ES2253379T3 - Utilizacion de extractos de espermatofitos como moduladores de la respuesta inmunitaria. - Google Patents
Utilizacion de extractos de espermatofitos como moduladores de la respuesta inmunitaria.Info
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Abstract
Utilización de al menos uno de los compuestos seleccionados de entre el grupo de: Trans-Resveratrol, , CCis-Re s-veratrol, Cis-Resveratrol glucosilado, s-viniferina, H-gnetina, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeafenol, Ampelopepsina A y Trans-Resveratrol glucosilado y las correspondientes mezclas como principio activo para la síntesis de un medicamento para tratar al menos una de las siguientes afecciones: la inmunodeficiencia primaria en niños y en adultos; las inmunodeficiencias secundarias derivadas por ejemplo de la desnutrición, de las enfermedades linfoproliferativas, de infecciones producidas por virus, bacterias, hongos y parásitos animales, las intervenciones quirúrgicas, los tratamientos de radioterapia y/o quimioterapia, la administración de fármacos, quemaduras y el síndrome nefrótico.
Description
Utilización de extractos de espermatófitos como
moduladores de la respuesta inmunitaria.
La presente invención se refiere a un método de
extracción de productos farmacéuticamente activos a partir de
espermatófitos, a los productos obtenidos de este modo y a su
utilización en el campo médico, en particular como sustancias
activas como moduladoras de la respuesta inmunitaria.
En particular, la invención se refiere a la
utilización en el campo farmacéutico de la actividad moduladora de
la respuesta inmunitaria del cis o trans resveratrol (a los que a
partir de ahora nos referiremos como C-Res y
T-Res respectivamente) y de los estilbenos
hidroxilados, los oligoestilbenos y los estilbenoides tanto en sus
formas libres como glucosiladas.
El sistema inmunitario protege al organismo de
las agresiones de diversos patógenos, tales como virus, bacterias,
micoplasmas, hongos y protozoos, de sustancias extrañas y del
desarrollo de células neoplásicas gracias a factores humorales y
celulares. Sin embargo, las reacciones inmunitarias no siempre
juegan un papel positivo, ya que pueden provocar reacciones de
hipersensibilidad y de autoinmunidad.
En los últimos años los resultados de una serie
de investigaciones han demostrado la posibilidad de modular y de
controlar las respuestas inmunitarias. En la actualidad, la
estimulación y la supresión del sistema inmunitario se utilizan en
el tratamiento o la prevención de diversas patologías.
Los inmunomoduladores son compuestos que
modifican las funciones inmunitarias y que pueden actuar
positivamente o negativamente en la actividad del sistema
inmunitario. Dicho grupo de fármacos comprende compuestos químicos,
tales como por ejemplos compuestos orgánicos, sustancias de origen
biológico o moléculas de origen natural.
En la práctica médica, la utilización de los
inmunomoduladores comprende tanto la estimulación o la
reconstitución de una respuesta inmunitaria (corrección de una
inmunodeficiencia) como la supresión de una respuesta inmunitaria
normal o excesiva. La estimulación del sistema inmunitario resulta
importante por ejemplo para proteger un paciente de tumores o para
incrementar la respuesta inmunitaria en pacientes con un sistema
inmunitario deficiente, tal como en pacientes de cirugía o
quemados, en pacientes sometidos a radioterapia o quimioterapia y en
pacientes que padecen SIDA. En general, dichos pacientes
inmunodeficientes pueden desarrollar infecciones producidas por
virus tales como el citomegalovirus, el virus herpético, el virus
respiratorio sincitial y el virus de la hepatitis.
Los inmunomoduladores pueden utilizarse para
estimular la respuesta inmunitaria a dichas infecciones o como
agentes profilácticos en su prevención. Además, dichas sustancias
pueden también utilizarse en el tratamiento de las enfermedades
autoinmunitarias.
Uno de los mecanismos clave en la respuesta
inmunitaria es la producción, por parte de los linfocitos o
citocinas, un grupo de polipéptidos con un efecto similar al de las
hormonas y que afectan la función de diversos tipos celulares.
Investigaciones recientes han demostrado que la producción de
citocinas por parte de las células T CD4 positivas (CD4+) y las
células T CD8+ a menudo corresponde a uno de los dos fenotipos TH1 y
TH2. Las células TH1 producen la interleucina 2 (IL2), el
interferón-g (IFN-g) y el factor de
la necrosis tumoral (TFN) y son principalmente responsables de la
inmunidad en la que intervienen células, tal como por ejemplo la
hipersensibilidad retardada. Las células TH2 producen otros tipos
de interleucinas tales como la IL4, la IL5, la IL6, la IL9, la IL10
y la IL13 y son principalmente responsables de la regulación de la
inmunidad tumoral.
Las respuestas del TH1 y del TH2 fuertemente
polarizadas juegan un papel importante, a parte de la protección
del organismo frente a agentes infecciosos o células tumorales, en
la inducción de diversas patologías, tales como por ejemplo la
autoinmunidad órgano-específica y algunos tipos de
inflamaciones crónicas por lo que se refiere a las respuestas del
TH1; el asma alérgica y la dermatitis atópica por lo que se refiere
a las respuestas del TH2. De todos modos, los dos tipos de
respuesta se encuentran estrictamente relacionados entre sí, ya que
la estimulación de la respuesta del TH1 provoca en la mayoría de los
casos una inhibición de la producción de las citocinas del TH2 o
viceversa.
Resulta por lo tanto evidente que la modulación
de la producción de las citocinas por parte de las células T puede
jugar un papel fundamental en el control de diversas patologías, y
que sustancias que puedan modular dicha producción pueden tener un
efecto importante inmunofarmacológico y terapéutico.
Los estilbenos hidroxilados, tanto los monómeros
como los oligómeros, representan una clase de compuestos químicos
que se encuentran presentes en un número limitado de espermatófitos
y en particular en la vid, en la que son componentes esenciales de
la raíz, el tallo, las hojas y principalmente de los frutos
(Vrhovsek U., Mattivi F., 1998, Proceedings of the 29th J.
Plecnik, Cardiovascular Diseases, 449 - 463 ; Mattivi F. et
al., 1995, J. Agric. Food Chem., 42, 1820 - 1823). Debido
a que su papel en la fisiología vegetal parece ser principalmente
la inhibición de la progresión de infecciones causadas por hongos,
dicho grupo de sustancias se ha incluido entre las fitoalexinas, un
grupo de antibióticos de origen vegetal (Hain R. et al.,
1990, Plant Mot. Biol., 15, 325 - 335).
Los resultados de una serie de estudios
realizados por distintos grupos de investigadores indican que uno
de los compuestos que pertenecen a la clase de los estilbenos, el
trans-resveratrol, puede realizar unas actividades
farmacológica en los humanos. De hecho, dichas investigaciones han
demostrado que el trans-resveratrol presenta
actividades antioxidantes (Fauconneau B. et al., 1997,
Life Sci., 61, 2103 - 2110), y que pueden inhibir la
agregación de los trombocitos (Bertelli A. et al., 1996,
Drug Exp. Clin. Res., 22, 61 - 63) y la actividad de la
ciclooxigenasa (Jang M. et al, 1997, Science, 275, 218
- 220). Además, se ha demostrado que dicho compuesto puede inhibir
in vitro la proliferación de células que pertenecen a la
línea MCF-7 obtenida del adenocarcinoma de mama
(Mgbonyebi O. P. et al., 1998, Int. J. Oncology, 12,
865 - 869), y de las células que pertenecen a la línea HL60
(leucemia promielocítica humana aguda) puede provocar la
interrupción del ciclo celular en la transición de la etapa S a la
etapa G2 (Della Ragione F. et al., 1998, Biochem.
Biophys. Res. Corn., 250, 53 - 58), y a dosis elevadas puede
provocar la apoptosis y regular la expresión del CD95L (Clement M.
V. et al., 1998, Blood, 92, 996 - 1002). Finalmente,
se ha demostrado que el trans-resveratrol in
vivo es capaz de inhibir la génesis tumoral en un modelo murino
de cáncer de piel provocado por sustancias cancerígenas (Jang M.
et al., 1997, Science, 275, 218 - 220).
Durante nuestras investigaciones hemos
descubierto sorprendentemente que, además de las actividades
mencionadas anteriormente, el trans- y el cis- resveratrol pueden
modular tanto la respuesta citolítica natural (NK) como la
respuesta linfocítica antineoplásica
antígeno-específica (CTL). Además, hemos descubierto
que las sustancias anteriormente mencionadas pueden modular la
producción de citocinas por parte de las células T CD4+ y CD8+.
La presente invención se basa por lo tanto en el
descubrimiento que los estilbenos hidroxilados, en particular el
cis- y el trans- resveratrol, pueden modular la respuesta productora
de un efecto de los linfocitos T humanos y pueden por lo tanto
utilizarse como fármacos para modular la respuesta del sistema
inmunitario en diversas situaciones patológicas, como por ejemplo
i) la inmunodeficiencia primaria en niños y en adultos; ii) las
inmunodeficiencias secundarias derivadas por ejemplo de la
desnutrición, de las enfermedades linfoproliferativas, de
infecciones (tales como las producidas por virus, bacterias, hongos,
parásitos animales), las intervenciones quirúrgicas, los
tratamientos de radioterapia o quimioterapia, la administración de
fármacos, quemaduras y el síndrome nefrótico; iii) las enfermedades
autoinmunitarias tales como por ejemplo la artritis reumatoide, la
uveítis, la psoriasis; iiii) el rechazo en un trasplante.
Otro objetivo son los productos del procedimiento
de extracción, que se utilizan en el campo farmacéutico,
consistiendo dichos productos en mezclas complejas que comprenden
unos compuestos que poseen en su molécula uno o más grupos
estilbeno, hidroxilados y/o glucosilados de distintos modos, y los
compuestos que resultan de las mismas mediante procedimientos
biosintéticos enzimáticos naturales (los oligoestilbenos se definen
como aquellos oligómeros que presentan en su molécula al menos un
enlace estilbeno reconocible, y los estilbenoides como aquellos
oligómeros que tienen implicados todos los dobles enlaces de
estilbeno en el proceso de condensación). Los compuestos preferidos
son los siguientes:
Un objetivo de la invención es la utilización de
los compuestos T-Res, C-Res,
C-Res glucosilada,
\varepsilon-viniferina,
H-gnetina,
r-2-viniferina,
r-viniferina, hopeafenol, Ampelopepsina A y
T-Res glucosilada, en particular como fármacos con
actividad antineoplásica, más en particular como
1) fármacos inmunomoduladores para utilizar en
diversas patologías, tales como por ejemplo i) la inmunodeficiencia
primaria en niños y en adultos; ii) las inmunodeficiencias
secundarias derivadas por ejemplo de la desnutrición, de las
enfermedades linfoproliferativas, de infecciones (tales como las
producidas por virus, bacterias, hongos, parásitos animales), las
intervenciones quirúrgicas, los tratamientos de radioterapia o
quimioterapia, la administración de fármacos, quemaduras y el
síndrome nefrótico;
2) fármacos inmunodepresores para utilizar en
patologías tales como por ejemplo i) las enfermedades
autoinmunitarias tales como por ejemplo la artritis reumatoide, la
uveítis, la psoriasis; ii) el rechazo en un trasplante.
Un objetivo adicional de la presente invención lo
constituye la utilización de los compuestos obtenidos de la
extracción en diferentes concentraciones según la actividad
inmunoestimuladora e inmunodepresora.
La Figura 1A ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD8+/IFN+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 1B ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD8+/IL2+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 1C ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD8+/IL4+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 2A ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD4+/IFN+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 2B ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD4+/IL2+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 2C ilustra el efecto del resveratrol en
la producción de citocinas por parte de las células T CD4+/IL4+
activadas con anti-CD3/CD28.
La Figura 3A ilustra el efecto del resveratrol en
la replicación de los linfocitos activados con
anti-CD3/CD28.
La Figura 3B ilustra el efecto del resveratrol en
la síntesis del ADN de los linfocitos activados con
anti-CD3/CD28.
La Figura 4A ilustra el efecto del resveratrol en
la provocación de la apoptosis de los linfocitos activados con
anti-CD3/CD28.
La Figura 4B ilustra el efecto del resveratrol en
la mortalidad de los linfocitos activados con
anti-CD3/CD28.
La Figura 5A ilustra el efecto del resveratrol en
la actividad citolítica natural (NK).
La Figura 5B ilustra el efecto del resveratrol en
la expresión de los antígenos de superficie CD16 y CD95 en los
linfocitos humanos.
La Figura 5C ilustra el efecto del resveratrol en
la expresión de los antígenos de superficie CD4 y CD95 en los
linfocitos humanos.
La Figura 6A ilustra el efecto del resveratrol en
la actividad antineoplásica de los linfocitos T.
La Figura 6B ilustra el efecto del resveratrol en
la blastización de los linfocitos T.
La Figura 7A ilustra el efecto del resveratrol en
el porcentaje de células CD8+.
La Figura 7B ilustra el efecto del resveratrol en
el porcentaje de células CD4+.
La Figura 8 ilustra el diagrama cromatográfico de
fase inversa HPLC de la mezcla compleja de estilbenos,
oligoestilbenos y estilbenoides extraídos de las raíces de
Vitis: el seguimiento de los trans-estilbenos
y los trans-oligoestilbenos se realiza a 320 nm,
los cis-estilbenos y los
cis-oligoestilbenos a 282 nm.
Los compuestos utilizados en la presente
invención en líneas generales pueden dividirse en dos familias: la
primera es la de los estilbenos y oligoestilbenos, la segunda es la
de los estilbenoides. La primera comprende moléculas caracterizadas
por la presencia de uno o más grupos estilbeno
[(C_{6}H_{5})-CH=CH-(C_{6}H5)], hidroxilados
y/o glucosilados de distintos modos. A título de ejemplo no
restrictivo, los siguientes compuestos pertenecen a dicha primera
familia:
\vskip1.000000\baselineskip
(alternativamente a la posición 3,
el enlace glucosídico también puede encontrarse presente en la
posición 4' y producirá distintos T-Res y
R-Res, distintamente glucosilados, o
T-Res y C-Res con más de un grupo
glucosídico).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda familia, la de los estilbenoides,
comprende compuestos que, como los anteriores, pueden clasificarse
como oligómeros de estilbeno, pero en los que la estructura original
de estilbeno no resulta reconocible, ya que todos los dobles
enlaces del estilbeno se encuentran modificados por procesos
naturales de biosíntesis enzimática en los productos vegetales de
los que se extraen.
A título de simple ejemplo no restrictivo se
pueden mencionar los siguientes compuestos:
La Ampelopepsina A se considera un dímero
oxidativo del T-Res. El Hopeafenol es el tetrámero
correspondiente, es decir, un dímero de dímeros que se enlazan
mediante dos posiciones C8.
Los compuestos que pertenecen a las dos clases
pueden obtenerse mediante tratamientos de extracción y purificación
de los productos naturales que los contienen, por ejemplo frutos
(por ejemplo, uvas), partes aéreas (tronco, brotes, hojas) o partes
subterráneas de los espermatófitos, en particular aquellos que
pertenecen a la familia de las vitáceas o las poligonáceas. Las
partes subterráneas de dichos vegetales resultan particularmente
preferidas.
El procedimiento de extracción y purificación
sigue los métodos indicados a continuación. Se ha de tener presente
que las mezclas obtenidas con los procedimientos según la presente
invención son mezclas complejas en las que solamente se han
identificado los componentes principales (estilbenos,
oligoestilbenos y estilbenoides indicados anteriormente); sin
embargo, dichos productos han de contemplarse únicamente como
representativos de otros componentes similares, que se encuentran
presentes en cantidades menores y que no han sido aislados y
caracterizados aunque poseen la misma naturaleza y características
de aplicaciones; dichos productos también forman parte de la
presente invención, aunque no estén aislados y caracterizados, ya
que se encuentran presenten en los extractos naturales.
La presente invención se refiere a la actividad
moduladora de la respuesta inmunitaria desarrollada por dichos
compuestos, tanto por separado como en mezcla.
El procedimiento de extracción según la presente
invención se aplica a espermatófitos. El material inicial pueden
ser frutos, partes aéreas o subterráneas de los vegetales. El
material inicial puede ser fresco o congelado o liofilizado y
pulverizado. Se considera que las matrices más significativas son
las raíces de Polygonum cuspidatum y de Polygonum
multiflorum y la corteza de la raíz lignificada del género
Vitis.
Resulta preferible trabajar con materiales tan
secos como sea posible, y de este modo puede resultar ventajoso
someter dicho material al que se ha de realizar la extracción a un
pretratamiento que comprenda la eliminación sustancial de agua en
frío, por ejemplo por liofilización. La extracción se realiza en un
ambiente natural con un alcohol alifático, preferentemente metanol
o etanol y sus mezclas, preferentemente utilizando cantidades de
disolvente comprendidas entre 10 y 20 veces en volumen el peso de la
matriz a la que se ha de realizar la extracción. Se mezclan el
material a realizar la extracción y el disolvente, agitándose el
conjunto y procediendo a la extracción en una atmósfera libre de
oxígeno, por ejemplo saturada con nitrógeno, con protección de la
luz, a temperatura ambiente, con una duración de la extracción que
varía en función de la matriz, generalmente comprendida entre
aproximadamente 2 y 12 horas para matrices propiamente dichas, y
entre aproximadamente 5 y 120 minutos para matrices que se han
liofilizado previamente y se han pulverizado moliendo previamente el
producto liofilizado. El extracto final se centrifuga y se recupera
el líquido sobrenadante, se concentra al vacío a temperaturas bajas
(inferiores a 45ºC) y se recogen con acetato de etilo u otro
disolvente similar tal como por ejemplo acetato de metilo y/o
tetrahidrofurano (extracto bruto en disolvente) o con agua (extracto
bruto acuoso) (en particular para las raíces de Polygonum,
para obtener un mayor grado de pureza).
El extracto bruto puede tratarse siguiendo uno de
dos métodos, en función de si se va a obtener una mezcla que
contiene sustancialmente todos los productos según la presente
invención o únicamente trans-resveratrol y
trans-resveratrol glucosilado.
El primer tipo de tratamiento (Tratamiento A) se
prefiere en el caso de que la extracción se lleve a cabo en
vegetales del género Vitis, mientras que el segundo tipo de
tratamiento (Tratamiento B) se prefiere para las matrices más
simples relacionadas con vegetales de género Polygonum.
Tratamiento
(A)
El extracto bruto en un disolvente tal como el
acetato de etilo se lava con agua saturada con una sal inorgánica
(por ejemplo NaCl), la fracción en acetato de etilo se carga en una
columna preparada con una resina de un polímero aromático (los
copolímeros de estireno y divinilbenceno, preferentemente con un
tamaño de grano comprendido entre 0,1 y 0,25 mm, resultan
especialmente preferidos para dicho propósito).
Después de cargar el conjunto se eluye con agua,
preferentemente en un volumen aproximadamente el doble del de
acetato de etilo, a continuación con cloruro de pentano y metileno
en un proporción 2:1 (en un volumen que es aproximadamente el de
acetato de etilo). Los estilbenos se eluyen con acetato de etilo o
con mezclas adecuadas de disolventes orgánicos con una polaridad
intermedia, cuya capacidad eluyente corresponde al
XAD-2, abreviación conocida por los expertos en la
técnica. El XAD-2 es un tipo particular de resina
copolimérica de estireno y divinilbenceno con respecto a la que los
factores que conciernen a la capacidad eluyente relativa se tabulan
en las publicaciones científicas (véase por ejemplo Robinson J. L.
et al., J. Chromatogr., 1980, 185, 145), tal como por
ejemplo el tetrahidrofurano y el cloruro de metileno. El volumen de
acetato de etilo se escoge de modo que se garantice la recuperación
cuantitativa del grupo entero (como en la Figura 14) y varía en
función de la morfología y el volumen libre de la columna. El
producto de dicha elución selectiva consiste en una fracción
purificada que contiene todo el grupo de viniferinas, conteniendo
tanto oligoestilbenos como estilbenoides.
Los constituyentes básicos que garantizan el
interés farmacológico de dicha fracción son los oligómeros de
resveratrol, con particular atención a los dímeros, trímeros y
tetrámeros, tanto los que todavía contienen un doble enlace de
estilbeno en forma trans o cis (oligoestilbenos) como los que han
perdido su estructura de estilbeno durante la polimerización
natural (estilbenoides). La misma fracción también contiene el
monómero de trans-resveratrol glucosilado.
Si se obtienen los siguientes compuestos puros:
\varepsilon-viniferina,
\alpha-viniferina, H-gnetina (que
también puede aislarse de la madera de la Welwitschia
mirabilis), r-viniferina, Ampelopepsina A (que
también puede aislarse de las raíces de Ampelopsis
brevipenduculata) y hopeafenol, se ha de realizar una
cromatografía en fase líquida de alta resolución en columnas de
fase inversa. Pueden utilizarse fases basadas en sílice
funcionalizadas con C18 o C8 (términos conocidos por los expertos en
la técnica) o polímeros de estireno, estos últimos únicamente a
baja presión. Un ejemplo práctico (ideal para separar
\varepsilon-viniferina, H-gnetina
y r-viniferina) es la utilización de una columna
empaquetada con una fase fija RP-18, por ejemplo
Li-Chrospher 100 o similar, con un tamaño de
partícula de 10 micrómetros, eluyendo con un gradiente linear de
agua y acetonitrilo, este último del 30 al 50%. La preparación de
las condiciones de separación para este tipo de mezclas es conocida
por los expertos en la técnica.
Un análisis cuantitativo de la mezcla de
estilbenos, oligoestilbenos y estilbenoides obtenidos con la
extracción según la invención puede obtenerse generalmente mediante
cromatografía en fase líquida de alta resolución en columnas de
fase inversa (u otro tipo de técnicas de separación en fase líquida
tal como la electroforesis, la cromatografía de capa fina (TLC) con
detección por rayos UV, MS (espectrometría de masas) o detector de
fluorescencia. Las dos primeras técnicas son las preferidas ya que
permiten una identificación fiable. Un ejemplo de condiciones
optimizadas puede encontrarse en el ejemplo 8.
Tratamiento
B
El tratamiento B consiste en las siguientes
alternativas:
- Si tanto los componentes lipófilos como los
hidrófilos han de eliminarse del extracto final, el extracto acuoso
bruto se lava en cloruro de metileno u otro disolvente con polaridad
similar tal como por ejemplo el cloroformo, a fin de eliminar los
productos lipófilos aunque no los estilbenos, y a continuación se
extrae de nuevo en acetato de etilo (por ejemplo cinco veces con un
volumen de extracto / solvente de extracción en un proporción 1:1,
a reducirse en el caso de volúmenes superiores de solvente de
extracción o de modificación de la capacidad iónica del extracto),
para recuperar los estilbenos, mientras que los compuestos hidrófilo
permanecen en la porción acuosa que se descarta.
- Si únicamente se han de obtener derivados
glucosilados del extracto final, estos pueden precipitarse en frío
selectivamente a partir del extracto bruto en un disolvente tal como
el acetato de etilo con un disolvente no polar (el hexano sería el
ideal, en una proporción de 3:1 en relación con el acetato de
etilo), y recuperarse por filtración. Alternativamente, la fracción
completa puede utilizarse a fin de recuperar también el
trans-resveratrol.
- Si se ha de obtener una separación exactamente
precisa de la mezcla, resulta posible empezar a partir del extracto
bruto en un disolvente tal como el acetato de etilo, que ha de ser
perfectamente anhidro. Dicho extracto bruto, preferentemente
reducido a su volumen mínimo, se carga en la parte superior de una
columna preparatoria de sílice para cromatografía (por ejemplo una
Kieselgel de 0,05 - 0,20 mm) empaquetándose la última en un
disolvente no polar (por ejemplo hexano). Se deja por encima de la
columna un volumen adecuado de cloroformo.
El tratamiento proporciona dos secuencias
posteriores de lavado y elución con las mezclas presentando grados
de elución crecientes, cloroformo - metanol, I (20:1); II (10:1);
III (5:1); IV (2,5:1) respectivamente. De un modo más general, con
mezclas binarias o ternarias de disolventes con una polaridad
moderada (por ejemplo disolventes clorados, éter dietílico,
tetrahidrofurano) y disolventes fuertes (por ejemplo alcoholes
alifáticos, acetonitrilo) resulta posible obtener separaciones
similares empleando mezclas que tienen una posición en la serie de
elución que es completamente similar a la de las indicadas
anteriormente, tal como resultará conocido para un experto en la
técnica. Dicha separación permite la recuperación integral de los
principios activos de estilbeno, separados de todas las sustancias
principales que interfieren, obteniendo de este modo dos
preparaciones de pureza muy elevada: la fracción IV contiene dos
derivados monoglucosilados del trans-resveratrol
distintos, recogidos de la misma fracción, y la fracción II
contiene trans-resveratrol libre. Las condiciones
descritas aquí se refieren en particular a la extracción en raíces
de Polygonum cuspidatum, y puede adaptarse con un
procedimiento similar al Polygonum multiflorum, que contiene
- por lo que se sabe - también otros tipos de estilbenos
glucosilados
(2,3,5,4'-tetrahidroxiestilbeno-2-glucósido,
Yong et al.,
2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl
radical-scavenging active components from Polygonum
multiflorum ("componentes de Polygonum multiflorum
activos en la eliminación de radicales del
2,2-difenil-I-picrilhidrazilo")
Thunb., J. Agr. Food Chem., 1999, 47, 226 - 228). Si resulta
necesario llegar a nivel molecular, pueden emplearse técnicas de
purificación de cromatografía preparatoria, en las condiciones
descritas en Mattivi et al., Isolation, characterization
and evolution in red wine vinification of resveratrol monomers
("Aislamiento, caracterización y evolución de monómeros de
resveratrol en la vinificación del vino tinto"), J. Agr. Food
Chem., 1995, 43, 7, 1820 - 1823.
Puede realizarse un análisis cuantitativo de
resveratroles según el ejemplo 8.
Las técnicas de análisis cuantitativo descritas
resultan particularmente indicadas por ejemplo para evaluar la
presencia del principio activo deseado en medios de cultivo, y por
lo tanto para soportar modelos experimentales in vitro.
En el ejemplo 7 puede encontrarse una indicación
de las técnicas de isomerización según la invención.
La función más importante del sistema inmunitario
es proteger el organismo de las enfermedades. A fin de alcanzar
dicho objetivo, durante su evolución el sistema inmunitario ha
desarrollado diversos mecanismos producidos por linfocitos
efectores, en los que tanto participan humores como células. Cada
uno de estos mecanismos producidos por linfocitos efectores
presentan unas características propias por lo que se refiere a su
capacidad de afectar a la velocidad de progresión o de provocar la
eliminación de los microorganismos patógenos o las células
tumorales. Dicha diversidad de mecanismos resulta absolutamente
necesaria y que una respuesta sola producida por linfocitos
efectores no puede afrontar todos los tipos de situaciones
patógenas. Además, una respuesta adecuada producida por linfocitos
efectores debe actuar selectivamente en el órgano objetivo y ha de
ser capaz de inhibir el desarrollo de otros tipos no específicos de
respuesta inmunitaria a fin de reducir el riesgo de consecuencias
patológicas.
En el marco de las respuestas en las que
intervienen células se pueden distinguir dos apartados: el primero
concierne a los macrófagos y a los linfocitos citolíticos (NK) y
proporciona una respuesta natural, independiente de estímulos
antigénicos. El segundo, relacionado con las respuestas adquiridas,
concierne a los linfocitos T antineoplásicos (CTL) y proporciona
una respuesta que está relacionada estrictamente al reconocimiento
del antígeno en asociación con el complejo principal de
histocompatibilidad (MHC). Los linfocitos T, gracias a su capacidad
para producir distintos tipos de citocinas como respuesta a diversos
estímulos que los activan, juegan un papel central en el desarrollo
de una correcta respuesta producida por linfocitos efectores por
parte del sistema inmunitario.
Por lo tanto, las intervenciones farmacológicas
que modulan el sistema inmunitario tanto controlando directamente
la respuesta producida por linfocitos efectores como regulando la
síntesis y la secreción de citocinas por parte de las células T
pueden tener una influencia directa cuantitativa y cualitativa en la
naturaleza de la respuesta inmunitaria.
La presente invención describe un método para
modular, mediante los compuestos según la invención, en particular
mediante el resveratrol, la actividad productora de los linfocitos
efectores de las células del sistema inmunitario y en particular la
actividad citolítica natural (NK), la activad antineoplásica
específica de antígeno de los linfocitos T, la producción de
citocinas de tipo TH1 y TH2 al activar las células T CD8+ y
CD4+.
Los efectos de los inmunomoduladores descritos en
la presente invención sobre los parámetros funcionales del sistema
inmunitario mencionados anteriormente varían en función de la dosis
de la sustancia administrada (efecto inmunoestimulante a dosis
bajas y efecto inmunodepresor a dosis superiores). Por lo tanto, los
compuestos según la invención pueden utilizarse como fármacos
inmunoestimulantes para reforzar la respuesta inmunitaria en el
caso de inmunodeficiencias primarias o secundarias, tales como las
que se presentan en pacientes que padecen tumores, SIDA,
infecciones víricas o bacteriana o en pacientes ancianos, así como
fármacos inmunodepresores en el tratamiento de enfermedades
autoinmunitarias o en general para inhibir respuestas inmunitarias
indeseadas tal como es el caso de los procesos asmáticos o de los
rechazos en trasplantes.
Los inmunomoduladores descritos en la presente
invención pueden utilizarse en combinación con otros agentes
terapéuticos farmacéuticamente activos, tales como por ejemplo
compuestos antineoplásicos (antimetabolitos, agentes intercalantes,
inhibidores de la mitosis u otros inhibidores antineoplásicos (por
ejemplo, complejos de coordinación de platino, alcaloides de la
vinca, sustitutos de la urea, L-asparaginasa,
inhibidores corticoadrenales). En los extractos para el tratamiento
pueden utilizarse como tales, es decir, los compuestos individuales
tanto en forma natural (como aislados a partir de las matrices de
origen vegetal) como obtenidos por síntesis química. El principio
activo puede administrarse en forma de sal, éster, amida, profármaco
o similares, todos ellos farmacéuticamente aceptables, o
combinaciones de los mismos. Pueden prepararse las sales, ésteres,
amidas, profármacos o similares de los principios activos siguiendo
los procedimientos estándar de química de síntesis orgánica.
Sobre la base del tipo de administración que va a
utilizarse, la formulación farmacéutica puede presentarse en forma
de comprimidos, supositorios, pastillas, cápsulas, polvos, líquidos,
suspensiones, cremas, ungüentos, lociones o similares. De este modo
las composiciones comprenderán una cantidad eficaz del principio en
combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable y también
pueden comprender otros agentes farmacológicos, aditivos,
diluyentes, soluciones amortiguadoras del pH, etc. Los compuestos
pueden por lo tanto administrarse por vía oral, parenteral
(inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular), transdérmica,
rectal, intranasal, bucal, por administración tópica o mediante un
implante de liberación controlada.
La cantidad del principio activo que se tendrá
que administrar dependerá de la patología (o patologías) en
particular que afecten al paciente a tratar, del peso y la edad del
paciente, del tipo de administración escogido y de la opinión del
médico responsable. En el método según la invención, la pauta de
tratamiento proporcionará la administración del fármaco a unas
dosis comprendidas entre 0,0001 y 20 mg/kg/día.
Las aplicaciones clínicas de los compuestos
afectarán la prevención y el tratamiento de patologías cuya solución
requiera la estimulación de la respuesta inmunitaria o su
inhibición. Por lo tanto, los compuestos puede utilizarse: 1) como
fármacos inmunomoduladores para utilizar en patologías tales como
por ejemplo i) la inmunodeficiencia primaria en niños y en adultos;
ii) las inmunodeficiencias secundarias derivadas por ejemplo de la
desnutrición, de las enfermedades linfoproliferativas, de
infecciones (tales como las producidas por virus, bacterias, hongos,
parásitos animales), las intervenciones quirúrgicas, los
tratamientos de radioterapia o quimioterapia, la administración de
fármacos, quemaduras y el síndrome nefrótico; 2) como fármacos
inmunodepresores para utilizar en patologías tales como por ejemplo
i) las enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo la artritis
reumatoide, la uveítis, la psoriasis); ii) el rechazo en un
trasplante.
Los siguientes ejemplos 1 a 16 no forman parte de
la presente invención.
Se congela la matriz y a continuación se
homogeneíza en presencia de metabisulfito sódico y ácido ascórbico
en una cantidad de un 1% en peso cada uno, se somete el producto
homogeneizado a extracción líquido - líquido tres veces con acetato
de etilo (150% en volumen con relación al peso de la matriz) en
ausencia de luz. Los extractos se lavan una vez con una disolución
acuosa al 3% de bicarbonato sódico y dos veces con agua destilada,
con un volumen de un 10% del volumen del extracto en cada lavado. El
extracto lavado se anhidrifica con sulfato sódico anhidro o al
congelar y concentrar hasta secar bajo presión reducida y
temperatura baja. El extracto seco se recoge con acetato de etilo
anhidro.
La raíz del vegetal una vez arrancada se lava, se
seca, se corta en fragmentos grandes, se liofiliza y se tritura. La
extracción se realiza con metanol (o etanol) bajo agitación en
ausencia de luz y oxígeno. A continuación se centrifuga el extracto
y el líquido sobrenadante se recupera y se concentra a presión
reducida y a una baja temperatura y se recoge con acetato de
etilo.
La extracción de viniferina a partir de las
partes aéreas (tronco, brotes, hojas) o partes subterráneas de
vegetales de la familia de las vitáceas o las poligonáceas puede
llevarse a cabo tanto en una matriz fresca como congelada, o en una
parte liofilizada o pulverizada. Si la extracción se lleva a cabo
con las raíces, estas se lavan, se secan, se cortan en fragmentos
grandes, se liofilizan y se trituran. La matriz que se considera
como la más importante consiste en la corteza de raíces lignificadas
del género Vitis.
La extracción se obtiene con metanol (o
alternativamente con etanol) en un volumen de 10 a 20 veces el peso
de la matriz que se ha de extraer, en una atmósfera libre de
oxígeno, por ejemplo saturada con nitrógeno, y con protección de la
luz, a temperatura ambiente, con una duración de la extracción que
varía en función de la matriz. El extracto final se concentra bajo
presión reducida y a una temperatura baja y se recoge con acetato
de etilo.
El extracto concentrado obtenido se lava con agua
saturada con una sal inorgánica (por ejemplo NaCl), la fracción en
acetato de etilo se carga en una columna preparada con una resina de
un polímero de estireno y divinilbenceno, con un tamaño de
partícula comprendido entre 0,1 y 0,25 mm, a continuación se
pre-purifica mediante lavados consecutivos con
metanol, cloruro de metileno, acetona, metanol y agua. Un volumen de
agua que corresponde a aproximadamente 10 veces el volumen del
extracto a cargar se deja en la parte superior de la columna.
Después de la carga se inicia la absorción en la parte superior de
la columna, a continuación se procede a los lavados con agua,
después con cloruro de pentano y metileno en un proporción 2:1. Los
estilbenos se eluyen con acetato de etilo. El producto de dicha
elución selectiva consiste en una fracción purificada que contiene
todo el grupo de viniferinas, conteniendo tanto oligoestilbenos
como estilbenoides. Los otros polifenoles, fuertemente absorbidos,
se eluyen con metanol y/o metanol acidificado con ácido inorgánico
fuerte.
En particular, los constituyentes básicos que
garantizan el interés farmacológico de dicha fracción son los
oligómeros de resveratrol, con atención particular a los dímeros,
trímeros y tetrámeros, tanto los que todavía contienen un doble
enlace de estilbeno en forma trans o cis (oligoestilbenos) como los
que han perdido su estructura de estilbeno durante la
polimerización natural (estilbenoides). La misma fracción también
contiene el monómero de trans-resveratrol
glucosilado.
El extracto obtenido tal como se ha descrito
anteriormente a partir de las raíces de Polygonum cuspidatum
se trata del siguiente modo. Si únicamente se han de purificar
glucósidos, estos pueden precipitarse en frío selectivamente en un
disolvente no polar (el hexano sería el ideal). Alternativamente, la
fracción completa puede utilizarse a fin de recuperar también el
trans-resveratrol. El extracto en acetato de etilo,
que ha de ser perfectamente anhidro, se reduce a su volumen mínimo
y se carga en la parte superior de una columna preparatoria de
sílice para cromatografía (por ejemplo una Kieselgel de 0,05 - 0,20
mm) empaquetada en hexano. Se deja por encima de la columna un
volumen adecuado de cloroformo. El tratamiento proporciona dos
secuencias posteriores de lavado y elución con diversas mezclas de
cloroformo y metanol, I (20:1); II (10:1); III (5:1); IV (2,5:1)
respectivamente. Dicha separación permite la recuperación integral
de los principios activos, separados de todas las sustancias
principales que interfieren, obteniendo de este modo dos
preparaciones de pureza muy elevada: una contiene dos distintos
monoglucósidos de trans-resveratrol, recogidos en la
misma fracción, y la otra contiene
trans-resveratrol libre. Si resulta necesario llegar
a nivel molecular, pueden aplicarse técnicas de purificación de
cromatografía preparatoria, en las condiciones descritas en Mattivi
et al., Isolation, characterization and evolution in red
wine vinification of resveratrol monomers ("Aislamiento,
caracterización y evo- lución de monómeros de resveratrol en
la vinificación del vino tinto"), J. Agr. Food Chem.,
1995, 43, 7, 1820 - 1823.
Si el producto inicial consiste en las raíces de
Vitis, pueden obtenerse los siguientes compuestos puros:
\varepsilon-viniferina,
\alpha-viniferina, H-gnetina (que
también puede aislarse de la madera de la Welwitschia
mirabilis), r-viniferina, Ampelopepsina A (que
también puede aislarse de las raíces de Ampelopsis
brevipenduculata) y hopeafenol.
El aislamiento final de dichos compuestos puede
obtenerse mediante cromatografía en fase líquida de alta resolución
en columnas de fase inversa. Pueden utilizarse satisfactoriamente
fases basadas en sílice funcionalizadas con C18 o C8 o polímeros de
estireno, estos últimos únicamente a baja presión. Un ejemplo
práctico (ideal para separar
\varepsilon-viniferina, H-gnetina
y r-viniferina) es la utilización de una columna
empaquetada con una fase fija RP-18, por ejemplo
Li-Chrospher 100 RP-18, con un
diámetro de partícula de 10 micrómetros, eluyendo con un gradiente
linear de agua y acetonitrilo, este último del 30 al 50%.
Dicha reacción puede utilizarse tanto para
obtener productos que no se encuentran disponibles comercialmente
(ejemplo: cis-resveratrol) y para desplazar el
equilibrio de mezclas de extractos naturales que contienen ambas
formas, si resulta necesario farmacológicamente.
Los isómeros cis pueden prepararse mediante
fotoisomerización partiendo de los isómeros trans correspondientes.
El mejor rendimiento de conversión puede obtenerse mediante
irradiación débil con luz negra o con luz visible que puede
realizarse en recipientes de vidrio transparente. Por ejemplo, la
isomerización de una disolución que contenga 0,5 mg/ml de
T-Res comercial en etanol, protegido del oxígeno
mediante desgasificación en un baño de ultrasonidos, insuflado con
nitrógeno y a continuación sellado e irradiado a 366 nm, permite
obtener unos rendimientos de conversión de aproximadamente el 90%
con tiempos de 600 minutos. La conversión puede controlares
utilizando las técnicas de cromatografía en fase líquida de alta
presión (HPLC), descrita anteriormente, mediante una inyección
directa, interrumpiendo la reacción cuando se alcanza el rendimiento
deseado. Obviamente, los períodos y los modos se han de adaptar
según la práctica general: pueden utilizarse irradiaciones más
potentes únicamente si se aplican controles del procedimiento más
rápidos, conocidos por los expertos en la técnica (UV directos,
HPLC isocrática), que de todos modos resultan sencillos en el caso
de componentes simples. La disolución alcohólica, en nuestro caso
con etanol, permite una estabilidad óptima de la preparación, que
se ha de mantener en la disolución debido a que presenta grandes
problemas de estabilidad en estado sólido.
En lo que se refiere a la cuantificación de la
viniferina, en la mezcla del Ejemplo 4 o del Ejemplo 6, un volumen
comprendido entre 1 y 6 microlitros de extracto en acetato de etilo,
anhidrificado y filtrado a 0,22 micrómetros, se inyecta en un
sistema de HPLC con columna de fase inversa Hypersil ODS C18, 5
micrómetros, 200 x 2,1 mm. Las condiciones instrumentales consisten
en eluyentes A = H_{3}PO_{4}, 1 mM en agua, B = acetonitrilo,
gradiente lineal desde 100% A, + 2% B/min, 0,6 ml/min de flujo,
40ºC. La detección se obtiene con un detector de fotodiodo a 325 nm
para los oligoestilbenos y a 282 nm para los estilbenoides. La
cuantificación se realiza con el método externo estándar con
referencia a la líneas rectas de calibración con compuestos de
referencia puros.
En lo que se refiere a los resveratroles, pueden
obtenerse con dos técnicas alternativas, HPLC o GC. Para ambas
técnicas se lleva a cabo la cuantificación con el método estándar
interno. El compuesto que hemos hallado como óptimo es el
trans-4-hidroxi-estilbeno,
disponible comercialmente.
Para los análisis de CG (cromatografía de gases)
se utilizan las técnicas descritas en Mattivi et al.,
Isolation, characterization and evolution in red wine
vinification of resveratrol monomers ("Aislamiento,
caracterización y evolución de monómeros de resveratrol en la
vinificación del vino tinto"), J. Agr. Food Chem., 1995,
43, 7, 1820 - 1823. Se ha de utilizar un agente derivatizante
distinto de los indicados en las publicaciones relacionadas, que
consiste en el trimetilclorosilano y el hexametildisilazano en
piridina anhidra. Dichas condiciones específicas se determinan para
superar los problemas de silanización con el
bis(trimetilsilil)fluoroacetamida (BSTFA).
Para la HPLC puede aplicarse el método de
referencia con columna de fase inversa, con detección a 310 nm para
los isómeros trans y a 282 nm para los isómeros cis (Mattivi F.
Solid phase extraction of trans-resveratrol from
wines for HPLC analysis ("Extracción en fase sólida de
trans-resveratrol de vinos para la HPLC"),
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und
Forschung, 1993, 196, 522 - 525). Las condiciones instrumentales
son las mismas descritas anteriormente para la viniferina. El
coeficiente de extinción molar de ambos glucósidos es casi el mismo
que uno de los correspondientes aglucones, de modo que pueden
determinarse como tales después de realizar una corrección para los
pesos moleculares (Mattivi et al., Isolation,
characterization and evolution in red wine vinification of
resveratrol monomers ("Aislamiento, caracterización y
evolución de monómeros de resveratrol en la vinificación del vino
tinto"), J. Agr. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820 -
1823).
Si resulta necesaria una preparación para
matrices acuosas o hidroalcohólicas, la inyección ha de ir precedida
por una etapa de prepurificación en cartuchos de fase inversa según
Mattivi F. Solid phase extraction of
trans-resveratrol from wines for HPLC analysis
("Extracción en fase sólida de trans-resveratrol
de vinos para la HPLC"), Zeitschrift für
Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 1993,
196, 522 - 525. Además de lo que se expone en el anterior
documento, se ha verificado que el método resulta adecuado para
todos los monómeros de estilbeno, tanto libres como glucósidos, y
que la fracción eluida de acetato de etilo puede secarse bajo un
flujo moderado de nitrógeno, en caso de que se necesario realizar el
intercambio en otro disolvente y/o reducir más los límites de la
cuantificación.
Dichas técnicas puede utilizarse por ejemplo para
controlar la estabilidad del principio activo en medios de cultivo,
y de este modo soportar modelos experimentales in vitro que
se van a describir en los siguientes ejemplos. Por ejemplo, para
los medios de cultivo descritos en el ejemplo 10 resulta posible
encontrar períodos de división de 38 horas para el
cis-resveratrol, que todavía se encuentra presente
en una cantidad de aproximadamente el 25% al final del análisis (72
h), mientras que el período de división es todavía elevado para el
trans-resveratrol, que no se encuentra presente
como tal después de 72 h.
Los principales experimentos que resultan
necesarios para la caracterización unívoca a nivel molecular se
comentan ahora según la técnica que emplean:
Espectrometría ultravioleta: en un
espectrómetro UV con célula estática se realiza la doble
determinación en etanol absoluto sin y con la adición de etilato
sódico (Hillis W.E., Ishikura N. 1968 J. Chromatogr., 32,
323). En un detector de fotodiodo acoplado con HPLC, según Mattivi
F., Raniero F. Relationship between UV spectra and molecular
structure of resveratrol oligomers ("Relación entre los
espectros UV y la estructura molecular de los oligómeros de
resveratrol"). Polyphenols Communications 96, 125 - 126.
Dado y = A230 / A236, el número de unidades de estilbeno en los
oligómeros, es decir x, se obtiene con la ecuación y = 0,657x -
0,065.
Resonancia magnética nuclear: ^{1}H en
un espectrómetro NMR a 400 MHz o superior, 13 C a 100 MHZ o
superior en acetona hexadeuterada con TMS como referencia. Como
alternativa, pueden emplearse resonancias del grupo metilo de la
acetona hexadeuterada como referencia (\DeltaH = 2,04, \DeltaC =
29,8). Para compuestos específicos, según los requisitos, pueden
aplicarse diversos experimentos de determinación, por ejemplo DEPT
homonuclear, ^{1}H COSY, ^{1}H COSY de amplio espectro, COSY con
filtro de doble cuanto, HECTOR heteronuclear y experimentos de
desacoplamiento
^{1}H-^{13}C(^{13}C)-GARP
heteronuclear de amplio espectro, HMQC, HMBC, espectros de
diferencia NOE. Las concentraciones óptimas para las determinaciones
en sondas de 5 mm son 15 mg en 0,5 ml para los experimentos
protónicos y 80 mg para los experimentos de carbono.
Espectrometría de masas: en particular
FAB-MS registrada en modalidad negativa, en matriz
de glicerina.
Espectroscopía de infrarrojos: registrada
en comprimidos de KBr.
Acetilación de hidroxilos libres, en las
condiciones indicadas por Koenig et al. (1987,
Phytochemistry, 26, 2, 423 - 427).
Las células mononucleadas de las sangre
periférica humana (PBMC) obtenidas de pacientes sanos se han
obtenido por separación en gradiente
(Ficoll-Hypaque) de células de una capa
leucocítica.
La producción in vitro de citocinas
provocada por la activación del anticuerpo monoclonal
anti-CD3 realizada por diversas subpoblaciones de
células T en la PBMC se ha analizado mediante una determinación
citofluorométrica simultánea del contenido en citocinas
intracitoplasmáticas y la expresión de los antígenos de superficie
en cada célula individual. Al utilizar dicho método ha resultado
posible analizar el producción de citocinas mediante subpoblaciones
de células individuales sin separarlas físicamente previamente, y
por lo tanto sin la presencia de interacciones en la producción de
citocinas que se producen en los sistemas fisiológicos. La
realización de dicho método se ha hecho posible mediante la
utilización de la saponina como agente permeabilizante de la
membrana celular. En pocas palabras, las PBMC se han resuspendido en
una concentración de 1x10^{6}/ml, activadas mediante el
tratamiento con anti-CD3 (10 ng/ml) y se han
incubado con diversas dosis de resveratrol. Después de 3 días de
cultivo a 37ºC en un incubador de CO_{2}, las células se han
tratado con anti-CD28 (2 ng/ml) y con resveratrol
con las mismas dosis utilizadas previamente. Después de 3 días más
de tratamiento, se han incubado las células con un anticuerpo
monoclonal fluorescente específico de un antígeno de superficie
(CD4 o CD8), se han resuspendido en un medio con la adición de
saponina al 0,3%, y se han marcado con una dosis óptima de una
mezcla de anticuerpos monoclonales anti-citocina
conjugados con diversos fluorocromos. Las mezclas tratadas de este
modo a continuación se sometieron a análisis citofluorométrico
utilizando un citofluorómetro FACscan (BD).
Las PBMC se han resuspendido en una concentración
de 1 x 10^{6}/ml y se han incubado con diversas dosis de
resveratrol. A continuación se han incubado las células con uno o
más anticuerpos monoclonales fluorescentes cada uno de ellos
específico de un antígeno de superficie (CD4, CD8, CD16 y CD95), y
se han sometido a análisis citofluorométrico utilizando un
citofluorómetro FACscan (BD).
Se han resuspendido las PBMC a una concentración
de 1 x 10^{6}/ml y se han fijado en acetona y metanol en una
proporción de 1:4, se han tratado con 100 KU/ml de RNasa y se han
marcado con yoduro de propidio (50 mcg/ml). A continuación se han
analizado las células por citofluorometría de flujo utilizando un
citómetro FACscan.
Se han resuspendido las células a una
concentración de 1 x 10^{6}/ml, se han fijado en paraformaldehído
al 4%, se han tratado con 100 KU/ml de RNasa y se han marcado con
yoduro de propidio. A continuación se han analizado las células
mediante la observación con un microscopio confocal (LEIKA TCS
4D).
Se analizó la replicación celular mediante un
recuento celular realizado utilizando un contador Coulter. La
síntesis de ADN se determinó mediante una prueba de incorporación de
bromodesoxiuridina (BrdU) analizado por citometría de flujo
utilizando un citómetro FACscan (Becton - Dickinson).
La mortalidad celular se ha analizado mediante un
recuento celular en azul tripán y/o por citometría de flujo
utilizando un citómetro FACscan (Becton - Dickinson), determinando
la vitalidad de las células sin fijar que se han marcado con yoduro
de propidio (PI).
Se han tratado las PBMC en una concentración de 2
x 10^{6}/ml in vitro con distintas dosis de resveratrol
durante 18 h. Al final de la incubación se ha analizado la actividad
antineoplásica de las células (NK) contra la línea eritroleucémica
K 562. La actividad antineoplásica de las células efectoras
incubadas durante 4 horas a 37ºC con K 562 se ha determinado una
prueba estándar de antineoplasia basada en la liberación de
^{51}Cr por parte de las células objetivo.
Se han estimulado las PBMC en una concentración
de 2 x 10^{6}/ml in vitro durante 5 días a 37ºC con
células MT-2 irradiadas (una línea de células T
humanas obtenidas a partir de la sangre del cordón umbilical
infectado con HTVL-1), y simultáneamente se han
tratado con distintas dosis de resveratrol. Al final de la
incubación se ha analizado la actividad antineoplásica de las
células contra las células MT-2 utilizando una
prueba estándar de antineoplasia basada en la liberación de
^{51}Cr por parte de las células objetivo.
Se han activado células mononucleadas de sangre
periférica humana (PBMC) mediante la incubación con
anti-CD3 + anti-CD28 y a
continuación se han incubado con distintas dosis de resveratrol (o
DMSO como control) tal como se ha descrito anteriormente. Las
células no activadas obtenidas de la misma capa leucocítica se han
utilizado como control. El porcentaje de linfocitos T CD4+ y CD8+
positivos para la IL2, la IL4 y el IFN-g se ha
analizado a continuación mediante citofluorometría de flujo. Los
resultados de los experimentos han demostrado que en una dosis
comprendida entre 0,625 y 2,5 mcg/ml el resveratrol provoca en las
células activadas con anti-CD3 +
anti-CD28 un incremento significativo, en relación
con los controles, del porcentaje de células T CD8+ para el
IFN-g, la IL2 y la IL4 intercelulares (y por lo
tanto activadas para sintetizar las citocinas mencionadas) (Figura
1). El máximo de actividad varía según la citocina examinada, y
precisamente: 1,25 - 2,5 para IFN-g (Figura 1A),
0,625 para IL2 (Figura 1B) y 2,5 para IL4 (Figura 1C). A una dosis
de 5 y más significativamente a una dosis de 10 mcg/ml el
resveratrol efectuó una inhibición del porcentaje de células que
pueden sintetizar todas las citocinas analizadas (Figuras 1A, 1B,
1C). Unos resultados similares se han obtenido con las células T
CD4+ (Figura 2), aunque con diferencias en lo que se refiere al
máximo de la activad de estimulación, que fueron de 2,5, 1,25 - 2,5
y 0,625 para el IFN-g (Figura 2A), la IL2 (Figura
2B) y IL4 (Figura 2C) respectivamente. Dichos resultados demuestran
claramente que el resveratrol puede modular (tanto en el sentido de
una estimulación a dosis bajas como en el de una inhibición a dosis
elevadas) la producción de citocinas de las células T activadas
CD8+ y CD4+, y por lo tanto gracias a dicho efecto puede utilizarse
como fármaco con actividad inmunomoduladora.
Se han activado células mononucleadas de sangre
periférica humana (PBMC) mediante la incubación con
anti-CD3 + anti-CD28 y a
continuación se han incubado con distintas dosis de resveratrol (o
DMSO como control) tal como se ha descrito anteriormente. Las
células no activadas obtenidas de la misma capa leucocítica se han
utilizado como control. Los resultados de los experimentos han
demostrado que en una dosis comprendida entre 0,625 y 1,25 mcg/ml
el resveratrol provoca un incremento estadísticamente significativo
tanto en el número (Figura 3A) como en la capacidad de sintetizar
ADN (Figura 3B) de las células tratadas, y por lo tanto un
incremento en su capacidad proliferativa. Contrariamente, con unas
dosis comprendidas entre 2,5 y 10 mcg/ml el tratamiento con
resveratrol produce una inhibición dependiente de la dosis de la
proliferación celular (Figuras 3A y 3B).
Se han activado células mononucleadas de sangre
periférica humana (PBMC) mediante la incubación con
anti-CD3 + anti-CD28 y a
continuación se han incubado con distintas dosis de resveratrol (o
DMSO como control) tal como se ha descrito anteriormente. Las
células no activadas obtenidas de la misma capa leucocítica se han
utilizado como control. Los resultados de los experimentos han
demostrado que en una dosis comprendida entre 0,625 y 1,25 mcg/ml
el resveratrol no provoca efecto alguno en la apoptosis de las
células activadas (Figura 4A). Contrariamente, con unas dosis
comprendidas entre 2,5 y 10 mcg/ml el tratamiento con resveratrol
produce un incremento dependiente de la dosis del porcentaje de
células apoptósicas (Figura 4A). De un modo similar, las dosis
comprendidas entre 0,625 y 1,25 mcg/ml no tienen efecto alguno en la
mortalidad de las células activadas (Figura 4B). Contrariamente,
con unas dosis comprendidas entre 2,5 y 10 mcg/ml el tratamiento con
resveratrol produce un incremento dependiente de la dosis en la
mortalidad (Figura 4B).
Se han incubado durante 18 horas células
mononucleadas de sangre periférica humana (PBMC) con resveratrol en
una concentración de 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 y 20 mcg/ml. Al final
de la incubación se ha analizado la activad antineoplásica natural
(NK) de las células contra la línea eritroleucémica humana K 652.
Los resultados han demostrado (Figura 5A) que en una dosis
comprendida entre 0,625 y 5 mcg/ml el resveratrol provoca un
incremento estadísticamente significativo en la actividad NK. Dicho
incremento significativo (Figura 5B), después del tratamiento con
resveratrol con una dosis de 5 mcg/ml, de células que pueden
co-expresar CD16 y CD95 (células CD16+ / CD95+) se
refiere claramente a la actividad estimuladora específica en el
parámetro de la sustancia analizada que se toma en consideración,
presumiblemente mediante la estimulación de dichas células. Dicha
especificidad también se demuestra en que el tratamiento de los
linfocitos con resveratrol con la misma dosis no provoca variación
alguna en el porcentaje de las células CD4+ / CD95+ (Figura 5C).
Dichos resultados demuestran claramente que el resveratrol,
probablemente mediante la activación de las células CD16+ / CD95+,
pueden desarrollar una actividad inmunoestimulante en relación con
la respuesta NK y pueden de ese modo reforzar la respuesta
antineoplásica natural.
Contrariamente, con dosis de 10 y 20 mcg/ml el
resveratrol provoca la inhibición de la actividad NK.
Se han incubado células mononucleadas de sangre
periférica humana (PBMC) con resveratrol en una concentración de
0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 mcg/ml en presencia de células
MT-2 (una línea de células T humanas obtenidas a
partir de la sangre del cordón umbilical infectado con
HTVL-1) durante 5 días a 37ºC. Al final de la
incubación se ha analizado su activad antineoplásica contra dichas
células MT-2. Los resultados de dichos experimentos
han demostrado que en una dosis comprendida de 0,625 mcg/ml el
resveratrol provoca un incremento de la actividad antineoplásica de
los linfocitos T (Figura 6A) y un incremento en el número de
blastocitos (Figura 6B). Contrariamente, con dosis comprendidas
entre 2,5 y 10 mcg/ml el resveratrol provoca la inhibición tanto de
la actividad antineoplásica (Figura 5A) como del número de
blastocitos (Figura 5B).
Se han incubado células mononucleadas de sangre
periférica humana (PBMC) con anti-CD3 +
anti-CD28 y a continuación se han incubado con
distintas dosis de resveratrol (o DMSO como control) tal como se ha
descrito anteriormente. Los resultados de los experimentos han
demostrado que el resveratrol provoca un descenso dependiente de la
dosis en el porcentaje de células CD8+ activadas en una dosificación
comprendida entre 2,5 y 10 mcg/ml. Contrariamente, no produce
variación alguna con dosis inferiores o en el porcentaje de las
células CD 4+.
Claims (7)
1. Utilización de al menos uno de los compuestos
seleccionados de entre el grupo de:
Trans-Resveratrol, Cis-Resveratrol,
Cis-Resveratrol glucosilado,
\varepsilon-viniferina, H-gnetina,
r-2-viniferina,
r-viniferina, hopeafenol, Ampelopepsina A y
Trans-Resveratrol glucosilado y las correspondientes
mezclas como principio activo para la síntesis de un medicamento
para tratar al menos una de las siguientes afecciones: la
inmunodeficiencia primaria en niños y en adultos; las
inmunodeficiencias secundarias derivadas por ejemplo de la
desnutrición, de las enfermedades linfoproliferativas, de
infecciones producidas por virus, bacterias, hongos y parásitos
animales, las intervenciones quirúrgicas, los tratamientos de
radioterapia y/o quimioterapia, la administración de fármacos,
quemaduras y el síndrome nefrótico.
2. Utilización de al menos uno de los compuestos
seleccionados de entre el grupo de:
Trans-Resveratrol, Cis-Resveratrol,
Cis-Resveratrol glucosilado,
\varepsilon-viniferina, H-gnetina,
r-2-viniferina,
r-viniferina, hopeafenol, Ampelopepsina A y
Trans-Resveratrol glucosilado y las correspondientes
mezclas como principio activo para la síntesis de un medicamento
para tratar al menos una afección seleccionada de entre las
enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, la
uveítis, la psoriasis; el rechazo en un trasplante.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2
en combinación con un agente terapéutico farmacéuticamente activo
seleccionado de entre el grupo de compuestos antineoplásicos tales
como antimetabolitos, agentes intercalantes, inhibidores de la
mitosis u otros inhibidores antineoplásicos tales como los complejos
de coordinación de platino, los alcaloides de la vinca, los
sustitutos de la urea, la L-asparaginasa, los
inhibidores corticoadrenales.
4. Utilización según las reivindicaciones 1 a 3
administrándose el medicamento en forma de sal, éster, amida,
profármaco o similares, todos ellos farmacéuticamente aceptables, o
las correspondientes combinaciones.
5. Utilización según las reivindicaciones 1 a 3
administrándose el medicamento en forma de comprimidos,
supositorios, pastillas, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones,
cremas, ungüentos o lociones.
6. Utilización según las reivindicaciones 1 a 3
administrándose el medicamento por vía oral, parenteral (inyección
subcutánea, intravenosa, intramuscular), transdérmica, rectal,
intranasal, bucal, por vía tópica o mediante un implante de
liberación controlada.
7. Utilización según las reivindicaciones 1 a 3
administrándose el medicamento a unas dosis comprendidas entre
0,0001 y 20 mg/kg/día del principio activo.
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