ES2253437T3 - Descontaminacion de alimento para animales que contiene priones (p.ej.un agente de eeb). - Google Patents
Descontaminacion de alimento para animales que contiene priones (p.ej.un agente de eeb).Info
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Abstract
Un método para fabricar un alimento para animales que incluye las etapas de: (i) añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8, 5; (ii)calentar el material de la etapa (i) a una temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las proteínas presentes en el material animal; y (iii) deshidratar el material producido en la etapa (ii); en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es 1-4 horas.
Description
Descontaminación de alimento para animales que
contiene priones (p. ej. un agente de EEB).
Esta invención se refiere a un método para
producir un alimento para animales. Más particularmente, esta
invención se refiere a un método para producir un alimento para
animales a partir de subproductos animales donde el tratamiento con
álcali y calor elimina o reduce encefalopatías degenerativas
transmisibles tales como encefalopatía espongiforme bovina,
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y tembladera de las
ovejas (encefalopatía espongiforme ovina).
Las encefalopatías degenerativas transmisibles
(EDT) incluyen encefalopatía espongiforme bovina (EEB o
"enfermedad de las vacas locas"), tembladera de las ovejas,
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ), síndrome de
Gerstmann-Straussler-Scheinker
(GSS) y kuru en humanos. Estas enfermedades se han hecho tristemente
célebres en los últimos años debido, al menos en parte, a la
percepción de que las autoridades no vigilaron suficientemente la
incorporación de carne de ternera contaminada por EEB en
suministros de alimentos para humanos y animales, lo que condujo a
brotes de ECJ, principalmente en Reino Unido (véase Editorial en
Nature, 1997, 389 423).
Ahora está demostrado que el agente responsable
de la transmisión de EDT es una proteína, generalmente llamada una
proteína "priónica", que es responsable tanto de EEB como de
ECJ (Hill et al., Nature 1997, 389 448).
Generalmente, se ha llegado a la conclusión de
que la destrucción de EDT en carne requiere tratamiento a 132ºC
durante 20 minutos bajo 3 bares de presión. Alternativamente, en
presencia de álcali se puede reducir la temperatura y la presión a
121ºC y 2 bares respectivamente.
El álcali es conocido por su efecto hidrolítico
sobre biomoléculas tales como proteínas, y los intentos para
esterilizar tejido animal contaminado con EDT han usado tratamiento
con álcali, calor y presión como medio para destruir la patogénesis
del prión.
Por ejemplo, Taguchi et al., 1991, Arch.
Virol. 119 297, usaron un tratamiento de 1 hora con NaOH 1 N seguido
de tratamiento en autoclave a 121ºC durante 30 minutos para
inactivar homogenatos de cerebro infectado con ECJ. Ernst &
Race, 1993, J. Virol. Methods 41 193, emplearon tratamiento
en autoclave junto con tratamiento con NaOH y LpH para inactivar
homogenatos de cerebros infectados con tembladera.
Taylor et al., 1994, Arch. Virol.
139 131, llevaron a cabo una serie de pruebas más amplias
para descontaminar muestras de cerebro bovino infectado de EEB o de
cerebro de roedor infectado de tembladera. Los tratamientos
incluían NaOH 1 M ó 2 M durante hasta 1 hora, tratamiento en
autoclave a temperaturas entre 134ºC y 138ºC durante hasta 1 hora o
tratamiento con hipoclorito sódico o dicloroisocianurato sódico
durante hasta 2 horas. Estos autores llegaron a la conclusión de
que ninguno de los procedimientos probados producían inactivación
completa de EDT.
La patente de Estados Unidos 5.780.288 describe
un método para destruir la actividad infecciosa de vectores de
infección en una mezcla de proteínas sin destruir la estructura
primaria de la proteína.
El problema de fabricar un alimento para animales
a partir de tejido animal potencialmente infectado con EDT es que
las condiciones de alta temperatura y presión no se alcanzan
fácilmente usando las instalaciones típicas de aprovechamiento de
grasas animales o de recirculación de residuos animales. También,
los tratamientos a alta temperatura durante la fabricación de
alimento para animales tienden a producir un alimento inferior que
tiene subproductos indeseables tales como carcinógenos,
di-aminoácidos y olores volátiles.
Por tanto es un objeto de la invención
proporcionar un método para fabricar alimento para animales donde la
posibilidad de contaminación con EDT está al menos reducida, si no
eliminada.
En un aspecto, la presente invención radica en un
método para fabricar un alimento para animales que incluye las
etapas de:
- (i)
- añadir álcali a material animal para mantener un pH de al menos 8,5;
- (ii)
- calentar el material de la etapa (i) a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 99ºC; y
- (iii)
- deshidratar el material producido en la etapa (ii).
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En otro aspecto la presente invención radica en
un método para fabricar un alimento para animales descontaminado de
EDT que incluye las etapas de:
- (i)
- añadir álcali a material animal contaminado por EDT para mantener un pH de al menos 8,5;
- (ii)
- calentar el material de la etapa (i) a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 99ºC; y
- (iii)
- deshidratar el material producido en la etapa (ii).
Adecuadamente, el método de la invención se lleva
a cabo a aproximadamente presión atmosférica.
Preferentemente, se añade álcali suficiente para
mantener un pH de al menos 9,5.
Más preferentemente, se añade álcali suficiente
para mantener un pH en el intervalo de 10,5 a 13,0.
Incluso más preferentemente, se añade álcali
suficiente para mantener un pH en el intervalo
11,0-11,5.
Preferentemente, el álcali es hidróxido cálcico
tal como en la forma de cal hidratada.
Preferentemente, el material de la etapa (ii) se
caliente a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 90ºC.
En una realización particular, la temperatura es
aproximadamente 60ºC.
En otra realización particular, la temperatura es
80ºC-85ºC.
La duración de las etapas (i) y (ii), llamadas la
"fase hidrolítica", es preferentemente de 1 a 4 horas o
más preferentemente de 1 a 2 horas.
Después de esta fase hidrolítica, el material
animal tratado se puede almacenar antes de la deshidratación o
inmediatamente deshidratado.
En relación con la deshidratación, es preferente
que el contenido de humedad del alimento para animales no sea mayor
que 10-15% en peso. Típicamente, con el tiempo el
nivel de humedad puede caer a aproximadamente 7-8%
en peso que es óptimo para el alimento para animales.
La invención también proporciona un método para
producir un material animal descontaminado de EDT según las etapas
(i) y (ii) del segundo aspecto mencionado de la invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos
que se indique otra cosa, "comprenden", "comprende" y
"que comprende" se usan de modo inclusivo más que exclusivo,
de modo que un entero o grupo de enteros señalados puede incluir
uno o más de otros enteros o grupos de enteros no señalados.
Tabla 1: pH final de muestras variadas de carne
tratada.
Tabla 2: resumen de velocidades de aclaración de
proteínas priónicas de muestras de carne inoculadas con EDT después
del tratamiento con álcali y calor.
Fig 1: ejemplo de un aparato para producir un
alimento para animales.
Fig 2: titulación de la cepa 263K SP0172200.
Calle 1: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle
2: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 3: marcadores arco
iris de bajo peso molecular. Calles 4-10: 5
diluciones en serie de la cepa 263K digerida con proteinasa K, de la
dilución 10^{-1,4} a 10^{-5,6} respectivamente.
Fig 3: análisis de muestras de procesos después
de la digestión con proteinasa K. Calle 1: cepa 263K Hs digerida con
proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 2: marcadores arco iris de bajo
peso molecular. Calle 3: cepa 287.1A digerida con proteinasa k.
Calle 4: cepa 287.1-1 digerida con proteinasa K.
Calle 5: mezcla hirviendo 1x. Calle 6: mezcla hirviendo 1x. Calle 7:
cepa 287.1-2 digerida con proteinasa K. Calle 8:
cepa 287.1-3 digerida con proteinasa K. Calle 9:
cepa 387.1-4 digerida con proteinasa K. Calle 10:
mezcla hirviendo 1x.
Fig 4: análisis de muestras de proceso sin
digerir. Calle 1: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 2:
cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle 3: cepa
287.1A sin digerir. Calle 4: cepa 287.1-1 sin
digerir. Calle 5: marcadores arco iris de bajo peso molecular. Calle
6: mezcla hirviendo 1x. Calle 7: cepa 287.1-2 sin
digerir. Calle 8: cepa 287.1-3 sin digerir. Calle 9:
cepa 287.1-4. Calle 10: mezcla hirviendo 1x.
\newpage
Fig 5: titulación de la cepa 263K SP0172200.
Calle 1: cepa 263K Hs digerida con proteinasa K, 10^{-2,1}. Calle
2: cepa 263K Hs sin digerir, 10^{-2,1}. Calle 3: marcadores arco
iris de bajo peso molecular. Calles 4-10: 5
diluciones en serie de la cepa 263K digerida con proteinasa K, de la
dilución 10^{-1,4} a 10^{-5,6} respectivamente.
Fig 6: análisis por transferencia Western de
muestras digeridas con proteinasa K. Calle 1: testigo positivo a
dilución 10^{-2,8}. Calle 2: marcadores de peso molecular. Calle
3: muestra de cepa 309.1A. Calle 4: blanco. Calles
5-10: muestras de cepas 309.1-1.3,
309.1-1.6, 309.1-2.3,
309.1-3.3, 309.1-4.3 y
309.1-4.3, respectivamente.
Fig 7: análisis por transferencia Western de
muestras sin digerir con proteinasa K. Calle 1: testigo positivo a
dilución 10^{-2,8}. Calle 2: marcadores de peso molecular. Calle
3: muestra de cepa 309.1A. Calle 4: blanco. Calles
5-10: muestras de cepas 309.1-1.3,
309.1-1.6, 309.1-2.3,
309.1-3.3, 309.1-4.3 y
309.1-4.3, respectivamente.
La presente invención surge del descubrimiento
inesperado de solicitante de que material animal tratado con álcali
sometido a tratamiento suave con calor a presión atmosférica
destruirá eficazmente EDT. El minimizar el tratamiento con calor
guarda relación con el hecho de que el alimento para animales debe
ser altamente digestible, particularmente con respecto al contenido
de proteína, así como estar libre de EDT. Además, el calor excesivo
generará productos indeseados tales como aminoácidos reticulados,
racemización de aminoácidos L a sus isómeros D y formación de
mutágenos tal como 2-amino
3,8-dietil-imidazol[4,5f]quinolina.
También, es importante que tenga lugar mínima volatilización
durante la fabricación, ya que se minimiza la producción de olor
nocivo. Con estos fines, la presente invención minimiza el
tratamiento con calor durante la fabricación a presión atmosférica
mientras que utiliza las etapas de tratamiento con álcali y
deshidratación para esterilizar eficazmente el alimento para
animales en lo que respecta a EDT. Las condiciones de fabricación
que proporciona la presente invención resultan fáciles de lograr
con el potencial de muchas instalaciones comerciales normales de
fabricación de alimento para animales, o se pueden utilizar con tan
sólo pequeñas modificaciones de tales instalaciones.
Los materiales animales que se pueden usar
incluyen, por ejemplo, residuos y despojos animales de trabajos de
sacrificio; animales domésticos de poco valor comercial tales como
ovejas o ganado desechado por la edad o afectado por la sequía, o
reducción del rebaño de ovejas; residuos o desechos de canales de
animales salvajes o sus partes; despojos de aves de corral o aves
de corral desechadas por la edad; despojos de pescado o cangrejos o
especies no aprovechables de las capturas.
El material animal preferentemente se mezcla en
bruto con un material deshidratante seco que es capaz de absorber
humedad (o químicamente o físicamente) del material animal,
reduciendo el porcentaje del contenido de agua en el material para
dar un producto seco estable.
Los materiales deshidratantes incluyen al menos
uno o más de las combinaciones de:
bentonitas, zeolitas, caolines u otras arcillas
en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
óxido cálcico, óxido magnésico u óxido alumínico
en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
diatomita u otras tierras de diatomeas en una
proporción que no exceda de 35% (p/p);
yeso, dolomita, piedra caliza, bicarbonato sódico
o sal en una proporción que no exceda de 35% (p/p);
fosfatos cálcicos y/o ácido fosfórico en una
proporción que no exceda de 35% (p/p);
sulfato ferroso y/o sulfato férrico en una
proporción que no exceda de 35% (p/p);
granos, almidones y materiales gelatinosos y
subproductos de granos (por ejemplo, endospermo, salvado, cáscaras
y similares) incluyendo formas extruidas en una proporción que no
exceda de 80% (p/p);
granos proteicos y granos de semillas oleaginosas
y sus subproductos incluyendo formas procesadas y extruidas de
harinas proteicas en una proporción que no exceda de 80% (p/p);
productos vegetales y subproductos tales como
harina de copra y harina de grano de palma, bagazo y heno y paja
picado en una proporción que no exceda de 75% (p/p); y
subproductos animales tales como harinas de
carne, harinas de hueso y harinas de sangre y materiales gelatinosos
en una proporción que no exceda de 75% (p/p).
Los materiales deshidratantes preferentes que se
pueden usar son variados y dependerán de diversos factores que
incluyen:
1. La proximidad y coste del material
deshidratante a la instalación de deshidratación.
2. La velocidad a la que se necesita llevar a
cabo la deshidratación.
3. El uso que se busca para el producto seco que
resulta.
La deshidratación se realiza preferentemente en
un secador rotatorio.
El álcali usado en la etapa (i) puede incluir
óxidos, hidróxidos y sales de los elementos metálicos. Ejemplos
incluyen óxido cálcico, hidróxido cálcico, hidróxido sódico,
carbonato sódico, sulfito sódico, hidróxido potásico, carbonato
potásico, hidróxido magnésico, carbonato magnésico, sulfato
magnésico o cualquier combinación de dos o más.
Preferentemente, el álcali está en la forma de
hidróxido cálcico (cal hidratada).
La concentración de álcali usado en la etapa (i)
dependerá del pH deseado, del álcali usado en particular y de la
capacidad de tamponamiento del material animal y otros usados
durante la fabricación.
Por ejemplo, una proporción típica es 25 kg de
cal hidratada por 1.200 kg de material animal húmedo.
Dependiendo del material con el que se va a
mezclar el producto, el nivel de pH se puede ajustar mediante la
adición de ácido.
Durante la fabricación, se pueden añadir
materiales adicionales opcionales que mejorarán el valor nutricional
o económico del producto final. Tales materiales adicionales pueden
incluir (aunque no están limitados), por ejemplo, modificadores de
rumen tales como monensina o avoparcina, cultivos de enzimas o
bacterias; vitaminas o minerales adicionales; fuentes de nitrógeno
no proteico tal como urea; antioxidantes, estabilizantes,
antibióticos, inhibidores de moho, conservantes (incluyendo sal) y
similares; modificadores de proteínas y lípidos para alterar su
digestibilidad en el rumen; mejoradores de palatabilidad tales como
melazas y subproductos de la fermentación de melazas.
Preferentemente, después del secado, el alimento
para animales se deja reposar durante 24 horas antes de alimentar
directamente al ganado (tanto a rumiantes como a monogástricos) en
forma granular o en bloque o como un polvo molido fino.
El alimento para animales se puede mezclar con
suplementos alimenticios, oligoelementos, harinas proteicas,
proteína de cereal y granos de oleaginosas, melazas o subproductos
de la fermentación de melazas, heno o similar en cualquier
combinación para alimentación de ganado (tanto rumiantes como
monogástricos); se puede usar como un alimento para mascotas, bien
tal como se produce o mezclado con otros materiales; y/o se puede
usar directamente o como un ingrediente en alimentos para consumo
humano. Generalmente el material secado se mezclará en un máximo de
10-15% (p/p) del producto final.
Algunos ejemplos de alimento fabricado para
animales son:
1. Se mezclan fracciones desgrasadas de sólidos
de matadero (típicamente <10% de grasa sobre materia seca) más
agua de cola de pescado con hidróxido cálcico para dar el pH de 11
requerido (aproximadamente 1:30 p/p sobre materia seca) y se deja
reposar en una tolva de alimentación durante 1 hora. Después el
producto se seca a 80ºC en un secador rotatorio a lo largo de 1
hora para dar un producto resultante con <10% de humedad libre
que después se muele para dar una harina fina.
2. Se mezclan fracciones desgrasadas de sólidos
de matadero (típicamente <10% de grasa sobre materia seca) con
hidróxido cálcico para dar el pH de 10 requerido (aproximadamente
1:50 sobre materia seca) y se deja reposar en una tolva de
alimentación durante 30 minutos y después se seca en un secador
rotativo con entrada de algo de calor solar a lo largo de 3 horas a
60ºC para dar un producto resultante con <10% de humedad.
Después este producto se muele para dar una harina fina.
3. Se mezcla material de residuo de pescado
crudo con álcali que consiste en 80% de hidróxido cálcico y 20% de
hidróxido sódico hasta un pH de 10,5 (aproximadamente 1:40 sobre
materia seca) y se seca en un secador rotativo a 70ºC a lo largo de
4 horas para dar un producto resultante con <11% de humedad que
después se muele para dar una harina fina.
Aunque aún no se ha detectado ninguna infección
de EDT en animales domésticos distintos de rumiantes (por ejemplo
peces y aves de corral), en algunos países hay prohibiciones en la
alimentación con harinas proteicas de origen animal en general. Por
ejemplo, en Australia y EEUU hay una prohibición en la alimentación
de animales rumiantes con cualquier harina proteica de origen
animal. En muchos países europeos, hay una prohibición total en la
alimentación de todas las especies animales con cualquier harina
proteica de origen animal. Estas prohibiciones existen por el temor
a que finalmente se detecte infección de EDT en animales distintos a
rumiantes.
También se considerará que el alimento para
animales se puede usar como un fertilizante descontaminado de
EDT.
EDT.
Para permitir que la invención se entienda
completamente, ahora se describirán realizaciones preferentes con
referencia al dibujo que acompaña (fig. 1) que es un diagrama
esquemático del aparato empleado en el método de la presente
invención.
En relación con el método de la presente
invención, se mezcla el material deshidratante con el material
animal de partida y después se calienta y se seca. Es normal mezclar
todos los materiales al comienzo pero no es imprescindible, ya que
se puede introducir cualquier ingrediente en cualquier momento
durante el proceso. Una vez mezclado, el material se seca. Se puede
usar cualquier sistema de secado por calor pero normalmente lo más
práctico es usar un sistema normal de corriente de aire
caliente.
Con referencia a la fig. 1, los residuos 10
animales (por ejemplo canales de ganado) se hacen pasar a través de
una picadora o trituradora 11 antes de que se añada el álcali 12
(preferentemente hidróxido cálcico) y se mezcle en la mezcladora
13.
Después de picar y antes de añadir el álcali 12,
se puede calentar el residuo 10 animal para licuar el componente de
sebo. Después el residuo animal calentado se decanta o se prensa
para crear una fracción sólida y otra líquida. La fracción líquida
se acidifica y se separa en una fracción de sebo, otros líquidos
(mayoritariamente agua) y sólidos residuales (referidos como
"agua de cola de pescado"). Esta agua de cola de pescado se
puede procesar por separado o en combinación con la fracción sólida
para el tratamiento con álcali y con calor.
En este ejemplo, la adición de álcali 12
(preferentemente hidróxido cálcico) eleva el pH de la mezcla a
aproximadamente pH 11,0-11,5. Durante esta
"fase hidrolítica", el pH se debería mantener al menos a
8,5 o preferentemente a pH 9,5 durante 1-4 horas.
El pH puede descender mientras tiene lugar la hidrólisis de
proteínas, por tanto es preferible empezar a un pH de al menos 11,0
de modo que el pH nunca desciende por debajo de pH 8,5 o
preferentemente pH 9,5.
Durante esta fase hidrolítica, la temperatura se
puede mantener a 60ºC durante un periodo más largo (díganse 3
horas) para reducir el consumo de energía o se puede mantener a
80-85ºC durante un periodo más corto (dígase 1
hora).
Después la mezcla se transporta (por ejemplo
mediante un tornillo sin fin (auger)) a un secador 14 de tambor que
está provisto de un de flujo de aire en contracorriente mediante un
ventilador o soplador 16 calentado por el calentador 15.
Preferentemente, es en este punto donde se añaden materiales
deshidratantes opcionales (por ejemplo bentonita, zeolita, piedra
caliza, grano de cereal molido) al secador para facilitar el proceso
de deshidratación.
El alimento para animales normalmente saldrá del
secador 14 con aproximadamente 10-11% (p/p) de
contenido de humedad. Se ha encontrado que este contenido de
humedad decrece a aproximadamente 7-8% (p/p) sobre
24-48 horas después del secado debido a que la
hidrólisis de proteínas continúa.
El alimento para animales secado se transporta a
un molino 17 de martillo para molerlo a un tamaño de gránulo/polvo
deseado y el material alimentario granulado/en polvo se transporta
al área 18 de envasado/distribu-
ción.
ción.
Cuando el producto se va a usar para alimentación
directa, por ejemplo, en alimentación de peces, se puede añadir
ácido 19 a la mezcladora 13 (después de que haya tenido lugar la
mezcla inicial) o al molino 17 de martillo para reducir el pH del
producto final por ejemplo a pH 6,5-7,5.
Cuando el producto se va a mezclar con materiales
ácidos tales como grano, la adición de ácido puede no requerirse ya
que el producto alcalino puede estar equilibrado mediante la acidez
del grano.
El destinatario experto advertirá inmediatamente
que el alimento de valor, preferentemente para animales pero que
también es adecuado para consumo humano, se puede producir a partir
de tejido animal, fundamentalmente sin contaminación por EDT o que
tiene una posibilidad reducida mínima de contaminación por EDT, y
que el alimento que resulta es adecuado para una amplia gama de usos
potenciales, incluyendo el uso como un fertilizante.
Por tanto la invención se puede entender
rápidamente y poner en efecto práctico, se remite al experto en la
técnica a los siguientes ejemplos.
Se compró carne picada vacuna del cuarto trasero
a un carnicero local y se pesaron 4 alícuotas de 10 g. Se colocaron
dos de las alícuotas en vasos de metal, se inocularon con 1 ml de
homogenato 263K de cerebro crudo de hámster con tembladera (cHs) y
se mezcló bien. A los dos vasos se añadieron 20 ml de una disolución
de hidróxido cálcico al 5%, se agitó, se cubrió con papel de
aluminio y se colocó en un baño de agua a 60ºC durante doce horas.
La disolución se agitó aproximadamente cada 30 minutos durante las
12 horas de incubación.
A la tercera alícuota de carne de 10 g se añadió
1 ml de cHs, se mezcló bien, y después se añadieron 20 ml de
disolución de SDS al 1%. Esta mezcla se colocó en una mezcladora de
tambor durante 10 minutos. Después la mezcla se hirvió durante 5
minutos, se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC.
Esto constituye la muestra 287.1A cHs.
Se colocó la última alícuota de 10 g en un vaso
de metal, se inoculó con 1 ml de cHs, se mezcló bien y después se
colocó en la estufa a 60ºC para secarse con aire. De nuevo, la
muestra se mezcló cada 30 minutos aproximadamente. Una vez seca, la
carne deshidratada se sacó de la estufa y se molió usando un mortero
y una mano de mortero. La carne molida se mezcló con 20 ml de
mezcla hirviendo 1x, se colocó en la mezcladora de tambor, se batió
durante 12 horas a temperatura ambiente, después se clarificó y se
dividió en alícuotas. Esto constituye la muestra
287.1-1 cHs.
Los dos vasos de metal se sacaron del baño de
agua a 60ºC después de 12 horas. Uno de los vasos se colocó en la
estufa a 60ºC y se secó con aire con agitación intermitente, como
anteriormente. El material del segundo vaso se colocó en un tubo de
centrífuga y se ajustó el pH a pH 7,5. Se añadieron 22 ml de mezcla
hirviendo 1x, se colocó en la mezcladora de tambor y se dejó
mezclando durante 12 horas a temperatura ambiente. Después esto se
clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto
constituye la mezcla 287.1-2 cHs.
Después de la deshidratación a 60ºC, la carne
hidrolizada se sacó de la estufa y se molió usando un mortero y una
mano de mortero. Se añadieron 20 ml de acetato sódico 50 mM a la
carne molida y se ajustó el pH a pH 7,5. Se añadieron 22 ml de
mezcla hirviendo 2x y el tubo se colocó en la mezcladora de tambor
para mezclar durante 12 horas a temperatura ambiente. Después esto
se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC. Esto
constituye la muestra 287.1-3 cHs.
Se volvió a hacer una suspensión con la pella que
quedaba de la muestra cHs 287.1-3, y se incubó con
10 ml de tampón de acetato sódico 50 mM (pH 6,0), se colocó en la
mezcladora de tambor durante 60 minutos a temperatura ambiente.
Después esto se clarificó, se dividió en alícuotas y se congeló a
-80ºC. Esto constituye la muestra 287.1-4 cHs.
Después se llevaron a cabo análisis por
transferencia Western de las muestras. El análisis por
transferencia Western de 263K de hámster con tembladera implica el
uso del anticuerpo monoclonal específico, 3F4. 3F4 reconoce tanto
la forma celular normal de la proteína priónica, PrP^{c}, como la
forma asociada a la enfermedad, PrP^{Sc}. A diferencia de la
forma celular normal, PrP^{Sc} es relativamente resistente a
proteasa, y por tanto se puede usar digestión de muestras con
proteinasa K para diferenciar PrP^{Sc} de PrP^{c}. La digestión
de muestras del proceso con proteinasa K también es útil para
eliminar proteínas presentes en las muestras del proceso que
podrían causar fondo de tinción no específica o de reacción cruzada
en el ensayo de transferencia Western.
La fig. 2 muestra una titulación de la cepa de
tembladera adaptada a hámster 263K usada en estos estudios
(SPO172200). Esto muestra el diseño típico de tinción observado para
263K, usando 3F4. La proteína PrP madura de longitud completa se
cree que tiene una proporción molecular aparente (Mr) de
\approx33.000 daltons (33K, banda superior de la calle 2).
Después de la digestión con proteinasa K, normalmente se observa
(véase calle 1) una banda ancha predominante en la región de 28K,
una banda ancha más débil \approx23K, y una banda nítida pero
débil \approx19K. Obsérvese que en las cepas de 263K Hs, también
se pueden detectar estas especies con más bajo Mr (calle 2),
presumiblemente debido a las proteasas endógenas presentes en, o
durante la preparación de la cepa.
Las calles 4-10 muestran 5
diluciones en serie de la cepa 263K, desde la dilución 1:25
(10^{-1,4}) a 1:390625 (10^{-5,6}), respectivamente. Se puede
detectar la especie 28K PrP^{Sc} en las calles
4-7, es decir, hasta una dilución 10^{-3,5}. En
exposiciones más prolongadas de esta transferencia (no se muestra),
también se detecta la especie 28K a dilución 10^{-4,2}. El punto
final, o título, de la cepa se define como la primera dilución a la
que ya no se detecta la especie 28K PrP. Por tanto el título de esta
cepa es 10^{-4,9}, ó 7,8x10^{4} unidades arbitrarias/ml.
En la fig. 3 se muestra el análisis por
transferencia Western de muestras de proceso digeridas con
proteinasa K. La cepa 263K Hs SPO172200 digerida con proteinasa K
sirve como un testigo interno positivo (calle 1, dilución
10^{-2,1}). La especie 28K PrP se puede ver claramente en las
muestras 287.1A y 287.1-1 (calles 3 y 4,
respectivamente). También se observa una especie de proteína
\approx33K, que sugiere que la digestión con proteinasa K de esta
muestras es incompleta. No se observan bandas de proteína en las
muestras 287.1-2, 287.1-3 ó
287.1-4 (calles 7-9,
respectivamente), lo que sugiere que el proceso de hidrólisis
alcalina ha eliminado las proteínas PrP^{Sc}. Ya que no se
observan especies PrP^{Sc} para estas muestras, puede entenderse
que tienen un punto final, o título, de 10^{0}, ó 1x10^{0}
unidades arbitrarias/ml. Obsérvese que no se puede hacer estimación
del título para las muestras 287.1A ó 287.1-1.
Para confirmar que las proteínas PrP^{Sc} no se
han degradado sencillamente por la etapa de digestión con
proteinasa K, se analizaron muestras de proceso sin digerir por
transferencia Western (fig. 4). Tanto la cepa 263K Hs SPO172200 sin
digerir como la digerida con proteinasa K, sirvieron como testigos
internos positivos (calles 1 y 2, respectivamente). De nuevo, en
las muestras 287.1A y 287.1-1 (calles 3 y 4,
respectivamente), se pueden ver especies de proteína PrP. No son
evidentes bandas de proteína en las muestras
287.1-2, 287.1-3 ó
287.1-4 (calles 7-9,
respectivamente), confirmando los resultados de la fig. 3.
Se llevaron a cabo pruebas preliminares para
investigar la estabilidad del pH después del tratamiento del
material de carne.
Se ajustó el pH a 12 en una disolución de
hidróxido cálcico al 5% usando ácido clorhídrico. Después se
añadieron 20 ml de esta disolución a 10 g de carne magra picada de
ternera y la mezcla se mezcló bien. Se midió el pH y después se
monitorizó durante aproximadamente 85 minutos durante los que el pH
permaneció a 12,0.
De modo similar, se ajustó el pH a 10,5 en
hidróxido cálcico al 5% y se mezclaron bien 20 ml con 10 g de carne
magra picada de ternera. El pH inicial era 5,4 y se ajustó a pH 10,5
mediante más adición de hidróxido cálcico. Después el pH descendió
durante los siguientes 25 minutos a pH 10,3.
Se colocaron dos alícuotas de 10 g de carne
picada vacuna del cuarto trasero en vasos de metal individuales y
cada alícuota se inoculó con 1 ml de homogenato 263K de cerebro
crudo de hámster con tembladera (cHs). Después a cada vaso se
añadieron 20 ml de hidróxido cálcico a pH 12,0, las muestras se
mezclaron bien y el pH medido para ambas muestras era pH 12,0.
Después los vasos se taparon con papel de aluminio y se incubaron a
75ºC durante un total de 3 ó 6 horas (2 ó 5 horas en un baño de
agua, respectivamente, con la hora final en una estufa).
Se colocaron cuatro alícuotas de 10 g de carne
picada vacuna del cuarto trasero en vasos de metal individuales y
cada alícuota se inoculó con 1 ml de homogenato 263K de cerebro
crudo de hámster con tembladera (cHs). Después a cada vaso se
añadieron 18 ml de hidróxido cálcico a pH 10,5, las muestras se
mezclaron bien y el pH de todas las muestras se ajustó a pH 10,5
(con hidróxido cálcico). Después los vasos se taparon con papel de
aluminio y se incubaron a 60ºC durante un total de 3 horas, 75ºC
durante un total de 3 ó 6 horas o 90ºC durante 3 horas
(inicialmente en un baño de agua con la hora final en una
estufa).
Todas las muestras se neutralizaron a pH
6,5-7,5 y después se ajustaron a una concentración
final de SDS al 1%. Las mezclas se mezclaron en la mezcladora de
tambor durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente,
se hirvieron durante 5 minutos y se clarificaron mediante
centrifugación a baja velocidad. Después se recogió la fracción
sobrenadante, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70ºC.
En la tabla 1 se resumen los detalles de las
muestras.
Las muestras se analizaron por transferencia
Western.
Como testigo, una alícuota de 10 g de carne
picada vacuna del cuarto trasero se inoculó con 1 ml de 263K cHs,
se mezcló bien, y se añadieron 20 ml de SDS al 1%. Esta muestra se
mezcló en una mezcladora de tambor durante aproximadamente 10
minutos a temperatura ambiente, se hirvió durante 5 minutos y se
clarificó mediante centrifugación a baja velocidad. Después se
recogió la fracción sobrenadante, se dividió en alícuotas y se
almacenó a -70ºC.
La fig. 5 muestra una titulación de la cepa de
tembladera 263K adaptada a hámster usada en estos estudios
(SPO172200). Esto muestra el diseño típico de la tinción observado
para 263K, usando mAb 3F4. La proteína PrP madura de longitud
completa se cree que tiene una proporción molecular aparente (Mr) de
\approx33.000 daltons (33K, banda superior de la calle 2).
Después de la digestión con proteinasa K, normalmente se observa
(véase calle 1) una banda ancha predominante en la región de 28K,
una banda ancha más débil \approx23K, y una banda nítida pero
débil \approx19K. Obsérvese que en las cepas 263K Hs, también se
pueden detectar estas especies con más bajo Mr (calle 2),
presumiblemente debido a las proteasas endógenas presentes en, o
durante la preparación de la cepa.
Se hicieron pruebas en las muestras procesadas
sólo a dilución pura, o bien sin digestión o después de digestión
con proteinasa K a una concentración final de 10 \mug/ml (basado
en resultados previos). En las figuras 6 y 7 se muestran los
resultados.
La cepa 263K cHs digerida con proteinasa K
SPO172200 sirvió como testigo positivo interno (calle 1 de la fig.
6). Las especies 28K PrP se pueden ver claramente en la muestra
309.1A (ambas con y sin digestión con proteinasa K; véase la calle
3 de las figuras 6 y 7). Se observa un número de especies de
proteína adicionales en la muestra sin digerir. La especie 33K PrP
aún es visible después de la digestión con proteinasa K (calle 3 de
la fig. 6) lo que indica que la digestión con proteinasa K fue
incompleta.
No se observaron bandas de proteína en ninguna de
las muestras tratadas con hidróxido cálcico y calor (calles
5-10), tanto con como sin digestión con proteinasa
K, incluso con exposiciones más largas de la transferencia Western
(hasta 30 minutos). Así, todos los sistemas probados en este estudio
tratados con hidróxido cálcico y calor eliminaron las proteínas
PrP^{Sc}. Ya que no se observaron especies de PrP^{Sc} para
estas muestras, puede entenderse que tienen un título de punto
final de 10^{0} ó 1x10^{0} unidades arbitrarias por ml.
Obsérvese que no se puede hacer estimación del título para la
muestra 309.1A.
El nivel de proteínas PrP presentes en las
muestras procesadas no se cuantificó por titulación en el ensayo de
transferencia Western. Sin embargo, aunque no se pudo detectar PrP
en ninguna de las muestras tratadas con hidróxido cálcico o calor,
se puede hacer una estimación de la eliminación en comparación con
la 236K inoculado estimado.
El factor de eliminación log_{10} es la
proporción entre la cantidad total de 263K inoculado en el material
inicial de carne y la cantidad total de 263K recuperada de la
muestra final tratada, expresado como un valor de log_{10}:
Eliminación =
\frac{\text{título de la cepa x volumen del inóculo}}{\text{título
de la muestra x volumen de la
muestra}}
Para todas las muestras tratadas se logró un
factor de eliminación \geq 3,4 log. Estos cálculos se resumen en
la tabla 2.
Como conclusión, se inoculó 263K Hs en muestras
de carne picada de ternera y el efecto del tratamiento con
hidróxido cálcico y calor, según la presente invención, se midió en
términos de eliminación de proteína PrP^{Sc}. Los resultados
positivos que se informan en esta memoria sugieren que el método de
la invención es un buen procedimiento para la eliminación o
inactivación de EDT en muestras de carne usadas en la producción de
alimento para animales.
El experto en la técnica comprenderá que la
presente invención no está limitada a las realizaciones aquí
descritas en detalle, y que se pueden tener en cuenta una
diversidad de otras realizaciones que, no obstante, concuerdan con
el amplio espíritu y el ámbito de la invención.
Toda la bibliografía científica y de patentes a
que se hace referencia en esta memoria descriptiva está incorporada
aquí como referencia.
| Muestra | Descripción | PH |
| 309.1A | Carne magra de ternera inoculada con 263K cHs (testigo) | 6,5 |
| 309.1-1.3 | Muestra tratada a pH 10,5, 75ºC, durante 3 horas | 8,8 |
| 309.1-1.6 | Muestra tratada a pH 10,5, 75ºC, durante 6 horas | 8,8 |
| 309.1-2.3 | Muestra tratada a pH 10,5, 60ºC, durante 3 horas | n.d. |
| 309.1-3.3 | Muestra tratada a pH 10,5, 90ºC, durante 3 horas | 8,2 |
| 309.1-4.3 | Muestra tratada a pH 12,0, 75ºC, durante 3 horas | 11,6 |
| 309.1-4.6 | Muestra tratada a pH 12,0, 75ºC, durante 6 horas | 11,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Título (u.a. por ml) | Volumen (ml) | Total (u.a. por ml) | Eliminación (log_{10}) |
| Inóculo | 7,8x10^{4} | 1 | 7,8x10^{4} | - |
| 309.1-1.3 cHs | 1x10^{0} | 30 | 3,0x10^{1} | \geq3,41 |
| 309.1-1.6 cHs | 1x10^{0} | 25 | 2,5x10^{1} | \geq3,49 |
| 309.1-2.3 cHs | 1x10^{0} | 30 | 3,0x10^{1} | \geq3,41 |
| 309.1-3.3 cHs | 1x10^{0} | 26 | 2,6x10^{1} | \geq3,48 |
| 309.1-4.3 cHs | 1x10^{0} | 20 | 2,0x10^{1} | \geq3,59 |
| 309.1-4.6 cHs | 1x10^{0} | 15 | 1,5x10^{1} | \geq3,72 |
Claims (12)
1. Un método para fabricar un alimento para
animales que incluye las etapas de:
(i) añadir álcali a material animal para mantener
un pH de al menos 8,5;
(ii) calentar el material de la etapa (i) a una
temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las
proteínas presentes en el material animal; y
(iii) deshidratar el material producido en la
etapa (ii);
en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es
1-4 horas.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el material animal de la etapa (i) es material animal
contaminado por EDT donde el alimento para animales que resulta de
dicho método es alimento para animales descontaminado de EDT.
3. Un método para producir material animal
descontaminado de EDT que incluye las etapas de:
(i) añadir álcali a material animal para
mantener un pH de al menos 8,5;
(ii) calentar el material de la etapa (i) a una
temperatura de 60ºC a 99ºC para lograr hidrólisis alcalina de las
proteínas presentes en el material animal;
en el que la duración de las etapas (i) y (ii) es
1-4 horas.
4. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en
el que el pH es al menos 9,5.
5. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en
el que el pH es de 10,5 a 13.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que
el pH es de 11,0 a 11,5.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura es de 60ºC a
90ºC.
8. Un método según la reivindicación 7, en el que
la temperatura es 60ºC.
9. Un método según la reivindicación 7, en el que
la temperatura es de 80ºC a 85ºC.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que la duración es de 1 a 2 horas.
11. Un método según la reivindicación 8, en el
que la duración es 3 horas.
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que se lleva a cabo a presión
atmosférica.
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