ES2363758T3

ES2363758T3 - Vegf y pdgf modificados con propiedades angiogénicas mejoradas.

Info

Publication number: ES2363758T3
Application number: ES06789808T
Authority: ES
Inventors: Kari Alitalo; Tuomas Tammela; Salla Keskitalo; Katri Pajusola; Markku M. Jeltsch; Seppo Yla-Herttuala; Terhi Karpanen; Ulf Eriksson; Marko J. T. Uutela
Original assignee: Vegenics Pty Ltd
Current assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 2005-08-15
Filing date: 2006-08-15
Publication date: 2011-08-16
Anticipated expiration: 2026-08-15
Also published as: WO2007022287A2; WO2007022287A3; US8025886B2; US20120071406A1; AU2006279462A1; US20070142282A1; EP1919944A2; EP1919944B1; ATE502956T1; DE602006020881D1

Abstract

Una construccion que comprende: un dominio de union a RTK, al menos un dominio flanqueante y al menos un enlace que conecta el dominio de union a RTK con el al menos un dominio flanqueante; en la que el dominio de union a RTK comprende una secuencia de aminoacidos que es identica al menos el 90% a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-A de mamifero;secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-B de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-C de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-D de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-E de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de PIGF de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de PDGF-A de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de PDGF-B de mamifero; secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de PDGF-C de mamifero; y secuencias de aminoacidos del dominio de union a RTK de PDGF-D de mamifero; en la que la construccion y el dominio de union a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFRbeta; y en la que el al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoacidos que es identica al menos el 90% a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en un propeptido del extremo amino de VEGF-C de mamifero; un propeptido del extremo carboxi de VEGF-C de mamifero; un propeptido del extremo amino de VEGF-D de mamifero; un propeptido del extremo carboxi de VEGF-D de mamifero; un peptido LAP TGF-β1 de mamifero; y fragmentos de los mismos que son eficaces para unir proteinas de la matriz extracelular o proteinas de neuropilina; con la condicion de que cuando el dominio de union a RTK sea identico al menos el 90% a una secuencia de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-C, el al menos un dominio flanqueante no sea identico al menos el 90% a un propeptido de VEGF-C;y cuando el dominio de union a RTK sea identico al menos el 90% a una secuencia de aminoacidos del dominio de union a RTK de VEGF-D, el al menos un dominio flanqueante no sea identico al menos el 90% a un pro-peptido de VEGF-D.

Description

La presente solicitud reivindica prioridad respecto de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/708.226 presentada el 15 de agosto de 2005.

Campo de la invención

La presente solicitud está dirigida a materiales y procedimientos para promover la angiogénesis.

Antecedentes

La angiogénesis es un proceso fundamental requerido para el crecimiento y el desarrollo normal de tejidos e implica la proliferación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes. La angiogénesis no sólo participa en el desarrollo embrionario y el crecimiento, la reparación y la regeneración de tejido normal, sino que también participa en el ciclo reproductor femenino, el establecimiento y el mantenimiento del embarazo y en la reparación de heridas y fracturas. Además de la angiogénesis que tiene lugar en el individuo sano, los acontecimientos angiogénicos participan en varios procesos patológicos, notablemente el crecimiento de tumores y metástasis, y otras afecciones en las que se aumenta la proliferación de vasos sanguíneos, especialmente del sistema microvascular, tales como retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. La inhibición de la angiogénesis es útil en la prevención o el alivio de estos procesos patológicos.

Debido a la función crucial de la angiogénesis en tantos procesos fisiológicos y patológicos, los factores implicados en el control de la angiogénesis se han investigado exhaustivamente. Se han mostrado varios factores de crecimiento que están implicados en la regulación de la angiogénesis; éstos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento α transformante (TGFα) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Véase, por ejemplo, Folkman y col., “Angiogenesis”, J. Biol. Chem., 1992 267 10931-10934 para una revisión.

Se ha sugerido que una familia particular de factores de crecimiento específicos de células endoteliales y sus receptores correspondientes es principalmente responsable de la estimulación del crecimiento y diferenciación de células endoteliales, y de ciertas funciones de las células diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia PDGF/VEGF y parece que se actúan mediante receptores tirosina-cinasas (RTK).

Hasta la fecha se han identificado varios miembros de la familia de PDGF/VEGF. Éstos incluyen PDGF-A (véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank X06374), PDGF-B (véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank M12783), PDGF-C (publicación internacional nº WO 00/18212), PDGF-D (publicación internacional nº WO 00/027879), VEGF (también conocido como VEGF-A o por la isoforma particular), factor de crecimiento placentario, PIGF (patente de EE.UU. nº 5.919.899), VEGF-B (también conocido como factor relacionado con VEGF (VRF), publicación internacional nº PCT/US96/02597 y el documento WO 96/26736), VEGF-C (patente de EE.UU. nº 6.221.839 y documento WO 98/33917), VEGF-D (también conocido como factor de crecimiento inducido por c-fos (FIGF) (patente de EE.UU. nº 6.235.713, publicación internacional nº WO98/07832), VEGF-E (también conocido como NZ7 VEGF o OV NZ7; publicación internacional nº WO00/025805 y publicación de patente de EE.UU. nº 2003/0113870), NZ2 VEGF (también conocido como OV NZ2; véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank S67520), proteína similar a VEGF D1701 (véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank AF106020; Meyer y col., EMBO J 18:363-374) y proteína similar a VEGF NZ10 (descrita en la solicitud de patente internacional PCT/US99/25869) [Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11 (1999); Neufeld y col., FASEB J 13:9-22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77:527-543 (1999)].

Los factores de crecimiento endoteliales vasculares actúan uniéndose a receptores tirosina-cinasas. Se han identificado siete receptores tirosina-cinasas, concretamente Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt4 (VEGFR3), PDGFR-α, PDGFR-β, Tie y Tek/Tie-2. Todos estos tienen la actividad de tirosina cinasa intrínseca que es necesaria para la transducción de señales. La función específica esencial en la vasculogénesis y la angiogénesis de Flt-1, Flk-1, Tie y Tek/Tie-2 se ha demostrado por mutaciones elegidas como diana que inactivan estos receptores en embriones de ratón. La expresión en exceso de tanto la familia de VEGF/PDGF de factores de crecimiento como de los receptores de VEGF/PDGF puede conducir a desarrollo anormal del sistema vascular (Saaristo y col., FASEB

J. 16:1041-9, 2002; Kubo y col., Proc Natl Acad Sci USA. 99:8868-73, 2002.). La actividad de VEGF/VEGFR también promueve la angiogénesis de nuevas células y tejido en desarrollo, facilitándose así la angiogénesis y la vascularización de células tumorales.

Aunque las moléculas de VEGF anteriormente mencionadas han mostrado alguna promesa con respecto al desarrollo de nuevos vasos sanguíneos y otras propiedades de factores de crecimiento, sigue existiendo la necesidad del desarrollo de soluciones terapéuticas mejoradas para promover la angiogénesis.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a polinucleótidos y polipéptidos recombinantes de la familia de VEGF/PDGF de factores de crecimiento que se modifican con secuencias flanqueantes para conferir propiedades mejoradas. Los materiales y procedimientos de los polipéptidos y los polinucleótidos para la estimulación de la angiogénesis están entre las realizaciones preferidas de la invención.

La invención se destina a necesidades existentes proporcionando nuevos compuestos, composiciones de materia, materiales, dispositivos y procedimientos para modular procesos tales como angiogénesis, linfangiogénesis y cicatrización, que tienen numerosas aplicaciones terapéuticas y profilácticas.

Un aspecto de la invención es compuestos novedosos, especialmente compuestos proteináceos, con propiedades angiogénicas. Un aspecto de la invención es una construcción quimérica que comprende: un dominio de unión a RTK; al menos un dominio flanqueante heterólogo o dominio CUB; y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el al menos un dominio flanqueante o dominio CUB; en los que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFR-beta. Aquellas construcciones que se unen y estimulan el receptor son útiles como agonistas de receptores. Aquellas construcciones que se unen, pero dejan de estimular el receptor, son útiles como antagonistas de receptores. Como se describe en mayor detalle más adelante, algunas realizaciones de la invención se comportan como pro-agonistas, en tanto que un dominio CUB escindible previene la activación del receptor, pero bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, administración o estimulación de una proteasa para escindir el dominio CUB), el dominio CUB se escinde, creando un agonista de receptor. El término “heterólogo” en el contexto usado anteriormente se refiere al dominio flanqueante/CUB que es de una proteína diferente de la del dominio de unión a RTK. Por ejemplo, si el al menos un dominio flanqueante comprende un pro-péptido de VEGF-C, entonces dominios de RTK heterólogos a modo de ejemplo incluyen cualquier miembro de la familia de VEGF/PDGF distinto de VEGF-C (por ejemplo, VEGF-A, -B, o -D; PDGF-A, -B, -C, o -D; o P1GF, pero no VEGF-C).

En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la presente invención es una construcción que comprende un dominio de unión a RTK de receptor tirosina-cinasa, al menos un dominio flanqueante y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el al menos un dominio flanqueante. El término “construcción” generalmente se refiere a una molécula, compuesto o composición de materia y no pretende ser limitante a una estructura o función. El término “dominio” como se usa en este documento es descriptivo del hecho de que puede usarse una parte de una molécula (que puede ser menos de una molécula completa), y también es descriptivo del hecho de que la propia construcción tiene porciones discretas que contribuyen a la funcionalidad global (actividad biológica) de la construcción. En algunas realizaciones, el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK seleccionada del grupo que consiste en: VEGF-A de mamífero, VEGF-B de mamífero, VEGF-C de mamífero, VEGF-D de mamífero, VEGFE de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D. La construcción y el dominio de unión a RTK se unen a al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFR-beta. En realizaciones preferidas, el dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un propéptido del extremo amino de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo amino de VEGF-D de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-D de mamífero; un péptido LAP TGF-β1 de mamífero; y fragmentos de los mismos que son eficaces para unir proteínas de la matriz extracelular o proteínas de neuropilina, con la condición de que cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C, la construcción contenga al menos un dominio flanqueante que no sea idéntico al menos el 90% a un propéptido de VEGF-C; y cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D, la construcción contenga al menos un dominio flanqueante que no sea idéntico al menos el 90% a un pro-péptido de VEGF-D. En otras palabras, las construcciones de la invención son compuestos heterólogos cuyos dominios no proceden exclusivamente de VEGF-C o exclusivamente de VEGF-D.

En las construcciones descritas en este documento, un ligador (o ligadores) se usa(n) para unir el (los) dominio(s) de unión a RTK a uno o más dominios flanqueantes (o para unir adicionalmente dominios flanqueantes entre sí o para unir dominios adicionales opcionales tales como un dominio de unión a heparina o un dominio CUB). En algunas realizaciones, el ligador comprende un enlace covalente. En realizaciones relacionadas, el ligador comprende un enlace peptídico.

En algunas variaciones, los dominios constituyen péptidos separados y distintos unidos por el ligador. En otras variaciones, los dominios se unen por enlaces peptídicos para formar una cadena de polipéptidos continua.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la construcción es un polipéptido quimérico que comprende una estructura que satisface la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc en la que Fn comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un amino-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un amino-pro-péptido de VEGF-D de mamífero; en la que Fc comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada de un carboxi-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un carboxi-pro-péptido de VEGF-D de mamífero; en la que RTK comprende el dominio de unión a RTK; y en la que L comprende el enlace entre el dominio flanqueante y el dominio de unión a RTK.

En algunas realizaciones particulares, el al menos un dominio flanqueante del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 46; la secuencia de carboxi-propéptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 47; la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 48; y la secuencia de carboxi-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones particulares, el polipéptido quimérico que comprende la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc se une a VEGFR-1 o VEGFR-2; en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos 27 a 147 de la secuencia de aminoácidos de VEGF121 de SEQ ID NO: 4 o fragmento de la misma; los aminoácidos 27 a 171 de la secuencia de aminoácidos de VEGF145 de SEQ ID NO: 5 o fragmento de la misma; los aminoácidos 27 a 191 de la secuencia de aminoácidos de VEGF165 de SEQ ID NO: 6 o fragmento de la misma; los aminoácidos 27 a 215 de la secuencia de aminoácidos de VEGF189 de SEQ ID NO: 7 o fragmento de la misma; los aminoácidos 27-232 de la secuencia de aminoácidos de VEGF206 de SEQ ID NO: 3 o fragmento de la misma.

En una realización particularmente preferida, el polipéptido quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de la construcción CAC de SEQ ID NO 27.

En otras realizaciones particulares, el polipéptido quimérico que comprende la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc se une a VEGFR-1 o VEGFR-2; en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos 22 a 188 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B167 de SEQ ID NO: 44 o fragmento de la misma; los aminoácidos 22 a 207 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B186 de SEQ ID NO: 45 o fragmento de la misma; los aminoácidos 19 a 149 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-1 de SEQ ID NO: 9 o fragmento de la misma; los aminoácidos 19 a 170 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-2 de SEQ ID NO: 42 o fragmento de la misma; y los aminoácidos 19 a 221 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-3 de SEQ ID NO: 43 o fragmento de la misma.

En realizaciones alternativas, el polipéptido quimérico que comprende la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc se une a PDGFRalfa o PDGFR-beta; en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos 87 a 211 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-A de SEQ ID NO: 17 o fragmento de la misma; los aminoácidos 82 a 190 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-B de SEQ ID NO: 19 o fragmento de la misma; los aminoácidos 230 a 345 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-C de SEQ ID NO: 21 o fragmento de la misma; y los aminoácidos 255 a 370 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-D de SEQ ID NO: 24 o fragmento de la misma.

En otras realizaciones mas, el polipéptido quimérico que comprende la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc se une a VEGFR-3 o VEGFR-2; en el que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos 103 a 227 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 13 o fragmento de la misma; y los aminoácidos 93 a 201 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 15 o fragmento de la misma.

En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: la secuencia de aminoácidos de la construcción CAC de SEQ ID NO 27; la secuencia de aminoácidos de la construcción CDD de SEQ ID NO: 37; la secuencia de aminoácidos de la construcción CDC de SEQ ID NO: 39; y la secuencia de aminoácidos de la construcción DDC de SEQ ID NO: 41.

En otra realización más se proporciona otra construcción quimérica (designada “CUB-VEGF”) que comprende un dominio de unión a RTK, un dominio CUB y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el dominio CUB, en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-E de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PlGF de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-A de mamífero; y secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-B de mamífero, en la que el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF-C y secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF-D; y en la que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFRalfa y PDGFR-beta. Será evidente que no se requiere que la construcción de esta realización tenga un dominio flanqueante (aunque las construcciones de esta realización comprenden opcionalmente además un dominio flanqueante).

En algunas realizaciones, el dominio CUB está conectado al extremo N del dominio de unión a RTK, mientras que en otras realizaciones el dominio CUB está conectado al extremo C del dominio de unión a RTK. En una realización, el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en tanto SEQ ID NO: 54 como SEQ ID NO: 56.

En realizaciones particulares, el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a los aminoácidos 27 a 127 de la secuencia de aminoácidos de VEGF109 de SEQ ID NO: 52.

En otras realizaciones particulares, el polipéptido de la construcción quimérica comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57,59 y 61.

En algunas realizaciones, el dominio CUB está unido al dominio de unión a RTK mediante una secuencia de reconocimiento reconocida específicamente por una enzima proteolítica de forma que la enzima proteolítica, si está presente, se escinde en la secuencia de reconocimiento para eliminar el dominio CUB y producir un factor de crecimiento activado.

Se contempla particularmente que cualquiera de las construcciones y polipéptidos de la invención puedan prepararse para incluir adicionalmente una marca de péptido, por ejemplo, una marca de polihistidina. La inclusión de una marca tal facilita la purificación. En realizaciones adicionales, las construcciones o polipéptidos pueden estar PEGilados con uno o más restos de polietilenglicol (PEG).

Las construcciones y polipéptidos de la presente invención pueden formularse ventajosamente en composiciones en las que tales composiciones comprenden una construcción de polipéptido de la invención en un vehículo, excipiente

o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las construcciones de la invención comprenden dominios de polipéptidos y se preparan opcionalmente mediante técnicas recombinantes in vitro y/o se expresan in vivo. Los polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican toda (o una parte de) una construcción son un aspecto adicional de la invención. Los vectores que incluyen vectores de expresión para la producción in vitro y los vectores de terapia génica para la producción/expresión in vivo de construcciones también son un aspecto de la invención.

Por ejemplo, la invención incluye polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier polipéptido quimérico de la invención que incluye un polipéptido quimérico de fórmula Fn-L-RTK-L-Fc, o un polipéptido quimérico designado “CUB-VEGF”, como se trata anteriormente y se describe en más detalle en la descripción más adelante. En realizaciones específicas, el polinucleótido comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal fusionado en marco con los polipéptidos descritos anteriormente. El péptido señal facilita la secreción extracelular de la construcción codificada cuando se expresa en una célula huésped adecuada.

La invención también incluye un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier polipéptido quimérico de la invención que incluye un polipéptido quimérico de fórmula Fn-L-RTK-L-Fc, o un polipéptido quimérico designado “CUB-VEGF”, ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión o secuencia promotora. En algunas variaciones se usa un promotor específico de tejido para preparar un polinucleótido que codifica una construcción y que se expresa preferencialmente en uno o algunos tejidos de un organismo; tal como piel (para la cicatrización), músculo (para isquemia), células endoteliales, neuronas u otros tejidos. En ciertas realizaciones, la secuencia promotora es un promotor específico de la piel seleccionado del grupo que consiste en K14, K5, K6, K16 y el promotor de colágeno alfa 1 (I). En otras realizaciones, el promotor es un promotor específico de células endoteliales. El vector de expresión puede ser cualquier vector usado para la expresión de un ácido nucleico y puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en vectores adenovíricos deficientes en la replicación, vectores víricos adenoasociados y vectores de lentivirus. Los polinucleótidos y vectores de la invención pueden formularse como composiciones en las que los polinucleótidos o el vector se presentan en un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Otros aspectos de la invención incluyen células huésped que han sido transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector de la invención. En algunas variaciones, las células son cualquier célula procariota o eucariota que pueda ser manipulada (por ejemplo, mediante transformación o transfección) para expresar construcciones de polipéptidos de la invención. En algunas variaciones, las células son adecuadas para transfección/transformación ex vivo y reimplantación en un organismo huésped. Por ejemplo, en una variación, las células huésped son células endoteliales de mamífero o células precursoras endoteliales de mamífero. En otra variación, las células son células de músculo o neuronales o precursores.

Otros aspectos de la invención se refieren a procedimientos de modulación del crecimiento de células endoteliales de mamífero o células precursoras endoteliales de mamífero usando construcciones de la invención o usando polinucleótidos/vectores que codifican las construcciones. Un procedimiento a modo de ejemplo comprende poner en contacto las células con una composición que comprende uno o más de lo siguiente: una construcción de polipéptido que comprende un dominio de unión a RTK, al menos un dominio flanqueante y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el al menos un dominio flanqueante; un polipéptido quimérico que comprende la fórmula Fn-L-RTK-L-Fc; un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido. En ciertas realizaciones, el poner en contacto comprende administrar la composición a un sujeto mamífero en una cantidad eficaz para modular el crecimiento de células endoteliales in vivo. En realizaciones particulares, el sujeto mamífero es un ser humano.

También se contempla como parte de la invención un procedimiento de modulación de la angiogénesis en un sujeto mamífero que comprende administrar a un sujeto mamífero en necesidad de modulación de la angiogénesis una composición, en una cantidad eficaz para modular la angiogénesis, que comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

Otras realizaciones de la invención se refieren a procedimientos de modulación de la linfangiogénesis en un sujeto mamífero que comprende administrar a un sujeto mamífero en necesidad de modulación de la linfangiogénesis una composición en una cantidad eficaz para modular la linfangiogénesis, que comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

También se contempla en este documento un procedimiento de mejora de la curación de un injerto de piel o colgajo de piel al tejido subyacente de un sujeto mamífero que comprende poner en contacto el injerto de piel o colgajo de piel tejido al tejido subyacente con una composición que comprende un agente de curación que está presente en dicha composición en una cantidad eficaz para reducir el edema o aumentar la perfusión en el injerto de piel o colgajo de piel, mejorando así la curación del injerto de piel o colgajo de piel; en el que el agente de curación comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

También se contempla una mejora en un dispositivo médico para mejorar la circulación, cicatrización o circulación sanguínea que comprende recubrir o impregnar el dispositivo con una composición que comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

Otros aspectos de la invención incluyen un parche que comprende un material de almohadilla que tiene una superficie superior y una superficie inferior, un adhesivo sobre la superficie inferior y una composición terapéutica, en el que la composición comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

Todavía otro aspecto de la invención es un hilo de sutura quirúrgica impregnado con una composición, en el que la composición comprende uno o más de lo siguiente: cualquier construcción de la invención; un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

Otro aspecto de la invención incluye procedimientos y composiciones para antagonizar un receptor para un factor de crecimiento de la familia de PDGF/VEGF, comprendiendo el procedimiento proporcionar una construcción de la invención que inhibe la unión de un factor de crecimiento a su receptor respectivo. En algunas realizaciones, la invención incluye procedimientos para antagonizar en una célula al menos un receptor seleccionado del grupo que consiste en VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-α y PDGFR-β, en el que el procedimiento comprende administrar a la célula un agente seleccionado del grupo que consiste en una construcción de CUB-VEGF; un dímero que comprende dos polipéptidos quiméricos de la invención, un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

En otras realizaciones, la invención incluye un procedimiento para bloquear la unión de PDGF-D a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β, en una célula en la que están presentes tanto PDGFR-α como PDGFR-β, comprendiendo el procedimiento administrar a la célula un agente seleccionado del grupo seleccionado del grupo que consiste en una construcción de CUB-VEGF; un dímero que comprende dos polipéptidos quiméricos de la invención, un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado

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operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido.

Todavía otro aspecto de la invención incluye un procedimiento para modular actividades de un receptor de una célula cuyo receptor se une específicamente a y es activado por un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en PDGF-A, PDGF-B, el dominio de homología con VEGF de PDGF-C, VEGF, VEGF-B, VEGF-C y PlGF, comprendiendo el procedimiento administrar a la célula un agente seleccionado del grupo que consiste en una construcción de CUB-VEGF; un dímero que comprende dos polipéptidos quiméricos de la invención, un polinucleótido que codifica una construcción tal; un vector de expresión que contiene un polinucleótido tal ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y una célula transformada o transfectada con un polinucleótido tal o un vector tal que expresa la construcción de polipéptido; y proveer a la célula de una enzima proteolítica, por lo que se activa el factor de crecimiento.

En este documento también se describe el descubrimiento de que PDGF-D completamente procesado se une a y activa tanto PDGFR-α como PDGFR-β. Por consiguiente, en este documento se describen moléculas de PDGF-D completamente procesadas, composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas y el uso de las mismas para regular PDGFR-α.

Aspectos adicionales de la invención se definen o se resumen en los siguientes párrafos numerados:

1. Una construcción que comprende:

un dominio de unión a RTK, al menos un dominio flanqueante y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el al menos un dominio flanqueante;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-E de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PlGF de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-C de mamífero; y secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-D de mamífero;

en la que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFRbeta; y

en la que el al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un propéptido del extremo amino de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo amino de VEGF-D de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-D de mamífero; un péptido LAP TGF-β1 de mamífero; y fragmentos de los mismos que son eficaces para unir proteínas de la matriz extracelular o proteínas de neuropilina;

con la condición de que cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C, el al menos un dominio flanqueante no sea idéntico al menos el 90% a un propéptido de VEGF-C; y cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D, el al menos un dominio flanqueante no sea idéntico al menos el 90% a un pro-péptido de VEGF-D.

2.: Una construcción según el párrafo 1, en la que al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un amino-pro-péptido de VEGF-C de mamífero; un carboxi-pro-péptido de VEGF-C de mamífero; un amino-propéptido de VEGF-D de mamífero; y un carboxi-pro-péptido de VEGF-D de mamífero.

3.: Una construcción según el párrafo 1 o el párrafo 2 que comprende además un dominio de unión a heparina conectado a la construcción por un enlace.

4.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 1-3 que comprende además un dominio CUB conectado a la construcción por un enlace.

5.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 1-4, en la que cada uno del al menos un enlace comprende un enlace peptídico.

6.: Una construcción según el párrafo 5, en la que la construcción comprende además un péptido señal.

7.: La construcción del párrafo 5 ó 6, en la que la construcción comprende además una marca de péptido.

8.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-7, en la que la construcción comprende al menos dos dominios flanqueantes.

9.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-8, en la que la construcción satisface la fórmula:

Fn-L-RTK-L-Fc

en la que Fn comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un amino-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un amino-pro-péptido de VEGF-D de mamífero;

en la que Fc comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada de un carboxi-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un carboxi-pro-péptido de VEGF-D de mamífero;

en la que RTK comprende el dominio de unión a RTK; y

en la que L comprende el enlace entre el dominio flanqueante y el dominio de unión a RTK.

10.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-9, en la que el al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 46; la secuencia de carboxi-pro-péptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 47; la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 48; y la secuencia de carboxi-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 49.

11.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-1 o VEGFR-2;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a): aminoácidos 27 a 147 de la secuencia de aminoácidos de VEGF121 de SEQ ID NO: 4;

(b): aminoácidos 27 a 171 de la secuencia de aminoácidos de VEGF145 de SEQ ID NO: 5;

(c): aminoácidos 27 a 191 de la secuencia de aminoácidos de VEGF165 de SEQ ID NO: 6;

(d): aminoácidos 27 a 215 de la secuencia de aminoácidos de VEGF189 de SEQ ID NO:7;

(e): aminoácidos 27-232 de la secuencia de aminoácidos de VEGF206 de SEQ ID NO: 3; y

(f): fragmentos de (a) -(e) que se unen a VEGFR-1 o VEGFR-2.

12.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 1-11 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 27.

13.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-1 o VEGFR-2; y

(a): aminoácidos 22 a 188 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B167 de SEQ ID NO: 44;

(b): aminoácidos 22 a 207 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B186 de SEQ ID NO: 45;

(c): aminoácidos 19 a 149 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-1 de SEQ ID NO: 9;

(d): aminoácidos 19 a 170 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-2 de SEQ ID NO: 42;

(e): aminoácidos 19 a 221 de la secuencia de aminoácidos de PlGF-3 de SEQ ID NO: 43; y

(f): fragmentos de (a) -(e) que se unen a VEGFR-1 o VEGFR-2.

14. Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a PDGFR-alfa o PDGFR-beta; y

(a): aminoácidos 87 a 211 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-A de SEQ ID NO: 17;

(b): aminoácidos 82 a 190 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-B de SEQ ID NO: 19;

(c): aminoácidos 230 a 345 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-C de SEQ ID NO: 21;

(d): aminoácidos 255 a 370 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-D de SEQ ID NO: 24; y

(e): fragmentos de (a) -(d) que se unen a PDGFR-alfa o PDGFR-beta.

15. Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 5-10, en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-3 o VEGFR-2; y en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a

una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a): aminoácidos 103 a 227 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 13;

(b): aminoácidos 93 a 201 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 15; y

(c): fragmentos de (a) -(b) que se unen a VEGFR-3 o VEGFR-2.

16. Una construcción según el párrafo 15 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en

(a): la secuencia de aminoácidos de la construcción CDD de SEQ ID NO 37;

(b): la secuencia de aminoácidos de la construcción CDC de SEQ ID NO: 39; y,

(c): la secuencia de aminoácidos de la construcción DDC de SEQ ID NO: 41.

17.: Una composición que comprende la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18.: Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16, en el que la construcción comprende un polipéptido.

19.: Un polinucleótido según el párrafo 18, en el que el polinucleótido comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal fusionado en marco con el polipéptido.

20.: Un polinucleótido según el párrafo 18 ó 19 que comprende además un secuencia promotora que promueve la expresión del polinucleótido en una célula de mamífero.

21.: Un polinucleótido según el párrafo 20, en el que la secuencia promotora comprende un promotor específico de la piel.

22.: Un polinucleótido según el párrafo 21, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en K14, K5, K6, K16 y promotor del colágeno alfa 1(I).

23.: Un polinucleótido según el párrafo 20, en el que el promotor es un promotor específico de células endoteliales.

24.: Un vector que comprende el polinucleótido de uno cualquiera de los párrafos 18-23.

25.: Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de uno cualquiera de los párrafos 18-23 ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión.

26.: Un vector de expresión del párrafo 25, en el que la secuencia de control de la expresión comprende un promotor específico de células endoteliales.

27.: Un vector de uno cualquiera de los párrafos 24-26 seleccionado del grupo que consiste en vectores adenovíricos deficientes en la replicación, vectores víricos adenoasociados y vectores de lentivirus.

28.: Una composición que comprende el polinucleótido de uno cualquiera de los párrafos 18-23 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

29.: Una composición que comprende el vector de uno cualquiera de los párrafos 24-27 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

30.: Una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido de uno cualquiera de los párrafos 18-23.

31.: Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de uno cualquiera de los párrafos 24-27.

32.: Una célula huésped según el párrafo 31 que expresa el polipéptido codificado por el polinucleótido.

33.: Una célula huésped según uno cualquiera de los párrafos 30-32 que comprende una célula endotelial o célula precursora endotelial de mamífero.

34.: Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 44-54; (b) un polinucleótido que codifica (a); (c) un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (d) una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento de modulación del

crecimiento de células endoteliales de mamífero o células precursoras endoteliales de mamífero.

36.: Un procedimiento del párrafo 34, en el que el sujeto mamífero es un ser humano.

37.: Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

(c): un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d): una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a);

en la que la composición se administra en una cantidad eficaz para modular angiogénesis para uso en un procedimiento de modulación de la angiogénesis en un sujeto mamífero.

38. Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

en la que la composición se administra en una cantidad eficaz para modular linfangiogénesis procedimiento de modulación de la linfangiogénesis en un sujeto mamífero.

39. Un agente de curación seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

(d): una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a)

para uso en un procedimiento de mejora de la cicatrización de un injerto de piel o colgajo de piel al tejido subyacente de un sujeto mamífero.

40. Un dispositivo médico para mejorar la circulación, cicatrización o circulación sanguínea que comprende recubrir

o impregnar el dispositivo con una composición que comprende un agente angiogénico seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

(d): una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a).

41. Un parche que comprende un material de almohadilla que tiene una superficie superior y una superficie inferior, un adhesivo sobre la superficie inferior y una composición terapéutica,

en el que la composición comprende un agente de cicatrización seleccionado del grupo que consiste en

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

42. Un hilo de sutura quirúrgica recubierto o impregnado con una composición,

en el que la composición comprende un agente de curación seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 1-16 y 43-54;

(b): un polinucleótido que codifica (a);

43. Una construcción que comprende:

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un dominio de unión a RTK, un dominio CUB y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el dominio CUB;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-E de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PlGF de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-A de mamífero; y secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-B de mamífero;

en la que el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF-C y secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF-D; y

en la que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFRbeta.

44.: La construcción según el párrafo 43, en la que el dominio CUB está conectado al extremo N del dominio de unión a RTK.

45.: La construcción según el párrafo 43, en la que el dominio CUB está conectado al extremo C del dominio de unión a RTK.

46.: La construcción según uno cualquiera de los párrafos 43-45, en la que el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 53.

47.: La construcción según uno cualquiera de los párrafos 43-45, en la que el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 55.

48.: La construcción según uno cualquiera de los párrafos 1-11 y 43-47, en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a los aminoácidos 27 a 127 de la secuencia de aminoácidos de VEGF109 de SEQ ID NO: 52:

49.: La construcción según uno cualquiera de los párrafos 43-48 que comprende además un dominio de unión a heparina conectado a la construcción por un enlace.

50.: Una construcción según uno cualquiera de los párrafos 43-49, en la que el enlace comprende un enlace peptídico, por lo que el dominio de unión a RTK y el dominio CUB comprenden un polipéptido quimérico.

51.: La construcción según el párrafo 50, en la que el polipéptido quimérico comprende además un péptido señal.

52.: La construcción del párrafo 51, en la que el polipéptido quimérico comprende además una marca de péptido.

53.: La construcción según el párrafo 48, en la que la construcción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57, 59 y 61.

54.: La construcción según los párrafos 43-53, en la que el dominio CUB está conectado al factor de crecimiento mediante una secuencia de reconocimiento reconocida específicamente por una enzima proteolítica de forma que la enzima proteolítica, si está presente, se escinde en la secuencia de reconocimiento para eliminar el dominio CUB y producir un factor de crecimiento activado.

55.: Un dímero que comprende dos polipéptidos de construcción de los párrafos 5-15 y 49-54.

56.: El dímero del párrafo 54, que es un homodímero.

57.: El dímero del párrafo 54, que es un heterodímero.

58.: Un agente seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de uno cualquiera de los párrafos 43-54;

(b): el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 55-57;

(c): un polinucleótido que codifica (a);

(d): un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(e): una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento para antagonizar en una célula al menos un receptor seleccionado del grupo que consiste en

VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-α y PDGFR-β.

59. Un agente seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de uno cualquiera de los párrafos 43-54;

(b) el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 55-57; (c) un polinucleótido que codifica (a); (d) un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (e) una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento para bloquear la unión de PDGF-D a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β, en una célula cuando están presentes tanto PDGFR-α como PDGFR-β.

60. Un agente seleccionado del grupo que consiste en:

(a): la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 43-54;

(b): el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 55-57;

(c): un polinucleótido que codifica (a);

(b): un vector de expresión que contiene (c) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(e): una célula transformada o transfectada con (c) o (d) y que expresa el polipéptido de (a); y

proveyendo a la célula de una enzima proteolítica, por lo que el factor de crecimiento se activa para uso en un procedimiento para modular actividades de un receptor de una célula cuyo receptor se une específicamente a y es activado por un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en PDGF-A, PDGF-B, el dominio de homología con VEGF de PDGF-C, VEGF, VEGF-B, VEGF-C y PlGF.

El anterior resumen no pretende definir cada aspecto de la invención, y aspectos adicionales se describen en otras secciones tales como la descripción detallada. Todo el documento pretende referirse a una divulgación unificada, y debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones de características descritas en este documento aunque la combinación de características no se encuentren juntas en la misma frase o párrafo o sección de este documento.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y están incluidos para ilustrar adicionalmente aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en este documento.

Fig. 1A: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que un dominio flanqueante (F) está posicionado en el extremo amino con respecto al dominio de unión al receptor tirosina-cinasa (RTK). Fig. 1B: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que un dominio flanqueante está posicionado en el extremo carboxi con respecto al dominio de unión a RTK. Fig. 1C: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que dos dominios flanqueantes (F1, F2) están posicionados con un dominio de unión a RTK central. Fig. 1D: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que dos dominios flanqueantes están ambos posicionados en el extremo amino con respecto al dominio de unión a RTK. Fig. 1E: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que dos dominios flanqueantes están ambos posicionados en el extremo carboxi con respecto al dominio de unión a RTK. Fig. 1F: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que dos dominios de unión a RTK están posicionados con un dominio flanqueante central. Fig. 1G: Representación esquemática de un polipéptido quimérico en el que tres dominios flanqueantes están alternando con dos dominios de unión a RTK. Figs. 2A-2C: Fotografía que representa los efectos de vectores adenovíricos que codifican tanto VEGF-CAC (Fig. 2A), VEGF-A165 (Fig. 2B) como control (LacZ, Fig. 2C) en la vasculatura sanguínea de piel de ratón.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La invención incluye nuevos materiales (por ejemplo, biomoléculas, composiciones, dispositivos médicos) y procedimientos y usos médicos para modular procesos angiogénicos, además de la modulación del crecimiento y la maduración de células progenitoras.

A. Moléculas quiméricas de la presente invención

Un aspecto de la invención son construcciones (por ejemplo, moléculas o compuestos) compuestas por un dominio de unión al receptor de receptor tirosina-cinasa (RTK) unido a al menos un dominio flanqueante (F) que confieren propiedades biológicas novedosas a las construcciones, en comparación con las propiedades del dominio de RTK solo. La unión se denomina genéricamente en lo sucesivo un enlace (L) y puede ser tan sencilla como un enlace peptídico u oligopéptido que enlaza los dominios para formar una única cadena de polipéptidos quimérica, o pueden ser estructuras más complejas descritas en este documento. Debido a que las construcciones comprenden al menos un RTK y una secuencia flanqueante que no se originan a partir del mismo gen, pero que han sido recombinados, las construcciones se denominan en este documento construcciones “quiméricas” o polipéptidos “quiméricos”. Las construcciones quiméricas de polipéptidos de la invención pueden tener una variedad de estructuras, como se representa por las siguientes fórmulas esquemáticas:

F-L-RTK (un dominio flanqueante posicionado en el extremo amino con respecto al dominio de unión a RTK)

RTK-L-F (un dominio flanqueante posicionado en el extremo carboxi con respecto al dominio de unión a RTK)

F1-L1-RTK-L2-F2 (dos dominios flanqueantes con un dominio de unión a RTK central)

F1-L1-F2-L2-RTK o RTK-L1-F1-L2-F2 (dos dominios flanqueantes, ambos en el extremo amino o ambos en el extremo carboxi con respecto al dominio de unión a RTK).

RTK1-L1-F1-L2-RTK2 (dos dominios de unión a RTK con un dominio flanqueante central)

F1-L1-RTK1-L2-F2-L3-RTK2-L4-F3 (dos dominios de unión a RTK, tres dominios flanqueantes, alternos)

Otras estructuras que varían de los ejemplos anteriores serán rápidamente evidentes.

1. Dominio de unión al receptor tirosina-cinasa (RTK).

Todos los polipéptidos de VEGF y PDGF que se producen naturalmente pueden usarse para preparar construcciones de la invención, y numerosas de tales secuencias son conocidas, por ejemplo, por Genbank, bibliografía científica y bibliografía de patentes. Los miembros de la familia de VEGF/PDGF preferidos incluyen aquellos de especies aviares y mamíferas y de especies víricas que infectan especies aviares y mamíferas. Especies mamíferas a modo de ejemplo son primates, roedores, especies bovina, equina, canina, porcina y felina. Secuencias a modo de ejemplo incluyen (1) todas aquellas secuencias de miembros de la familia de VEGF y PDGF enumeradas en la base de datos accesible al público GENBANK a partir de la fecha de prioridad de la presente solicitud; (2) todas las secuencias de VEGF y PDGF que se hibridan con secuencias humanas específicas identificadas en este documento bajo condiciones de rigurosidad moderadas o altas; y (3) todas las secuencias de VEGF y PDGF que pueden amplificarse a partir de una biblioteca de ADN genómico o ADNc usando PCR y técnicas relacionadas y usando cebadores diseñados a partir de regiones altamente conservadas de las secuencias proporcionadas en este documento. Realizaciones altamente preferidas se preparan usando secuencias humanas de VEGF/PDGF y secuencias víricas tales como aquellas descritas en los siguientes párrafos.

VEGF-A (o VEGF) se purificó originariamente a partir de varias fuentes basándose en su actividad mitogénica hacia células endoteliales, y también por su capacidad para inducir permeabilidad microvascular, de ahí que también se llame factor de permeabilidad vascular (VPF). Posteriormente se ha mostrado que el VEGF-A induce varios procesos biológicos que incluyen la movilización del calcio intracelular, la inducción del activador de plasminógeno y la síntesis del inhibidor 1 del activador de plasminógeno, la promoción de la migración de monocitos in vitro, inducción de la expresión de proteínas antiapoptósicas en células endoteliales humanas, inducción de fenestraciones en células endoteliales, promoción de la expresión de moléculas de adhesión a células en células endoteliales e inducción de la vasodilatación y la hipotensión mediada por óxido nítrico [Ferrara, J. Mol. Med. 77: 527-543 (1999); Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999); Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-74 (1998)].

VEGF-A (SEQ ID NO: 1 y 2) es una glucoproteína homodimérica ligada por disulfuro secretada compuesta por subunidades de 23 kD. Se han descrito cinco isoformas de VEGF-A humano de 121 (SEQ ID NO: 4), 145 (SEQ ID NO: 5), 165 (SEQ ID NO: 6), 189 (SEQ ID NO: 7) o 206 (SEQ ID NO: 3) aminoácidos de longitud (VEGF121-206), codificadas por distintas variantes de corte y empalme de ARNm, pudiendo todas estimular la mitogénesis en células endoteliales. Sin embargo, cada isoforma se diferencia en su actividad biológica, especificidad por receptor y afinidad por proteoglicanos de sulfato de heparano asociados a la superficie celular y a la matriz extracelular que se comportan como receptores de baja afinidad por VEGF-A. VEGF121 no se une ni a heparina ni a sulfato de heparano; VEGF145 y VEGF165 (nº de acceso de GenBank M32977) pueden unirse ambos a heparina; y VEGF189 y VEGF206 muestran la afinidad más fuerte por heparina y sulfatos de heparano. VEGF121, VEGF145, y VEGF165 son secretados en una forma soluble, aunque la mayoría del VEGF165 está confinado en proteoglicanos de la superficie celular y de la matriz extracelular, mientras que VEGF189 y VEGF206 siguen asociados a la matriz extracelular. Tanto VEGF189 como VEGF206 pueden liberarse mediante tratamiento con heparina o heparinasa, que indica que estas isoformas están unidas a la matriz extracelular mediante proteoglicanos. El VEGF189 unido a células también puede escindirse por proteasas tales como plasmina, produciendo la liberación de un VEGF110 soluble activo. Se observa que la mayoría de los tejidos que expresan VEGF expresan simultáneamente varias isoformas de VEGF, aunque VEGF121 y VEGF165 son las formas predominantes, mientras que VEGF206 es raramente detectado (Ferrara, J Mol Med 77:527-543, 1999). VEGF145 se diferencia en que se expresa principalmente en células derivadas de órganos reproductores (Neufeld y col., FASEB J 13:9-22, 1999).

Como se observa anteriormente, el gen VEGF-A humano se expresa como numerosas isoformas, que incluyen VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206. Una secuencia humana de VEGF206 obtenida de la base de datos Swiss

Prot (nº de acceso P15692) se expone a continuación y en SEQ ID NO: 3:

imagen1

Los aminoácidos 1-26 de esta secuencia representan el péptido señal y VEGF206 maduro comprende los aminoácidos 27-232. Con referencia a la misma secuencia, el péptido señal y los aminoácidos 142-226 están ausentes en la isoforma madura VEGF121 (SEQ ID NO: 4). El péptido señal y los aminoácidos 166-226 están ausentes en la isoforma madura VEGF145 (SEQ ID NO: 5). El péptido señal y los aminoácidos 142-182 están ausentes en la isoforma madura VEGF165 (SEQ ID NO: 6). El péptido señal y los aminoácidos 166-182 están ausentes en la isoforma madura VEGF189 (SEQ ID NO: 7).

VEGF109, que sólo comprende el dominio de homología con VEGF (es decir, el dominio de unión al receptor mínimo), se ha probado para la actividad angiogénica en un ensayo de CAM de pollo, pero los resultados indicaron que era menos angiogénico que VEGF165 (Jeltsch y col., J. Biol. Chem., 281, 12187-95, 2006).

VEGF-A es un ligando para VEGFR-1/Flt-1 (tirosina cinasa 1 similar a fms) y VEGFR-2/Kdr/Flk-1 (dominio de inserto de cinasa que contiene receptor/cinasa 1 de hígado fetal). La expresión de receptores de VEGF se produce principalmente en células endoteliales vasculares, aunque algunos pueden estar presentes en monocitos y células de melanoma. Sólo se ha informado que las células endoteliales proliferan en respuesta a VEGF, y las células endoteliales de diferentes fuentes muestran diferentes respuestas. Por tanto, las señales mediadas por VEGFR-1 y VEGFR-2 parecen ser específicas del tipo de célula.

PlGF (SEQ ID NO: 8 y 9), un segundo miembro de la subfamilia de VEGF, es generalmente un mal estimulador de la angiogénesis y proliferación de células endoteliales en comparación con VEGF-A, y la función in vivo de PlGF no se entiende bien. Su aislamiento y características se describen en detalle en Maglione y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267-9271, 1991. PlGF-2 (SEQ ID NO: 42) y PlGF-3 (SEQ ID NO: 43) se producen por corte y empalme alternativo de ARNm (Hauser y col., Growth Factors 9:259-268, 1993; Maglione y col., Oncogene 8:925-931, 1993). PlGF forma tanto homodímeros como heterodímeros ligados por disulfuro con VEGF-A. Los heterodímeros de PlGF-VEGF-A son más eficaces en la inducción de la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis que los homodímeros de PlGF. PlGF se expresa principalmente en la placenta, y también se coexpresa con VEGF-A durante la embriogénesis temprana en las células gigantes trofoblásticas del saco vitelino parietal (Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11, 1999).

VEGF-B (SEQ ID NO: 10 y 11), descrito en detalle en la publicación de patente internacional nº WO 96/26736 y las patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918, incorporados en este documento por referencia, comparte aproximadamente el 44% de identidad de aminoácidos con VEGF-A. Aunque las funciones biológicas de VEGF-B in vivo siguen sin entenderse completamente, se ha mostrado que tiene propiedades angiogénicas y también puede participar en la adhesión y migración de células y en la regulación de la degradación de la matriz extracelular. VEGFB se expresa como dos isoformas de 167 y 186 residuos de aminoácidos generadas por corte y empalme alternativo. VEGF-B167 (SEQ ID NO: 44) está asociado a la superficie celular o matriz extracelular mediante un dominio de unión a heparina, mientras que VEGF-B186 (SEQ ID NO: 45) es secretado. Tanto VEGF-B167 como VEGF-B186 pueden formar homodímeros o heterodímeros ligados por disulfuro con VEGF-A. La asociación a la superficie celular de los heterodímeros VEGF165-VEGF-B167 parece estar determinada por el componente de VEGFB, sugiriendo que la heterodimerización puede ser importante para secuestrar VEGF-A. VEGF-B se expresa principalmente en tejidos de músculo cardíaco y esquelético embrionario y adulto (Joukov y col., J Cell Physiol 173:211-215, 1997; Stacker y Achen, (antes). Los ratones que carecen de VEGF-B sobreviven, pero tienen corazones más pequeños, vasculatura coronaria disfuncional y presentan recuperación alterada de isquemia cardíaca (Bellomo y col., Circ Res., E29-E35, 2000).

VEGF-B tiene propiedades angiogénicas y otras propiedades similares a las de VEGF, pero está distribuido y se expresa en los tejidos de forma diferente a VEGF. En particular, VEGF-B se expresa muy fuertemente en el corazón, y sólo débilmente en el pulmón, mientras que la inversa es el caso para VEGF. Esto sugiere que VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresen en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

VEGF-C (SEQ ID NO: 12 y 13) se aisló de medios condicionados de la línea de células de adenocarcinoma de próstata PC-3 (CRL1435) seleccionando un componente del medio que produjo la fosforilación de la tirosina del receptor tirosina-cinasa Flt4 específico de células endoteliales (VEGFR-3) usando células transfectadas para expresar Flt4. El aislamiento de VEGF-C y las características se describen en detalle en Joukov y col., EMBO J. 15 290-298,1996 y las patentes de EE.UU. nº 6.221.839; 6.235.713; 6.361.946; 6.403.088; y 6.645.933 y las publicaciones de patente internacional nº WO 97/05250, WO 98/07832 y WO 98/01973, incorporados en este documento por referencia. En embriones de ratón, el ARNm de VEGF-C se expresa principalmente en el alantoides, el área yugular y el metanefros. (Joukov y col., J Cell Physiol 173:211-215,1997), y parece que participa en la regulación de la angiogénesis linfática (Jeltsch y col., Science, 276:1423-1425, 1997). Como se describe más adelante en mayor detalle, el dominio de unión a RTK de VEGF-C maduro se corresponde con los residuos 103-227 de SEQ ID NO: 14.

VEGF-D (SEQ ID NO: 14 y 15) se expresa inicialmente como un prepro-péptido que experimenta la eliminación de un péptido señal (residuos 1-21 de SEQ ID NO: 15), procesamiento proteolítico del extremo N (residuos 22-92 de SEQ ID NO: 15) y del extremo C (residuos 202-354 de SEQ ID NO: 15) y forma dímeros ligados no covalentemente. VEGF-D estimula respuestas mitogénicas en células endoteliales in vitro. Durante la embriogénesis, VEGF-D se expresa en un complejo patrón temporal y espacial, y su expresión persiste en el corazón, pulmón y los músculos esqueléticos en adultos. El aislamiento de un fragmento biológicamente activo de VEGF-D designado VEGF-D∆N∆C se describe en la publicación de patente internacional nº WO 98/07832 (PCT/US97/14696). VEGF-D∆N∆C consiste en los residuos de los aminoácidos 93 a 201 de VEGF-D (SEQ ID NO: 15) y se une a VEGFR-2 y VEGFR-3. Las formas parcialmente procesadas de VEGF-D se unen a VEGFR-3.

Los fragmentos preferidos de VEGF-C o -D para uso en la preparación de las moléculas quiméricas de la invención son fragmentos continuos que se unen a uno o más de los receptores de VEGF. Sin embargo, se ha demostrado que la unión a VEGFR puede lograrse con moléculas que incorporan fragmentos discontinuos discretos de VEGF-C fusionados, por ejemplo, con fragmentos de VEGF-A u otras secuencias de aminoácidos. Tales ligandos de VEGFR quiméricos se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/795.006 presentada el 26 de febrero de 2001 y la publicación de patente internacional nº WO 01/62942, .

PDGF-A (SEQ ID NO: 16 y 17) y PDGF-B (SEQ ID NO: 19 y 20) pueden homodimerizarse o heterodimerizarse para producir tres isoformas diferentes: PDGF-AA, PDGF-AB o PDGF-BB. PDGF-A solo puede unirse al receptor de PDGF-α (PDGFR-α que incluye homodímeros de PDGFR-α/α). PDGF-B puede unirse tanto a PDGFR-α como a un segundo receptor de PDGF (PDGFR-β). Más específicamente, PDGF-B puede unirse a homodímeros PDGFR-α/α y PDGFR-β/β, además de a heterodímeros PDGFR-α/β.

PDGF-AA y -BB son los principales mitógenos y quimioatrayentes para células de origen mesenquimatoso, pero no tienen efecto, o tienen poco efecto, sobre células de linaje endotelial, aunque tanto PDGFR-α como -β se expresan en células endoteliales (EC). Se ha mostrado que PDGF-BB y PDGF-AB participan en la estabilización/maduración de vasos recientemente formados (Isner y col., Nature 415:234-9, 2002; Vale y col., J Interv Cardiol 14:511-28, 2001); Heldin y col., Physiol Rev 79:1283-1316, 1999; Betsholtz y col., Bioassays 23:494-507, 2001). Sin embargo, otros datos mostraron que PDGF-BB y PDGF-AA inhibieron la angiogénesis inducida por bFGF in vivo mediante la señalización de PDGFR-α. PDGF-AA está entre los estímulos más potentes de la migración de células mesenquimatosas, pero ni estimula o estimula mínimamente la migración de EC. En ciertas condiciones, PDGF-AA incluso inhibe la migración de EC (Thommen y col., J Cell Biochem. 64:403-13, 1997; De Marchis y col., Blood 99:2045-53, 2002; Cao y col., FASEB. J. 16:1575-83, 2002). Además, se ha mostrado que PDGFR-α antagoniza la migración de SMC inducida por PDGFR-β (Yu y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:697-700, 2001) y anticuerpos neutralizantes contra PDGF-AA potencian la migración de células de músculo liso (SMC) (Palumbo, R. y col., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22:405-11, 2002). Por tanto, la actividad angiogénica/arteriogénica de PDGF-A y -B, especialmente cuando se señalizan mediante PDGFR-α, ha sido controvertida y enigmática.

Se ha informado de que PDGF-AA y -BB desempeñan funciones importantes en la proliferación y diferenciación de tanto células madre/progenitoras cardiovasculares como nerviosas. PDGF-BB indujo la diferenciación de Flk1 + citoblastos embrionarios en células murales vasculares (Carmeliet, P., Nature 408:43-45, 2000; Yamashita y col., Nature 408:92-6, 2000) y posiblemente aumentó la supervivencia de neuronas derivada de neuroesferas (Caldwell y col., Nat Biotechnol. 19:475-479, 2001); mientras que PDGF-AA estimuló la proliferación de precursores de oligodendrocitos mediante integrinas αvβ3 (Baron y col., Embo. J. 21:1957-66, 2002).

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para PDGF-C se exponen en SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente, y el nucleótido y aminoácido para PDGF-D se expone en SEQ ID NO: 22 y 23, respectivamente. PDGF-C se une a homodímeros PDGFR-α/α y PDGF-D se une a homodímeros PDGFR-β/β y se ha informado que ambos se unen a heterodímeros PDGFR-α/β. Los polipéptidos y polinucleótidos de PDGF-C fueron caracterizados por Eriksson y col. en la publicación de patente internacional nº WO 00/18212, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0164687 A1 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 10/303.997 [publicada como la publicación de patente de EE.UU. nº 2003/0211994]. Los polinucleótidos y polipéptidos de PDGF-D fueron caracterizados por Eriksson y col. en la publicación de patente internacional nº WO 00/27879 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0164710 A1. Como se describe en su interior, PDGF-C y -D se unen a receptores alfa y beta de PDGF, respectivamente. Sin embargo, una distinción notable entre estos polipéptidos y PDGF-A y -B es que PDGF-C y -D poseen cada uno un dominio CUB del extremo amino que puede escindirse proteolíticamente dando un dominio del extremo carboxi biológicamente activo (de unión a receptor) con homología de secuencias con otros miembros de la familia de PDGF. PDGF-C (SEQ ID NO: 21) requiere la eliminación proteolítica del dominio CUB del extremo N para la unión al receptor y la activación del receptor.

Una forma preferida de PDGF-C comprende el dominio de homología con PDGF/VEGF (PVHD) de PDGF-C y retiene las funciones de unión al y activación del receptor. El dominio mínimo tiene aproximadamente los residuos 230-345 de SEQ ID NO: 21. Sin embargo, el dominio puede extenderse hacia el extremo N hasta el residuo 164. El PVHD de PDGF-C también se denomina en lo sucesivo PDGF-C truncado. El PDGF-C truncado es una forma activada de PDGF-C. Un sitio proteolítico putativo en PDGF-C se encuentra en los residuos 231-234 de SEQ ID NO: 21, un motivo dibásico. El sitio proteolítico putativo también se encuentra en PDGF-A, PDGF-B, VEGF-C y VEGF-D. En estas cuatro proteínas, el sitio proteolítico putativo también se encuentra justo antes del dominio mínimo para el dominio de homología con PDGF/VEGF. El dominio CUB de PDGF-C representa aproximadamente los residuos de aminoácidos 23-159 de SEQ ID NO: 21 (publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº: 2002/0164687).

Similar a PDGF-C, PDGF-D tiene una estructura de dos dominios con un extremo N. El dominio CUB (descrito como aproximadamente los residuos 67-167 ó 54-171 de SEQ ID NO: 23) y un dominio de homología con PDGF/VEGF del extremo C (PVHD). Un sitio proteolítico putativo en PDGF-D se encuentra en los residuos 255-258 de SEQ ID NO:

23. Un polipéptido de PDGF-D preferido comprende el dominio de homología con PDGF/VEGF (PVHD) de PDGF-D y retiene las funciones de unión al y activación del receptor. El dominio mínimo de PDGF-D es aproximadamente los residuos 272-362 ó 255-370 de SEQ ID NO: 23. Sin embargo, PVHD de PDGF-D se extiende hacia el extremo N hasta el residuo 235 de SEQ ID NO: 23. El PDGF-D truncado es la forma activada putativa de PDGF-D (publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0164710.)

PDGF-C y PDGF-D también poseen un inserto de tres aminoácidos (NCA) entre las cisteínas 3 y 4 conservadas en el dominio de homología con VEGF. El VHD de PDGF-C y PDGF-D se parece mucho al de VEGF-C y VEGF-D. PDGF-C requiere la eliminación proteolítica del dominio CUB del extremo N para la unión al receptor y la activación del receptor. Esto indica que es probable que los dominios CUB bloqueen estéricamente los epítopes de unión al receptor del dímero sin procesar. Las proteínas proteolíticamente procesadas in vitro e in vivo carecen de porciones del extremo N correspondientes a más de 14-16 kDa como se determina por análisis de SDS-PAGE que está de acuerdo con una pérdida del dominio CUB de 110 aminoácidos de longitud y una parte de la región bisagra entre los dominio CUB y de núcleo que varían de longitud.

Esta quinta cisteína “invariante” encontrada en los otros miembros de la familia de PDGF/VEGF no está conservada en PDGF-D. Esta característica es única para PDGF-D. El VHD de PDGF-D se parece mucho al de VEGF-C y VEGF-D. La expresión del ARNm de PDGF-D fue la más alta en el corazón, ovarios y el páncreas, y se expresó a niveles más bajos en los testículos, riñón, hígado, placenta, próstata e intestino delgado.

Durante el desarrollo, PDGF-C se expresa en células progenitoras de músculo y células de músculo liso diferenciadas en la mayoría de los órganos, incluyendo el corazón, pulmón y riñón (Aase y col., Mech. Dev. 110:18791, 2002). En la edad adulta, PDGF-C se expresa ampliamente en la mayoría de los órganos, con el mayor nivel de expresión en el corazón y el riñón (Li y col., Nat. Cell. Biol. 2:302-09, 2000). PDGF-CC es secretado como un homodímero inactivo de aproximadamente 95 kD. Tras la eliminación proteolítica del dominio CUB, PDGF-CC puede unirse a y activar su receptor, PDGFR-α (Li y col., Cytokine & Growth Factor Reviews 244:1-8, 2003). En células que coexpresan tanto PDGFR-α como -β, PDGF-CC también puede activar el heterodímero PDGFR-α/β, pero no el homodímero PDGFR-β/β (Cao y col., FASEB. J. 16:1575-83, 2002; Gilbertson y col., J. Biol. Chem. 276:27406-14, 2001).

El PDGF-CC activo es un potente mitógeno para células de fibroblasto y de músculo liso vascular (Li y col., Nat. Cell. Biol. 2:302-09, 2000; Cao y col., FASEB. J. 16:1575-83, 2002; Uutela y col., Circulation 103:2242-7, 2001). Tanto PDGF-AA como PDGF-CC se unen a PDGFR-α, pero sólo PDGF-CC estimula potentemente la angiogénesis en ensayos en la bolsa de la córnea de ratón y membrana corioalantoidea de pollo (CAM) (Cao y col., FASEB. J. 16:1575-83, 2002). PDGF-CC también promueve la cicatrización estimulando la vascularización de tejido (Gilbertson y col., antes). Sin embargo, estos estudios no tratan si PDGF-CC estimuló el crecimiento de vasos afectando las células endoteliales o de músculo liso ni examinaron si PDGF-CC promovió o no la maduración de vasos recientemente formados (incluyendo vasculogénesis, angiogénesis, neoangiogénesis y arteriogénesis).

Cuatro miembros adicionales de la subfamilia de VEGF denominados conjuntamente en lo sucesivo factores VEGFE se han identificado en poxvirus, que infectan seres humanos, oveja y cabras. El VEGF-E codificado por el virus orf (SEQ ID NO: 24 y 25) y NZ2 VEGF son potentes mitógenos y factores que potencian la permeabilidad. Ambos muestran aproximadamente el 25% de identidad de aminoácidos con VEGF-A de mamífero y se expresan como homodímeros ligados por disulfuro. Otra variante de la proteína similar a VEGF-E del virus orf de la cepa NZ10 se describe en el documento WO 00/25805, incorporado aquí por referencia. La infección por estos virus se caracteriza por dermatitis pustular que puede implicar la proliferación de células endoteliales y la permeabilidad vascular inducida por estas proteínas víricas de VEGF (Ferrara, J Mol Med 77:527-543, 1999; Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11, 1999). Las proteínas similares a VEGF también se han identificado a partir de dos cepas adicionales del virus orf, D1701 (nº de acceso de GenBank AF106020; descrito en Meyer y col., EMBO J 18:363374, 1999) y NZ10 [descrito en la solicitud de patente internacional WO 00/25805]. Se ha mostrado que estas proteínas víricas similares a VEGF se unen a VEGFR-2 presente en endotelio de huésped, y esta unión es importante para el desarrollo de infección e inducción vírica de angiogénesis (Meyer y col., EMBO J 18:363-374, 1999; solicitud de patente internacional WO 00/25805).

imagen2

VEGF-A: 2 véanse las isoformas

VEGF109: 52 27-127

VEGF206: 3 27-232 142-226

VEGF121: 4 27-147 N/A

VEGF145: 5 27-171 142-165

VEGF165: 6 27-191 183-226

VEGF189: 7 27-215 142-215

PlGF-1: 9 19-149 N/A

PlGF-2: 42 19-170 142 a 162

PIGF-3: 43 19-221 193-213

VEGF-B: 11 véanse las isoformas

VEGF-B167: 44 22-188 138 a 182

VEGF-B186: 45 22-207 N/A

VEGF-C: 13 103-227 N/A

VEGF-D: 15 93-201 N/A

PDGF-A: 17 87-211 N/A

PDGF-B: 19 82-190 N/A

PDGF-C: 21 230-345 N/A

PDGF-D: 23 272-362 ó 255-370 N/A

VEGF-E: 25 N/A

Fragmentos más pequeños de la mayoría o todos de la familia de VEGF y PDGF también pueden unirse a sus receptores respectivos y la identidad de tales fragmentos más pequeños se determina por ensayos de unión a RTK tales como aquellos descritos en este documento o en la bibliografía.

5 2. Dominio flanqueante

Un dominio flanqueante usado para preparar las construcciones de la invención comprende una secuencia de péptidos o de polipéptidos similar a o idéntica a un propéptido de un miembro de la familia de VEGF o PDGF. En preproproteínas nativas, los propéptidos flanquean el dominio de homología con VEGF (dominio de unión a RTK),es decir, están posicionados adyacentes al dominio de homología con VEGF (VHD). En una realización preferida

10 descrita en los siguientes párrafos, el dominio flanqueante comprende propéptidos del extremo N (FN) y del extremo C (FC) de VEGF-C o VEGF-D (en los que “del extremo” se refiere a la localización del propéptido con respecto al VHD).

VEGF-C comprende un VHD que es idéntico aproximadamente el 30% al nivel de aminoácidos a VEGF-A. La proteína de VEGF-C secretada consiste en un homodímero no covalentemente ligado, conteniendo cada monómero 15 el VHD. Las formas intermedias de VEGF-C producidas por el procesamiento proteolítico parcial muestran una afinidad creciente por el receptor VEGFR-3, y la proteína madura también puede unirse al receptor VEGFR-2 [véanse los documentos WO 97/05250; WO 98/33917; WO 00/24412, las patentes de EE.UU. nº 6.221.839, 6.361.946, 6.645.933, 6.730.658 y 6.245.530; y Joukov y col., EMBO J., 16(13):3898-3911 (1997), incorporándose todos en este documento por referencia]. También se ha demostrado que un VEGF-C mutante, en el que una única

20 cisteína en la posición 156 está tanto sustituida con otro aminoácido como delecionada, pierda la capacidad para unirse a VEGFR-2 , pero sigue pudiendo unirse a y activar VEGFR-3 [véase la publicación de patente internacional nº WO 98/33917 y las patentes de EE.UU. nº 6.130.071 y 6.361.946, cada una de las cuales se incorporan en este documento por referencia].

VEGF-C (SEQ ID NO: 12 y 13) se expresa originariamente como una proteína precursora grande, prepro-VEGF-C, que tiene secuencias de péptidos extensivas del extremo amino y carboxi que flanquean un dominio de homología con VEGF (VHD), conteniendo el péptido del extremo C residuos de cisteína repetidos en tándem en un motivo típico de la proteína 3 del anillo de Balbiani. El polipéptido de prepro-VEGF-C se procesa en múltiples etapas para producir un polipéptido de VEGF-C maduro y más activo (∆N∆C VEGF-C) de aproximadamente 21-23 kD (como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras). Tal procesamiento incluye escisión de un péptido señal (SEQ ID NO: 13, residuos 1-31); escisión de un péptido del extremo carboxilo (SEQ ID NO: 47, que se corresponde aproximadamente con los residuos 228-419 de SEQ ID NO: 13) para producir una forma parcialmente procesada de aproximadamente 29 kD; y escisión (aparentemente extracelularmente) de un péptido del extremo amino (SEQ ID NO: 46, que se corresponde aproximadamente con los residuos 32-102 de SEQ ID NO: 13) para producir una forma madura completamente procesada de aproximadamente 21-23 kD. La evidencia experimental demuestra que las formas parcialmente procesadas de VEGF-C (por ejemplo, la forma de 29 kD) pueden unirse al receptor de Flt4 (VEGFR-3), mientras que la alta unión por afinidad a VEGFR-2 sólo se produce con las formas completamente procesadas de VEGF-C. Además, se ha demostrado que los aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO: 13 no son todos críticos para mantener las funciones de VEGF-C. Un polipéptido que consiste en los aminoácidos 112-215 (y que carece de los residuos 103-111 y 216-227) de SEQ ID NO: 13 retiene la capacidad para unirse a y estimular receptores de VEGF-C, y se espera que un polipéptido que abarca de aproximadamente el residuo 131 a aproximadamente el residuo 211 de SEQ ID NO: 13 retendrá la actividad biológica de VEGF-C. Se ha mostrado que el residuo de cisteína en la posición 156 es importante para la capacidad de unión a VEGFR-2. Parece que los polipéptidos de VEGF-C se asocian naturalmente como dímeros ligados por no disulfuro. Recientemente se estudió la interacción de propéptidos de VEGF-C con neuropilina 1 (NP-1) y neuropilina 2 (NP-2) y se encontró que el dominio del extremo N de los propéptidos de VEGF-C era un mediador importante en la unión a NP-1 y NP-2 (Karpenen y col., FASEB J., 20:1462-1472, 2006).

VEGF-D está estructuralmente y funcionalmente muy estrechamente relacionado con VEGF-C [véase la publicación de patente internacional nº WO 98/07832, incorporada en este documento por referencia]. Al igual que VEGF-C, VEGF-D (SEQ ID NO: 14 y 15) se expresa inicialmente como un prepro-péptido que se somete a eliminación de un péptido señal (residuos 1-21 de SEQ ID NO: 10), procesamiento proteolítico de propéptidos del extremo amino (SEQ ID NO: 48, que se corresponde con los residuos 22-92 de SEQ ID NO: 15) y propéptidos del extremo carboxi (SEQ ID NO: 49, que se corresponde con los residuos 202-354 de SEQ ID NO: 15), y forma dímeros ligados no covalentemente. VEGF-D estimula respuestas mitogénicas en células endoteliales in vitro. Durante la embriogénesis, VEGF-D se expresa en un complejo patrón temporal y espacial, y su expresión persiste en el corazón, pulmón y los músculos esqueléticos en adultos. El aislamiento de un fragmento biológicamente activo de VEGF-D designado VEGF-D∆N∆C se describe en la publicación de patente internacional nº WO 98/07832. VEGFD∆N∆C consiste en los residuos de aminoácidos 93 a 201 de VEGF-D (SEQ ID NO: 15) y se une a VEGFR-2 y VEGFR-3. Formas parcialmente procesadas de VEGF-D se unen a VEGFR-3.

Además, VEGF-D se describe en mayor detalle en la publicación de patente internacional nº WO 98/07832 y la patente de EE.UU. nº 6.235.713, y describe polipéptidos de VEGF-D y variantes de los mismos que son útiles en la producción de quimeras de la presente invención. Las moléculas relacionadas con VEGF-D también se describen en la publicación de patente internacional nº WO 98/02543 y WO 97/12972, y la patente de EE.UU. nº 6.689.580, y la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/219.345 y 09/847.524.

El dominio de LAP (proteína asociada a la latencia) de TGF-β1 también puede servir de secuencia flanqueante (SEQ ID NO: 50). Se ha mostrado que LAP proporciona una interacción que impide la envuelta ligada por disulfuro de la citocina de TGF-β1 con sus receptores celulares, confiriendo una semivida muy larga de 55 horas in vivo (Adams y col., Nature Biotechnol., 21, 1314-1320, 2003). Sin ceñirse a ningún mecanismo de acción se contempla que la presencia de un dominio de LAP en construcciones de la invención aumenta la semivida en suero de construcciones in vivo y/o ayuda en la localización de las construcciones en la matriz extracelular para aumentar la eficiencia de unión de las construcciones a sus receptores de la superficie celular respectivos, aumentando así la biodisponibilidad y potencia como terapéutico.

Estas y otras moléculas que pueden servir de secuencias flanqueantes se describen en más detalle en este documento.

3. Dominio de unión a heparina

Las moléculas quiméricas de la invención pueden incluir adicionalmente un dominio de unión a heparina. Sin ceñirse a ningún mecanismo de acción se contempla que la presencia de un dominio de unión a heparina en los factores de crecimiento facilita la unión de los factores de crecimiento a heparina y permite la concentración de los factores de crecimiento en la matriz extracelular para aumentar la eficiencia de unión de los factores de crecimiento a sus receptores de la superficie celular respectivos, aumentando así la biodisponibilidad de los factores de crecimiento en un sitio dado.

Mulloy y col., (Curr Opin Struct Biol. 11(5):623-8, 2001) describen propiedades de muchas estructuras de dominios de unión a heparina e identifican muchos ejemplos de dominios de unión a heparina, y se incorpora en este documento por referencia. Cualquier dominio de unión a heparina tal puede usarse en las moléculas quiméricas de la presente invención. En otra realización, las moléculas quiméricas de la presente invención pueden comprender el dominio de unión a heparina de P1GF-2 (véase, Hauser y Weich, Growth Factors, 9 259-68, 1993). Los dominios de unión a heparina de otros factores de crecimiento también pueden usarse en los presentes polipéptidos quiméricos tales como, por ejemplo, el dominio de unión a heparina del factor de crecimiento similar a EGF (Shin y col., J Pept Sci. 9(4):244-50,2003); el dominio de unión a heparina del factor de crecimiento similar a la proteína de unión a insulina (Shand y col., J Biol Chem. 278(20):17859-66, 2003) y similares. Otros dominios de unión a heparina que pueden usarse en este documento incluyen, pero no se limitan a, los dominios de unión a heparina de pleiotrofina y anfoterina (Matrix Biol. 19(5):377-87, 2000); CAP37 (Heinzelmann y col., Int J Surg Investig. 2(6):457-66, 2001); y el fragmento de unión a heparina de fibronectina (Yasuda y col., Arthritis Rheum. 48(5):1271-80, 2003).

La inclusión de un dominio de unión a heparina en una molécula quimérica de VEGF se ha descrito previamente en la publicación de patente de EE.UU. de propiedad común nº 2005/0032697 y la publicación PCT nº WO 20051016963. Los dominios de unión a heparina preferidos se encuentran en moléculas de VEGF/PDGF nativas. VEGF-C y VEGF-D, al igual que VEGF121, carecen de un dominio de unión a heparina. Sin embargo, se sabe que VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206 comprenden dominios de unión a heparina (Keck y col., Arch. Bioch. Biophys., 344:103-113, 1997; Fairbrother y col., Structure 6:637-648, 1998). Los exones 6 (21 aminoácidos) y 7 (44 aminoácidos) contienen dos dominios de unión a heparina independientes (Poltorak y col., Herz, 25:126-9, 2000). En una realización preferida, el dominio de unión a heparina está codificado por el exón 6 y/o el exón 7 de VEGF. El dominio de unión a heparina puede comprender adicionalmente los aminoácidos codificados por el exón 8 de VEGF. Las secuencias de los diversos exones de VEGF son ampliamente conocidas y pueden encontrarse, por ejemplo, en los números de acceso de GenBank M63976-M63978, en los que M63976 es el exón 6, M63977 es el exón 7; y M63978 es el exón 8.

En otras realizaciones, el dominio de unión a heparina puede ser de otros factores de crecimiento de VEGF, por ejemplo, puede usarse el dominio de unión a heparina de VEGF-B. Makinen y col. (J. Biol. Chem., 274:21217-22, 1999) han descrito diversas isoformas de VEGF-B y han mostrado que el exón 6B codificado por la secuencia de VEGF-B167 se parece al dominio de unión a heparina y a NRP1 codificado por el exón 7 de VEGF165. Por tanto, el exón 6B de VEGF-B167 (o un fragmento de unión a heparina del mismo) puede usarse como dominio de unión a heparina de las moléculas quiméricas de la presente invención. La publicación de Makinen y col., J. Biol. Chem.,

274: 21217-22, 1999, proporciona una descripción detallada de la construcción de la secuencia codificada por el exón 6B de VEGF-B. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas para VEGF-B están depositadas en GenBank bajo el nº de acceso U48801, incorporadas en este documento por referencia. En este documento también se incorpora por referencia Olofsson y col., J. Biol. Chem. 271 (32), 19310-19317 (1996), que describe la organización genómica de los genes de ratón y humanos para VEGF-B, y su entrada en Genbank relacionada en AF468110, que proporciona una secuencia genómica a modo de ejemplo de VEGF-B.

El dominio de unión a heparina de miembros de VEGF/PDGF puede unirse al polipéptido de la invención en cualquier extremo del dominio de unión a RTK o al dominio flanqueante.

4. Dominio CUB

Las moléculas quiméricas de la invención pueden incluir adicionalmente un dominio CUB. Sin ceñirse a ningún mecanismo de acción se contempla que la presencia de un dominio CUB en los factores de crecimiento proporciona un sitio de unión para enzimas proteolíticas que procesan los factores en condiciones biológicas adecuadas a las que necesitan activarse.

El dominio CUB de PDGF-C y/o PDGF-D puede unirse al polipéptido quimérico de la invención en cualquier extremo del dominio de unión a RTK o al dominio flanqueante.

En otra realización mas, las moléculas quiméricas de la invención pueden comprender el dominio CUB unido al dominio de unión a RTK de un miembro de la familia de VEGF/PDGF (tanto directamente como mediante un ligador), en las que la construcción resultante no incluye necesariamente adicionalmente un dominio flanqueante como se define anteriormente. Por ejemplo, el dominio CUB de PDGF-C y/o PDGF-D puede unirse a VEGF-A para producir una proteína quimérica designada CUB-VEGF, y también se contempla como un aspecto de la invención. Se contempla que la propiedad de activación proteolítica de las formas latentes de PDGF-C y PDGF-D que contienen dominios CUB podría transferirse a factores de la familia de VEGF/PDGF preparando proteínas quiméricas que contienen el dominio CUB fusionado con los dominios de factores de crecimiento de otro de los ligandos de la familia de VEGF/PDGF, conteniendo el dominio CUB o estando unido por un enlace que es proteolíticamente escindible.

CUB-VEGF (o CUB unido a cualquier dominio de unión a RTK de la familia de VEGF/PDGF) se contempla para uso en la restricción de la actividad biológica de estos factores hasta que se activan de un modo deseado in vivo. En algunas realizaciones, la adición del dominio CUB al dominio de unión a RTK introduciría un sitio de escisión de proteasas para la posible activación de estos factores. Adicionalmente, el sitio sensible a proteasa puede sustituirse por un sitio de escisión para una enzima proteolítica no disponible en el sistema biológico, pero que podría proporcionarse en trans como proteína o vector de expresión génico para la activación de las quimeras del ligando latente. En otra variación, el enlace y la construcción es no escindible y la construcción resultante es una forma latente que se une, pero que no activa receptores y es útil como inhibidor.

5. Ligadores

Para preparar moléculas de la invención se usa un ligador, preferentemente un ligador covalente, para unir el dominio de unión a RTK a uno o más dominios flanqueantes (o para unir adicionalmente dominios flanqueantes entre sí o para unir dominios adicionales opcionales tales como un dominio de unión a heparina). En algunas realizaciones, el ligador es simplemente un enlace covalente. Por ejemplo, en una realización preferida, si FN-L-RTKL-FC (“L” denota un ligador) comprende un único polipéptido continuo, el ligador puede denotar un enlace amida (péptido) entre el aminoácido del extremo C de FN y el aminoácido del extremo N del dominio de unión a RTK, o entre el aminoácido del extremo N de FC y el aminoácido del extremo C del dominio de unión a RTK.

El ligador puede ser un resto orgánico construido para contener un esqueleto alquilo, arilo y puede contener un enlace amida, éter, éster, hidrazona, disulfuro o cualquier combinación de los mismos. Enlaces que contienen componentes unidos por aminoácido, éter y amida serán estables en condiciones de pH fisiológico, normalmente 7,4 en suero y 4-5 tras la captación en células (endosomas). Se prefieren enlaces disulfuro debido a que son sensibles a la escisión reductora; los ligadores de aminoácido pueden diseñarse para ser sensibles a la escisión por enzimas específicas en el órgano diana deseado. Ligadores a modo de ejemplo se explican en Blattler y col. Biochem. 24:1517-1524, 1985; King y col.. Biochem. 25:5774-5779, 1986; Srinivasachar y Nevill, Biochem. 28:2501-2509, 1989.

En todavía otras realizaciones, la entidad L es un enlace químicamente, o de otro modo, escindible que bajo condiciones apropiadas permite la liberación de la subunidad FN de la subunidad FC. Por ejemplo, los dominios FN y el dominio de unión a RTK pueden ligarse covalentemente por uno o más puentes disulfuro que ligan residuos de cisteína de FN y el dominio de unión a RTK; o por unión mutua con un entidad química distinta tal como un resto carbohidrato.

El ligador es opcionalmente un polipéptido de proteína heteróloga. En realizaciones particulares, el ligador comprende un ligador de péptidos que comprende de 1 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el ligador tiene de 1 a 10 residuos. En algunas realizaciones, el ligador tiene de 1 a 50 residuos. En algunas realizaciones, el ligador tiene 1-100 residuos. Se prefieren ligadores de 4-50 aminoácidos, y 415 son altamente preferidos. Los ligadores de péptidos preferidos son péptidos lineales unidos en el extremo N y en el extremo C a dominios FN y al dominio de unión a RTK para formar un único polipéptido continuo. En ciertas realizaciones, el ligador de péptidos comprende un sitio de escisión de proteasa tal como un sitio de escisión del factor Xa, un sitio de escisión de enterocinasa (New England Biolabs), un sitio de escisión de trombina, un sitio de escisión de TEV proteasa (Life Technologies) y un sitio de escisión PreScission (Amersham Pharmacia Biotech). Se conocen numerosas otras proteasas y sus sitios de escisión. Preferentemente, la proteasa y el ligador se seleccionan de manera que la proteasa escinda el enlace, pero no el dominio de RTK de la construcción.

En otras variaciones, el ligador puede comprender un dominio de horquilla que se deriva de PDGF-C o PDGF-D. El dominio de horquilla puede separar el dominio CUB del dominio de unión a RTK de la construcción.

El ligador puede afectar tanto si el (los) polipéptido(s) al (a los) que está fusionado puede(n) dimerizarse con otro polipéptido idéntico como si puede(n) dimerizarse con otro polipéptido. Cuando el ligador comprende un péptido, la construcción es expresable como una molécula recombinante de un único polipéptido. Los ligadores pueden elegirse de forma que sea menos probable que induzcan una reacción alérgica o antigénica.

Se usa más de un ligador por molécula de construcción cuando se unen más de dos dominios distintos, tal como en construcciones que satisfacen la fórmula FN-L-RTK-L-FC en la que en FN y FC denotan una secuencia flanqueante del extremo N y del extremo C, respectivamente. El ligador puede seleccionarse para la óptima libertad (estérica) conformacional entre el factor de crecimiento (dominio de unión a RTK) y dominios flanqueantes y de unión a heparina o CUB opcionales para permitir que interactúen con componentes de unión. El ligador puede ser lineal de forma que FN y RTK estén ligados en serie, o el ligador puede servir de un andamiaje al que se unen dos o más unidades de unión a FN o RTK. Un ligador también puede tener múltiples ramas. Por ejemplo, usando ligadores desvelados en Tam, J. Immunol. Methods 196:17 (1996). FN y RTK puede unirse entre sí o al andamiaje del ligador mediante grupos amino del extremo N, grupos carboxilo del extremo C, cadenas laterales, grupos químicamente modificados, cadenas laterales, u otros medios.

Cuando comprende péptidos, el ligador puede diseñarse para tener secuencias que permitan características deseadas. Por ejemplo, el uso de residuos de glicilo permite un grado de libertad conformacional relativamente grande, mientras que una prolina tendería a tener el efecto opuesto. Los ligadores de péptidos pueden elegirse de manera que consigan estructuras secundarias y terciarias particulares, por ejemplo, hélices alfa, hojas beta y barriles beta. La estructura cuaternaria también puede utilizarse para crear ligadores que unen juntas no covalentemente dos unidades de unión. Por ejemplo, la fusión de un dominio de proteína con una cara hidrófoba a cada unidad de unión puede permitir la unión de dos unidades de unión mediante la interacción entre la interacción hidrófoba de las dos moléculas. En algunas realizaciones, el ligador puede proporcionar interacciones polares. Por ejemplo, puede usarse un dominio de cremallera de leucina de las proto-oncoproteínas Myc y Max, respectivamente. Luscher y Larsson, Ongogene 18:2955-2966 (1999). En algunas realizaciones, el ligador permite la formación de un puente de sal o enlace disulfuro. Los ligadores pueden comprender aminoácidos que se producen no naturalmente, además de aminoácidos que se producen naturalmente que no están naturalmente incorporados en un polipéptido. En algunas realizaciones, el ligador comprende un complejo de coordinación entre un ión metálico u otros iones y diversos residuos de los múltiples péptidos unidos de ese modo.

En algunas realizaciones, el ligador de péptidos lineal comprende residuos con cadenas laterales relativamente inertes. Los residuos de aminoácidos de ligadores de péptidos no necesitan ligarse enteramente o en absoluto mediante grupos alfa-carboxi y alfa-amino. Es decir, los péptidos pueden ligarse mediante grupos de cadena lateral de diversos residuos. En algunas realizaciones, un ligador se usa como se describe en Liu y col., publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0064053.

6. Variación de secuencias naturales tipo silvestre en construcciones de la invención.

En una realización preferida, las construcciones de la invención se construyen con secuencias de dominios de RTK y flanqueantes que se producen naturalmente (y, cuando se incluyen, otras secuencias que se producen naturalmente tales como secuencias de dominio de unión a heparina o secuencias de dominio CUB). En otras palabras, las secuencias de RTK o flanqueantes u otras secuencias son idénticas el 100% a secuencias humanas o de otros mamíferos o aviares. Especialmente para aplicaciones in vivo, el 100% de identidad con una secuencia natural minimiza la inmunorreactividad hacia construcciones de la invención.

Los receptores de factores de crecimiento incluyen variantes de corte y empalme y variaciones alélicas que se producen naturalmente. Las variantes alélicas son muy conocidas en la técnica y representan formas alternativas o una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, pero que no producen ninguna alteración funcional sustancial del polipéptido codificado.

En otras realizaciones, las construcciones de la invención se construyen con secuencias de RTK o flanqueantes u otras secuencias similares a, pero no idénticas a, secuencias que se producen naturalmente. Se contemplan secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 99,5% a una secuencia que se produce naturalmente. Se contemplan específicamente variantes que retienen una propiedad/actividad biológica para la que se seleccionaron. Por ejemplo, una variante de RTK deberá retener las propiedades de unión al receptor de las secuencias naturales.

Por ejemplo, en una realización, un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a una secuencia de aminoácidos del propéptido de VEGF-C del extremo N, una secuencia de aminoácidos del propéptido de VEGF-D del extremo N o un fragmento de cualquiera de los anteriores. Fragmentos útiles a modo de ejemplo como dominios flanqueantes para la práctica de la invención son fragmentos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 o más aminoácidos, hasta un residuo más pequeño que la secuencia flanqueante natural. Fragmentos preferidos incluyen fragmentos que retienen uno o más motivos estructurales de una secuencia natural y/o que potencian la misma actividad de un dominio de RTK que es potenciado por la secuencia flanqueante de longitud completa.

En otra realización, un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a una secuencia de aminoácidos del propéptido de VEGF-C del extremo C, una secuencia de aminoácidos del propéptido de VEGF-D del extremo C o un fragmento de cualquiera de las anteriores. Fragmentos útiles a modo de ejemplo como dominios flanqueantes para la práctica de la invención son fragmentos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75-80, 81-90, 91-100, 101-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200 o más aminoácidos. Los fragmentos preferidos incluyen fragmentos que retienen un motivo estructural o característico del dominio flanqueante, tal como fragmentos que incluyen uno o más dominios de homología con BR3P. Con referencia a la secuencia de aminoácidos del extremo C de VEGF-C de SEQ ID NO: 47, dominios de BR3P a modo de ejemplo incluyen aproximadamente los residuos 16-29, los residuos 53-68, los residuos 77-92, los residuos 101-116, los residuos 120-135, los residuos 142-160 y los residuos 171-180. Con referencia a la secuencia de aminoácidos del extremo C de VEGF-D de SEQ ID NO: 49, dominios de BR3P a modo de ejemplo incluyen aproximadamente los residuos 21-34, los residuos 76-92, los residuos 99-117 y los residuos 127-135.

En otra realización, un dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a una secuencia del dominio CUB de PDGF-C o PDGF-D natural, o fragmentos de la misma.

Se contemplan específicamente diferencias de aminoácidos resultantes de inserciones, deleciones y sustituciones (con respecto a una secuencia natural).

Procedimientos convencionales pueden usarse fácilmente para generar tales polipéptidos que incluyen mutagénesis dirigida a sitio de polinucleótidos, o escisión enzimática específica y ligación. Similarmente se contempla el uso de compuestos peptidomiméticos o compuestos en los que uno o más residuos de aminoácidos son sustituidos por un aminoácido que se produce no naturalmente o un análogo de aminoácidos que retienen la actividad de unión.

Preferentemente, si se usa la sustitución de aminoácidos, la sustitución es conservativa, es decir, un aminoácido es sustituido por uno de tamaño similar y con propiedades de carga similares. Como se usa en este documento, el término “sustitución conservativa” denota la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina, norleucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo similarmente cargado o polar por otro, tal como la sustitución de lisina por arginina, ácido aspártico por ácido glutámico, o asparagina por glutamina, y similares. Los aminoácidos hidrófilos neutros que pueden sustituirse por otros incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. El término “sustitución conservativa” también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido sin sustituir.

Alternativamente, los aminoácidos conservativos pueden agruparse como se describe en Lehninger, (Biochemistry, segunda edición; Worth Publishers, Inc. NY:NY, pág. 71-77 (1975)) como se explica a continuación:

No polar (hidrófobo)

A. Alifático: A, L, I, V, P,

B. Aromático: F, W,

C. Que contiene azufre: M,

D. Límite: G.

Sin carga -polar

A. Hidroxilo: S, T, Y,

B. Amidas: N, Q,

C. Sulfhidrilo: C,

D. Límite: G.

Positivamente cargado (básico): K, R, H.

Negativamente cargado (ácido): D, E.

Con referencia al dominio de unión a RTK, los análogos que retienen la actividad biológica de la unión al receptor de VEGF/PDGF se contemplan para uso en construcciones de la presente invención. En una realización preferida, los análogos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 modificaciones tales y que retienen la actividad de unión al receptor de VEGF/PDGF se contemplan para inclusión en construcciones de la presente invención. Los polinucleótidos que codifican tales análogos se generan usando PCR convencional, mutagénesis dirigida a sitio y técnicas de síntesis química. Se prefieren análogos que se unen y estimulan la fosforilación de uno o más receptores que el polipéptido de RTK natural estimula (por ejemplo, VEGFR1 y/o VEGFR-2, en el caso de VEGF-A).

B. Procedimientos de preparación de polipéptidos quiméricos de VEGF

Las construcciones de la invención o porciones de las mismas pueden sintetizarse en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales. Tales polipéptidos pueden sintetizarse como pequeños fragmentos de la construcción completa o como una secuencia completa de longitud completa. Están disponibles diversos sintetizadores automáticos y pueden usarse según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam y col., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232: 341-347, (1986); y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284, (1979), cada uno incorporado en este documento por referencia. Los polipéptidos quiméricos de VEGF de la invención pueden sintetizarse fácilmente y luego cribarse usando distintos ensayos que identifican los polipéptidos para actividad similar a VEGF-A, similar a VEGF-C, similar a VEGF-D u otra similar a PDGF u otra similar a VEGF tal como, por ejemplo, unión a VEGFR-1, VEGFR-2, o VEGFR-3, inducción de permeabilidad vascular, actividad en un ensayo de proliferación de células endoteliales, inducción del crecimiento de vasos linfáticos o sanguíneos, promoción del crecimiento y diferenciación de células progenitoras CD34+ in vitro, actividad en ensayos de CAM, y similares. Estos y otros ensayos para determinar la actividad de la actividad del factor de crecimiento endotelial vascular se describen en solicitudes de propiedad común, la publicación de patente de EE.UU. nº 2002/0151680 y WO 01/62942,

Ejemplos de tecnología en fase sólida que puede usarse en la presente invención incluyen un sintetizador de péptidos modelo 433A de Applied Biosystems, Inc. Los procedimientos de uso de tales sintetizadores en fase sólida automatizados para producir polipéptidos puros son muy conocidos.

Como alternativa a la síntesis de péptidos automatizada puede emplearse tecnología de ADN recombinante en la que una secuencia de nucleótidos que codifica una construcción de la invención que es un polipéptido quimérico o que codifica una porción de polipéptido de una construcción se inserta en un vector de expresión, se transforma o se transfecta en una célula huésped apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión. Los procedimientos recombinantes son especialmente preferidos para producir polipéptidos más largos de la invención. Las construcciones de la invención también pueden producirse por una combinación de técnicas por las que los dominios se sintetizan recombinantemente o sintéticamente en dos o más etapas y se unen juntos con un ligador.

Puede utilizarse una variedad de sistemas de vectores de expresión/huésped para contener y expresar la secuencia que codifica la construcción. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófago, plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células de animal. Las células de mamífero que son útiles en las producciones de proteínas recombinantes incluyen, pero no se limitan a, células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tales como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. Protocolos a modo de ejemplo para la expresión recombinante de los polipéptidos en bacterias, levadura y otros invertebrados se describen en este documento más adelante.

Los vectores de expresión para uso en huéspedes procariotas comprenden generalmente uno o más genes de marcadores de selección fenotípicos. Tales genes codifican generalmente, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que satisface un requisito auxotrópico. Están fácilmente disponibles una amplia variedad de tales vectores de fuentes comerciales. Ejemplos incluyen vectores pSPORT, vectores pGEM (Promega), vectores pPROEX (LTI, Bethesda, MD), vectores Bluescript (Stratagene), vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen). La secuencia de ADN que codifica un dominio de péptido o polipéptido quimérico se clona en un vector tal, por ejemplo, pGEX 3X (Pharmacia, Piscataway, NJ) diseñado para producir una proteína de fusión que comprende glutatión S transferasa (GST), codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Se espera que el tratamiento de la proteína de fusión recombinante con trombina

: o factor Xa (Pharmacia, Piscataway, NJ) escinda la proteína de fusión, liberando el polipéptido de interés de la porción de GST. La construcción de pGEX 3X/polipéptido quimérico de VEGF se transforma en células XL 1 Blue de

E.: coli (Stratagene, La Jolla CA), y se aislaron y se cultivaron transformantes individuales. El ADN de plásmido de transformantes individuales se purifica y se secuencia parcialmente usando un secuenciador automatizado para confirmar la presencia del inserto de ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido deseado en la orientación apropiada.

La inducción de la proteína de fusión de GST/sustrato se logra cultivando el cultivo de XL 1 Blue transformado a 37ºC en medio LB (complementado con carbenicilina) a una densidad óptica a la longitud de onda de 600 nm de 0,4, seguido de incubación adicional durante 4 horas en presencia de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido 0,5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

La proteína de fusión de GST, que se espera que se produzca como un cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, puede purificarse del siguiente modo. Las células se recogen por centrifugación; se lavan en NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se depura por sonicación y el residuo celular se sedimenta por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. El sedimento que contiene la proteína de fusión se resuspende en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM, se deposita en capas sobre glicerina al 50% y se centrifuga durante 30 min a 6000 X g. El sedimento se resuspende en solución salina tamponada con fosfato (PBS) patrón libre de Mg2+ y Ca2+. La proteína de fusión se purifica adicionalmente fraccionando el sedimento resuspendido en un gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante (Sambrook y col., arriba). El gel se pone en remojo en KCl 0,4 M para visualizar la proteína, que se corta y se electroeluye en tampón de electroforesis en gel que carece de SDS. Si la proteína de fusión de GST/polipéptido quimérico de VEGF se produce en bacterias como una proteína soluble, puede purificarse usando el módulo de purificación GST (Pharmacia Biotech).

La proteína de fusión puede someterse a digestión con trombina para escindir el GST del polipéptido de la construcción. La reacción de digestión (20-40 µg de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) en 0,5 ml de PBS) se incuba 16-48 h a temperatura ambiente y se carga sobre un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los productos de reacción. El gel se pone en remojo en KCl 0,4 M para visualizar las bandas de proteína. La identidad de la banda de proteína correspondiente al peso molecular esperado del polipéptido de la construcción puede confirmarse por el análisis parcial de secuencias de aminoácidos usando un secuenciador automatizado (modelo 473A de Applied Biosystems, Foster City, CA).

Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la construcción o porción del mismo puede clonarse en un plásmido que contiene un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia conductora (véase, por ejemplo, Better y col., Science, 240: 1041 43, 1988). La secuencia de esta construcción puede confirmarse por secuenciación automatizada. Entonces, el plásmido se transforma en E. coli usando procedimientos convencionales empleando incubación con CaCl2 y tratamiento por choque térmico de las bacterias (Sambrook y col., antes). Las bacterias transformadas se cultivan en medio LB complementado con carbenicilina, y la producción de la proteína expresada se induce por crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, una secuencia conductora efectuará la secreción del polipéptido de la construcción y se escindirá durante la secreción. La proteína recombinante secretada puede entonces purificarse usando técnicas convencionales de purificación de proteínas.

Similarmente, las células huésped de levadura de los géneros que incluyen Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces pueden emplearse para generar el péptido recombinantemente. Los huéspedes de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris. Los vectores de levadura frecuentemente contendrán un origen de la secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2T, una secuencia autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador de selección. También puede usarse vectores replicables en tanto levadura como E. coli (llamados vectores lanzadera). Además de las características anteriormente mencionadas de los vectores de levadura, un vector lanzadera también incluirá secuencias para la replicación y la selección en E. coli. La secreción directa de polipéptidos expresados en huéspedes de levadura puede llevarse a cabo mediante la inclusión de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia conductora del factor de levadura I en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el sustrato.

Generalmente, un polipéptido se expresa recombinantemente en levadura usando un sistema de expresión comercialmente disponible, por ejemplo, el sistema de expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia pre pro alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto es accionada por el promotor de la alcohol-oxidasa (AOX1) tras la inducción por metanol.

El polipéptido recombinante secretado se purifica a partir del medio de crecimiento de levadura por, por ejemplo, los procedimientos usados para purificar polipéptidos a partir de sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero.

Alternativamente, los polipéptidos quiméricos de la invención pueden expresarse en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para la expresión de proteínas son muy conocidos. En un sistema tal, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. La secuencia codificante de polipéptidos se clona en una región no esencial del virus, tal como el gen poliedrina, y se coloca bajo el control del promotor de poliedrina. La inserción satisfactoria inactivará el gen poliedrina y producirá virus recombinante que carece de cápside de proteína. Entonces, los virus recombinantes se usan para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el polipéptido deseado (Smith y col., J Virol 46: 584, 1983; Engelhard EK y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3224-7, 1994). Por ejemplo, el ADN que codifica un polipéptido de la invención puede clonarse en el vector de expresión de baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA; Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)). Entonces, este vector resultante se usa según las indicaciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medios libres de proteína SF9 y para producir proteína recombinante. La proteína o péptido se purifica y se concentra a partir de los medios usando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) y columnas de tamaño molecular secuencial (Amicon, Beverly, MA), y se resuspende en PBS. El análisis de SDS-PAGE muestra una única banda y confirma el tamaño de la proteína, y la secuenciación de Edman en un secuenciador de péptidos Porton 2090 confirma su secuencia del extremo N.

Los sistemas huésped de mamífero para la expresión de proteínas recombinantes también son muy conocidos. Las cepas de células huésped pueden elegirse para una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones postraducción que serán útiles en proporcionar actividad de proteína. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma “prepro” de la proteína también puede ser importante para corregir la inserción, el plegamiento y/o la función. Diferentes células huésped tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 y similares tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña introducida.

Se prefiere que las células transformadas se usen para la producción de proteínas de alto rendimiento a largo plazo y como tal se desea expresión estable. Una vez se transforman tales células con vectores que contienen marcadores de selección junto con el casete de expresión deseado, puede dejarse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a medios selectivos. El marcador de selección se diseña para conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Los grupos resistentes de células establemente transformadas pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para la célula.

Pueden usarse varios sistemas de selección para recuperar las células que han sido transformadas para la producción de proteínas recombinantes. Tales sistemas de selección incluyen, pero no se limitan a, genes HSV timidina-cinasa, hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa y adenina-fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Por tanto, puede usarse resistencia a antimetabolitos como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; als que confiere resistencia a clorsulfurón; e hygro, que confiere resistencia a higromicina. Genes de selección adicionales que pueden usarse incluyen trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan un indicación visual de la identificación de transformantes incluyen antocianinas, b-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina.

C. Purificación de proteínas.

Para muchas aplicaciones se desea purificar las construcciones, tales como los polipéptidos quiméricos de VEGF, de la presente invención. Las técnicas de purificación de proteínas son muy conocidas. Estas técnicas implican, a un nivel, el fraccionamiento bruto del medio celular en fracciones de polipéptidos y no polipéptidos. Habiendo separado el péptido o polipéptidos de la invención de otras proteínas, los polipéptidos o péptidos de interés pueden purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad).

Generalmente, “purificado” se referirá a una composición de polipéptido, proteína o péptido que ha sido sometida a fraccionamiento para eliminar diversos otros componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica. Si se usa el término “sustancialmente purificado”, esta designación se referirá a una composición en la que el polipéptido, proteína o péptido forma el componente principal de la composición, tal como constituyendo aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o más de las proteínas en la composición.

Los diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación del polipéptido, proteína o péptido serán evidentes. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción por análisis de SDS/PAGE. Un procedimiento preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial y, por tanto, calcular el grado de pureza, evaluada en este documento por un “número de purificación de -veces”. Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y de si el polipéptido, proteína o péptido expresado presenta una actividad detectable o no.

Diversas técnicas conocidas para uso en la purificación de proteínas también son adecuadas para moléculas de la presente invención. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares, o por desnaturalización por calor, seguido de centrifugación; etapa de cromatografía tal como cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, en fase inversa, de hidroxilapatita, de exclusión y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel (incluyendo electroforesis en gel de poliacrilamida); y combinaciones de tales y otras técnicas. El orden de realización de las diversas etapas de purificación puede variarse, y ciertas etapas pueden omitirse, y todavía producir un procedimiento adecuado para la preparación de un polipéptido, proteína o péptido sustancialmente purificado.

No hay requisito general de que el polipéptido, proteína o péptido siempre se proporcione en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial puede llevarse a cabo usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando formas diferentes, del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC producirá generalmente una purificación de “-veces” mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los procedimientos que presentan un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, algunas veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977). Por tanto, se apreciará que bajo condiciones de electroforesis diferentes puedan variar los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados.

En otra realización relacionada adicional, la invención proporciona un procedimiento para producir una construcción de proteína que comprende las etapas de cultivar una célula huésped de la invención en un medio nutriente y aislar el polipéptido de la construcción de la célula o el medio. El aislamiento del polipéptido de las células o del medio en el que se cultivan las células se lleva a cabo por procedimientos de purificación conocidos en la técnica, por ejemplo, procedimientos cromatográficos convencionales que incluyen cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad por receptor, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad por lectina, filtración por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), HPLC de fase inversa y similares. Todavía otros procedimientos de purificación incluyen aquellos en los que la proteína deseada se expresa y se purifica como una proteína de fusión que tiene una marca específica, etiqueta o resto quelante que es reconocido por un componente o agente de unión específica. La proteína purificada puede escindirse para dar la proteína deseada, o quedarse como una proteína de fusión intacta. La escisión del componente de fusión puede producir una forma de la proteína deseada que tiene residuos de aminoácidos adicionales como resultado del proceso de escisión.

En realizaciones preferidas, la purificación de los polipéptidos quiméricos de la presente invención puede lograrse usando purificación por afinidad usando un dominio extracelular de uno o más de la familia de PDGF/VEGF de receptores tales como VEGFR-1 (Flt1) o VEGFR-2 (KDR/flk-1), u otras porciones de un receptor a las que puedan unirse los polipéptidos quiméricos de la invención. Una purificación por afinidad a modo de ejemplo de composiciones relacionadas con VEGF se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.342.219, incorporada en este documento por referencia. En un procedimiento de purificación por afinidad a modo de ejemplo usando el dominio extracelular de VEGFR-2, la composición que va purificarse que contiene el polipéptido se concentra inicialmente 30-50 veces usando cartuchos de filtración Centriprep y se carga en una columna de dominio extracelular de VEGFR inmovilizado (EC). Se preparan dos matrices de afinidad. En el primer caso, la proteína de fusión VEGFR-EC-6xHis está reticulada con Sepharose 4B activada con CNBr (Pharmacia) y en el segundo caso la proteína de fusión VEGFR-EC-Ig se acopla a proteína A-Sepharose usando pimelidato de dimetilo (Schneider y col.,

J. Biol. Chem. 257: 10766-10769, 1982). El material eluido de la columna de afinidad se somete a más purificación usando cromatografía de intercambio iónico y a alta presión en fase inversa y electroforesis en gel de SDSpoliacrilamida. Un protocolo de purificación por afinidad usando el dominio de EC de VEGFR-3 se describe en la patente de EE.UU. nº 5.776.755.

Otro procedimiento de purificación por cromatografía por afinidad que puede usarse para purificar los polipéptidos quiméricos de la presente invención emplea cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para uno o más de los dominios de unión a RTK, un dominio flanqueante, o un dominio adicional, si está incluido, tal como un dominio de unión a heparina, marca de epítope o secuencia ligadora. Los anticuerpos para diversos factores de crecimiento VEGF y PDGF son muy conocidos y también se producen fácilmente usando técnicas convencionales. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para VEGF-A son útiles para la purificación de construcciones que incluyen el dominio de unión a RTK de VEGF-A. Además, la purificación de los polipéptidos quiméricos de la presente invención puede lograrse usando procedimientos para la purificación de VEGF-A o VEGFA que se describen en la patente de EE.UU. nº 5.332.671.

D. Ácidos nucleicos y composiciones relacionadas.

La invención engloba polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención y también polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones moderadamente restrictivas o de alta rigurosidad con la cadena no codificante completa , o complemento, de tales polinucleótidos. Las moléculas complementarias son útiles como moldes para sintetizar moléculas codificantes y para preparar polinucleótidos bicatenarios estables. Debido a la muy conocida degeneración del código genético universal, pueden sintetizarse numerosas secuencias de polinucleótidos que codifican cada polipéptido quimérico de la presente invención. Todos aquellos polinucleótidos se contemplan como parte de la invención. Tales polinucleótidos son útiles para la expresión recombinante de polipéptidos de la invención in vivo o in vitro (por ejemplo, para terapia génica). Los polinucleótidos también son útiles para la manipulación para diseñar construcciones de la invención con dominios funcionales introducidos o mutaciones o similares.

Este género de polinucleótidos engloba polinucleótidos que codifican polipéptidos con una o algunas diferencias de aminoácidos (adiciones, inserciones o deleciones) con respecto a secuencias de aminoácidos específicamente representadas en este documento. Tales cambios se introducen fácilmente realizando, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio.

Los polinucleótidos de la invención (y polipéptidos así codificados) puede definirse por moléculas que se hibridan bajo condiciones especificadas con una secuencia de polinucleótidos complementaria a una secuencia que codifica una construcción de la invención.

Condiciones de hibridación altamente restrictivas a modo de ejemplo son las siguientes: hibridación a 65ºC durante al menos 12 horas en una disolución de hibridación que comprende 5X SSPE, 5X Denhardt, SDS al 0,5% y 2 mg de ADN no homólogo sonicado por 100 ml de disolución de hibridación; lavar dos veces durante 10 minutos a temperatura ambiente en una disolución de lavado que comprende 2X SSPE y SDS al 0,1%; seguido de lavado una vez durante 15 minutos a 65ºC con 2X SSPE y SDS al 0,1%; seguido de un lavado final durante 10 minutos a 65ºC con 0,1X SSPE y SDS al 0,1%. Los lavados de rigurosidad moderada pueden lograrse lavando con 0,5X SSPE en lugar de 0,1X SSPE en el lavado de 10 minutos final a 65ºC. Los lavados de baja rigurosidad pueden lograrse usando 1X SSPE durante el lavado de 15 minutos a 65ºC, y omitiendo el lavado de 10 minutos final. Se entiende en la materia que las condiciones de rigurosidad equivalente pueden lograrse mediante la variación de la temperatura y el tampón, o la concentración de sales como se describe Ausubel y col. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pág. 6.0.3 a 6.4.10. Las modificaciones en las condiciones de hibridación pueden determinarse empíricamente o calcularse con precisión basándose en la longitud y el porcentaje del apareamiento de bases guanosina/citosina (GC) de la sonda. Las condiciones de hibridación pueden calcularse como se describe en Sambrook y col., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), pág. 9.47 a 9.51.

Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de hibridación moderadamente restrictivas o de alta rigurosidad con el complemento de cualquier secuencia de nucleótidos específica de la invención, y que codifica un polipéptido quimérico como se describe en este documento que se une al menos a uno de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular o factor de crecimiento derivado de plaquetas que se producen naturalmente.

En una realización relacionada, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o el 99% a cualquier secuencia de nucleótidos específica de la invención y que codifica un polipéptido que se une al menos a uno de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular o factor de crecimiento derivado de plaquetas que se producen naturalmente.

En una realización relacionada, la invención proporciona vectores que comprenden un polinucleótido de la invención. Tales vectores son útiles, por ejemplo, para amplificar los polinucleótidos en células huésped para crear cantidades útiles de los mismos y para expresar polipéptidos de la invención usando técnicas recombinantes. En realizaciones preferidas, el vector es un vector de expresión en el que el polinucleótido de la invención está ligado operativamente a un polinucleótido que comprende una secuencia de control de la expresión. Se contemplan específicamente construcciones de expresión recombinantes que se replican autónomamente tales como vectores de ADN de plásmido y vírico que incorporan polinucleótidos de la invención. Las secuencias de control de la expresión de ADN incluyen promotores, potenciadores y operadores y generalmente se seleccionan basándose en los sistemas de expresión en los que va a utilizarse la construcción de expresión. Las secuencias promotoras y potenciadoras preferidas se seleccionan generalmente por la capacidad para aumentar la expresión génica, mientras que las secuencias operadoras se seleccionan generalmente por la capacidad para regular la expresión génica. Los vectores de expresión son útiles para la producción recombinante de polipéptidos de la invención. Las construcciones de expresión de la invención también pueden incluir secuencias que codifican uno o más marcadores de selección que permiten la identificación de células huésped que llevan la construcción. Las construcciones de expresión también pueden incluir secuencias que facilitan, y preferentemente promueven, la recombinación homóloga en una célula huésped. Las construcciones preferidas de la invención también incluyen secuencias necesarias para la replicación en una célula huésped.

En realizaciones preferidas, los polinucleótidos de la invención comprenden además secuencias adicionales para facilitar la terapia génica. En una realización, un transgén “desnudo” que codifica un polipéptido de la invención (es decir, un transgén sin un vector vírico, liposómico u otro vector para facilitar la transfección) se emplea para terapia génica. En esta realización, el polinucleótido de la invención comprende preferentemente una secuencia promotora y/o potenciadora adecuada (por ejemplo, promotor/potenciador del citomegalovirus [Lehner y col., J. Clin. Microbiol., 29:2494 2502 (1991); Boshart y col., Cell, 41:521 530 (1985)]; promotor del virus del sarcoma de Rous [Davis y col., Hum. Gene Ther., 4:151 (1993)]; promotor de Tie [Korhonen y col., Blood, 86(5): 1828 1835 (1995)]; o promotor del virus simio 40) para la expresión en las células de mamífero diana, estando el promotor ligado operativamente aguas arriba (es decir, 5') de la secuencia codificante del polipéptido. En una realización preferida, la secuencia promotora comprende un promotor específico de la piel. Secuencias promotoras preferidas incluyen los promotores K14, K5, K6, K16 para la epidermis y el promotor del colágeno alfa 1(I) para la dermis (Diamond, I. y col., J. Invest. Dermatol., 115(5):788-794 (2000); Galera, P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(20):9372-9376 (1994); Wawersik, M. J. y col., Mol. Biol. Cell, 12(11):3439-3450 (2001)). Los polinucleótidos de la invención también incluyen preferentemente adicionalmente una secuencia de poliadenilación adecuada (por ejemplo, la secuencia de poliadenilación del gen SV40 o de la hormona de crecimiento humana) ligada operativamente aguas abajo (es decir, 3') de la secuencia codificante del polipéptido. Los polinucleótidos de la invención también comprenden preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal secretor fusionado en marco con la secuencia de polipéptidos. El péptido señal secretor dirige la secreción del polipéptido de la invención mediante las células que expresan el polinucleótido, y es escindido por la célula del polipéptido secretado. La secuencia de péptidos señal puede ser la de otra proteína secretada, o puede ser una secuencia señal completamente sintética eficaz para dirigir la secreción en células del sujeto mamífero.

El polinucleótido puede comprender adicionalmente opcionalmente secuencias cuya única función prevista es facilitar la producción a gran escala del vector, por ejemplo, en bacterias tal como un origen de replicación bacteriano y una secuencia que codifica un marcador de selección. Sin embargo, en una realización preferida, tales secuencias superfluas son separadas por escisión al menos parcialmente antes de la administración a seres humanos según procedimientos de la invención. Tales polinucleótidos pueden prepararse y administrarse para terapia génica usando procedimientos que se han descrito en la bibliografía para otros transgenes. Véase, por ejemplo, Isner y col., Circulation, 91: 2687-2692 (1995); e Isner y col., Human Gene Therapy, 7: 989-1011 (1996).

Los vectores también son útiles para pautas de tratamiento de “terapia génica”, en las que un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención se introduce en un sujeto en necesidad de tratamiento que implica la modulación (estimulación o bloqueo) de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular en una forma que haga que las células en el sujeto expresen el polipéptido de la invención in vivo. Los aspectos de la terapia génica que se describen en la publicación de patente de EE.UU. de propiedad común nº 2002/0151680 y WO 01/62942 también son aplicables en este documento.

Cualquier vector adecuado puede usarse para introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención que codifica uno de los polipéptidos de la invención en el huésped. Vectores a modo de ejemplo que se han descrito en la bibliografía incluyen vectores retrovíricos deficientes en la replicación que incluyen, pero no se limitan a, vectores de lentivirus [Kim y col., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, octubre, 1998, pág. 43 46.]; vectores víricos adeno-asociados (AAV) [patente de EE.UU. nº 5.474.935; patente de EE.UU. nº 5.139.941; patente de EE.UU. nº 5.622.856; patente de EE.UU. nº 5.658.776; patente de EE.UU. nº 5.773.289; patente de EE.UU. nº 5.789.390; patente de EE.UU. nº 5.834.441; patente de EE.UU. nº 5.863.541; patente de EE.UU. nº 5.851.521; patente de EE.UU. nº 5.252.479; Gnatenko y col., J. Invest. Med., 45: 87 98 (1997)]; vectores adenovíricos (AV) [véanse, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.792.453; patente de EE.UU. nº 5.824.544; patente de EE.UU. nº 5.707.618; patente de EE.UU. nº 5.693.509; patente de EE.UU. nº 5.670.488; patente de EE.UU. nº 5.585.362; Quantin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581 2584 (1992); Stratford Perricadet y col., J. Clin. Invest., 90: 626 630 (1992); y Rosenfeld y col., Cell, 68: 143 155 (1992)]; una quimera vírica adenoasociada adenovírica (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.856.152) o una variolovacuna vírica o un herpesvírico (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.879.934; patente de EE.UU. nº 5.849.571; patente de EE.UU. nº 5.830.727; patente de EE.UU. nº 5.661.033; patente de EE.UU. nº 5.328.688); transferencia de genes mediada por lipofectina (BRL); vectores liposómicos [véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.631.237 (liposomas que comprenden proteínas del virus Sendai)]; y combinaciones de los mismos. Los vectores adenovíricos deficientes en la replicación constituyen una realización preferida.

La terapia génica con ADN desnudo de plásmido es otro vehículo para administrar los polipéptidos quiméricos de la invención. Un ensayo actual, GENASIS (Estudio en investigación de la estimulación angiogénica genética), está siendo realizado por Corautus Genetics, Inc., para evaluar la seguridad y la eficacia de un miembro de la familia de VEGF para el tratamiento de pacientes con angina grave. El ensayo emplea según se informa dosis definidas del transgén en forma de ADN “desnudo” de plásmido, un vector de administración no vírico, administrado a tejido del músculo cardíaco enfermo mediante el sistema de catéter por inyección directa Stiletto ™ (Boston Scientific Corporation). Una vez administrado, el plásmido de ADN parece ser captado y expresado por el miocardio cercano al sitio de inyección. El ensayo clínico espera ver el crecimiento terapéutico de nuevos vasos sanguíneos.

En otra realización relacionada, la invención proporciona células huésped que incluyen células procariotas y eucariotas que se transforman o se transfectan (estable o transitoriamente) con polinucleótidos de la invención o vectores de la invención. Los polinucleótidos de la invención pueden introducirse en la célula huésped como parte de un plásmido circular, o como ADN lineal que comprende una región codificante de proteínas aislada o un vector vírico. Los procedimientos para introducir ADN en la célula huésped, que son muy conocidos y puestos rutinariamente en práctica en la materia, incluyen la transformación, transfección, electroporación, inyección nuclear

o fusión con vehículos tales como liposomas, micelas, células fantasma y protoplastos. Como se establece anteriormente, tales células huésped son útiles para amplificar los polinucleótidos y también para expresar los polipéptidos de la invención codificados por el polinucleótido. La célula huésped puede aislarse y/o purificarse. La célula huésped también puede ser una célula transformada in vivo para producir expresión transitoria o permanente del polipéptido in vivo. La célula huésped también puede ser una célula aislada transformada ex vivo e introducida después de la transformación, por ejemplo, para producir el polipéptido in vivo para fines terapéuticos. La definición de célula huésped excluye explícitamente un ser humano transgénico.

Tales células huésped son útiles en ensayos como se describen en este documento. Para la expresión de polipéptidos de la invención es aceptable cualquier célula huésped que incluye, pero no se limita a, células huésped bacterianas, de levadura, de planta, de invertebrado (por ejemplo, insecto), de vertebrados y de mamífero. Para desarrollar las preparaciones terapéuticas se prefiere la expresión en líneas de células de mamífero, especialmente líneas de células humanas. Se espera que el uso de células huésped de mamífero proporcione tales modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glicosilación, truncación, lipidación y fosforilación), ya que puede desearse conferir actividad biológica óptima a productos de expresión recombinantes de la invención. Las formas glicosiladas y no glicosiladas de los polipéptidos están englobadas por la presente invención. Similarmente, la invención engloba adicionalmente polipéptidos descritos anteriormente que han sido covalentemente modificados para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol.

Similarmente, la invención proporciona el uso de polipéptidos o polinucleótidos o células huésped de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos descritos en este documento que incluyen, pero no se limitan a, trastornos caracterizados por proliferación de células endoteliales insuficiente o no deseable y/o trastornos caracterizados por isquemia y/u oclusión de vasos, deseándose la neovascularización.

En una realización relacionada, la invención proporciona un kit que comprende un polinucleótido, polipéptido o composición de la invención envasado en un recipiente tal como un vial o frasco y que comprende además una etiqueta unida a o embalada con el recipiente describiendo la etiqueta el contenido del recipiente y proporcionando indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar uno o más estados de enfermedad como se describen en este documento.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona procedimientos de producción de polipéptidos que tienen novedosas propiedades de unión al receptor de VEGF y de estimulación, y procedimientos para producir polinucleótidos que codifican tales polipéptidos.

Como se usa en este documento, “modular el crecimiento de células endoteliales de mamífero” significa estimular tal crecimiento induciendo una señal mitogénica mediante receptores de la superficie celular de unión expresados en células endoteliales vasculares, o inhibiendo tal crecimiento. La inhibición puede ser debida al bloqueo de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular o linfático o a la formación de heterodímeros con factores de crecimiento endógenos que previenen la estimulación de receptores endógenos por los factores de crecimiento endógenos. La inhibición también puede lograrse conjugando agentes citotóxicos con polipéptidos de la invención que se unen a receptores de VEGF. Toxinas a modo de ejemplo son conocidas en la técnica y se describen en cualquier parte en este documento. Los polipéptidos de la invención conjugados con agentes citotóxicos u otros agentes que modulan el crecimiento celular se contemplan como otro aspecto de la invención. Las moléculas agonistas de la invención que estimulan el crecimiento de células endoteliales son una clase preferida de agentes. También se prefieren antagonistas que inhiben el crecimiento de células endoteliales.

E. Procedimientos de uso de construcciones tales como polipéptidos quiméricos de VEGF

En otra realización más, la invención proporciona numerosos procedimientos in vitro e in vivo de uso de los polipéptidos y polinucleótidos quiméricos de la invención. En términos generales, los polipéptidos quiméricos de la invención son útiles para modular (estimular o inhibir) procesos celulares que están mediados por cualquiera de la familia de PDGF/VEGF de receptores. Estos receptores pueden participar singularmente en ciertos procesos y en combinación, a grados variables, en otros procesos.

Por tanto, en una variación, la invención es un procedimiento de modulación de la señalización de uno o más de los receptores de VEGF. En una variación se contempla la modulación para activar la señalización (estimulación), y la célula se pone en contacto con un polipéptido de la invención que estimula la señalización del receptor en una cantidad suficiente para unirse a uno o más receptores e inducir la señalización del receptor. Preferentemente se emplea una cantidad tal que es eficaz para estimular una respuesta celular tal como una proliferación in vitro o in vivo de células endoteliales y/o reclutamiento o angiogénesis o linfangiogénesis. Los objetivos terapéuticos deseados incluyen cicatrización y mejora de la circulación en tejidos que padecen isquemia o enfermedad oclusiva.

En otra variación se contempla la modulación para inhibir la señalización. La célula se pone en contacto con un polipéptido que inhibe la activación del receptor inducida por ligando en una cantidad suficiente para inhibir la señalización que es inducida por los polipéptidos del factor de crecimiento del ligando del receptor que existen endógenamente en el entorno de la célula. En una realización relacionada, la inhibición se logra administrando una construcción de la invención que está conjugada con una citotoxina o precursor de citotoxina con el fin de detener el crecimiento de (o destruir) una célula que expresa un receptor diana.

Los estudios de dosis-respuesta permiten la determinación precisa de una cantidad apropiada de polipéptido quimérico a emplear. Cantidades eficaces pueden estimarse a partir de mediciones de la afinidad de unión de un polipéptido por un receptor diana, de la cantidad de receptor presente en células diana, del volumen de dilución esperado (por ejemplo, peso del paciente y volumen en sangre para realizaciones in vivo) y de las velocidades de eliminación del polipéptido. La bibliografía existente referente a la dosificación de ligandos de VEGFR conocidos también facilita orientación para la dosificación de moléculas de la invención.

En términos generales, las realizaciones descritas en este documento en el contexto de la administración de polipéptidos también pueden ponerse en práctica administrando polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La terapia con polinucleótidos (por ejemplo, usando vectores de terapia génica) puede producir la producción sostenida de una construcción in vivo, reduciendo o eliminando la necesidad de la dosificación repetida de polipéptidos.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, un atributo de las construcciones de la invención relevante para la eficacia terapéutica puede ser velocidades de eliminación reducidas y una mejor elección de diana en comparación con polipéptidos de ligandos de RTK naturales (VEGF/PDGF nativos).

Los polipéptidos de la invención que pueden activar VEGFR-1 y VEGFR-2 pueden usarse para promover las funciones endoteliales de la vasculatura y tejidos de la sangre tales como para tratar pérdida de vasos sanguíneos, oclusión de vasos sanguíneos y tejidos isquémicos. En una realización preferida, los polipéptidos quiméricos descritos en este documento se usan para tratar un sujeto humano al que se le ha diagnosticado una enfermedad cardiovascular.

El VEGF-A ha desempeñado una función terapéutica en diversos trastornos cardiovasculares. Se ha mostrado que la administración intraarterial o intramuscular de VEGF-A aumenta significativamente la perfusión y el desarrollo de vasos colaterales en un modelo de conejo en el que se creó isquemia crónica mediante la extirpación quirúrgica de la arteria femoral (Takeshita y col., J. Clin. Invest., 93:662-670; 1994; Takeshita y col., Circulation, 90:228-234, 1994). Estos estudios proporcionaron evidencia angiográfica de neovascularización en las extremidades isquémicas. Otros estudios han mostrado que la administración de VEGF-A también conduce a una recuperación de reactividad endotelial normal en endotelio disfuncional (Sellke y col., Am. J. Physiol., 262:H1669-1675, 1992; Bauters y col., Circulation, 91:2793-2801, 1995). Isner y col. (Hum. Gene Ther., 7:859-888, 1996) probaron la hipótesis de que el tratamiento con VEGF-A produce angiogénesis terapéuticamente significativa en un ensayo de terapia génica en pacientes con isquemia grave de extremidades. Las transferencia de genes arteriales de ADN desnudo de plásmido que codifica VEGF-A aplicada al recubrimiento polimérico de hidrogel de un balón de angioplastia produjo una evidencia angiográfica e histológica en la rodilla, parte central de la tibia y el tobillo. Bauters y col. (Am. J. Physiol., 267:H1263-1271, 1994) han mostrado que tanto la velocidad de flujo máxima como la circulación sanguínea máxima aumentan significativamente en extremidades isquémicas después de la administración de VEGF-A. También se ha demostrado que después de la administración de VEGF-A se produjo un aumento de la circulación sanguínea en un modelo de perro de insuficiencia coronaria (Banai y col., Circulation, 89:2189-2189, 1994). Estas observaciones proporcionan una indicación de que los polinucleótidos o polipéptidos según la invención pueden usarse para tratar o prevenir diversos trastornos cardiovasculares mediante angiogénesis terapéutica.

Los polipéptidos de la invención que pueden activar VEGFR-3 pueden usarse para promover las funciones endoteliales de vasos y tejidos linfáticos tales como para tratar la pérdida de vasos linfáticos, oclusiones de vasos linfáticos, linfangiomas y linfedemas idiopáticos primarios que incluyen enfermedad de Milroy y linfedema precoz, además de linfedemas secundarios que incluyen aquellos resultantes de la extirpación de ganglios y vasos linfáticos, radioterapia y cirugía en el tratamiento de cáncer, traumatismo e infección.

Los polinucleótidos o polipéptidos de la invención pueden administrarse puramente como un tratamiento profiláctico para prevenir linfedema en sujetos en riesgo de desarrollar linfedema o como un tratamiento terapéutico para sujetos aquejados de linfedema con el fin de mejorar sus síntomas (por ejemplo, hinchazón debida a la acumulación de linfa).

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención que activan VEGFR-3 también pueden usarse para promover el recrecimiento o la permeabilidad de vasos linfáticos en pacientes cuyos vasos linfáticos auxiliares se extirparon durante intervenciones quirúrgicas en el tratamiento de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama). Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden usarse para tratar la vascularización en, por ejemplo, pacientes con trasplante de órganos. Una composición que contiene el (los) polipéptido(s) o polinucleótido(s) de la invención puede administrarse directamente al segmento de vaso aislado antes de ser injertado in vivo para minimizar el rechazo del material trasplantado y para estimular la vascularización de los materiales trasplantados.

Los polipéptidos de la invención que activan la actividad del receptor de VEGF pueden usarse para tratar heridas, incisiones quirúrgicas, llagas y otras indicaciones en las que se espera razonablemente que se promueva la curación si el proceso de neovascularización puede inducirse y/o acelerarse. En ciertas realizaciones, tales polipéptidos pueden usarse para mejorar la curación de colgajos de piel o injertos de piel tras la cirugía como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. copresentada de propiedad común nº 10/868.549 presentada el 14 de junio de 2004 y la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/019197 presentada el 14 de junio de 2004.

Además, se ha observado la expresión de receptores para factores de crecimiento endoteliales vasculares en ciertas células progenitoras tales como células progenitoras hematopoyéticas y/o endoteliales, y se ha observado que VEGF-C tiene actividad mielopoyética. Estas observaciones proporcionan una indicación de que los polinucleótidos

o polipéptidos según la invención pueden usarse para tratar o prevenir la inflamación, infección o trastornos inmunitarios mediante la modulación de la proliferación, diferenciación y maduración, o migración de células inmunitarias o células hematopoyéticas. Los polinucleótidos o polipéptidos según la invención también puede ser útiles para promover o inhibir el tráfico de leucocitos entre tejidos y vasos linfáticos y la migración dentro y fuera del timo. Véase la publicación de patente internacional nº WO 98/33917.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden usarse para estimular la mielopoyesis (especialmente el crecimiento de granulocitos neutrófilos) o inhibirla. Véase la publicación de patente internacional nº WO 98/33917. Por tanto, la invención incluye un procedimiento para modular la mielopoyesis en un sujeto mamífero que comprende administrar a un sujeto mamífero en necesidad de modulación de la mielopoyesis una cantidad de un polipéptido de la invención que es eficaz para modular mielopoyesis. En una realización se selecciona un sujeto mamífero que padece granulocitopenia, y el procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad de un polipéptido eficaz para estimular mielopoyesis. En particular, un polipéptido de la invención se administra en una cantidad eficaz para aumentar el número de neutrófilos en sangre del sujeto.

En una realización relacionada, la invención incluye un procedimiento de aumentar el número de neutrófilos en la sangre de un sujeto mamífero que comprende la etapa de expresar en una célula en un sujeto en necesidad de un aumento del número de neutrófilos en sangre un ADN que codifica un polinucleótido de la invención que puede activar la señalización mediante receptores de VEGF, el ADN ligado operativamente a un promotor u otra secuencia de control que promueva la expresión del ADN en la célula. Similarmente, la invención incluye un procedimiento de modulación del crecimiento de granulocitos neutrófilos in vitro o in vivo que comprende la etapa de poner en contacto citoblastos de mamífero con un polipéptido de la invención en una cantidad eficaz para modular el crecimiento de células endoteliales de mamífero.

La invención también incluye un procedimiento para modular el crecimiento de células progenitoras CD34+ de mamífero (especialmente células progenitoras hematopoyéticas y células progenitoras endoteliales, más preferentemente células CD34+IVEGFR-2+ y CD34+/VEGFR-3+, todavía más preferentemente CD133+/VEGFR2+ y CD133+/VEGFR3+) in vitro o in vivo que comprende la etapa de poner en contacto células progenitoras CD34+ de mamífero con un polipéptido de la invención en una cantidad eficaz para modular el crecimiento y/o la diferenciación de tales células (Peichev y col., Blood, 95:952-958; 2000; Salven y col., Blood, 168-172, 2003). Para procedimientos in vitro se contemplan específicamente células progenitoras CD34+ aisladas de sangre del cordón umbilical o médula ósea. También se contempla el aislamiento posterior de subfracciones de CD133+/VEGFR2+ y CD133+ VEGFR-3+. Los procedimientos in vitro e in vivo de la invención para estimular el crecimiento de células precursoras CD34+ también incluyen procedimientos en los que se emplean polipéptidos de la invención junto (simultáneamente o secuencialmente) con otros factores de polipéptido con el fin de modular la hematopoyesis/mielopoyesis o proliferación de células endoteliales. Tales otros factores incluyen, pero no se limitan a, factores estimulantes de colonias “CSF”, por ejemplo, CSF de granulocitos (G-CSF), CSF de macrófagos (M-CSF) y CSF de granulocitosmacrófagos (GM-CSF)), interleucina 3 (IL-3, también llamado factor estimulante de múltiples colonias), otras interleucinas, factor de citoblasto (SCF), otros factores de polipéptido, y sus análogos que se han descrito y se conocen en la técnica. Véanse generalmente The Cytokine Handbook, segunda ed., Angus Thomson (editor), Academic Press (1996); Callard y Gearing, The Cytokine FactsBook, Academic Press Inc. (1994); y Cowling y Dexter, TIBTECH, 10(10):349-357 (1992). El uso de un polipéptido de la invención como célula progenitora o factor o cofactor mielopoyético del crecimiento celular con uno o más de los anteriores factores puede potenciar efectos mielopoyéticos que no podían obtenerse previamente y/o potenciar efectos mielopoyéticos que podían obtenerse previamente a la vez que se usa menos de los factores anteriores que serían necesarios en ausencia de un polipéptido de la invención.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención también pueden usarse en el tratamiento de trastornos pulmonares para mejorar la circulación de la sangre en el pulmón y/o el intercambio gaseoso entre los pulmones y la circulación sanguínea; para mejorar la circulación de la sangre al corazón y la permeabilidad del gas O2 en casos de insuficiencia cardíaca; para mejorar la circulación sanguínea y el intercambio gaseoso en enfermedad crónica obstructiva de las vías respiratorias; y para tratar afecciones tales como insuficiencia cardiaca congestiva que implica acumulaciones de fluido en, por ejemplo, el pulmón resultante del aumento en la permeabilidad vascular, ejerciendo un efecto de compensación sobre la permeabilidad vascular con el fin de contrarrestar la acumulación de fluido.

Los polipéptidos de la invención que se unen, pero que no estimulan la señalización mediante uno o más de los receptores de VEGF, pueden usarse para tratar inflamación crónica producida por el aumento de la permeabilidad vascular, retinopatía asociada a diabetes, artritis reumatoide y psoriasis. Los polinucleótidos o polipéptidos según la invención que pueden inhibir la función de uno o más receptores de VEGF también pueden usarse para tratar edema, enfermedad arterial periférica, sarcoma de Kaposi o desarrollo retiniano anormal en recién nacidos prematuros.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para modular el crecimiento de células endoteliales en un sujeto mamífero que comprende las etapas de exponer células endoteliales de mamífero a un polipéptido según la invención en una cantidad eficaz para modular el crecimiento de las células endoteliales de mamífero. En una realización, la modulación del crecimiento se afecta usando un polipéptido que puede estimular la fosforilación de tirosina de receptores de VEGF en una célula huésped que expresa los receptores de VEGF. En la modulación del crecimiento de células endoteliales, la invención contempla la modulación de trastornos relacionados con células endoteliales. En una realización preferida, el sujeto, y las células endoteliales, son humanos. Las células endoteliales pueden proporcionarse in vitro o in vivo y pueden estar contenidas en un injerto de tejido. Una cantidad eficaz de un polipéptido es una cantidad necesaria para lograr un cambio reproducible en la tasa de crecimiento celular (como se determina por visualización microscópica o macroscópica y estimación del tiempo de duplicación de células, o ensayos de síntesis de ácidos nucleicos).

Como la angiogénesis y la neovascularización son esenciales para el crecimiento tumoral, la inhibición de la actividad angiogénica puede prevenir adicionalmente el crecimiento e incluso conducir a una regresión de tumores sólidos. Asimismo, la inhibición de la linfangiogénesis puede jugar un papel decisivo en la prevención de metástasis. Véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 02/060950 y WO 00/21560. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, cuando están conjugados con un agente citotóxico, pueden usarse para tratar neoplasias que incluyen sarcomas, melanomas, carcinomas y gliomas inhibiendo la angiogénesis tumoral.

Por tanto, se contempla que pueda tratarse una amplia variedad de cánceres usando los péptidos de la presente invención que incluyen cánceres de cerebro (glioblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, ependimomas), pulmón, hígado, bazo, riñón, ganglio linfático, páncreas, intestino delgado, glóbulos sanguíneos, colon, estómago, mama, endometrio, próstata, testículo, ovario, piel, cabeza y cuello, esófago, médula ósea, sangre u otro tejido.

En muchos contextos no es necesario que la célula tumoral sea destruida o inducida para que experimente una muerte celular normal o “apoptosis.” Más bien, para realizar un tratamiento significativo, todo lo que se requiere es que el crecimiento tumoral se ralentice a un cierto grado o se localice en un área específica y se inhiba la diseminación a sitios dispares. Sin embargo, puede ser que el crecimiento tumoral sea completamente bloqueado, o que se logre algo de regresión tumoral. Terminología clínica como “remisión” y “reducción de la carga tumoral” también se contemplan dado su uso normal. En el contexto de la presente invención el efecto terapéutico puede resultar de una inhibición de la angiogénesis y/o una inhibición de la linfangiogénesis.

VEGF-C y VEGF-D de la familia de VEGF de factores de crecimiento tienen utilidad para prevenir estenosis o reestenosis de vasos sanguíneos. Véase la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/24054 (documento WO 00/24412), “Uso de gen o proteína de VEGF-C o VEGF-D para prevenir reestenosis”, presentada el 26 de octubre de 1999. Como se trata ahí, el VEGF-A también se ha probado para inhibir reestenosis. El VEGF-A acelera la reendoteliazación y se ha encontrado que atenúa la hiperplasia de la íntima en arteria carótida de rata o arteria de conejo lesionada por balón (Asahara y col., Circulation, 92:2802-2809, 1995; Callow y col., Growth Factors, 10:223228, 1994). Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también tendrán utilidad para estas indicaciones y pueden sustituir (o usarse junto con) VEGF-C y VEGF-D con respecto a los materiales y procedimientos descritos en su interior. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar un sujeto mamífero para prevenir estenosis o reestenosis de un vaso sanguíneo que comprende la etapa de administrar a un sujeto mamífero en necesidad de tratamiento para prevenir estenosis o reestenosis de un vaso sanguíneo una composición que comprende uno o más polipéptido(s) o polinucleótido(s) de la invención en una cantidad eficaz para prevenir estenosis o reestenosis del vaso sanguíneo. En una realización preferida, la administración comprende implantar una prótesis intravascular en el sujeto mamífero, en la que la prótesis está recubierta o impregnada con la composición. Materiales a modo de ejemplo para construir una prótesis recubierta de fármaco o impregnada de fármaco se describen en bibliografía citada anteriormente y revisada en Lincoff y col., Circulation, 90: 2070-2084 (1994). En otra realización preferida, la composición comprende micropartículas compuestas por polímeros biodegradables tales como PGLA, polímeros no degradables o polímeros biológicos (por ejemplo, almidón) cuyas partículas encapsulan o están impregnadas de un polipéptido(s) de la invención. Tales partículas se administran a la pared intravascular usando, por ejemplo, un catéter de angioplastia para infusión. Otras técnicas para lograr la administración de fármaco localmente sostenida se revisan en Wilensky y col., Trends Cardiovasc. Med., 3:163-170 (1993). Tales materiales y dispositivos son por sí mismos aspectos de la invención.

También se contempla la administración mediante una o más inyecciones intravenosas simultáneas a o posteriores a la angioplastia o procedimiento de derivación. La localización de los polipéptidos de la invención en el sitio del procedimiento se produce debido a la expresión de receptores de VEGF en células endoteliales proliferantes. La localización se facilita adicionalmente expresando recombinantemente los polipéptidos de la invención como un polipéptido de fusión (por ejemplo, fusionado con un oligopéptido de apolipoproteína B-100 como se describe en Shih y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87:1436-1440 (1990). También se contempla la coadministración de polinucleótidos y polipéptidos de la invención.

Asimismo, la invención también proporciona dispositivos quirúrgicos que se usan para tratar trastornos circulatorios tales como prótesis intravasculares o endovasculares (patentes de EE.UU. nº 6.846.323 y 4.580.568), catéteres con balón (patente de EE.UU. nº 6.238.401), catéteres de infusión-perfusión (patente de EE.UU. nº 5.713.860), collares extravasculares (publicaciones de patente internacional WO 98/20027 y WO 99/55315), membranas elastoméricas y similares que se han mejorado recubriendo con, impregnando con, adhiriendo a o encapsulando dentro del dispositivo una composición que comprende un polinucleótido de polipéptido de la invención.

Los polinucleótidos o polipéptidos de la invención pueden administrarse puramente como un tratamiento profiláctico para prevenir estenosis, o poco antes, y/o simultáneamente a, y/o poco después de un procedimiento de angioplastia coronaria transluminal percutánea, con el fin de prevenir reestenosis del vaso objeto. En otra realización preferida, el polinucleótido o polipéptido se administra antes, durante y/o poco después de un procedimiento de derivación (por ejemplo, un procedimiento de derivación coronaria) para prevenir estenosis o reestenosis en o próxima al vaso trasplantado (injertado), especialmente estenosis en la localización del propio injerto. En otra realización más, el polinucleótido o polipéptido se administra antes, durante, o después de un trasplante vascular en la periferia vascular que se ha realizado para tratar isquemia periférica o claudicación intermitente. Por prevención de estenosis o reestenosis se indica tratamiento profiláctico para reducir la cantidad/gravedad de, y/o eliminar sustancialmente, la estenosis o reestenosis que frecuentemente se produce en tales procedimientos quirúrgicos. El polinucleótido o polipéptido se incluye en la composición en una cantidad y en una forma eficaz para promover la estimulación de receptores de VEGF en un vaso sanguíneo del sujeto mamífero, previniéndose así la estenosis o reestenosis del vaso sanguíneo.

En una realización preferida, el sujeto mamífero es un sujeto humano. Por ejemplo, el sujeto es una persona que padece enfermedad de las arterias coronarias que ha sido identificada por un cardiólogo como candidato que podría beneficiarse de un procedimiento de angioplastia por balón terapéutico (con o sin inserción de una prótesis intravascular) o de un procedimiento de derivación coronaria. También se contempla la práctica de los procedimientos de la invención en otros sujeto mamíferos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en seres humanos (por ejemplo, animales primates, porcinos, caninos o conejos).

Los polipéptidos de la invención pueden usarse para modular el crecimiento de células aisladas o líneas celulares. Por ejemplo, ciertos estados de enfermedad neoplásica se caracterizan por la aparición de receptores de VEGF sobre las superficies celulares [Valtola y col., Am J Path 154:1381-90 (1999)]. Los polipéptidos de la invención pueden cribarse para determinar la capacidad del polipéptido para modular el crecimiento de las células neoplásicas. Otros estados de enfermedad se caracterizan probablemente por mutaciones en receptores de VEGF [Ferrell y col., Hum Mol Genetics 7:2073-78 (1998)]. Los polipéptidos de la invención que modulan la actividad de las formas mutantes del receptor de VEGF de un modo diferente al de los factores de crecimiento endoteliales vasculares que se producen naturalmente serán útiles en la modulación de los síntomas y la gravedad de tales estados de enfermedad.

Los polipéptidos de la invención pueden usarse para modular el crecimiento de citoblastos, células progenitoras para diversos tejidos y cepas aisladas de células primarias que expresan el receptor para los polipéptidos.

Como se indica en este documento anteriormente y se trata adicionalmente en la solicitud de patente de EE.UU. nº 10/669.176 presentada el 23 de septiembre de 2003, las composiciones de VEGF-C son útiles en el tratamiento de trastornos neurológicos. Las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento de tales trastornos tanto solas como conjuntamente con agentes terapéuticos adicionales tales como un factor de crecimiento neural. Factores de crecimiento neural a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, interferón gamma, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), neurogenina, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), hormona tiroidea, proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor inhibidor de leucemia (LIF), sonic hedgehog y factor neurotrófico derivado de la línea de células de la glía (GDNF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucinas, interferones, factor de citoblasto (SCF), activinas, inhibinas, quimiocinas, ácido retinoico y factor neurotrófico ciliar (CNTF). En un aspecto, la invención contempla una composición que comprende un ligando de VEGFR-3 de unión a heparina de la invención y un factor de crecimiento neural en un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, o polinucleótidos que comprenden al mismo.

Diversas células neurales expresan uno o más de los receptores de VEGF (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2 y neuropilina 1) y, por tanto, pueden responder directamente al VEGF-A liberado por células neurales vecinas (Oosthuyse y col., Nat. Genet., 28:131-138, 2001; Sondell y col., J. Neurosci., 19-5731-5740, 1999; Sondell y col., Neuroreport, 12:105-108, 2001). Por ejemplo, VEGF-A estimula la excrecencia axonal en cultivos de explante de ganglios retinianos o de la raíz cervical o dorsal superior. Además, en condiciones de estrés hipóxico, excitotóxico u oxidativo, el VEGF-A aumenta la supervivencia de neuronas hipocámpicas, corticales, de los gránulos cerebelosos, dopaminérgicas, autonómicas y sensoriales. El VEGF-A también estimula el crecimiento y la supervivencia de células de Schwann en condiciones hipóxicas y aumenta la proliferación y la migración de astrocitos y células de la microglía (Plataman y col., Neuroscience, 90:1529-1541, 1999; Krum y col., Neuroscience, 110:589-604, 2002; y Forstreuter y col., J. Neuroimmunol., 132:93-98, 2002). Estas observaciones proporcionan una indicación para el uso de los polinucleótidos o polipéptidos según la invención para tratar o prevenir o ralentizar la progresión de trastornos neurodegenerativos.

Los procedimientos de la invención se realizan preferentemente en el sujeto que tiene una enfermedad o afección caracterizada por crecimiento aberrante de células neuronales, cicatrización y lesión neuronal o degeneración neural. Una enfermedad o trastorno médico se considera que es una lesión nerviosa si se compromete la supervivencia o la función de las células nerviosas y/o sus procesos axonales. Tal lesión nerviosa se produce como resultado de condiciones que incluyen: lesión física que produce la degeneración de los procesos axonales y/o cuerpos de células nerviosas próximos al sitio de la lesión; isquemia como un accidente cerebrovascular; exposición a neurotoxinas tales como los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer y el SIDA tales como cisplatino y didesoxicitidina (ddC), respectivamente; enfermedades metabólicas crónicas tales como diabetes o disfunción renal; y enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y esclerosis lateral amiotrófica (ELA) que producen la degeneración de poblaciones neuronales específicas. Las afecciones que implican lesión nerviosa incluyen enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, accidente cerebrovascular, polineuropatía diabética, neuropatía tóxica, cicatrización de la glía y lesión física al sistema nervioso tal como la producida por lesión física del cerebro y médula espinal o lesiones por choque o corte al brazo y la mano u otras partes del cuerpo que incluyen cese temporal o permanente de la circulación sanguínea a partes del sistema nervioso, como en accidente cerebrovascular.

En una realización, la enfermedad o afección que está tratándose es un trastorno neurodegenerativo en el que el trastorno neurodegenerativo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de las neuronas motoras, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia y parálisis cerebral. En otra realización, la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en traumatismo neural o lesión neural. Los procedimientos de la invención también pueden realizarse para tratar o mejorar los efectos del traumatismo o la lesión neural tales como lesión relacionada con accidente cerebrovascular, lesión de la médula espinal, lesión posoperatoria, isquemia cerebral y otros traumatismos.

La invención puede usarse para tratar una o más consecuencias adversas de la lesión del sistema nervioso central que se producen a partir de una variedad de afecciones. Trombo, émbolo e hipotensión sistémica están entre las causas más comunes de accidente cerebrovascular. Otras lesiones pueden producirse por hipertensión, enfermedad vascular cerebral hipertensiva, rotura de una aneurisma, un angioma, discrasia sanguínea, insuficiencia cardiaca, parada cardíaca, choque cardiogénico, insuficiencia renal, choque séptico, traumatismo craneal, traumatismo de la médula espinal, convulsión, hemorragia de un tumor u otra pérdida de volumen o presión de sangre. Estas lesiones conducen a un trastorno de la función fisiológica, posterior muerte de neuronas y necrosis (infarto) de las áreas afectadas. El término “accidente cerebrovascular” connota las deficiencias neurológicas repentinas y dramáticas resultantes asociadas a cualquiera de las lesiones anteriores.

Los términos “isquemia” o “episodio isquémico”, como se usan en este documento, significan cualquier circunstancia que produzca un aporte deficiente de sangre a un tejido. Por tanto, un episodio isquémico del sistema nervioso central resulta de una insuficiencia o interrupción en el suministro de sangre a cualquier sitio del cerebro tal como, pero no se limita a, un sitio del cerebro, cerebelo o tronco encefálico. La médula espinal, que también es una parte del sistema nervioso central, es igualmente susceptible a isquemia resultante de la disminución de circulación sanguínea. Un episodio isquémico puede producirse por una constricción u obstrucción de un vaso sanguíneo, como se produce en el caso de un trombo o émbolo. Alternativamente, el episodio isquémico puede resultar de cualquier forma de función cardíaca alterada que incluye parada cardíaca, como se ha descrito anteriormente. Si la deficiencia es suficientemente grave y prolongada puede conducir a la interrupción de la función fisiológica, posterior muerte de neuronas y necrosis (infarto) de las áreas afectadas. El grado y el tipo de anomalía neurológica resultante de la lesión dependen de la localización y el tamaño del infarto o el foco de isquemia. Si la isquemia está asociada a un accidente cerebrovascular, puede ser de un grado tanto global como focal.

Los polipéptidos y las composiciones de polinucleótidos de la invención también serán útiles para tratar lesiones traumáticas al sistema nervioso central que se producen por fuerzas mecánicas tales como un golpe en la cabeza. El traumatismo puede implicar una agresión del tejido seleccionada de abrasión, incisión, contusión, punción, compresión, etc., tal como puede producirse a partir el contacto traumático de un objeto extraño con cualquier sitio de o complementario a la cabeza, cuello o columna vertebral del mamífero. Otras formas de lesión traumática pueden producirse a partir de la constricción o compresión del tejido del SNC del mamífero por una acumulación inapropiada de fluido (por ejemplo, un bloqueo o disfunción de la producción normal de líquido cefalorraquídeo o fluido del humor vítreo, recambio o regulación del volumen, o un hematoma o edema subdural o intracraneal). Similarmente, la constricción o compresión traumática puede producirse a partir de la presencia de una masa de tejido anormal tal como un tumor metastásico o primario.

Se contempla adicionalmente que los procedimientos de la invención dirigidos a indicaciones neurológicas pueden ponerse en práctica coadministrando un polipéptido quimérico de la presente invención con un agente neuroterapéutico. Por “agente neuroterapéutico” se indica un agente usado en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o para tratar traumatismo neural y lesión neural. Agentes neuroterapéuticos a modo de ejemplo incluyen inhibidores de tacrina (Cognex), donepezilo (Aricept), rivastigmina (Exelon), galantamina (Reminil) y colinesterasa y fármacos antiinflamatorios que son útiles en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, además de otras enfermedades neurodegenerativas.

Agentes neuroterapéuticos adicionales incluyen anticolinérgicos, agonistas de la dopamina, catecol-O-metiltransferasas (COMT), amantadina (Symmetrel), Sinemet®, selegilina, carbidopa, ropinirol (Requip), coenzima Q10, pramipexol (Mirapex) y levodopa (L-dopa), que son útiles en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, además de otras enfermedades neurodegenerativas. Otros agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos neurológicos serán conocidos para aquellos expertos en la materia y pueden ser útiles en las terapias de combinación contempladas en este documento.

F. Receptores de VEGF/PDGF y ensayos de unión a receptor

Las abundantes pruebas demuestran que la familia de VEGF/PDGF de factores de crecimiento ejerce sus actividades de factor de crecimiento, maduración celular, migración de células y otras actividades mediante la unión y estimulación de la fosforilación de receptores tirosina-cinasas (RTK) de la superficie celular (las pruebas indican que un dímero de polipéptido del factor de crecimiento se une a y estimula un dímero de receptor). Las construcciones de la invención que se unen a y estimulan la fosforilación de RTK son útiles como agonistas de los RTK. Por otra parte, las construcciones que se unen a, pero dejan de estimular, son útiles como agonistas de la actividad de factores de crecimiento VEGF/PDGF endógenos. Las propiedades de unión a RTK de factores de crecimiento nativos se describen más adelante.

Se han identificado al menos siete receptores de la superficie celular que interactúan con los miembros de la familia de PDGF/VEGF descritos anteriormente. Éstos incluyen PDGFR-α [véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank NM006206; Swiss Prot No. P16234], PDGF-β [véase, por ejemplo, nº de acceso de GenBank NM002609; Swiss Prot. No. P09619], VEGFR-1/Flt-1 (tirosina cinasa 1 similar a fms) [nº de acceso de GenBank X51602; De Vries y col., Science 255:989-991 (1992)]; VEGFR-2/KDR/Flk-1 (dominio de inserto de cinasa que contiene receptor/cinasa 1 de hígado fetal) [nº de registro de GenBank X59397 (Flk-1) y L04947 (KDR); Terman y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-1586 (1992); Matthews y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030 (1991)]; VEGFR3/Flt4 (tirosina cinasa 4 similar a fms; algunas veces citada en este documento como “R-3”) [la patente de EE.UU. nº

5.776.755 y nº de acceso de GenBank X68203 y S66407; Pajusola y col., Oncogene 9:3545-3555 (1994)], neuropilina 1 [nº de acceso de Gen Bank NM003873] y neuropilina 2 [nº de acceso de Gen Bank NM003872; SwissProt O60462]. Los receptores alfa y beta de PDGF median en la señalización de PDGF.

VEGF121, VEGF165, VEGF-B, P1GF-1 y P1GF-2 se unen a VEGF-R1; VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF-C (maduro completamente procesado), VEGF-D (maduro completamente procesado), VEGF-E y NZ2 VEGF se unen a VEGFR-2; VEGF-C y VEGF-D se unen a VEGFR-3; VEGF165, VEGF-C, P1GF-2 y NZ2 VEGF se unen a neuropilina 1; y VEGF165 y VEGF-C se unen a neuropilina 2 [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999); Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11 (1999); Ortega y col., Fron. Biosci. 4:141-152 (1999); Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998); Petrova y col., Exp. Cell. Res. 253:117-130 (1999); publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 20030113324]. PDGF-A, PDGF-B y PDGF-C se unen a PDGFR-α. PDGF-B y PDGF-D se unen a PDGFR-β.

La expresión de VEGFR-1 se produce principalmente en células endoteliales vasculares, aunque algunas pueden estar presentes en monocitos, células de trofoblasto y células mesangiales renales [Neufeld y col., FASEB. J. 13:922 (1999)]. También se detectan altos niveles de ARNm de VEGFR-1 en órganos adultos, sugiriendo que VEGFR-1 tiene una función en el endotelio inactivo de vasos maduros no relacionados con el crecimiento celular. Ratones VEGFR-1-/-mueren en el útero entre el día 8,5 y 9,5. Aunque las células endoteliales se desarrollaron en estos animales, la formación de vasos sanguíneos funcionales estuvo gravemente alterada, sugiriendo que VEGFR-1 puede participar en las interacciones célula-célula o célula-matriz asociadas a la migración de células. Se ha demostrado que los ratones que expresan un VEGFR-1 mutado, en el que sólo faltaba el dominio de tirosina cinasa, muestran angiogénesis y supervivencia normales, sugiriendo que la capacidad de señalización de VEGFR-1 no es

esencial. [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999); Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)].

La expresión de VEGFR-2 es similar a la de VEGFR-1 porque se expresa ampliamente en el endotelio vascular, pero también está presente en citoblastos hematopoyéticos, megacariocitos y células progenitoras retinianas [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999)]. Aunque el patrón de expresión de VEGFR-1 y VEGFR-2 se solapan ampliamente, las pruebas sugieren que en la mayoría de los tipos de células VEGFR-2 es el principal receptor mediante el cual la mayoría de los VEGF ejercen sus actividades biológicas. El examen de embriones de ratón deficientes en VEGFR-2 indica adicionalmente que este receptor se requiere para tanto la diferenciación de células endoteliales como el desarrollo de células hematopoyéticas [Joukov y col., J. Cell. Physiol. 173:211-215 (1997)].

VEGFR-3 se expresa ampliamente en células endoteliales durante la embriogénesis temprana. Durante etapas posteriores del desarrollo, la expresión de VEGFR-3 se restringe al desarrollo de vasos linfáticos [Kaipainen, A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3566-70 (1995)]. En adultos, los endotelios linfáticos y algunas vénulas de endotelio alto expresan VEGFR-3, y el aumento de la expresión se produce en senos linfáticos en ganglios linfáticos metastásicos y en linfangioma. VEGFR-3 también se expresa en un subconjunto de células hematopoyéticas CD34+ que pueden mediar en la actividad mielopoyética de VEGF-C demostrada por estudios de expresión en exceso [documento WO 98/33917]. El trastorno elegido como diana del gen VEGFR-3 en embriones de ratón conduce a fallo de la remodelación de la red vascular primaria, y muerte después del día embrionario 9,5 [Dumont y col., Science 2,82:946-49 (1998)]. Estos estudios sugieren una función esencial para VEGFR-3 en el desarrollo de la vasculatura embrionaria, y también durante la linfangiogénesis.

La neuropilina 1 se clonó originariamente como un receptor para la familia de colapsina/semaforina de proteínas que participan en la orientación de axones [Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11 (1999)]. Se expresa tanto en endotelios como en conjuntos específicos de neuronas durante la embriogénesis, y se cree que participa en la coordinación del sistema neuronal y vascular en desarrollo. Aunque la activación de neuropilina 1 no parece provocar respuestas biológicas en ausencia de los receptores tirosina-cinasa de la familia de VEGF, su presencia en células conduce a una unión más eficiente de respuestas mediadas por VEGF165 y VEGFR-2 [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999)] Los ratones que carecen de neuropilina 1 muestran anomalías en el sistema cardiovascular embrionario en desarrollo [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999)]

La neuropilina 2 se identificó clonando por expresión y es un receptor de colapsina/semaforina estrechamente relacionado con la neuropilina 1. La neuropilina 2 es un receptor de VEGF específico de isoforma porque sólo se une a VEGF165. Al igual que la neuropilina 1, la neuropilina 2 se expresa tanto en endotelios como en neuronas específicas, y no se predice que funcione independientemente debido a su dominio intracelular relativamente corto. La función de la neuropilina 2 en el desarrollo vascular es desconocida [Neufeld y col., FASEB. J. 13:9-22 (1999); documento WO 99/30157]. La NP-2 se expresa principalmente en el sistema linfático y también se expresa a bajos niveles en las venas (Karpanen y col., FASEB J., 20:1462-1472 (2006).

PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D se unen a y activan, con distinta selectividad, complejos diméricos de los receptores tirosina cinasas PDGFR-α y PDGFR-β [Heldin, C.H. & Westermark, B. Physiol Rev 79, 1283-1316 (1999)]. Se ha informado que la expresión de PDGFR-α en células endoteliales vasculares cardíacas participa en la comunicación local entre distintas células en el corazón [Edelberg y col., J. Clinical Inves. 102:837-43 (1998)]. Los PDGF regulan la proliferación celular, supervivencia celular y quimiotaxia de muchos tipos de células in vitro (revisado en [Heldin y col., Biochimica et Biophysica Acta 1378:F79-113 (1998); Carmeliet P y col. Nature 380, 435-9 (1996); Hellström. M. y col. J Cell Biol 153, 543-53. (2001).] PDGF-A y PDGF-B pueden homodimerizarse o heterodimerizarse para producir tres isoformas diferentes: PDGF-AA, PDGF-AB o PDGF-BB. PDGF-A sólo puede unirse al receptor de PDGF-α (PDGFR-α que incluye homodímeros PDGR-α/α). PDGF-B puede unirse tanto a PDGFR-α como a PDGFR-β. Más específicamente, PDGF-B puede unirse a homodímeros PDGFR-α/α y PDGFRβ/β, además de heterodímeros PDGFR-α/α. PDGF-C se une a homodímeros PDGR-α/α y PDGF-D se une a homodímeros PDGFR-β/β y se ha informado que ambos se unen a heterodímeros PDGFR-α/β.

Tanto los ligandos como los receptores existen generalmente como dímeros, que incluyen tanto homodímeros como heterodímeros. Tales dímeros pueden influir en la unión. Por ejemplo, para PDGF, PDGF-AA se une a PDGFR-α/α. PDGF-AB y PDGF-CC se unen a PDGFR-α/α y PDGFR-α/β. PDGFR-BB se une tanto a los homodímeros como al receptor de PDGF heterodimérico. PDGF-DD se une a heterodímeros del receptor de PDGF y homodímeros del receptor beta [véase, por ejemplo, Pietras y col., Cancer cells, 3:439-443 (2003).] VEGF-A puede heterodimerizarse con VEGF-B y PIGF. VEGF, PDGF y PIGF pueden existir como dos o más isoformas, por ejemplo, variantes de corte y empalme, y no todas las isoformas de un factor de crecimiento particular compartirán el mismo perfil de unión

o capacidad para dimerizarse con moléculas particulares. Ciertas isoformas del mismo factor de crecimiento pueden también dimerizarse entre sí. Por ejemplo las isoformas 167 y 186 de VEGF-B pueden heterodimerizarse entre sí.

Los ensayos de unión a receptor para determinar la unión de tales moléculas quiméricas a uno o más de los receptores de VEGF/PDGF son muy conocidos en la técnica. Ejemplos de tales ensayos de unión a receptor se enseñan, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/795.006, documento WO 01/62942; Thuringer y col., J. Biol. Chem., 277:2028-2032 (2002) y Cao y col., FASEB J., 16:1575-1583 (2002) (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 de la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/795.006, y documento WO 01/62942, que detalla ensayos de unión de VEGF-C y ligandos del receptor de VEGF relacionados a proteínas de fusión de Fc del receptor de VEGF soluble. El Ejemplo 5 de aquellos documentos detalla análisis de activación o inhibición del receptor por tales ligandos. El Ejemplo 6 describe análisis de afinidades de unión al receptor de tales ligandos. Además, Achen y col., Proc Natl Acad Sci USA 95:548 53 (1998), incorporado por referencia en su totalidad, enseña ensayos de unión a modo de ejemplo. Thuringer y col., J. Biol. Chem., 277:2028-2032 (2002) detalla ensayos de unión (activación e inhibición) para VEGF-A a VEGFR-2. Los ensayos de unión para PDGFR-α y PDGF-β se describen en Cao y col., FASEB J., 16:1575-1583 (2002). La unión de los polipéptidos quiméricos de VEGF descritos anteriormente a VEGFR-1 y VEGFR-2 puede analizarse usando tales ensayos a modo de ejemplo.

Se apreciará que tales ensayos de unión pueden realizarse con cualquier forma de receptores de VEGF/PDGF que se produzcan naturalmente que retengan la capacidad para unir sus ligandos respectivos que incluyen, pero no se limitan a, células completas que expresan naturalmente un receptor o que se han modificado recombinantemente para expresar el receptor; dominios de unión a ligando extracelular solubilizado truncado de receptores; fusiones que comprenden dominios extracelulares de receptores fusionados con otras proteínas tales como fosfatasa alcalina (por ejemplo, AP de VEGFR-2 descrita en Cao y col., J. Biol. Chem. 271:3154-62,1996) o secuencias de inmunoglobulina; y fusiones que comprenden dominios extracelulares de receptores fusionados con secuencias de marca (por ejemplo, una marca de polihistidina) útiles para capturar la proteína con un anticuerpo o con un soporte sólido; y dominios extracelulares de receptores químicamente unidos a soportes sólidos tales como perlas de Sepharose activadas con CNBr. Ensayos de unión de receptores a modo de ejemplo pueden realizarse según el procedimiento expuesto en el Ejemplo 3 de, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/795.006 y el documento WO 01/62942,

a) Análisis de activación o inhibición de receptores por las proteínas quiméricas de VEGF.

En otro conjunto de ensayos, los polipéptidos quiméricos de la presente invención se evalúan para aplicaciones terapéuticas en las que se desea tanto la activación como la inhibición de uno o más receptores de VEGF. Por ejemplo, una proteína quimérica candidata puede añadirse a líneas celulares estables que expresan un receptor de VEGF particular cuya activación es necesaria para la supervivencia celular. La supervivencia de la línea celular indica que la proteína del polipéptido quimérico candidato puede unirse a y activar ese receptor de VEGF particular. Por otra parte, la muerte de la línea celular indica que el polipéptido quimérico candidato deja de activar el receptor. Ejemplos a modo de ejemplo de tales ensayos de supervivencia celular se han descrito en la publicación de patente internacional nº WO 98/07832 y en Achen y col., Proc Natl Acad Sci USA 95:548 553 (1998), incorporados en este documento por referencia. Este ensayo emplea células Ba/F3 NYK EpoR, que son células pre B de Ba/F3 que han sido transfectadas con un plásmido que codifica un receptor quimérico que consiste en el dominio extracelular de VEGFR-2 y el dominio citoplásmico del receptor de eritropoyetina (EpoR). Estas células son sometidas rutinariamente a pases en interleucina 3 (IL-3) y morirán en ausencia de IL-3. Sin embargo, si la señalización se induce a partir del dominio citoplásmico del receptor quimérico, estas células sobreviven y proliferan en ausencia de IL-3. Tal señalización se induce por ligandos que se unen al dominio extracelular de VEGFR-2 del receptor quimérico. Por ejemplo, la unión de VEGF-A o VEGF-D al dominio extracelular de VEGFR-2 hace que las células sobrevivan y proliferen en ausencia de IL-3. Las células Ba/F3 parentales que carecen del receptor quimérico no son inducidas ni por VEGF-A ni por VEGF-D para proliferar en ausencia de IL-3, que indica que las respuestas de las células Ba/F3-NYK-EpoR a estos ligandos son totalmente dependientes del receptor quimérico.

Los polipéptidos quiméricos candidatos de la presente invención pueden probarse para la unión al dominio extracelular de VEGFR-2 y la posterior activación de un receptor quimérico ensayando la supervivencia celular en ausencia de IL-3.Por otra parte, los polipéptidos quiméricos que interfieren con la unión de ligandos de VEGFR-2, tales como VEGF-A o VEGF-D, al dominio extracelular, o con la activación del dominio citoplásmico, producirán muerte celular en ausencia de IL-3.

b) Ensayos de autofosforilación de VEGFR-1 (flt1), VEGFR-2 (KDR), VEGFR-3 (Flt4), PDGFR-α y PDGFR-β.

Como un indicador alternativo de actividad también puede examinarse la capacidad de un polipéptido quimérico de la invención para estimular la autofosforilación de un receptor de VEGF o PDGF particular. Un polipéptido quimérico candidato se añade a células que expresan un receptor de VEGF o PDGF particular. Entonces, las células se lisan y se inmunoprecipitan con antisuero del receptor anti-VEGF o anti-PDGF y se analizan por transferencia Western usando anticuerpos anti-fosfotirosina para determinar la fosforilación inducida por el polipéptido quimérico del receptor de VEGF o PDGF.

La capacidad de un polipéptido quimérico para estimular la autofosforilación (detectada usando los anticuerpos antifosfotirosina) se puntúa como la estimulación del receptor. El nivel de estimulación observado para diversas concentraciones de polipéptido quimérico, con respecto a concentraciones conocidas de moléculas VEGF y PDGF, proporciona una indicación de la potencia de la estimulación de receptores. Los polipéptidos que se ha mostrado que se unen al receptor, pero que son incapaces de estimular la fosforilación de receptores, se puntúan como inhibidores. La actividad inhibitoria puede ensayarse adicionalmente mezclando un agonista conocido del receptor tal como VEGF-A o VEGF-C recombinante con tanto medios solos como con medios condicionados concentrados para determinar si los medios condicionados concentrados inhiben la fosforilación del receptor mediada por VEGF-A

o mediada por VEGF-C.

c) Ensayos para la unión a neuropilina.

Los resultados indican que NRP-1 es un co-receptor para la unión a VEGF165, formando un complejo con VEGFR-2, que produce una potenciación de la señalización de VEGF165 mediante VEGFR-2, pasando por la unión de VEGF165 a VEGFR-2 solo, potenciando así las respuestas biológicas a este ligando (Soker y col., Cell 92: 735-45. 1998). Un fenómeno similar puede aplicarse a la señalización de VEGF-C mediante posibles complejos del receptor VEGFR3/NRP-2. Las composiciones de la presente invención se prueban usando ensayos de unión a neuropilina. Aquellos ejemplos a modo de ejemplo se describen en detalle en, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. nº 10/669.176 presentada el 23 de septiembre de 2003, la patente de EE.UU. nº 6.428.965 y 6.515.105.

Tales ensayos pueden emplear células transformadas con construcciones de expresión que codifican neuropilinas. Los anticuerpos y reactivos que pueden usarse en ensayos de unión a neuropilina son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sema3A=AP que reconoce neuropilina. Los ensayos de unión competitiva usando Sema3 AP y las composiciones de la invención demuestran si las composiciones descritas en este documento poseen o no actividad de unión a neuropilina.

d) Análisis de las afinidades de unión a receptor de polipéptidos quiméricos.

Los polipéptidos quiméricos de la presente invención pueden unirse a más de un VEGFR. Pueden realizarse ensayos para determinar esa actividad de unión a receptor de estos polipéptidos quiméricos. Para tales experimentos, el polipéptido quimérico puede expresarse en un sistema de célula de insecto, por ejemplo, células SF9, para eliminar la contaminación con VEGF-A endógeno encontrada en células de mamífero. Para medir las afinidades de unión relativa del polipéptido quimérico seleccionado se usa una solución de tipo ELISA. Por ejemplo, para examinar la afinidad de unión por VEGFR-2, diluciones seriadas de proteínas de fusión VEGFR-2-IgG competentes y una concentración inferior a la de saturación del polipéptido quimérico candidato marcado con el epítope myc se añaden a placas de microtitulación recubiertas con VEGFR-2, y se incuban hasta que se establece el equilibrio. Entonces, las placas se lavan para eliminar las proteínas sin unir. Las moléculas de polipéptido quimérico que siguen unidas a las placas recubiertas con VEGFR-2 se detectan usando un anticuerpo anti-myc conjugado con una marca fácilmente detectable, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. Las afinidades de unión (CE50) pueden calcularse como la concentración de proteína de fusión VEGFR-2-IgG competente que produce la mitad de la unión máxima. Estos valores pueden compararse con aquellos obtenidos a partir del análisis de VEGF-A

: o VEGF-C para determinar cambios en la afinidad de unión de uno o más de los VEGFR. Similarmente, la unión a VEGFR-3 se lleva a cabo usando una proteína de fusión VEGFR-3-IgG y la unión a VEGFR-1 se determina usando una proteína de fusión VEGFR-1-IgG.

G.: Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención pueden administrarse en cualquier modo adecuado usando un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, por ejemplo, un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefieren diluyentes líquidos, semisólidos o sólido que sirven de vehículos, excipientes o medios farmacéuticos. Puede usarse cualquier diluyente conocido en la técnica. Diluyentes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, monolaurato de polioxietilensorbitano, estearato de magnesio, hidroxibenzoato de metilo y propilo, talco, alginatos, almidones, lactosa, sacarosa, dextrosa, sorbitol, manitol, glicerina, fosfato de calcio, aceite mineral y manteca de cacao. Tales formulaciones son útiles, por ejemplo, para la administración de polipéptidos o polinucleótidos de la invención a sujetos mamíferos (incluyendo seres humanos) en pautas terapéuticas.

La composición que va a administrarse según procedimientos de la invención comprende preferentemente (además del polinucleótido o vector) una disolución de vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, glucosa u otros vehículos convencionalmente usados para administrar agentes terapéuticos intravascularmente. También se contempla terapia multigénica, en cuyo caso la composición comprende opcionalmente tanto el polinucleótido de la invención/vector como otro polinucleótido/vector seleccionado para prevenir reestenosis u otro trastorno mediado por la acción de un receptor de VEGF. Genes/vectores candidatos a modo de ejemplo para la co-transfección con transgenes que codifican polipéptidos de la invención se describen en la bibliografía citada anteriormente que incluye genes que codifican factores citotóxicos, factores citostáticos, factores de crecimiento endotelial e inhibidores del crecimiento/migración de células de músculo liso.

La “administración” que se realiza según el presente procedimiento puede realizarse usando cualquier medio médicamente aceptado para introducir un agente terapéutico directa o indirectamente en la vasculatura de un sujeto mamífero que incluye, pero no se limita a, inyecciones (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, subcutánea o catéter); ingestión oral; administración intranasal o tópica; y similares. En una realización preferida, la administración de la composición que comprende un polinucleótido de la invención se realiza intravascularmente tal como por inyección intravenosa, intra-arterial o arterial intracoronaria. La composición terapéutica puede administrarse al paciente en múltiples sitios. Las múltiples administraciones pueden convertirse simultáneamente o pueden administrarse durante un periodo de varias horas. En ciertos casos puede ser beneficioso proporcionar un flujo continuo de la composición terapéutica. Puede administrarse terapia adicional periódicamente, por ejemplo, diariamente, semanalmente o mensualmente. Para minimizar los efectos secundarios angiogénicos en tejidos no diana, procedimientos preferidos de administración son procedimientos de administración local tales como administración por inyección intramuscular.

En general, las formas farmacéuticas perorales para la administración terapéutica de polipéptidos son ineficaces ya que para que una formulación sea eficaz el péptido debe protegerse del entorno enzimático del tracto gastrointestinal. Adicionalmente, el polipéptido debe formularse de forma que sea fácilmente absorbido por la barrera de células epiteliales en concentraciones suficientes para efectuar un resultado terapéutico. Los polipéptidos quiméricos de la presente invención pueden formularse con potenciadores de la captación o absorción para aumentar su eficacia. Tal potenciador incluye, por ejemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato, aprotinina, bacitracina, caprato de SDS y similares. Una discusión detallada adicional de formulaciones orales de péptidos para la administración terapéutica se encuentra en Fix, J. Pharm. Sci., 85(12) 1282 1285, 1996, y Oliyai y Stella, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521 544, 1993,

Las cantidades de péptidos en una dosificación dada variarán según el tamaño del individuo al que está siendo administrada la terapia, además de las características del trastorno que está tratándose. En tratamientos a modo de ejemplo puede ser necesario administrar aproximadamente 50 mg/día, 75 mg/día, 100 mg/día, 150 mg/día, 200 mg/día, 250 mg/día. Estas concentraciones pueden administrarse como una forma farmacéutica individual o como dosis múltiples.

En realizaciones de terapia génica empleando administración vírica, la dosis unitaria puede calcularse en términos de la dosis de partículas víricas que se administran. Las dosis víricas incluyen un número particular de partículas víricas o unidades formadoras de placa (ufp). Para realizaciones que implican adenovirus, dosis unitarias particulares incluyen 103, 101, 105, 106, 107,108,109, 1010, 1011, 1012, 1013 ó 1014 ufp. Las dosis de partículas pueden ser algo mayores (10 a 100 veces) debido a la presencia de partículas defectivas en una infección.

Los polipéptidos también pueden emplearse según la presente invención mediante la expresión de tal polipéptido in vivo, que se denomina frecuentemente en lo sucesivo terapia génica. La presente invención proporciona un vector de ADN recombinante que contiene un segmento heterólogo que codifica un polipéptido quimérico de la invención que puede insertarse en un microorganismo o célula eucariota y que puede expresar la proteína quimérica codificada.

En una realización preferida, la composición se administra localmente. Por tanto, en el contexto de tratar reestenosis

o estenosis se prefiere la administración directamente al sitio de angioplastia o derivación. Por ejemplo, la administración comprende una transferencia mediada por catéter del transgén que contiene la composición en un vaso sanguíneo del sujeto mamífero, especialmente en una arteria coronaria del sujeto mamífero. Materiales y procedimientos a modo de ejemplo para la administración local se revisan en Lincoff y col., Circulation, 90: 2070 2084 (1994); y Wilensky y col., Trends Cardiovasc. Med., 3:163 170 (1993), ambos incorporados en este documento por referencia. Por ejemplo, la composición se administra usando catéteres con balón de infusión-perfusión (preferentemente catéteres con balón microporosos) tales como aquellos que se han descrito en la bibliografía para infusiones de fármacos intracoronarios. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.713,860 (Catéter intravascular con matriz de infusión); la patente de EE.UU. nº 5.087.244; la patente de EE.UU. nº 5.653.689; y Wolinsky y col., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 475 481 (1990) (catéter de infusión de Wolinsky); y Lambert y col., Coron. Artery Dis., 4: 469 475 (1993). El uso de tales catéteres para la terapia génica de células somáticas dirigidas a sitio se describe, por ejemplo, en Mazur y col., Texas Heart Institute Journal, 21; 104 111 (1994), incorporado en este documento por referencia. En una realización en la que el transgén que codifica un polipéptido quimérico de la invención se administra en un vector de adenovirus, el vector se administra preferentemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable a una dosis de 107 a 1013 partículas víricas, y más preferentemente a una dosis de 109 a 1011 partículas víricas. La composición de vector adenovírico se infunde preferentemente durante un periodo de 15 segundos a 30 minutos, más preferentemente 1 a 10 minutos.

Por ejemplo, en pacientes con angina de pecho debida a una única o múltiples lesiones en arterias coronarias y para los que se prescribe PTCA basándose en hallazgos de angiograma coronario primario, un protocolo a modo de ejemplo implica realizar PTCA mediante un catéter guía de 7F según la práctica clínica convencional usando el enfoque femoral. Si no se consigue un resultado óptimo con PTCA sola, entonces también se implanta una prótesis endovascular (un resultado no óptimo se define como estenosis residual de > 30% del diámetro luminal según un cálculo aproximado visual, y disección de tipo B o C). La transferencia génica arterial en el sitio de dilatación del balón se realiza con un vector adenovírico deficiente en la replicación que expresa un polipéptido de la invención inmediatamente después de la angioplastia, pero antes de la implantación de la prótesis, usando un catéter con balón de infusión-perfusión. El tamaño del catéter se seleccionará para ajustarse al diámetro de la arteria como se mide a partir del angiograma, variable, por ejemplo, de 3,0 a 3,5F de diámetro. El globo se infla a la presión óptima y la transferencia génica se realiza durante una infusión de 10 minutos a la tasa de 0,5 ml/min con título de virus de 1,15 x 1010 ufp/ml.

En otra realización se contempla la administración intravascular con un catéter recubierto de gel como se ha descrito en la bibliografía para introducir otros transgenes. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.674.192 (Catéter recubierto con polímero de hidrogel hinchable tenazmente adherido); Riessen y col., Human Gene Therapy, 4: 749 758 (1993); y Steg y col., Circulation, 96: 408 411 (1997) y 90: 1648 1656 (1994); todos incorporados en este documento por referencia. Brevemente, el ADN en disolución (por ejemplo, un polinucleótido de la invención) se aplica una o más veces ex vivo a la superficie de un balón del catéter de angioplastia inflado recubierto con un polímero de hidrogel (por ejemplo, Slider con Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA). El recubrimiento de Hydroplus es un polímero de ácido poliacrílico hidrófilo que está reticulado al balón para formar un hidrogel de alto peso molecular fuertemente adherido al balón. Se deja que el hidrogel cubierto de ADN se seque antes de desinflar el balón. El volver a inflar el balón intravascularmente, durante un procedimiento de angioplastia, produce la transferencia del ADN a la pared del vaso.

En otra realización más, una membrana elástica expandible o estructura similar montada a o integral con un catéter de angioplastia de balón o prótesis se emplea para administrar el transgén que codifica un polipéptido de la invención. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.707.385, 5.697.967, 5.700.286, 5.800.507 y 5.776.184.

En otra realización más, la composición que contiene los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se administran por inyección intramuscular. Véanse, por ejemplo, Shyu y col., Am. J. Med., 114:85-92 (2002); Freedman y col., Hum. Gene Ther., 13:1595-1603 (2002).

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden administrarse por un parche transdérmico. El espesor del parche transdérmico depende de los requisitos terapéuticos y, por consiguiente, puede adaptarse. Los parches transdérmicos representan una alternativa a las formas líquidas de administración. Estos dispositivos pueden venir en una variedad de formas, teniendo todas la capacidad de adherirse a la piel, y permitiendo así el contacto prolongado entre la composición terapéutica y el área diana. También tienen la ventaja de ser relativamente compactos y portátiles, y de permitir una administración muy precisa de una composición al área que va a tratarse. Estos parches vienen en una variedad de formas, conteniendo algunas depósitos de fluido para el componente activo, conteniendo otros componentes secos que son liberados tras el contacto con la humedad en la piel. Muchas requieren alguna forma de adhesivo para retenerlos en conexión con la piel durante un periodo adecuado. Un tipo diferente de parche se aplica seco, aplicado con agua para humedecer el parche para formar una película adhesiva que es retenida sobre la piel.

Como se usa en este documento, “parche” comprende al menos una composición tópica según la invención y una capa de cubierta de forma que el parche puede colocarse sobre una herida quirúrgicamente cerrada, incisión, colgajo de piel, injerto de piel o quemadura, colocándose así el parche/composición adyacente a la superficie de tejido dañado. Preferentemente, el parche se diseña para maximizar la administración de la composición mediante el estrato córneo, la epidermis superior y en la dermis, y para minimizar la absorción en el sistema circulatorio, reducir el tiempo de retardo, promover la absorción uniforme y reducir el frotamiento mecánico.

Los parches preferidos incluyen (1) el parche tipo matriz; (2) el parche tipo depósito; (3) el parche tipo fármaco en adhesivo multilaminado; y (4) el parche tipo fármaco en adhesivo monolítico; (Ghosh, T. K. y col., Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Interpharm Press, Inc. pág. 249-297 (1997). Estos parches son muy conocidos en la técnica y generalmente están comercialmente disponibles.

En otra realización se proporciona un vendaje para la administración de una composición que comprende los polipéptidos o polinucleótidos de la invención. El término “vendaje” como se usa en este documento significa una cubierta diseñada para proteger y o administrar una composición (previamente aplicada). “Vendaje” incluye cubiertas tales como un vendaje que puede ser poroso o no poroso y diversas cubiertas inertes, por ejemplo, una envoltura de película de plástico u otra película no absorbente. El término “vendaje” también engloba cubiertas no tejidas o tejidas, particularmente cubiertas elastoméricas, que permiten el transporte de calor y vapor. Estos vendajes permiten enfriar el sitio de dolor, que proporciona mayor comodidad.

En otra realización se proporciona un hilo de sutura quirúrgica impregnado con los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

En otra variación, la composición que contiene el transgén que codifica un polipéptido de la invención se administra extravascularmente, por ejemplo, usando un dispositivo para rodear o encapsular una parte del vaso. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 98/20027 que describe un collar que se coloca alrededor del exterior de una arteria (por ejemplo, durante un procedimiento de derivación) para administrar un transgén a la pared arterial mediante un vector de plásmido o de liposoma.

En otra variación adicional, células endoteliales o células progenitoras endoteliales se transfectan ex vivo con el transgén que codifica un polipéptido de la invención, y las células transfectadas se administran al sujeto mamífero. Procedimientos a modo de ejemplo para sembrar un injerto vascular con células endoteliales genéticamente modificadas se describen en la patente de EE.UU. nº 5.785.965.

Otros mecanismos de administración no vírica contemplados incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, 1987; Rippe y col., Mol. Cell Biol.,10:689-695, 1990) DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985), electroporación (Tur-Kaspa y col., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985.), liposomas cargados de ADN (Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Felgner, Sci Am. 276(6):102 6, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(15):1791 3, 1996), sonicación de células (Fechheimer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987), bombardeo de genes usando microproyectiles de alta velocidad (Yang y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987; Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu y Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993).

La construcción de expresión (o la propia construcción de polipéptido) puede atraparse en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de disolución acuosa. Los componentes de lípidos se someten a auto-transposición antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas de lípidos (Ghosh y Bachhawat, en: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, pág. 87-104, 1991). La adición de ADN a liposomas catiónicos produce una transición topológica de liposomas a glóbulos condensados líquido-cristalinos ópticamente birrefringentes (Radler y col., Science, 275(5301):810 4, 1997). Estos complejos de ADN-lípido son posibles vectores no víricos para uso en terapia génica y administración.

La administración de ácido nucleico mediado por liposoma y la expresión de ADN extraño in vitro ha sido satisfactoria. En la presente invención también se contemplan diversos enfoques comerciales que implican tecnología de “lipofección”. En ciertas realizaciones de la invención, el liposoma puede conjugarse con un virus hemaglutinante (HVJ). Esto se ha mostrado para facilitar la fusión con la membrana celular y promover la entrada celular de ADN encapsulado en liposoma (Kaneda y col., Science, 243:375-378, 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede complejarse o emplearse conjuntamente con proteínas cromosómicas de no histona nucleares (HMG-1) (Kato y col., J. Biol. Chem., 266:3361-3364,1991). En todavía otras realizaciones, el liposoma puede complejarse o emplearse conjuntamente con tanto HVJ como HMG-1. Debido a que tales construcciones de expresión se han empleado satisfactoriamente en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in vivo, son aplicables a la presente invención.

Otros sistemas de administración de vectores que pueden emplearse para administrar un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico en células incluyen vehículos de administración mediados por receptor. Esto aprovecha la captación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptor en casi todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica del tipo de célula de diversos receptores, la administración puede ser altamente específica (Wu y Wu, 1993, antes).

En otras realizaciones, el vehículo de administración puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau y col. (Methods Enzymol., 149:157-176, 1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialgangliósido del extremo de galactosa, incorporada en liposomas y observaron un aumento en la captación del gen de insulina por hepatocitos. Por tanto, es factible que un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico también pueda administrarse específicamente en un tipo de célula particular por cualquier número de sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas.

En otra realización de la invención, la construcción de expresión puede consistir simplemente en ADN desnudo recombinante o plásmidos. La transferencia de la construcción puede realizarse por cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente que permeabilizan físicamente o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro; sin embargo, también puede aplicarse para uso in vivo. Dubensky y col. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533, 1984) inyectaron satisfactoriamente ADN del virus del polioma en forma de precipitados de CaPO4 en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando replicación vírica activa e infección aguda. Benvenisty y Neshsi (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555, 1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO4 produce la expresión de los genes transfectados.

Otra realización de la invención para transferir una construcción de expresión de ADN desnudo en células puede implicar el bombardeo de partículas. Este procedimiento depende de la capacidad para acelerar los microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad permitiendo que atraviesen membranas celulares y entren en células sin destruirlas (Klein y col., Nature, 327:70-73, 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Un dispositivo tal se basa en una descarga a alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza móvil (Yang y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como perlas de tungsteno o de oro.

En realizaciones que emplean un vector vírico, polinucleótidos preferidos todavía incluyen una secuencia promotora y de poliadenilación adecuada como se ha descrito anteriormente. Además, será rápidamente evidente que, en estas realizaciones, el polinucleótido incluye adicionalmente secuencias de polinucleótidos del vector (por ejemplo, secuencias de polinucleótidos adenovíricas) conectadas operativamente con la secuencia que codifica un polipéptido de la invención.

Similarmente, la invención incluye kits que comprenden compuestos o composiciones de la invención envasados de un modo que facilita su uso para poner en práctica los procedimientos de la invención. En una realización más simple, un kit tal incluye un compuesto o composición descrito en este documento como útil para poner en práctica la invención (por ejemplo, polinucleótidos o polipéptidos de la invención) envasado en un recipiente tal como un frasco o recipiente cerrado con una etiqueta pegada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o composición para poner en práctica el procedimiento de la invención. Preferentemente, el compuesto o composición está envasado en una forma farmacéutica unitaria. En otra realización, un kit de la invención incluye una composición de tanto un polinucleótido como un polipéptido envasado junto con un dispositivo físico útil para implementar los procedimientos de la invención tal como una derivación, un catéter, un collar extravascular, una película de polímero, un vendaje, una sutura o similares. En otra realización, un kit de la invención incluye composiciones de tanto un polinucleótido como un polipéptido de la invención envasado junto con un polímero de hidrogel, o polímeros de micropartículas, u otros vehículos descritos en este documento como útiles para la administración de los polinucleótidos o polipéptidos al paciente.

EJEMPLO 1

CONSTRUCCIÓN QUIMÉRICA DE VEGF-CAC

El presente ejemplo describe la generación de una molécula de polipéptido quimérico designada VEGF-CAC (o simplemente “CAC”) que comprende propéptidos de VEGF-C del extremo amino y carboxi (dominios flanqueantes de la invención) fusionados con un dominio de unión a receptor tirosina-cinasa (RTK) de VEGF-A. Se generó un polinucleótido codificante para expresar recombinantemente el VEGF-CAC.

Clonación: Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión CAC se produjo por amplificación por PCR y subclonación del extremo N y extremo C de un ADNc de VEGF-C humano y el dominio de unión a RTK de un ADNc de VEGF-A humano. Se añadió una marca His al extremo C y se añadió un péptido señal IgGK al extremo N. El ADNc resultante (SEQ ID NO. 26) se secuenció y se codificó la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:

27. Este ADNc se insertó en el vector pSecTagI-ACAswap como un fragmento BamHI-NotI. Para las transfecciones transitorias y los ensayos de unión, el promotor K14 se eliminó de la construcción. El polinucleótido de VEGF-CAC se cortó con enzimas de restricción AgeI y ClaI, se desmochó y se ligó en el plásmido psub-CMV-WPRE.

Transfección e inmunoprecipitación. La secreción y el procesamiento de la proteína recombinante se analizó por transfección en células 293T, que luego se marcaron con aminoácidos radiactivos. Las células 293T se transfectaron con psub-CMV/CAC o el vector pEBS7/psub-CMV usando liposomas (FuGENE 6, Roche) o polímeros catiónicos (jetPEI, Qbiogene). Las células transfectadas se cultivaron durante 24 ó 48 horas y luego se marcaron metabólicamente en medio modificado Eagle sin metionina y sin cisteína complementado con [35S]metionina/[35S]cisteína (Promix, Amersham Pharmacia Biotech) a 100 µCi/ml durante 8 h. Entonces, el medio condicionado se recogió, se purificó de material particulado por centrifugación y se incubó con las fusiones de dominio extracelular del receptor soluble-inmunoglobulina VEGFR1-Ig, VEGFR2-Ig, VEGFR3-Ig; anticuerpo anti-VEGF-A (R&D); anticuerpo anti-VEGF-C (R&D); y anticuerpos policlonales contra VEGF-C (Joukov y col., Embo J

16: 3898-911, 1997). Los inmunocomplejos y los complejos ligando-receptor-Ig formados se unieron a proteína A-Sepharose y proteína G-Sepharose (Pharmacia Biotech) respectivamente, que luego se lavaron dos veces con albúmina de suero bovino al 0,5%/Tween 20 al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con PBS, y se analizaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras. También se prepararon muestras sin reducir a partir de algunas uniones. Se determinó que los medios de células transfectadas que expresaban psub-CMV/CAC y psub-CMV/VEGF-A165 activaron VEGFR-1 y VEGFR-2 en diluciones similares, pero no activaron VEGFR-3.

Bioensayo para la supervivencia celular mediada por factor de crecimiento: Las células 293T que expresaban psub-CMV/CAC se sembraron en placas de 96 pocillos a 15.000 células/pocillo por triplicado suministradas con medio condicionado (0, 1, 5, 10 ó 20 µl) como se describe en la solicitud PCT de propiedad común nº PCT/US2004/019122

o el vector pREP7. La viabilidad celular se midió por un ensayo colorimétrico. Se añadió MTT (bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Sigma), 0,5 mg/ml) a cada pocillo y se incubaron durante 4 h a 37ºC. La reacción se terminó añadiendo 100 µl de tampón de lisis (SDS al 10%, HCl 10 mM) y los productos de formazano resultantes se solubilizaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera húmeda. La absorbancia a 540 nm se midió con un lector de placas de microtitulación Multiscan (Labsystems).

El polipéptido quimérico de VEGF-CAC se produjo como se describe, y la secreción y el procesamiento de la proteína resultante se analizó por transfección en células 293T, que luego se marcó con aminoácidos radiactivos. Los medios condicionados se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-VEGF-C o anti-VEGF-A o VEGFR-1 soluble. Bajo condiciones no reductoras, los polipéptidos de VEGF-CAC tuvieron pesos moleculares aparentes de 94 kDa, 66 kDa, mientras que VEGF-C migró a 58 kDa. El dominio del factor de crecimiento de VEGF migró como un doblete a 56 kDa y 50 kDa.

Para el análisis de seguimiento de pulso, células 293T transfectadas con VEGF-CAC y VEGF-C se marcaron durante 30 minutos con aminoácidos radiactivos y luego se siguieron en medio de crecimiento no radiactivo durante 30 minutos, 6 horas y 24 horas. Los medios condicionados se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-VEGF-C y se analizaron en SDS-PAGE. La electroforesis en gel indicó la secreción de una forma principal de 66 kDa de VEGFCAC y doblete de 68 kDa para VEGF-C, como era de esperar (Joukov y col., Embo J., 16:3898-3911, 1997). Éstos se escindieron después de un periodo de seguimiento de 30 minutos en dobletes de aproximadamente 30 kDa. La forma de 66 kDa sin procesar ya no se detectó a las 24 horas, mientras que en este momento de tiempo también se generaron pequeñas cantidades de la forma madura de 20 kD que contenía el dominio del factor de crecimiento a partir de ambos polipéptidos. Para concluir, el procesamiento de VEGF-CAC se produjo similarmente al procesamiento de VEGF-C natural, escindiéndose aparentemente cada propéptido en el orden extremo C, luego extremo N.

EJEMPLO 2

CONSTRUCCIONES QUIMÉRICAS DE VEGF-CDD, VEGF-CDC Y VEGF-DDC

El presente ejemplo describe la generación de moléculas de polinucleótidos y polipéptidos quiméricos designadas VEGF-CDD, VEGF-CDC y VEGF-DDC que comprenden diversas combinaciones del extremo amino y carboxi de los propéptidos de VEGF-C o VEGF-D fusionados con un dominio de unión a receptor tirosina cinasa de VEGF-D.

Un polinucleótido que codifica la proteína quimérica CDD (SEQ ID NO: 36 y 37) que combina el propéptido del extremo N de VEGF-C humano con el dominio de homología con VEGF (VHD) de VEGF-D y el propéptido del extremo C de VEGF-D humano se construyó mediante PCR usando los cebadores 5'-GCGGATCCGTTCGAGTC CGGACTCGACCTCTCGGAC-3' (SEQ ID NO: 28) (cebador I, que contiene el sitio BamHI) y 5'CTTTTAGTGTTTCAA TGTCATAGAAAGTTGCAGCAAATTTTAT AGTCTCTTCTGTCCTTGAGTTG AGG-3' (SEQ ID NO: 29) para amplificar el FN de VEGF-C humano y los cebadores 5'-GGACAGAAGAGACTATAAAATTT GCTGCAACTTTCTATGACATTGA AACACTAAAAGTTATAGATGAAG AATGGCA-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'CGGATCCTCAAGGATTCTTTCGGCT GTGGGGCC-3' (SEQ ID NO: 31) (cebador II, que contiene un sitio BamHI) para amplificar el VHD y CT de VEGF-D humano. Estos fragmentos de PCR se hibridaron y se usaron como molde para amplificar la quimera de CDD con los cebadores I y II, el fragmento de PCR obtenido se ligó en el vector pCRII (Invitrogen), se cortó con BamHI y se ligó en el sitio BamHI del vector pSecTaqI en marco con la secuencia señal.

Un polinucleótido que codifica la proteína quimérica DDC (SEQ ID NO: 40 y 41) que contiene el propéptido del extremo N y el dominio de homología con VEGF de VEGF-D humano combinado con el propéptido del extremo C de VEGF-C humano se construyó mediante PCR usando los cebadores 5'-GCGGATCCGTCCAGTAATGAACA TGGACCAGTGAGGCGA TCATC-3' (SEQ ID NO: 32) (cebador III, que contiene un sitio BamHI) y 5'GCCTGACACTGTGGTAGTGTTGCTGGCAGGGATCTT CTGATAATT GAGTATGGATGGCGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 33) para amplificar el AT y el VHD de VEGF-D humano y los cebadores 5'-GCCATCCATACTCA ATTATCAGAAGATCCCTGCCAGCA ACACTACCACAGTGTCAG-3' (SEQ ID NO: 34) y 5'-GCGGATCC TTAGCTCATTTGTGGTCTTTTCCAATATGA AGGGAC ACAAC-3' (SEQ ID NO: 35) (cebador IV, que contiene un sitio BamHI) para amplificar el FN de VEGF-C humano. Estos fragmentos de PCR se hibridaron y se usaron como molde para amplificar la quimera de DDC con los cebadores III y IV, el fragmento de PCR obtenido se ligó en el vector pCRII (Invitrogen), se cortó con BamHI y se ligó en el sitio BamHI del vector pSecTaqI en marco con la secuencia señal.

El ADNc para la proteína quimérica CDC (SEQ ID NO: 38 y 39) se construyó ligando el fragmento NdeI -EcoRV de 954 pb de CDD/pSecTaqI con el plásmido DDC/pSecTaqI cortado con NdeI (en la secuencia del promotor del CMV) y EcoRV (en el VHD de VEGF-D).

Transfección y marcado metabólico

Se transfectaron células 293T con plásmidos DDC/pSecTaqI, CDC/pSecTaqI o CDD/pSecTaqI usando el reactivo de transfección JetPEI. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron dos veces con PBS y se marcaron metabólicamente en medio MEM que contenía 100 µCi /ml de 35S-metionina y 35S-cisteína (Promix, Amersham) y 10 U/ml de heparina durante la noche. Los plásmidos que codifican neuropilina 1-Ig (Makinen y col., J Biol Chem 274(1999):21217-21222) o neuropilina 2-Ig (Karkkainen y col., PNAS 98(2001): 12677-12682) se transfectaron similarmente con células 293T y 48 horas después de la transfección las células se lavaron y las proteínas de fusión de Ig se produjeron en medio de privación. Los medios condicionados se recogieron y se purificaron por centrifugación.

El medio condicionado se complementó con BSA y Tween 20 a concentraciones finales del 0,5% y el 0,02%, respectivamente. Las quimeras de CDD, CDC y DDC se unieron tanto con 200 ng de proteínas de fusión VEGFR-1Ig (Mäkinen y col., Nat Med 7(2001): 199-205), VEGFR-2-Ig (Uutela y col., Blood 104(2004): 3198-3204) o VEGFR-3-Ig (Mäkinen y col., Nat Med 7(2001): 199-205) como con los medios condicionados con NP-1-Ig o NP-2-Ig. Entonces, los complejos se precipitaron con proteína A-Sepharose y se lavaron tres veces con 1 x tampón de unión (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,02% en PBS) y una vez con PBS a 4ºC. Las proteínas se analizaron por SDS-PAGE en un gel al 12,5% bajo condiciones reductoras.

Resultados:

Todas las proteínas quiméricas CDD (SEQ ID NO: 37), CDC (SEQ ID NO: 39) y DDC (SEQ ID NO: 41) se expresaron, aunque CDD y CDC bastante débilmente, y se procesaron de una forma similar a VEGF-C y VEGF-D natural. Al igual que VEGF-C y VEGF-D naturales, todas las quimeras de CDD, CDC y DDC se unen a neuropilina 1 y DDC se une también a neuropilina 2. La unión de CDD y CDC a neuropilina 2 no pudo detectarse en estos experimentos, posiblemente debido a los menores niveles de expresión de estas quimeras.

La actividad de los polipéptidos quiméricos descritos en este ejemplo puede evaluarse realizando experimentos como se describe en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 3

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS DE LA TERAPIA GÉNICA CON VEGF-CAC

Materiales y procedimientos: Los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 también se usan en el presente ejemplo. Los estudios descritos en el presente ejemplo también emplearon los siguientes protocolos experimentales adicionales.

Producción y administración in vivo de VEGF-CAC por vectores víricos: El vector AAV psub-CAG-WPRE se clonó sustituyendo el fragmento del promotor del CMV de psub-CMV-WPRE (Paterna y col., Gene Ther., 7(15):1304-1311, 2000) con el inserto de beta-actina de pollo del CMV (Niwa y col., Gene, 108(2):193-199, 1991). La longitud completa del casete de expresión de CAC se clonó en el sitio NheI del plásmido del vector psub-CMV-WPRE como un fragmento de AgeI-ClaI. El ADNc que codifica VEGF-CAC se clonó en el vector pAdBglII (AdCAC) y se produjeron adenovirus recombinantes como se describen en Laitinen y col., Hum. Gene Ther., 9(10):1481-1486, 1998. Se usaron células Hela para el análisis de expresión y se infectaron con un adenovirus (MOI 100). La expresión de la proteína recombinante se examinó por marcado metabólico, inmunoprecipitación seguida de SDSPAGE.

Los adenovirus (AdVEGF-CAC o AdLacZ, aproximadamente 3 × 108 ufp) se inyectaron en las pieles de ratones NMRI nu/nu, mientras que los AAV se inyectaron estereotáxicamente en el cerebro de ratón (volumen 3 µl). Los tejidos se recogieron para el análisis histológico dos semanas después de la transducción adenovírica o tres semanas después de la transducción con AAV.

Inmunohistoquímica. Para la tinción del portaobjetos completo, los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA), se bloquearon con suero de cabra al 5% en Triton-X1000 al 0,3% que contenía PBS y se incubaron con anticuerpos policlonales para LYVE-1 (Karkkainen y col., Nat. Immunol., 5:74-80, 2004) y/o anticuerpos monoclonales contra PECAM-1 (PharMingen), nidogen (Chemicon) y α-actina de músculo liso (SMA, conjugado de Cy2). Para la tinción de secciones de tejido, los tejidos se fijaron en PFA al 4% durante la noche a 4ºC y las secciones en parafina o congeladas (6-20 µm) se inmunotiñeron con anticuerpos monoclonales anti-LYVE-1 contra PECAM-1 o PDGFR-β. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa594 y Alexa488 (Molecular Probes) para la tinción, y entonces las muestras se montaron con Vectashield (Vector Laboratories) y se analizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM510. Parte de los ratones experimentales se perfundieron con lectina de Lycopersicon esculentum conjugada con FITC, seguido de fijación por perfusión con PFA al 1% y lavados con PBS.

Resultados. La transducción de VEGF-CAC adenovírico de la piel de la oreja del ratón produjo eritema, hinchazón y engrosamiento de la oreja, mientras que tales efectos fueron leves en orejas transducidas con AdVEGF-A165 e inexistentes en orejas LacZ de control (Fig. 2 y Figs. 3A-3C). La transducción de AdVEGF-CAC condujo a una masiva respuesta angiogénica caracterizada por láminas endoteliales de sangre con una falta parcial de estructuras luminales, AdVEGFA165 indujo una destacada respuesta angiogénica que sin embargo fue más débil cuando se comparó con AdVEGF-CAC. Se ha mostrado que VEGF-A165 induce angiogénesis mediante un mecanismo dependiente del gradiente, caracterizado por proliferación endotelial, germinación y migración guiada (Ruhrberg y col., Genes Dev., 16:2684-2698, 2002). Esta acción coordinada es evidentemente debida a las propiedades de difusión intermedias de VEGF165. La VEGF-CAC quimérica es un inductor muy potente de angiogénesis. Esto sugiere que los propéptidos de VEGF-C se asocian de forma diferente con el entorno extracelular cuando se compararon con los dominios de unión a heparina de VEGF165 y produjeron el aumento de la disponibilidad del dominio del núcleo de VEGF. Se hincharon los capilares linfáticos en las orejas de ratones tratados con AdVEGF-CAC o AdVEGF-A165, y sus luces se alargaron en comparación con los controles. Previamente también se ha observado dilatación vascular linfática similar en respuesta a expresión en exceso adenovírica de VEGF-A165 en la piel de la oreja de ratón (Saaristo y col., FASEB J., 16:1041-1049, 2002).

Tanto las vasculaturas sanguíneas como linfáticas permanecieron inafectadas por el tratamiento con el adenovirus de control que codifica LacZ. También se observó hiperplasia circunferencial marcada de vasos sanguíneos grandes de la oreja en orejas transducidas con AdVEGF-CAC, mientras que ni AdVEGF-A165 ni AdLacZ tuvieron efectos similares. La tinción para nidogen mostró un aumento masivo en los vasos que estaban rodeados por la membrana basal en orejas transducidas con AdVEGF-CAC cuando se comparó con el control, sugiriendo que los vasos recientemente formados fueron maduros y estables. Además, la perfusión de los ratones con lectina de Lycopersicon esculentum conjugada con FITC, un marcador para células endoteliales, mostró que la mayoría de los vasos recientemente formados en orejas transducidas con AdVEGF-CAC se perfundieron, y su número había aumentado cuando se comparó con las orejas de control. De forma interesante, la mayoría de los vasos de calibre medio y grande formados en respuesta a la transducción con AdVEGF-CAC se rodearon por pericitos positivos de actina de músculo liso, mientras que sólo los nuevos vasos nacientes en orejas transducidas con AdVEGF-A165 fueron rodeados por tales células. Se encontró una jerarquía normal de vasos sanguíneos, caracterizada por vasos de tamaño medio y grande cubiertos por SMA en orejas con AdLacZ. Esto sugiere que los vasos formados en respuesta a la estimulación con VEGF-CAC son más estables que aquellos sin cubierta de pericitos formados después de la estimulación con VEGF-A165. La germinación de pericitos positivos para SMA se observó tanto en orejas transducidas con AdVEGF-CAC como con AdVEGF165, sugiriendo que la angiogénesis estimulada por estos factores también conduce a la movilización de pericitos. Se ha mostrado que la transducción de genes mediada por adenovirus o AAV de VEGF-C induce linfangiogénesis en varios tejidos, mientras que VEGF-C víricamente expresado es un estimulador débil de la angiogénesis (Rissanen y col., Circ. Res. 30;92(10):1098-106, 2003 y Saaristo y col. J. Exp. Med., 16;196(6):719-30,2002).

EJEMPLO 4

ESTIMULACIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES

Tanto VEGF-A como VEGF-C estimulan la migración de células endoteliales en gel de colágeno. Las construcciones de polipéptido quimérico de la invención se examinan para determinar si también pueden estimular la migración de células endoteliales en gel de colágeno, proporcionando así otro indicio de actividad biológica. Experimentos a modo de ejemplo de tales ensayos de migración de células se han descrito en la publicación de patente internacional nº WO 98/33917, incorporada en este documento por referencia. Brevemente, células endoteliales de capilares bovinos (BCE) se siembran en la parte superior de una capa de colágeno en placas de cultivo de tejido. Se coloca medio condicionado de las células transfectadas con un vector de expresión que produce el polipéptido quimérico candidato en pocillos hechos en gel de colágeno aproximadamente 4 mm separados de la localización de las células BCE unidas. Entonces se cuenta el número de células BCE que han migrado desde el área original de unión en el gel de colágeno hacia los pocillos que contienen el polipéptido quimérico para evaluar la capacidad del polipéptido quimérico para inducir migración de células.

Las células BCE (Folkman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:5217 5221 (1979)) se cultivan como se describe en Pertovaara y col., J. Biol. Chem., 269:6271 74 (1994). Los geles de colágeno se prepararan mezclando disolución madre de colágeno tipo I (5 mg/ml en HCl 1 mM) con un volumen igual de 2x MEM y 2 volúmenes de MEM que contiene suero de bovino recién nacido al 10% para dar una concentración de colágeno final de 1,25 mg/ml. Las placas de cultivo de tejido (5 cm de diámetro) están recubiertas con aproximadamente 1 mm de espesor de capa de la disolución, que se deja polimerizar a 37ºC. Las células BCE se siembran encima de esta capa.

Para los ensayos de migración, las células se dejan que se unan dentro de un anillo de plástico (1 cm de diámetro) situado en la parte superior de la primera capa de colágeno. Después de 30 minutos, el anillo se quita y las células sin unir se eliminan aclarando. Se añaden una segunda capa de colágeno y una capa de medio de crecimiento (suero de bovino recién nacido al 5% (NCS)), solidificada por agar al 0,75% de bajo punto de fusión (FMC BioProducts, Rockland, ME). Se perfora un pocillo (3 mm de diámetro) a través de todas las capas a ambos lados de la mancha de células a una distancia de 4 mm, y el medio que contiene un polipéptido quimérico de VEGF tal como VEGF-CAC (o medio solo o medio que contiene VEGF-A o VEGF-C para servir de controles) se pipetea diariamente en los pocillos. Se toman fotomicrografías de las células que migran fuera del borde de la mancha, por ejemplo, después de seis días, mediante una microscopio invertido Olympus CK 2 equipado con óptica de contraste de fase. Se cuentan las células que migran después de la tinción nuclear con el colorante fluorescente bisbencimida (1 mg/ml, Hoechst 33258, Sigma).

El número de células que migran a diferentes distancias del área original de unión hacia pocillos que contienen medio condicionado por las células no transfectadas (control) o transfectadas (con vector vacío; polipéptido quimérico; VEGF-C; o VEGF A) se determinan 6 días después de la adición del medio. El número de células que migran fuera del anillo original de unión se cuentan en cinco cuadrados de 0,5 mm x 0,5 mm adyacentes usando una rejilla de lente ocular de microscopio y aumento de 10x con un microscopio de fluorescencia. Las células que migran más de 0,5 mm se cuentan de un modo similar moviendo la rejilla en etapas de 0,5 mm.

La capacidad de un polipéptido quimérico para inducir migración de las células BCE es indicativa de actividad agonista de receptor. El número de células que migran en presencia de un polipéptido quimérico frente a una concentración similar de VEGF-A o VEGF-C proporciona una indicación de la potencia de la actividad agonista. Los polipéptidos que se ha mostrado que se unen a los receptores expresados sobre las células BCE, pero que son incapaces de estimular la migración, se puntúan como posibles inhibidores. La actividad inhibitoria puede ensayarse adicionalmente mezclando un agonista de receptor conocido tal como VEGF-A o VEGF-C recombinante con tanto medio solo como con medio condicionado concentrado para determinar si el medio condicionado concentrado inhibe la migración de BCE mediada por VEGF-A o mediada por VEGF-C.

EJEMPLO 5

EFECTOS IN VIVO DE FACTORES ANGIOGÉNICOS

El ensayo en membrana corioalantoidea (CAM) descrito en, por ejemplo, Oh y col., Dev Biol 188:96 109 (1997), incorporado en este documento en su totalidad, es un procedimiento comúnmente usado para examinar los efectos in vivo de factores angiogénicos. Usando este ensayo se ha mostrado que los factores de crecimiento VEGF que incluyen tanto VEGF-A como VEGF-C inducen el desarrollo de vasos sanguíneos [Oh y col., Dev Biol 188:96 109 (1997)]. Por tanto, este procedimiento puede usarse para estudiar las propiedades angiogénicas de los polipéptidos quiméricos de la invención.

Brevemente, en el día cuatro de desarrollo se corta una ventana en la cáscara de huevo de huevos de pollito o codorniz. Los embriones se comprueban para el desarrollo normal, la ventana en la cáscara de huevo se cierra con cinta adhesiva y los huevos se incuban hasta el día 13 de desarrollo. Se añaden aproximadamente 3,3 µg de polipéptido quimérico disuelto en 5 µl de agua destilada a cubreobjetos Thennanox (Nunc, Naperville, IL), que han sido cortados en discos con diámetros de aproximadamente 5 mm, y se secan al aire. Los discos sin proteína añadida se usan como controles. Los discos secados se aplican entonces sobre la membrana corioalantoidea (CAM) de los huevos. Después de 3 días, los discos se quitan y se fijan en glutaraldehído al 3% y formaldehído al 2% y se aclaran en tampón cacodilato de sodio 0,12 M. Los especímenes fijados se fotografían y se incorporan en resina Epon (Serva, Alemania) para seccionamiento medio (0,75 µm) y ultrafino (70 nm). Tanto las secciones medias como las ultrafinas se cortan usando un Ultracut S (Leika, Alemania). Las secciones ultrafinas se analizan por un EM 10 (Zeiss, Alemania). Entonces, los especímenes se analizan para indicios del crecimiento de nuevos capilares, que indicaría que el polipéptido quimérico que se examina puede estimular la angiogénesis. Los polipéptidos naturales de VEGF pueden usarse como controles positivos.

EJEMPLO 6

TRATAMIENTO DE TEJIDO ISQUÉMICO

El uso de polipéptidos quiméricos de la invención en el tratamiento de tejido isquémico tal como isquemia de extremidades debido a circulación insuficiente se analiza usando ensayos reconocidos. La eficacia de los polipéptidos quiméricos en tales indicaciones puede determinarse usando un modelo para isquemia. Previamente se ha descrito un modelo de conejo tal para isquemia en Bauters y col., Am J. Physiol. 267:H1263-1271, 1996; y Pu y col., J. Invest. Surgery, 7:49-60, 1994. Estos animales se anestesian y la arteria femoral de la extremidad posterior se corta de su origen proximal como una rama de la arteria ilíaca externa hasta el punto en el que se bifurca en las arterias safena y poplítea. Como resultado de este procedimiento, la circulación sanguínea a la extremidad isquémica depende de vasos colaterales que se originan a partir de la arteria ilíaca interna (Takeshita y col., Circulation, 90:II-228-II-234, 1994). El animal se deja un periodo de recuperación posoperatoria de 10 días. Durante este periodo se desarrollan vasos colaterales endógenos. Después del periodo de recuperación se determinan parámetros fisiológicos de referencia tales como la tensión arterial, circulación sanguínea intravascular, angiografía ilíaca y densidad de vasos capilares. Los procedimientos para determinar estas características fisiológicas de referencia se detallan en Witzenbichler y col. (Am. J. Path. 153:381-394, 1998).

Después de obtenerse las características fisiológicas de referencia del animal, el animal del modelo se trata con un bolo intraarterial de un polipéptido quimérico de la presente invención. Preferentemente, el bolo comprende el equivalente de 500 µg de VEGF-A en un volumen apropiado, por ejemplo, 3 ml, de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene albúmina de suero de conejo (RSA) al 0,1%. La proteína quimérica se administra durante un periodo de 1 a 5 minutos mediante un catéter posicionado en la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica. Entonces, el catéter se lava con un volumen igual de PBS que contienen RSA. Entonces, los parámetros fisiológicos tratados anteriormente se monitorizan a intervalos adecuados después de la administración de los polipéptidos quiméricos.

En una realización alternativa, el modelo isquémico se trata usando terapia génica con tanto ADN desnudo que comprende polinucleótidos que codifican los polipéptidos quiméricos de la presente invención como, preferentemente, con vectores de terapia génica descritos en este documento que codifican un polipéptido quimérico de la presente invención. Se prefieren particularmente los vectores de terapia génica adenovírica. En tales realizaciones de terapia génica, la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica del animal se transfecta con el ADN desnudo o el vector adenovírico u otra terapia génica usando, por ejemplo, un catéter con balón de 2,0 mm (Slider con Hydroplus, Boston Scientific, MA). El balón de angioplastia se prepara preferentemente ex vivo avanzando primero el balón desinflado a través de una vaina de teflón (Boston Scientific) y aplicando la composición de terapia génica a la capa de hidrogel que recubre la superficie externa del balón inflado. Entonces, el balón se retrae dentro de la vaina protectora. La vaina y el catéter de angioplastia se introducen por la arteria carótida derecha y avanzan a la aorta abdominal inferior usando un alambre guía apropiado. El catéter con balón avanza a la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica y se infla para administrar localmente la composición de terapia génica en la extremidad isquémica. Entonces, el catéter con balón se desinfla y se saca.

Los procedimientos anteriores pueden realizarse con controles que comprenden composición no relacionada con VEGF y controles positivos que comprenden VEGF-A, VEGF-C o VEGF-D.

Los estudios anteriores se describen con respecto a un modelo de conejo para isquemia. Estudios similares pueden realizarse en modelos de enfermedad cardiaca isquémica tales como aquellos descritos por Kastrup y col., (Curr. Gene Ther., 3(3):197-206, 2003) y Khan y col., (Gene Ther. 10(4):258-91, 2003).

EJEMPLO 7 TRANSFERENCIA GÉNICA DE VEGF-CAC PARA PREVENIR REESTENOSIS

El siguiente experimento se realiza in vivo en un modelo de reestenosis de conejo para demostrar la eficacia de las composiciones para la prevención de reestenosis posangioplastia.

Un primer grupo de conejos se alimenta con una dieta rica en colesterol al 0,25% durante dos semanas, luego se someten a desnudamiento con balón de la aorta, luego se someten tres días después a las composiciones terapéuticas que van probarse. Los animales se sacrifican 2 ó 4 semanas después del inicio de la terapia. Las composiciones que van a probarse incluyen VEGF-C, o VEGF-D o composiciones quiméricas de la invención tales como VEGF-CAC tanto sola como en combinación con un inhibidor de PDGF (por ejemplo un anticuerpo α-PDGF-A; anticuerpo α-PDGF-B, anticuerpo α-PDGF-C, anticuerpo α-PDGF-D, un anticuerpo α-PDGFR-alfa o un anticuerpo αPDGFR-beta o una molécula de ARN interferente corta dirigida a uno o más de estas dianas) o con uno o varios inhibidores del crecimiento celular de músculo liso. Se contempla terapia con polipéptidos o terapia génica. Como control de la terapia génica, el vector de elección lleva el gen LacZ.

En el primer grupo de conejos, la aorta completa, empezando desde la punta del arco, se desnudó usando un catéter de embolectomía arterial 4,0 F (Sorin Biomedical, Irvine, CA). El catéter se introduce por la arteria ilíaca derecha hasta el arco aórtico y se infla, y la aorta se desnuda dos veces.

Tres horas antes del sacrificio, los animales se inyectan intravenosamente con 50 mg de BrdU disuelto en etanol al 40%. Después del sacrificio se elimina el segmento aórtico en el que se había realizado la transferencia génica, se lava cuidadosamente con solución salina y se divide en cinco segmentos iguales. El segmento proximal se congela criogénicamente en nitrógeno líquido y se guarda a -70ºC. El siguiente segmento se fija por inmersión en paraformaldehído al 4% / sacarosa al 15% (pH 7,4) durante 4 horas, se aclara en sacarosa al 15% (pH 7,4) durante la noche y se incorpora en parafina. El segmento medial se fija por inmersión en paraformaldehído al 4% / solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) durante 10 minutos, se aclara 2 horas en PBS, se incorpora en compuesto OCT (Miles) y se guarda a -70ºC. El cuarto segmento se fija por inmersión en etanol al 70% durante la noche y se incorpora en parafina. El segmento distal se tiñe directamente para actividad de β-galactosidasa en disolución de tinción X-GAL a +37ºC durante 16 horas, se fija por inmersión en paraformaldehído al 4% / sacarosa al 15% (pH 7,4) durante 4 horas, se aclara en sacarosa al 15% durante la noche y se incorpora en parafina. Las secciones de parafina se usan para la detección inmunocitoquímica de células de músculo liso (SMC), macrófagos y endotelio. Las células positivas para BrdU se detectan según instrucciones del fabricante. El análisis morfométrico se realizó usando secciones de parafina teñidas con hematoxilina-eosina usando un software de análisis de imágenes. La relación de íntima/medio (I/M) se usa como parámetro para el engrosamiento de la íntima.

Se realiza el análisis histológico de los ratones desnudados con balón. Las composiciones que son eficaces en la inhibición de reestenosis revelarán que grupos de control (es decir, aquellos grupos sin las composiciones que comprenden las composiciones relacionadas con VEGF-CAC) tienen una relación I/M que es superior a la relación de aquellos animales tratados con las composiciones terapéuticas basadas en VEGF-CAC.

El marcado con BrdU permitirá el análisis de la proliferación de células de músculo liso en animales tratados frente a control. Se espera que se reduzca la proliferación de SMC en la población tratada. Una descripción más detallada de ensayos y composiciones para tratar reestenosis está contenida en la solicitud internacional nº PCT/US99/24054 publicada como el documento WO 00/24412, cuya la divulgación se incorpora en este documento por referencia en su totalidad.

EJEMPLO 8

EFECTOS DE LA TERAPIA GÉNICA DE VEGF-CAC EN NEURONAS MOTORAS

Este ejemplo demuestra la administración de polipéptidos quiméricos de VEGF tales como VEGF-CAC a un modelo de ratón con esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Los ratones 'con genes activados' para VEGF, en los que está eliminada la secuencia de elementos de respuesta a hipoxia en el promotor de VEGF, tienen un potencial alterado para regular por aumento niveles de VEGF en condiciones de estrés. Estos ratones desarrollan neuropatología similar a ELA (Oosthuyse y col., Nature Genet., 23:131-138 (2001), sugiriendo que las neuronas motoras son particularmente sensibles a reducciones en los niveles de VEGF. También se ha informado que VEGF tiene efectos favorables sobre la neuropatía isquémica en ratones (Schratzberger, P. Nat. Med., 6:405-413 (2000). El siguiente ejemplo se realiza para demostrar los efectos de la transferencia génica de VEGF-CAC a neuronas motoras, que puede ralentizar la degeneración de neuronas motoras en ratones SOD1G93A . El protocolo se realiza como se describe en Azzouz y col., Nature, 429:413-417 (2004), incorporado en este documento por referencia.

Modelo animal. Se usan ratones transgénicos que expresan en exceso SOD1 humano que lleva una mutación Gly93-Ala (Gurney y col., Science, 264:1772-1775, 1994). Esta línea de ratones tiene la forma de alta expresión del SOD 1 mutante y los animales desarrollan la aparición de enfermedad a aproximadamente 90 días de edad y mueren aproximadamente 30 días después. La progenie transgénica se identifica por PCR usando cebadores específicos para SOD1 humano (Gurney y col., antes).

Producción vírica. Se construyen genomas de vectores autoinactivantes de EIAV a partir de vectores pONY8.0Z o pONY8.0G como se ha descrito previamente (Mazarakis y col., Hum. Mol. Genet., 10:2109-2121, 2001; Azzouz y col., J. Neurosci., 22:10302-10312, 2002). El ADN complementario que codifica el gen indicador LacZ o VEGF-CAC se clona en el vector de transferencia de EIAV y se generan EIAV-VEGFCAC-IRES-GFP. Se prepararon reservas de vectores víricos pseudotipados con glicoproteína G de la rabia usando el sistema transitorio HEK293T como se ha descrito previamente (Mazarakis y col., Hum. Mol. Genet., 10:2109-2121, 2001; Mitrophanous y col., Gene Ther., 6:1808-1818,1999). Los títulos (~1 x 109 TUml-1) de vectores víricos EIAV-LacZ concentrados se estiman por transducción de células D17. Los títulos (~ 7 x 108 a 3 x 109 TUml-1) de los vectores EIAV-VEGFCAC o EIAVVEGFCAC-IRES-GFP se estiman usando reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-PCR) mediante comparación con vectores EIAV-LacZ y se normalizan para ARN vírico (Rohll y col., Methods Enzymol., 346:466-500, 2002; Martin-Rendon y col., Mol. Ther., 566,570, 2002).

ELISA de VEGF. Se transducen células D17 de osteosarcoma de perro en presencia de 8 mg/ml de polibreno como se ha descrito previamente (Mitrophanous, antes). Las células se transducen tanto con vectores EIAV-VEGFCAC como EIAV-LacZ. Las células transducidas se someten a pases tres veces antes del análisis de expresión transgénica. Una semana después de la transducción, los sobrenadantes se recogen y se miden los niveles de VEGF-CAC por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) (R&D Systems). Para determinar los niveles de VEGFCAC en plasma se recoge sangre en tubos a vacío de 10 ml que contienen 100 µl de una disolución de citrato de trisodio al 4%, se centrifugan rápidamente y las fracciones de plasma se guardan a -80ºC hasta el análisis. Las mediciones del ensayo de ELISA de VEGF-CAC también se llevaron a cabo usando muestras de tejido de la médula espinal y el tronco encefálico.

Administración de vector vírico. Se inyectan bilateralmente vectores lentivíricos pseudotipados con rabia G que llevan genes VEGF-CAC o LacZ humanos en los músculos gastrocnemio de la extremidad posterior, facial, diagrama, de la lengua e intercostal de ratones transgénicos SOD1 antes de y en la aparición de la enfermedad. El primer grupo de ratones SOD1 recibe inyecciones de EIAV-VEGFCAC-IRES-GFP (n = 7) a los 21 días de edad. El grupo de control se trata con el vector EIAV-LacZ (n =6). El segundo conjunto de animales se inyecta en la aparición de la enfermedad (ratones de 90 días de edad) con EIAV-VEGFCAC (n = 7) y el control EIAV-LacZ (n = 7). Cada ratón se inyecta con una dosificación total de 90 µl de disolución vírica. Se inyectan seis sitios por músculo de la extremidad trasera con 5 µl por sitio.

Histología e inmunohistoquímica. Los animales se perfunden transcárdicamente con disolución de NaCl al 0,9% seguido de paraformaldehído al 4% frío en hielo. Se diseccionan los tejidos de la médula espinal, el cerebro y el músculo y se fijan posteriormente durante la noche en la misma disolución y luego se transfieren a sacarosa al 30%. Los tejidos se analizan por inmunohistoquímica y reacción con X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactósido).

Análisis de comportamiento. Una tarea en cilindro rotatorio de los ratones SOD1 por un instrumento Economex Rotarod (Colombus Instruments) se analiza cada diez días durante la fase de luz del ciclo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad. Se realizan tres ensayos y se registra la duración más larga en el cilindro para cada ratón. El temporizador se detiene cuando los ratones se caen del cilindro o después de un límite arbitrario de 180 segundos. También se realiza el análisis de las huellas. Las patas traseras del ratón se cubren con tinta para registrar los patrones de marcha durante la locomoción continua, y se mide la longitud del paso.

Se indica un beneficio terapéutico por el aumento de la supervivencia de neuronas motoras en ratones que reciben la terapia génica de VEGF-CAC, en comparación con controles.

EJEMPLO 9

INDUCCIÓN DE CRECIMIENTO IN VIVO DE VASOS LINFÁTICOS Y/O SANGUÍNEOS EN PIEL DE RATONES TRANSGÉNICOS

Los experimentos se realizan en ratones transgénicos para analizar los efectos específicos de la expresión en exceso de polipéptidos quiméricos en tejidos. Los efectos fisiológicos in vivo proporcionan una indicación del perfil de activación/inhibición de receptores y una indicación de la posible acción terapéutica de un polipéptido quimérico. En una variación, el promotor de queratina K14 humano que es activo en las células basales de epitelios escamosos estratificados [Vassar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:1563-1567 (1989)] se usa como elemento de control de la expresión en el transgén de polipéptido quimérico recombinante. El vector que contiene el promotor de la queratina K14 se describe en Vassar y col., Genes Dev., 5:714-727 (1991) y Nelson y col., J. Cell Biol. 97:244-251 (1983).

Se aísla un fragmento de ADN que contiene el promotor K14, polipéptido quimérico que codifica ADNc y la señal de poliadenilación de K14 y se inyecta en ovocitos fecundados de la cepa de ratón FVB-NIH. Los cigotos inyectados se trasplantan en oviductos de ratones híbridos C57BL/6 x DBA/2J pseudopreñados. Entonces, los ratones que resultaron positivos resultantes se analizan para la presencia del transgén mediante reacción en cadena de la polimerasa de ADN de la cola usando cebadores apropiados o por análisis de Southern.

Entonces, estos ratones transgénicos se examinan para indicios de angiogénesis o linfangiogénesis en la piel, tal como la linfangiogénesis observada en ratones transgénicos que expresan en exceso VEGF-C [véase, publicación internacional WO98/33917]. El examen histológico de ratones transgénicos K14-VEGF-C mostró que, en comparación con la piel de compañeros de camada no manipulados genéticamente, la dermis dorsal era atrófica y el tejido conjuntivo estaba sustituido por grandes lagunas carentes de eritrocitos, pero revestido con una fina capa endotelial. Estas estructuras similares a vasos distendidas se parecieron a las observadas en linfangiomas humanos. Se redujo el número de órganos anexos a la piel y folículos pilosos. En la región del hocico también se observó un aumento del número de vasos.

El examen de los vasos en la piel de los ratones transgénicos usando anticuerpos que reconocen proteínas específicas para tanto vasos sanguíneos como linfáticos puede verificar adicionalmente la identidad de estos vasos. Los tipos de colágeno IV, XVIII [Muragaki y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8763-8776 (1995)] y la laminina se expresan en células endoteliales vasculares, mientras que las desmoplaquinas I y II (Progen) se expresan en células de endotelios linfáticos. Véase Schmelz y col., Differentiation, 57: 97-117 (1994).

Además, las moléculas quiméricas pueden coexpresarse con Ang-1 u otros miembros de la familia de VEGF/PDGF para modular el crecimiento de nuevos vasos.

EJEMPLO 10

ENSAYO PARA DETERMINAR LA MODULACIÓN DE MIELOPOYESIS

La expresión en exceso de VEGF-C en la piel de ratones transgénicos de VEGF-C de K14 restablece una correlación con una alteración distinta en poblaciones de leucocitos [véase, publicación internacional WO98/33917, incorporada en este documento por referencia]. Notablemente, las poblaciones medidas de neutrófilos aumentaron marcadamente en los ratones transgénicos. Los efectos de los polipéptidos quiméricos sobre la hematopoyesis pueden analizarse usando análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia usando anticuerpos que reconocen proteínas expresadas en poblaciones de células de leucocitos específicas. Las poblaciones de leucocitos se analizan en muestras de sangre tomadas de los ratones transgénicos F1 descritos anteriormente y de sus compañeros de camada no transgénicos. Las alteraciones en las poblaciones de leucocitos tienen numerosas indicaciones terapéuticas tales como estimular una respuesta inmunitaria en patógenos, recuperación del sistema inmunitario tras quimioterapia u otra terapia supresora o, en el caso de inhibidores, inmunosupresión beneficiosa (por ejemplo, para prevenir la enfermedad de injerto frente a huésped o trastornos autoinmunitarios). Se contempla específicamente el uso de moléculas de la invención para estas indicaciones terapéuticas. El uso de anticuerpos que reconocen diversas poblaciones de citoblastos o células progenitoras permite la evaluación del efecto de polipéptidos quiméricos de la invención sobre tales tipos de células.

EJEMPLO 11

MIGRACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES Y GERMINACIÓN DE MICROVASOS

En este ejemplo se compara el efecto de las construcciones quiméricas de PDGF de la invención sobre la migración y proliferación de células endoteliales (EC) con el de VEGF (que principalmente afecta a células endoteliales [Senger, D. R. y col., Am. J. Patol. 149:293-305. (1996)]), PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC (que principalmente afectan a fibroblastos y células de músculo liso [Heldin, C. H. & Westermark, B. Physiol. Rev. 79:1283-1316 (1999); Li y col., Nat. Cell. Biol., 2:302-309, 2000]) y PDGF-DD. Se realizan ensayos de migración, proliferación y anillo aórtico.

A. Ensayos de migración de células

Los ensayos de migración de células se realizan en células HMVEC o BAEC confluentes de crecimiento detenido. Se hieren monocapas de células con una varilla de vidrio con punta de caucho y se lavan con medio sin suero. Entonces, las placas se incuban durante 20 horas en medio sin suero que contiene las construcciones quiméricas VEGF165, PDGF-AA, -BB, -CC o -DD o PDGF. Cada ensayo incluye dos placas por condición y se repite tres veces independientemente. Las células se fotografían a un aumento de 40x y el porcentaje de migración correspondiente a la relación entre el área de las células y el área total de la herida (Biocom visiol@b 2000 versión 4.52, San Diego). Para el ensayo de migración de células se usa la prueba de Dunett de ANOVA para analizar datos, con P<0,05 considerada estadísticamente significativa. Los datos se presentan como media +/-EEM.

PDGFR-α. La expresión en las células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) se confirma por transferencia Western. Las construcciones quiméricas de VEGF y PDGF, pero no PDGF-AA o PDGF-BB, estimulan la migración de células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) y células endoteliales de aorta bovina (BAEC).

B. Ensayo de proliferación

Para el ensayo de proliferación de HMVEC, las células se siembran en placas de 96 pocillos (5 pocillos por condición) y se incuban con la construcción quimérica PDGF-AA, PDGF-BB o PDGF (50 ng/ml) después de privación de suero. Después de 7 días se cuentan las células viables usando el ensayo viabilidad de células luminiscentes cellTiter-glo (Promega). Para el ensayo de proliferación de NIH-3T3 y hSMC, las células cultivadas en placas de 96 pocillos se privan de suero durante la noche, seguido de tratamiento con factores de crecimiento a diferentes concentraciones. Dos días después se cuentan los números de células y se calcula el porcentaje de proliferación usando células cultivadas en medio que contiene suero al 10% como control.

C. Ensayo de anillo aórtico

El ensayo de anillo aórtico es un medio de evaluación de la excrecencia de microvasos a partir de un vaso intacto in vitro [Blacher, S. y col., Angiogenesis 4:133-42 (2001)]. El ensayo se realiza como se describe en [Blacher, S. y col., Angiogenesis 4:133-42 (2001)]. Brevemente, anillos aórticos de un milímetro de largo se incorporan en geles de colágeno intersticial de cola de rata y se cultivan a 37ºC complementados con diferente tipo natural de factores de crecimiento quiméricos (50 ng/ml). Los experimentos incluyen tres explantes por condición y se repiten al menos dos veces. Los anillos aórticos se fotografían a un aumento de 25x.

En el día 9 después del cultivo, los microvasos y la distancia de su excrecencia a partir del anillo aórtico se cuantifican y se evalúan usando la prueba de la t de Student. Específicamente se usa la prueba de la t de Student de dos colas para el análisis de datos, con P<0,05 considerada estadísticamente significativa. Para el ensayo de migración de células se usa la prueba de Dunett de ANOVA para analizar los datos, con P<0,05 considerada estadísticamente significativa. La cuantificación de la excrecencia de brotes microvasculares y células similares a fibroblastos perivasculares se realiza usando morfometría asistida por ordenador.

EJEMPLO 12

USO DE TERAPIA DE VEGF-CAC EN CIRUGÍA RECONSTRUCTIVA TRAS UNA QUEMADURA GRAVE U OTRO TRAUMATISMO DE LA PIEL

El siguiente ejemplo describe un procedimiento y administración de una construcción quimérica tal como VEGF-CAC a tejido traumatizado por una quemadura para mejorar la curación tras la cirugía reconstructiva. Las víctimas de quemaduras frecuentemente requieren amplias intervenciones quirúrgicas que incluyen injertos de piel sustanciales para restaurar el tejido lesionado. El siguiente ejemplo proporciona un procedimiento para mejorar la curación de tejido tras la cirugía reconstructiva para una quemadura u otro traumatismo de la piel.

A. Animales y preparación de la piel

Se ha mostrado que conejos blancos de Nueva Zelanda son apropiados para estudios de quemaduras (Bucky y col., Plast. Reconstr. Surg., 93(7):1473-1480 (1994)). Además, las características estructurales de las capas de la piel en conejos y seres humanos son similares. Tres días antes de la operación, los lomos de 10 conejos blancos de Nueva Zelanda se depilan con una crema depilatoria. Como el espesor de la piel depende de la fase de su ciclo de crecimiento de pelo, la estimación del patrón de crecimiento de pelo se evalúa cuidadosamente. Inmediatamente antes de causar la lesión por quemadura, el área de operación se depila una segunda vez para lograr una superficie de piel suave y sin pelo.

B. Técnica operativa

Los conejos se sedan por administración intramuscular de ketamina (25 mg/kg de masa corporal) como se describe en la materia (Knabl y col., Burns, 25:229-235 (1999)). Un hierro de soldar con un sello de contacto de aluminio ajustable se usa para causar la quemadura. La temperatura del sello se fija a 80ºC y se monitoriza continuamente. Las quemaduras se causan en la piel dorsal de los conejos durante aproximadamente 14 segundos usando sólo el peso del sello (aproximadamente 85 g). Entonces, las heridas se enfrían inmediatamente con termoelementos que proporcionan una temperatura coherente de 10ºC durante 30 minutos (Knabl y col., antes).

Para minimizar el hecho de que diferentes partes del cuerpo con diferente espesor de piel tienen diferentes potenciales de re-epitelización y curación se usa el mismo sitio donante en los animales. Por tanto, cualquier diferencia observada podría atribuirse al propio tratamiento en vez de a otras variables. Se usa un Padget Electric Dermatome para recoger un injerto de piel de 0,12 pulgadas (0,3 cm) de grosor del muslo depilado en todos los animales. El injerto se extiende cuidadosamente sobre el área de la quemadura. Se mantiene en el sitio tanto por una ligera presión de un vendaje bien acolchado como por unos pocos puntos pequeños. El área donante bruta se cubre con un vendaje no adherente estéril durante 3-5 días para protegerlo de la infección hasta que se observe la re-epitelización completa.

Se inyectan intradérmicamente 1x109 ufp de AdVEGF, AdVEGF-CAC, AdVEGF-C y AdLacZ en la piel dorsal al sitio de quemadura de los conejos. La construcción de AdVEGF se ha descrito previamente (Makinen y col., antes) y los vectores AdVEGF-CAC, AdLacZ se construyen como se describe en este documento. La reducción del edema y el aumento en la perfusión de la piel en un sitio de herida por quemadura como resultado de un aumento en los ganglios linfáticos funcionales se evalúa siguiendo la acumulación de dextrano fluorescente.

Adicionalmente, la curación se monitoriza evaluando el aspecto cosmético del injerto de piel. El color normal del injerto es similar al del sitio receptor. La temperatura de la superficie del injerto puede monitorizarse usando tiras adhesivas (para un número preciso) o el dorso de la mano (para proporcionar una evaluación comparativa con la piel de alrededor). Se sugieren problemas con la entrada arterial cuando el injerto está pálido con respecto al sitio donante y/o frío al tacto. Se sugieren problemas con la salida venosa cuando el injerto está congestionado y/o edematoso. El color y el aspecto de los injertos congestionados pueden variar dependiendo de si la congestión es leve o grave, y oscila de un tono tirando a rosa destacado a un color púrpura azulado oscuro.

C. Resumen

El modelo anteriormente mencionado demuestra el potencial terapéutico de usar VEGF-CAC para preservar la función de los vasos linfáticos y para mejorar la curación y reducir el edema y complicaciones posquirúrgicas concomitantes en víctimas de quemaduras. Por tanto, los procedimientos y las composiciones descritas en este documento proporcionan una importante necesidad en la materia. Específicamente, la reducción de edema o el aumento en la perfusión en un sitio de quemadura se lleva a cabo, por ejemplo, mediante la administración de AdVEGF-CAC al sitio de la herida.

EJEMPLO 13

TERAPIA CON POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS DE OTRAS CONSTRUCCIONES QUIMÉRICAS

Los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes se repiten usando una composición que comprende otras construcciones quiméricas que incluyen dominios de unión a RTK de otros miembros de la familia de VEGF/PDGF y tanto propéptidos de VEGF-C como de VEGF-D.

EJEMPLO 14

DATOS EXPERIMENTALES ADICIONALES

Este ejemplo proporciona datos experimentales adicionales para la construcción de CAC descrito en el Ejemplo 1.

Cultivo celular. Se mantuvieron células 293T y HeLa de ATCC (www.atcc.org) en DMEM (HaartBio, Helsinki, Finlandia) complementado con L-glutamina 2 mM (HaartBio), penicilina al 0,2%/sulfato de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (PromoCell, Heidelberg, Alemania). Se cultivaron células Ba/F3 (Achen y col., Eur. J. Biochem/. 267:2505-2515, 2000) en DMEM complementado con 200 µg/ml de zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y interleucina 3 de ratón recombinante (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.).

Construcciones. Se produjo un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de CAC mediante amplificación por PCR y subclonación del extremo N y extremo C de un ADNc de VEGF-C humano y el dominio de unión a RTK de un ADNc de VEGF-A humano. Se añadió una marca 6xHis al extremo C y se añadió un péptido señal de IgGk al extremo N. Se verificó la secuencia de ADNc resultante. Este ADNc se insertó en el vector pMosaic (Jeltsch y col., J. Biol. Chem., 281, 12187-95, 2006) como un fragmento BamHI-NotI. El VEGF-CAC se cortó con AgeI y ClaI, se hizo romo y se ligó en el plásmido AAV2 psub-CMV-WPRE (Witzenbichler y col., Am. J. Patol., 153:384-394, 1998; Marconcini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9671-9676, 1999).

El ADNc para VEGF-A109, que comprende 109 aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A, se amplificó con los cebadores 5'-GCGGATCCGGGGCAGAATCATC ACGAAGTGGTG-3' (SEQ ID NO: 64) y 5'GCGGATCCCTAATCTTTC TTTGGTCTACATTCACAT-3' (SEQ ID NO: 65) usando el plásmido AAV2 CAC/psub-CMV-WPRE como molde. El fragmento de ADNc obtenido se digirió con BamHI y se clonó en el sitio BamHI del vector pMosaic.

Transfecciones e inmunoprecipitaciones. Se transfectaron células 293T con psub-CMV/CAC, psub-CMVNEGF-A165, psub-CMV/VEGF-A109, pEBS7/VEGF-C(fl) o el vector pEBS7/CMV usando JetPEI (Qbiogene, Irvine, CA, EE.UU.). Las células transfectadas se cultivaron durante 48 horas y se marcaron metabólicamente en medio Eagle modificado sin metionina y sin cisteína (HaartBio) complementado con [35S]metionina y [35S]cisteína (Redivue ProMix, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) a 100 µCi/ml durante 16 horas. Entonces se recogió el medio condicionado, se purificó de material particulado por centrifugación, se complementó con BSA al 5% y Tween 20 al 0,02%, y se incubó con anticuerpos anti-hVEGF-A (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) o anticuerpos anti-hVEGF-C (R&D Systems) o 200 ng de VEGFR-1-Ig soluble (Mäkinen y col., EMBO J., 20:4762-4773, 2001) o 200 ng de VEGFR-2-Ig soluble (Uutela, Blood, 104:3198-3204, 2004) o con proteínas de fusión neuropilina-Ig solubles con o sin adición de 10 µg/ml de heparina (Gibco BRL/Invitrogen). Las proteínas de fusión neuropilina-Ig se produjeron en células 293T transitoriamente transfectadas usando NP1-Ig (Karpanen y col., FASEB J., 20:1462-1472 (2006) y NP2-Ig (Karkkainen Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 98:12677-12682, 2001) como se ha descrito previamente. Entonces, los inmunocomplejos formados se unieron a proteína A-Sepharose o proteína G-Sepharose (Amersham Biosciences), seguido de lavado tres veces con albúmina de suero bovino al 0,5% y Tween 20 al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con PBS. Las proteínas se separaron mediante SDS al 12%-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras y se visualizaron por autorradiografía.

Análisis de seguimiento de pulso. Células 293T transitoriamente transfectadas se marcaron metabólicamente en medio Eagle modificado sin metionina y sin cisteína complementado con [35S]metionina y [35S]cisteína (Redivue ProMix) a 100 µCi/ml durante 30 min y luego se siguieron en DMEM no radiactivo durante diferentes periodos de tiempo. Los medios condicionados se complementaron con BSA al 5% y Tween 20 al 0,02% y se inmunoprecipitaron usando anticuerpos anti-VEGF-C humano (R&D Systems). Los inmunocomplejos se analizaron como antes bajo condiciones reductoras. El cultivo transfectado con vector vacío se analizó sólo después de 24 horas del periodo de seguimiento.

Bioensayo para la supervivencia celular mediada por factor de crecimiento. Para el bioensayo de Ba/F3, células HeLa se transdujeron (MOI 100) con Ad-CAC, Ad-VEGF109, Ad-VEGF165 y Ad-LacZ. 24 horas después de la transducción, las células se privaron de suero durante 16 horas, tras lo cual se recogió el medio, se centrifugó a 2500 rpm durante 5 minutos y se guardó a 4ºC. Para comparar niveles de expresión en diferentes construcciones, 100 µl de medio condicionado se mezclaron con 25 µl de 5x LSB, se calentó durante 5 minutos a 95ºC y se separó en geles de SDS al 12%-PAGE (Ready-Gel, Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon con PBA al 5% y se incubaron con un anticuerpo primario (AF293NA). Como anticuerpos secundarios se usaron HRP de conejo anti-biotina de cabra y biotinilada con estreptavidina. Las proteínas se visualizaron usando el reactivo Femto ECL (Amersham).

Se sembraron células Ba/F3 que expresan el receptor quimérico VEGFR-1/EpoR o VEGFR-2/EpoR (Achen y col., Eur. J. Biochem., 267:2505-2515, 2000) en placas de 96 pocillos a 20.000 células/pocillo por triplicado, suministradas con medio condicionado de células HeLa a diferentes diluciones. La viabilidad celular se cuantificó por un ensayo colorimétrico después de 48 horas. Brevemente, se añadieron 0,5 mg/ml de MTT (bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. La reacción se terminó añadiendo 100 ul de tampón de lisis (SDS al 10%, HCl 10 mM) y los productos de formazano resultantes se solubilizaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera húmeda. La absorbancia a 540 nm se midió usando un lector de placas de microtitulación Multiscan (Thermo Labsystems, Milford, MA).

Producción y análisis de vectores adenovíricos. Los ADNc que codifican VEGF-CAC y VEGF-A109 se clonaron en el vector pAdBglII y se produjeron adenovirus recombinantes como se ha descrito previamente (Laitinen y col., Hum. Gene Ther., 9:1481-1486, 1998). Para el análisis de la producción de proteínas, células HeLa se transdujeron con los adenovirus (AdCAC, Ad VEGF-A165, AdVEGF-A109 o AdLacZ con MOI 100). La expresión de las proteínas recombinantes se examinó por marcado metabólico e inmunoprecipitación seguido de análisis por SDS al 12%PAGE como se ha descrito anteriormente. Después de SDS-PAGE, las bandas se visualizaron por autorradiografía.

Análisis in vivo de vectores adenovíricos. Se inyectaron subcutáneamente aproximadamente 2×108 ufp de AdVEGF-CAC, AdVEGF-A165, AdVEGF-A109 o AdLacZ en las orejas de ratones NMRI nu/nu (Taconic Europe, Mollegaard, Dinamarca). Dos semanas después de la transducción de genes adenovíricos, los ratones se anestesiaron y entonces se perfundieron con PFA al 1% durante 2-3 minutos. Las orejas se recogieron, se sumergieron en paraformaldehído al 4% durante 2 horas y se diseccionaron para la tinción del montaje completo.

Alternativamente, las orejas se incorporaron en medio OCT (Tissue Tek, Sakura Finetek, Zoeterwoude, Los Países Bajos), se congelaron y se cortaron en secciones de 20 µm. Los tejidos se bloquearon con suero de cabra o mono normal al 5% en Triton-X100 al 0,3% (Fluka Biochemika, Steinheim, Suiza) en PBS. Para la tinción de vasos sanguíneos en la oreja, los tejidos se incubaron durante la noche con anticuerpos monoclonales de hámster antiPECAM-1 (CD31) de ratón (clon 2H8, MAB-13982Z, Chemicon, Temecula, CA).

Los vasos sanguíneos perfundidos se visualizaron inyectando ratones con 1 mg de lectina de Lycopersicon esculentum conjugada con FITC (VectorLabs, Burlingame, CA), seguido de fijación por perfusión con PFA al 1%. Las membranas basales de los vasos sanguíneos se tiñeron con anticuerpos monoclonales de rata contra nidogen/entactina (Chemicon), mientras que los vasos linfáticos se visualizaron con un antisuero de conejo contra LYVE-1 (Karkkainen y col., Nat. Immunol., 5:74-80, 2004). Los anticuerpos para F4/80 (Serotec, Oxfordshire, RU) y CD45 (BD Pharmingen) se usaron para detectar macrófagos y células hematopoyéticas, respectivamente, en secciones congeladas. La incubación con el anticuerpo primario se siguió mediante incubación durante la noche con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos apropiados (Alexa 488, Alexa594 o Alexa633, Molecular Probes, Eugene, OR; o FITC, Jackson ImmunoResearch, Bar Harbor, ME). Las muestras fluorescentemente marcadas se montaron con Vectashield (VectorLabs) y se analizaron con un microscopio de fluorescencia compuesto (Zeiss 2, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania; objetivo 10x con apertura numérica 0,30) o un microscopio confocal (Zeiss LSM 510, objetivos 40x con NA 1,3 y 63x con NA 1,4) usando barrido multicanal en modo de marco. Las proyecciones tridimensionales se construyeron digitalmente a partir de pilas z confocales.

Para estudiar colateralmente el crecimiento de arterias, músculos semimembranosos de la extremidad trasera de conejo se transfectaron adenovíricamente con virus con AdCAC, AdA165 y AdLacZ como se ha descrito previamente (Rissanen y col., Circ. Res., 92:1098-1106, 2003). También se llevaron a cabo inyección con azul de Evans y tinción histológica con CD31 como en Rissanen y col.(antes).

Resultados. Las construcciones de VEGF-CAC que comprenden el dominio de unión a RTK de VEGF-A y los propéptidos del extremo amino y carboxilo de VEGF-C se construyeron con el fin de demostrar los efectos de los propéptidos de VEGF-C sobre las propiedades de VEGF. Como era de esperar, se encontró que la proteína VEGFCAC producida por células 293T transitoriamente transfectadas se unía a VEGFR-1 y -2, además de a neuropilina 1 y 2. La heparina afectó enormemente la unión, y la interacción especialmente con neuropilina 2 fue casi inexistente en ausencia de heparina. La proteína VEGF-A109, que consiste en el dominio de unión al receptor mínimo, pudo unirse a VEGFR-1 y VEGFR-2, pero su unión a receptores de neuropilina fue débil. La heparina potenció algo la unión a neuropilina 1, dejando la interacción todavía extremadamente débil. VEGF-A165 se unió tanto a receptores de VEGF como a neuropilinas como era de esperar. En SDS-PAGE no reductora, el polipéptido de VEGF-CAC de longitud completa migró como 94 kD, que indica que el factor formó dímeros ligados por disulfuro.

La actividad del VEGF-CAC producido se probó en bioensayos de Ba/F3-VEGFR-1 y Ba/F3-VEGFR-2. VEGF-A165 y VEGF-A109 se usaron como controles y su actividad se comparó con la de VEGF-CAC. Los niveles de expresión de estos factores de crecimiento en medio condicionado fueron iguales. El medio de células HeLa transducidas con AdVEGF-CAC y AdVEGF-A165 activó VEGFR-1 y VEGFR-2 en diluciones similares, pero no activó VEGFR-3. VEGF-A109 pareció ser un mejor inductor del crecimiento celular de VEGFR-1/BpoR o VEGFR-2/EpoR que VEGFCAC o VEGF-A165.

Con el fin de ensayar la actividad biológica de VEGF-CAC in vivo, AdCAC se inyectó en las orejas de ratones sin pelo y en el músculo esquelético de la extremidad trasera de conejo. Dos semanas después de la transducción génica se observó un marcado hinchamiento y eritema en las orejas transducidas con AdVEGF-CAC, mientras que tales efectos no se observaron en orejas tratadas con AdLacZ. La tinción fluorescente del montaje completo de orejas transducidas con AdVEGF-CAC reveló una extensa hiperplasia de endotelio positivo para PECAM-1, mientras que los capilares se distendieron y sus luces se alargaron cuando se compararon con controles. También se observó hiperplasia circunferencial de las arterias y venas más grandes de la oreja. No se observaron efectos similares en orejas tratadas con el virus de control. AdVEGF-CAC también produjo un alargamiento de capilares en músculo esquelético de conejo. La inyecciones con azul de Evans en extremidades traseras transducidas revelaron que AdVEGF-CAC indujo vasos menos permeables que AdVEGF-A165.

Como AdVEGF-CAC indujo un destacado aumento en estructuras similares a vasos positivas para PECAM-1, también se estudió el posible aumento en el número de vasos sanguíneos funcionales. Las preparaciones del montaje completo de orejas transducidas con AdVEGF-CAC se tiñeron con anticuerpos para nidogen (también conocido como entactina) y PECAM-1 mostró un aumento masivo en tubos de la membrana basal que contenían células endoteliales cuando se comparó con controles, que indica organización de células endoteliales en vasos.

También se estudió la funcionalidad de los nuevos vasos formados después de AdVEGF-CAC. Los ratones se inyectaron intravenosamente con lectina de Lycopersicon esculentum (tomate) fluorescente que se une a N-acetil-Dglicosaminoglicano, un marcador específico para células endoteliales de vasos sanguíneos (BEC) con el fin de visualizar vasos sanguíneos perfundidos. Las orejas transducidas con AdVEGF-CAC mostraron un marcado aumento en el número de vasos positivos para lectina cuando se comparó con control, aunque algo del endotelio positivo para PECAM-1 permaneció negativo para lectina. La cuantificación de la densidad del área (Baffert y col., Circ. Res. 94:984-992; Tammela y col., Blood, 105:4642-4648, 2005) de vasos positivos para lectina de preparaciones de montaje completas mostró un aumento de 2,8 veces en vasos perfundidos en orejas transducidas con AdVEGF-CAC en comparación con el control, mientas que el área de vasos positivos para PECAM-1 aumentó 2,0 veces. La angiogénesis inducida por AdVEGF-CAC estuvo acompañada de hiperplasia de pericitos.

Discusión. El Ejemplo 1 desvela la generación y la caracterización biológica de un VEGF quimérico, VEGF-CAC, que comprende el dominio activador del receptor de VEGF-A y los propéptidos de VEGF-C. VEGF-CAC se secretó y se procesó idénticamente cuando se comparó con VEGF-C, sugiriendo que los sitios de escisión del extremo amino y carboxi también están sometidos a proteólisis en la quimera. VEGF-C no se une a heparina, que se sabe que interactúa con las regiones básicas de las isoformas de corte y empalme largas de VEGF-A. Sin embargo, se contempla que VEGF-C o VEGF-CAC inmaduro se asociará al entorno extracelular mediante interacciones con el propéptido del extremo C que contiene dominios similares a EGF de otras proteínas secretadas que se sabe que participan en interacciones proteína-proteína y proteína-superficie celular (Appella y col., FEBS Lett, 231:1-4, 1988).

Se ha mostrado que VEGF-A165 induce angiogénesis por un mecanismo dependiente del gradiente, caracterizado por proliferación endotelial, germinación y migración guiada (Ruhrberg y col., Gene Dev., 16:2684-2698; Gerhardt y col., J. Cell. Biol., 161:1163-1177, 2003). Esta acción coordinada es evidentemente debida a las propiedades de difusión intermedias de VEGF-A165 (Tammela y col., Cardiovasc. Res., 65:550-563, 2005). Como se indica anteriormente, el VEGF-CAC quimérico era un potente inductor de la proliferación de células quiméricas BaF3 in vitro, mientras que la expresión en exceso in vivo del factor condujo a una robusta angiogénesis que se mostró que superaba incluso la actividad angiogénica de VEGF-A165. Se contempla que este aumento en la actividad biológica es debido a la mayor solubilidad del VEGF-CAC inmaduro cuando se comparó con VEGF-A165. También se contempla que VEGF-CAC es más susceptible a la proteólisis por proteasas extracelulares tales como plasmina, conduciendo a un aumento de la tasa de liberación del dominio del núcleo de VEGF (McColl y col., J. Exp. Med., 198:863-868,2003). Simultáneamente, la arquitectura de los vasos formados en respuesta a expresión adenovírica en exceso de VEGF-CAC fue caótica y se pareció a hemangiomas en algunas localizaciones, sugiriendo que, después del procesamiento proteolítico de VEGF-CAC, el dominio del núcleo de VEGF liberado induce proliferación endotelial sin ejemplo de orientación de un modo comparable a ratones que expresan sólo la isoforma VEGF-A120 (homóloga a la isoforma VEGF-A121 humana) (Ruhrberg y col., antes). Sin embargo, en comparación con VEGFA109, la hiperplasia inducida por VEGF-CAC fue más caótica y extendida.

Además de su actividad angiogénica, se mostró que VEGF-CAC inducía dilatación circunferencial de vasos linfáticos cutáneos. En línea con los resultados se ha mostrado que la expresión en exceso de VEGF-A induce grandes vasos linfáticos hiperplásicos, Saaristo y col., FASEB J., 16:1041-1049, 2002; Nagy y col., J. Exp. Med., 196:1497-1506, 2002 y Hon y col., FASEB J., 10:1111-1113,2004). Estas señales pueden mediarse por VEGFR-2, que también se expresa por vasos linfáticos, Jeltsch y col., Science, 276:1423-1425, 1997 y Veikkola y col., EMBO J., 6:1223-1231, 2001). Es posible que los efectos de VEGF-CAC sobre vasos linfáticos pudieran ser debidos a un aumento del drenaje como resultado de hiperpermeabilidad vascular, y al reclutamiento mediado por VEGFR-1 de células inflamatorias que producen VEGF-C y VEGF-D (Schoppmann y col., Am. J. Patol., 161:947-956,2002; Cursiefen y col., Invest. Ophthamol. Vis. Sci., 45:2666-2673, 2004; Baluk y col., J. Clin. Invest., 115:247-257, 2005; Veikkola y col., EMBO J., 6:1223-1231, 2001).

EJEMPLO 15

CONSTRUCCIONES QUIMÉRICAS CUB-VEGF

El presente ejemplo describe la generación de una molécula de polipéptido quimérico designada CUB-VEGF que comprende el dominio CUB de PDGF-C o PDGF-D fusionado con un dominio de unión al receptor tirosina-cinasa (RTK) de VEGF-A. El dominio CUB se unió al extremo N de VEGF. Se generó un polinucleótido codificante para expresar el CUB-VEGF recombinantemente.

Vectores de expresión. Se clonaron ADNc humanos para la expresión de PDGF-D de longitud completa (PDGFDFL) (pb 176-1285 de SEQ ID NO: 22, número de secuencia de Genbank: AF336376) en el vector de expresión de mamífero pcDNA 3.1/V5-His A (Invitrogen) que era el dominio CUB con la región bisagra de PDGF-D (pb 176-988 de SEQ ID NO: 22, número de secuencia de Genbank: AF336376). Los diferentes CUB-VEGF (CUB271; pb 244-988 de SEQ ID NO: 22, CUB256 pb 244-943 de SEQ ID NO: 22; CUB254 pb 244-937 de SEQ ID NO: 22, todos de número de secuencia de Genbank: AF336376, fusionados con VEGF pb 100-402, Genbank NM003376) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pSecTagB (Invitrogen).

Cultivo celular, transfección y marcado metabólico. Se cultivaron células 293T en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)-suero bovino fetal al 10% (SBF). Las transfecciones de células se realizaron usando el kit de transfección JetPei (Polyplus) según las instrucciones del fabricante. Se usaron cantidades equivalentes de plásmidos de expresión sin los insertos en transfecciones con vector vacío. El marcado metabólico de las células transfectadas con construcciones de expresión se llevó a cabo mediante la adición de 200 mCi/ml de la mezcla de marcado de células in vitro Pro-Mix L-[35S] (Amersham) al medio de cultivo que carecía de cisteína y metionina, pero con SBF al 3%. Después de 6 horas, el medio se recogió, se purificó por centrifugación y se usó para inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación. Las inmunoprecipitaciones de PDGF-D y CUB271-VEGF metabólicamente marcados con 35S se llevaron a cabo usando proteínas de fusión receptor α de PDGF-Ig y receptor β de PDGF-Ig (R&D), anti-PDGF-D (R&D) y anti-myc (Invitrogen). Las proteínas producidas unidas a proteínas de fusión o anticuerpos se precipitaron usando proteína A-Sepharose (Pharmacia). Las proteínas precipitadas se analizaron usando SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Resultados. La precipitación de CUB271-VEGF marcado con myc con anti-myc demostró que se produce y se secreta. El medio que contiene CUB271-VEGF se mezcló 1:1 con medio que contiene PDGF-D de longitud completa secretado (residuos 1-370) y después de 3 horas los medios se precipitaron con PDGFR-α o PDGF-β. Los resultados indicaron que la presencia de la proteína quimérica bloqueó la unión de la forma madura de PDGF-D a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β. El experimento se repitió con cotransfección de las quimeras PDGF-DFL y CUB271VEGF y los resultados fueron similares.

EJEMPLO 16

PROCESAMIENTO PROTEOLÍTICO DE LA PROTEÍNA QUIMÉRICA CUB-VEGF

Para determinar si el dominio CUB puede escindirse cuando se liga a otra proteína homóloga se preparó una proteína quimérica PDGF-D-VEGF fusionando el dominio del factor de crecimiento de VEGF con la parte del extremo N del polipéptido de PDGF-D que contenía el dominio CUB de manera que se conservara el sitio de escisión en el extremo C del dominio CUB de PDGF-D natural. Los resultados indicaron que la proteína quimérica se escindió entre el dominio CUB y el dominio de VEGF.

El análisis detallado de las diversas fusiones mostró que la escisión se inhibió fuertemente cuando la secuencia de PDGF-D del extremo N se truncó adicionalmente de manera que se eliminó parcialmente la secuencia tribásica RKSK. Esto sugiere que el sitio de escisión principal en la proteína quimérica se localizó en esta secuencia.

EJEMPLO 17

UN POLIPÉPTIDO DE FUSIÓN DE CUB-VEGF LATENTE Y HOMODÍMEROS DEL MISMO

El dominio CUB del ADNc de PDGF-D de longitud completa se clonó en un vector que contenía el dominio del factor de crecimiento de VEGF. Esta forma de VEGF, llamada VEGF109, se clonó en el vector modificado pSecTag (Invitrogen) y se produjo una forma biológicamente activa de VEGF que puede unirse a y activar VEGFR-y VEGFR

2. Este VEGF también tiene una marca myc unida en su extremo C. Se prepararon tres clones diferentes, uno que contenía el dominio CUB y la región bisagra completa entre él y el dominio de homología con PDGF, el segundo que contenía un dominio CUB que termina en el supuesto sitio de procesamiento y el tercero que termina justo antes de este sitio.

Los clones se prepararon y se transfectaron en células 293T usando el reactivo de transfección FuGene6 (Roche). Dos días después de la transfección, el medio de cultivo se sustituyó con medio sin metionina y sin cisteína que incluía metionina y cisteína radiactivamente marcadas (35S) (Promix, Amersham). Este medio se recogió y 1 ml del mismo se usó para extraer proteínas producidas por las construcciones transfectadas. La extracción se realizó usando los anticuerpos anti-myc (Babco) en inmunoprecipitación. Los productos de proteína extraídos se separaron en geles de PAGE al 12%. Las tres construcciones produjeron productos de proteína de aproximadamente el tamaño predicho a partir de las inmunoprecipitaciones previas de los polipéptidos componentes.

Los polipéptidos observados en los geles son CUB-VEGF109 de longitud completa y VEGF109 procesado a partir del cual se ha escindido el dominio CUB. Este resultado también validó el sitio de procesamiento ya que el producto del clon que incluye el área de bisagra completa es ligeramente más grande que los otros y más grande que la proteína VEGF109 de control. La electroforesis en PAGE al 7% en condiciones no reductoras mostró que estas proteínas también forman dímeros y que parece que las proteínas CUB-VEGF109 sin procesar forman dímeros no sólo consigo mismos, sino también con la forma procesada de VEGF109. El uso de tales formas dimerizantes como inhibidores se contempla específicamente como un aspecto de la invención.

EJEMPLO 18

ACTIVIDAD DE UNIÓN A RECEPTOR DE CUB-VEGF

Los resultados indicaron que los tres productos de proteína quimérica de CUB-VEGF109 se unieron tanto a VEGFR-como a VEGFR-2. Se probó la capacidad de estas proteínas quiméricas para activar los receptores estimulando el crecimiento de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). El medio condicionado que contiene CUB(248)-VEGF109 se obtuvo para la prueba, mientras que el medio que contiene VEGF109, medio de crecimiento de células endoteliales o medio de privación se usó como controles. La prueba de proliferación celular se llevó a cabo simultáneamente en 10 pocillos, conteniendo cada uno 10.000 células; por pocillo se administraron 100 µl de medio condicionado. Después de 72 horas de incubación a 37ºC se añadieron 10 µl de una disolución 5 mg/ml de MTT y los pocillos se incubaron durante 4 horas adicionales después de que las células se lisaran en 100 µl de SDS al 10% /10 mmol/l de HCl durante la noche. La absorbancia se midió a 540 nm.

Los resultados demostraron que aunque CUB(248)-VEGF109 se unió a VEGFR-1 y VEGFR-2, no se indujo proliferación celular mediante estos receptores cuando se comparó con el medio de crecimiento completo o VEGF109. Una posible explicación podría ser que CUB(248)-VEGF109 no puede dimerizar los receptores a pesar de unirse a ellos. Por consiguiente, pueden servir de inhibidores para la activación de receptor mediada por VEGF.

EJEMPLO 19

LA PROTEÍNA QUIMÉRICA CUB-VEGF PROMOVIÓ LA HETERODIMERIZACIÓN CON PDGF-D

La co-transfección de los vectores de PDGF-D y CUB-VEGF condujo a la heterodimerización de los polipéptidos. Los polipéptidos de CUB-VEGF y PDGF-D marcados con epítope de Myc y de V5, respectivamente, se expresaron por separado o en las mismas células y se precipitaron con anticuerpos dirigidos contra las marcas de epítopes. No se produjeron dímeros de VEGF procesados. Los polipéptidos que migran a aproximadamente 105 kD representaron una proteína heterodimérica como puede deducirse de su precipitación con ambos antisueros. De forma interesante, a aproximadamente 68 kD hubo polipéptidos que precipitaron tanto con anti-V5 como con antimyc. Se cree que éste es un dímero en el que una cadena de CUB-VEGF está procesada y la otra cadena no. Las bandas también fueron visibles cuando se precipitó tanto con anti-V5 como con anti-myc.

EJEMPLO 20

ESCISIÓN DEL DOMINIO CUB DEL HETERODÍMERO CUB-VEGF/PDGF-D

Sorprendentemente, cuando las proteínas quiméricas del Ejemplo 16 se analizaron en condiciones no reductoras, muy poco de la proteína de VEGF escindida homodimérica pudo detectarse en los geles. Por el contrario, las especies principales de la proteína de CUB-VEGF fueron el dímero de longitud completa y un heterodímero entre la quimera CUB-VEGF de longitud completa y escindida. Esto sugiere que la primera escisión que separa el dominio CUB del extremo N de PDGF-D y el dominio de VEGF es eficiente, pero la segunda escisión es mucho más ineficiente después de la pérdida del primer dominio CUB. Todas las formas retuvieron la actividad de unión a VEGFR-1 y VEGFR-2.

EJEMPLO 21

LA QUIMERA CUB271-VEGF BLOQUEA LA UNIÓN DE PDGF-D A PDGFR-ALFA, PERO NO A PDGFR-BETA

La co-transfección de quimeras PDGF-DFL y CUB-VEGF demostró que la presencia de la proteína quimérica bloqueó la unión de la forma madura de PDGF-D a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β. Los resultados indicaron que la co-expresión de VEGF nativo con PDGF-D no afectó la unión de la forma madura tanto a PDGFR-α como a -β. Este resultado se confirmó produciendo CUB271-VEGF y PDGF-D por separado y mezclando los medios para determinar si CUB-VEGF bloquearía la unión de PDGF-D a PDGFR-α. Después de 3 horas de mezcla se realizó la precipitación con PDGFR-α y PDGFR-β. Los resultados confirmaron la conclusión obtenida a partir de la co-transfección: la presencia de CUB271-VEGF bloquea la unión a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β de PDGF-D.

Por tanto, se contempla que las construcciones de CUB-VEGF de la invención actuarán de antagonistas de PDGFRα y serían útiles para tratar sujetos que padecen ascitis por edema, hidrotórax, hidropericardio, edema cerebral, hidrocéfalo, glaucoma y edema pulmonar agudo, y otras enfermedades en las que el edema es un problema clínico significativo.

EJEMPLO 22

PROCESAMIENTO DE LONGITUD COMPLETA Y ACTIVIDAD DE UNIÓN A RECEPTOR DE PDGF-D

Este ejemplo proporciona los datos que indican que PDGF-D completamente procesado se une a y activa tanto PDGFR-α como PDGF-β.

Vectores de expresión. Los ADNc humanos para la expresión de PDGF-D de longitud completa (pb 176-1285 de SEQ ID NO: 22, secuencia de Genbank AF336376) y el dominio CUB de PDGF-D (pb 176-677 de SEQ ID NO: 22, secuencia de Genbank AF336376, y SEQ ID NO: 55) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA 3.1/VS-His A (Invitrogen), ADNc para PDGF-DAN (pb 917-1285 de SEQ ID NO: 22), todos los CUB-VEGF diferentes (CUB271; pb 244-988 de SEQ ID NO: 22; CUB256 pb 244-943 de SEQ ID NO: 22; CUB254 pb 244-937 de SEQ ID NO: 22 fusionados con VEGF pb 100-402, Genbank NM_003376), PDGF-C∆N (pb 912-1223 de SEQ ID NO: 20, GenBank AF244813) y PDGF-B de longitud completa (pb 1023-2368 de SEQ ID NO: 18, GenBank NM_002608) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pSecTagB (Invitrogen).

Cultivo celular, transfecciones y marcado metabólico. Se cultivaron células 293T en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)-suero bovino fetal al 10% (SBF). Las transfecciones de células se llevaron a cabo usando el kit de transfección JetPei (Polyplus) según las instrucciones del fabricante. Se usaron cantidades equivalentes de plásmidos de expresión sin los insertos en transfecciones con vector vacío. El marcado metabólico de las células transfectadas con las construcciones de expresión se hizo mediante adición de 200 mCi/ml de la mezcla de marcado de células in vitro Pro-Mix L-[35S] (Amersham) al medio de cultivo que carecía de cisteína y metionina, pero que contenía SBF al 3%. Después de 6 horas, el medio se recogió, se purificó por centrifugación y se usó para inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación. Las inmunoprecipitaciones y las precipitaciones de receptores de PDGF-D metabólicamente marcados con 35S, PDGF-D∆N, todos los CUB-VEGF diferentes, CUB, PDGF-C∆N y PDGF-B se llevaron a cabo usando proteínas de fusión receptor α de PDGF-Ig y receptor β de PDGF-Ig (R&D), anti-PDGF-D (R&D), anti-myc (Invitrogen) y anti-V5 (Invitrogen). Las proteínas producidas unidas a proteínas de fusión o anticuerpos se precipitaron usando proteína A-Sepharose (Pharmacia). Las proteínas precipitadas se analizaron usando SDSPAGE en condiciones tanto reductoras como no reductoras.

Resultados. Previamente se ha mostrado que PDGF-D es secretado como un dímero de polipéptidos de longitud completa de aproximadamente 60 kD, y en presencia de suero, PDGF-D experimenta procesamiento proteolítico para generar el dímero del factor de crecimiento activo de los dominios de homología con PDGF de 23 kD, pero que carecen de los dominios CUB del extremo N (Bergsten, Nat. Cell. Biol., 3:512-516, 2001; LaRochelle, Nat. Cell. Biol., 3:517-521, 2001). Una especie de ARN de PDGF-D alternativamente cortada y empalmada se encontró en corazón de ratón que codifica sólo el dominio CUB, con un codón de terminación en la posición 256 del marco de lectura. Los vectores de plásmido se construyeron para la expresión del dominio CUB, además de las formas de longitud completa y activadas de PDGF-D para probar si esta proteína truncada y el dominio CUB tiene una función en el procesamiento de PDGF-D.

El dominio del factor de crecimiento procesado se escindió del PDGF-D de longitud completa unido a PDGFR-α y-β, mientras que el dominio CUB aislado no se unió a ningún receptor. Esto se detectó precipitando PDGF-D de longitud completa metabólicamente marcado con proteínas de fusión receptor α de PDGF-Ig. De forma interesante, el polipéptido de PDGF-D∆N que carece del dominio CUB, pero que contiene parte de las secuencias intervinientes, también se unió a PDGFR-β, pero sólo muy débilmente a PDGFR-α. Sin embargo, el polipéptido de PDGF-D∆N no experimentó procesamiento proteolítico a la forma activa correspondiente a la escindida de la proteína de longitud completa, sugiriendo que la presencia del dominio CUB intacto es necesaria para la correcta escisión proteolítica. Los experimentos de control mostraron que PDGF-C∆N se une sólo a PDGFR-β y PDGF-B se une a ambos receptores, como se ha informado previamente.

Además, los experimentos de marcado de seguimiento de pulso demostraron que el procesamiento proteolítico se produce en las células productoras de PDGF-D, pero no en el medio de crecimiento después de la secreción. Por tanto, la capacidad de PDGF-D completamente procesado para unirse tanto a PDGFR-α como a β se confirmó adicionalmente por los experimentos de marcado de seguimiento de pulso. Los plásmidos de expresión que 5 codifican las formas de PDGF tratadas anteriormente se transfectaron en células 293T usando el reactivo de transfección JetPei (Polyplus). Dos días después de la transfección, el medio de cultivo se sustituyó con medio sin metionina y sin cisteína que incluía metionina y cisteína radiactivamente marcadas (35S) (Promix, Amersham) y suero bovino fetal al 5%. Este medio se recogió después de 24 horas y se usó 1 ml para precipitar proteínas producidas por las construcciones transfectadas. La precipitación se hizo usando proteínas de fusión de receptor de

10 PDGF (R&D) y proteína A-Sepharose. Las proteínas precipitadas se separaron en un gel de PAGE al 12%. Todas las construcciones produjeron polipéptidos del tamaño predicho a partir de las inmunoprecipitaciones previas de los polipéptidos en cuestión.

A diferencia de los informes anteriores, la forma naturalmente procesada de PDGF-D también puede unirse a PDGFR-α. La precipitación con la proteína de fusión receptor α de PDGF-Ig reveló la unión de la forma procesada

15 de PDGF-D. Como control negativo se usó el vector vacío. PDGF-C∆N y PDGF-B se usaron como controles positivos. Pareció que la forma corta recombinantemente “activada”, PDGF-D∆N, se unía al receptor α muy débilmente. Los resultados indicaron que PDGF-D∆N, además de PDGF-B y PDGF-D, se unen a PDGF-β, pero no PDGF-C∆N.

Estos resultados revelan que el sitio de escisión endógeno de PDGF-D se localiza más hacia el extremo C de lo que

20 previamente se pensaba y que la escisión correcta del dominio CUB es esencial para revelar la actividad de unión a PDGFR-α de PDGF-D. También se determinó que PDGF-D completamente procesado podría estimular la fosforilación de tanto los receptores PDGFR-α como PDGFR-β.

Debe entenderse que la anterior descripción se refiere a realizaciones preferidas de la invención y que equivalentes y variaciones que serán evidentes para el lector también están previstas como aspectos de la invención. Las

25 referencias citadas en todo este documento están todas específicamente incorporadas en este documento por referencia.

ÍNDICE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

Secuencia nº: Nombre Tipo de secuencia

1.: VEGF-A ADN

2.: VEGF-A AA

3.: VEGF 206 AA

4.: VEGF 121 AA

5.: VEGF 145 AA

6.: VEGF 165 AA

7.: VEGF 189 AA

8.: PIGF ADN

9.: PIGF AA

10.: VEGF-B ADN

11.: VEGF-B AA

12.: VEGF-C ADN

13.: VEGF-C AA

14.: VEGF-D ADN

15.: VEGF-D AA

16.: PDGF-A ADN

(cont.) (cont.)

Secuencia nº: Nombre Tipo de secuencia

17.: PDGF-A AA

18.: PDGF-B ADN

19.: PDGF-B AA

20.: PDGF-C ADN

21.: PDGF-C AA

22.: PDGF-D ADN

23.: PDGF-D AA

24.: VEGF-E ADN

25.: VEGF-E AA

26.: CAC ADN

27.: CAC AA

28.: CEBADOR ADN

29.: CEBADOR ADN

30.: CEBADOR ADN

31.: CEBADOR ADN

32.: CEBADOR ADN

33.: CEBADOR ADN

34.: CEBADOR ADN

35.: CEBADOR ADN

36.: CDD ADN

37.: CDD AA

38.: CDC ADN

39.: CDC AA

40.: DDC ADN

41.: DDC AA

42.: P1GF-2 AA

43.: P1GF-3 AA

44.: VEGFB-167 AA

45.: VEGFB-186 AA

46.: Propéptido del extremo N de VEGF-C AA

47.: Propéptido del extremo C de VEGF-C AA

48.: Propéptido del extremo N de VEGF-D AA

49.: Propéptido del extremo C de VEGF-D AA

Secuencia nº: Nombre Tipo de secuencia

50.: LAP-1 AA

51.: VEGF109 ADN

52.: VEGF109 AA

53.: Dominio CUB de PDGF-C AA

54.: Dominio CUB de PDGF-D ADN

55.: Dominio CUB de PDGF-D AA

56.: CUB271-VEGF ADN

57.: CUB271-VEGF AA

58.: CUB254-VEGF ADN

59.: CUB254-VEGF AA

60.: CUB256-VEGF ADN

61.: CUB256-VEGF AA

62.: CUB+V5+His ADN

63.: CUB+V5+His ADN

64.: Cebador ADN

65.: Cebador ADN

LISTADO DE SECUENCIAS 5 <110> Alitalo y col.

<120> VEGF-A modificado con propiedades angiogénicas mejoradas

<130> 28967/41018A 10

<150> US 60/708.226

<151> 15-08-2005 15 <160> 65

<170> Patent In versión 3.3

<210> 1 20 <211> 649

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 25 <221>

<223> VEGF-A

<400> 1 <210> 2

imagen3

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-A

<400> 2

<210> 3

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF206

<400> 3

<210> 4

<211> 147

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> VEGF121

<400> 4

<210> 6

<211> 191

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF189

imagen1

imagen4

imagen1

10

<210> 5

<211> 171

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<220>

<221>

<223> VEGF145

20: <400> 5

imagen1

imagen5

<400> 7 <210> 8

imagen1

<211> 1645 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> 10 <223> PlGF

<400> 8

imagen1

5

<210> 9

<211> 149

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<220>

<221>

<223> PlGF

imagen6

<210> 10

<211> 755

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> VEGF-B 15

<400> 10 <210> 11

imagen7

<213> Homo sapiens

<220>

<221> 10 <223> VEGF-B

<400> 11 <210> 12

imagen1

<211> 2076 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-C

<400> 12

<210> 13

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-C

imagen1

imagen8

<400> 13

imagen1

<210> 14

<211> 2128 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-D

<400> 14

<210> 15

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-D

imagen1

imagen9

<400> 15

imagen1

<210> 16

<211> 2797 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> 10 <223> PDGF-A

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 211

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> PDGF-A 10

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 3373

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> PDGF-B 10

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 241

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

imagen1

<210> 20

<211> 3007

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> PDGF-C

<400> 20

imagen1

imagen10

<210> 21

<213> Homo sapiens

<220>

<221> 10 <223> PDGF-C

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 2253 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> PDGF-D

<400> 22

<210> 23

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> PDGF-D

imagen1

imagen11

<400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 1830 5 <212> ADN

<213> Virus ORF

<220>

<221> 10 <223> VEGF-E

<400> 24

imagen1

<210> 25

<211> 148

<212> PRT

<213> Virus ORF 5

<220>

<221>

<223> VEGF-E

10 <400> 25

imagen1

<210> 26

<211> 1251 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 20 <223> CAC

<400> 26

<210> 27

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CAC

<400> 27

<210> 28

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 28

<210> 29

<211> 68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 29

<210> 30

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 30

<210> 31

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 31

<210> 32

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 32

<210> 33

<211> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 33

<210> 34

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 34

<210> 35

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 1110

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> Construcción de CDD

<400> 36

<210> 37

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Construcción de CDD

imagen12

imagen1

imagen13

<400> 37

imagen1

<210> 38

<211> 1239 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Construcción de CDC

<400> 38

<210> 39

<211> 412

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> Construcción de CDC

<210> 40

<211> 1209

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> Construcción de DDC

<400> 40

<210> 41

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 15 <223> Construcción de DDC

<400> 41

<210> 42

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> PIGF-2

<400> 42

<210> 43

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> PlGF-3

<400> 43

<210> 44

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF-B167

imagen1

imagen14

imagen1

imagen15

imagen1

imagen16

imagen1

imagen17

imagen18

<400> 44

imagen1

5 <210> 45

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <220>

<221>

<223> VEGF-B186

<400> 45

imagen19

<210> 46

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Propéptido del extremo N de VEGF-C

<400> 46

<210> 47

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Propéptido del extremo C de VEGF-C

<400> 47

<210> 48

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Propéptido del extremo N de VEGF-D

<400> 48

<210> 49

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Propéptido del extremo C de VEGF-C

<400> 49

<210> 50

<211> 258

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> VEGF109

imagen20

imagen19

imagen21

imagen1

imagen22

<400> 51

imagen1

15 <210> 52

<211> 152

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <220>

<221>

<223> VEGF109

<400> 52

imagen23

<210> 53

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Dominio CUB de PDGF-C

<400> 53

<210> 54

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Dominio CUB de PDGF-D

<400> 54

<210> 55

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> Dominio CUB de PDGF-D

imagen24

imagen25

<400> 55

imagen1

<210> 56

<211> 1209 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CUB271VEGF109

<400> 56

<210> 57

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CUB271VEGF109

imagen26

<400> 57

imagen1

<210> 58

<211> 1161

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

<223> CUB254VEGF109

<400> 58

imagen1

10

<210> 59

<211> 386

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<220>

<221>

<223> CUB254VEGF109

20: <400> 59

imagen1

<210> 60

<211> 1167 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CUB256VEGF109

<400> 60

<210> 61

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CUB256VEGF109

<400> 61

<210> 62

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: 10 <223> CUB+V5+His

imagen27

imagen1

imagen28

<400> 62 <210> 64

imagen1

15

<210> 63

<211> 196

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20

<220>

<221>

<223> CUB+V5+His

25: <400> 63

imagen29

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético 10

imagen30

<210> 65

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 65

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción que comprende:

un dominio de unión a RTK, al menos un dominio flanqueante y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el al menos un dominio flanqueante;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-E de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PIGF de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-C de mamífero; y secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-D de mamífero;

en la que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-alfa y PDGFRbeta; y

en la que el al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un propéptido del extremo amino de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-C de mamífero; un propéptido del extremo amino de VEGF-D de mamífero; un propéptido del extremo carboxi de VEGF-D de mamífero; un péptido LAP TGF-β1 de mamífero; y fragmentos de los mismos que son eficaces para unir proteínas de la matriz extracelular o proteínas de neuropilina;

con la condición de que cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C, el al menos un dominio flanqueante no sea idéntico al menos el 90% a un propéptido de VEGF-C; y cuando el dominio de unión a RTK sea idéntico al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D, el al menos un dominio flanqueante no sea idéntico al menos el 90% a un pro-péptido de VEGF-D.
2.

Una construcción según la reivindicación 1, en la que al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un amino-pro-péptido de VEGF-C de mamífero; un carboxi-pro-péptido de VEGF-C de mamífero; un amino-pro-péptido de VEGF-D de mamífero; y un carboxi-pro-péptido de VEGF-D de mamífero.
3.

Una construcción según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además un dominio de unión a heparina conectado a la construcción por un enlace.
4.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende además un dominio CUB conectado a la construcción por un enlace.
5.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que cada uno del al menos un enlace comprende un enlace peptídico.
6.

Una construcción según la reivindicación 5, en la que la construcción comprende además un péptido señal.
7.

La construcción de la reivindicación 5 ó 6, en la que la construcción comprende además una marca de péptido.
8.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en la que la construcción comprende al menos dos dominios flanqueantes.
9.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en la que la construcción satisface la fórmula:

Fn-L-RTK-L-Fc

en la que Fn comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un amino-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un amino-pro-péptido de VEGF-D de mamífero;

en la que Fc comprende un dominio flanqueante que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada de un carboxi-pro-péptido de VEGF-C de mamífero y un carboxi-pro-péptido de VEGF-D de mamífero;

en la que RTK comprende el dominio de unión a RTK; y

en la que L comprende el enlace entre el dominio flanqueante y el dominio de unión a RTK.
10.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en la que el al menos un dominio flanqueante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 46; la secuencia de carboxi-pro-péptidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 47; la secuencia de amino-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 48; y la secuencia de carboxi-pro-péptidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 49.
11.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-1 o VEGFR-2;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

aminoácidos 27 a 147 de la secuencia de aminoácidos de VEGF121 de SEQ ID NO: 4;

(b)

aminoácidos 27 a 171 de la secuencia de aminoácidos de VEGF145 de SEQ ID NO: 5;

(c)

aminoácidos 27 a 191 de la secuencia de aminoácidos de VEGF165 de SEQ ID NO: 6;

(d)

aminoácidos 27 a 215 de la secuencia de aminoácidos de VEGF189 de SEQ ID NO: 7;

(e)

aminoácidos 27-232 de la secuencia de aminoácidos de VEGF206 de SEQ ID NO: 3; y

(f)

fragmentos de (a) -(e) que se unen a VEGFR-1 o VEGFR-2.
12. Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-1 o VEGFR-2;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a los aminoácidos 27 a 127 de la secuencia de aminoácidos de VEGF109 de SEQ ID NO: 52.
13.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 27.
14.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-1 o VEGFR-2; y

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

aminoácidos 22 a 188 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B167 de SEQ ID NO: 44;

(b)

aminoácidos 22 a 207 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-B186 de SEQ ID NO: 45;

(c)

aminoácidos 19 a 149 de la secuencia de aminoácidos de PIGF-1 de SEQ ID NO: 9;

(d)

aminoácidos 19 a 170 de la secuencia de aminoácidos de PIGF-2 de SEQ ID NO: 42;

(e)

aminoácidos 19 a 221 de la secuencia de aminoácidos de PIGF-3 de SEQ ID NO: 43; y

(f)

fragmentos de (a) -(e) que se unen a VEGFR-1 o VEGFR-2.
15. Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a PDGFR-alfa o PDGFR-beta; y

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

aminoácidos 87 a 211 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-A de SEQ ID NO: 17;

(b)

aminoácidos 82 a 190 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-B de SEQ ID NO: 19;

(c)

aminoácidos 230 a 345 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-C de SEQ ID NO: 21;

(d)

aminoácidos 255 a 370 de la secuencia de aminoácidos de PDGF-D de SEQ ID NO: 24; y

(e)

fragmentos de (a) -(d) que se unen a PDGFR-alfa o PDGFR-beta.
16. Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en la que el polipéptido quimérico se une a VEGFR-3 o VEGFR-2; y

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

aminoácidos 103 a 227 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-C de SEQ ID NO: 13;

(b)

aminoácidos 93 a 201 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-D de SEQ ID NO: 15; y

(c)

fragmentos de (a) -(b) que se unen a VEGFR-3 o VEGFR-2.
17. Una construcción según la reivindicación 15 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos de la construcción CDD de SEQ ID NO 37;

(b)

la secuencia de aminoácidos de la construcción CDC de SEQ ID NO: 39; y,

(c)

la secuencia de aminoácidos de la construcción DDC de SEQ ID NO: 41.
18.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que dicha construcción comprende además una secuencia de aminoácidos del dominio CUB unida por un enlace.
19.

Una construcción que comprende:

un dominio de unión a RTK, un dominio CUB y al menos un enlace que conecta el dominio de unión a RTK con el dominio CUB;

en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-A de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-B de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-C de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-D de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de VEGF-E de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PIGF de mamífero; secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-A de mamífero; y secuencias de aminoácidos del dominio de unión a RTK de PDGF-B de mamífero; en la que el dominio CUB comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF-C y secuencias de aminoácidos del dominio CUB de PDGF; y en la que la construcción y el dominio de unión a RTK se unen al dominio extracelular de al menos un receptor tirosina-cinasa seleccionado del grupo que consiste en: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFRalfa y PDGFR-beta.
20.

La construcción según la reivindicación 19, en la que el dominio CUB está conectado al extremo N del dominio de unión a RTK.
21.

La construcción según la reivindicación 19, en la que el dominio CUB está conectado al extremo C del dominio de unión a RTK.
22.

La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en la que el dominio CUB comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 53.
23.

La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en la que el dominio CUB comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 55.
24.

La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en la que el dominio de unión a RTK comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 90% a los aminoácidos 27 a 127 de la secuencia de aminoácidos de VEGF109 de SEQ ID NO: 52.
25.

La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 19-24 que comprende además un dominio de unión a heparina conectado a la construcción por un enlace.
26.

Una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 19-25, en la que cada uno de los enlaces comprende un enlace peptídico, por lo que la construcción comprende un polipéptido quimérico.
27.

La construcción según la reivindicación 26, en la que el polipéptido quimérico comprende además un péptido señal.
28.

La construcción de la reivindicación 27, en la que el polipéptido quimérico comprende además una marca de péptido.
29.

La construcción según la reivindicación 24, en la que la construcción comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57, 59 y 61.
30.

La construcción según la reivindicación 19-29, en la que el dominio CUB está unido al factor de crecimiento

mediante una secuencia de reconocimiento reconocida específicamente por una enzima proteolítica de forma que la enzima proteolítica, si está presente, se escinde en la secuencia de reconocimiento para eliminar el dominio CUB y producir un factor de crecimiento activado.
31.

Un dímero que comprende dos polipéptidos quiméricos de una cualquiera de las reivindicaciones 5-15 y 26-30.
32.

El dímero de la reivindicación 31, que es un homodímero.
33.

El dímero de la reivindicación 32, que es un heterodímero.
34.

Una composición que comprende la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
35.

Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-33, en el que la construcción comprende un polipéptido quimérico.
36.

Un polinucleótido según la reivindicación 35, en el que el polinucleótido comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal fusionado en marco con el polipéptido.
37.

Un polinucleótido según la reivindicación 35 ó 36 que comprende además una secuencia promotora que promueve la expresión del polinucleótido en una célula de mamífero.
38.

Un polinucleótido según la reivindicación 37, en el que la secuencia promotora comprende un promotor específico de la piel.
39.

Un polinucleótido según la reivindicación 38, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en K14, K5, K6, K16 y promotor del colágeno alfa 1(I).
40.

Un polinucleótido según la reivindicación 36, en el que el promotor es un promotor específico de células endoteliales.
41.

Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 35-40.
42.

Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 35-40 ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión.
43.

Un vector de expresión de la reivindicación 42, en el que la secuencia de control de la expresión comprende un promotor específico de células endoteliales.
44.

Un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 41-43 seleccionado del grupo que consiste en vectores adenovíricos deficientes en la replicación, vectores víricos adenoasociados y vectores de lentivirus.
45.

Una composición que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 35-40 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
46.

Una composición que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 41-44 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
47.

Una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 35-40.
48.

Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 41-44.
49.

Una célula huésped según la reivindicación 48 que expresa el polipéptido codificado por el polinucleótido.
50.

Una célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 47-49 que comprende una célula endotelial o célula precursora endotelial de mamífero.
51.

Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30; (b) un polinucleótido que codifica (a); (c) un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (d) una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento de modulación del crecimiento de células endoteliales de mamífero o células precursoras endoteliales de mamífero.
52.

Una composición de la reivindicación 51, en la que el sujeto mamífero es un ser humano.
53.

Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a);

en la que la composición se administra en una cantidad eficaz para modular angiogénesis para uso en un procedimiento de modulación de la angiogénesis en un sujeto mamífero.
54. Una composición que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a);

en la que la composición se administra en una cantidad eficaz para modular angiogénesis para uso en un procedimiento de modulación de la linfangiogénesis en un sujeto mamífero
55. Un agente de cicatrización seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento de mejora de la cicatrización de un injerto de piel o colgajo de piel al tejido subyacente de un sujeto mamífero.
56. Un dispositivo médico para mejorar la circulación, cicatrización de medidas o circulación sanguínea, recubierto o impregnado con una composición que comprende un agente angiogénico seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a).
57. Un parche que comprende un material de almohadilla que tiene una superficie superior y una superficie inferior, un adhesivo sobre la superficie inferior y una composición terapéutica, en el que la composición comprende un agente de cicatrización seleccionado del grupo que consiste en

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a).
58. Un hilo de sutura quirúrgica recubierto o impregnado con una composición, en el que la composición comprende un agente de cicatrización seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

una construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30;

(b)

un polinucleótido que codifica (a);

(c)

un vector de expresión que contiene (b) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y

(d)

una célula transformada o transfectada con (b) o (c) y que expresa el polipéptido de (a).
59.

Un agente seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 19-30; (b) el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 31-33; (c) un polinucleótido que codifica (a); (b) un vector de expresión que contiene (c) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (e) una célula transformada o transfectada con (c) o (d) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento para antagonizar en una célula al menos un receptor seleccionado del grupo que consiste en VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-α y PDGFR-β.
60.

Un agente seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 19-30; (b) el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 31-33; (c) un polinucleótido que codifica (a); (b) un vector de expresión que contiene (c) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (e) una célula transformada o transfectada con (c) o (d) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento para bloquear la unión de PDGF-D a PDGFR-α, pero no a PDGFR-β, en una célula cuando están presentes tanto

PDGFR-α como PDGFR-β.
61.

Un agente seleccionado del grupo que consiste en: (a) la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 19-30; (b) el dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 31-33; (c) un polinucleótido que codifica (a); (b) un vector de expresión que contiene (c) ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión; y (e) una

5 célula transformada o transfectada con (c) o (d) y que expresa el polipéptido de (a) para uso en un procedimiento para modular actividades de un receptor de una célula cuyo receptor se une específicamente, a y es activado por, un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en PDGF-A, PDGF-B, el dominio de homología con VEGF de PDGF-C, VEGF, VEGF-B, VEGF-C y PIGF, proveyendo la célula de una enzima proteolítica, por medio de lo cual se activa el factor de crecimiento.

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