ES2243002T3 - Anticuerpos y otras moleculas de union especificas para antigenos virales de la hepatitis b. - Google Patents

Abstract

la invención se refiere a anticuerpos y a otras moléculas de unión específicos para antígenos virales de la hepatitis B (HBV), a péptidos que comprenden epítopos reconocidos por las moléculas y a líneas celulares capaces de producir anticuerpos. La invención se refiere además a la utilización de las moléculas en las diagnosis del virus de la hepatitis B (HBV). La invención se refiere además a un procedimiento para la diagnosis de la hepatitis B, el procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con la molécula de unión específica de acuerdo con la invención. De forma más adecuada, la invención se refiere a un procedimiento para la diagnosis de la hepatitis B, el procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con al menos una molécula de unión específica dirigida a la región S del HBV y al menos una molécula de unión específica De acuerdocon la invención. La invención se refiere además a un equipo de ensayo para la detección de partículas o antígeno de la hepatitis B, el equipo comprende una molécula de unión específica De acuerdo con la invención y medios para detectar cuándo la molécula de unión específica se une a una partícula o antígeno del virus de la hepatitis B.

Description

Anticuerpos y otras moléculas de unión específicas para antígenos virales de la hepatitis B.

La presente invención se relaciona con un método y un kit para el diagnóstico in vitro de la hepatitis B.

El virus que causa la hepatitis B o hepatitis sérica parece infectar sólo al hombre y a los chimpancés. La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en humanos tiene una amplia distribución.

La infección de la hepatitis se transmite por tres mecanismos generales: (1) por inoculación parenteral de sangre o fluidos orgánicos infectados, ya sea en grandes cantidades, como en las transfusiones sanguíneas, o en cantidades diminutas, como a través de un pinchazo cutáneo; (2) por estrecho contacto familiar o sexual, y (3) por algunas madres, quienes, infectadas durante la gestación, transmiten el virus a sus hijos recién nacidos. En condiciones naturales, el VHB no es altamente contagioso. La transmisión por inhalación se produce raramente, si es que llega a producirse.

La vía de transmisión por sangre o productos sanguíneos contaminados es una amenaza importante para la salud humana.

La infección con VHB da lugar frecuentemente a enfermedad hepática autolimitada subclínica o aguda, o puede dar lugar a infección crónica a largo plazo. La infección crónica por VHB provoca un espectro de entidades morbosas que va desde la forma más severa de hepatitis activa crónica (HAC)) hasta la hepatitis persistente crónica menos grave (HPC) y hasta el estado de portador asintomático (PAS). Se ha desarrollado recientemente una serie de ensayos diagnósticos para ayudar al clínico a diferenciar las infecciones por el virus de la hepatitis B de otras formas de hepatitis vírica (es decir, VHA, VHE, VHC). Sin embargo, la capacidad para distinguir entre una infección por hepatitis B aguda (HA-B) y una infección por hepatitis B crónica sintomática (HC-B) es aún problemática. Esto es especialmente cierto, ya que los pacientes con HAC y HPC demuestran con frecuencia un patrón cíclico de hepatitis, caracterizado por exacerbaciones agudas (E.A.) de lesión hepática alternando con función hepática normal.

Tras la infección con VHB, están presentes en el suero grandes cantidades del virus y de partículas asociadas. Durante las fases sintomáticas de la infección, los pacientes con VHB tanto agudos como crónicos tienen elevados niveles de enzimas hepáticas, poseen el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en el suero y producen anticuerpos frente al antígeno de la nucleocápside (HBcAg). No se detectan anticuerpos específicos para el HBsAg o el antígeno de la hepatitis B e (HBeAg). La aparición de anticuerpos para HBsAg no se observa normalmente hasta aproximadamente dos meses después de desaparecer el HBsAg circulante. Se sabe que las partículas víricas presentes en el suero eliminan su capa superficial, exponiendo la nucleocápside, conocida como el antígeno nuclear (HBcAg). La producción de anticuerpos para HBcAg se produce inicialmente en el curso de la fase aguda de la infección por VHB y puede persistir durante muchos años y los pacientes con infección crónica pueden producir altos títulos de anticuerpos anti-HBc.

El HBsAg se establece como el marcador más importante de la infección por hepatitis B aguda o crónica, detectable en el suero de individuos infectados. El rastreo de HBsAg de sangre de donantes, por ejemplo, es esencial para evitar la transmisión de la hepatitis B. Está claro que la sensibilidad es de la mayor importancia en ensayos diagnósticos para el VHB.

Antígenos de superficie del VHB (HBsAg)

Los antígenos de superficie del VHB (HBsAg) son los productos de la traducción de un gran marco abierto de lectura ("ORF") que se demarca en tres dominios; cada uno de estos dominios comienza con un codon ATG en-marco que puede funcionar como sitio de iniciación de la traducción. Se hace referencia a estos dominios como Pre-S1, Pre-S2 y S en su respectivo orden 5' a 3' en el gen. Así, estos dominios definen tres polipéptidos a los que se hace referencia como S o HBsAg (226 aminoácidos), Pre-S2 + S (281 aminoácidos) y Pre-S1 + Pre-S2 + S (289-400 aminoácidos), a los que también se hace referencia, respectivamente, como proteína mayor (proteína S), proteína media (proteína M) y proteína grande (proteína L) (Toillais y col., 1985, Nature, 317, 489-495).

Definición de un subtipo de HBsAg

El HBsAg en la parte de la envuelta vírica de VHB tiene un determinante "a" específico de grupo bien caracterizado y dos conjuntos de determinantes de subtipo mutuamente excluyentes d/y y w/r. Así, cuatro subtipos mayores de HBsAg - adw, ayw, adr y ayr - denotan los fenotipos del virión (Le Bouvier y col., 1975, Amer. J. Med. Sci. 270, 165). Con la subdivisión de la especificidad de "a" en a1, a2 y a3 y otras especificidades intermedias que se redefinieron posteriormente como subdeterminantes de w (w1-w4) en un taller internacional en París en 1975 (Courouce y col., 1976, Bibl. Hematol., Basel, Karger, Vol. 42), la aparición de subtipos de HBsAg adquirió un considerable grado de complejidad. Estos subtipos eran ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4 y adr. Con la identificación del determinante q (Magnius y col., 1975, Acta Pathol. Micr. Scand., 83B, 295-297), el número de subtipos aumentó de ocho a nueve, debido a la subdivisión del subtipo adr en una categoría q-positiva y una q-negativa (Courouce-Pauty y col., 1978, Vox Sang, 35, 304-308). La secuenciación de los genomas completos codificantes de los subtipos adw2 y ayw3 reveló numerosas substituciones en todo el genoma (Valenzuela y col., 1980, ICN-UCLA, Symposia on Animal Virus Genetics, NY, Ac. Press, pp. 57-70). Se reivindicó que una serie de estas substituciones en el gen S se asociaban con la expresión de la especificidad de d e y (Okamoto y col., 1986, J. Gen. Virol. 67, 2305-2314). Análisis de patrones de reactividad con anticuerpos monoclonales después de la modificación química del HBsAg revelaron la importancia de la Lys 122 para la expresión del determinante d (Peterson y col., 1984, J. Immun. 132, 920-927). Estudios posteriores en donantes de sangre portadores de antígenos de superficie de los subtipos compuestos adyr y adwr, respectivamente, mostraron que substituciones de aminoácidos en la posición 122 y 160 solas explicaban la expresión de la especificidad d/y y w/r, respectivamente (Okamoto y col., 1987, J. Virol., 61, 3030-3034). Los dos cambios de d a y y de w a r estaban mediados por un cambio de Lys a Arg en las posiciones correspondientes. Por lo tanto, existen variaciones mayores de subtipos de HBsAg.

Definición de un genotipo HBsAg

La secuenciación de genomas víricos y la comparación han definido cuatro grupos genómicos de VHB con una divergencia del 8% o más del genoma completo y se les designó con A-D (Okamoto y col., 1988, J. Gen. Virol., 69, 2575-2583). Se encontraron genomas codificantes del subtipo adw en los grupos genómicos A-C, mientras que se encontraron todos los genomas codificantes de ayw en el grupo D y en el grupo B (Sastrosoewignjo y col., 1991, J. Gastroenterol. Hepatol., 6, 491-498). Los genomas codificantes tanto del subtipo adr como del ayr aparecían en el grupo genómico C junto con adw.

También se identificaron recientemente dos nuevos genotipos de VHB designados con E y F (Norder y col., 1994, Virology, 198, 489-503).

Mutantes de escape inmune en relación a los genotipos

Aparte de la variabilidad genética del VHB en base a la divergencia de las cepas de VHB a lo largo de prolongados períodos de tiempo, que dan lugar a subtipos y genotipos geográficamente relacionados, se ha centrado recientemente un considerable interés en dos tipos de mutantes de escape inmune. El primero de éstos que se va a describir era una mutación del Trp 28 a un codon de parada en la secuencia prenuclear, que evitaba específicamente la expresión de HBsAg, aunque dejando la de HBcAg sin afectar (Carman y col., 1989, Lancet, ii, 588- 591; Brunetto y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4186-4190).

Se han descrito mutantes de escape vacunales que tienen el determinante "a" de HBsAg, una parte importante del cual está formada por un bucle que abarca los residuos de aminoácidos 139-147 estabilizado por un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína en estas posiciones (Waters y col., 1991, Virus Res., 22, 1-12; Stirk y col., 1992, Intervirology, 33, 148-158). Se reveló una mutación de Gly a Arg en el residuo 145 de HBsAg en varios vacunados en Italia (Carman y col., 1990, Lancet, ii, 325-329) y Singapur (Harrison y col., 1991, J. Hepatol. 13 (supl. 4), S105-107). Otra supuesta mutación de escape vacunal de Lys a Glu en la posición 141 ha sido sólo descrita de África Occidental (Allison y col., 1993, Abstr. Ixth Int. Congr. of Virology, Glasgow, pp. 1-118; Howard y col., 1993, Abstr. Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver Disease, Tokyo, pp. 1-75). Es interesante el hecho de que este mutante sólo ha sido encontrado hasta la fecha en asociación con el subtipo ayw4. Más recientemente, varios nuevos mutantes fueron, entre otros, descritos en la literatura por Brind y col., 1997, J. of Hepatology, 26: 228-235; Kohno y col., 1996, J. of Gen. Virol. 77: 1825-1831; Ni y col., 1995, Res. Virol. 146: 397-407.

Está claro por lo anterior que se ha de detectar todo tipo de mutaciones en las proteínas de HBsAg para rastrear la sangre de donantes y otras fuentes.

Por ejemplo, Okomoto y col. (1992) ya mostraron que la afinidad entre mutantes de HBsAg y anticuerpos monoclonales anti-HBs con especificidadepitópica conocida se alteraba por substitución en el aminoácido 145 ó 126 en la región S (Okamoto y col., 1992, Pediatric Research 32: 264-268). La substitución con arginina de la glicina en el aminoácido 145 en la vacuna de levaduras también da lugar a una unión marcadamente reducida por anticuerpos monoclonales (Waters y col., 1992, J. of Clin. Invest., 90: 2543-2547). También se ha descrito que la antigenicidad de HBsAg se debilita por substitución del aminoácido 141 (Karthigesu y col., 1994, J. Gen. Virol., 75: 443-448).

Se han descrito ya varios casos de positividad a HBsAg que han desestimado por el fallo de los ensayos serológicos actuales para detectar algunas formas variantes del antígeno (Suzuki y col., 1995, Int. Hepatology Comm., 4: 121-125; Carman y col., 1995, The Lancet 345: 1406-1407; Jongerius y col., 1997, Ned Tijdschr Geneesk 141 (22), 1128).

Afrontando los problemas anteriores, muchas compañías de diagnóstico cambiaron sus ensayos usando anticuerpos policlonales como anticuerpos de captura en lugar de usar anticuerpos monoclonales altamente específicos.

Sin embargo, los inconvenientes de usar anticuerpos policlonales se dirigen principalmente a la pobre reproductibilidad y a la especificidad y sensibilidad desconocidas de los anticuerpos individuales en el total de todos los anticuerpos presentes en el suero policlonal.

Se desconocerá siempre, por lo tanto, si se detectarán variantes recién documentadas antes del rastreo.

Otra aproximación es hallar nuevos anticuerpos monoclonales para la región S de HBsAg que reconozcan una región bien conservada.

La región S de HBsAg es de la mayor importancia y, por lo tanto, es la primera región que se ha de investigar. La región pre-S de HBsAg es también un posible candidato.

Se ha descrito una serie de epitopos inmunogénicos en la región pre-S de HBsAg. Por ejemplo, Meisal y col., Intervirology, 37(6), 1994, 330-339, describen dos epitopos localizados entre los aminoácidos 131-144, llamado grupo I, y entre 162-168, llamado grupo III.

Se usó una región casi similar, los aminoácidos 130-145, para caracterizar el anticuerpo monoclonal H8, Lee y col., Biochemistry and Molecular Biology International, 40(6), 1996, 1077-1085; Lee y col., Biochemistry and Molecular Biology International, 34(1), 1994, 159-168; Park y col., Molecules and Cells, 4(4), 1994, 413-417, y EP
0.521.348.

Tres grupos de dominios inmunogénicos fueron identificados por Nimms y col., Virology, 176, 1990, 604-619, y en EP 0.456.215. El primer grupo se extendía desde el aminoácido 130 hasta el aminoácido 132 de HBsAg. El segundo grupo requería un glicano rico en manosa en la asparraguina 123 y el tercer grupo estaba formado por la región carboxi-terminal de HBsAg, específicamente por los residuos de aminoácidos 150-174.

Neurath y col., Molecular Immunology, 24, 1987, 975-980, describen una posible influencia del aminoácido 132 de HBsAg sobre la unión del F376 monoclonal. Se sugería que posiblemente también los aminoácidos 128-131 podrían estar implicados.

Dash y col., Hepatology, 13(1), 1991, 124-142, usaron un péptido sintético correspondiente a la región de aminoácidos 120-145 de HBsAg para producir anticuerpos policlonales.

Habría que hacer notar que hay variantes de HBsAg conocidas que no tienen una proteína codificada pre-S en su material vírico (Santantonio y col., 1992, Virology, 188, 948-952).

En la misma referencia, se describe la heterogeneidad de las secuencias pre-S del VHB codificantes de las proteínas de la envuelta por amplificación de ADN y secuenciación directa de los genomas víricos. En algunos pacientes, se vieron deleciones en la región pre-S, principalmente agrupadas en el extremo amino-terminal de la región pre-S2. Los datos indicaban una alta prevalencia de genomas de VHB que sólo pueden expresar mutantes de deleción de las proteínas pre-S2 y la mayor parte de ellos no pueden expresar una proteína pre-S2 en absoluto. Según los resultados, la mayoría de las deleciones no deben prevenir la síntesis de HBs.

La heterogeneidad descrita de los mutantes pre-S predice que se pueden obtener resultados falso-negativos cuando se usan enzimoinmunoensayos con anticuerpos monoclonales para proteínas pre-S únicamente para su detección en suero de portadores crónicos.

Es hacia el problema anterior hacia donde la invención se dirige.

Se describe una molécula que es capaz de unirse específicamente a un determinante antigénico de la hepatitis B y que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal dirigido contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos RDSHPQAMQWNSTTFHQA-LLDPRVRGLYFPAGGSSSGT. También se describen fragmentos que contienen al menos parte de la secuencia de aminoácidos RDSHPQAMQWNSTTFHQAL o SHPQAMQWNSTTFHQ
ALLDPR o ALLDPRVRGL-YFPAGGSSSGT y fragmentos MQWN, STTFHQA o VRGLYFPA.

Una molécula preferida capaz de unirse específicamente a un determinante antigénico de la hepatitis B y que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal segregado por la línea celular HB.OT104A, HB.OT107C o HB.OT230B. Estas líneas celulares han sido depositadas en la European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, bajo los números de acceso ECACC-97062610, ECACC-(97062609 y 98042805) o ECACC-97062608, respectivamente.

Dicho determinante antigénico de la hepatitis B se localiza en la región pre-S del VHB.

Una molécula de unión específica, tal como un anticuerpo, presenta competición cruzada con otra si se une precisamente a la misma localización, o a una conformacionalmente ligada, que el otro. Las localizaciones conformacionalmente ligadas pueden ser localizaciones adyacentes sobre la cadena polipeptídica del antígeno, o pueden estar ligadas en virtud de la estructura secundaria de la cadena polipeptídica, que puede provocar el plegamiento adyacente de regiones por lo demás no adyacentes. Los experimentos de competición cruzada son relativamente fáciles de llevar a cabo (Waters y col., 1991) y, por lo tanto, es sencillo determinar si un anticuerpo dado u otra molécula de unión específica compite cruzadamente con el anticuerpo monoclonal al que se ha hecho específicamente referencia anteriormente.

Las moléculas de unión específica que presentan competición cruzada al menos parcial con los anticuerpos monoclonales especificados (es decir, cuya competición cruzada es significativamente mayor que %) son útiles en la invención. Se prefieren las moléculas de unión específica que presentan competición cruzada total (es decir, cuya competición cruzada no es significativamente menor del 100%), al menos en algunas circunstancias.

Las moléculas de unión específica útiles en la invención serán con frecuencia ellas mismas anticuerpos. Aunque no se excluyen los anticuerpos policlonales, se preferirán, en general, los anticuerpos monoclonales, debido a su especificidad mucho más precisa. La tecnología de los anticuerpos monoclonales se ha establecido bien desde el trabajo original de Köhler y Milstein (1975, Nature, 256, 495) y existen hoy en día muchos protocolos disponibles para la generación rutinaria de anticuerpos monoclonales. Son técnicas adecuadas, por ejemplo, las de Gefter y col. (1977, Somatic Cell Genetics, 3, 231), Köhler y col. (1976, Euro. J. Immuvirol., 292-295) y Goding ("Monoclonal antibodies: Principle and Practice" (2ª Edición, 1986), Academic Press, New York).

Típicamente, el protocolo usado es el siguiente:

-

un animal experimental (tal como un ratón) es inmunológicamente inoculado con el antígeno contra el cual se van a producir anticuerpos;

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se fusionan entonces las células esplénicas del animal con células de una línea celular de mieloma y se plaquean las células de fusión del hibridoma resultante en medio selectivo;

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se realiza el rastreo de anticuerpos específicos por cualquier técnica, por ejemplo, usando anticuerpos anti-inmunoglobulinas de otras especies.

Aunque el uso de anticuerpos monoclonales humanos puede ser, en principio, preferido para determinadas aplicaciones, en particular para la terapia humana y el diagnóstico in vivo, las dificultades técnicas hacen que la tecnología de hibridomas convencional sea inapropiada para la generación de muchos anticuerpos monoclonales humanos. Por lo tanto, se usan con frecuencia en la práctica anticuerpos monoclonales no humanos, tales como de origen murino.

También se incluyen en el alcance de la invención anticuerpos quiméricos, particularmente anticuerpos monoclonales quiméricos. Dichos anticuerpos quiméricos incluyen suficientes secuencias de aminoácidos de HB.OT104A, HB.OT107C y HB.OT230B como para tener su especificidad característica. Como mínimo, las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo especificado estarán presentes en un grado suficiente para mantener la especificidad. Puede ser que estén presentes todos los dominios V_{H} y V_{L}, o incluso todos los fragmentos de unión a anticuerpo, tales como los fragmentos Fab o F(ab')_{2} enzimáticamente derivados.

Existen varias tecnologías diferentes para preparar anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, se han descrito anticuerpos quiméricos consistentes en una región C humana fusionada a una región V de roedor (Morrison y col., 1984, PNAS, 81, 6851-6855; Boulianne y col., 1984, Nature, 312, 643-646; Neuberger y col., 1985, Nature, 314, 268-270).

También se han descrito anticuerpos totalmente humanizados, particularmente anticuerpos monoclonales. Existen actualmente tres métodos independientes para humanizar anticuerpos no humanos (particularmente murinos). Reichmann y col. (1988, Nature, 332, 323-327) usaron mutagénesis dirigida a sitio sobre ADN de una sola hebra. En otra aproximación, tanto Jones y col. (1986, Nature, 321, 522-525) como Queen y col. (1989, PNAS, 86, 10029-10033) construyeron toda la región V usando oligonucleótidos solapantes que incorporaban regiones determinantes de complementariedad de roedores ("CDR") en un marco humano. Más recientemente, Lewis y Crowe (1991, Gene, 101, 297-302) han adaptado la metodología de la reacción en cadena de polimerasa ("PCR") a la injertación de CDR de roedores en marcos de inmunoglobulinas humanas.

Se pueden determinar las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales a partir de ADN complementario clonado y de las regiones hipervariables (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) identificadas según Kabal y col. (en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Usando cualquiera de los métodos anteriores, se pueden injertar estas CDR en un marco humano.

Los anticuerpos de un solo dominio ("dAbs") de Ward y col. (1989, Nature, 341, 544-546) representan otra clase de moléculas de unión específica (tanto si son o no apropiados para ser considerados como "anticuerpos"), que pueden ser usadas dentro del alcance de la presente invención. En esta aproximación, se usa PCR u otra tecnología apropiada para clonar un gen V_{H} o V_{L} y expresarlo en un hospedador heterólogo, tal como E. coli.

Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras pueden ser amplificados a partir del hibridoma usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y clonados en vectores de expresión. Los dominios variables aislados pueden ser rastreados para la unión a antígeno y se puede determinar su afinidad. Se pueden obtener otros anticuerpos de un solo dominio directamente amplificando por los genes de dominio variable reorganizados a partir de ADN esplénico de un ratón inmunizado. Se puede clonar el ADN amplificado en un vector y rastrearlo luego en cuanto a actividad de unión a antígeno. Un refinamiento usando bacteriófago como vector de expresión permite al fago que lleva los genes variables ser seleccionado directamente con antígeno, ya que se expresan sobre la superficie celular (McCafferty y col., 1990, Nature, 348, 552-554).

La tecnología de dAbs indica cómo la metodología del ADN recombinante está cambiando por completo la generación de moléculas que tienen capacidades de unión específica. Por esta razón, si no por otra, la invención no ha de ser considerada como restringida a anticuerpos, tal como se entienden el sentido clásico (ya sean policlonales o monoclonales).

También se describe una línea celular o cultivo celular capaz de expresar, y preferiblemente segregar, moléculas de unión específica según se ha descrito anteriormente.

En este aspecto de la invención, se encuentran líneas celulares de hibridomas a las que se ha hecho referencia específicamente antes. Estas líneas celulares han sido depositadas en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, bajo los números de acceso y fechas mostrados en la siguiente tabla:

Línea celular	Fecha de depósito	Nº de acceso
HB.OT104A	26-06-1997	97062610
HB.OT107C	26-06-1997	97062609
	28-04-1998	98042805
HB.OT230B	26-06-1997	97062608

Estos depósitos han sido hechos bajo los términos del Tratado de Budapest.

Se ha descrito anteriormente un método generalizado para producir otros anticuerpos monoclonales. Para asegurarse de que puedan ser utilizados en la invención, se puede hacer reaccionar un experimento de competición cruzada simple con anticuerpos segregados por la línea celular depositada.

Se pueden usar los anticuerpos antes definidos y otras moléculas de unión en aplicaciones diagnósticas en combinación con anticuerpos específicamente dirigidos a otras regiones del VHB, como la región S.

Si se usa en combinación, sólo es necesaria una prueba. En este caso, los anticuerpos dirigidos contra la región S sí reconocen también las variantes de VHB que carecen de la región pre-S.

Los anticuerpos y otras moléculas de unión, cuando se usan según la presente invención, superan la omisión de individuos infectados por VHB en el diagnóstico de la infección por VHB. Con estos anticuerpos, el concepto de prueba de HBsAg basado en la región S del VHB podría mejorar. Se confirma la detección de mutantes de
HBsAg.

Los anticuerpos y otras moléculas de unión que se usan en la presente invención son herramientas útiles para la detección de la expresión de VHB en células y extractos celulares tanto in vivo como in vitro con fines de purificación y para una variedad de técnicas de análisis bioquímicos e inmunológicos para estudiar la función de estas proteí-
nas.

También se describe un péptido consistente en al menos una parte de la secuencia de aminoácidos RDSHPQ-AMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT.

En una realización específica, el péptido tiene al menos parte de la secuencia de aminoácidos RDSHPQAMQWNS
TTFHQAL. Un fragmento específico preferido es MQWN.

En otra realización específica, el fragmento es un péptido que tiene al menos parte de la secuencia de aminoácidos SHPQAMQWNSTTFHQALLDPR. Un fragmento específico preferido es STTFHQA.

Otro fragmento es un péptido que tiene al menos parte de la secuencia de aminoácidos ALLDPRVRGLYF
PAGGSSSGT. Un fragmento específico preferido es VRGLYFPA.

La definición de péptidos óptimos (sintéticos o recombinantes) que representan dominios inmunodominantes de HBsAg, capaces de substituir a los péptidos o proteínas existentes en pruebas diagnósticas es de crucial importancia para detectar todas las posibles muestras positivas a HBsAg.

Estos péptidos pueden ser sintetizados con una elevada reproductibilidad y son fácilmente purificados y, por lo tanto, bien adecuados para mejorar aún más y estandarizar la serología del VHB.

Los péptidos sintéticos tienen la ventaja de estar químicamente bien definidos, permitiendo así la producción fácil y reproducible con altos rendimientos, bien adecuada para aplicación en ensayos diagnósticos, que pueden ser fabricados y usados con mayor reproductibilidad.

Contrariamente a las proteínas HBsAg naturales, los péptidos usados en la presente invención tienen la gran ventaja de ser de un origen no infeccioso seguro.

El término "péptido", tal como se usa aquí, se refiere a una cadena molecular de aminoácidos con actividad biológica y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, entre otros, se incluyen proteínas, proteínas o péptidos de fusión, oligopéptidos y polipéptidos.

Si es necesario, los péptidos para uso en la invención pueden ser modificados in vivo o in vitro, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación. Son variantes funcionales, por ejemplo, las sales de adición de ácido, las amidas, los ésteres, y específicamente los ésteres C-terminales, y los derivados N-acilo de los péptidos.

El término "al menos una parte", tal como se usa aquí, significa una subsecuencia de la secuencia identificada de aminoácidos. Dicha parte o fragmento es una región que tiene uno o más determinantes antigénicos de las proteínas HBsAg. Se pueden producir fragmentos, entre otros, por escisión enzimática de moléculas precursoras, usando endonucleasas de restricción para el ADN y proteasas para los (poli)péptidos. Otros métodos incluyen la síntesis química de los fragmentos o la expresión de fragmentos peptídicos por fragmentos de ADN.

La preparación de los péptidos o fragmentos de los mismos para uso en la invención es efectuada por medio de uno o más métodos conocidos de química orgánica para la síntesis de péptidos o con ayuda de técnicas de ADN recombinante, que también son conocidas en este campo. Los péptidos pueden también combinarse en una sola molécula.

Como ya se ha indicado anteriormente, los péptidos usados en la invención pueden igualmente ser preparados con ayuda de técnicas de ADN recombinante. Esta posibilidad tiene importancia particularmente cuando se incorpora el péptido en una secuencia repetitiva ("en tándem") o cuando se puede preparar el péptido como un constituyente de una proteína o polipéptido (mucho mayor) o como una proteína de fusión con, por ejemplo, (parte de) la \beta-galactosidasa. Este tipo de péptidos, por lo tanto, pueden ser igualmente usados en la invención.

Los péptidos o sus fragmentos preparados y descritos anteriormente pueden ser también usados para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, y otras moléculas de unión.

Según la presente invención, se facilita un método para el diagnóstico de la hepatitis B, cuyo método consiste en poner en contacto la muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con al menos una molécula de unión específica dirigida a la región S del VHB y al menos una molécula de unión específica según la presente invención, según se reivindica.

Los métodos de diagnóstico según la presente invención pueden ser llevados a cabo in vitro.

Un método particularmente adecuado para la detección de HBsAg en una muestra se basa en una reacción de competición entre un péptido según la invención provisto de una substancia de marcaje y partículas o antígenos de la hepatitis B (presentes en la muestra), mediante la cual el péptido y el antígeno compiten con la molécula de unión específica según la presente invención unida a un soporte sólido.

Otra realización preferida de la presente invención se dirige a un método para la detección de anticuerpos para la hepatitis B, cuyo método consiste en poner en contacto la muestra sospechosa de contener anticuerpos para partículas o antígenos de la hepatitis B con al menos un péptido como se ha descrito anteriormente.

En los ensayos in vitro, se usa alguna forma de soporte para inmovilizar las moléculas o péptidos de unión según la presente invención. Los soportes que se pueden usar son, por ejemplo, la pared interna de un pocillo de microensayo o una cubeta, un tubo o capilar, una membrana, un filtro, una tira de ensayo o la superficie de una partícula, como, por ejemplo, una partícula de látex, una partícula de aldehído (tal como una partícula magnetizable de cerámica con grupos superficiales aldehído activos), un eritrocito, un sol colorante, un sol metálico o un compuesto metálico como partícula de sol, o una proteína de soporte tal como BSA o KLH.

También se usa alguna forma de marcaje para detectar la interacción antígeno-anticuerpo. Las substancias de marcaje pueden ser radiactivas o no radiactivas, como un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un sol colorante o un sol metálico o compuesto metálico como partícula de sol. Dependiendo del formato del ensayo, se pueden marcar las moléculas de unión específica dentro del alcance de la invención u otras moléculas de unión específica que se unan a ellas. Se pueden usar inmunoensayos (incluyendo radioinmunoensayos) y ensayos inmunométricos (incluyendo radioensayos inmunométricos y ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas), al igual que técnicas de inmunotransferencia.

Los ensayos in vitro pueden adoptar muchos formatos. Algunos dependen del uso de moléculas de unión específica marcadas, tales como anticuerpos (cuyo uso se incluye en el alcance de la invención), mientras que algunos detectan la interacción de anticuerpo (u otra molécula de unión específica) y antígeno observando la precipitación resultante. Éstos son bien conocidos en la técnica.

Los ensayos in vitro serán con frecuencia llevados a cabo usando kits. Según otro aspecto de la presente invención, se facilita un kit de ensayo para la detección de partículas o antígenos de la hepatitis B, consistiendo el kit en una molécula de unión específica según se ha descrito antes y medios para detectar si la molécula de unión específica se une a una partícula o antígeno de la hepatitis B según se reivindica.

La metodología de ensayo puede ser, por ejemplo, cualquiera de los ensayos a los que se ha hecho referencia anteriormente. Se prefieren los kits de inmunoensayo competitivo y especialmente en sandwich. La molécula de unión específica y los medios de detección pueden ser presentados en compartimentos separados del kit. La molécula de unión específica puede ser presentada unida a un soporte sólido. Los medios de detección pueden consistir en una segunda molécula de unión específica marcada detectable (que puede ser a su vez un anticuerpo monoclonal, pero preferiblemente policlonal) que se une a la partícula o antígeno de la hepatitis B unidos.

Una realización preferida de la presente invención es un kit de ensayo para la detección de una partícula o antígeno de la hepatitis B, cuyo kit consiste en al menos una molécula de unión dirigida a la región S del VHB y al menos una molécula de unión específica según la presente invención y medios para detectar si la molécula de unión específica se une a una partícula o antígeno de la hepatitis B.

Otra realización preferida de la presente invención es un kit de ensayo para la detección de anticuerpos para la hepatitis B, cuyo kit consiste en al menos un péptido según la presente invención y medios para detectar si el péptido se une a anticuerpos para la hepatitis B.

Al llevarse a cabo una reacción en sandwich para la detección de anticuerpos para la hepatitis B, el kit de ensayo puede consistir, por ejemplo, en un péptido según la invención depositado en un soporte sólido, por ejemplo, la pared interna de un pocillo de microensayo, y o bien un péptido marcado, o bien un anti-anticuerpo marcado.

Para llevar a cabo una reacción de competición, el kit de ensayo puede incluir un péptido depositado en un soporte sólido y una molécula de unión específica marcada.

También se describe el uso de una molécula de unión específica para el diagnóstico in vitro de la hepatitis B. Los anticuerpos y otras moléculas de unión pueden ser útiles en el desarrollo y el control de calidad de ensayos serológicos y para la detección directa del VHB.

También se describe el uso de las moléculas de unión específica descritas en métodos inmunológicos y bioquímicos destinados a detectar la proteína de longitud completa en una muestra de fluido o tejido de ensayo.

La invención es además ejemplificada mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Producción y selección de anticuerpos (monoclonales)

Se produjeron los anticuerpos murinos anti-PreS HB.OT107C, HB.OT104A y HB.OT230B inyectando ratones Balb/c con HBsAg nativo en adyuvante completo de Freund. Se obtuvo el HBsAg de sueros de donantes infectados con VHB. Después de dos meses, se reforzó a los ratones con el antígeno mezclado en adyuvante incompleto de Freund, repitiéndolo después de dos semanas. Tras días después, se extirpó el bazo y se fusionaron los linfocitos esplénicos según el manual CRL G6-1 con células de mieloma de ratón P3x63Ag8653 (ATCC CRL 1580) usando polietilenglicol 1000 según métodos estándar. Se rastrearon las células de hibridoma en cuanto a la producción de anticuerpos anti-PreS usando péptidos específicos y/o HBsAg desnaturalizado. Se necesitaron varios ciclos de clonación por dilución limitante para conseguir una línea celular estable con un 100% de clonalidad.

Ejemplo 2 Determinación del epitopos mínimo de los anticuerpos Materiales y método

Se determinó el epitopo mínimo de HB.OT107C y HB.OT104A usando el método pepscan estándar (Geysen y col., 1987, J. Immunol. Meth. 102, 259-274). Se acortaron péptidos basados en la secuencia "MQWNSTTFHQAL" en el extremo N o C y se estudiaron con HB.OT104A y HB.OT107C. Se realizaron experimentos similares con péptidos acortados basados en la secuencia "LDPRVRGLYFPA" y mAb HB.OT230B. Para la determinación del epitopo mínimo de HB.OT107C, se prolongó la serie con péptidos basados en la secuencia "STTFHQAL" acortados en el extremo C.

Resultados

Los resultados mostrados en la Tabla 3 indican que la primera metionina (M) en el extremo N de la secuencia Pre-S2 es esencial para la reactividad del mAb HB.OT104A. El epitopo mínimo probablemente incluye al menos los aminoácidos "MQW". En el caso de HB.OT107C, la reactividad disminuye si se elimina la serina (S) o la treonina (T) del extremo C. El epitopo de HB.OT107C podría incluir los aminoácidos S (124) y T (126).

TABLA 3

1

Se investigó aún más el epitopo de HB.OT107C usando péptidos basados en la secuencia "STTFHQAL". En la Tabla 4 se muestran los resultados. La secuencia reactiva mínima incluye los aminoácidos "STTF". Esto concuerda con los resultados mostrados en la Tabla 3. La reactividad de la secuencia "STTFHQA" es comparable a la reactividad del péptido 12-mérico original, "MQWNSTTFHQAL", pero, si se acorta la secuencia "STTFHQA" en el lado C-terminal, la reactividad disminuye. Aún se obtiene una reactividad muy baja, pero que se puede medir, con la secuencia "STT".

TABLA 4

Mapa de epitopo mínimo del mAb HB.OT107C usando péptidos basados en la secuencia "124-STTFHQAL-131"
Secuencia	Reactividad
	HB.OT107C
MQWNSTTFHQAL	2061
NSTTFHQAL	2045
STTFHQAL	2102
STTFHQA	2174
STTFHQ	1777
STTFH	1757
STTF	1626
STT	327
ST	97
S	218

En el caso de HB.OT230B, se obtuvo la mayor reactividad con el péptido 12-mérico completo, que incluía la secuencia "132-LDPRVRGLYFPA-143". La eliminación de la alanina (A) del extremo C del péptido da lugar a un fuerte descenso de la reactividad con el anticuerpo. Los péptidos en los que se elimina la leucina (L) y/o el ácido aspártico (D) del extremo N aún muestran una alta reactividad. La eliminación de la primera prolina (P) del extremo N, sin embargo, reduce fuertemente la reactividad del péptido, pero, si se eliminan tanto P como la primera arginina (R), la reactividad aumenta de nuevo. Según los resultados, el epitopo mínimo de HB.OT230 incluye probablemente la secuencia "VRGLYFPA".

TABLA 5

Mapa de epitopo mínimo de HB.OT230B usando péptidos basados en la secuencia "DPRVRGLYFPA"
Secuencia	HB.OT230B	Secuencia	HB.OT230B
DPRVRGLYFPA	1753	LDPRVRGLYFP	208
PRVRGLYFPA	1036	LDPRVRGLYF	103
RVRGLYFPA	650	LDPRVRGLY	102
VRGLYFPA	1467	LDPRVRGL	90
RGLYFPA	302	LDPRVRG	87
GLYFPA	282	LDPRVR	73
LYFPA	365	LDPRV	88
YFPA	96	LDPR	78
FPA	77	LDP	85
PA	80	LD	89
A	92	L	88
LDPRVRGLYFPA	2022

Ejemplo 3 Substitución de aminoácidos por alanina (A) Materiales y método

En péptidos 12-méricos reactivos con los mAbs HB.OT104A y/o HB.OT107C ("MQWNSTTFHQAL" y "STTFH QALLDPR") o HB.OT230B ("LDPRVR GLYFPA"), se substituyó cada aminoácido por una alanina (A). Si la alanina (A) aparecía de forma natural en la secuencia básica, se la substituyó por serina (S). Se determinó la reactividad de cada péptido usando la tecnología pepscan estándar.

Resultados

En la Tabla 6, se muestran los resultados del estudio Ala basado en el péptido "MQWNSTTFHQAL". Si se substituía la metionina (M) o el triptófano (W) en el extremo N por alanina (A), la reactividad del péptido con el mAb HB.OT104A disminuía fuertemente. Este hallazgo concuerda con los resultados del mapa de epitopos. El epitopo mínimo de HB.OT104A probablemente incluye la secuencia "MQW", pero, aparentemente, los aminoácidos M (120) y W (122) son los más esenciales para la reactividad del anticuerpo.

La reactividad de HB.OT107C era más sensible a las substituciones considerando la serina (S) o la fenilalanina (F) localizadas en mitad del péptido. En todos los casos, sin embargo, la reactividad nunca cayó drásticamente. Según el mapa de epitopos, tanto S (124) como F (127) se localizan en un área reconocida por HB.OT107C. Los resultados fueron confirmados en un estudio Ala basado en el péptido "124-STTFHQALLDPR-135" (en la Tabla 7 se muestran los resultados), pero, en este caso, la substitución de ambos aminoácidos tuvo un efecto más drástico sobre la reactividad del péptido. Tanto la serina (S-124) como la fenilalanina (F-127) parecen ser importantes para la reactividad de HB.OT107C.

TABLA 6

Estudio Ala de HB.OT104A y HB.OT107C. Substitución de cada aminoácido subsiguiente en la secuencia
peptídica "120-MQWNSTTFHQAL-131". A-130 es substituido por serina (S)
Secuencia	HB.OT104B	HB.OT107C	Aminoácido
MQWNSTTFHQAL	2198	2353	-
AQWNSTTFHQAL	460	2292	M
MAWNSTTFHQAL	1932	2281	Q
MQANSTTFHQAL	93	2224	W
MQWASTTFHQAL	2157	2501	N
MQWNATTFHQAL	1753	1679	S
MQWNSATFHQAL	2060	2319	T
MQWNSTAFHQAL	1853	1983	T
MQWNSTTAHQAL	2214	1601	F
MQWNSTTFAQAL	2025	2314	H
MQWNSTTFHAAL	2264	2097	Q
MQWNSTTFHQSL	2263	2086	A
MQWNSTTFHQAA	2138	1873	L

TABLA 7

Estudio Ala de HB.OT107C en base al péptido "124-STTFHQALLDPR-135"
Secuencia	HB.OT107C	Aminoácido
STTFHQALLDPR	2426	-
ATTFHQALLDPR	427	S
SATFHQALLDPR	1285	T
STAFHQALLDPR	1425	T
STTAHQALLDPR	220	F
STTFAQALLDPR	2279	H
STTFHAALLDPR	2342	Q
STTFHQSLLDPR	1714	A
STTFHQAALDPR	2058	L
STTFHQALADPR	2206	L
STTFHQALLAPR	1728	D
STTFHQALLDAR	1961	P
STTFHQALLDPA	2506	R

TABLA 8

Estudio Ala de HB.OT230B. Cada aminoácido subsiguiente en la secuencia 132-LDPRVRGLYFPA-143 fue
substituido por alanina (A). Se substituyó A (143) por serina (S)
Secuencia	HB.OT230B	Aminoácido
LDPRVRGLYFPA	2211	-
ADPRVRGLYFPA	1408	L
LAPRVRGLYFPA	960	D
LDARVRGLYFPA	1895	P
LDPAVRGLYFPA	1745	R
LDPRARGLYFPA	1553	V
LDPRVAGLYFPA	2060	R
LDPRVRALYFPA	946	G
LDPRVRGAYFPA	93	L
LDPRVRGLAFPA	157	Y
LDPRVRGLYAPA	1155	F
LDPRVRGLYFAA	1363	P
LDPRVRGLYFPS	1845	A

En la Tabla 8, se muestran los resultados del estudio de substitución con Ala considerando la reactividad del mAb HB.OT230B. Está claro que la substitución de la leucina (L-139) o de la tirosina (Y-140) tenía un efecto drástico sobre la reactividad del mAb HB.OT230B. Probablemente, ambos aminoácidos son esenciales para la reactividad. Según los resultados del mapa, el epitopo mínimo de HB.OT230B incluye los aminoácidos "RGLYFPA" (véanse los resultados del mapa de epitopos mínimos), pero claramente los aminoácidos L (139) e Y (140) son muy cruciales para la reactividad.

Ejemplo 4 Reactividad de anticuerpos Pre-S2 con péptidos que incluyen substituciones de aminoácidos naturales Materiales y método

Se incluyeron diversas substituciones de aminoácidos en péptidos basados en la secuencia "MQWNSTTFHQAL", "STTFHQALLDPR" o "LDPGVRGLYFPA". Las mayoría de las substituciones fueron previamente descritas por Norder y col. (1994) y se basaban en variaciones naturales (subtipos) en la región Pre-S2. Se estudiaron los péptidos con los mAbs HB.OT104C y/o HB.OT107C y/o HB.OT230B. Se menciona cada substitución en las Tablas 9, 10 ó 11. Se determinó la reactividad de cada péptido usando la tecnología pepscan estándar como se ha descrito previamente.

Resultados

En base al péptido "MQWNSTTFHQAL", las substituciones de aminoácidos naturales no tenían efectos importantes sobre la reactividad del mAb HB.OT104A (véase la Tabla 9). En el caso de HB.OT107C, la reactividad resultó afectada si se substituía la treonina (T-126) del extremo C del péptido por histidina (H) (véase la Tabla 9). La substitución de la leucina C-terminal (L-131) por glutamina (Q) o la substitución de la arginina (R-135) por glicina (G) dieron también como resultado una marcada reducción de la reactividad del péptido.

TABLA 9

Reactividad del péptido "MQWNSTTFHQAL" con los mAbs HB.OT107C y HB.OT104A incluyendo
substituciones de aminoácidos naturales
Secuencia	HB.OT104A	HB.OT107C	Mutación
MQWNSTTFHQAL	2198	2098
MQWTSTTFHQAL	2173	2343	N/T
MQWNSTAFHQAL	1598	2241	T/A
MQWNSTHFHQAL	2098	192	T/H
MQWNSTTLHQAL	2456	2595	F/L
MQWNSTTFQQAL	2621	2591	H/Q
MQWNSTTFHQVL	1992	1926	A/V
MQWNSTTFHQTL	2282	2332	A/T
MHWNSTTFHQAL	1993	2071	Q/H

TABLA 10

Reactividad del péptido "STTFHQALLDPR" con el mAb HB.OT107C incluyendo substituciones de
aminoácidos naturales
Secuencia	HB.OT107C	Mutación
STTFHQALLDPR	2426	-
STTFHQALQDPR	83	L/Q
STTFHQALLDPG	81	R/G

La reactividad de HB.OT230B resultó afectada por la substitución de glicina (G-138) por valina (V) y de fenilalanina (F-141) por leucina (L). Estos resultados concuerdan con el estudio Ala que mostró que la substitución de glicina (G-138) por alanina (A) y de fenilalanina (F-141) por alanina (A) reducía la reactividad del péptido.

TABLA 11

Reactividad del péptido "LDPRVRGLYFPA" con el mAb HB.OT230B incluyendo substituciones de
aminoácidos naturales
Secuencia	HB.OT230B	Mutación
LDPRVRGLYFPA	2211	-
QDPRVRGLYFPA	1876	L/Q
LDPGVRGLYFPA	1388	R/G
LDPRVRALYFPA	1120	G/A
LDPRVRVLYFPA	280	GN
LDPRVRGLYLPA	400	F/L
LDPRVRGLYFPP	1591	A/P

Ejemplo 5 Rastreo de suero de pacientes mutante en HBsAg Material y métodos

Se usó un suero de pacientes mutante en HBsAg para investigar la sensibilidad de inmunoensayos que incluían una molécula de unión según la presente invención.

En un ensayo, llamado "ensayo básico", sólo se usan anticuerpos monoclonales murinos dirigidos a la región S de HBsAg. En otro ensayo (que es el ensayo según la presente invención), llamado "ensayo mejorado", se añade un anticuerpo monoclonal murino dirigido a la región pre-S de HBsAg a los anticuerpos monoclonales ya presentes en el ensayo básico.

Específicamente, se revistieron pocillos de microelisa con dichos anticuerpos monoclonales. Cada pocillo de microelisa contenía una esfera de conjugado anti-HBs marcado con HRP que incluía anticuerpo para HBsAg (anti-HBs) copulado a peroxidasa de rábano picante ("HRP"), que sirve como conjugado con tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido como substrato.

Se incubaron la muestra de ensayo o controles apropiados en los pocillos de microelisa.

La esfera de conjugado se disuelve en la muestra y se forma un complejo de anticuerpo/HBsAg/anticuerpo marcado enzimáticamente de fase sólida. Después de un lavado y de incubación con substrato TMB, se produce color, que se vuelve amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico. Si hay presencia de HBsAg en la muestra, se desarrolla un color. Sin embargo, cuando la muestra está libre de HBsAg, no se forma, o se forma poco, color con la adición de substrato. Dentro de unos límites, la cantidad de HBsAg en la muestra es proporcional al desarrollo de color.

Se estudia la muestra sin diluir.

Ambos ensayos (ensayo básico y mejorado) fueron llevados a cabo según el mismo procedimiento.

El suero de paciente mutante en HBsAg es:

-

Suero de paciente 1: Mutante 129R/133T.

Esta muestra fue una amable donación del Dr. T. Cuijpers (descrito en Jongerius y col., 1997, Ned Tijdschr Geneesk 141 (22), 1128).

En cada pocillo de ambas placas, se pipetearon 100 \mul de sobrenadante de cultivo o control. Se cubrió la placa, se agitó durante 15 segundos y se incubó a 37 \pm 2ºC durante 1 hora \pm 5 minutos en una incubadora OT500. Después de la incubación, se lavaron las placas cuatro veces con tampón fosfato usando un lavador OT400. En cada pocillo, se pipetearon 100 \mul de substrato TMB y se incubó a 18-25ºC durante 30 \pm 2 minutos. Se detuvo entonces la reacción añadiendo 100 \mul de ácido sulfúrico 1M. Después de hacer el blanco en el lector OT510 al aire, se leyó la absorbancia de la solución en cada pocillo a 450 \pm 5 nm.

Resultados

En la Tabla 12 se muestran los resultados de ambos ensayos.

Para la muestra 129R/133T, el valor de corte para el ensayo básico era 132 y el valor de corte para el ensayo mejorado era 110.

Esta muestra dio un resultado negativo en el ensayo básico, pero dio un resultado positivo en el ensayo mejorado.

Está claro que el ensayo mejorado resultó más reactivo en comparación con el ensayo básico.

TABLA 12

Absorbancia medida a 450 nm del suero de paciente mutante en HBsAg 129R/133T y control negativo
estudiados en el ensayo básico y el ensayo mejorado
Suero mutante de paciente	Ensayo básico	Pos/neg	Ensayo mejorado	Pos/neg
129R/133T	94	neg	113	pos
Blanco	82	neg	60	neg
neg = resultado negativo
pos = resultado positivo
Blanco = media de 3 pocillos individuales

Ejemplo 6 Rastreo de panel mutante HBsAg recombinante Materiales y método

Debido a la falta de sueros de pacientes mutantes en HBsAg bien documentados y disponibles (a excepción de la muestra descrita en el ejemplo 5), se preparó un panel mutante HBsAg recombinante.

Se preparó el panel mutante HBsAg como sigue: Se cultivaron tanto células Cos I como células HepG2 como monocapa en frascos de Roux de 75 cm^{2} en 10 ml de medio MEM de Dulbecco que contenía un 10% de suero de ternera fetal ("FCS") en una incubadora a 37ºC. Cuatro horas antes de la electroporación, se reemplazó el
medio.

Tras la tripsinización, se diluyeron las células en 5 ml de medio y se centrifugaron durante 10 minutos a 233 g en una centrífuga Beckmann GP. Para las líneas de células Cos I, se diluyeron 1,5 x 10^{6} células en 200 \mul de solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") y, para las líneas de células HepG2, se diluyeron 5 x 10^{6} células en 500 \mul de medio. Se añadieron entonces 20 \mul de solución de ADN estéril de cada construcción recombinante de HBsAg a la suspensión celular. Se incubaron las mezclas sobre hielo durante 5 minutos y se pipetearon en una cubeta de 4 mm. Se electroporaron nueve combinaciones de células Cos I más ADN por 300 V y 125 \muF y se electroporaron cuatro combinaciones de células HepG2 más ADN por 235 V y 960 \muF con el Pulsador Génico Biorad. De nuevo, se incubaron las mezclas sobre hielo durante 5 minutos. Se diluyeron las células electroporadas en 5 ml de medio y se cultivaron en placas de 9 cm en una incubadora a 37ºC. Después de aproximadamente una semana de cultivo, se recogió el sobrenadante y se guardó a -20 \pm 2ºC.

Se estudiaron los sobrenadantes derivados de las 9 líneas de células Cos I y de las 4 líneas de células HepG2 en un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas ("ELISA") basado en un principio de sandwich de una etapa. De nuevo, se comparó el ensayo básico con el ensayo mejorado según la presente invención.

Todas las muestras fueron estudiadas sin diluir.

Ambos ensayos (ensayo básico y mejorado) fueron llevados a cabo según el mismo procedimiento.

Se pipetearon 100 \mul de sobrenadante de cultivo o de control en cada pocillo de ambas placas. Se cubrió la placa, se agitó durante 15 segundos y se incubó a 37 \pm 2ºC durante 1 hora \pm 5 minutos en una incubadora OT500. Tras la incubación, se lavaron las placas cuatro veces con tampón fosfato usando un lavador OT400. En cada pocillo, se pipetearon 100 \mul de substrato TMB y se incubó a 18-25ºC durante 30 \pm 2 minutos. Se detuvo entonces la reacción añadiendo 100 \mul de ácido sulfúrico 1 M. Después de hacer el blanco en el lector OT510 al aire, se leyó la absorbancia de la solución en cada pocillo a 450 \pm 5 nm.

Resultados

En la Tabla 13 se muestran los resultados de ambos ensayos.

Las construcciones, es decir, las líneas de células Cos I y las líneas de células HepG2, fueron estudiadas por separado en dos operaciones de ensayo. Operación 1: para todas las líneas de células Cos I, el valor de corte para el ensayo básico era 126, y el valor de corte para el ensayo mejorado era 133. Operación 2: para las líneas de células HepG2 (tipo salvaje y 129/133), el valor de corte para el ensayo básico era 103 y el valor de corte para el ensayo mejorado era 96.

Tres muestras que dieron negativo en el ensayo básico dieron positivo en el ensayo mejorado, es decir, que la mutación Cos I 129/145R, Cos I 145R y HepG2 129/133 dieron negativo en el ensayo básico y positivo en el ensayo mejorado.

En todos los casos, el ensayo mejorado resultó más reactivo (sensible) en comparación con el ensayo básico.

TABLA 13

Absorbancia medida a 450 nm de 9 líneas de células Cos I, 4 líneas de células HepG2 y dichos controles
negativos estudiados en el ensayo básico y el ensayo mejorado
Línea celular/mutación S	Ensayo básico	Pos/neg	Ensayo mejorado	Pos/neg
Cos I 129	1288	pos	2377	pos
Cos I 129/133	> 3000	pos	> 3000	pos
Cos I 129/145R	115	neg	1451	pos
Cos I 145A	1638	pos	> 3000	pos
Cos I 145R	125	neg	> 3000	pos
Cos I WT	> 3000	pos	> 3000	pos
Cos I 129/145A	1609	pos	2717	pos
Cos I 133	587	pos	1456	pos
Blanco 1 Cos	94	neg	119	neg
HepG2 129/133	97	neg	105	pos
HepG2 WT	238	pos	425	pos
HepG2 133	110	pos	165	pos
HepG2 145A	231	pos	467	pos
Blanco 2 HepG2	68	neg	51	neg
neg = resultado negativo
pos = resultado positivo
WT = tipo salvaje

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Akzo Nobel N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Velperweg 76

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(C)

CIUDAD: Amhem

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(E)

PAÍS: Países Bajos

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos y otras moléculas de unión específicas para los antígenos víricos de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv)

FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flotante

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr}

\sac{Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr}

\sac{Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr}

\sac{Phe His Gln Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His}

\sac{Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala}

\sac{Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gln Trp Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Thr Thr Phe His Gln Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Virus de la hepatitis B

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala}

Claims (8)

1. Método para el diagnóstico in vitro de la hepatitis B, cuyo método consiste en hacer reaccionar una muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con al menos una molécula de unión específica (I) inmovilizada sobre un soporte que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal, dirigida contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº 1, y con al menos una molécula de unión específica (II) inmovilizada sobre un soporte dirigida a la región S del VHB, y en detectar la unión de las moléculas de unión específicas a la partícula o el antígeno de la hepatitis B.

2. Métodos según la reivindicación 1, donde la molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.

3. Método según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, donde la molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº 5, 6 ó 7.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la molécula de unión específica (I) es segregada por la línea celular HB.OT104A, depositada bajo el número ECACC 97062610, la línea celular HB.OT107C, depositada bajo el número ECACC 98042805 ó la línea celular HB.OT230B, depositada bajo el número ECACC 97062608.

5. Kit de ensayo para la detección de una partícula o antígeno de la hepatitis B, cuyo kit consiste en al menos una molécula de unión específica (I) que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal, dirigida contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº 1; al menos una molécula de unión específica (II) dirigida a la región S del VHB, y medios para detectar si una molécula de unión específica se une a la partícula o el antígeno de la hepatitis B, que incluye al menos una molécula de unión dirigida contra el antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg).

6. Kit de ensayo según la reivindicación 5, donde la molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.

7. Kit de ensayo según la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, donde la molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº 5, 6 ó 7.

8. Kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la molécula de unión específica (I) es segregada por la línea celular HB.OT104A, depositada bajo el número ECACC 97062610, la línea celular HB.OT107C, depositada bajo el número ECACC 98042805 ó la línea celular HB.OT230B, depositada bajo el número ECACC 97062608.