marcador
apropiado o sonda de detección complementaria de otra parte de la
secuencia de la diana. En el caso de la utilización de iniciadores,
éstos pueden ser marcados directamente para la puesta en evidencia
de un producto de amplificación marcado o no marcadas en cuyo caso
los productos de amplificación generados pueden ser seleccionados
en función del tamaño esperado por paso sobre gel de acrilamida o
analizados con ayuda de unas sondas de detección
apropiadas.
apropiadas.
A partir de la selección de la secuencia
nucleotídica ADN que codifica para el epítopo
199-128 de la invención, que corresponde a los
nucleótidos 751-780 del genoma de HBV descrito por
Galibert et al. (Nature 280: 646-650 (1979),
representada SEC ID nº: 4, de su secuencia complementaria y de la
secuencia ARN correspondiente, está al alcance del experto en la
materia determinar y obtener unas sondas nucleotídicas o unos
iniciadores capaces de hibridarse con SEC ID nº: 4, con su
secuencia complementaria o con la secuencia ARN correspondiente.
Se pueden citar a título de ejemplos para la producción de
oligonucleótidos la utilización de enzimas de restricción y la
síntesis química en sintetizador automático. Las sondas e
iniciadores susceptibles de hibridarse en unas condiciones de
astringencia determinadas con una secuencia nucleotídica de ADN, o
de ARN de la invención forman parte de esta definición. Está al
alcance del experto en la materia definir las condiciones de
astringencia apropiadas. Unas condiciones de astringencia
características son las que corresponden a una combinación de la
temperatura y de la concentración salina seleccionada
aproximadamente de entre 12 a 20ºC bajo el Tm ("melting
temperature") del híbrido en estudio. Todo ello forma parte de
los conocimientos generales del experto en la materia y se puede
citar a título de ilustración la enseñanza dada en el libro
titulado "DNA PROBES" de George H. Kéller y Marck M.Manak;
Segunda Edición, editado en 1993 por Stockton Press, 49 West
24^{th} St., New York, N.Y. 10010, USA (véase más precisamente:
Sección I-Molecular Hybridization Technology,
págs.1-21).
Figura
1
La figura 1 anexa representa la secuencia de
aminoácidos del antígeno HBsAg. En esta figura está localizado el
epítopo 199-208, puesto en evidencia por cartografía
o "mapping" de epítopos como se ilustra en los siguientes
ejemplos. Los dos clones HWWKHPTRYSLG y HPLKQYWWRPSI que presentan
unos aminoácidos comunes u homólogos o idénticos y unos
aminoácidos equivalentes a los aminoácidos de la secuencia del
antígeno HBsAg de tipo salvaje en la región comprendida entre los
aminoácidos 194-209 de la secuencia de aminoácidos
del antígeno HBsAg están representados por debajo de la secuencia
del antígeno HBsAg de tipo salvaje. Los aminoácidos comunes u
homólogos o idénticos y equivalentes están representados en negrita
en la figura 1.
Ejemplo
1
Se han inmunizado unos ratones hembra BALB/c
JYco, de 4 a 6 semanas (IFFA Credo), mediante una inyección
intraperitoneal de 50 \mug de HBsAg ay recombinante
emulsionado con un volumen igual del adyuvante completo de Freund.
La proteína recombinante HBsAg ay ha sido obtenida de
Pasteur Mérieux Connaught. Esta proteína corresponde a la cepa
ayw secuenciada por Gallibert et al. (Nature 280:
646-650 (1979)) y ha sido expresada en unas
células CHO (Michel et al., PNAS 81/7708-7712
(1984)). Está compuesta por unas regiones pre-S y
S. Los 55 aminoácidos situados en posición NH_{2} terminal
corresponden a la región pre-S2.
Se han aplicado a continuación tres inyecciones
cada dos semanas en presencia del adyuvante incompleto. Cuatro
días después de la última inyección, se han extraído células del
bazo y han sido fusionadas con la descendencia celular de mielomas
de ratón Sp 2/0-Ag14, según la técnica descrita por
Köhler & Milstein (Natura 256: 45-47 (1975);
European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976)).
Después de haber cultivado las células durante 12 a 14 días, los
sobrenadantes de los cultivos han sido cribados mediante una prueba
ELISA indirecta con el antígeno HBsAg plasmático ay
recombinante fijado sobre la fase sólida. Mil cincuenta y ocho
sobrenadantes de cultivo, diluidos al 1/10, han sido cribados de
esta forma. Se han seleccionado sesenta y seis clones positivos
para los que la OD a 405 nm era de aproximadamente 2, es decir seis
veces superior al valor umbral, a esta misma longitud de onda, de
0,3. Los sesenta y seis sobrenadantes de cultivo de clones
positivos, diluidos al 1/10, han sido a continuación cribados
mediante una prueba ELISA indirecta con antígeno HBaAg plasmático
ay nativo. Se han seleccionado veinte clones para los que la
OD a 405 nm era superior a 2, o sea 24 veces superior al valor
umbral, a esta misma longitud de onda, de 0,1. Los sobrenadantes de
cultivo de 12 de estos 20 clones, diluidos al 1/10, han sido a
continuación probados mediante la prueba ELISA indirecta,
respectivamente con el antígeno HBsAg ay nativo y el
antígeno HBsAg ad nativo, fijado sobre la fase sólida. Se
han seleccionado seis clones en cada una de estas pruebas para los
que la OD a 405 nm era de 1,2 o más para el ensayo con el
antígeno HBsAg ay nativo y de aproximadamente 1,1 para el
ensayo con el antígeno HBsAg ad nativo, a una dilución al
1/1600 del sobrenadante del cultivo, es decir una OD
aproximadamente diez veces superior al valor umbral de 0,1. Cuatro
de estos seis clones positivos han sido subclonados dos veces, por
dilución limitante, y producidos en forma de ascitis. Las ascitis
han sido obtenidas a partir de ratones, que han recibido con
anterioridad una inyección de Pristane (nombre comercial), y a los
que se les ha inyectado 10^{6} células de
hibridomas.
hibridomas.
Las cuatro IgGs así obtenidas han sido
purificadas sobre columna de sepharosa acoplada a la proteína A
4FF, según el protocolo suministrado por el fabricante (Pharmacia)
y han sido utilizados para las siguientes experiencias.
Finalmente, el anticuerpo monoclonal 2G2G10, que pertenece a la
clase de las inmunoglobulinas IgG2b, ha sido retenido debido a sus
excelentes prestaciones.
Ejemplo
2
La clase del anticuerpo monoclonal 2G2G10 ha sido
cambiada de IgG2b a IgG2a mediante su tratamiento con UV según el
protocolo de Rosén y Klein (Nature
306:189-190(1983)). El anticuerpo modificado
ha sido nombrado
8B4H7.
8B4H7.
\newpage
Ejemplo
3
El banco Ph.D.12^{TM} comercializado por New
England Biolabs Inc. ha sido cribado por los anticuerpos
monoclonales 2G2G10 y 8B4H7 biotinilados según el método descrito
por Gretch et al. (Analytical Biochemestry 163:
270-277 (1987)). Es un banco combinatorio de
dodecapéptidos expresados como N-terminal de una
proteína menor de envolvente (pUI) del fago M13. Contiene
aproximadamente 4-10^{12} fagos/ml, que
representan 1,9 \cdot 10^{9} secuencias diferentes.
Durante el primer "biopanning", 10 \mug de
estreptavidina en tampón NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,6) son fijados en
una caja de Petri de 35 mm de diámetro, durante una noche, a 4ºC, en
cámara húmeda, bajo agitación. La caja es a continuación saturada
durante 2 h a 4ºC con una solución de saturación [5 mg/ml BSA;
0,02% NaN_{3} en NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,6)]. Después de 6
lavados con TBS (Tris Buffer Saline) [Tris 0,5 M; NaCl 0,75 M, pH
7,5]-Tween 0,1%, los anticuerpos monoclonales
biotinilados 2G2G10 o 8B4H7 son incubados a una concentración de
170 nM en TBS Tween 0,1% con 0,02% NaN_{3} y 1 mg/l de BSA durante
1 noche a 4ºC, en cámara húmeda y bajo agitación. Para bloquear
los lugares no ocupados por el anticuerpo, se han añadido e
incubado durante 1 hora a 4ºC en cámara húmeda y bajo agitación 40
\mug de biotina. Después de 6 lavados con TBS Tween 0,1% 10
\mul del banco (4.10^{9} fagos) diluidos en TBS Tween
0,1%-biotina 0,1 nM son incubados a temperatura ambiente durante 1
hora, bajo agitación. Los fago no fijados son a continuación
eliminados mediante 10 lavados con TBS Tween 0,1%. La elución de
los fagos fijados se realiza mediante una incubación de 7 minutos
con el tampón de elución [0,1M HCl-Glicina; pH 2,2;
1 mg/ml BSA; 0,1 mg/ml de rojo de fenol]. El eluido es neutralizado
con 200 \mul de Tris-HCl 1M pH 9,1.
Los eluidos correspondientes a los cribados del
banco, o bien con el 2G2G10, o bien con el 8B4H7 son amplificados
separadamente por infección de la cepa ER2537 de Escherichia
coli en medio LB [triptona 10 g/l; extracto de levadura 5 g/l;
NaCl 10 g/l; pH 7,5]. Después de 4h30 de incubación a 37ºC a 250
rpm, los restos celulares son eliminados mediante dos
centrifugaciones sucesivas de 10 min a 10.000 rpm. Los fagos
contenidos en los sobrenadantes son precipitados dos veces con 1/6
de Polietilenglicol/NaCl [Polietilenglicol 16,7%, NaCl 3,3 M].
Después de una centrifugación de 15 min a 14.000 rpm, los culotes
son recogidos por 200 \mul de TBS-NaN_{3};
0,02%. 100 \mul de estos eluidos amplificados son
utilizados para los segundos biopannings.
Para los 2º, 3º y 4º "biopannings", 100
\mul de los eluidos amplificados anteriormente son preincubados
con 100 nM, 1 nM y 0,1 nM respectivamente de los anticuerpos
biotinilados 2G2G10 o 8B4H7 durante una noche a 4ºC, mientras que
10 \mug de estreptavidina son fijados sobre una caja de Petri,
como anteriormente. Las mezclas fagos/anticuerpos son añadidas
después de la saturación de las cajas, durante 15 minutos a
temperatura ambiente. La continuación del protocolo es parecida a
la de los primeros "biopannings".
Ejemplo
4
Un cultivo de E. coli es incubado a 37ºC a
250 rpm hasta que la densidad óptica (OD) alcanza 0,5. Durante el
crecimiento bacteriano, se funde agarosa top [11 LB; 10 g
bacto-triptona; 5 g extracto de levadura; 5 g
NaCl; 1 g MgCl_{2}, 6 H_{2}O; 7 g agarosa] y alicuotado por 3
ml, y conservado a 55ºC. Cuando las células están preparadas, 200
\mul de cultivo son incubados de 1 a 5 minutos a temperatura
ambiente con 10 \mul de los eluidos obtenidos después del 4º
biopanning y diluidos en medio LB. Las mezclas son a continuación
transferidas en 2 tubos de agarosa, tratadas con el vórtex y
rápidamente extendidas sobre unas cajas LB IPTG/XGal. Las cajas
son incubadas una noche
a 37ºC.
a 37ºC.
Se amplifican 36 colonias seleccionadas al azar
en las cajas correspondientes al cribado por 2G1G10 o 8B4H7 por
infección de 1 ml de un cultivo de E. coli durante 4 a 5
horas a 37ºC, a continuación las células son eliminadas por
centrifugación 30 s a 14.000 rpm. Se utilizan a
continuación 500 \mul de sobrenadante para el secuenciado, el
resto es centrifugado de nuevo, diluido 1:1 en glicerol y
conservado a -20ºC.
Se amplifican 2 \mul de fagos conservados en
LB/Glicerol por infección con 1,7 ml de un cultivo de E.coli
durante 24 horas a 37ºC y 250 rpm. Las células son eliminadas por
centrifugación 5 min a 14.000 rpm. El sobrenadante es precipitado
por PEG/NaCl, Después de una centrifugación de 15 min a 14.000 rpm,
el culote es recogido por 500 \mul de TBS. Estas soluciones de
fagos son dosificadas por espectrometría de absorción a 269 nm y
utilizadas para las pruebas de ELISA.
Ejemplo
5
La extracción y la purificación del ADN de los
diferentes clones se realizan a partir de 500 \mul de
sobrenadante que son precipitados por 200 \mul de PEG/NaCl
durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación
10 min a 14.000 rpm, el culote es recogido por 100 \mul de
Tris-HCl 10 nM pH 8,0, EDTA 1 mM, Nal 4M y 250
\mul de etanol absoluto incubado a continuación 10 min a
temperatura ambiente. Después de centrifugación de 10 min a
14.000 rpm, el culote es lavado una vez con 500 \mul de etanol
70%, a continuación secado 10 min al vacío. Por último, se recoge
por 30 \mul de Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1
mM.
El secuenciado nucleotídico de la inserción es
realizado según el método modificado de Sanguer con un secuenciador
automático (modelo 377A, Perkin Elmer) utilizando el kit de
secuenciado "Big Dye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction" (Perkin-Elmer) y el iniciador 5'
HO-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-OH3'
correspondiente a la secuencia salvaje del fago. La mezcla de
reacción está compuesta por 5 \mul de ADN a secuenciar, 2,5
moles de oligonucleotidos en 2,5 \mul de agua, 8 \mul de mezcla
"Big Dye^{TM}" que contiene los didesoxirribonucleótidos y
la Taq^{TM} polimerasa, y 4,5 \mul de H_{2}O. Los 25 ciclos de
secuenciado (30 s a 96ºC, 15 s a 50ºC, 4 min a 60ºC) son
realizados en un aparato PCR (Polymerase Chain Reaction) Trioblock
de Biométra. La fracciones de secuencia son purificadas sobre
columna Sephadex G50 equilibrada con tampón TE
[tris-HCl 10 nM pH 8, EDTA 1 mM], secadas y
conservadas a -20ºC hasta su secuenciado. Las secuencias protéicas
son deducidas de las secuencias nucleotídicas con el programa
lógico Geneworks.
Ejemplo
6
Se han fijado durante una noche a 4ºC en cámara
húmeda 100 \mul de los anticuerpos anti-HBsAg
2G2G10 o 8B4H7 o de un anticuerpo no pertinente utilizado como
control negativo a la concentración final de 100 \mug/ml en
tampón NaHCO_{3} 0,1 M, sobre unas hileras de pocillos de placas
ELISA "Nunc Maxisorb". La placa es a continuación saturada 2
horas a 4ºC en solución de saturación [NaHCO_{3} 0,1M; BSA 50
mg/ml; NaN_{3} 0,02%]. Después de 4 lavados con
TBS-Tween 0.5%, 100 \mul de diferentes
concentraciones de fagos diluidos con TBS Tween (1.10^{12},
2,5.10^{11}, 6,2.10^{10} y 4.10^{9} fagos/ml) son añadidos por
pocillo e incubados 2 horas a temperatura ambiente, bajo
agitación. Después de 4 lavados con TBS Tween 0,5%, se incuban 100
\mul/pocillo de anticuerpos anti-M13 acoplado a
la peroxidasa y diluido al 1/5000 en solución de saturación durante
2 horas a temperatura ambiente, bajo agitación. Después de
incubación de 1 hora a 37ºC, la placa es lavada 4 veces con
TBS-Tween 0,5%. Para el revelado, la placa es
incubada con una solución de o-fenilendiamina y
peróxido de hidrógeno (kit color EIA, bioMerieux) durante 10 min en
la oscuridad. La reacción es interrumpida con ácido sulfúrico 1,8
N y la placa es leída a 492 nm, con un lector de placas ELISA (Axia
microreader). Por cada dilución de cada clon, los resultados son
expresados por la diferencia de los valores obtenidos entre el
anticuerpo anti-HBsAg y el anticuerpo de control.
Los resultados son confirmados a continuación ensayando las
diluciones óptimas por triplicado.
Ningún clon inmunorreactivo ha podido ser
seleccionado por el anticuerpo 2G2G10. Por el contrario, el
anticuerpo equivalente 8B4H7 que tiene el mismo paratopo pero de
clase IgG2a ha permitido seleccionar unos clones inmunorreactivos
(tabla 1). Además dos de estos clones (HWWKHPTRYSLG y
HPLKQYWWRPSI) son también reconocidos por el anticuerpo 2G2G10.
| Secuencia de los clones | Frecuencia de los clones | Reactividad con 8B4H7^{A} | Reactividad con 2G2G10^{B} | |
| HKMHSHPRLTSP | 13/36 | <0,1^{c} | ||
| HWGNHSKSHPQR | 6/36 | <0,1 | ||
| WHKAVPRWLASP | 4/36 | 0,8 | 0,4^{d} | <0,1^{c} |
| HMAHRWQSFLRP | 2/36 | <0,1 | ||
| RVHKRHRTQKNA | 1/36 | >2,5 | <0,1 | |
| HWWKHTPRYSLG | 1/36 | >2,5 | 0,5 | >2,5 |
| HFFKLSNWRTTP | 1/36 | 22,5 | <0,1 | |
| HPLKQYWWRPSI | 1/36 | <0,1 | 0,4 |
La inmunorreactividad de los clones ha sido
determinada por ELISA como se indica en el ejemplo 6, con
8B4H7^{a} o 2G2G10^{b} fijado sobre la fase sólida y los clones
de fagos son añadidos a la dilución final de 8 X 10^{10}
fagos/ml^{c} y 2 X 10^{10} fagos/ml^{d}.
\newpage
Ejemplo
7
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos han
sido comparadas con la secuencia de la proteína recombinante del
HBsAg que ha servido para la obtención del anticuerpo monoclonal
(Galibert et al., 1979) utilizando el programa Mac Vector,
Ver. 4.5 (Kodack). Brevemente, las regiones de altamente similares
son detectadas con el programa LFASTA que busca las mejores
identidades locales (Pearson y Lipman, PNAS 85:
2444-2448 (1988)). Los dos clones inmunorreactivos
con respecto al 2G2G10 han permitido localizar claramente el
epítopo reconocido por 2G2G10 y 8B4H7 en la región
199-208 del HBsAg (Figura 1). En efecto,
HWWKHPTRYSLG tiene 4 residuos idénticos y 3 residuos similares con
la secuencia 199-208 mientras que HPLKQYWWRPSI
comparte 3 residuos idénticos y 1 residuo similar con la secuencia
201-205.
Ejemplo
8
El formato utilizado es un formato tipo sándwich
que utiliza el anticuerpo monoclonal 2G2G10 o 8B4H7 en captura y
un anticuerpo policlonal de cabra anti-HBs en
detección.
La Sociedad Nacional de Transfusión Sanguínea de
Lille ha suministrado unos sueros de pacientes que comprenden
varios subtipos (muestras diluidas). Dichos sueros han sido probados
con el anticuerpo monoclonal 2G2G10 en captura y un anticuerpo
policlonal de cabra anti-HBs en detección. Los
resultados son presentados en la tabla 2 siguiente. Las muestras
probadas son identificadas según su subtipo y su origen. Los
resultados son expresados en señal detectada con respecto a un
valor umbral. El valor umbral corresponde a cinco veces a la señal
de la muestra negativa. Los valores cuya señal/valor umbral es
superior a 1 son positivos.
| Identificación de la muestra/subtipos | Señal/Valor umbral |
| 41- adw 2-(US+Asia) | 2,91 |
| 42- adw 4-(Eur. + Am.sud) | 3,04 |
| 43- adr - (Asia) | 2,94 |
| 44- ayw 1 | 3,00 |
| 45- ayw 2-(Europa sur) | 3,94 |
| 46- ayw 3-(Europa-Asia) | 3,42 |
| 47- ayw 3 | 3,07 |
| 48- ayw 4-(Africa) | 4,02 |
| 49- ayr -(japón) | 4,00 |
| 50-Negativo/diluyente de las muestras | 0,2 |
Se han ha probado unos plasmas de la seroteca de
bioMerieux en las mismas condiciones que las anteriores utilizando
a la vez el anticuerpo monoclonal 2G2G10 y el anticuerpo monoclonal
8B4H7 en capture. Los resultados son presentados en la tabla 5
siguiente. Son expresados en señal/valor umbral. El valor umbral
corresponde a cinco veces la señal de la muestra negativa. Los
valores cuya señal/valor umbral sean superiores a 1 son
positivos.
| muestra | 2G2G10//señal/valor umbral | 8B4H7//señal/valor umbral |
| MAP 52 1/600 | 25,7 | 29,4 |
| MAP 97 1/50 000 | 24,6 | 36,1 |
| MAP 59 1/3000 | 42,2 | 43,0 |
| MAP 62 1/7000 | 46,0 | 47,6 |
| muestra | 2G2G10//señal/valor umbral | 8B4H7//señal/valor umbral |
| MAP 64 1/6000 | 54,7 | 70,7 |
| H80 1/7000 | 58,9 | 56,9 |
| ]44519 1/6000 | 52,2 | 54,0 |
| ]44344 1/16000 | 62,7 | 69,3 |
El anticuerpo 2G2G10 ha sido probado por su
capacidad de detectar unos mutantes HBsAg a partir de los
sobrenadantes de cultivo de las variantes HBsAg recombinantes que
han sido obtenidas del Dr. Carman y preparadas según el método
descrito anteriormente por Ireland et al., (Hepatology 31;
1176-1181 (2000)).
Las dosificaciones han sido realizadas
utilizando una prueba cualitativa fluoroinmunoenzimática
desarrollada en el analizador automático Vidas (marca registrada)
(Weber et al., Journal of Virological Methods 42:
63-74 (1993); Mikkeksen et al., Gynecologic
Obstetric Investigation 41:35-40 (1996)). Esta
prueba de captura en dos etapas ha sido realizada como sigue:
El anticuerpo 2G2G10 ha sido fijado sobre el
receptáculo en fase sólida (SPR para Receptacle Solid Phase) a la
concentración final de 10 \mug/ml. A continuación se ha puesto a
incubar el SPR, simultáneamente con los sobrenadantes de cultivo
que contienen las proteínas recombinantes que corresponden a las
diferentes variantes y el anticuerpo policlonal de cabra
biotinilado antiHBsAg. A continuación la segunda etapa ha utilizado
el conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina para
la reacción fluorométrica.
Como muestra la Tabla 4, en comparación con otro
anticuerpo anti-HBsAg 6H6B6, el anticuerpo 2G2G10
es capaz de detectar las diferentes variantes probadas. En efecto,
las muestras BA3.2 y T5N llevan respectivamente las mutaciones
C124R y T23N que afectan, como así lo han indicado Ireland et
al., (Hepatology 31: 1176-1181 (2000)), la
secreción del antígeno en los sobrenadantes de los cultivos
probados. Por lo tanto la ausencia de detección de estos dos
sobrenadantes no se puede tener en cuenta.
| Reactividad de los anticuerpos ani-HBsAg con respecto a variantes HBsAg | |||
| Mutaciones en el MHR | Muestra | 2G2G10 | 6H6B6 |
| Secuencia standard | Gly D | 3,3 | 3,0 |
| Secuencia standard | Gly Y | 4,9 | 4,3 |
| Plásmido de control^{a} | 0,2 | 0,3 | |
| P120T | BA 2.4 | 3,3 | 3,5 |
| C121R | J1^{a} | 6,7 | 27,5 |
| T123N | BA 3.4 | 2,2 | 0,3 |
| T123N/C124R | BA 3.2^{a} | 0,2 | 0,3 |
| M133T | SA7 | 3,0 | 2,1 |
| F134L | J2 | 2,3 | 3,0 |
| D144A | AP 3.1 | 4,7 | 0,7 |
| G145R | Arg 1.2 | 7,2 | 0,4 |
| Mutaciones en el MHR | Muestra | 2G2G10 | 6H6B6 |
| Q129R/G130N/A166V | SA6 | 4,6 | 2,6 |
| Q30R/S53L/L98V/Q101R/ S21 0T | HK188 | 27,4 | 24,2 |
| S143L | 1043 Sp | 3,0 | 0,7 |
| P127A/S143L | 1157 Sp | 3,4 | 0,3 |
| P120S/S143L | 1056 Sp | 1,8 | 0,5 |
| Y100S/T118V/R122K/ M133I/ Y134N/P142S/ S143L/G145K | M5 | 2,0 | 0,7 |
| polisubstitucion que incluye D144E | PA17 | 2,5 | 2,3 |
| D99N/122NT123/G145R | T5Na | 0,2 | 0,3 |
| MHR: significa región hidrófila principal. | |||
| \begin{minipage}[t]{145mm}Los resultados están expresados por la señal media de duplicado/valor umbral. Para cada anticuerpo, se ha definido el valor umbral por la señal media de duplicados obtenidos con 0,16 ng/ml de HBsAg plasmático purificado de los subtipos, ad lay\end{minipage} | |||
| ^{a} Muestras no diluidas |
<110> BIOMERIEUX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS
CONTRA VIRUS DE LA HEPATITIS B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> IFB BIOM TOPE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fragmento de la proteína HBSAg del
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipvirus de la hepatitis B
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fragmento de la proteína HBSAg del
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipvirus de la hepatitis B
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Pro Leu Lys Gln Tyr Trp Trp Arg Pro Ser
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fragmento de la proteína HBSAg del
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipvirus de la hepatitis B
\hfill
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Trp Trp Lys His Pro Thr Arg Tyr Ser Leu
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fragmento de la secuencia nucleotídica codificante
para la proteína HBsAg del virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtattggg ggccaagtct gtacagcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un
antígeno HBsAg de tipo salvaje y al menos a una, preferentemente
al menos a dos y ventajosamente a más de dos, formas mutantes del
antígeno HBsAg, uniéndose dicho anticuerpo monoclonal a una
secuencia peptídica que consiste en al menos 6 aminoácidos
contiguos en la región 199-208 del antígeno HBsAg,
y uniéndose ventajosamente a la secuencia peptídica constituida por
la región 199-208 del antígeno HBsAg, según el
numerado definido en la figura 1.
2. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, capaz de unirse al menos a una forma mutante del
antígeno HBsAg que comprende al menos una sustitución de un
aminoácido en el determinante "a" del antígeno HBsAg.
3. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, capaz de unirse al menos a una forma mutante del
antígeno HBsAg que comprende al menos una sustitución de un
aminoácido en el determinante "a" del antígeno HBsAg en las
posiciones 127, 133, 134, 142, 143, 144 o 145 del antígeno HBsAg y
eventualmente al menos otra sustitución de un aminoácido en la
posición 100, 118, 120, 122 del antígeno HBsAg.
4. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende al menos una sustitución que corresponde al
reemplazo de una serina por una leucina en la posición 143 del
antígeno HBsAg.
5. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende al menos una sustitución que corresponde al
reemplazo de un ácido aspártico por una alanina en la posición 144
del antígeno HBsAg.
6. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende al menos una sustitución que corresponde al
reemplazo de una glicina por una arginina en la posición 145 del
antígeno HBsAg.
7. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende al menos una sustitución que corresponde al
reemplazo de una prolina por una alanina en la posición 127 del
antígeno HBsAg y al menos una sustitución correspondiente a un
reemplazo de una serina por una leucina en la posición 143 del
antígeno HBsAg.
8. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende al menos una sustitución que corresponde al
reemplazo de una prolina por una serina en la posición 120 del
antígeno HBsAg y al menos una sustitución correspondiente al
reemplazo de una serina por una leucina en la posición 143 del
antígeno HBsAg.
9. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, capaz de unirse a la forma mutante del antígeno
HBsAg que comprende una sustitución que corresponde al reemplazo de
una tirosina por una serina en la posición 100 del antígeno
HBsAg, una sustitución que corresponde al reemplazo de una treonina
por una valina en la posición 118 del antígeno HBsAg, una
sustitución que corresponde al reemplazo de una arginina por una
lisina en la posición 122 del antígeno HBsAg, una sustitución que
corresponde al reemplazo de una metionina por una isoleucina en la
posición 133 del antígeno HBsAg, una sustitución que corresponde al
reemplazo de una tirosina por una asparagina en la posición 134 del
antígeno HBsAg, una sustitución que corresponde al reemplazo de
una prolina por una serina en la posición 142 del antígeno HBsAg,
una sustitución que corresponde al reemplazo de una serina por
una leucina en la posición 143 del antígeno HBsAg y una sustitución
que corresponde al reemplazo de una glicina por una lisina en la
posición 145 del antígeno HBsAg.
10. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, capaz de unirse a un antígeno HBsAg de tipo
salvaje y al menos a un mutante HBsAg portador de un determinante
"a" codificado por unas secuencias que presentan unas
mutaciones puntuales a nivel de uno o varios codones que codifican
para los aminoácidos 127, 133, 134, 142, 143, 144 y 145 del
antígeno HBsAg, uniéndose dicho anticuerpo monoclonal a la región o
epítopo 199-208 del antígeno HBsAg.
11. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque
pertenece a la clase de las inmunoglobulinas G.
12. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en forma humanizada.
13. Fragmento o derivado de un anticuerpo
monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
seleccionado de entre el grupo que comprende los fragmentos Fab,
Fab', F(ab)2 y scFv.
14. Procedimiento para producir un hibridoma
capaz de producir un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, que consiste en inmunizar un animal
mamífero no humano, preferentemente murino, con un antígeno HBsAg
de tipo salvaje o una forma mutante de un antígeno HBsAg,
eventualmente en forma de un fragmento o de un derivado antigénico
apropiado, en inmortalizar las células productoras de anticuerpos
para formar hibridomas, en cribar los cultivos de hibrodomas contra
el antígeno HBsAg de tipo salvaje y al menos una forma mutante tal
como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10,
eventualmente en forma de un fragmento o derivado antigénico
apropiado, y en seleccionar los hibridomas que producen unos
anticuerpos que se unen al antígeno HBsAg de tipo salvaje y al
menos una forma mutante del tipo definido en cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10.
15. Hibridoma capaz de producir un anticuerpo
monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Procedimiento para producir un anticuerpo
monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que
consiste en cultivar un hibridoma según la reivindicación 15 o
susceptible de ser obtenido según un procedimiento del tipo
definido en la reivindicación 14 in vitro o in vivo y
en recuperar el anticuerpo monoclonal a partir del medio de
cultivo.
17. Procedimiento de detección del antígeno
HBsAg en una muestra, que consiste en poner en contacto la muestra
con al menos un anticuerpo monoclonal tal como el definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un fragmento o
derivado tal como el definido en la reivindicación 13 y la
reivindicación 12 y en poner en evidencia la presencia de al menos
un complejo antígeno/anticuerpo, fragmento o derivado.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
que consiste en poner en contacto una muestra con un anticuerpo
monoclonal tal como el definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, o un fragmento o derivado tal como el
definido en la reivindicación 13 y la reivindicación 12 y al menos
otro anticuerpo seleccionado de entre los anticuerpos policlonales
o monoclonales anti-HBsAg.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó
18 realizado según la técnica denominada de sándwich o de
competición.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que la detección del antígeno HBsAg
es realizada simultáneamente con la detección del anticuerpo
anti-HBc.
21. Composición para diagnóstico que comprende
al menos un anticuerpo monoclonal tal como el definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un fragmento o derivado
tal como el definido en la reivindicación 13 y la reivindicación
12, eventualmente en asociación con al menos un reactivo para la
detección de anticuerpos anti-HBc.
22. Composición para diagnóstico según la
reivindicación 21, que comprende además al menos otro anticuerpo
monoclonal o policlonal para la detección del antígeno HBsAg.
23. Antisuero que comprende un anticuerpo
monoclonal tal como el definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, o un fragmento o derivado tal como el
definido en la reivindicación 13 y la reivindicación 12 o sus
combinaciones.
24. Antisuero según la reivindicación 23, que
comprende además al menos un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales y policlonales
anti-HBsAg, distintos del anticuerpo monoclonal
definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o de un
fragmento o derivado tal como el definido en la reivindicación 13
y la reivindicación 12.
25. Composición farmacéuticamente apropiada para
una utilización terapéutica o profiláctica para una inmunización
pasiva contra el HBV que comprende un anticuerpo monoclonal tal como
el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un
fragmento o derivado tal como el definido en la reivindicación 13 y
la reivindicación 12 o sus combinaciones, en mezcla con un soporte
farmacéuticamente aceptable.
26. Composición farmacéutica apropiada para una
utilización terapéutica o profiláctica para una inmunización
pasiva contra HBV según la reivindicación 25, que comprende además
un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal o una mezcla
de anticuerpos monoclonales y policlonales
anti-HBsAg, distintos del anticuerpo monoclonal
definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o de un
fragmento o derivado tal como el definido en la reivindicación 13
y la reivindicación 12.
27. Anticuerpo anti-idiotipo de
un anticuerpo monoclonal tal como el definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de un fragmento o derivado tal como el
definido en la reivindicación 13 y la reivindicación 12.
28. Composición vacunante que comprende una
cantidad suficiente, para inmunizar un animal contra HBV, de una
composición biológicamente activa que comprende un anticuerpo
monoclonal anti-idiotipo según la reivindicación
27 que induce en el animal la producción de un anticuerpo
anti-anti-idiotipo que reconoce la
región 199-208 del antígeno HBsAg o un
fragmento Fab de dicho anticuerpo anti-idiotipo o
su mezcla y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
29. Péptido inmunogénico que consiste en la
secuencia peptídica que empieza en el aminoácido 199 y termina en
el aminoácido 208 del antígeno HBsAg y está representado como SEC ID
nº: 1.
30. Péptido inmunogénico cuya secuencia
peptídica consiste la secuencia SEC ID nº: 2.
31. Péptido inmunogénico cuya secuencia
peptídica consiste en la secuencia SEC ID nº: 3.
32. Procedimiento para la obtención de
anticuerpos monoclonales según la reivindicación 16, de fragmentos
de anticuerpos monoclonales, o derivados de anticuerpos monoclonales
utilizando un péptido inmunogénico según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 31.
33. Sonda nucléica o iniciador capaz de
hibridarse, en unas condiciones astringentes, con una secuencia
nucleotídica ADN que codifica para la secuencia peptídica de la
reivindicación 29 o con la secuencia nucleótidica ADN
complementaria de dicha secuencia nucleotídica que codifica para la
secuencia peptídica de la reivindicación 29 o con el producto de
transcripción ARN de dichas secuencias nucleotídicas ADN.
34. Sonda nucléica según la reivindicación 33,
capaz de hibridarse, en unas condiciones astringentes, con una
secuencia nucleotídica ADN representada como SEC ID nº: 4 que
codifica para la secuencia peptídica de la reivindicación 29 o con
la secuencia nucleótidica ADN complementaria de SEC ID nº: 4 o con
el producto de transcripción ARN de dichas secuencias nucleotídicas
ADN.
35. Composición para diagnóstico que comprende
al menos una sonda o al menos un iniciador según una de las
reivindicaciones 33 ó 34 para la detección y/o la cuantificación del
virus HBV en una muestra biológica.
36. Procedimiento de diagnóstico in vitro
del ADN y/o del ARN del virus HBV en una muestra biológica,
tal como suero, plasma o muestra de tejido tomada de un paciente
sospechoso de estar infectado por al menos un virus HBV, según el
cual se trata si resulta necesario dicha muestra para extraer el
ADN y/o el ARN, se pone en contacto dicha muestra con al menos una
sonda o al menos un iniciador según la reivindicación 33, en unas
condiciones de astringencia determinadas y se detecta y/o cuantifica
el ADN y/o el ARN viral de la muestra, o bien evidenciando una
hibridación de dicho ADN y/o ARN viral con al menos una sonda, o
bien por amplificación de dicho ADN y/o ARN.
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| US20110097270A1 (en) * | 2005-01-14 | 2011-04-28 | Schofield Darren J | Monoclonal Antibodies That Bind or Neutralize Hepatitis B Virus |
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| ES2712686T3 (es) * | 2012-07-10 | 2019-05-14 | Green Cross Corp | Una composición de anticuerpos para la prevención o el tratamiento de una infección por un virus de la hepatitis B mutante |
| CN105263522B (zh) * | 2013-05-31 | 2019-03-22 | 赛特瑞恩股份有限公司 | 可中和乙肝病毒的结合分子 |
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