ES2252830T3

ES2252830T3 - Soportes recubiertos por celulas.

Info

Publication number: ES2252830T3
Application number: ES98915561T
Authority: ES
Inventors: Riley S. Rees; Cynthia Marcelo; Belinda Adamson; Lenore Rhodes; Berverly Marchant; William Lindblad; Robert Gilmont; Warren Garner; Cynthia Zuccaro; Thomas E. Taddonio
Original assignee: University of Michigan System; University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan System; University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2018-04-15
Also published as: US6197330B1; US6890552B2; DE69838356T2; DE69838356D1; EP1640024A2; US20010001039A1; EP0975226B1; EP1640024A3; US20020015725A1; US6440452B2; US20030124173A1; US5972332A; WO1998046082A1; EP1640024B1; US20010014674A1; ES2292034T3; EP0975226A4; EP0975226A1; US6299898B2; AU6971198A

Abstract

Se describen unos dispositivos y/o procedimientos para aumentar la curación de heridas, especialmente heridas crónicas (por ejemplo, heridas diabéticas), mediante el empleo de queratinocitos. Los queratinocitos se cultivan en un soporte sólido que se puede transplantar (por ejemplo, soportes cubiertos con colágeno), y los soportes sólidos cubiertos con queratinocitos se colocan en una envuelta. La envuelta, a su vez, se coloca sobre la herida para su uso como promotor interactivo de la curación de la herida.

Description

Soportes recubiertos por células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la cicatrización y la regeneración tisular y, más particularmente, a sistemas para la cicatrización de heridas y el uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

El objetivo principal en el tratamiento de heridas es conseguir el cierre de la herida. Las heridas cutáneas abiertas representan una categoría importante de heridas e incluyen heridas por quemaduras, úlceras neuropáticas, úlcera de decúbito, úlceras por insuficiencia venosa y úlceras diabéticas. Las heridas cutáneas abiertas suelen cicatrizar mediante un proceso que comprende seis componentes importantes: i) inflamación, ii) proliferación de fibroblastos, iii) proliferación de vasos sanguíneos, iv) síntesis de tejido conjuntivo, v) epitelización y vi) contracción de la herida. La cicatrización de heridas se ve alterada cuando estos componentes, de forma individual o en conjunto, no funcionan de forma adecuada. Numerosos factores pueden afectar a la cicatrización de heridas, entre los que se incluyen malnutrición, infección, agentes farmacológicos (p. ej., actinomicina y esteroides), diabetes y edad avanzada [véase Hunt y Goodson en Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange), pág. 86-98 (1988)].

Las heridas que no cicatrizan con facilidad pueden causar al sujeto un considerable sufrimiento físico, emocional y social, así como grandes gastos económicos [véase, p. ej., Richey y col., Annals of Plastic Surgery 23 (2): 159-165 (1989)]. De hecho, es posible que sea necesaria la escisión del tejido afectado en las heridas que no cicatrizan de forma adecuada y se infecten. Dado que el conocimiento básico de las heridas y de los mecanismos de cicatrización de heridas por parte de los científicos ha progresado, se ha desarrollado una serie de modalidades terapéuticas.

La modalidad convencional usada con más frecuencia que contribuye a la cicatrización de heridas implica el uso de vendajes de heridas. En la década de 1960 se produjo una gran paso adelante en el cuidado de las heridas, cuando se descubrió que la cicatrización de heridas con un vendaje húmedo oclusivo era, en términos generales, más eficaz que el uso de vendajes secos no oclusivos [Winter, Nature 193: 293-94 (1962)]. Hoy en día, se usan de forma rutinaria numerosos tipos de vendajes, incluidas películas (p. ej., películas de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espuma de poliuretano), hidrogeles (polímeros degradados) que contienen alrededor de, al menos, un 60% de agua), espumas (hidrófilas o hidrófobas), alginatos de calcio (compuestos no tejidos de fibras formadas por alginato de calcio) y celofán (celulosa con un plastificante) [Kannon and Garret, Dermatol. Surg. 21: 583-590 (1995); Davies, Burns 10:94 (1983)]. Por desgracia, ciertos tipos de heridas (p. ej., úlceras diabéticas, úlceras de decúbito) y las heridas de ciertos sujetos (p. ej., receptores de corticosteroides exógenos) no cicatrizan en su momento (o no cicatrizan en absoluto) con el uso de tales vendajes.

También se han usado diversas modalidades farmacéuticas en un intento de mejorar la cicatrización de heridas. Por ejemplo, algunos facultativos han usado regímenes terapéuticos con sulfato de cinc. Sin embargo, la eficacia de estos regímenes se ha atribuido, principalmente, a la reversión que produce de los efectos de los niveles séricos de cinc por debajo de lo normal (p. ej., menor resistencia del huésped y alteración de la actividad bactericida intracelular) [Riley, Am. Farm. Physician 24: 107 (1981)]. Aunque otras deficiencias de vitaminas y de minerales también se han asociado con una disminución de la cicatrización de heridas (p. ej., deficiencias de las vitaminas A, C y D; y de calcio, magnesio, cobre y hierro), no existen pruebas de que el incremento de los niveles séricos de estas sustancias por encima de sus niveles normales de verdad aumente la cicatrización de heridas. Por tanto, excepto en circunstancias muy limitadas, la estimulación de la cicatrización de heridas con estos agentes no ha tenido mucho éxito.

Lo que se necesita es un medio seguro, eficaz e interactivo para aumentar la cicatrización de heridas crónicas. El medio debería poder usarse con independencia del tipo de herida o de la naturaleza de la población de pacientes a la que pertenece el sujeto.

El documento WO-A 96/12510 describe un tratamiento de heridas, en el que un biomaterial que contiene células epiteliales se pone en contacto con la herida.

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones dirigidas a sistemas para aumentar la cicatrización de heridas, en especial de heridas crónicas (p. ej., heridas diabéticas, úlceras de decúbito), que implican el uso de queratinocitos cultivados. En un soporte sólido y un envoltorio que comprende un material de malla que tiene poros, donde dicho envoltorio alberga dicho soporte sólido, en el que dicho envoltorio se sella para impedir que dicho soporte sólido salga de dicho envoltorio. La presente invención no está limitada por la naturaleza del soporte sólido; de hecho, la presente invención contempla el uso de cualquier soporte o matriz tridimensional (p. ej., matrices compuestas por glucosaminoglucanos), al que se adherirán los queratinocitos, se dividirán y mantendrán sus comportamientos funcionales (p. ej., cicatrizar heridas).

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En formas de realización preferidas, el soporte sólido comprende perlas recubiertas por colágeno. En formas de realización concretas, las perlas recubiertas por colágeno se colocan en un envoltorio, compartimento, bolsa o barrera similar, en el que dicho envoltorio tiene poros, y a continuación el envoltorio se coloca en la zona de la herida para usar como estimulador interactivo de la cicatrización de heridas. La presente invención no está limitada por la naturaleza del envoltorio; sin embargo, en una forma de realización, los poros son lo bastante grandes como para permitir que las células de las perlas salgan del envoltorio hacia la herida, mientras que en otra forma de realización, los poros son demasiado pequeños como para permitir la salida de las perlas del envoltorio, pero lo suficientemente grandes como para permitir que factores celulares salgan del envoltorio o para que componentes fluidos de la herida entren en el envoltorio. En ciertas formas de realización, los envoltorio se sustituyen cada pocos días hasta que la herida
cicatriza.

Más particularmente, la presente invención contempla un sistema para el tratamiento de heridas, que comprende a) queratinocitos en un soporte sólido; y b) un envoltorio, donde el envoltorio alberga el soporte sólido. En algunas formas de realización, el soporte sólido comprende perlas, y en otras formas de realización, las perlas son macroporosas. En otras formas de realización más, las perlas están recubiertas con una matriz extracelular (p. ej. colágeno). Aunque la presente invención no está limitada por la naturaleza de los queratinocitos, en una forma de realización preferida los queratinocitos son viables y en crecimiento.

El envoltorio comprende un material de malla que tiene poros. En ciertas formas de realización, el material de malla comprende poliéster. En una forma de realización, los poros son lo bastante grandes como para permitir que las células de las perlas salgan del envoltorio hacia la herida, mientras que en otra forma de realización, los poros son demasiado pequeños como para permitir la salida de las perlas del envoltorio, pero lo suficientemente grandes como para permitir que factores celulares (p. ej., citocinas) salgan del envoltorio o para que componentes fluidos de la herida entren en el envoltorio.

Además, en otras formas de realización, el envoltorio comprende una membrana biocompatible. En otras formas de realización, el envoltorio comprende medios para eliminar el envoltorio de una herida. En formas de realización concretas, el medio de eliminación comprende un asa o cuerda unida al envoltorio.

La presente invención es útil en un procedimiento para tratar una herida, que comprende a) proporcionar: i) queratinocitos en un soporte sólido, ii) un envoltorio e iii) un sujeto con al menos una herida; b) colocar el soporte sólido que contiene los queratinocitos en el envoltorio con el fin de producir un envoltorio que contiene queratinocitos; y c) colocar el envoltorio que contiene queratinocitos en la herida del sujeto en condiciones tales que se estimule la cicatrización de la herida. Otras formas de realización comprenden además, tras la etapa b) y antes de la etapa c), sellar el envoltorio para producir un envoltorio sellado que contiene queratinocitos. Por último, algunas formas de realización comprenden además la etapa d), cubrir el envoltorio que contiene queratinocitos con un vendaje.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la invención que se expone en la descripción siguiente, a continuación se definen una serie de términos.

El término "herida" se refiere en un sentido amplio a las lesiones de la piel y del tejido subcutáneo que se inician de formas diferentes (p. ej., úlceras de decúbito producidas por un periodo prolongado en una cama y heridas inducidas por traumatismos) y con características variables. Las heridas se pueden clasificar en uno de cuatro grados en función de la profundidad de la herida: i) Grado I: heridas limitadas al epitelio, ii) Grado II: heridas que se extienden a la dermis; iii) Grado III: heridas que se extienden al tejido subcutáneo; y iv) Grado IV (o heridas de espesor completo): heridas en las que los huesos están expuestos (p. ej., un punto de presión óseo tal como el trocánter mayor o el sacro). El término "herida de espesor parcial" se refiere a las heridas que abarcan los Grados I-III; entre los ejemplos de heridas de espesor parcial se incluyen heridas por quemaduras, úlceras de decúbito, úlceras por insuficiencia venosa y úlceras diabéticas. Con el término "herida profunda" se pretende incluir las heridas tanto de Grado III como de Grado IV.

El término "herida crónica" se refiere a una herida que no ha cicatrizado en 30 días.

Con la frase "colocar el envoltorio en la herida" se quiere decir poner en contacto alguna parte de la herida con el envoltorio. "Que contiene" incluye, entre otras cosas, acercar el envoltorio a la herida de forma que las células se encuentren en comunicación fluida con la herida.

Las frases "estimular la cicatrización de heridas" "aumentar la cicatrización de heridas" y similares se refieren a la inducción de la formación de tejido de granulación de contracción de heridas y/o a la inducción de epitelización (es decir, la generación de células nuevas en el epitelio).

La frase "contenidos fluidos de la herida" se refiere al líquido asociado con una herida, así como a las células, los factores celulares, los iones, las macromoléculas y el material proteico suspendido en tal líquido en la zona de la herida.

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El término "queratinocito" se refiere a células que producen queratina (ceratina), una escleroproteína o albuminoide. En general, los queratinocitos se encuentran en la epidermis o a partir de líneas celulares derivadas de queratinocitos (p. ej., productos derivados de bacterias).

El término "sujeto" se refiere tanto a seres humanos como a animales.

Los términos "envoltorio", "compartimento" y similares se refieren en un sentido amplio a cualquier recipiente capaz de confinar un soporte sólido recubierto por células dentro de una localización definida mientras permiten la salida del envoltorio de factores celulares hacia la herida y la entrada de los contenidos líquidos de la herida. En formas de realización preferidas, el envoltorio es una bolsa de malla estéril construida de una malla tejida de poliéster de grado médico. En una forma de realización, la presente invención contempla un envoltorio degradable (es decir, un envoltorio que se rompe con el tiempo). Además, la presente invención contempla el uso de un envoltorio construido de membranas. Después de que el soporte sólido que contiene las células (p. ej., en crecimiento sobre la superficie de la superficie del soporte sólido o dentro del soporte sólido) se coloca en el interior del envoltorio, el envoltorio se sella para impedir que el soporte sólido salga del envoltorio. En una forma de realización, el envoltorio sellado además comprende un medio de transporte para transportar factores celulares (p. ej., fuera del envoltorio y hacia la herida). Aunque la presente invención no se limita a un medio de transporte concreto, el medio de transporte puede incluir un medio para aplicar presión (p. ej., una bomba).

El término "soporte sólido" se refiere en un sentido amplio a cualquier soporte que permita el crecimiento celular, e incluye, entre otros, perlas microtransportadoras, geles y accesorios para placas de cultivo. Las perlas microtransportadoras adecuadas para usar con la presente invención se pueden obtener comercialmente de una serie de fuentes, entre las que se incluyen Sigma, Pharmacia e ICN. En formas de realización preferidas, los queratinocitos se cultivan en perlas recubiertas por colágeno (p. ej., CYTOLINE 1^{TM}, perlas microtransportadoras macroporosas (Pharmacia Biotech)). Los accesorios para placas de cultivo (es decir, matrices de soporte celular que en general comprenden una membrana que soporta el crecimiento celular) se pueden obtener comercialmente de, entre otras fuentes, Collaborative Biomedical Products, Costar, ICN y Millipore. En formas de realización preferidas, los accesorios para placas de de cultivo comprenden una membrana microporosa permeable que permite la difusión libre de iones y macromoléculas.

El término "soporte sólido trasplantable" se refiere a un soporte sólido que contiene células (p. ej., queratinocitos, denominado "soporte sólido que contiene queratinocitos") que se puede colocar en el interior de un envoltorio. El envoltorio que contiene el soporte sólido que contiene células puede colocarse después en una herida para estimular la cicatrización de heridas.

Las frases "medio para eliminación", "medio de eliminación" y similares se refieren en sentido amplio a cualquier mecanismo útil para ayudar a la retirada de un envoltorio que contiene células de una herida (y/o la colocación del envoltorio que contiene células dentro de una herida). en algunas formas de realización, el medio de eliminación comprende una cuerda, un hilo, u cordón o similares unidos al envoltorio; en formas de realización preferidas, el medio de eliminación está unido a un agarre que se puede usar como asa para ayudar a colocar el envoltorio que contiene células dentro de la herida y su eliminación de la misma.

El término "vendaje" se refiere en sentido amplio a cualquier material que se aplique a una herida para protección, absorbancia, drenaje, etc. En el mercado se dispone de numerosos tipos de vendajes, incluidas películas (p. ej., películas de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espuma de poliuretano), hidrogeles (polímeros degradados) que contienen alrededor de, al menos, un 60% de agua), espumas (hidrófilas o hidrófobas), alginatos de calcio (compuestos no tejidos de fibras formadas por alginato de calcio) y celofán (celulosa con un plastificante) [Kannon and Garret, Dermatol. Surg. 21: 583-590 (1995); Davies, Burns 10:94 (1983)]. La presente invención también contempla el uso de vendajes impregnados con compuestos farmacológicos (p. ej., antibióticos).

El término "biocompatible" quiere decir que existe un efecto mínimo (es decir, no se observan diferencias significativas en comparación con un control), si existe alguno) sobre las zonas de alrededor. Por ejemplo, en algunas formas de realización de la presente invención, el envoltorio comprende una membrana biocompatible; la propia membrana ejerce un efecto mínimo sobre las células del soporte sólido (es decir, es inocuo y compatible con el crecimiento de los queratinocitos) en la membrana y en el sujeto (es decir, no ejerce un impacto adversos sobre la salud del sujeto o sobre la velocidad de cicatrización de la herida) después de colocar el envoltorio en una herida.

El término "matriz extracelular" se refiere en sentido amplio al material que soporta el crecimiento celular. No se pretende limitar la presente invención con un material concreto; la presente invención contempla una amplia variedad de materiales, incluidos, entre otros, el material que se distribuye por todo el cuerpo de los organismos multicelulares, tal como glucoproteínas, proteoglucanos e hidratos de carbono complejos. La presente invención contempla el uso de un sustrato de matriz extracelular con los accesorios para placas de cultivo sobre los que las células (p. ej., queratinocitos) se cultivan. Aunque la presente invención no está limitada por la naturaleza de la matriz extracelular, entre las matrices extracelulares preferidas se incluyen Matrigel, Growth Factor Reduced Matrigel, colágeno fibrilar, laminina, fibronectina y colágeno de tipo IV. El colágeno es la matriz extracelular más preferida para usar con la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada al uso de colágeno, ni al uso de soportes sólidos recubiertos comercialmente con colágeno o con otras matrices extracelulares.

Descripción de la figura

La Figura representa en forma de diagrama una forma de realización de una bolsa de té contemplada para usar con los soportes sólidos que contienen células de la presente invención. Un envoltorio, (1), se conecta con un medio de eliminación, (2) y (3), y contiene soporte sólido, (4). En esta forma de realización, el medio de eliminación comprende una cuerda, (2), y una lengüeta conectada a la cuerda, (3).

Descripción de la invención

La invención implica el uso excepcional de células cultivadas para tratar heridas, en especial heridas crónicas (p. ej., heridas diabéticas). En formas de realización preferidas, los queratinocitos cultivados sembrados en soportes sólidos trasplantables se colocan en un envoltorio permeable; a continuación el envoltorio se coloca en una herida. Aunque para la práctica de la presente invención no se requiere un conocimiento exacto de cómo el envoltorio que contiene células ejerce su efecto sobre la cicatrización de heridas, se cree que las células del envoltorio secretan ciertos factores que aumentan la cicatrización de heridas. La utilidad de la presente invención se ha demostrado en ratones desnudos atímicos, un modelo animal que se utiliza de forma habitual en las pruebas de cierre de heridas [véase, p. ej., Boyce y col., Surgery 110: 866-76 (1991); Barbill y col., Surgery 105: 764-69 (1989); y Hansbrough y col., J. Burn Care Rehabil. 14: 485-94 (1993)].

La presente invención no está limitada por la naturaleza de las células utilizadas. Entre los ejemplos de células se incluyen, entre otras, las células que se exponen en la Tabla 1.

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TABLA 1

Tipo de	Tejido	Citocinas, factor de crecimiento,	Interacciones de la matriz	Potencial de cicatrización
células		preparado/responde a		N de heridas
Fibroblasto	Dermis	TGF-beta, PDGF, IGF, IL-1,	Colágeno tipo I, III y IV,	Fibroblasto *4
	vísceras	FGF, CTGF	elastina, fibronectina, nidogen,
	Órganos		PSARC, osteonectina,
			proteoglicanos,
			glucosaminoglucanos,
			colagenasas, gelatinasa,
			estromelisina, TIMP,
			trombospondina
Célula	Vasos	FGF, VEGF, endotelina,	TIMP, GAG, elastina, laminina,	Célula endotelial *4
endotelial	sanguíneos	IGF, IL-1	colagenasa, colágeno tipo IV,
			fibronectina
Melanocito	Dermis	II-1, MSH	No hay producción de MEC	Melanocito*1
Célula de	Vasos	PDGF, IGF, EGF, FGF	TIMP, GAG, elastina,	Célula de músculo liso*3
músculo	sanguíneos		laminina, colagenasa,
liso			colágenos, fibronectina
Fibroblasto	Mesénquima	FGF, TGF-beta, PDGF,	IMP, GAG, elastina,	Fibroblasto fetal*4
fetal	fetal	ILGF, IL-1, FGF	laminina, colagenasa,
			colágenos, fibronectina
Célula	Dermis	FGF, TGF-alfa, TGF-beta,	TIMP, GAG, elastina,	Célula epitelial*4
epitelial	Mucosa	PDGF, IGF, IL-1 EGF,	laminina, colagenasa,
		FGF, KGF, IFN-gamma,	colágenos de tipo IV,
		TNF-gamma, IL-1 alfa,	VI, VII, laminimas,
		activina	fibronectina, epiligrina,
			nidogen, elastina, tenascina,
			tromsbospondina, GAG,
			proteoglucanos, EMMPRIN,
			PSARC, uPA, PAI, colagenasa,
			gelatinasa, estromelisina

Glosario de abreviaturas

Citocinas, factores de crecimiento preparado/responde a	Interacciones con la matriz
TGF	Factor transformante del crecimiento	TIMP	Inhibidor tisular de las metaloproteinasas
PDGF	Factor de crecimiento derivado de las	GAG	Glucosaminoglucanos
	plaquetas
IGF	Factor de crecimiento de tipo insulina	PSARC	Proteína secretada ácida y rica en cisteína
IL	Interleucina	MEC	Matriz extracelular
FGF	Factor de crecimiento fibroblástico	EMMPRIN	Inductor de metaloproteinasas de la matriz
			extracelular
CTGF	Factor de crecimiento del tejido conjuntivo	uPA	Activador de plasminógeno de tipo
			uroquinasa
VEGF	Factor de crecimiento endotelial vascular	PAI	Inhibidor del activador de plasminógeno
MSH	Hormona estimulante de los melanocitos
EGF	Factor de crecimiento epidérmico
KGF	Factor de crecimiento de los queratinocitos
IFN	Interferón

I. Fuentes de queratinocitos

La presente invención no está limitada por la fuente de los queratinocitos. En algunas formas de realización preferidas, las células se obtienen de donantes vivos sometidos a operaciones de mama; antes de su uso, las células obtenidas de los donantes se archivan durante al menos seis meses, tras los cuales se analizan para determinar la presencia de virus (p. ej., virus de la hepatitis). En otras formas de realización preferidas, las células proceden de cadáveres. Después de que las células se han recogido del cadáver, antes de su uso se someten a pruebas para determinar la presencia de virus y otros microbios.

En general, los queratinocitos contemplados para usar con la presente invención son células primarias cultivadas (es decir, las células no derivan de líneas celulares) o son células que se han transfeccionado y desarrollado en una línea celular derivada de queratinocitos.

Ejemplo 1

En la sección experimental se ilustra una forma de realización de cómo se pueden aislar y procesar los queratinocitos para usar con la presente invención. Sin embargo, debería observarse que la presente invención no se limita a células primarias cultivadas.

Además, la presente invención contempla el uso de células que tienen características similares a los queratinocitos (p. ej., células que secretan factores de crecimiento, citocinas o queratina, cuyo comportamiento utilizan las células para estimular la cicatrización de las heridas). Estas células pueden derivar de, por ejemplo, células que no son de origen queratinocítico sino que han sido modificadas mediante técnicas recombinantes.

II. Crecimiento de células sobre soportes sólidos

Las células contempladas para usar con la presente invención (p. ej., queratinocitos) se cultivan en soportes sólidos trasplantables. La presente invención contempla el crecimiento de queratinocitos sobre soportes sólidos, incluidas superficies sólidas recubiertas con proteínas, como se ha descrito en la técnica. Por ejemplo, Gilchrest y col. [Cell Bio Int. Rep. 4:1009 (1980)] describe el crecimiento de queratinocitos sobre placas recubiertas por fibronectina en ausencia de una monocapa de 3T3, mientras que Schafer y col. [Exp. Cell. Res. 183:112 (1989)] describen un estudio de queratinocitos en geles de colágeno flotantes. Además, Cook y Buskirk [In vitro Cell Dev. Biol. 31: 132 (1995)] describen el crecimiento de queratinocitos sobre una variedad de matrices, incluidas membranas microporosas recubiertas con colágeno.

La presente invención no está limitada por la naturaleza del soporte sólido. De hecho, los procedimientos de la presente invención se pueden poner en práctica junto con cualquier soporte que permita el crecimiento de células, incluidos, entre otros, perlas microtransportadoras, geles y accesorios para placas de de cultivo. Cuando se desean perlas microtransportadoras, las perlas adecuadas se comercializan en numerosas fuentes; por ejemplo, Sigma comercializa perlas recubiertas tanto por colágeno como por gelatina, Pharmacia vende perlas con base de dextrano e ICN anuncia perlas de colágeno. En formas de realización preferidas, los queratinocitos se cultivan sobre perlas recubiertas con colágeno (p. ej., CYTOLINE 1^{TM} perlas microtransportadoras macroporosas (Pharmacia Biotech)).

Además, los accesorios para placas de de cultivo (es decir, matrices de soporte celular que en general comprenden una membrana que soporta el crecimiento celular) se comercializan en, entre otras fuentes, Collaborative Biomedical Products, Costarl ICN y Millipore. Tales accesorios con frecuencia comprenden polietileno, tereftalato, policarbonato, TEFLON® (Gore) y ésteres mixtos de celulosa. En formas de realización particulares, los accesorios para placas de de cultivo comprenden una membrana microporosa permeable que permite la difusión libre de iones y macromoléculas.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención contempla el uso de soportes sólidos trasplantables. Más específicamente, la presente invención contempla la aplicación a las heridas de soportes sólidos recubiertos por queratinocitos, albergados en un envoltorio. El uso de soportes sólidos trasplantables recubiertos por células para su aplicación a heridas ha sido descrito en la técnica. Por ejemplo, Hansbrough y col. [J. Am. Med. Assoc. 262:2125 (1989)] describen membranas de colágeno-glucosaminoglucano cubiertas con queratinocitos para su aplicación a heridas [Véase también, Cooper y col., J. Surg. Res. 48:528 (1990); Ronfard y col. Burns 17: 181 (1991); Tinois y col. Exp. Cell Res. 193:310 (1991); y Nanchahal y Ward, Brit. J. Plas. Surg, 45: 354 (1992)]. No obstante, no se ha informado acerca del envoltorio de soportes sólidos recubiertos por queratinocitos.

En términos generales, el crecimiento de queratinocitos y otras células "dependientes de anclaje" requiere la unión a la superficie y su diseminación con el fin de crecer. Por convención, tales células se han cultivado en las paredes de vasos no agitados (p. ej., matraces de cultivo tisular) y frascos rotativos [patente de EE.UU. nº 5.512.474 concedida a Clapper y col.]. Aunque no está limitada por la forma en la que se cultivan los queratinocitos en los soportes sólidos, la presente invención contempla el uso de estas técnicas convencionales para cultivar queratinocitos sobre soportes sólidos (véase el Ejemplo 1).

Otras técnicas para cultivar queratinocitos unidos a soportes sólidos se contemplan para usar con la presente invención. En algunas formas de realización, la presente invención contempla el uso de biorreactores para crecimiento celular [véase la patente de EE.UU. nº 5.459.069 concedida a Palsson y col. y la patente de EE.UU. nº 5.563.068 concedida a Zhang y col.]. Algunos biorreactores utilizan sistemas de fibra hueca. Con frecuencia, en un compartimento externo se encierran haces de fibras paralelas; las células se cultivan en la superficie externa de las fibras, mientras que el medio rico en nutrientes y en gas fluye por el centro de las fibras huecas, nutriendo las células [véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.512.474 concedida a Clapper y col.].

Además, junto con la presente invención se pueden usar biorreactores que utilizan microtransportadores (p. ej., perlas de dextrano derivadas de DEAE). En formas de realización preferida, se usan proteínas de adhesión celular como colágeno, fibronectina y laminina para anclar las células al soporte sólido; la proteína de adhesión celular más preferida es el colágeno. Los microtransportadores también se pueden incorporar una carga iónica para contribuir a la unión de la célula al microtransportador. Con frecuencia, los microtransportadores son perlas porosas que son lo bastante grandes como para permitir que las células migren y crezcan en el interior de la perla [véase la patente de EE.UU. nº 5.512.474 concedida a Clapper y col.].

En una forma de realización particularmente preferida, los queratinocitos se encuentran en una matriz de soporte rígida (una membrana semipermeable) que permite la adherencia y el crecimiento celular. Las células forman una matriz densa y tridimensional con una gran superficie que aumenta la modificación de la fase fluida que baña a las células; la matriz poblada por células se encuentra constantemente expuesta a los componentes fluidos de la herida, que difunden hacia el interior del reactor. El fluido se puede modificar y/o las células pueden secretar mediadores al fluido para optimizar el entorno de la herida.

III. Envoltorios

La presente invención contempla la colocación de perlas de colágeno recubiertas con queratinocitos en un envoltorio, que a su vez se coloca en una herida. En formas de realización preferidas, el envoltorio es una bolsa de malla estéril construida de un malla de poliéster tejida de grado médico. Aunque no se limitan a materiales de malla fabricados por ninguna empresa concreta, Tetko, Inc. y Saati fabrican en la actualidad materiales de malla adecuados para usar con la presente invención.

Por supuesto, también se pueden usar otros materiales adecuados (p. ej., nylon), que se encuentran dentro del alcance de la presente invención. De hecho, con la presente invención se puede cualquier material que exhiba biocompatibilidad cuando se coloque en una herida. Además, la presente invención contempla el uso de un envoltorio construido a partir de membranas, incluidas las membranas vendidas comercialmente por Gelman Sciences y
Millipore.

En una forma de realización preferida, los envoltorios se ensamblan en forma de recipientes similares a bolsillos con cuatro bordes y dos superficies. Estos recipientes pueden fabricarse mediante uno de varios modos. Por ejemplo, el envoltorio se puede crear mediante soldadura (es decir, unión para crear un sello) dos piezas de material (de aproximadamente las mismas dimensiones) juntas en tres bordes. El cuarto borde se deja abierto para permitir el llenado del envoltorio con las perlas de colágeno recubiertas por queratinocitos.

En una forma de realización alternativa, el envoltorio puede fabricarse a partir de una pieza de material, en primer lugar, plegando la pieza de material sobre sí misma. La región donde el material se superpone sobre sí mismo puede soldarse, lo que tiene como resultado la formación de un tubo cilíndrico. A continuación, se puede formar un bolsillo cerrando mediante soldado uno de los extremos abiertos del cilindro, dejando el otro extremo abierto para el llenado con las perlas de colágeno recubiertas por queratinocitos; este diseño de envoltorio posee la ventaja de requerir una soldadura menos.

La presente invención no está limitada a envoltorios ensamblados en forma de bolsillos de cuatro bordes ni la invención se limita a las técnicas de construcción de envoltorios descritas anteriormente. Por ejemplo, conjuntamente con la presente invención también se pueden usar envoltorios trapezoidales o circulares.

Para el ensamblaje de los envoltorios, la presente invención contempla el uso de una variedad de técnicas de sellado, incluidos la soldadura por ultrasonidos o la soldadura por calor. La técnica de soldadura por ultrasonidos es bien conocida en la técnica de fabricación de dispositivos médicos [véase, p. ej., las patentes de EE.UU. nº 4.576.715 y 5.269.917]. La presente invención no está limitada a una técnica de soldadura/sellado concreta; de hecho, con la presente invención se puede usar cualquier técnica adecuada de sellado, incluidos, entre otros, el sellado por ultrasonidos, radiofrecuencia, calor e impulsos.

En las formas de realización que comprendan un envoltorio de malla, la presente invención no está limitada por el tamaño del poro de la malla. Sin embargo, debería observarse que los poros demasiado pequeños pueden retrasar o impedir el movimiento de los materiales fuera del envoltorio. El intervalo preferido de tamaños de poro es de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 300 micrómetros. Asimismo, si se usa una membrana, la membrana debe ser permeable hasta el punto que permita que los factores celulares atraviesen la membrana hacia la herida.

En formas de realización preferidas, los envoltorios de la presente invención que contienen soportes sólidos están configurados en forma de bolsas de té (véase la FIGURA). Es decir, un extremo de un asa (3) (p. ej., un material de nylon biocompatible o exceso de un sellado por calor) está unida al envoltorio (1) que alberga el soporte sólido (4), mientras que el otro extremo de la cuerda está unido a un agarre (2). El agarre (2) se usa como un "asa" para ayudar en la colocación del envoltorio que contiene soporte sólido dentro de la herida y su retirada de la misma. La presente invención no está limitada por el material usado para construir el agarre; en formas de realización preferida, el agarre (2) comprende un material de poliéster de grado médico. En general, el agarre (2) se pega a la piel del sujeto en un punto exterior a la herida. El soporte sólido (4) tiene células (p. ej., queratinocitos) unidas; es preferible que dichas células sean viables.

IV. Transferencia de factores celulares

Tras la colocación del envoltorio en la herida, los factores celulares (p. ej., factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, citocinas, PDGF, el factor de crecimiento de tipo insulina, el TGF-alfa, la citocina factor de crecimiento de queratinocitos, el TNF, las quimiocinas, péptidos quimiotácticos, inhibidores tisulares de metaloproteinasas, etc.) excretados por los queratinocitos atraviesan el envoltorio hasta la herida. Los inventores de la presente invención han descubierto que no es necesario que los queratinocitos se encuentren en contacto directo con la herida. Aunque no se requiere un conocimiento de la razón por la cual tal contacto indirecto basta para la cicatrización de heridas con le fin de poner en práctica la presente invención, se cree que los queratinocitos donantes (es decir, los contenidos dentro del envoltorio) crean un entorno favorable para el crecimiento de los queratinocitos en la herida del sujeto. Por tanto, se piensa que los queratinocitos de la zona de la herida cicatrizada proceden del receptor y no del donante [véase Van der Merve y col., Burns 16: 193 (1990)]. Además, los queratinocitos pueden modificar de forma activa las características o los componentes del fluido de la herida (p. ej., modulando la actividad proteolítica para optimizar el entorno de la herida.)

Los inventores de la presente invención descubrieron de forma empírica que la colocación dentro de los envoltorios (descritos anteriormente) de soportes sólidos recubiertos con queratinocitos tenía como resultado una buena "toma" de queratinocitos en las heridas profundas; en comparación, los investigadores comunicaron previamente una toma ni siquiera ideal en las heridas más profundas [Van der Merve y col., Burns 16:193 (1990)] cuando se usaron otras técnicas.

Los inventores han encontrado que el uso de la presente invención junto con materiales de vendaje de heridas estándar no afecta de forma adversa a la capacidad para modificar el entorno de la herida. Por ejemplo, tras colocar los envoltorios que contienen queratinocitos en una herida, los propios envoltorios pueden estar cubiertos con vendajes oclusivos tales como hidrogeles, espumas, alginatos de calcio, hidrocoloides y películas. El ejemplo 2 de la sección Descripción Experimental está dirigido a una forma de realización en la que un envoltorio que contiene queratinocitos está cubierto con un vendaje de heridas.

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Descripción experimental

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas formas de realización y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

En la siguiente descripción experimental se aplican las siguientes abreviaturas: M (molar); mM (milimolar), \muM (micromolar); g (gramos); mg (miligramos), \mug (microgramos); kg (kilogramos); l (litros); ml (mililitros); dl (decilitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros), \mum (micrómetros); nm (nanómetros); h y hr (horas); min (minutos); s y seg (segundos); FDA (Agencia americana del medicamento); AET, Inc. (Middletown, DE); Abbott (Abbott Laboratories, Chicago, IL); American International Electric Co. (Santa Fé Springs, CA); Collaborative Biomedical Products (Bedford, MA); Gelman Sciences (Ann Arbor, MI); ICN (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA); Jackson Labs (Bar Harbor, ME); Labelon Corp. (Canadaigua, NY); Labline (Melrose Park, IL); Mallinckrodt Veterinary (San Luis, MO); Millipore (Millford, MA); Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia); Richard-Allen, Inc. (Richland, MI); Saati (Stanford, CT); Sigma (San Luis, MO); Tetko, Inc. (Depew, NY); 3M Healthcare (St. Paul, MN); y Thunderware (Orinda, CA).

Ejemplo 1

Los experimentos de este ejemplo demuestran que queratinocitos de cultivo humano cultivados en microtransportadores macroporosos y contenidos en un envoltorio poroso mejoran la cicatrización en heridas creadas mediante cirugía en ratones.

A. Metodología experimental Preparación de queratinocitos humanos Aislamiento y crecimiento de queratinocitos humanos

Los queratinocitos humanos (certificados por la AATB; programa de cultivo de queratinocitos de la Universidad de Michigan) se aislaron en la Unidad de Traumatología de la Universidad de Michigan a partir de piel de espesor SPLIT.

La tripsinización de la piel de espesor SPLI se efectuó del siguiente modo. La piel se colocó con la dermis hacia abajo en placas petri de 150 mm. Las piezas se cortaron en piezas más pequeñas (alrededor de 2 cm x alrededor de 0,3 cm) y se empaparon en una solución estéril de HEPES 30 mM, glucosa 10 mM, KCl 3 mM, NaCl 130 mM, tampón Na_{2}HPO_{4} 1 mM, pH 7,4, con 50 unidades de penicilina y 50 \mug de estreptomicina (Sigma, P-0906). Tras empapar durante 1-2 h a 4ºC, se aspiró el tampón y a las placas que contienen el tejido cutáneo se añadió tripsina al 0,09% (Sigma, Tipo IX) en un tampón con penicilina y estreptomicina.

Tras tripsinizar durante la noche a temperatura ambiente, se aspiró la solución enzimática y a las piezas de piel se añadió MCDB completo 153 (Gibco, Grand Island, NY) que contenía inhibidor de tripsina. El medio completo MCDB 153 se preparó mediante la complementación de medio MCDB 153 básico (Gibco, Grand Island, NY), preparado como han descrito Boyce y Ham ["Normal human epidermal keratinocytes", In Vitro Models for Cancer Research (Weber y Sekely, eds.) CRC press, Boca Ratón, FL, pág. 245-274 (1985), con hidrocortisona 0,6 \muM (0,218 \mug/ml), 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 5 \mug/ml de insulina, extracto de hipófisis bovina al 6% y CaCl_{2} 0,15 mM.

Se separó la dermis de la epidermis y suavemente se rasparon las células epidérmicas basales de ambos segmentos de la piel. La suspensión celular se combinó en tubos de centrifugación cónica de 50 ml, se centrifugó suavemente a temperatura ambiente y se resuspendió en 50 ml de medio completo más suero quelado al 2%.

Las células se contaron utilizando un hemocitómetro y 20 x 10^{8} células se sembraron en matraces de plástico T-75 Coming y se cultivaron a 37ºC con gas CO2 al 5% utilizando un incubador humidificado. Después de 3 días, se eliminó el medio de crecimiento usado se añadió MCDB 153 completo sin suero. Las células se nutrieron en días alternos.

Las células se pasaron durante la fase log de crecimiento. A continuación, las células se tripsinizaron utilizando tripsina al 0,025% (tipo IX) más EDTA al 0,01% en el tampón HEPES. Las monocapas se lavaron con el tampón dos veces, después se añadieron 2-3 ml de solución enzimática recién preparada (o una alícuota congelada). Tras 1 min a 37ºC, la solución enzimática se aspiró suavemente y las células se introdujeron en matraces a 37ºC durante 2-3 min hasta que al golpear suavemente el matraz, del fondo se desprendían láminas de células. Los medios se neutralizaron con 1-3 ml de medio 153 MCDB más inhibidor de tripsina al 0,03% (Sigma). Las células se contaron, se centrifugaron y se sembraron de 0,5 a 1,0 x 10^{6} células por matraz T-75. Las células se pasaron de 3 a 4 veces.

Lavado de las perlas CYTOLINE 1^{TM}

Cinco gramos de perlas microtransportadoras macroporosas CYTOLINE 1^{TM} (Pharmacia Biotech) se introdujeron en la autoclave durante 10 min en 40 ml de agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Tras los procedimientos de autoclave, las perlas se enfriaron y se aspiró el agua. Las perlas se resuspendieron en 40 ml de agua Milli Q y a continuación se agitaron a velocidad moderada en un agitador orbital Labline durante 10 min. El agua se volvió a aspirar y se realizó un lavado final con 40 ml de agua Milli Q.

Las perlas se transfirieron a un tubo de cultivo cónico de 50 ml, se aspiró el agua y se añadieron 30 ml de NaOH 0,1N. Las perlas se incubaron a temperatura ambiente durante la noche. La solución de NaOH se aspiró de las perlas y las perlas se resuspendieron en 50 ml de agua Milli Q. La alícuota se transfirió a un matriz Erlenmeyer de 125 y se agitó a velocidad moderada durante diez minutos. El agua Milli Q se aspiró de las perlas y las perlas se resuspendieron en agua Milli Q; este procedimiento de aspiración/resuspensión se repitió un total de cinco veces. El pH era neutro (es decir, inferior a 8), medido con papel de pH.

Las perlas se aspiraron y resuspendieron en 40 ml de PBS sin Mg^{2+} y Ca^{2+} y se introdujeron en la autoclave durante 30 min a 121ºC.

Crecimiento de queratinocitos en perlas CYTOLINE 1^{TM}

En la autoclave se introdujo una suspensión que contenía 10 ml de solución de PBS y 5 g de perlas (contenidas en un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 ml) como se ha descrito anteriormente. El PBS se decantó y a las perlas se añadieron 50 ml de medio 153 MCDB completo. Las células se acondicionaron en el medio a 37ºC con gas CO_{2} al 5% durante 48 h.

El medio se decantó y las perlas se transfirieron a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Se añadieron de diez a 15 ml de medio y la suspensión se centrifugó a 1000 rpm durante 3 min. El medio se volvió a decantar y se añadieron 30 x 10^{6} células de mama (de un pase) de donante vivo 1, nunca congelado). Tras agitar suavemente las células con las perlas durante 5 minutos, las células y las perlas se vertieron en un frasco rotativo de vidrio de 250 ml y se añadieron 50 ml de medio; Esto se realizó utilizando un sistema de crecimiento agitado con un fermentador.

Como ensayo de toxicidad del frasco rotativo de vidrio se extrajeron 5 ml de células y perlas y se cultivaron en un matraz T-25 para determinar el crecimiento de las células en el fondo de plástico del matraz en presencia de las perlas. El frasco rotativo de vidrio se incubó durante la noche a 37ºC, tras lo cual al frasco rotativo se añadieron 100 ml de medio adicional y se inició la rotación del frasco rotativo (velocidad de rotación = una vuelta/15 s).

Para nutrir las células se extrajo una alícuota de medio y se sustituyó por medio reciente, se ajustó al pH correcto con gasificación con CO_{2}. Las células se alimentaron cada 48 horas.

Diseño experimental

Se llevó a cabo un ensayo con animales de 8 días de duración con dos grupos de diez animales cada uno. Los vendajes de las heridas (véase más adelante) se cambiaron en días alternos a parir del día 0. Se obtuvieron medidas y fotografías de la zona de la herida los días 0, 2, 4, 6 y 8.

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles dentro de una campana de flujo laminar. Se usaron ratones hembra Nu/J de cinco semanas de edad (Jackson Labs). Los ratones Nu/J contienen una mutación recesiva localizada en el cromosoma 11 son atímicos (deficientes en células T). Los ratones poseen una cifra de linfocitos reducida compuesta casi por completo de células B, una respuesta normal de IgM a antígenos independientes del timo, una respuesta mala a los antígenos del timo, una mayor actividad de macrófagos y células NK y una mayor susceptibilidad a la infección. Los ratones Nu/J no rechazan los injertos cutáneos y tumorales alogénicos y xenogénicos.

Los ratones se anestesiaron con metofano (Mallinckrodt Veterinary) y se prepararon con etanol. Con tijeras quirúrgicas FINE, se creó una herida quirúrgica de espesor completo de aproximadamente 80 mm^{2} en la espalda de los ratones (la profundidad de la herida podía medirse mediante el panniculus carnosis, pero la piel de ratón es tan fina que no se usó como indicador en la presente). Los vendajes de las heridas (véase a continuación) se aseguraron al extremo anterior de la herida con una grapa quirúrgica. Después, cada ratón se devolvió a su jaula para contenido biopeligroso.

Los días 2, 4, 6 y 8 se devolvieron a la campana de flujo laminar para la extracción de la grapa y sustitución de la bolsa. Se sujetó ligeramente a los animales mientras se obtenían las mediciones del área y fotográficas (se describe más adelante. El vendaje se reemplazó y se aseguró; todos los cambios de vendaje se realizaron utilizando técnicas estériles sin anestesia general.

Vendajes de las heridas

Las heridas se vendaron con queratinocitos humanos cultivados que han crecido en perlas (queratinocitos/perlas) en una bolsa DELNET^{TM} (P530 Natural; AET, Inc.) o una bolsa DELNET^{TM} solo (P530 Natural; AET, Inc.); las bolsas DELNET^{TM} eran casi cuadradas (alrededor de 23 mm x 25 mm). Las junturas de las bolsas se prepararon con una unidad de sellado por impulso de calor (American International Electric Co.). Antes de su aplicación a los ratones, las bolsas DELNET^{TM} se esterilizaron mediante gas con óxido de etileno y se colocaron en un envase estéril. Con una tirita BANDAID^{TM} se cubrieron las bolsas DELNET^{TM} y se aseguró con grapas quirúrgicas (Richard-Allen, Inc.). LA bolsa se grapó a la tirita y la titita se grapó al ratón.

El ensamblaje de la bolsa y la perla se realizó en una campana de cultivo tisular. Dentro de una campana de flujo laminar, la suspensión de queratinocitos/perlas se transfirió a la bolsa DELNET^{TM} con una pipeta de vidrio. Alrededor de 250 ml de la suspensión de queratinocitos/perlas se colocaron en la bolsa. Después de que las perlas se cargaran en la bolsa, el sellado final se realizó con un bisturí quirúrgico calentado en un esterilizador de perlas de vidrio. La bolsa DELNET^{TM} que contiene la suspensión de queratinocitos/bolsa se denomina "perlas/bolsa", mientras que la bolsa DELNET^{TM} sin las perlas se denomina "bolsa". Las bolsas y las perlas/bolsas se colocaron en medio 153 MCDB completo descrito anteriormente tras su carga y se sellaron con calor.

Medición del área de la herida

El área total de las heridas de ratones se realizó como se ha descrito previamente [Schwartz y col., Wound Repair and Regeneration 3: 204-212 (1995)). Brevemente, el área de la herida se trazó en una transparencia (Apollo, Ronkonkoma, NY) con un marcador fino. La transparencia se fotocopió en papel sencillo y posteriormente se escaneó en un archivo PIC con un escáner manual Lighting Scan Pro 256 (Thunderware). El área del tejido se calculó mediante un análisis de área no rectangular utilizando software Statworks (una diferencia estadísticamente significativa fue p< 0,05).

B. Resultados experimentales

En la tabla 2 se presenta el área del tejido de la herida (mm^{2}) basal (día 0) y los días 2, 4, 6 y 8 para cada ratón que recibió las bolsas que contenían perlas recubiertas con queratinocitos (peras/bolsas); también se indica la reducción del tamaño de la herida en forma de un porcentaje del tamaño original de la herida para cada ratón. En la tabla 3 se presentan datos análogos para los ratones que recibieron bolsas solas.

En la tabla 4 se presentan los datos acumulados para i) los ratones con perlas/bolsas y ii) los ratones con sólo bolsas.

TABLA 2

ID	Ratón 1	Ratón 2	Ratón 3	Ratón 4	Ratón 5
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	117,02		66,29		89,89		69,9		103,82
Día 2	92,44	21	90,87	0	63,13	30	51,34	27	180,56	0
Día 4	70,31	40	68,81	0	31,6	65	40,65	42	85,68	17
Día 6	80,87	31	54,21	18	32,73	64	39,24	44	89,76	14
Día 8	50,05	57	37,18	44	26,73	70	31,95	27	58,58	44

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ID	Ratón 6	Ratón 7	Ratón 8	Ratón 9	Ratón 10
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	61,61		58,81		80,08		78,02		65,5
Día 2	40,97	34	49,84	15	111,31	0	103,48	0	79,92	0
Día 4	28,5	54	21,11	64	77,31	3	48,44	38	55,03	16
Día 6	23,53	62	15,89	73	61,27	23	41,87	46	60,73	7
Día 8	10,31	83	12,48	79	29,55	63	33,69	57	57,29	13

TABLA 3

ID	Ratón 11	Ratón 12	Ratón 13	Ratón 14	Ratón 15
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	49,58		87,16		40,29		90,81		55,23
Día 2	71,23	0	160,23	0	45,5	0	201,15	0	61,55	0
Día 4	51,6	0	78,68	10	33,21	18	156,42	0	52,19	6
Día 6	26,48	47	52,24	40	27,95	31	92,19	0	36,61	34
Día 8	33,84	32	52,4	40	15,19	62	59,15	35	30,61	45

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ID	Ratón 16	Ratón 17	Ratón 18	Ratón 19	Ratón 20
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	120,42		59,11		120,15		78,29		55,44
Día 2	90,26	25	151,4	0	151,4	0	114,18	0	80,89	0
Día 4	59,84	50	124,81	0	124,81	0	138,73	0	66,58	0
Día 6	47,11	61	92,94	23	92,94	23	92,39	0	59,6	0
Día 8	26,95	78	90,71	35	78,32	35	65,52	16	38,79	30

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TABLA 4

Día 0 Tamaño (mm)
Perlas/bolsas	Media	79,09
	DE	19,2
Solo bolsas	Media	75,64
	DE	28,64

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% más	Día 2	Día 4	Día 6	Día 8
pequeña	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo
	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas
Media	12,7	2,5	33,9	8,4	38,2	26,6	56,4	37,3
Desviación	14,29	7,9	23,82	15,83	23,06	22,62	21,12	21,78
estándar
Significación	P< 0,027	P< 0,008	P< 0,19	P< 0,05
(< 0,05)

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Como indican los datos de las Tablas 2-4, las perlas/bolsas mostraron una diferencia estadísticamente significativa en la cicatrización de heridas (es decir, una reducción del área de la herida) el día 2 en comparación con las bolsas solas (véase la Tabla 4, p< 0,027). El día 4, las heridas del ratón tratados con perlas/bolsas (Tabla 2 1) presentaron una reducción significativa en el área de la herida en comparación con las heridas del ratón tratado con las bolsas solas (Tabla 3), como indica el nivel de significación (p< 0,008) en la Tabla 4. El día 6, no se observaron diferencias significativas en la cicatrización de heridas entre los dos grupos (véase la Tabla 3, p< 0,16). Sin embargo, el día 8 se observó de nuevo una reducción estadísticamente significativa en el área de heridas en el grupo tratado con perlas/bolsas (Tabla 2) en comparación con el grupo tratado con las bolsas solo (Tabla 3) (véase la Tabla 4, p< 0,05).

Mediante los experimentos de este ejemplo se muestra que los queratinocitos humanos cultivados cuyo crecimiento se ha inducido sobre microtransportadores macroporosos (perlas/bolsa) estimulan la cicatrización de heridas. El modelo de ratones usado es predictivo de que los queratinocitos humanos cultivados en microtransportadores macroporosos contenidos en bolsas aumentarán la cicatrización de heridas en seres humanos.

Ejemplo 2

Mediante los experimentos de este ejemplo se demuestra que los queratinocitos humanos cultivados cuyo crecimiento se ha inducido sobre microtransportadores macroporosos y contenidos en un envoltorio poroso que después está cubierto con un material de vendaje de heridas mejoran la cicatrización en heridas creadas mediante cirugía en ratones.

A. Metodología experimental

Los experimentos de este ejemplo se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1, con las siguientes excepciones. El grupo de ratones que recibió las perlas microtransportadoras macroporosas CYTOLINE 1^{TM} recubiertas con queratinocitos (Pharmacia Biotech) (es decir, el grupo tratado con perlas/bolsas) estaba compuesto por cinco animales, mientras que el grupo que recibió sólo las bolsas (es decir, el grupo tratado con sólo las bolsas) estaba compuesto por cuatro animales. (Se han marcado de 2 a 5 porque el Ratón 1 espiró durante la anestesia). En este ejemplo, las bolsas del grupo tratado con perlas/bolsas y el grupo tratado sólo con bolsas se cubrieron con un vendaje de película de poliuretano (TEGADERM^{TM}, 3M Health Care, Rt. Paul, MN) con un producto de celofán.

Más específicamente, las heridas se vendaron con queratinocitos cultivados humanos en crecimiento sobre perlas (queratinocitos/perlas) en una bolsa DELNET^{TM} (P530 Natural; AET, Inc.) o una bolsa DELNET^{TM} sola (P530 Natural; AET, Inc.). A continuación, las bolsas se cubrieron con un vendaje TEGADERM^{TM}, que, a su vez, se cubrió con una tirita BANDAID^{TM} (3M Healthcare). Las bolsas se graparon al ratón.

B. Resultados experimentales

En la tabla 5 se presentan las áreas de tejido de herida (mm^{2}) basal (día 0) y los días 2, 4, 6 y 8 la para cada ratón que recibió bolsas que contenían perlas recubiertas por queratinocitos (perlas/bolsas); también se indica la reducción del tamaño de la herida en forma de un porcentaje del tamaño original de la herida para cada ratón. En la tabla 6 se presentan datos análogos para los ratones que recibieron bolsas solas.

En la tabla 7 se presentan los datos acumulados para i) los ratones con perlas/bolsas e ii) los ratones con sólo bolsas

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TABLA 5

ID	Ratón 2	Ratón 3	Ratón 4	Ratón 5	Ratón 6
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	182,41		132,68		155,53		173,76		164,24
Día 2	162,43	11	168,57	0	157,02	0	190,51	0	216,66	0
Día 4	136,73	25	122,37	8	96,69	38	164,7	6	136,72	17
Día 6	74,71	59	89,91	33	49,66	68	25	86	25	85
Día 8	13,91	93	10,78	92	4,59	97	18,24	90	27,87	83

TABLA 6

ID	Ratón 7	Ratón 8	Ratón 9	Ratón 10
	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más	mm^{2}	% más
		pequeña		pequeña		pequeña		pequeña
Día 0	134,14		198,31		124,1		229,96
Día 2	151,4	0	170,21	0	166,42	0	203,36	0
Día 4	206,34	0	204,39	0	160,69	0	193,03	16
Día 6	112,29	22	121,92	39	117,33	5	64,92	22
Día 8	16,86	88	53,45	73	61,36	51	59,3	74

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TABLA 7

Día 0 Tamaño (mm^{2})
Perlas/bolsas	Media	155,76
	DE	22,47
Solo bolsas	Media	171,16
	DE	50,9

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% más	Día 2	Día 4	Día 6	Día 8
pequeña	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo	Perlas/	Sólo
	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas	bolsas
Media	2,2	0	18,8	0	66,2	22	91	71,5
Desviación	4,9	0	13,1	0	21,8	13,8	5,1	15,2
estándar
Significación	P< 0,407	P< 0,026	P< 0,010	P< 0,030
(< 0,05)

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Como indican los datos de las tablas 5-7, se mostró que las perlas/bolsas presentaban una diferencia estadísticamente significativa en la cicatrización de heridas (es decir, una reducción del área de la herida) el día 4 en comparación con las bolsas solas (véase la tabla 7, p< 0,026). La diferencia estadísticamente significativa en la cicatrización de heridas entre los dos grupos se mantuvo los días 6 y 8 (p< 0,010 y p< 0,030, respectivamente).

La comparación de los datos del la tabla 7 con los de la tabla 4 (Ejemplo 1) indica que los vendajes sin
TEGADERM^{TM} de las heridas comienzan a contraerse antes que los vendajes con TEGADERM^{TM}. Más específicamente, las heridas de los animales que recibieron perlas/bolsas tratadas sin TEGADERM^{TM} fueron un 12,7% más pequeñas hacia el día 2 y un 33,9% más pequeñas hacia el día 4, mientras que las heridas de los animales que recibieron perlas/bolsas tratadas con TEGADERM^{TM} fueron un 2,2% y un 18,8% más pequeñas los mismos días. Sin embargo, el tamaño de las heridas de los animales que recibieron perlas/bolsas tratadas con TEGADERM^{TM} se redujeron más que las heridas tratadas sin TEGADERM^{TM} los días 6 y 8. Aunque para la práctica de la presente invención no se requiere un conocimiento del mecanismo de este efecto, se cree que se debe, en parte, a la capacidad de TEGADERM^{TM} para mantener las heridas húmedas.

Los experimentos de este ejemplo indican que los sistemas y procedimientos de la presente invención pueden ponerse en práctica en combinación con medios y procedimientos convencionales de cicatrización de heridas.

Sobre la base del análisis precedente y de los materiales experimentales, debe quedar claro que la presente invención proporciona sistemas y procedimientos eficaces y eficientes para la cicatrización de heridas, en especial para la cicatrización de heridas crónicas. Los dispositivos y procedimientos se pueden usar solos o combinados con otros medios empleados tradicionalmente en la cicatrización de heridas.

Claims

1. Un sistema para el tratamiento de heridas, que comprende:

a): queratinocitos en un soporte sólido; y

b): un envoltorio que comprende material de malla que tiene poros, en el que dicho envoltorio alberga dicho soporte sólido, en el que dicho envoltorio se sella para impedir la salida de dicho soporte sólido de dicho envoltorio.

2. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos queratinocitos son viables.

3. El sistema de la reivindicación 1, en el que dicho soporte sólido comprende perlas.

4. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos queratinocitos crecen en perlas.

5. El sistema de la reivindicación 3, en el que dichas perlas son macroporosas.

6. El sistema de la reivindicación 3, en el que dichas perlas están recubiertas con colágeno.

7. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos poros son lo bastante grandes como para permitir que dichos queratinocitos atraviesen dicho material de malla.

8. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos poros son demasiado pequeños como para permitir que dichos queratinocitos atraviesen dicho material de malla.

9. El sistema de la reivindicación 1, en el que dicho material de malla comprende poliéster.

10. El sistema de la reivindicación 1, en el que dicho envoltorio comprende una membrana biocompatible.

11. El sistema de la reivindicación 1, en el que dicho envoltorio comprende además medios para retirar dicho envoltorio de una herida.

12. El sistema de la reivindicación 11, en el que dicho medio de eliminación comprende una cuerda unida a dicho envoltorio.

13. El uso de queratinocitos en un soporte sólido sellado dentro de un envoltorio que comprende material de malla con poros, lo que proporciona un envoltorio que contiene queratinocitos sellado, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que dicho soporte sólido comprende perlas.

15. El uso de la reivindicación 13, en el que dichas perlas son macroporosas.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dichas perlas están recubiertas con colágeno.

17. El uso de la reivindicación 13, en el que dichos poros son lo bastante grandes como para permitir que dichos queratinocitos atraviesen dicho material de malla.

18. El uso de la reivindicación 13, en el que dichos poros son demasiado pequeños como para permitir que dichos queratinocitos atraviesen dicho material de malla.

19. El uso de la reivindicación 13, en el que dicho material de malla comprende poliéster.

20. El uso de la reivindicación 13, en el que dicho envoltorio comprende una membrana biocompatible.

21. El uso de la reivindicación 13, en el que el medicamento además comprende un vendaje para cubrir dicho envoltorio que contiene queratinocitos colocado en dicha herida.