ES2252461T3 - Glicoproteina rica en histidina (hrgp) para la inhibicion de la angiogenesis. - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación de un polipéptido antiangiogénico, comprendiendo: la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre la migración inducida por el FGF-2 de células primarias endoteliales capilares del córtex adrenal bovino; y la identificación de dicho polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando dicha migración inducida por el FGF-2 se ve disminuida de forma significativa en presencia de dicho polipéptido HRGP.

Description

Glicoproteina rica en histidina (HRGP) para la inhibición de la angiogénesis.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención está relacionada con la inhibición de la angiogénesis y, más en particular, con la utilización de la proteína glicoproteina rica en histidina (HRGP) para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

Descripción del campo relacionado con la misma

La HRGP es una proteína plasmática de unión a la heparina identificada por Heimburger et al. Ver Heimburger et al. (1972) Physiol. Chem. 353:1133-1140. La concentración media de HRGP en el plasma es de alrededor de 100 \mug/ml. Ver Drasin y Sahud (1996) Thrombosis Research 84:179-188. Han sido resueltas las secuencias aminoacídicas de la HRGP de ratón, de rata (Hulett y Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78:280-287), de conejo (Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934) y de humano (Koide et al. (1986) Biochemistry 25:2220-2225). Estructuralmente la molécula de HRGP puede ser dividida en tres dominios principales. El dominio amino terminal, que comprende alrededor de 250 residuos aminoacídicos, contiene dos tramos del tipo inhibidor cisteina-proteasa (cistatina), lo cual permite la clasificación de la HRGP como un miembro de una superfamilia de la cistatina junto con la glicoproteina \alpha2HS y el kininogén. Existen seis sitios putativos para la glicosilación ligada a N en la parte amino terminal de la HRGP. Un dominio central contiene repeticiones en tándem del pentapéptido [H/P]-[H/P]PHG. Tanto el dominio central como el dominio C-terminal de 105 aminoácidos se encuentran unidos por medio de enlaces disulfuro con los tramos de tipo cistatina en el dominio amino terminal (Borza et al., 1996). La HRGP se une a los sulfatos de heparina/heparán (Lijnen et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:3803-3808) en una interacción dependiente del pH (Peterson et al (1987) J. Biol. Chem. 262:7567-7574). El dominio medio rico en histidina-prolina aislado media la unión con la heparina (Borza et al., 1996), pero el dominio amino terminal ha estado también implicado en la unión a la heparina. Ver Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244. Se ha trazado un mapa de una deficiencia congénita de HRGP hasta llegar a una mutación de nucleótido único, lo cual da como resultado un reemplazo de Gly85 por Glu en la HRGP. Esta mutación lleva a un procesamiento inadecuado de la proteína, la mayor parte de la cual es retenida intracelularmente. Como consecuencia de ello, los niveles de suero de HRGP se ven reducidos a un 25-30% de los niveles normales. Ver Shigekiyo et al. (1993) Thromb. Haemost. 70:263-265 y Shigekiyo et al. (1998) Blood 91:128-133. La HRGP inhibe el efecto antiangiogénico del trombospondín 1 en ensayos in vivo de angiogénesis córnea (Simantov et al. (2001) J. Clin. Invest. 107:45-52).

La angiogénesis, el proceso de generación de nuevos vasos sanguíneos que lleva a la neovascularización, es esencial durante el desarrollo embriónico, la ovulación, el desarrollo cíclico del endometrio uterino, la curación de heridas, el crecimiento de tejidos y órganos, la inflamación y curación de heridas. Se cree que un desequilibrio en la neovascularización contribuye a la patogénesis de ciertos estados de enfermedad, tales como la artritis, la psoriasis, los hemangiomas, la retinopatía diabética y la fibroplasia retrolental, y que permite que tenga lugar el crecimiento de tumores y la metástasis. Ver, por ejemplo, la Patenta americana 5.854.205. Las células tumorales deben atraer nuevos vasos para expandirse localmente y producir metástasis.

Resumen

La invención está basada en el descubrimiento de que la administración de HRGP a un mamífero da como resultado la inhibición de la angiogénesis.

En un aspecto, la invención ofrece una composición incluyendo un polipéptido HRGP y un agente antiangiogénico y/o un agente antineoplástico. La composición puede incluir un portador farmacéutico aceptable para la administración a un mamífero. El polipéptido HRGP puede incluir, por ejemplo, HRGP intacta, un polipéptido HRGP modificado, o un fragmento de HRGP intacta. Este fragmento de HRGP intacta puede incluir, aunque sin estar limitado a los mismos, el dominio amino terminal, el dominio central o el dominio C-terminal de la HRGP intacta, o un fragmento incluyendo, al menos, una repetición en tándem del pentapéptido [H/P]-[H/P]PHG. El agente antiangiogénico puede ser, por ejemplo, la angiostatina, la trombostatina, la endostatina, el interferón \alpha, el factor 10 inducible por interferón, el factor plaquetario 4 o un inhibidor de la COX-2.

La presente invención está relacionada también con la composición comprendiendo un polipéptido HRGP en combinación con un agente antiangiogénico y/o un agente antineoplástico, para su utilización como un medicamento. Adicionalmente, la invención está relacionada con la utilización de dicha combinación para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

También son ofrecidos en la invención artículos de fabricación, incluyendo materiales de embalaje y un polipéptido HRGP en combinación con un agente antiangiogénico y/o antineoplástico dentro del material de embalaje, en donde el material de embalaje incluye una etiqueta o inserción en el embalaje indicando que el polipéptido HRGP es para ser administrado a un mamífero para la inhibición de la angiogénesis.

En otro aspecto, la invención ofrece la utilización de un polipéptido HRGP para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis en un mamífero. El mamífero puede tener un cáncer dependiente de angiogénesis, o puede sufrir una dolencia relacionada con la angiogénesis. Tal dolencia asociada a la angiogénesis puede incluir, aunque sin estar limitada a las mismas, la angiogénesis miocárdica, la retinopatía diabética, la neovascularización diabética, la curación inadecuada de heridas o una enfermedad inflamatoria.

En otro aspecto, la invención ofrece un método para identificar un polipéptido antiangiogénico. El método puede comprender la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre la migración inducida por el FGF-2 de células primarias endoteliales capilares del córtex adrenal bovino, y la identificación del polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando la migración inducida por el FGF-2 se ve disminuida significativamente en presencia del polipéptido HRGP. Alternativamente, el método puede comprender la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre la angiogénesis en la membrana corioalantóica de pollo, y la identificación del polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando la angiogénesis en la membrana corioalantóica de pollo se ve disminuida significativamente en presencia del polipéptido HRGP. En otra alternativa, el método puede comprender la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre el crecimiento de un tumor dependiente de angiogénesis en un mamífero, y la identificación del polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando el crecimiento del tumor se ve disminuido significativamente en presencia del polipéptido HRGP. El polipéptido HRGP puede ser un fragmento de HRGP. El tumor dependiente de angiogénesis puede ser, por ejemplo, un fibrosarcoma, un neuroblastoma o un teratoma. El tumor puede ser cultivado, por ejemplo, en un ratón o una rata.

A menos que sea definido de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados poseen el mismo significado por el que son entendidos usualmente por una persona con un conocimiento ordinario en el campo al que pertenece la invención. Aunque pueden ser utilizados en la práctica y pruebas de la presente invención métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos aquí descritos, son descritos los métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, será la que rija. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitadores.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención son presentados en los dibujos que se acompañan y en la descripción que sigue. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes tendiendo en cuenta la descripción y dibujos, así como las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los efectos de la HRGP sobre la migración celular endotelial inducida por el FGF-2. Fueron analizadas células endoteliales capilares bovinas primarias (BCE) para determinar su habilidad para migrar hacia el FGF-2 en una cámara mini-Boyden, en presencia o ausencia de HRGP. Son mostrados los valores medios \pm SEM de tres experimentos distintos.

La Figura 2 es un gráfico representando la inhibición del crecimiento tumoral con la administración de HRGP. En la Figura 2A ratones hembra C57BL6/J fueron inoculados subcutáneamente con 0,5x10^{6} células T241 en solución salina en tampón de fosfato (PBS). Cuando los tumores fueron palpables (tratamiento día 0) los animales fueron asignados aleatoriamente para recibir un tratamiento de 11 días con 4 mg/kg/día con HRGP (n=8) o PBS (n=10) por medio de inyección subcutánea. En la Figura 2B un grupo paralelo de ratones portadores de tumores T241 palpables fueron inyectados con PBS (N=6) o con antitrombina clivada por termolisina (N=6). AT= antitrombina clivada por termolisina.

La Figura 3 muestra dominios mayores de HRGP incluyendo: una parte N-terminal de tipo cistatina, un dominio medio rico en histidina/prolina y una región C-terminal. Son también mostradas una HRGP de longitud total con un marcador His (His 1) y dos polipéptidos truncados en el C-terminal (His 3-4). 6xHis= marcador His, EK= sitio de clivaje por enteroquinasa. Los números 390 y 320 indican el residuo C-terminal de los polipéptidos truncados. Las barras marcadas 0115, 0116 y 0119 indican las posiciones de los péptidos contra los que fueron preparados anticuerpos de conejo.

La Figura 4 muestra el efecto de la HRGPr sobre la migración inducida por FGF-2 y suero. A. La migración inducida por el FGF de las células BCE fue inhibida por medio de 100 ng/ml de HRGPr. La migración inducida por suero (FCS) no fue inhibida por la HRGP. B. La curva de respuesta por dosis de la HRGPr contra la migración inducida por el FGF de células BCE. El FGF-2 fue utilizado en dosis de 5 ng/ml.

Descripción detallada

Ha sido descubierto que la HRGP procedente de plasma humano purificada inhibe la angiogénesis en la membrana corioalantóica (CAM), la migración celular endotelial y el crecimiento tumoral. El tratamiento de la CAM con factores de crecimiento, como el factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF-2) o el factor de crecimiento celular endotelial vascular A (VEGF-A) estimula la angiogénesis en la CAM. Sorprendentemente, la aplicación de un exceso molar de diez veces de HRGP, junto con el FGF-2 o el VEGF-A, da como resultado la supresión de la angiogénesis. Las células endoteliales capilares bovinas primarias (BCE) migran hacia el FGF-2 con un incremento del 150% sobre la migración basal en una cámara mini-Boyden. Este incremento en la migración fue suprimido completamente al co-incubar con HRGP. Finalmente, fue observado que inyecciones de HRGP purificada llevaron a una drástica reducción en el crecimiento tumoral de fibrosarcoma en ratones, reduciéndose el tamaño de los tumores en un 75%. Ver Ejemplo 9 y Figura 2. Basándose en estos descubrimientos inesperados, los polipéptidos HRGP son un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades o procesos que son mediados por, o en los que es parte, la angiogénesis. Los polipéptidos HRGP serán particularmente útiles para el tratamiento o represión del crecimiento de cánceres dependientes de angiogénesis.

Los polipéptidos HRGP de la presente invención pueden ser purificados procedentes de suero humano de recogida reciente, o producidos por medio de metodologías recombinantes de sobra conocidas. Las composiciones farmacéuticas comprendiendo polipéptidos HRGP pueden ser administradas a sujetos en los que se desee inhibir la angiogénesis. Conforme a la presente invención, los polipéptidos HRGP son utilizados en combinación con otros compuestos antiangiogénicos y/o compuestos antineoplásticos, para el tratamiento de enfermedades.

La presente invención incluye también kits, comprendiendo materiales de embalaje y un polipéptido HRGP aislado, en combinación con un agente antiangiogénico y/o agente antineoplástico, en donde el material de embalaje comprende una etiqueta o inserción en el embalaje indicando que el polipéptido HRGP ha de ser administrado a un mamífero para la inhibición de la angiogénesis.

Producción de polipéptidos HRGP

La invención proporciona la utilización de polipéptidos HRGP substancialmente puros. El término "substancialmente puro", conforme es aquí utilizado en referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido se encuentra substancialmente libre de otros polipéptidos, lípidos, carbohidratos y ácido nucleico, con los cuales se asocia de manera natural. De esta forma, un polipéptido substancialmente puro es cualquier polipéptido que es separado de su ambiente natural. Conforme es aquí utilizado, un polipéptido HRGP substancialmente puro puede ser puro, al menos, en un 60%, y puede ser puro, al menos, alrededor de un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%. Usualmente, un polipéptido substancialmente puro proporcionará una banda única grande sobre un gel de poliacrilamida no reduc-
tor.

Son conocidos el ADNc y las secuencias aminoacídicas de la HRGP procedente de distintas especies diferentes. Son conocidos el ADNc completo y las secuencias aminoacídicas de la HRGP de humano (Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244), de rata y ratón (Hulett y Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78:280-287). Son conocidas una secuencia parcial de ADNc, a la que le falta la región codificadora de la secuencia líder, y la secuencia aminoacídica deducida de longitud total de la HRGP de conejo. Ver Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934. También se encuentra disponible una secuencia parcial aminoacídica de HRGP bovina, derivada por medio de secuenciación proteínica directa. Ver Sorenson et al. (1993) FEBS Lett. 328:285. Han sido identificados cinco polimorfismos aminoacídicos en HRGP humana por Hennis et al.: IIe162, Pro186, His322, Arg430 y Asn475. Ver Hennis et al. (1995) Thromb. Haemost. 74:1491 y Hennis et al. (1995) Thromb. Haemost. 74:1497. En Shigekiyo et al. han identificado un polimorfismo adicional Glu85. Ver Shigekiyo et al. (1998) Blood 91:128.

Se observará que el término "polipéptido HRGP" no solo incluye a la HRGP intacta. El término "polipéptido HRGP" incluye también proteínas o péptidos alargados, en donde son añadidos uno o más aminoácidos a cada uno de los extremos, o a ambos, de la HRGP, o a una región interna de la HRGP. El término "polipéptido HRGP" incluye también polipéptidos HRGP marcados con restos o toxinas detectables, tales como la ricina.

El término polipéptido HRGP incluye a los polipéptidos que contienen uno de los tres dominios principales de la molécula de HRGP, y fragmentos funcionales de los mismos. El dominio amino terminal, comprendiendo alrededor de 250 residuos aminoacídicos, contiene dos tramos del tipo inhibidor cisteina-proteasa (cistatina). Existen seis sitios putativos para la glicosilación ligada a N en el dominio amino terminal de la HRGP. El dominio central contiene repeticiones en tándem del pentapéptido [H/P]-[H/P]PHG, y el dominio C-terminal contiene 105 aminoácidos. Tanto el dominio central como el dominio C-terminal están unidos por enlace disulfuro a los terminales tipo cistatina en el dominio amino terminal (ver Borza et al., 1996). El dominio medio rico en histidina-prolina aislado media la unión con la heparina dependiente del pH (Borza et al., 1996). El dominio amino terminal se ha visto implicado también en la unión a la heparina.

El término polipéptido HRGP incluye, por ejemplo, polipéptidos acortados que contienen una secuencia aminoacídica que tiene una longitud de 75 o más residuos aminoacídicos (por ejemplo, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 320, 325, 350, 390, o más residuos aminoacídicos) y que es idéntica a cualquier trozo de una secuencia aminoacídica de HRGP.

En algunas realizaciones, los polipéptidos HRGP retienen la actividad antiangiogénica del polipéptido HRGP intacto. Tales polipéptidos HRGP mantienen, al menos, el 5% (por ejemplo, el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, o incluso más) de la actividad antiangiogénica de la HRGP intacta de longitud completa. La actividad antiangiogénica es ensayada en la CAM o a través de la migración celular endotelial, descrita más abajo.

Se encuentran incluidos también en la definición de "polipéptido HRGP" los "polipéptidos HRGP modificados". Tales polipéptidos HRGP modificados retienen la actividad antiangiogénica.

Los polipéptidos HRGP modificados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, polipéptidos HRGP con substituciones de aminoácidos naturales en sitios específicos por otras moléculas, incluyendo, aunque sin estar limitados a los mismos, los aminoácidos naturales o no naturales. También se encuentran incluidos los polipéptidos HRGP conteniendo una secuencia aminoacídica que contenga una única inserción, un único borrado, una única substitución, múltiples inserciones, múltiples borrados, múltiples substituciones, o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, un único borrado junto con múltiples inserciones). Estas distintas modificaciones pueden ser realizadas utilizando métodos de sobra conocidos en este campo, incluyendo técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y mutagénesis dirigidas a un punto in vitro, con el fin de introducir uno o más cambios aminoacídicos o para cortar la secuencia codificadora de la proteína en residuos aminoacídicos predeterminados. Ver, por ejemplo, Kunkel et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492.

También se encuentran incluidos dentro de la definición de polipéptidos HRGP modificados los polipéptidos HRGP ligados a otros compuestos, tales como polímeros de glicol de polietileno (PEG). La derivatización de grupos amino en la superficie de los polipéptidos -tales como los polipéptidos HRGP- con compuestos que contienen PEG puede extender la vida útil en circulación de tales polipéptidos y reducir sus propiedades antigénicas potenciales. Ver Beauchamp et al. (1983) Anal. Biochem. 131(1):25-33. El peso molecular del PEG utilizado no está particularmente limitado, usualmente es desde 300 a 30.000, preferiblemente desde 1.000 a 15.000. El método de modificación con PEG puede ser cualquiera de los conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, Beauchamp et al. (1983) Anal. Biochem. 131(1):25-33.

Adicionalmente, un polipéptido HRGP modificado, dentro del ámbito de la invención, puede ser "fabricado" para contener una secuencia aminoacídica que permita al polipéptido ser capturado en una matriz de afinidad. Por ejemplo, puede ser utilizado un marcador -como c-myc, hemaglutinina, polihistidina, o un marcador Flag™ (Kodak)- para ayudar en la purificación del polipéptido. Tales marcadores pueden ser insertados en cualquier lugar dentro del polipéptido, incluyendo en el terminal carboxilo o en el amino. Los polipéptidos HRGP pueden ser producidos también como fusiones con enzimas que ayudan en la detección del polipéptido, tales como la fosfatasa alcalina.

Puede ser utilizado cualquier método para obtener un polipéptido HRGP substancialmente puro. Por ejemplo, la HRGP intacta procedente de plasma humano fresco puede ser purificada, siguiendo los procedimientos, por medio de cromatografía sobre fosfocelulosa en presencia de inhibidores de proteinasa. Ver Rylatt et al. (1981) Eur. J. Biochem. 119:641-646 o Kluszynski et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13541-13547. La proteína resultante es pura en un 95%, conforme es estimado por medio de electrofóresis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). Los dominios de la HRGP -incluyendo el dominio N-terminal, el dominio C-terminal y el dominio central- pueden ser aislados de la HRGP sometida a proteólisis limitada de la plasmina, siguiendo el método explicado en Borza et al. (1986) Biochemistry 35:1925-1934. Puede ser utilizado cualquier material como una fuente de obtención de un polipéptido substancialmente puro. Por ejemplo, pueden ser utilizadas células de cultivo tisular expresando un polipéptido determinado de interés con el fin de obtener un polipéptido substancialmente puro. Adicionalmente a las técnicas de purificación del polipéptido, tales como cromatografía por afinidad y HPLC, pueden ser utilizadas técnicas de síntesis de polipéptidos para producir un polipéptido HRGP.

Los polipéptidos HRGP pueden ser producidos también por medio de métodos recombinantes. Las secuencias de ADNc de HRGP de conejo (Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934) de rata, ratón (Hulett y Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78:280-287) y de humano (Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244) son conocidas en este campo. Son de sobra conocidos los métodos para la expresión de un producto proteínico procedente de un clon de ADNc. Ver, por ejemplo, Maniatis et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., páginas 16.1-17.44. El polipéptido HRGP producido puede ser tanto un polipéptido HRGP intacto o un fragmento de HRGP. Sistemas de expresión adecuados incluyen, sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante del bacteriófago, de ADN plásmido, o de ADN cósmido; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el baculovirus); sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores de expresión plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) conteniendo secuencias nucleótidas de proteína de fusión; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células HEK, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38 y NIH 3T3) transformadas con constructos de expresión conteniendo promotores procedentes del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneina), o procedentes de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus y el promotor 7.5K del virus vaccinia). Son útiles también como células anfitrionas las células primarias o secundarias obtenidas directamente de un mamífero, transfectadas con un vector plásmido o infectadas con un vector viral como los virus del herpes, los retrovirus, los virus vaccinia, los virus vaccinia atenuados, los virus de viruela del canario, los adenovirus, los virus adenoasociados, los lentivirus y los virus del herpes, entre otros.

Ensayos para determinar la actividad antiangiogénica

La actividad antiangiogénica puede ser medida por medio del ensayo CAM, esencialmente conforme es descrito en Friedlander et al. y Dixelius et al. Ver Friedlander et al. (1995) Science 5241:1500 y Dixelius et al. (2000) Blood 95:3403. Brevemente, practicando una ventana de 1x1 cm en la cáscara se expone una zona avascular de la CAM de un embrión de pollo fertilizado. La muestra a ser analizada es aplicada a esta zona avascular, la ventana es sellada con cinta y el embrión de pollo es incubado durante tres días más. En este punto la CAM es inspeccionada con un microscopio de luz para ver si ha sido inhibido por la muestra el crecimiento celular endotelial, indicando de esta manera que la muestra analizada es antiangiogénica. Una disminución estadísticamente significativa en los valores de CAM de 1,0 o más, en relación a los valores de sólo el estimulador, indica que un polipéptido HRGP posee actividad antiangiogénica.

Alternativamente, la actividad antiangiogénica de un polipéptido HRGP puede ser determinada midiendo el efecto del polipéptido HRGP sobre la supresión de la migración inducida por el FGF-2 de células endoteliales capilares bovinas en una cámara Boyden modificada. Ver Auerbach et al. (1991) Pharmacol. Ther. 51:1-11. Una disminución estadísticamente significativa de, al menos, el 50% en la migración inducida por el FGF-2, comparada con la migración en presencia únicamente del FGF-2, indica que un polipéptido HRGP posee actividad antiangiogénica.

La actividad antiangiogénica de un polipéptido HRGP pude ser determinada también a través de la medición del efecto del polipéptido sobre el crecimiento de un tumor dependiente de angiogénesis en un mamífero, por ejemplo, el crecimiento del fibrosarcoma en animales. Un polipéptido HRGP que, al ser administrado a ratones portadores del tumor, consigue una inhibición estadísticamente significativa del volumen del tumor, es considerado como poseedor de actividad antiangiogénica. En algunas realizaciones, un polipéptido HRGP antiangiogénico puede dar como resultado una reducción del 10% en el volumen del tumor, comparado con un polipéptido de control del que se conoce que no tiene efectos sobre el crecimiento tumoral. En otras realizaciones, un polipéptido HRGP antiangiogénico puede reducir el volumen tumoral en un 15% o más, en un 20% o más, en un 30% o más, en un 50% o más, en un 75% o más, o en un 90% o más, comparado con un polipéptido de control que no tiene efectos sobre el crecimiento tumoral.

Se entiende que al analizar el efecto de un polipéptido HRGP, una diferencia es considerada como estadísticamente significativa cuando tiene un valor p de \leq 0,05 con una estadística adecuada paramétrica o no paramétrica, por ejemplo, el test de Chi-cuadrado, el test t para estudiantes, el test de Mann-Whitney, o el test F.

Composiciones comprendiendo HRGP

Una composición de la invención comprende un polipéptido HRGP en combinación con un agente antiangiogénico y/o un agente antineoplástico. En algunas realizaciones una composición incluye también un portador farmacéuticamente aceptable.

Los agentes antiangiogénicos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, a la proteína 10 inducible por interferón y fragmentos y análogos de la proteína 10 inducible por interferón, TGF-beta, la trombospondina, la interleucina-1 (IL-1), el interferón gamma y alfa (IFN), el inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), el factor plaquetario 4 (PF4), la protamina, la fumagilina, la angiostatina y similares.

Los agentes antineoplásticos contemplados para su utilización en esta invención son aquellos agentes que son conocidos como agentes quimioterapéuticos tóxicos para células tumorales. Los agentes quimioterapéuticos incluyen a los agentes alquilantes, antimetabolitos, productos naturales, hormonas y antagonistas, modificadores de respuesta biológica (tales como el interferón y los factores de crecimiento hematopoyéticos), agentes diferenciadores tales como derivados del butirato, anticuerpos de antígenos tumorales y otros agentes varios. Ejemplos específicos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, el taxol, la ciclofosfamida, el carboplatino, el cisplatino, la cisplatina, el ganciclovir, la camptotecina, el paclitaxel, la hidroxiurea, la 5-azacitidina, la 5-aza-2'-deoxicitidina, la suramina, los retinoides y similares. La utilización de los agentes quimioterapéuticos es particularmente útil en situaciones en las cuales el mamífero a ser tratado posee una masa tumoral preexistente grande, la cual se encuentra bien vascularizada. Los agentes quimioterapéuticos sirven para reducir la masa tumoral y el polipéptido HRGP previene o inhibe la neovascularización dentro de la masa tumoral o rodeándola.

Las composiciones farmacéuticas comprendiendo HRGP pueden ser administradas por medio de infusión intravenosa, o pueden ser inyectadas subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intrarectalmente, intravaginalmente, intranasalmente, intragástricamente, intratraquealmente, intrapulmonarmente, intratumoralmente o intralesional. La dosificación requerida depende de la elección de la ruta de administración, de la naturaleza de la formulación, de la naturaleza de la enfermedad del paciente, del tamaño del sujeto, del peso, del área de superficie, de la edad y del sexo, de otros fármacos que estén siendo administrados, y del criterio del médico que atiende el caso. Han de esperarse grandes variaciones en la dosificación necesitada a la vista de la variedad de rutas de administración. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ser ajustadas utilizando rutinas empíricas estándares para su optimización, como es bien entendido en este campo. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2 o 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o más veces). Los portadores farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles, adecuados para administrar a un sujeto mamífero como, por ejemplo, un paciente humano, e.g., solución fisiológica salina. Tales composiciones farmacéuticas contienen usualmente desde alrededor de 0,1 hasta el 90% en peso (como de 1 a 20%, o de 1 a 10%) de un agente terapéutico de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones inyectables de la composición pueden contener distintos portadores, tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, isopropil miristato, etanol, polioles (glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, y similares). Para inyecciones intravenosas pueden ser administradas versiones solubles en agua de los compuestos por medio de goteo, por el que es infundida una formulación farmacéutica conteniendo HRGP y un excipiente fisiológico. Los portadores fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa 5%, solución salina 0,9%, solución de Ringer u otros portadores adecuados. Preparaciones intramusculares, por ejemplo, una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada de los compuestos, pueden ser disueltas y administradas en un excipiente farmacéutico, como solución salina 0,9% o solución glucosa 5%. Una forma no soluble adecuada del compuesto puede ser preparada y administrada como una suspensión en una base acuosa o en una base de aceite farmacéuticamente aceptable, como un éster de un ácido graso de cadena larga (por ejemplo, el oleato de etilo). Una formulación de ungüento semisólido tópico contiene, por lo general, una concentración del ingrediente activo desde alrededor del 1% al 20%, por ejemplo, del 5 al 10%, en un portador, como una crema base farmacéutica. Diversas formulaciones para uso tópico incluyen gotas, tinturas, lociones, cremas, soluciones y ungüentos conteniendo el ingrediente activo, y diversos soportes y vehículos. El porcentaje óptimo de agente terapéutico en cada formulación farmacéutica varía conforme a la propia formulación y al efecto terapéutico deseado en las patologías específicas y regímenes terapéuticos relacionados. Los métodos para la preparación de tales formulaciones son de sobra conocidos y pueden ser encontrados, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences".

Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad capaz de producir un resultado médico deseable en un mamífero sometido a tratamiento, por ejemplo, un paciente humano. Como es bien conocido en el campo médico, la dosificación para cualquier paciente dado depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie del cuerpo, la edad, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, el estado general de salud, y otros fármacos que son administrados concurrentemente. La dosis variarán, pero una dosificación preferida para administración es desde aproximadamente 0,01 a 1.000 mg/kg en peso corporal. Por ejemplo, una dosificación preferida puede incluir, aunque sin estar limitada a ello, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 25, 50, 100, 500, 750 o 1.000 mg/kg en peso corporal. Se espera que la administración preferida sea intravenosa.

Un polipéptido HRGP antiangiogénico puede ser administrado a un sujeto en el cual se desee inhibir la angiogénesis. Sujetos adecuados incluyen, sin limitación, aquéllos con cualquiera de entre una variedad de cánceres dependientes de angiogénesis, tales como el rabdomiosarcoma, el glioblastoma multiforme, el leiomiosarcoma, el carcinoma de próstata, el carcinoma mamario, el carcinoma pulmonar, el melanoma, el carcinoma de vejiga, el carcinoma pancreático y el carcinoma renal. Las enfermedades angiogénicas favorables al tratamiento utilizando el polipéptido HRGP incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, la retinopatía diabética, la neovascularización diabética, la fibroplasia retrolental, el tracoma, el glaucoma neovascular, la psoriasis, los angiofibromas, la inflamación inmunológica y no inmunológica, la formación capilar dentro de las placas ateroscleróticas, la angiogénesis miocárdica, los hemangiomas, la excesiva reparación de heridas, distintas enfermedades inflamatorias, y cualquier otra enfermedad caracterizada por la angiogénesis excesiva y/o desregulada.

Artículos de fabricación

Los polipéptidos HRGP en combinación con un agente antiangiogénico y/o agente antineoplástico pueden ser empaquetados como un artículo de fabricación que contiene una o más formas unitarias de dosificación. El artículo de fabricación comprende usualmente, al menos, un contenedor con una etiqueta. Este contenedor puede comprender, por ejemplo, botellas de cristal o plástico o viales, hojas metálicas o plásticas, y puede incluir también embalaje tipo blíster por unidad de dosis. El contenedor mantiene una composición comprendiendo un polipéptido HRGP. El embalaje puede estar acompañado por una etiqueta o inserción en el embalaje, indicando que el polipéptido HRGP es para ser administrado para la inhibición de la angiogénesis, y puede indicar también instrucciones para su utilización in vivo o ex vivo. El artículo de fabricación puede comprender también un segundo contenedor comprendiendo un diluyente o tampón adecuado. Puede incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, filtros, agujas, jeringuillas, e inserciones en el embalaje con instrucciones para su utilización.

Métodos terapéuticos para la inhibición de la angiogénesis

Un polipéptido HRGP antiangiogénico puede ser administrado a un sujeto en el cual se desee inhibir la angiogénesis. Sujetos adecuados incluyen, sin limitación, aquéllos con cualquiera de entre una variedad de cánceres dependientes de angiogénesis, tales como el rabdomiosarcoma, el glioblastoma multiforme, el leiomiosarcoma, el carcinoma de próstata, el carcinoma mamario, el carcinoma pulmonar, el melanoma, el carcinoma de vejiga, el carcinoma pancreático y el carcinoma renal. Las enfermedades angiogénicas favorables al tratamiento utilizando polipéptido HRGP incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, a la retinopatía diabética, la neovascularización diabética, la fibroplasia retrolental, el tracoma, el glaucoma neovascular, la psoriasis, los angiofibromas, la inflamación inmunológica y no inmunológica, la formación capilar dentro de las placas ateroscleróticas, la angiogénesis miocárdica, los hemangiomas, la excesiva reparación de heridas, distintas enfermedades inflamatorias, y cualquier otra enfermedad caracterizada por la angiogénesis excesiva y/o desregulada.

Usualmente, un polipéptido HRGP antiangiogénico es administrado en una composición farmacéutica. Para aplicaciones terapéuticas el polipéptido HRGP es administrado a un mamífero, por ejemplo, un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. El polipéptido HRGP puede ser administrado de forma intravenosa como un bolo, o por medio de infusiones continuas durante un periodo de tiempo, por ruta intramuscular, subcutánea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. La administración local continuada a largo plazo de un polipéptido HRGP puede ser conseguida por medio de la implantación de células secretoras de polipéptido HRGP microencapsulado. Ver, por ejemplo, Read et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(1):29-34 y Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(1):35-39.

Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada del polipéptido HRGP dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, de la gravedad y curso de la enfermedad, del curso de la terapia previa, del historial clínico del paciente y de la respuesta al polipéptido HRGP, y del criterio del médico que le atiende. El polipéptido HRGP es administrado al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, desde alrededor de 0,01 a alrededor de 1000 mg del polipéptido HRGP/kg de peso corporal del paciente es una dosificación inicial candidata para administración al paciente, por ejemplo, tanto para una como para más administraciones por separado, o para infusión continua. Para repetidas administraciones a lo largo de varios días o de más tiempo, dependiendo de la dolencia, el tratamiento es repetido hasta que tiene lugar una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, y no se encuentran excluidos.

La eficacia del tratamiento puede ser evaluada por medio de distintos parámetros, incluyendo reducción en el tamaño del tumor, según es determinado a través de la medición de la masa cutánea, según es determinado por medio de rayos X, escáneres y otros medios de evaluación del tamaño del tumor; falta de progresión en el tumor, según es evaluada por medio de los métodos relacionados más arriba; formación reducida del queloide, según es determinado por medio de la medición y evaluación de las lesiones superficiales; mejora de las lesiones retinales asociadas a la retinopatía diabética, según es determinado por el análisis comparativo de fotografías del fondo retinal y otros medios adecuados de evaluación; falta de progresión de la retinopatía diabética, según es determinado por el método relacionado más arriba. Los niveles farmacológicos del polipéptido HRGP en sangre pueden ser determinados por medio de ELISA, ensayos de captura, ensayos radioinmunológicos, ensayos de unión a un receptor y similares.

La invención será descrita más en detalle en los ejemplos siguientes, los cuales no limitan el ámbito de la invención, descrito en las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Cultivo celular

Una línea celular endotelial aórtica porcina (PAE) sobrexpresando el receptor FGF-1 (FGFR-1) fue cultivada en medio Ham-F12 suplementado con suero bovino fetal (FCS) 10%. Ver Wennström et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13749. Fueron cultivadas células primarias endoteliales capilares del córtex adrenal bovino (BCE) sobre placas de cultivo tisular recubiertas de gelatina en medio modificado Dulbecco complementado con FCS 10% y 1 ng/ml de FGF-2 (Boehringer Mannheim). Fueron cultivadas células humanas de glioma U-343 MG en medio modificado Dulbecco complementado con FCS 10%. Fribroblastos 3T3 suizos fueron cultivados en DMEM suplementado con FCS 10%. Células 293-EBNA de riñón embriónicas humanas (HEK) fueron cultivadas en DMEM/FCS 10%.

Ejemplo 2 Ensayos de membrana corioalantóica (CAM)

Las condiciones seguidas para el ensayo CAM fueron esencialmente conforme son descritas en Friedlander et al. y Dixelius et al. Ver Friedlander et al. (1995) Science 5241:1500 y Dixelius et al. (2000) Blood 95:3403. Fueron comprados localmente embriones de pollo fertilizados, y fueron preincubados durante diez días a 38ºC con un 70% de humedad. Fue perforado un agujero pequeño directamente sobre el saco de aire en el extremo del huevo. Fue identificada una zona avascular en la CAM, y fue realizado un segundo agujero en la cáscara del huevo por encima de ese área. La CAM fue separada de la cáscara por medio de la aplicación de vacío sobre el primer agujero. Discos de filtro (Whatman Inc.) fueron saturados con 3 mg/ml de acetato de cortisona (Sigma) y empapados en tampón (30 \mul por cada filtro) con o sin FGF-2 (Boehringer Mannheim; 0,2 \mug por cada filtro), VEGF-A (Peprotech; 0,2 \mug por cada filtro) y HRGP purificada (3 \mug por cada filtro). La CAM fue expuesta después de practicar una ventana de 1 x 1 cm en la cáscara, y la muestra fue añadida a una parte avascular de la membrana. Las ventanas fueron selladas con cinta, y los embriones de pollo fueron incubados durante tres días más. En este punto, la membrana fue cortada alrededor del filtro, el cual fue dado la vuelta del revés e inspeccionado en un microscopio de luz (Nikon Eclipse TE 300, aumento de 2,5 o 4).

Ejemplo 3 Ensayo de Migración Celular Endotelial

El ensayo de migración fue realizado en una cámara Boyden modificada (ver Auerbach et al. (1991) Pharmacol. Ther. 51:1-11) utilizando filtros de nitrocelulosa de microporo (8 \mum de espesor, 8 \mum de poro) recubiertos con solución de colágeno tipo 1 a 100 \mug/ml (Vitrogen 100, Collagen Corp.) Células BCE primarias o células humanas de glioma (U-343 MG) fueron preincubadas con HRGP (100 ng/ml) durante 30 minutos, tripsinizadas y resuspendidas en una concentración de 4,0 x 10^{5} células/ml en medio Ham F-12 conteniendo suero fetal de becerro (FCS) 0,1%. La suspensión celular fue colocada en la cámara superior y fue colocado por debajo del filtro, en la cámara inferior, un medio conteniendo FCS 0,1% en combinación con 5 ng/ml de FGF-2 o 5 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB; Peprotech Inc.) y 100 ng/ml de HRGP, individualmente o en combinación. Fue utilizado FCS al 10% como un control positivo. Después de 4 horas a 37ºC el medio fue retirado y las células pegadas al filtro fueron fijadas en metanol puro, y fueron tintadas con tinción Giemsa. Las células en el lado inferior del filtro fueron contadas en tres campos microscópicos separados, utilizando el programa de análisis de imagen (Easy Image Analysis) de Bergström Instruments, Suecia. Todas las muestras fueron analizadas en, al menos, seis pocillos por cada tratamiento.

Ejemplo 4 Estudios en animales

El trabajo con animales fue llevado a cabo en el centro de animales del Biomedical Center, de la Uppsala University, fue aprobado por el Consejo local de experimentación con animales, y fue realizado conforme a la normativa UKCCCR para el bienestar de los animales en neoplasia experimental. Ver Workman et al. (1988) Lab. Anim. 22:195-201. Ratones hembra C57BL6/J de 6 semanas de edad (Mollegard/Bomhultgard, Dinamarca) fueron aclimatados y puestos en cajas en grupos de cinco, y fueron alimentados con una dieta de comida para animales y agua potable ad lib. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (Forene; Abbott, Suiza) durante todas las manipulaciones. Fueron inyectadas subcutáneamente células de fibrosarcoma T241, 0,5 x 10^{6} en 50 \mul de DMEM, en el flanco izquierdo del ratón. Los animales portadores de tumores palpables fueron seleccionados al azar y recibieron tratamiento con 4 mg/kg/día de HRGP o vehículo (PBS), o como control, con antitrombina clivada por termolisina, proporcionado como inyecciones diarias subcutáneas en el flanco derecho durante once días. Los tumores fueron medidos con un cáliper una vez al día, en un procedimiento doble ciego, y fueron calculados los volúmenes por medio de la fórmula \pi/6 x anchura^{2} x longitud. Fue realizado análisis estadístico utilizando ANOVA. Después de alrededor de 11 días de tratamiento, los ratones fueron sacrificados con una dosis letal de pentobarbitón y perfundidos con paraformaldehido 4% en tampón fosfato de Millonig pH 7,4. A continuación, los tumores fueron embebidos en parafina conforme a procedimientos histológicos estándares, y fueron seccionados con un grosor de 4 \mum.

Ejemplo 5 Inmunoprecipitado y blotting (no forma parte de la invención)

Se les retiró el suero durante la noche a células PAR/FGFR-1 descritas en el Ejemplo 1, y fueron estimuladas, o no, con FGF-2 (100 ng/ml) o HRGP (1 \mug/ml), individualmente o en combinación, durante 10 minutos a 37ºC. Las células fueron lisadas en tampón conteniendo Nonidet P-40, las muestras fueron separadas por medio de SDS-PAGE y transferidas a Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech). Las membranas fueron sometidas a inmunoblotting con anticuerpos anti-fosfoErk1/2 (New England Biolabs Inc.) o anticuerpos anti-fosfo38 (New England Biolabs Inc.). Fueron visualizadas las proteínas inmunoreactivas por medio de un sistema de detección quimioluminiscente. Ver Matthews et al. (1985) Anal. Biochem. 151:205-209.

Ejemplo 6 La HRGP inhibe la angiogénesis en CAM

La CAM de embriones de pollo de diez días fue expuesta al realizar una ventana en la cáscara. El tratamiento de la CAM con factores de crecimiento, tales como el FGF-2, estimuló la angiogénesis en la CAM (Tabla 1). La aplicación del FGF-2 o del VEGF-A junto con un exceso molar de diez veces de la HRGP en la CAM dio como resultado la supresión de la angiogénesis.

TABLA 1

Efecto inhibidor de la HRGP en la angiogénesis de la membrana corioalantóica de pollo inducida por el FGF-2 o
el VEFG-A (0,2 \mug/filtro)
Estimulador	Inhibidor	Valores de la angiogénesis
Tampón	-	1,2
FGF-2	-	2,4
FGF-2	HRGP	1,3
VEGF	-	2,8
VEGF	HRGP	1,6

La valoración, desde 0 (baja) hasta 3 (alta) se basó en el número de puntos de ramificación del vaso, conforme al método de Friedlander et al., 1995 y Dixelius et al., 2000. Fueron registrados los valores medios para 5-6 embriones. La variabilidad fue inferior al 15%. Estos resultados indican que la HRGP posee actividad antiangiogénica, conforme es medido por un ensayo de membrana corioalantóica.

Ejemplo 7 La HRPG inhibe la migración celular endotelial

Angiogénesis es un término colectivo dado a un número de cambios que experimentan las células endoteliales vasculares para formar un nuevo vaso, como la proliferación, migración y diferenciación. Ver Gerwins et al. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34:185-194. Utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3, fue analizado el efecto de la HRGP sobre la migración celular endotelial. Las células endoteliales capilares bovinas primarias (BCE) migraron hacia el FGF-2 con un 150% de incremento sobre la migración basal en una cámara mini-Boyden. Este incremento de la migración fue suprimido completamente mediante la co-incubación del FGF-2 con la HRGP a 100 ng/ml (Figura 1). En contraste, la migración de las células humanas de glioma U-343 MG hacia el PDGF-BB no se vio inhibida por la HRGP. Los resultados indican que la HRGP posee actividad antiangiogénica, conforme es medido por un ensayo de migración celular endotelial.

Ejemplo 8 Transducción de la señal

Fueron analizados los efectos de la HRGP sobre la transducción de señal inducida por el FGF-2 en células endoteliales en el ensayo descrito en el Ejemplo 5. Células PAE/FGFR-1 fueron tratadas con 100 ng/ml de FGF-2 o 50 ng/ml de VEGF-A durante 7 minutos en presencia, o ausencia, de 1 \mug/ml de HRGP. Los lisados celulares totales fueron preparados y analizados por medio de SDS-PAGE e inmunoblotting. La HRGP no afectó la activación inducida por el VEGF-A o el FGF-2 de las quinasas de MAP, tales como la Erkl/2, o la activación inducida por el FGF-2 de la p38, indicando que la activación de FGFR-1 mediada por el FGF-2 y la transducción de señal no se vieron afectadas por la HRGP. Hubo un ligero incremento en el nivel basal de las actividades de la Erkl/2 y de la p38 en las células tratadas con HRGP.

Ejemplo 9 Inhibición del crecimiento tumoral del fibrosarcoma en ratones

La HRGP inhibió el crecimiento del fibrosarcoma en ratones en el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Fue utilizada HRGP purificada procedente de plasma humano para el tratamiento de ratones C57/black, portadores de fibrosarcomas T241 subcutáneos palpables en su flanco izquierdo. Como control, ratones C57/black fueron tratados con PBS. Los tratamientos fueron dados diariamente, como inyecciones subcutáneas en una dosis de 4 mg/kg en el flanco derecho, hasta que el tamaño del tumor de control alcanzó el nivel superior de 2,5 cm^{2} (aproximadamente 11 días). Inyecciones con HRGP llevaron a una drástica reducción en el crecimiento del tumor (Figura 2). En el momento del sacrificio, el tamaño de los tumores se había reducido en alrededor del 75%. En paralelo, los animales portadores de tumor fueron tratados con antitrombina clivada por termolisina (Figura 2B). No hubo una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño del tumor entre los animales tratados con PBS y los animales tratados con antitrombina clivada por termolisina. Estos resultados indican que el efecto de la HRGPp no fue debido a manipulaciones o inyección de proteína, en general, y que la HRPG posee actividad antiangiogénica, conforme es medido por medio de un ensayo de crecimiento tumoral de fibrosarcoma.

Ejemplo 10 Construcción de vectores de expresión de la HRPG (no forma parte de la invención)

ADNc humano de longitud total codificando la glicoproteina rica en histidina humana (HRGP) fue clonado en los sitios EcoR1/Xho1 en el vector de expresión pCEP-Pu2. (Hallgren et al., 2000). Los aminoácidos 1 a 18 en el ADNc de la HRGP codifican un péptido señal, el cual permite la secreción extracelular de la proteína. Por lo tanto, la secuencia señal BM40 en frente del casete clonador en pCEP-Pu2 fue retirada por medio de clivado de restricción con HindIII/Nhe1. El nuevo vector fue llamado pCEP-78544 y codifica la HRGP sin un marcador His (HRGPr).

Fueron construidos también vectores de expresión para la HRGP de longitud total con marcadores His y variantes truncadas en el C-terminal, utilizando el sistema de expresión pCEP-Pu2. Estos vectores fueron preparados por medio de amplificación PCR tanto de partes de longitud total, como de menos de la longitud total, de la HRGP. Fue añadido un marcador His (seis histidinas) al N-terminal de la región codificadora de la HRGP, con el fin de facilitar la purificación. Fue introducido un sitio de clivaje por enteroquinasa entre el marcador His y la región codificadora de la HRGP, para permitir la retirada del marcador His. En estos vectores la secuencia señal de la HRGP fue excluida. En su lugar, el producto PCR fue unido en marco con la secuencia señal BM40 en pCEP-Pu2. Fueron construidos tres vectores de este tipo, y fueron llamados pCEP-Pu2/His 1, 3 y 4. Los tres vectores codifican la HRGP de longitud total con marcadores His (His 1) y dos polipéptidos HRGP truncados, (His 3-4). Ver Figura 3.

Ejemplo 11 Transfección de células EBNA-293 y recogida del medio condicionado (no forma parte de la invención)

Fueron utilizadas células EBNA-293 de riñón embriónico humano (HEK) para producir polipéptidos HRGP recombinantes. Estas células son transfectadas establemente con el gen EBNA-1, el cual es expresado también por el vector pCEP-Pu2, con el fin de evitar la integración cromosómica del ADN plásmido transfectado. Esta manipulación permite un alto número de copias plásmidas en el citoplasma de la célula, e incrementa la producción de proteína recombinante. Los vectores de expresión de la HRGP descritos en el Ejemplo 10 fueron transfectados en la línea celular EBNA-293 utilizando Lipofectamina (Invitrogen) conforme al protocolo de los fabricantes. Alrededor de 48 a 72 horas después de la transfección, las células fueron puestas bajo presión selectiva con 2,5 \mug/ml de puromicina (Sigma) para seleccionar con el fin de captar el vector pCEP-Pu2, y 0,25 mg/ml de G418 (Calbiochem) para seleccionar con el fin de captar células expresoras de EBNA-1. Las células en crecimiento fueron expandidas y fue recogido el medio condicionado cada quinto día. Con el fin de evitar contaminación por la HRGP bovina, el FCS fue intercambiado por un medio definido reemplazado por suero, TCM (ICN Biomedicals), durante la recogida del medio condicionado. Las células y los restos fueron retirados por medio de centrifugación durante 10 minutos a 1200 g.

Ejemplo 12 Purificación de la HRGP procedente de plasma (HRGPp) y de la HRGP recombinante (HRGPr) (no forma parte de la invención)

La HRGPr procedente de plasma humano fresco fue purificada por medio de cromatografía sobre fosfocelulosa en presencia de inhibidores de proteinasa (Rylatt et al., 1981; Kluszynski et al., 1997). Fue utilizado el mismo método para purificar HRGP sin marcadores (HRGPr) procedente del medio condicionado.

Ejemplo 13 Purificación de la HRGP con marcadores His (no forma parte de la invención)

Fueron purificados polipéptidos HRGP con marcadores His procedentes de las líneas celulares transfectadas His 1, 3 y 4 descritas en el Ejemplo 11, utilizando agarosa Ni-NTA. Fueron incubados alrededor de 50 ml de medio condicionado HRGP con 200 \mul de mezcla de agarosa Ni-NTA 50% "end-over-end" a 4ºC durante la noche. La agarosa fue removida y lavada de 3 a 4 veces con PBS pH 7,0/1M de NaCl/Tween 20 0,1%. La agarosa fue puesta en una columna y lavada de nuevo conforme es indicado más arriba. El material unido fue eluido en fracciones utilizando 100 mM de imidazol/20 mM de Tris pH 8,0/0,1 M de NaCl. Las fracciones conteniendo proteína fueron reunidas y dializadas contra PBS pH 7,0. La concentración proteínica final fue estimada por medio de comparación con un BSA estándar sobre SDS-PAGE, y por medio del kit de ensayo proteínico BCA (Pierce).

Ejemplo 14 Ensayo TUNEL

Fueron llevados a cabo ensayos por medio de técnica TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling) (TLTNEL) como sigue. Fueron sembradas células BCE sobre diapositivas de cristal recubiertas de gelatina en DMEM/NCS 10% con 2 ng/ml de FGF-2. Después de 48 horas el medio fue cambiado por un medio sin nutrientes (DMEM/NCS 0,5%) conteniendo bien 10 ng/ml de FGF-2, o 1 \mug/ml de HRGPr, o la combinación de los dos. Cuarenta y cuatro horas más tarde las células fueron fijadas en paraformaldehido 4%, y las células apoptópicas fueron tintadas utilizando el Kit de detección celular in situ Fluorescein (Roche Diagnostic). Brevemente, el principio del método es marcar extremos libres 3'-OH -generados durante el proceso de apoptosis- con dUTP fluorescente en una reacción enzimática. Para ser capaces de detectar las células, fue realizado un doble tintado con Hoechst 33342. El porcentaje de células que dio positivo en el ensayo TUNEL fue determinado por medio del análisis de aproximadamente 1500 células de cada tratamiento.

Ejemplo 15 Análisis de activación de FGFR (no forma parte de la invención)

Fue llevado a cabo el análisis de activación del receptor de FGF (FGFR) utilizando células PAE/FGFR-1, sin suero durante la noche en F12/BSA 0,1%, y fueron estimuladas con FGF-2 (50 ng/ml) o HRGPr (1 \mug/ml), o la combinación de ambos, durante 8 minutos a 37ºC. Las células fueron lisadas en tampón conteniendo Triton X-100 y las proteínas fosforiladas en tirosina fueron inmunoprecipitadas utilizando anticuerpo 4G10 (Upstate Biotechnology). Las muestras fueron separadas por medio de SDS-PAGE y transferidas a Hybond-C-extra (Amersham Pharmacia Biotech). Fuero realizado inmunoblotting con un anticuerpo anti-FGFR-1 facilitado por Dr. P Maher, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA. Fue realizado análisis de fosforilación de la p38 en células PAE/FGFR-1 tratadas durante 10 o 30 minutos a 37ºC con 50 ng/ml de FGF-2, con o sin preincubado con 1 \mug/ml de HRGPr durante 30 minutos antes de la adición del FGF-2. Las células fueron lisadas en tampón conteniendo Triton X-100 y los lisados totales fueron separados por medio de SDS-PAGE y sometidos a inmunoblotting con anticuerpos anti-fosfo-p38 y anti-p38 (New England Biolabs Inc.) Fue realizado análisis de fosforilación de ERK1/2 en células BCE tratadas durante 10 o 90 minutos a 37ºC con 50 ng/ml de FGF-2, con o sin preincubado con 1 \mug/ml de HRGPr durante 30 minutos antes de la adición del FGF-2. Las células fueron lisadas en tampón conteniendo Triton X-100 y los lisados totales fueron separados por medio de SDS-PAGE y sometidos a inmunoblotting con anticuerpo anti-fosfo-ERK (New England Biolabs Inc.). Las proteínas inmunoreactivas fueron visualizadas por medio de un sistema de detección quimioluminiscente (Matthews et al., 1985).

Ejemplo 16 Producción y caracterización de la HRGP recombinante (no forma parte de la invención)

Con el fin de investigar más en profundidad la acción antiangiogénica de la HRGP y para determinar una región de actividad mínima de la proteína, fue producido HRGP recombinante (HRGPr). Fue construida HRGP de longitud total con y sin un marcador His, y fue aislada conforme es descrito en los Ejemplos 10 a 13. Fueron producidos y aislados, conforme es descrito en los Ejemplos 10 a 11 y 13, dos polipéptidos HRGP truncados en el C-terminal con marcadores His.

La tinción de Coomassie del polipéptido HRGPp aislado y del polipéptido HRGPr aislado reveló que la proteína recombinante mostraba un peso molecular aparentemente ligeramente menor, posiblemente debido a los diferentes niveles de glicosilación. El western blotting con un anticuerpo específico de HRGP reveló, además de la proteína de longitud total, un número de fragmentos más pequeños tanto en la HRGPp como en la fracción de HRGPr. Fueron analizados también por medio de tinción de Coomassie y de Western blot anti-HRGP los polipéptidos HRGP aislados His1, 3 y 4. Las masas moleculares predichas fueron conforme se esperaba, y las tres proteínas recombinantes fueron reconocidas por un anticuerpo específico de la HRGP. El polipéptido HRGP truncado más corto, His 3, pareció ser más sensible al clivaje proteolítico que los polipéptidos HRGP His 1 y 4.

Los anticuerpos específicos de dominio contra la HRGP fueron obtenidos por medio de la inmunización de conejos con tres péptidos diferentes, llamados 0115, 0116 y 0119. Las posiciones de estos péptidos en la proteína HRGP son indicadas en la Figura 3. Fueron llevados a cabo Western blots de la HRGP de longitud total utilizando los tres anticuerpos antipéptido. Estos resultados indicaron que el polipéptido HRGP de longitud total fue detectado por los tres anticuerpos. Sin embargo, fue observado un patrón específico de reactividad en cada uno de los tres anticuerpos contra los fragmentos más pequeños derivados de la HRGP.

Ejemplo 17 La HRGPr inhibe la migración celular endotelial

El efecto de la HRGPr sobre la migración celular endotelial fue medido utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3. El mismo efecto inhibidor sobre la migración inducida por el FGF visto con la HRGPp fue observado también cuando fue utilizada la HRGPr (Figura 4A). El efecto inhibidor de la HRGPr fue estadísticamente significativo. La migración inducida por el suero fetal de becerro, sin embargo, no se vio inhibida por la HRGPr. Ver Figura 4A.

El ensayo fue llevado a cabo también utilizando distintas cantidades de HRGPr. Conforme es mostrado en la Figura 4B, se necesitaron 100 ng/ml de HRGPr para inhibir la migración a nivel basal. La presencia de un marcador His no afectó la habilidad del HRGP His 1 para inhibir la migración inducida por el FGF.

El efecto de la HRGPr sobre los factores de crecimiento VEGF-A y el factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) fue analizado también. El VEGF-A y el PDGF-BB inducen también la migración de células BCE en cultivo. La HRGPr evitó por completo la migración inducida por factor de crecimiento, tanto por el VEGF-A como por el PDGF-BB. Con el fin de excluir la posibilidad de que cualquier proteína plasmática de unión a la heparina de aproximadamente el mismo tamaño que la HRGP pudiera afectar la migración inducida por el FGF, medimos el efecto del polipéptido inhibidor de la proteína C (PCI) en el ensayo de migración. La presencia del PCI, en ausencia de la HRGP, no tuvo efecto sobre la migración inducida por el FGF. El efecto sobre la migración celular endotelial inducida por el FGF de la HRGPr sola fue comparado con el de la endostatina (ES) sola. La ES es un conocido agente antiangiogénico. Tanto la HRGPr como la ES fueron utilizadas a 100 ng/ml, lo cual corresponde a una proporción molar de 1:3 entre la HRGP y la ES. Tanto la HRGPr como la ES inhibieron la migración inducida por el FGF, al menos hasta un nivel basal, siendo ligeramente más efectiva la ES. Para investigar la especificidad celular de los efectos de la HRGPr, analizamos su habilidad para inhibir la migración inducida por el FGF de los fibroblastos murinos suizos 3T3. Cuando las células 3T3 reemplazaron a las células BCE en el ensayo, la HRGPr no tuvo ningún efecto sobre la migración celular, indicando que la actividad biológica de la HRGPr es específica para las células endoteliales.

Ejemplo 18 La HRGP inhibe la supervivencia inducida por el FGF sobre las células endoteliales

Fue llevado a cabo un ensayo TUNEL conforme es descrito en el Ejemplo 14. Células BCE sembradas sobre diapositivas de cristal recubiertas de gelatina fueron colocadas en medio conteniendo un nivel bajo de suero (DMEM/NCS 0,5%), y fueron realizadas adiciones de FGF-2 y HRGPr tanto individualmente como en combinación, a 10 ng/ml de FGF-2 y 1 \mug/ml de HRGPr. Fue determinado el porcentaje de células que dio positivo en el TUNEL en cada tratamiento.

El FGF-2 indujo una reducción de tres veces el porcentaje de células apoptópicas (positivo TUNEL) en medio sin nutrientes. La supervivencia inducida por el FGF-2 sobre células endoteliales fue suprimida cuando fue añadida HRGPr junto con el FGF-2. La HRGPr sola no produjo efecto.

Ejemplo 19 Transducción de señal

Examinamos el efecto de la HRGP sobre la transducción de señal inducida por el FGF-2 en células endoteliales. El efecto sobre la activación del receptor 1 del FGF (FGFR-1) fue investigada por medio del tratamiento de células PAE/FGFR-1 con 50 ng/ml de FGF-2 durante 8 minutos, preincubadas o no con 1 \mug/ml de HRGPr durante 30 minutos. Los lisados totales celulares fueron preparados, y las proteínas fosforiladas en tirosina fueron inmunoprecipitadas. Las muestras fueron separadas por medio de SDS-PAGE y sometidas a inmunoblotting con anticuerpo anti-FGFR-1. Los resultados mostraron que la HRGPr no afectó la activación inducida por el FGF-2 del FGFR1.

El efecto de la HRGPr sobre la activación de la MAPK p38 fue analizado por medio de células PAE/FGFR-1. La MAPK p38 ha sido asociada con la apoptosis en las células endoteliales. Las células fueron tratadas durante 10 o 30 minutos con 50 ng/ml de FGF-2, con o sin preincubación con 1 \mug/ml de HRGPr durante 30 minutos antes de la adición del FGF-2. Los lisados totales fueron separados por medio de SDS-PAGE, y fueron sometidos a inmunoblotting con un anticuerpo anti-fosfo-p38. El FGF-2 indujo un incremento en la fosforilación de la p38 tanto a los 10 minutos como a los 30 minutos de la estimulación, pero no hubo ningún efecto de la HRGP. El inmunoblotting con un anticuerpo anti-p38 reveló una cantidad igual de proteína en cada camino.

Ejemplo 20 Crecimiento tumoral en ratones

Son preparados ratones portadores de tumor de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 4, utilizando células de neuroblastoma en lugar de células de fibrosarcoma T241, y un sitio adecuado de introducción en los animales. Ratones portadores de tumores detectables son seleccionados de forma aleatoria y reciben tratamientos con HRGP, solo vehículo (PBS), o un polipéptido negativo de control que no tiene efecto alguno sobre el crecimiento del tumor, como la AT clivada por termolisina o la inmunoglobulina G. La HRGP, el vehículo y el polipéptido de control son administrados diariamente. Los tumores son medidos una vez al día, o en el momento de la administración, utilizando un procedimiento doble ciego. Son calculados los volúmenes de los tumores por medio de la fórmula \pi/6 x anchura^{2} x
longitud. Es realizado análisis estadístico utilizando ANOVA u otro procedimiento estadístico adecuado. Al final del experimento, los ratones son sacrificados utilizando una dosis letal de pentobarbitón, u otro método de sacrificio aprobado, y son perfundidos con paraformaldehido 4% en tampón fosfato de Millonig pH 7,4, o perfundidos con un tampón conteniendo una lectina marcada que se una específicamente a las células endoteliales. A continuación, los tumores son embebidos en parafina, o congelados, conforme a procedimientos histológicos estándares, y son seccionados con un grosor de 4 \mum.

El experimento es repetido utilizando un calendario de administración de días alternos, o un calendario de administración de cinco días a la semana. El experimento es repetido utilizando células de pulmón de Lewis, células de teratoma, u otros modelos de células tumorales en lugar de células de neuroblastoma.

Ejemplo 21 Efecto de formas truncadas de la HRGP

Son aislados los polipéptidos HRGP recombinantes His 3 y 4 conforme es descrito en el Ejemplo 13. Son aislados también los correspondientes polipéptidos sin marcadores His.

Cada uno de los cuatro polipéptidos es examinado en el ensayo CAM descrito en el Ejemplo 2, en el ensayo de migración celular endotelial descrito en el Ejemplo 3, en el ensayo de tumor de fibrosarcoma descrito en el Ejemplo 4, en el ensayo de transducción de señal descrito en el Ejemplo 8, y en el ensayo de apoptosis TUNEL descrito en el Ejemplo 14.

Ejemplo 22 Angiogénesis del cuerpo embrioide

Células madre embriónicas de ratón son inducidas a diferenciarse por medio de la retirada del LIF. Las células son agregadas en cultivos de gota pendiente y, después de cuatro días, colocadas en placas de petri no adherentes. Los agregados (cuerpos embrioides, EB) son tratados en las placas de petri con uno de entre los siguientes: HRGPp, HRGPr, His1, His 3, o His 4. Como control, los EB son tratados con ES como un control positivo, y con PCI como un control negativo. La formación del plexo vascular es analizada cualitativamente por medio de inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos anti-CD31 en las muestras de EB después de 6, 8, 12 y 16 días en cultivo. Para la tinción inmunohistoquímica los EB sobre placas de cristal son fijados en paraformaldehido 4% y permeabilizados en metanol. La actividad de la peroxidasa endógena es bloqueada en H2O2 3% en metanol. Los sitios de unión no específica son bloqueados utilizando el kit de tampón bloqueador TNB (NEL 700; NEN Life Science Products), seguido por la incubación durante la noche con un anticuerpo primario CD31 de rata-antiratón (Pharmingen) diluido 1:8000 en TNB. Después del lavado, las muestras son incubadas con un suero secundario biotinilado de cabra anti IgG de rata (Vector) y, seguidamente, con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina y Biotinil tiramida (procedente del kit NEL) para amplificar la señal. Para la reacción enzimática es utilizado el kit reactivo ABC de Vector. Los EB en geles de colágeno 3D son tintados utilizando un protocolo similar, a excepción de que los tiempos de incubación y lavado son alargados, y de que el lavado es realizado con PBS conteniendo Triton-X 100.

Los cuerpos embrioides son analizados también cuantitativamente con el fin de determinar el tamaño del agrupamiento celular endotelial. Esto es realizado por medio de tratamiento con colagenasa, seguido de separación celular activada por fluorescencia (FACS), o por aislamiento de células endoteliales a través de la captura en partículas magnéticas recubiertas con anti-CD31.

El experimento es repetido escogiendo un EB individual y colocándolo sobre diapositivas de cristal, seguido por tratamiento con un polipéptido HRGP, conforme es descrito más arriba. El experimento es repetido al sembrar los EB en geles de colágeno de tres dimensiones, seguido por el tratamiento con un polipéptido HRGP, conforme es descrito más arriba.

Otras realizaciones

Debe ser entendido que, aunque la invención ha sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la intención es que la descripción precedente sea ilustrativa y no limite el ámbito de la invención, el cual es definido por el ámbito de las reivindicaciones añadidas. Se encuentran dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones otros aspectos, ventajas y modificaciones.

Claims (25)

1. Un método para la identificación de un polipéptido antiangiogénico, comprendiendo:

la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre la migración inducida por el FGF-2 de células primarias endoteliales capilares del córtex adrenal bovino; y

la identificación de dicho polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando dicha migración inducida por el FGF-2 se ve disminuida de forma significativa en presencia de dicho polipéptido HRGP.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido HRGP es un fragmento de la HRGP.

3. Un método para la identificación de un polipéptido antiangiogénico, comprendiendo:

la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre la angiogénesis en la membrana corioalantóica de pollo; y la identificación de dicho polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando dicha angiogénesis en la membrana corioalantóica de pollo se ve disminuida significativamente en presencia de dicho polipéptido HRGP.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido HRGP es un fragmento de la HRGP.

5. Un método para la identificación de un polipéptido antiangiogénico, comprendiendo:

la medición del efecto de un polipéptido HRGP sobre el crecimiento de un tumor dependiente de angiogénesis; y la identificación de dicho polipéptido HRGP como un polipéptido antiangiogénico cuando dicho crecimiento tumoral se ve disminuido significativamente en presencia de dicho polipéptido HRGP.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido HRGP es un fragmento de la HRGP.

7. Una composición comprendiendo un polipéptido HRGP substancialmente puro, en combinación con un agente antiangiogénico y/o un agente antineoplástico.

8. Una composición conforme a la reivindicación 7, en donde dicho agente antiangiogénico es seleccionado de entre el grupo comprendiendo la angiostatina, la trombostatina, la endostatina, el interferón \alpha, el factor 10 inducible por interferón, el factor plaquetario 4 y un inhibidor de la COX-2.

9. Una composición conforme a la reivindicación 7, en donde dicho agente antineoplástico es seleccionado de entre el grupo comprendiendo el taxol, la ciclofosfamida, el carboplatino, el cisplatino, la cisplatina, el ganciclovir, la camptotecina, el paclitaxel, la hidroxiurea, la 5-azacitidina, la 5-aza-2'-deoxicitidina, la suramina y los retinoi-
des.

10. Una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 9, en donde dicha composición comprende un fragmento de dicho polipéptido HRGP.

11. Una composición conforme a la reivindicación 10, en donde dicho fragmento comprende el dominio amino terminal de la HRGP intacta.

12. Una composición conforme a la reivindicación 10, en donde dicho fragmento comprende el dominio central de la HRGP intacta.

13. Una composición conforme a la reivindicación 10, en donde dicho fragmento comprende el dominio C-terminal de la HRGP intacta.

14. Una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 13, en donde dicho fragmento comprende, al menos, una repetición en tándem del pentapéptido [H/P]-[H/P]PHG.

15. Una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 14, en donde dicha composición comprende además un portador farmacéutico aceptable para la administración a un mamífero.

16. Una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 15, para su uso como un medicamento.

17. La utilización de una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 16, para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

18. Un artículo de fabricación comprendiendo material de embalaje y una composición fabricada conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 17 dentro de dicho material de embalaje, en donde dicho material de embalaje comprende una etiqueta o inserción en el embalaje indicando que dicho polipéptido es para ser administrado a un mamífero para la inhibición de la angiogénesis.

19. La utilización de un polipéptido HRGP substancialmente puro para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

20. La utilización conforme a la reivindicación 19, en donde dicho polipéptido HRGP comprende un fragmento de dicho polipéptido HRGP.

21. La utilización conforme a la reivindicación 20, en donde dicho polipéptido comprende el dominio amino terminal de la HRGP intacta.

22. La utilización conforme a la reivindicación 20, en donde dicho polipéptido comprende el dominio central de la HRGP intacta.

23. La utilización conforme a la reivindicación 20, en donde dicho polipéptido comprende el dominio C-terminal de la HRGP intacta.

24. La utilización conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 23, en donde dicho polipéptido comprende, al menos, una repetición en tándem del pentapéptido [H/P]-[H/P]PHG.

25. La utilización conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 24, en donde dicho medicamento comprende además un portador farmacéutico aceptable para la administración a un mamífero.