ES2253437T3 - Descontaminacion de alimento para animales que contiene priones (p.ej.un agente de eeb). - Google Patents

Descontaminacion de alimento para animales que contiene priones (p.ej.un agente de eeb).

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ES2253437T3
ES2253437T3 ES01983306T ES01983306T ES2253437T3 ES 2253437 T3 ES2253437 T3 ES 2253437T3 ES 01983306 T ES01983306 T ES 01983306T ES 01983306 T ES01983306 T ES 01983306T ES 2253437 T3 ES2253437 T3 ES 2253437T3
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Philip William Kemp
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    • A23K10/26—Animal feeding-stuffs from material of animal origin from waste material, e.g. feathers, bones or skin

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Abstract

Un método para fabricar un alimento para animales que incluye las etapas de: (i) añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8, 5; (ii)calentar el material de la etapa (i) a una temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las proteínas presentes en el material animal; y (iii) deshidratar el material producido en la etapa (ii); en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es 1-4 horas.

Description

Descontaminación de alimento para animales que contiene priones (p. ej. un agente de EEB).
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método para producir un alimento para animales. Más particularmente, esta invención se refiere a un método para producir un alimento para animales a partir de subproductos animales donde el tratamiento con álcali y calor elimina o reduce encefalopatías degenerativas transmisibles tales como encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y tembladera de las ovejas (encefalopatía espongiforme ovina).
Antecedentes de la invención
Las encefalopatías degenerativas transmisibles (EDT) incluyen encefalopatía espongiforme bovina (EEB o "enfermedad de las vacas locas"), tembladera de las ovejas, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ), síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) y kuru en humanos. Estas enfermedades se han hecho tristemente célebres en los últimos años debido, al menos en parte, a la percepción de que las autoridades no vigilaron suficientemente la incorporación de carne de ternera contaminada por EEB en suministros de alimentos para humanos y animales, lo que condujo a brotes de ECJ, principalmente en Reino Unido (véase Editorial en Nature, 1997, 389 423).
Ahora está demostrado que el agente responsable de la transmisión de EDT es una proteína, generalmente llamada una proteína "priónica", que es responsable tanto de EEB como de ECJ (Hill et al., Nature 1997, 389 448).
Generalmente, se ha llegado a la conclusión de que la destrucción de EDT en carne requiere tratamiento a 132ºC durante 20 minutos bajo 3 bares de presión. Alternativamente, en presencia de álcali se puede reducir la temperatura y la presión a 121ºC y 2 bares respectivamente.
El álcali es conocido por su efecto hidrolítico sobre biomoléculas tales como proteínas, y los intentos para esterilizar tejido animal contaminado con EDT han usado tratamiento con álcali, calor y presión como medio para destruir la patogénesis del prión.
Por ejemplo, Taguchi et al., 1991, Arch. Virol. 119 297, usaron un tratamiento de 1 hora con NaOH 1 N seguido de tratamiento en autoclave a 121ºC durante 30 minutos para inactivar homogenatos de cerebro infectado con ECJ. Ernst & Race, 1993, J. Virol. Methods 41 193, emplearon tratamiento en autoclave junto con tratamiento con NaOH y LpH para inactivar homogenatos de cerebros infectados con tembladera.
Taylor et al., 1994, Arch. Virol. 139 131, llevaron a cabo una serie de pruebas más amplias para descontaminar muestras de cerebro bovino infectado de EEB o de cerebro de roedor infectado de tembladera. Los tratamientos incluían NaOH 1 M ó 2 M durante hasta 1 hora, tratamiento en autoclave a temperaturas entre 134ºC y 138ºC durante hasta 1 hora o tratamiento con hipoclorito sódico o dicloroisocianurato sódico durante hasta 2 horas. Estos autores llegaron a la conclusión de que ninguno de los procedimientos probados producían inactivación completa de EDT.
La patente de Estados Unidos 5.780.288 describe un método para destruir la actividad infecciosa de vectores de infección en una mezcla de proteínas sin destruir la estructura primaria de la proteína.
El problema de fabricar un alimento para animales a partir de tejido animal potencialmente infectado con EDT es que las condiciones de alta temperatura y presión no se alcanzan fácilmente usando las instalaciones típicas de aprovechamiento de grasas animales o de recirculación de residuos animales. También, los tratamientos a alta temperatura durante la fabricación de alimento para animales tienden a producir un alimento inferior que tiene subproductos indeseables tales como carcinógenos, di-aminoácidos y olores volátiles.
Objeto de la invención
Por tanto es un objeto de la invención proporcionar un método para fabricar alimento para animales donde la posibilidad de contaminación con EDT está al menos reducida, si no eliminada.
Compendio de la invención
En un aspecto, la presente invención radica en un método para fabricar un alimento para animales que incluye las etapas de:
(i)
añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8,5;
(ii)
calentar el material de la etapa (i) a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 99ºC; y
(iii)
deshidratar el material producido en la etapa (ii).
\newpage
En otro aspecto la presente invención radica en un método para fabricar un alimento para animales descontaminado de EDT que incluye las etapas de:
(i)
añadir álcali a material animal contaminado por EDT para mantener un pH de al menos 8,5;
(ii)
calentar el material de la etapa (i) a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 99ºC; y
(iii)
deshidratar el material producido en la etapa (ii).
Adecuadamente, el método de la invención se lleva a cabo a aproximadamente presión atmosférica.
Preferentemente, se añade álcali suficiente para mantener un pH de al menos 9,5.
Más preferentemente, se añade álcali suficiente para mantener un pH en el intervalo de 10,5 a 13,0.
Incluso más preferentemente, se añade álcali suficiente para mantener un pH en el intervalo 11,0-11,5.
Preferentemente, el álcali es hidróxido cálcico tal como en la forma de cal hidratada.
Preferentemente, el material de la etapa (ii) se caliente a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 90ºC.
En una realización particular, la temperatura es aproximadamente 60ºC.
En otra realización particular, la temperatura es 80ºC-85ºC.
La duración de las etapas (i) y (ii), llamadas la "fase hidrolítica", es preferentemente de 1 a 4 horas o más preferentemente de 1 a 2 horas.
Después de esta fase hidrolítica, el material animal tratado se puede almacenar antes de la deshidratación o inmediatamente deshidratado.
En relación con la deshidratación, es preferente que el contenido de humedad del alimento para animales no sea mayor que 10-15% en peso. Típicamente, con el tiempo el nivel de humedad puede caer a aproximadamente 7-8% en peso que es óptimo para el alimento para animales.
La invención también proporciona un método para producir un material animal descontaminado de EDT según las etapas (i) y (ii) del segundo aspecto mencionado de la invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique otra cosa, "comprenden", "comprende" y "que comprende" se usan de modo inclusivo más que exclusivo, de modo que un entero o grupo de enteros señalados puede incluir uno o más de otros enteros o grupos de enteros no señalados.
Breve descripción de las figuras y tablas
Tabla 1: pH final de muestras variadas de carne tratada.
Tabla 2: resumen de velocidades de aclaración de proteínas priónicas de muestras de carne inoculadas con EDT después del tratamiento con álcali y calor.
Fig 1: ejemplo de un aparato para producir un alimento para animales.
Fig 2: titulación de la cepa 263K SP0172200. Calle 1: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 2: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 3: marcadores arco iris de bajo peso molecular. Calles 4-10: 5 diluciones en serie de la cepa 263K digerida con proteinasa K, de la dilución 10^{-1,4} a 10^{-5,6} respectivamente.
Fig 3: análisis de muestras de procesos después de la digestión con proteinasa K. Calle 1: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 2: marcadores arco iris de bajo peso molecular. Calle 3: cepa 287.1A digerida con proteinasa k. Calle 4: cepa 287.1-1 digerida con proteinasa K. Calle 5: mezcla hirviendo 1x. Calle 6: mezcla hirviendo 1x. Calle 7: cepa 287.1-2 digerida con proteinasa K. Calle 8: cepa 287.1-3 digerida con proteinasa K. Calle 9: cepa 387.1-4 digerida con proteinasa K. Calle 10: mezcla hirviendo 1x.
Fig 4: análisis de muestras de proceso sin digerir. Calle 1: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 2: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 3: cepa 287.1A sin digerir. Calle 4: cepa 287.1-1 sin digerir. Calle 5: marcadores arco iris de bajo peso molecular. Calle 6: mezcla hirviendo 1x. Calle 7: cepa 287.1-2 sin digerir. Calle 8: cepa 287.1-3 sin digerir. Calle 9: cepa 287.1-4. Calle 10: mezcla hirviendo 1x.
\newpage
Fig 5: titulación de la cepa 263K SP0172200. Calle 1: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 2: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 3: marcadores arco iris de bajo peso molecular. Calles 4-10: 5 diluciones en serie de la cepa 263K digerida con proteinasa K, de la dilución 10^{-1,4} a 10^{-5,6} respectivamente.
Fig 6: análisis por transferencia Western de muestras digeridas con proteinasa K. Calle 1: testigo positivo a dilución 10^{-2,8}. Calle 2: marcadores de peso molecular. Calle 3: muestra de cepa 309.1A. Calle 4: blanco. Calles 5-10: muestras de cepas 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3.3, 309.1-4.3 y 309.1-4.3, respectivamente.
Fig 7: análisis por transferencia Western de muestras sin digerir con proteinasa K. Calle 1: testigo positivo a dilución 10^{-2,8}. Calle 2: marcadores de peso molecular. Calle 3: muestra de cepa 309.1A. Calle 4: blanco. Calles 5-10: muestras de cepas 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3.3, 309.1-4.3 y 309.1-4.3, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención surge del descubrimiento inesperado de solicitante de que material animal tratado con álcali sometido a tratamiento suave con calor a presión atmosférica destruirá eficazmente EDT. El minimizar el tratamiento con calor guarda relación con el hecho de que el alimento para animales debe ser altamente digestible, particularmente con respecto al contenido de proteína, así como estar libre de EDT. Además, el calor excesivo generará productos indeseados tales como aminoácidos reticulados, racemización de aminoácidos L a sus isómeros D y formación de mutágenos tal como 2-amino 3,8-dietil-imidazol[4,5f]quinolina. También, es importante que tenga lugar mínima volatilización durante la fabricación, ya que se minimiza la producción de olor nocivo. Con estos fines, la presente invención minimiza el tratamiento con calor durante la fabricación a presión atmosférica mientras que utiliza las etapas de tratamiento con álcali y deshidratación para esterilizar eficazmente el alimento para animales en lo que respecta a EDT. Las condiciones de fabricación que proporciona la presente invención resultan fáciles de lograr con el potencial de muchas instalaciones comerciales normales de fabricación de alimento para animales, o se pueden utilizar con tan sólo pequeñas modificaciones de tales instalaciones.
Los materiales animales que se pueden usar incluyen, por ejemplo, residuos y despojos animales de trabajos de sacrificio; animales domésticos de poco valor comercial tales como ovejas o ganado desechado por la edad o afectado por la sequía, o reducción del rebaño de ovejas; residuos o desechos de canales de animales salvajes o sus partes; despojos de aves de corral o aves de corral desechadas por la edad; despojos de pescado o cangrejos o especies no aprovechables de las capturas.
El material animal preferentemente se mezcla en bruto con un material deshidratante seco que es capaz de absorber humedad (o químicamente o físicamente) del material animal, reduciendo el porcentaje del contenido de agua en el material para dar un producto seco estable.
Los materiales deshidratantes incluyen al menos uno o más de las combinaciones de:
bentonitas, zeolitas, caolines u otras arcillas en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
óxido cálcico, óxido magnésico u óxido alumínico en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
diatomita u otras tierras de diatomeas en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
yeso, dolomita, piedra caliza, bicarbonato sódico o sal en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
fosfatos cálcicos y/o ácido fosfórico en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
sulfato ferroso y/o sulfato férrico en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
granos, almidones y materiales gelatinosos y subproductos de granos (por ejemplo, endospermo, salvado, cáscaras y similares) incluyendo formas extruidas en una proporción que no exceda de 80% (p/p);
granos proteicos y granos de semillas oleaginosas y sus subproductos incluyendo formas procesadas y extruidas de harinas proteicas en una proporción que no exceda de 80% (p/p);
productos vegetales y subproductos tales como harina de copra y harina de grano de palma, bagazo y heno y paja picado en una proporción que no exceda de 75% (p/p); y
subproductos animales tales como harinas de carne, harinas de hueso y harinas de sangre y materiales gelatinosos en una proporción que no exceda de 75% (p/p).
Los materiales deshidratantes preferentes que se pueden usar son variados y dependerán de diversos factores que incluyen:
1. La proximidad y coste del material deshidratante a la instalación de deshidratación.
2. La velocidad a la que se necesita llevar a cabo la deshidratación.
3. El uso que se busca para el producto seco que resulta.
La deshidratación se realiza preferentemente en un secador rotatorio.
El álcali usado en la etapa (i) puede incluir óxidos, hidróxidos y sales de los elementos metálicos. Ejemplos incluyen óxido cálcico, hidróxido cálcico, hidróxido sódico, carbonato sódico, sulfito sódico, hidróxido potásico, carbonato potásico, hidróxido magnésico, carbonato magnésico, sulfato magnésico o cualquier combinación de dos o más.
Preferentemente, el álcali está en la forma de hidróxido cálcico (cal hidratada).
La concentración de álcali usado en la etapa (i) dependerá del pH deseado, del álcali usado en particular y de la capacidad de tamponamiento del material animal y otros usados durante la fabricación.
Por ejemplo, una proporción típica es 25 kg de cal hidratada por 1.200 kg de material animal húmedo.
Dependiendo del material con el que se va a mezclar el producto, el nivel de pH se puede ajustar mediante la adición de ácido.
Durante la fabricación, se pueden añadir materiales adicionales opcionales que mejorarán el valor nutricional o económico del producto final. Tales materiales adicionales pueden incluir (aunque no están limitados), por ejemplo, modificadores de rumen tales como monensina o avoparcina, cultivos de enzimas o bacterias; vitaminas o minerales adicionales; fuentes de nitrógeno no proteico tal como urea; antioxidantes, estabilizantes, antibióticos, inhibidores de moho, conservantes (incluyendo sal) y similares; modificadores de proteínas y lípidos para alterar su digestibilidad en el rumen; mejoradores de palatabilidad tales como melazas y subproductos de la fermentación de melazas.
Preferentemente, después del secado, el alimento para animales se deja reposar durante 24 horas antes de alimentar directamente al ganado (tanto a rumiantes como a monogástricos) en forma granular o en bloque o como un polvo molido fino.
El alimento para animales se puede mezclar con suplementos alimenticios, oligoelementos, harinas proteicas, proteína de cereal y granos de oleaginosas, melazas o subproductos de la fermentación de melazas, heno o similar en cualquier combinación para alimentación de ganado (tanto rumiantes como monogástricos); se puede usar como un alimento para mascotas, bien tal como se produce o mezclado con otros materiales; y/o se puede usar directamente o como un ingrediente en alimentos para consumo humano. Generalmente el material secado se mezclará en un máximo de 10-15% (p/p) del producto final.
Algunos ejemplos de alimento fabricado para animales son:
1. Se mezclan fracciones desgrasadas de sólidos de matadero (típicamente <10% de grasa sobre materia seca) más agua de cola de pescado con hidróxido cálcico para dar el pH de 11 requerido (aproximadamente 1:30 p/p sobre materia seca) y se deja reposar en una tolva de alimentación durante 1 hora. Después el producto se seca a 80ºC en un secador rotatorio a lo largo de 1 hora para dar un producto resultante con <10% de humedad libre que después se muele para dar una harina fina.
2. Se mezclan fracciones desgrasadas de sólidos de matadero (típicamente <10% de grasa sobre materia seca) con hidróxido cálcico para dar el pH de 10 requerido (aproximadamente 1:50 sobre materia seca) y se deja reposar en una tolva de alimentación durante 30 minutos y después se seca en un secador rotativo con entrada de algo de calor solar a lo largo de 3 horas a 60ºC para dar un producto resultante con <10% de humedad. Después este producto se muele para dar una harina fina.
3. Se mezcla material de residuo de pescado crudo con álcali que consiste en 80% de hidróxido cálcico y 20% de hidróxido sódico hasta un pH de 10,5 (aproximadamente 1:40 sobre materia seca) y se seca en un secador rotativo a 70ºC a lo largo de 4 horas para dar un producto resultante con <11% de humedad que después se muele para dar una harina fina.
Aunque aún no se ha detectado ninguna infección de EDT en animales domésticos distintos de rumiantes (por ejemplo peces y aves de corral), en algunos países hay prohibiciones en la alimentación con harinas proteicas de origen animal en general. Por ejemplo, en Australia y EEUU hay una prohibición en la alimentación de animales rumiantes con cualquier harina proteica de origen animal. En muchos países europeos, hay una prohibición total en la alimentación de todas las especies animales con cualquier harina proteica de origen animal. Estas prohibiciones existen por el temor a que finalmente se detecte infección de EDT en animales distintos a rumiantes.
También se considerará que el alimento para animales se puede usar como un fertilizante descontaminado de
EDT.
Para permitir que la invención se entienda completamente, ahora se describirán realizaciones preferentes con referencia al dibujo que acompaña (fig. 1) que es un diagrama esquemático del aparato empleado en el método de la presente invención.
En relación con el método de la presente invención, se mezcla el material deshidratante con el material animal de partida y después se calienta y se seca. Es normal mezclar todos los materiales al comienzo pero no es imprescindible, ya que se puede introducir cualquier ingrediente en cualquier momento durante el proceso. Una vez mezclado, el material se seca. Se puede usar cualquier sistema de secado por calor pero normalmente lo más práctico es usar un sistema normal de corriente de aire caliente.
Con referencia a la fig. 1, los residuos 10 animales (por ejemplo canales de ganado) se hacen pasar a través de una picadora o trituradora 11 antes de que se añada el álcali 12 (preferentemente hidróxido cálcico) y se mezcle en la mezcladora 13.
Después de picar y antes de añadir el álcali 12, se puede calentar el residuo 10 animal para licuar el componente de sebo. Después el residuo animal calentado se decanta o se prensa para crear una fracción sólida y otra líquida. La fracción líquida se acidifica y se separa en una fracción de sebo, otros líquidos (mayoritariamente agua) y sólidos residuales (referidos como "agua de cola de pescado"). Esta agua de cola de pescado se puede procesar por separado o en combinación con la fracción sólida para el tratamiento con álcali y con calor.
En este ejemplo, la adición de álcali 12 (preferentemente hidróxido cálcico) eleva el pH de la mezcla a aproximadamente pH 11,0-11,5. Durante esta "fase hidrolítica", el pH se debería mantener al menos a 8,5 o preferentemente a pH 9,5 durante 1-4 horas. El pH puede descender mientras tiene lugar la hidrólisis de proteínas, por tanto es preferible empezar a un pH de al menos 11,0 de modo que el pH nunca desciende por debajo de pH 8,5 o preferentemente pH 9,5.
Durante esta fase hidrolítica, la temperatura se puede mantener a 60ºC durante un periodo más largo (díganse 3 horas) para reducir el consumo de energía o se puede mantener a 80-85ºC durante un periodo más corto (dígase 1 hora).
Después la mezcla se transporta (por ejemplo mediante un tornillo sin fin (auger)) a un secador 14 de tambor que está provisto de un de flujo de aire en contracorriente mediante un ventilador o soplador 16 calentado por el calentador 15. Preferentemente, es en este punto donde se añaden materiales deshidratantes opcionales (por ejemplo bentonita, zeolita, piedra caliza, grano de cereal molido) al secador para facilitar el proceso de deshidratación.
El alimento para animales normalmente saldrá del secador 14 con aproximadamente 10-11% (p/p) de contenido de humedad. Se ha encontrado que este contenido de humedad decrece a aproximadamente 7-8% (p/p) sobre 24-48 horas después del secado debido a que la hidrólisis de proteínas continúa.
El alimento para animales secado se transporta a un molino 17 de martillo para molerlo a un tamaño de gránulo/polvo deseado y el material alimentario granulado/en polvo se transporta al área 18 de envasado/distribu-
ción.
Cuando el producto se va a usar para alimentación directa, por ejemplo, en alimentación de peces, se puede añadir ácido 19 a la mezcladora 13 (después de que haya tenido lugar la mezcla inicial) o al molino 17 de martillo para reducir el pH del producto final por ejemplo a pH 6,5-7,5.
Cuando el producto se va a mezclar con materiales ácidos tales como grano, la adición de ácido puede no requerirse ya que el producto alcalino puede estar equilibrado mediante la acidez del grano.
El destinatario experto advertirá inmediatamente que el alimento de valor, preferentemente para animales pero que también es adecuado para consumo humano, se puede producir a partir de tejido animal, fundamentalmente sin contaminación por EDT o que tiene una posibilidad reducida mínima de contaminación por EDT, y que el alimento que resulta es adecuado para una amplia gama de usos potenciales, incluyendo el uso como un fertilizante.
Por tanto la invención se puede entender rápidamente y poner en efecto práctico, se remite al experto en la técnica a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Se compró carne picada vacuna del cuarto trasero a un carnicero local y se pesaron 4 alícuotas de 10 g. Se colocaron dos de las alícuotas en vasos de metal, se inocularon con 1 ml de homogenato 263K de cerebro crudo de hámster con tembladera (cHs) y se mezcló bien. A los dos vasos se añadieron 20 ml de una disolución de hidróxido cálcico al 5%, se agitó, se cubrió con papel de aluminio y se colocó en un baño de agua a 60ºC durante doce horas. La disolución se agitó aproximadamente cada 30 minutos durante las 12 horas de incubación.
A la tercera alícuota de carne de 10 g se añadió 1 ml de cHs, se mezcló bien, y después se añadieron 20 ml de disolución de SDS al 1%. Esta mezcla se colocó en una mezcladora de tambor durante 10 minutos. Después la mezcla se hirvió durante 5 minutos, se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto constituye la muestra 287.1A cHs.
Se colocó la última alícuota de 10 g en un vaso de metal, se inoculó con 1 ml de cHs, se mezcló bien y después se colocó en la estufa a 60ºC para secarse con aire. De nuevo, la muestra se mezcló cada 30 minutos aproximadamente. Una vez seca, la carne deshidratada se sacó de la estufa y se molió usando un mortero y una mano de mortero. La carne molida se mezcló con 20 ml de mezcla hirviendo 1x, se colocó en la mezcladora de tambor, se batió durante 12 horas a temperatura ambiente, después se clarificó y se dividió en alícuotas. Esto constituye la muestra 287.1-1 cHs.
Los dos vasos de metal se sacaron del baño de agua a 60ºC después de 12 horas. Uno de los vasos se colocó en la estufa a 60ºC y se secó con aire con agitación intermitente, como anteriormente. El material del segundo vaso se colocó en un tubo de centrífuga y se ajustó el pH a pH 7,5. Se añadieron 22 ml de mezcla hirviendo 1x, se colocó en la mezcladora de tambor y se dejó mezclando durante 12 horas a temperatura ambiente. Después esto se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto constituye la mezcla 287.1-2 cHs.
Después de la deshidratación a 60ºC, la carne hidrolizada se sacó de la estufa y se molió usando un mortero y una mano de mortero. Se añadieron 20 ml de acetato sódico 50 mM a la carne molida y se ajustó el pH a pH 7,5. Se añadieron 22 ml de mezcla hirviendo 2x y el tubo se colocó en la mezcladora de tambor para mezclar durante 12 horas a temperatura ambiente. Después esto se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto constituye la muestra 287.1-3 cHs.
Se volvió a hacer una suspensión con la pella que quedaba de la muestra cHs 287.1-3, y se incubó con 10 ml de tampón de acetato sódico 50 mM (pH 6,0), se colocó en la mezcladora de tambor durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después esto se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto constituye la muestra 287.1-4 cHs.
Después se llevaron a cabo análisis por transferencia Western de las muestras. El análisis por transferencia Western de 263K de hámster con tembladera implica el uso del anticuerpo monoclonal específico, 3F4. 3F4 reconoce tanto la forma celular normal de la proteína priónica, PrP^{c}, como la forma asociada a la enfermedad, PrP^{Sc}. A diferencia de la forma celular normal, PrP^{Sc} es relativamente resistente a proteasa, y por tanto se puede usar digestión de muestras con proteinasa K para diferenciar PrP^{Sc} de PrP^{c}. La digestión de muestras del proceso con proteinasa K también es útil para eliminar proteínas presentes en las muestras del proceso que podrían causar fondo de tinción no específica o de reacción cruzada en el ensayo de transferencia Western.
La fig. 2 muestra una titulación de la cepa de tembladera adaptada a hámster 263K usada en estos estudios (SPO172200). Esto muestra el diseño típico de tinción observado para 263K, usando 3F4. La proteína PrP madura de longitud completa se cree que tiene una proporción molecular aparente (Mr) de \approx33.000 daltons (33K, banda superior de la calle 2). Después de la digestión con proteinasa K, normalmente se observa (véase calle 1) una banda ancha predominante en la región de 28K, una banda ancha más débil \approx23K, y una banda nítida pero débil \approx19K. Obsérvese que en las cepas de 263K Hs, también se pueden detectar estas especies con más bajo Mr (calle 2), presumiblemente debido a las proteasas endógenas presentes en, o durante la preparación de la cepa.
Las calles 4-10 muestran 5 diluciones en serie de la cepa 263K, desde la dilución 1:25 (10^{-1,4}) a 1:390625 (10^{-5,6}), respectivamente. Se puede detectar la especie 28K PrP^{Sc} en las calles 4-7, es decir, hasta una dilución 10^{-3,5}. En exposiciones más prolongadas de esta transferencia (no se muestra), también se detecta la especie 28K a dilución 10^{-4,2}. El punto final, o título, de la cepa se define como la primera dilución a la que ya no se detecta la especie 28K PrP. Por tanto el título de esta cepa es 10^{-4,9}, ó 7,8x10^{4} unidades arbitrarias/ml.
En la fig. 3 se muestra el análisis por transferencia Western de muestras de proceso digeridas con proteinasa K. La cepa 263K Hs SPO172200 digerida con proteinasa K sirve como un testigo interno positivo (calle 1, dilución 10^{-2,1}). La especie 28K PrP se puede ver claramente en las muestras 287.1A y 287.1-1 (calles 3 y 4, respectivamente). También se observa una especie de proteína \approx33K, que sugiere que la digestión con proteinasa K de esta muestras es incompleta. No se observan bandas de proteína en las muestras 287.1-2, 287.1-3 ó 287.1-4 (calles 7-9, respectivamente), lo que sugiere que el proceso de hidrólisis alcalina ha eliminado las proteínas PrP^{Sc}. Ya que no se observan especies PrP^{Sc} para estas muestras, puede entenderse que tienen un punto final, o título, de 10^{0}, ó 1x10^{0} unidades arbitrarias/ml. Obsérvese que no se puede hacer estimación del título para las muestras 287.1A ó 287.1-1.
Para confirmar que las proteínas PrP^{Sc} no se han degradado sencillamente por la etapa de digestión con proteinasa K, se analizaron muestras de proceso sin digerir por transferencia Western (fig. 4). Tanto la cepa 263K Hs SPO172200 sin digerir como la digerida con proteinasa K, sirvieron como testigos internos positivos (calles 1 y 2, respectivamente). De nuevo, en las muestras 287.1A y 287.1-1 (calles 3 y 4, respectivamente), se pueden ver especies de proteína PrP. No son evidentes bandas de proteína en las muestras 287.1-2, 287.1-3 ó 287.1-4 (calles 7-9, respectivamente), confirmando los resultados de la fig. 3.
Ejemplo 2
Se llevaron a cabo pruebas preliminares para investigar la estabilidad del pH después del tratamiento del material de carne.
Se ajustó el pH a 12 en una disolución de hidróxido cálcico al 5% usando ácido clorhídrico. Después se añadieron 20 ml de esta disolución a 10 g de carne magra picada de ternera y la mezcla se mezcló bien. Se midió el pH y después se monitorizó durante aproximadamente 85 minutos durante los que el pH permaneció a 12,0.
De modo similar, se ajustó el pH a 10,5 en hidróxido cálcico al 5% y se mezclaron bien 20 ml con 10 g de carne magra picada de ternera. El pH inicial era 5,4 y se ajustó a pH 10,5 mediante más adición de hidróxido cálcico. Después el pH descendió durante los siguientes 25 minutos a pH 10,3.
Ejemplo 3
Se colocaron dos alícuotas de 10 g de carne picada vacuna del cuarto trasero en vasos de metal individuales y cada alícuota se inoculó con 1 ml de homogenato 263K de cerebro crudo de hámster con tembladera (cHs). Después a cada vaso se añadieron 20 ml de hidróxido cálcico a pH 12,0, las muestras se mezclaron bien y el pH medido para ambas muestras era pH 12,0. Después los vasos se taparon con papel de aluminio y se incubaron a 75ºC durante un total de 3 ó 6 horas (2 ó 5 horas en un baño de agua, respectivamente, con la hora final en una estufa).
Se colocaron cuatro alícuotas de 10 g de carne picada vacuna del cuarto trasero en vasos de metal individuales y cada alícuota se inoculó con 1 ml de homogenato 263K de cerebro crudo de hámster con tembladera (cHs). Después a cada vaso se añadieron 18 ml de hidróxido cálcico a pH 10,5, las muestras se mezclaron bien y el pH de todas las muestras se ajustó a pH 10,5 (con hidróxido cálcico). Después los vasos se taparon con papel de aluminio y se incubaron a 60ºC durante un total de 3 horas, 75ºC durante un total de 3 ó 6 horas o 90ºC durante 3 horas (inicialmente en un baño de agua con la hora final en una estufa).
Todas las muestras se neutralizaron a pH 6,5-7,5 y después se ajustaron a una concentración final de SDS al 1%. Las mezclas se mezclaron en la mezcladora de tambor durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, se hirvieron durante 5 minutos y se clarificaron mediante centrifugación a baja velocidad. Después se recogió la fracción sobrenadante, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70ºC.
En la tabla 1 se resumen los detalles de las muestras.
Las muestras se analizaron por transferencia Western.
Como testigo, una alícuota de 10 g de carne picada vacuna del cuarto trasero se inoculó con 1 ml de 263K cHs, se mezcló bien, y se añadieron 20 ml de SDS al 1%. Esta muestra se mezcló en una mezcladora de tambor durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, se hirvió durante 5 minutos y se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad. Después se recogió la fracción sobrenadante, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70ºC.
La fig. 5 muestra una titulación de la cepa de tembladera 263K adaptada a hámster usada en estos estudios (SPO172200). Esto muestra el diseño típico de la tinción observado para 263K, usando mAb 3F4. La proteína PrP madura de longitud completa se cree que tiene una proporción molecular aparente (Mr) de \approx33.000 daltons (33K, banda superior de la calle 2). Después de la digestión con proteinasa K, normalmente se observa (véase calle 1) una banda ancha predominante en la región de 28K, una banda ancha más débil \approx23K, y una banda nítida pero débil \approx19K. Obsérvese que en las cepas 263K Hs, también se pueden detectar estas especies con más bajo Mr (calle 2), presumiblemente debido a las proteasas endógenas presentes en, o durante la preparación de la cepa.
Se hicieron pruebas en las muestras procesadas sólo a dilución pura, o bien sin digestión o después de digestión con proteinasa K a una concentración final de 10 \mug/ml (basado en resultados previos). En las figuras 6 y 7 se muestran los resultados.
La cepa 263K cHs digerida con proteinasa K SPO172200 sirvió como testigo positivo interno (calle 1 de la fig. 6). Las especies 28K PrP se pueden ver claramente en la muestra 309.1A (ambas con y sin digestión con proteinasa K; véase la calle 3 de las figuras 6 y 7). Se observa un número de especies de proteína adicionales en la muestra sin digerir. La especie 33K PrP aún es visible después de la digestión con proteinasa K (calle 3 de la fig. 6) lo que indica que la digestión con proteinasa K fue incompleta.
No se observaron bandas de proteína en ninguna de las muestras tratadas con hidróxido cálcico y calor (calles 5-10), tanto con como sin digestión con proteinasa K, incluso con exposiciones más largas de la transferencia Western (hasta 30 minutos). Así, todos los sistemas probados en este estudio tratados con hidróxido cálcico y calor eliminaron las proteínas PrP^{Sc}. Ya que no se observaron especies de PrP^{Sc} para estas muestras, puede entenderse que tienen un título de punto final de 10^{0} ó 1x10^{0} unidades arbitrarias por ml. Obsérvese que no se puede hacer estimación del título para la muestra 309.1A.
El nivel de proteínas PrP presentes en las muestras procesadas no se cuantificó por titulación en el ensayo de transferencia Western. Sin embargo, aunque no se pudo detectar PrP en ninguna de las muestras tratadas con hidróxido cálcico o calor, se puede hacer una estimación de la eliminación en comparación con la 236K inoculado estimado.
El factor de eliminación log_{10} es la proporción entre la cantidad total de 263K inoculado en el material inicial de carne y la cantidad total de 263K recuperada de la muestra final tratada, expresado como un valor de log_{10}:
Eliminación = \frac{\text{título de la cepa x volumen del inóculo}}{\text{título de la muestra x volumen de la muestra}}
Para todas las muestras tratadas se logró un factor de eliminación \geq 3,4 log. Estos cálculos se resumen en la tabla 2.
Como conclusión, se inoculó 263K Hs en muestras de carne picada de ternera y el efecto del tratamiento con hidróxido cálcico y calor, según la presente invención, se midió en términos de eliminación de proteína PrP^{Sc}. Los resultados positivos que se informan en esta memoria sugieren que el método de la invención es un buen procedimiento para la eliminación o inactivación de EDT en muestras de carne usadas en la producción de alimento para animales.
El experto en la técnica comprenderá que la presente invención no está limitada a las realizaciones aquí descritas en detalle, y que se pueden tener en cuenta una diversidad de otras realizaciones que, no obstante, concuerdan con el amplio espíritu y el ámbito de la invención.
Toda la bibliografía científica y de patentes a que se hace referencia en esta memoria descriptiva está incorporada aquí como referencia.
TABLA 1
Muestra Descripción PH
309.1A Carne magra de ternera inoculada con 263K cHs (testigo) 6,5
309.1-1.3 Muestra tratada a pH 10,5, 75ºC, durante 3 horas 8,8
309.1-1.6 Muestra tratada a pH 10,5, 75ºC, durante 6 horas 8,8
309.1-2.3 Muestra tratada a pH 10,5, 60ºC, durante 3 horas n.d.
309.1-3.3 Muestra tratada a pH 10,5, 90ºC, durante 3 horas 8,2
309.1-4.3 Muestra tratada a pH 12,0, 75ºC, durante 3 horas 11,6
309.1-4.6 Muestra tratada a pH 12,0, 75ºC, durante 6 horas 11,5
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
Muestra Título (u.a. por ml) Volumen (ml) Total (u.a. por ml) Eliminación (log_{10})
Inóculo 7,8x10^{4} 1 7,8x10^{4} -
309.1-1.3 cHs 1x10^{0} 30 3,0x10^{1} \geq3,41
309.1-1.6 cHs 1x10^{0} 25 2,5x10^{1} \geq3,49
309.1-2.3 cHs 1x10^{0} 30 3,0x10^{1} \geq3,41
309.1-3.3 cHs 1x10^{0} 26 2,6x10^{1} \geq3,48
309.1-4.3 cHs 1x10^{0} 20 2,0x10^{1} \geq3,59
309.1-4.6 cHs 1x10^{0} 15 1,5x10^{1} \geq3,72

Claims (12)

1. Un método para fabricar un alimento para animales que incluye las etapas de:
(i) añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8,5;
(ii) calentar el material de la etapa (i) a una temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las proteínas presentes en el material animal; y
(iii) deshidratar el material producido en la etapa (ii);
en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es 1-4 horas.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que el material animal de la etapa (i) es material animal contaminado por EDT donde el alimento para animales que resulta de dicho método es alimento para animales descontaminado de EDT.
3. Un método para producir material animal descontaminado de EDT que incluye las etapas de:
(i) añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8,5;
(ii) calentar el material de la etapa (i) a una temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las proteínas presentes en el material animal;
en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es 1-4 horas.
4. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el pH es al menos 9,5.
5. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el pH es de 10,5 a 13.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que el pH es de 11,0 a 11,5.
7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura es de 60ºC a 90ºC.
8. Un método según la reivindicación 7, en el que la temperatura es 60ºC.
9. Un método según la reivindicación 7, en el que la temperatura es de 80ºC a 85ºC.
10. Un método según la reivindicación 9, en el que la duración es de 1 a 2 horas.
11. Un método según la reivindicación 8, en el que la duración es 3 horas.
12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se lleva a cabo a presión atmosférica.
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