ES2252874T3 - Utilizacion de acido linoleico conjugado para tratamiento de la diabetes mellitus tipo ii. - Google Patents
Utilizacion de acido linoleico conjugado para tratamiento de la diabetes mellitus tipo ii.Info
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Abstract
La utilización de ácido linoleico conjugado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
Description
Utilización de ácido linoleico conjugado para el
tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
La presente invención trata sobre el tratamiento
de la diabetes mellitus tipo II.
La diabetes es una de las enfermedades
metabólicas más comunes y afecta a cientos de millones de individuos
en todo el mundo. Existen dos formas de la diabetes mellitus: Tipo
1 (insulino-dependiente) y Tipo II (no
insulino-dependiente). La enfermedad puede conducir
a complicaciones serias, incluyendo hiperglicemia, macroangiopatía,
microangiopatía, neuropatía, nefropatía y retinopatía. Los métodos
para el tratamiento de la diabetes han incluido la administración
de insulina en el caso de la diabetes tipo I y la administración de
diversos agentes hipoglicémicos en el caso de la diabetes tipo
II.
Muchos de los agentes hipoglucémicos conocidos
muestran efectos secundarios no deseables, y en ciertos casos son
tóxicos.
ZA-A-9-603
360 trata sobre un amplio rango de usos terapéuticos para mono- o
diésteres de 1,3-propanodiol, en los cuales el/los
residuos ácidos tienen 12-30 átomos de carbono. La
especificación ZA revela (entre otras muchas posibilidades) la
utilización de diésteres de 1,3-propanodiol en los
cuales uno de los ácidos esterificantes es GLA o DGLA y el otro es
GLA, DGLA, SA, EPA, DAJ, CLA o CA para el tratamiento de
"complicaciones en la diabetes" y la "mejora de las
respuestas de la insulina en la diabetes y en la
pre-diabetes".
US-A-5 518 751
(equivalente a EP-A-624 317) revela
la producción de leche y leche en polvo que incorporan una fracción
grasa que contiene ácidos grasos libres insaturados (por ejemplo
ácido oleico, ácido linoleico (que puede o no estar conjugado),
ácido \alpha-linoleico y ácidos grasos C_{20} y
C_{22} insaturados). Los ácidos grasos se incluyen con el
propósito de prevenir o reducir las enfermedades cardiovasculares,
atropías, desórdenes reumáticos o la diabe-
tes.
tes.
US-A-5 208 356
revela sales y ésteres de ácido linoleico conjugado (CLA)
sustancialmente puras y no tóxicas que son útiles como
antioxidantes y como inhibidores del crecimiento del moho. También
se revelan métodos para la fabricación del isómero
cis-9, trans-11 del ácido
linoleico.
US-A-5 585 400
revela el tratamiento de animales frente a los efectos adversos de
la hipersensibilidad mediada por tipo I o I_{R}E en el animal
mediante la adminsitración de CLA (o de una sustancia que se
convierte en CLA en el animal).
Journal of Nutrition, vol. 124, No. 5, 1994,
páginas 694-701 revela que el CLA es producido en
ratas convencionales pero no libres de microbios a las que se
alimenta con ácido linoleico.
Por consiguiente, existe la necesidad de usos de
composiciones adicionales para el tratamiento de la diabetes
mellitus tipo II. La presente invención se halla dirigida a esta
necesidad.
Estos y otros objetos y ventajas de la presente
invención serán obvios a partir de las descripciones que se
incluyen aquí.
La Fig. 1 muestra el mecanismo de acción de los
proliferadores de peroxisoma.
La Fig. 2 muestra gráficos de la cantidad de
cloramfenicol acetiltranferasa producida como porcentaje del
control frente a la concentración de CLA y de WY 14,643 100 \muM
con distintos subtipos de PPAR. Panel izquierdo, PPAR\alpha;
Panel central, PPAR\beta; Panel derecho, PPAR\gamma.
La Fig. 3 muestra los efectos biológicos de la
activación del receptor activado por proliferador de peroxisoma
(PPAR) por CLA.
La Fig. 4 representa un gráfico de barras que
muestra la extensión en la cual diversos isómeros de CLA activan
los 3 distintos subtipos de PPAR. Todos los compuestos químicos se
dieron a 100 \muM en dimetilsulfóxido (DMSC). Se muestran los
controles positivos para PPAR\alpha (Wy 14,643), PPAR\beta
(Bezafibrato; ácido 2-[4-[2-[(4-clorobenzoíl)
amino]-etil]fenoxi]-2-metilpropanoico])
y PPAR\gamma (Troglitazona) para propósitos de comparación. El
furano utilizado fue el ácido
8-(5-hexil-2-furil)-octanoico,
que es un producto de oxidación del CLA.
Los datos muestran el promedio de dos
experimentos.
La Fig. 5 representa gráficos de barras que
muestran la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros del CLA
activan el PPAR\alpha completo. Panel A: muestra la activación del
PPAR\alpha completo de ratón. Las células transfectadas se
trataron durante seis horas con concentraciones crecientes de una
mezcla de CLA (0 \muM, 5 \muM, 10 \muM, 50 \muM, 100
\muM, 150 \muM o 200 \muM).
Los asteriscos denotan valores que son
significativamente distintos de las células tratadas con DMSO (p
< 0.05, n = 3); Panel B: muestra la activación del PPAR\alpha
completo por los diversos isómeros geométricos de CLA. Las células
transfectadas se trataron durante seis horas con 100 \muM de cada
uno de los activadores mostrados. Las distintas letras denotan
diferencias significativas (p < 0.05, n=3).
La Fig. 6 representa un gráfico de barras
mostrando la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros de CLA
activan el PPAR\beta completo de ratón. Las células transfectadas
se trataron con 100 \muM de los compuestos indicados. Los
asteriscos denotan diferencias significativas (p < 0.01,
n=3).
La Fig. 7 representa un gráfico de barras
mostrando la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros de CLA
activan el PPAR\gamma completo de ratón. Las células transfectadas
se trataron durante seis horas con 100 \muM de los compuestos
indicados. Los asteriscos denotan diferencias significativas (p <
0.05, n=3).
La Fig. 8 presenta un gráfico de barras que
muestra los efectos del CLA sobre los marcadores de diferenciación
en preadipocitos 3T3-L1. Las células de preadipocito
de ratón se trataron a confluencia durante 48 horas con un medio de
inducción que contiene la concentración indicada de CLA, Wy 14,643
(Wy) 100 \muM o un vehículo (DMSO). Posteriormente se añadió
medio de inducción con insulina a las células.
Se llevó a cabo un ensayo de
RT-PCR cuantitativo utilizando estándares internos
específicos para cada gen. Los datos se expresan como el promedio
de tres muestras como el porcentaje de células tratadas con DMSO que
corrigen la expresión de \beta-actina.
La Fig. 9 presenta un gráfico de barras que
muestra los efectos del CLA y de la troglitazona (TZD) sobre la
expresión génica específica para un tejido. ACO y mAP2 se
cuantificaron mediante RT-PCR.
Los asteriscos denotan una diferencia
estadísticamente significativa respecto a las ratas alimentadas con
la dieta de control (P < 0.05).
La Fig. 10 representa un gráfico que muestra el
efecto del CLA en la dieta sobre la tolerancia a la glucosa. Se
alimentaron ratas Zucker delgadas (Panel A) o fa/fa (obesas, Panel
B) con dietas experimentales durante 14 días y se midió la
tolerancia a la glucosa.
Los valores representan la glucosa promedio
(mg/dl) \pm S. D. (n = 4 ratas delgadas u 8 ratas fa/fa).
Con el propósito de facilitar la comprensión de
los principios de la invención, se hará referencia a continuación a
los ejemplos de realización preferidos y al lenguaje específico que
se utilizará para describirlos.
La presente invención trata sobre el tratamiento
de la diabetes mellitus tipo II mediante la administración de una
cantidad con eficacia terapéutica de CLA. La administración de CLA
presenta la ventaja de normalizar la tolerancia a la glucosa en
animales mientras que también reduce los niveles de insulina,
triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma. La invención puede
implicar la utilización de isómeros de CLA purificados o de mezclas
purificadas de isómeros de CLA, por ejemplo una cantidad con
eficacia terapéutica de ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico
purificado, ácido
trans,cis-10,12-octadecadienoico
purificado, una mezcla de ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido
trans,cis-9,11-octadecadienoico, u
otro isómero purificado de CLA.
La invención abarca la utilización para el
tratamiento de la diabetes mellitus tipo II en un animal de una
cantidad con eficacia terapéutica de CLA, incluyendo sus sales, sus
ésteres (incluyendo, por ejemplo, monoglicéridos, diglicéridos y
triglicéridos), sus isómeros activos y sus mezclas. El término CLA
hace referencia a un grupo de isómeros posicionales y geométricos
del ácido linoleico (ácido
cis,cis-9,12-octadecadienoico). Los
isómeros posicionales incluyen los isómeros que tienen enlaces
dobles bien en los átomos de carbono 9 y 11 o en los átomos de
carbono 10 y 12, mientras que los isómeros geométricos incluyen los
isómeros que tiene las configuraciones cis y/o trans. Así pues,
existen diversos posibles isómeros del CLA, que incluyen, pero sin
estar limitados a: ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico; ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico;
ácido
trans,cis-9,11-octadecadienoico;
ácido
trans,trans-9,11-octadecadienoico;
ácido
cis,cis-10,12-octadecadienoico;
ácido
cis,trans-10,12-octadecadienoico;
ácido
trans,cis-10,12-octadecadienoico; y
ácido
trans,trans-10,12-octadecadienoico.
Los isómeros ácido cis,trans-9,11 y ácido
trans,cis-9,11 todavía no han sido aislados
independientemente el uno del otro y en la literatura se utiliza el
término aproximado ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico para
hacer referencia a los isómeros cis,trans-9,11 y
trans,cis-9,11.
El CLA utilizado en la presente invención puede
prepararse utilizando las técnicas conocidas en el campo de la
técnica y en la literatura, o puede obtenerse como un producto
comercial.
El CLA se puede obtener comercialmente de
compañías como, por ejemplo, Pharmanutrients, Inc., Lake Bluff, IL;
NuChek Prep, Elysian MN; y Peak Nutrition, Syracuse, NE. Sin
embargo, se prefiere el CLA vendido por
NuCheck Prep. Las proporciones relativas de los isómeros pueden variar en los CLA adquiridos comercialmente. La composición comercial también puede incluir otros ácidos grasos como ácido linoleico así como otros lípidos como hidrocarburos de cadena lineal con grupos terminales polares. Por ejemplo, la mezcla de CLA puede incluir otros ácidos grasos conocidos en el campo de la técnica, saturados o insaturados, o productos de degradación del CLA. La composición comercial puede incluir también antioxidantes como vitamina E, hidroxianisol butilado (BHA) o hidroxitolueno butilado (BHT). El CLA también puede sintetizarse mediante métodos conocidos en el campo de la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar CLA a partir de la isomerización del ácido linoleico utilizando, por ejemplo, una especie generadora de radicales y una proteína rica en residuos de azufre como las que se conocen en el campo de la técnica y tal como se describe en Dormandy TL, Wickens DG, Chem.Phys. Lipids 45: 353-64 (1987). Como otro ejemplo adicional, el CLA se puede sintetizar a partir de ácido linoleico o bien de aceite de cártamo bajo atmósfera inerte, con unos pasos posteriores de acidificación y extracción tal como se describe en la U. S. Patent No. 5,670,082 a Cook y col.. Además, algunos isómeros específicos de CLA, como el isómero trans,trans 9-11, el isómero cis,cis-9,11, el isómero cis,trans-9,11 (en combinación con el isómero trans,cis-9,11) y el isómero cis,trans-10,12 se pueden sintetizar, de hecho, en forma pura utilizando los métodos conocidos en el campo de la técnica. Las sales de CLA son aquellas conocidas en el campo de la técnica, incluyendo las sales de sodio y potasio.
NuCheck Prep. Las proporciones relativas de los isómeros pueden variar en los CLA adquiridos comercialmente. La composición comercial también puede incluir otros ácidos grasos como ácido linoleico así como otros lípidos como hidrocarburos de cadena lineal con grupos terminales polares. Por ejemplo, la mezcla de CLA puede incluir otros ácidos grasos conocidos en el campo de la técnica, saturados o insaturados, o productos de degradación del CLA. La composición comercial puede incluir también antioxidantes como vitamina E, hidroxianisol butilado (BHA) o hidroxitolueno butilado (BHT). El CLA también puede sintetizarse mediante métodos conocidos en el campo de la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar CLA a partir de la isomerización del ácido linoleico utilizando, por ejemplo, una especie generadora de radicales y una proteína rica en residuos de azufre como las que se conocen en el campo de la técnica y tal como se describe en Dormandy TL, Wickens DG, Chem.Phys. Lipids 45: 353-64 (1987). Como otro ejemplo adicional, el CLA se puede sintetizar a partir de ácido linoleico o bien de aceite de cártamo bajo atmósfera inerte, con unos pasos posteriores de acidificación y extracción tal como se describe en la U. S. Patent No. 5,670,082 a Cook y col.. Además, algunos isómeros específicos de CLA, como el isómero trans,trans 9-11, el isómero cis,cis-9,11, el isómero cis,trans-9,11 (en combinación con el isómero trans,cis-9,11) y el isómero cis,trans-10,12 se pueden sintetizar, de hecho, en forma pura utilizando los métodos conocidos en el campo de la técnica. Las sales de CLA son aquellas conocidas en el campo de la técnica, incluyendo las sales de sodio y potasio.
El ácido linoleico utilizado para sintetizar el
CLA, u otros ácidos grasos incluídos en la mezcla, puede obtenerse
a partir de plantas, incluyendo aceites de soja, semilla de algodón,
maíz, girasol, cártamo, colza y plama.
Los aceites de soja, maíz, girasol y cártamo son
particularmente ricos en ácido linoleico. El ácido linoleico
también se puede obtener a partir de la hidrólisis de triglicéridos
aislados a partir de plantas mediante la extracción con un
disolvente de la biomasa de la planta utilizando disolventes
alifáticos. Las purificaciones adicionales posteriores pueden
consistir en destilación, cristalización fraccional, descrudado,
decoloración y extracción con vapor. Los triglicéridos pueden
hidrogenarse como se considere necesario. Así pues, los
triglicéridos pueden hidrolizarse mediante métodos enzimáticos (por
ejemplo, mediante la utilización de lipasa) o químicos (por
ejemplo, mediante hidrólisis alcalina) conocidos en el campo de la
técnica. El ácido linoleico también puede sintetizarse a partir de
alcoholes grasos petroquímicos. De forma alternativa, los ácidos
grasos libres y los triglicéridos se pueden obtener de proveedores
comerciales, incluyendo Cargill, Archer Daniel Midlands y Central
Soya.
El CLA también se puede encontrar en la carne de
rumiantes, productos lácteos pasteurizados y quesos procesados.
Además, se puede incrementar la cantidad de CLA
en los productos lácteos mediante los métodos conocidos en el campo
de la técnica. Por ejemplo, la cantidad de CLA en la leche de vaca
se puede incrementar alimentando a la vaca en lactación con una
dieta compuesta solamente de hierba o con una dieta que contenga
alrededor de desde el 1% hasta alrededor del 5% en peso de un
aceite vegetal que contenga ácido linoleico o ácido linolénico, tal
como se describe en la U. S. Patent No. 5,770, 247 a Satter y col.
El CLA también se puede obtener mediante una reacción de conversión
enzimática del ácido linoleico tal como se conoce en el campo de la
técnica. Por ejemplo, el CLA se puede preparar utilizando el enzima
W^{11}-cis,
W^{11}-trans-isomerasa. El enzima
se puede obtener, por ejemplo, a partir de bacterias de rumen, como
Butyrivibrio fibrisolvens. Los microorganismos inofensivos
del tracto intestinal de ratas y otros animales monogástricos
también se puede convertir el ácido linoleico en CLA tal como se
describe en Chin, SF y col., FASEB J, 6 (1992).
El CLA se puede administrar de diversas formas.
Por ejemplo, el CLA se puede administrar en forma de tabletas, en
solución o emulsión, o en una cápsula. El CLA también se puede
mezclar con un vehículo aceptable para su uso farmacéutico. Cuando
se administra en forma de tabletas, puede incluir un vehículo
sólido, por ejemplo, lactosa, almidón, carboximetil celulosa,
dextrina, fosfato de calcio, carbonato de calcio, silicato de calcio
sintético o natural, óxido de magnesio, hidróxido de aluminio seco,
estearato de magnesio, bicarbonato de sodio, levadura desecada o
una combinación de los anteriores. En solución, el vehículo puede
ser un aceite pero es preferiblemente agua estéril o una solución
salina estéril para administración parenteral. El CLA también puede
administrarse como se administran otros fármacos conocidos en el
campo de la técnica.
El CLA se puede administrar de diversas formas.
Por ejemplo, el CLA se puede administrar tanto parenteralmente,
como oralmente, de forma intravenosa, vía rectal, así como
intraperitonealmente.
En otra característica de la invención, se ha
descubierto que ciertos isómeros de CLA poseen una mayor actividad.
Así pues, se pueden administrar isómeros purificados de CLA a
animales que lo necesiten, y se pueden añadir a los productos
alimentarios para formar una composición alimentaria. Los isómeros
de CLA pueden añadirse al producto alimentario en cualquier forma,
como en forma de polvo o en un aceite, como aceite de maíz, bien
solo o con otro aceite, como aceite de coco. Una composición
alimentaria preferida incluye un CLA compuesto de forma
predominante (es decir, por encima del 50%) de una mezcla de ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido trans,cis-9,11octadecadienoico purificados.
Otra composición alimentaria beneficiosa puede incluir una mezcla
compuesta de forma predominante de ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico o
ácido
trans,cis-10,12-octadecadienoico. En
otro ejemplo de realización preferido adicional, la composición
alimentaria puede incluir una mezcla de ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido
trans,cis-9,11-octadecadienoico
purificados. En este contexto, el término "purificado" que se
utiliza aquí haciendo referencia a un isómero de CLA particular o a
una mezcla de isómeros significa una composición de CLA que
contiene por debajo de un 10% en peso de isómeros de CLA distintos
a los que se han especifica-
do.
do.
Preferiblemente, el isómero o la mezcla
identificados no contendrán más de un 5% en peso, y preferiblemente
no más de un 3% en peso, de otros isómeros de CLA. La composición
alimentaria puede incluir ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico
purificado, u otros isómeros de CLA purificados, incluyendo ácido
trans,cis-10,12-octadecadienoico. En
otros ejemplos de realización adicionales, la composición
alimentaria puede incluir una mezcla purificada de CLA. Por
ejemplo, el CLA puede purificarse en distintos grados para producir
una mezcla purificada de CLA que no incluya todos los isómeros de
CLA. Los isómeros de CLA purificados pueden incluirse en cualquier
producto alimentario incluyendo, por ejemplo, cereales, carnes,
huevos, quesos y otros productos lácteos, vegetales, panes y otros
productos basados en harina o en fibra, y productos de confección.
Los isómeros de CLA también pueden añadirse a cualquier líquido
consumible pero puede requerir diversos agentes de emulsificación
para su disolución.
La cantidad con eficacia terapéutica administrada
tendrá un efecto beneficioso en animales con diabetes mellitus
tiipo II. Por ejemplo, la cantidad con eficacia terapéutica es de
forma deseable suficiente para normalizar la tolerancia frente a la
glucosa en un animal diabético. La normalización de la tolerancia a
glucosa se puede determinar, por ejemplo, mediante una prueba
frente la tolerancia de glucosa tal como se conoce en el campo de
la técnica y tal como se describe en los ejemplos que se presentan a
continuación. Además, la cantidad de CLA administrada será
preferiblemente suficiente para reducir los niveles sanguíneos de
insulina y/o para reducir en nivel de ácidos grasos libres o
triglicéridos libres en la circulación. Los niveles en sangre de
insulina, ácidos grasos libres y triglicéridos se reducen de forma
deseable por al menos alrededor de un 5%, más preferiblemente por
al menos alrededor de un 20%, y aún más preferiblemente por al menos
alrededor de un 50%. La cantidad de CLA administrada al animal con
diabetes mellitus tipo II variará dependiendo de la edad del
animal, el estado de salud general del animal y la gravedad de su
condición diabética. Sin embargo, se espera que un animal que esté
siendo tratado frente a la diabetes mellitus tipo II recibirá
usualmente al menos 1 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta
alcanzar como máximo el mayor nivel que no resulte tóxico para el
animal. Normalmente un animal puede recibir 1 mg/kg de peso corporal
de CLA/día hasta 10.000 mg/kg de peso corporal de CLA/día. Sin
embargo, se espera que dosis relativamente bajas de CLA serán
suficientes, por ejemplo, en el rango de 1 mg/kg de peso corporal
de CLA/día hasta 150 mg/kg de peso corporal de CLA/día, y más
deseablemente 10 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta 50 mg/kg de
peso corporal de CLA/día.
En otra característica adicional de la invención,
el CLA se puede administrar a un animal en una composición que
libera el CLA internamente, por ejemplo, en la forma de un éster de
CLA, preferiblemente un triglicérido. En otro ejemplo de
realización adicional, el triglicérido incluye al menos un residuo
de CLA en la forma de un éster con glicerol, y puede tener otros
residuos de ácido graso saturado o insaturado, pero preferiblemente
el ácido graso insaturado del ácido linoleico. En un aspecto más
preferido, el triglicérido incluye tres residuos de CLA en la forma
de un éster con glicerol. Los residuos de CLA son preferiblemente
los isómeros más activos de CLA, como el isómero
cis,trans-9,11 y trans,cis-9,11 o el
isómero cis,cis-9,11, pero puede incluir cualquiera
de los otros isómeros. Después de su ingestión, los residuos de CLA
pueden liberarse en el estómago del animal mediante hidrólisis
enzimática a través de, por ejemplo, la acción de una lipasa. Los
triglicéridos pueden purificarse a partir de plantas tal como se ha
descrito anteriormente, pueden adquirirse comercialmente o pueden
sintetizarse a partir de glicerol y de los respectivos ácidos grasos
mediante los métodos conocidos en el campo de la técnica.
La cantidad con eficacia terapéutica que se
administra dependerá de al menos los tres factores discutidos
anteriormente. La cantidad de triglicérido que se administra puede
ser la que proporciona la cantidad de CLA especificada
anteriormente. La cantidad de triglicérido que se requiere para
alcanzar una dosis específica dependerá del número de ésteres o de
residuos de CLA que comprenden el triglicérido y puede ser calculada
fácilmente por cualquier persona con experiencia en el campo de la
técnica. El triglicérido puede administrarse en formas similares a
las descritas anteriormente para el CLA.
El CLA se puede administrar a un animal con
diabetes, incluyendo vertebrados de sangre caliente como mamíferos.
La lista de mamíferos incluye, por ejemplo, los humanos.
Ahora se hará referencia a ejemplos específicos
que ilustran las composiciones y los usos mostrados anteriormente.
Los datos de los estudios que se muestran a continuación se
analizaron mediante ANOVA (Modelo Lineal General, LSD) utilizando
Statistical Analysis System (SAS; Cary, NC) o StatView para
Macintosh (Abacus Concepts,Berkeley, CA).
En este ejemplo, se muestra que el CLA está
involucrado en la activación de diversos subtipos del PPAR. El
PPAR, un receptor intracelular, es un miembro de la superfamilia de
las hormonas esteroideas, que puede ser importante en la regulación
de la expresión de los enzimas del metabolismo de lípidos y puede
tener un efecto en el crecimiento y/o en la diferenciación celular.
Se han identificado tres subtipos de PPAR (\alpha, \beta y
\gamma) en diversas especies, incluyendo en humanos. Se cree que
el PPAR\gamma está involucrado en la actividad
anti-diabética y de disminución de la glucosa de los
grupos de fármacos conocidos como tiazolidindionas y en los fármacos
hipolipidémicos fibratos. El PPAR puede ser activado por
proliferadores de peroxisoma, tiazolidindionas y ácidos grasos. El
mecanismo de acción de los proliferadores de peroxisoma se muestra
en la Fig.1 y los efectos de los activadores de los subtipos de
PPAR se muestra el la Tabla 1.
| Fármaco/Grupo Químico | PPAR\alpha | PPAR\beta | PPAR\gamma | Uso Clínico o efectos |
| Proliferadores de peroxisoma | ++++ | ++ | +++ | \begin{minipage}{65mm}Hipolidemia, posible antidiabético, proliferación del peroxisoma hepático, diferenciación de adipocitos\end{minipage} |
| Ácidos grasos de cadena larga | +++ | + | ++ | \begin{minipage}{65mm}Hipolidemia, proliferación del peroxisoma hepático, diferenciación de adipocitos\end{minipage} |
| Tiazolidindionas | - | - | ++++ | \begin{minipage}{65mm}Antidiabético, diferenciación de adipocitos, disminución en la resistencia a insulina, disminución en los niveles de glucosa en sangre\end{minipage} |
| CLA | +++ | - | ++ | \begin{minipage}{65mm}Efectos anti-cáncer, efectos anti-aterogénicos, hipolipidemia, proliferación del peroxisoma hepático. Antidiabético tal como se muestra en esta revelación.\end{minipage} |
Se mantuvieron células COS-1
(American Type Culture Collection) en un medio
\alpha-mínimo esencial (Sigma) complementado con
un 8% de suero fetal bovino (Gibco BRL), 0.2 mg/ml de estreptomicina
y 200 U/ml de penicilina. Las construcciones para la expresión de
la quimera pSG5-GAL4-PPAR, que
contiene el dominio de unión del ligando de PPAR\alpha, \beta y
\gamma, así como la construcción indicadora (UAS)
5-tk-CAT fueron amablemente
proporcionados por Steven A. Kliewer (Glaxo Research Institute). A
una confluencia del 75-90%, las células
COS-1 se co-transfectaron con
GAL4-PPAR,
(UAS)5-tk-CAT, y
pSV-Gal (Promega) tal como se describe en Lehmann,
J. M. y col., J.Biol. Chem.
270,12953-12956(1995). Veinticuatro horas
después de la transfección, las células se trataron con las
cantidades indicadas de CLA, o con una única dosis 100 \muM de
ácido
4-cloro-6-(2,3-xilindino)-2-pirimidiniltio)-acético
(Wy 14,643; un fármaco hipolipidémico conocido como proliferador
del peroxisoma). Después de 6 horas de tratamiento, las células se
recogieron y se midieron los niveles de cloramfenicol
acetiltransferasa mediante un ensayo ELISA (Gibco BRL) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Los datos se expresan en relación a la actividad
\beta-galactosidasa.
El CLA utilizado en este experimento se obtuvo de
una mezcla que se puede adquirir comercialmente de NuChek Prep,
Elysian MN. La mezcla contenía un 41.2% en peso de una composición
que incluía ácido cis, trans-9,11octadecadienoico y
ácido
trans,cis-9,11-octadecadienoico, un
44% en peso de ácido
trans,cis-10,12octadecadienoico, un 9.4% en peso de
ácido cis,cis10,12-octadecadienoico, un 1. 3% en
peso de una composición que incluía ácido
trans,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido
trans,trans-10,12-octadecadienoico,
un 1.1% en peso de ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico, un
0.7% en peso de ácido linoleico y un 2.2% de otros lípidos tal como
se ha mencionado anteriormente.
La Fig. 2 muestra que todos los subtipos de PPAR
estudiados fueron activados por el CLA. El PPAR\alpha fue activado
en mayor extensión que los PPAR\beta o PPAR\gamma. Sin embargo,
PPAR\beta y PPAR\gamma fueron activados de forma significativa
(aproximadamente 2 veces más que el valor de control).
Se cree que la activación de PPAR\alpha por la
mezcla adquirida comercialmente es resultado del isómero ácido
cis,trans9,11-octadecadienoico, tal como se discute
en el Ejemplo 2. Además, los efectos biológicos de la activación de
PPAR por CLA dependerán del tejido y del subtipo de PPAR dominante
que esté siendo examinado tal como se muestra en la Fig. 3.
En este ejemplo, se muestra que ciertos subtipos
de PPAR son activados por isómeros de CLA. Se llevó a cabo el mismo
procedimiento experimental que se ha descrito en el Ejemplo 1 para
generar los datos que se muestran el la Fig. 4. Sin embargo,
también se utilizó una concentración de 100 \muM de isómeros de
ciertos isómeros de CLA seleccionados en el ensayo de tranfección
para determinar si isómeros específicos de CLA podían activar
alguno de los subtipos de PPAR.
Los datos de las Figs. 5-7 se
generaron utilizando construcciones que incluían PPAR\alpha,
PPAR\beta o PPAR\gamma de ratón de cadena entera y un gen
indicador de luciferasa. Se utilizó la línea celular
CV-1 (células de riñón de mono verde africano)
adquiridas de American Type Culture Collection
(#CCL-70). Las células se hicieron crecer en medio
esencial mínimo Eagle que contenía un 10% de serum bovino fetal
(GIBCO). Para cada transfección que incluía PPAR\alpha, se
utilizaron 625 ng del vector de expresión
pcDNA3-PPAR\alpha junto con 250 ng del plásmido
indicador
psV-GL2-PPRE-luciferasa
y 250 ng del plásmido de control interno
pSV-\beta-galactosidasa. Para cada
transfección que incluía PPAR\beta o PPAR\gamma, se utilizaron
625 ng de pSGS-ratón-PPAR\beta o
625 ng de pSG5-ratón-PPAR\gamma
junto con 250 ng del plásmido indicador
psV-GL2-PPRE-luciferasa
y 250 ng de plásmido de control interno
pSV-\beta-galactosidasa. Las
células se transfectaron utilizando el reactivo Lipofect AMINE™
(GIBCO) y medio libre de rojo fenol y libre de serum (OptiMEM®I,
GIBCO Life Technologies, Grand Island, NY). Siete horas después de
la transfección, se añadió al medio serum depurado por carbón
(Cocalico Biologicals, Inc. Reamstown, PA) (concentración final del
10%) para una incubación durante la noche (16 horas).
Las células transfectadas se trataron durante
seis horas con diversas dosis 100 \muM de CLA, el isómero 9Z,11E
(cis, trans 9,11) (97% de pureza), el isómero 9E,11E
(trans,trans-9,11) (98% de pureza), el isómero
10E,12Z (trans,cis-10,12) o los otros activadores
que se han indicado. Las actividades de la luciferasa y la
\beta-galactosidasa se ensayaron en lisatos
celulares siguiendo los protocolos de los fabricantes (Promega,
Madison, WI). Los datos se cuantificaron en relación a la actividad
luciferasa/\beta-galactosidasa expresada como la
razón respecto a las células tratadas con vehículo (0.1% DMSO).
La Fig. 4 muestra que todos los isómeros
examinados activaron todos los subtipos de PPAR. Sin embargo, el
isómero 9Z11Z (cis,cis-9,11) y el 9Z11E
(cis,trans-9,11) activaron el PPAR\alpha y el
PPAR\beta más que la mezcla de CLA, y el isómero 9E11E
(trans,trans-9,11) sólo activó el PPAR\beta más
que la mezcla de CLA sola. Ninguno de estos isómeros activó el
PPAR\gamma más que la mezcla de CLA. Además, en un estudio
similar, el PPAR\gamma humano también fue activado por CLA (datos
no mostrados), mostrando que los sucesos moleculares que subyacen en
la presente invención también se dan en humanos.
Los datos que se muestran en las Figs.
5-7 muestran que todos los isómeros de CLA probados,
incluyendo el ácido
trans,cis-10,12octadecadienoico, activan los
respectivos subtipos de PPAR respecto al control de DMSO.
Además, los datos en las Figs. 5 y 6 muestran de
forma adicional que el isómero trans,cis-10,12 del
CLA activó al PPAR\alpha y al PPAR\beta en una extensión
significativamente mayor que solamente la mezcla de CLA.
La activación de ciertos subtipos del PPAR
resulta en una alteración de la expresión génica, como por ejemplo
inducción génica. En este ejemplo, se encontró que inducía dos
marcadores de diferenciación de preadipocitos
3T3-L1 de ratón en adipocitos diferenciados, que
requiere activación por PPAR\gamma. Los dos marcadores estudiados
fueron mARN de proteína-2 de adipocito (mAP2) y mARN
de PPAR\gamma.
Se mantuvieron preadipocitos de ratón
3T3-L1 (American Type Culture Collection) en medio
Eagle modificado por (DMEM) complementado con suero fetal bovino 10%
(Gibco BRL), 0.2 mg/ml de estreptomicina y 200 U/ml de penicilina
("medio de crecimiento"). La diferenciación se indujo tal como
se describe en Brandes, R., Arad R., and Bar Tana, J., Biochem.
Pharmacol. 50,1949-1951 (1995).
De forma resumida, la diferenciación se indujo
mediante la adición de diversas concentraciones de CLA
(concentración final de 25-250 \muM), ácido
linoleico (100 \muM), Wy 14,643 (100 \muM) o vehículo (DMSO) en
DMEM con FCS 10% y dexametasona 0.1 \muM ("medio de
inducción") a preadipocitos 3T3-L1
confluentes.
Después de 48 horas, se eliminó el medio de
inducción y se reemplazó por el medio de inducción con 4 mU/ml de
insulina. Este medio se cambió cada 48 horas. A diversos intervalos
de tiempo, las células se lavaron dos veces con PBS y el ARN total
se extrajo utilizando TriReagent (Molecular Research Center).
La diferenciación de las células
3T3-L1 de ratón se monitorizó mediante el examen de
marcadores específicos de adipocitos incluyendo PPAR\gamma
(\gamma1 y \gamma2) y proteína-2 de adipocito
(mAP2). También se examinó el gen constitutivo de la
\beta-actina tal como se describe en Vanden
Heuvel, J. P. y col., Cancer Res. 54, 62-68 (1994).
Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa
reversa cuantitativa para determinar la expresión de mARN para
estos genes (tal como se describe en Vanden Heuvel, J. P., PCR
Applications in Molecular Toxicology, 218 pgs. CRC Press, Boca
Raton, FL (1997), ver Tabla 2 para las secuencias cebadoras
utilizadas) utilizando estándares internos específicos para cada
grupo de cebadores (tal como se describe en Vanden Heuvel, J. P.,
Tyson, F. and Bell, D. A., Biotechniques 14, 395-398
(1993)).
| Cebador Interno^{*} | Secuencia | Diana | Estándar |
| mAP2 directo | 5' ACT GTG GCC TGA GCG ACT TCT ATG | 190 | 314 |
| mAP2 inverso | 5' AGG GGG CTT CTG GCA AAC AAT | ||
| mPPAR\gamma directo | 5' TGC TGG CCT CCC TGA TGA ATA | 315 | 352 |
| mPPAR\gamma inverso | 5' TTG GCG AAC AGC TGA GAG GAC | ||
| actina directa | 5' CCT CTA TGC CAA CAC AGT | 125 | 153 |
| actina inversa | 5' AGC CAC CAA TCC ACA CAG | ||
| ACO directo | 5' ATT CGG TGT TGT AAG TGC | 417 | 340 |
| ACO inverso | 5' TTG GTG GGT GGG TGT TGA | ||
| ^{*}Todos los estándares internos se sintetizaron sólo para los genes a cuantificar |
Tal como se observa en la Fig. 8, el CLA es
eficaz en la inducción de ARN de mAP2 y PPAR\gamma. También se
observa que el CLA es más potente como ligando del PPAR\gamma en
el bio-ensayo 3T3-L1 que lo que
cabría esperar a partir de los ensayos de transactivación, los
resultados de los cuales se muestran en la Fig. 4. La Fig. 8 también
muestra que la concentración más efectiva de CLA en los ensayos de
diferenciación fue 50 \muM.
Se obtuvieron ratas Zucker macho obesas (fa/fa) y
hemanos de camada delgados (wt) de seis semanas de edad de Genetic
Models, Inc. (Indianapolis, IN). Debido a que el objetivo principal
del estudio era determinar la capacidad del CLA de mejorar la
acción de la insulina y prevenir el inicio de la diabetes, se
determinó que todas las ratas fueran normoglicémicas antes de
asignarlas a los tratamientos experimentales. (Las dietas se
discuten en la sección que sigue). Después de mantener las ratas
bajo dietas experimentales durante 14 días, las ratas se
sacrificaron mediante CO_{2} y dislocación cervical y se
recogieron, pesaron y congelaron los tejidos. Los experimentos de
RT-PCR se llevaron a cabo tal como se ha descrito
anteriormente.
Los genes utilizados como marcadores del tejido y
de la activación de PPAR específica para subtipo incluyeron acil
Co-A Oxidasa (ACO; se encuentra en el hígado y es
inducido por la activación del PPAR\alpha), Proteína Específica
de Adipocitos (mAP2; se encuentra en el tejido adiposo y es inducida
por la activación del PPAR\gamma) y ACO en el músculo (inducida
por PPAR\beta).
Tal como se observa en la Fig. 9, el CLA y la
Troglitazona
(5-([4-[3,4-dihidro-6-hidroxi-2,5,-7,8-tetrametil-2H-1-benzopiran-2-il)metoxi]fenil]metil]-2,4-tiazolidindiona;
TDZ; Rezulin, Parke-Davis) inducen de forma
significativa la expresión de mARN de ACO en el tejido que contiene
PPAR\alpha (hígado) y en el tejido que contiene de forma
predominante PPAR\gamma (tejido adiposo) pero no tienen efecto
sobre el tejido que contiene de forma predominante PPAR\beta
(músculo). La inducción de mAP2 en el tejido adiposo verifica la
activación de PPAR\gamma observada en las células
3T3-L1.
Las ratas fa/fa Zucker son un modelo animal
excelente para el estudio del inicio de la diabetes en adultos. En
este ejemplo, se determinó el efecto de tres dietas distintas
(control, CLA, TZD) sobre los niveles de insulina, triglicéridos y
ácidos grasos libres en circulación en ratas fa/fa así como en sus
homólogos delgados (naturales, wt). Además, para determinar si el
CLA incrementaba la sensibilidad a la insulina como un activador
del PPAR\gamma, como la TZD, se llevó a cabo una prueba de
tolerancia a la glucosa.
Los componentes de las dietas se obtuvieron de
Dyets, Inc. (Bethlehem, PA), y la mezcla de isómeros de CLA (mezcla
de 90% de pureza) de PharmaNutrientes, Chicago, IL. La mezcla de CLA
tenía la siguiente distribución isomérica: 42% de una composición
que incluía ácido cis,trans-9,11 y
trans,cis-9-11-octadecadienoico;
43.5% ácido
trans,cis-10,12-octadecadienoico; 1%
ácido
cis,cis-9-11-octadecadienoico,
1% ácido
cis,cis-10,12-octadecadienoico, y
1.5% de una composición que incluía ácido
trans,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido
trans,trans-10,12-octadecadienoico,
siendo todos los porcentajes en peso. La mezcla de CLA también
incluía, en porcentajes en peso, un 0.5% de linoleato, un 5.5% de
oleato y un 5% de otros lípidos tal como se ha discutido
anteriormente. En estos estudios se utilizó tiazolidindiona, TZD
(Rezulin™, Parke-Davis, Ann Arbor, MI) como control
positivo para la actividad anti-diabética. Las
ratas Zucker obesas (fa/fa) macho y sus hermanos de camada delgados
(wt) se adquirieron con seis semanas de edad de Genetic Models,
Inc. (Indianapolis, IN). Debido a que el objetivo principal del
estudio era determinar la capacidad del CLA de mejorar la acción de
la insulina y prevenir el inicio de la diabetes, se determinó que
todas las ratas fueran normoglicémicas antes de asignarlas a los
tratamientos experimentales. Después de mantener las ratas bajo
dietas experimentales durante 14 días, las ratas se sacrificaron
mediante CO_{2} y dislocación cervical, y se recogió sangre que
se analizó de forma inmediata para determinar las concentraciones
de glucosa post-prandial (ver más adelante) o se
colocó en tubos de ensayo heparinizados para llevar a cabo análisis
de plasma tal como se describe a continuación.
Se recogieron y pesaron bloques de grasa
epididimal y los hígados. Se aisló una alícuota del bloque de grasa
epididimal en tampón salino para los análisis de transporte de
glucosa y el resto del bloque de grasa epididimal y músculo
gastrocnemio se aislaron, se congelaron de forma inmediata en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta que se llevaron a
cabo los análisis de mARN y proteína.
Se formularon tres dietas experimentales
isocalóricas de acuerdo con una mezcla AIN-76
modificada que contenía un 6.5% (en peso) de grasa (dieta descrita
en American Institute of Nutrition: Report of the American Instituye
of Nutrition Ad Hoc Committee on Standards for Nutritional
Studies, J. Nutr. 107 1340-1348 (1977), pero que
contiene un 6.5% en peso de grasa en lugar de un 5% en peso de
grasa). Se utilizó la misma cantidad de aceite de maíz (5%) en
todas las dietas ya que el aceite de maíz es rico en ácido
linoleico, un ácido graso esencial. Las dietas contenían un 5% de
aceite de maíz + 1.5% de manteca + no CLA (dieta de control), un 5%
de aceite de maíz + 1.5% de CLA (dieta CLA) o bien un 5% de aceite
de maíz + 1.5% de manteca + 0.2% de troglitazona (dieta TZD). Se
escogió una dosis de 1.5% de CLA en base a estudios previos en
nuestro laboratorio que muestran que esta dosis modula la expresión
génica asociada a PPAR en el hígado (Belury, M.A. y col., Nutr.
Biochem. 8: 579-84 (1997)) e inhibe la
tumorigenesis en piel murina (tal como se muestra en Belury, M.A. y
col., Nutr. Cancer 26: 149-157 (1996)). Se ha
mostrado que la dosis de TZD (0.2%) utilizada en este estudio es
efectiva para normalizar la tolerancia a glucosa después de 15 días
y para suprimir los niveles elevados de glucosa, triglicéridos,
ácidos grasos libres y proteína en orina en ratas Zucker (fa/fa).
Las dietas se proporcionaron en días alternos y se permitió a las
ratas tener acceso libre a comida y agua. Se midieron los pesos
corporales dos veces a la semana y el consumo de comida se estimó
midiendo las diferencias en peso entre las dietas recién
proporcionadas y la dieta que quedaba en los alimentadores dos días
después. Teniendo en cuenta el peso corporal promedio de las ratas
fa/fa y la cantidad de comida que consumían, las ratas fa/fa
recibieron una dosis diaria de 1.71 mg de CLA/kg de peso corporal,
que sumaba una dosis diaria de 375 mg.
Para comparar los efectos del CLA y de la TZD
sobre la acción de la insulina, se llevó a cabo una prueba de
tolerancia a la glucosa en el día 11 de la intervención sobre la
dieta. Se hizo ayunar a los animales durante la noche (16 horas). A
las ratas conscientes se les inyectó intraperitonealmente
D-glucosa (1 g/kg de peso corporal) y se recogieron
muestras de sangre a través de la vena de la cola antes de la
inyección (tiempo 0), y a 2, 5, 10, 15, 20, 40, 60, 120 y 180
minutos después de la inyección.
Los niveles de glucosa en sangre se determinaron
utilizando un medidor de glucosa One Touch (Lifescan, Inc.). Los
niveles de insulina en plasma se determinaron utlizando kits de
radioinmunoensayo asequibles comercialmente (Linco Research, St.
Charles, MO). Los ácidos grasos no esterificados en plasma se
cuantificaron utilizando un kit colorimétrico (Watco). Las
concentraciones de triglicérido en plasma se determinaron utilizando
un kit asequible comercialmente (Sigma Diagnostics, St. Louis,
MO).
La Fig. 10 muestra los resultados de las pruebas
de tolerancia frente a la glucosa. Tal como se esperaba, se observa
una menor capacidad para eliminar la glucosa de la sangre en las
ratas fa/fa (compárese en control en animales delgados frente al
control en animales obesos). En las ratas fa/fa que se habían
alimentado con CLA o bien con TZD, el nivel de glucosa en sangre se
redujo mucho más rápidamente que en los respectivos animales de
control. Como la tolerancia a la glucosa es la principal prueba
utilizada para confirmar la existencia de diabetes mellitus no
dependiente de insulina (NIDDM), los datos que se muestran en la
Fig. 10 muestran de forma convincente que el CLA es tan eficaz como
la TZD para mejorar la tolerancia a la glucosa. Así pues, el CLA
puede ser un tratamiento eficaz para individuos con NIDDM.
Los resultados que muestran los niveles relativos
de insulina en circulación, triglicéridos en plasma y ácidos grasos
libres en circulación se muestran el la Tabla 3.
| Dieta | Insulina | Triglicéridos en Plasma | Ácidos Grasos Libres |
| (ng/dl) \pm D.E. | (mg/dl) \pm D.E. | (mMol) \pm D.E. | |
| wt, Control | 2.8\pm0.1^{a} | 92.1\pm16.7^{bc} | 1.651\pm0.497^{ab} |
| wt, CLA | 2.8\pm0.5^{a} | 66.2\pm18.0^{bc} | 1.170\pm0.335^{he} |
| wt, TZD | 1.4\pm0.1^{a} | 61.1\pm12.1^{c} | 1.139\pm0.277^{c} |
| fa/fa, Control | 38.9\pm2.8^{b} | 408.3\pm148.7^{a} | 1.959\pm0.402^{a} |
| fa/fa, CLA | 20.6\pm3.3^{c} | 149.4\pm78.4^{b} | 1.004\pm0.262^{c} |
| fa/fa, TZD | 5.6\pm0.5^{d} | 57.08\pm12.3^{c} | 0.778\pm0.378^{c} |
| \hskip0.3cm \begin{minipage}{145mm}Las concentraciones de insulina, triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma se midieron en las ratas alimentadas después de que las dietas experimentales se hubieran suministrado durante 14 días.\end{minipage} | |||
| ^{a-d} \begin{minipage}[t]{145mm}Los valores (\pm D.E.) con diferencias significativas (p<0.005) en las columnas se denotan mediante distintos superíndices.\end{minipage} |
Tal como se esperaba, las ratas fa/fa mostraron
unos niveles más altos de insulina y triglicéridos en plasma en
comparación con los animales wt. Sin embargo, el CLA mejoró de forma
significativa los síntomas de la diabetes provocando una
disminución del 50-60% de la insulina, triglicéridos
y ácidos grasos en plasma. Además, la TZD hizo disminuir
marcadamente los niveles de insulina, triglicéridos y ácidos grasos
en la circulación de las ratas fa/fa, verificando, así que la TZD
es un agente anti-diabético efectivo. Para
información adicional sobre la normalización de la tolerancia a la
glucosa y otros efectos biológicos utilizando CLA, puede consultarse
Biochem. Biophys. Res. Comm., 244, 678-682
(1998).
Claims (17)
1. La utilización de ácido linoleico conjugado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
diabetes mellitus tipo II.
2. La utilización de la reivindicación 1, en la
cual dicho ácido linoleico conjugado se administra de forma
oral.
3. La utilización de la reivindicación 2, en la
cual dicho ácido linoleico conjugado se administra en una forma de
dosificación unitaria.
4. La utilización de la reivindicación 3, en la
cual dicha forma de dosificación unitaria es un producto
alimentario.
5. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado
se selecciona de entre el grupo consistente en ácido
9,11-octadecadienoico, sus ésteres, sus isómeros
geométricos, sus sales y sus mezclas.
6. La utilización de la reivindicación 5, en la
cual dichos isómeros geométricos tienen configuraciones
seleccionadas de entre el grupo consistente en trans,trans;
cis,cis; trans,cis; y cis,trans.
7. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado
se selecciona de entre el grupo consistente en ácido
10,12-octadecadienoico, sus ésteres, sus isómeros
geométricos, sus sales y sus mezclas.
8. La utilización de la reivindicación 7, en la
cual dichos isómeros geométricos tienen configuraciones
seleccionadas de entre el grupo consistente en trans,trans;
cis,cis; trans,cis; y cis,trans.
9. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado
está compuesto de ácido
cis,trans-9,11-octadecadienoico y
ácido
trans,cis-9,11-octadecadienoico.
10. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico está
compuesto por ácido
cis,cis-9,11-octadecadienoico.
11. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la cual dicho ácido linoleico conjugado
se administra en una cantidad de 1 mg de dicho ácido linoleico
conjugado/kg de peso corporal hasta 10,000 mg de dicho ácido
linoleico conjugado/kg de peso corporal.
12. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la cual dicho animal es un mamífero.
13. La utilización de la reivindicación 12, en la
cual dicho mamífero es un humano.
14. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13,
en las cuales dicho ácido linoleico conjugado se administra en un
vehículo aceptable para su uso farmacéutico.
15. La utilización de la reivindicación 14, en la
cual dicho vehículo aceptable para su uso farmacéutico incluye
agua.
16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 15 para la fabricación de un medicamento de acuerdo con la
reivindicación 1 para la normalización de la tolerancia a la glucosa
y la reducción de la insulina en plasma en un animal con diabetes
mellitus tipo II.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16
para la fabricación de un medicamento de acuerdo con la
reivindicación 1 para el tratamiento de niveles de glucosa elevados
en un animal con diabetes mellitus Tipo II.
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