ES2253566T3

ES2253566T3 - Procedimiento de extraccion con disolventes.

Info

Publication number: ES2253566T3
Application number: ES02779442T
Authority: ES
Inventors: Chris Dextra Laboratories Ltd. LAWSON
Original assignee: Glycomed Sciences Ltd Australia
Current assignee: Glycomed Sciences Ltd Australia
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2022-09-30
Also published as: DE60207878T2; US7479290B2; CA2461928A1; US20040249138A1; WO2003029269A1; EP1430073A1; EP1430073B1; DE60207878D1; JP2005508345A; ATE312118T1; AU2002342778B2

Abstract

Procedimiento para la preparación de un extracto de glicósido que comprende las siguientes etapas: a) se somete tejido vegetal seco, molido, de una especie de Solanum a una extracción con alcohol usando metanol; b) se seca el extracto obtenido y se disuelve en un ácido volátil débil y se centrifuga; c) se precipita el sobrenadante usando una base volátil; d) se lava el precipitado a conciencia y se seca.

Description

Procedimiento de extracción con disolventes.

La presente invención se refiere a un procedimiento de extracción mejorado para un extracto de glicósido alcaloide de una especie de Solanum.

Se conoce como BEC a una mezcla habitual de glicósidos de solasonina, aislada a partir de los frutos de Solanum sodomaeum. El BEC es una mezcla bruta de glicoalcaloides que comprende los triglicéridos solasonina (aproximadamente el 33%), solamargina (33%) y una fracción indefinida a la que se ha denominado como "di y monoglicósi- dos".

El procedimiento para preparar BEC supone homogeneizar los frutos de Solanum sodomaeum en un gran volumen de ácido acético, eliminar por filtración el líquido a través de muselina, precipitar los glicósidos con amoniaco y repetir las etapas varias veces (documento WO 00/6 11 53; Planta Medica 1987, 1:59-62). El rendimiento de la mezcla del glicósido solasodina es muy bajo (aproximadamente el 0,8%).

Se incorpora BEC en cantidades muy pequeñas en una crema tópica (Curaderm®) que se usa para tratar lesiones de la piel tales como manchas solares y queratosis.

También se ha notificado que BEC muestra una citotoxicidad preferente frente a varias células cancerígenas humanas (documento WO 91/10743).

Mientras que BEC tiene la calidad suficiente para usarse en pequeñas cantidades en formulaciones de cremas tópicas de especialidades farmacéuticas publicitarias (EFP), no cumple los requisitos reguladores para el uso farmacéutico. Por tanto, las etapas individuales de proceso del procedimiento habitual para la preparación de BEC no se definen como BPF (Buenas Prácticas de Fabricación) en cuanto a la ampliación a escala, definición del rendimiento, composición y calidad del producto.

Además, nunca se ha analizado la mezcla BEC en lo que respecta a la naturaleza precisa de los principios activos, más que la presencia de los triglicósidos solasonina y solamargina, suponiéndose que todos los componentes de glicósido son activos en combinación.

La presente invención se refiere al extracto novedoso de glicósido de Solanum que comprende los componentes de glicósido activo con alta pureza, cumpliendo los requisitos de BPF.

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de extracción novedoso para la preparación de un extracto de glicósido de Solanum que consiste esencialmente sólo en los glicósidos activos de Solanum.

También se proporciona un método de HPLC novedoso muy sensible para el análisis de los extractos de glicósido de Solanum. Este método de HPLC novedoso emplea una columna ACE 5 C18 (V99-140) (longitud de 25 cm + 1 cm de cartucho precolumna; tamaño de partícula de 5 \mum; diámetro interno de 4,6 mm; tamaño de poro de 100 \ring{A}), Advanced Chromatography Technologies (ACT) (que puede obtenerse de HiChrom, Theale).

La fase móvil usada a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min fue tampón fosfato 20 mM al 75% (pH 2,95), acetonitrilo al 25%, usando una bomba de HPLC ternaria SP 8800 de Spectra-Physics. Se llevó a cabo la detección a 205 nm con un detector de longitud de onda variable Spectra 1000, de Spectra-Physics.

Basándose en un análisis amplio de la mezcla BEC se ha mostrado que, junto con los triglicósidos solasonina y solamargina, está presente un componente de diglicósido en una cantidad de aproximadamente el 30%. Sorprendentemente se ha descubierto que el componente de diglicérido no parece mostrar ninguna actividad en citotoxicidad en varias líneas experimentales de células cancerígenas.

Según la presente invención, se proporciona un extracto del glicósido solasodina que consiste esencialmente de los triglicéridos solasonina y solamargina.

Preferiblemente, el extracto es de una pureza de casi el 100% con cantidades no medibles o sólo trazas del componente de diglicósido inactivo.

Preferiblemente, la solasonina está presente en el extracto final en una cantidad de entre el 30 - 50% mientras que la solamargina está presente en una cantidad del 40 - 60%.

El extracto de la presente invención puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento:

Se seca el tejido vegetal de Solanum y se tritura hasta polvo. Se somete el polvo a una extracción con alcohol usando metanol. Tras la eliminación del alcohol, se disuelve el extracto seco en ácido y se centrifuga. Se precipita el sobrenadante en condiciones alcalinas. Pueden repetirse las etapas de precipitación ácida/alcalina varias veces.

Entonces se lava a conciencia el precipitado con agua y se seca y se purifica adicionalmente mediante cromatografía en gel de sílice.

Puede usarse cualquiera de las plantas de la especie Solanum como fuente de glicósido de Solanum. Sin embargo, preferiblemente, se obtiene el extracto de la invención a partir de Solanum sodomaeum. Se ha descubierto que pueden obtenerse los mayores rendimientos de los dos componentes del extracto, solamargina y solasonina, a partir del fruto liofilizado de Solanum sodomaeum.

Se lleva a cabo la extracción usando metanol.

Para la etapa de precipitación puede tratarse el extracto seco con cualquier reactivo alcalino y ácido débil volátil. Se ha descubierto que pueden obtenerse resultados óptimos usando ácido acético y amoniaco concentrado.

Para la purificación cromatográfica usando cromatografía en gel de sílice, puede disolverse el extracto liofilizado en metanol. Antes de la elución, se lava el gel de sílice con acetona. Preferiblemente, se lleva a cabo la elución usando un gradiente de metanol y acetona.

En el ejemplo posterior, se ejemplifica a continuación en detalle el procedimiento de extracción de la invención.

Ejemplo 1 1.1 Preparación del fruto

Se cortaron las frutos de Solanum sodomaeum por la mitad y se secaron mediante liofilización. Entonces se trituraron los frutos secos hasta polvo. El polvo molido, seco final a partir de una producción de 5 kg de frutos fue de 898 g.

1.2 Extracción con disolventes de los glicoalcaloides

El fruto en polvo (aproximadamente 230 g cada uno) se dividió entre 3 cartuchos para Soxhlet (celulosa Whatman, 60 x 180 mm), y se llevaron a cabo cuatro extracciones para cada uno con 1 litro de metanol (Labscan, calidad para HPLC). Se llevó a cabo la primera extracción (1 litro de metanol) durante 7,5 horas antes de que el metanol se eliminara por evaporación y se analizaran los extractos resultantes mediante HPLC. Las 3 extracciones posteriores fueron con 750 ml de metanol para encontrar el punto en el cual se extraían completamente todos los glicoalcaloides. Se etiquetaron las cuatro extracciones con A, A1, A2 y A3, respectivamente. En la tabla 1 se muestran las concentraciones de glicoalcaloide en las cuatro extracciones diferentes.

TABLA 1 Concentración de glucoalcaloides en el extracto

	Solasonina, mg/ml mediante HPLC	Solamargina, mg/ml mediante HPLC
A	7,9	9,4
A_{1}	2,2	2,6
A_{2}	0,16	0,16
A_{3}	0,06	0,07

1.3.1 Purificación a escala de producción del extracto A

Se combinaron y se evaporaron los extractos A, A1 y A2 (se abandonó A3 debido a la falta de producto útil) secos y parcialmente evaporados para dar un extracto seco combinado (62,23 g). Se disolvieron los extractos en ácido acético (2 litros, al 3% (v/v)) y se clarificó la disolución ligeramente turbia mediante centrifugación (6.000 rpm, 20 min). Se recogió el sobrenadante y se desechó una pequeña cantidad de precipitado verde. Entonces se filtró la muestra para eliminar algunos pequeños grumos restantes de precipitado verde.

1.3.1.1 1ª precipitación con amoniaco

Se ajustó el filtrado a pH 9 mediante la adición de amoniaco concentrado y se permitió que el precipitado sedimentara durante 1 hora antes de la centrifugación (6.000 rpm, 20 min). Esto dio un precipitado parecido a un gel, que se redisolvió fácilmente en aproximadamente 1 litro de ácido acético al 3% (v/v), de tal manera que el volumen final de la muestra fue de 1,25 litros.

1.3.1.2 2ª precipitación con amoniaco

Se ajustó el pH de la muestra a 9 mediante la adición de amoniaco concentrado y se permitió que el precipitado sedimentara durante algunos minutos antes de la centrifugación (6.000 rpm, 20 min).

1.3.1.3 Lavado del precipitado

Se redispersó el precipitado y se mezcló a conciencia con agua desionizada (6 x 250 ml), y se recogió mediante centrifugación. Se repitió este procedimiento una vez y se drenaron los sedimentos.

1.3.1.4 Liofilización del producto A

Se disolvieron los sedimentos en acetato de amonio, pH 4,5 (se ajustó ácido acético al 3% (v/v) a pH 4,5 con amoniaco concentrado para dar una disolución de acetato de amonio a pH 4,5). El volumen final de disolución en esta fase era de 360 ml. Se sometió la muestra a una filtración de abrillantado a través de un filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/B) antes de las pesadas en recipientes de plástico (16 cm x 16 cm x 6 cm). Entonces se congeló la muestra y posteriormente se liofilizó. El rendimiento (en peso) del extracto fue aproximadamente del 1,14% del peso original del fruto completo, o del 6,45% del fruto en polvo seco.

Se determinó la composición del extracto liofilizado mediante HPLC. Se descubrió que contenía aproximadamente un 33% de solasonina, un 40,1% de solamargina, pero sin trazas detectables del componente de diglicósido.

1.4 El extracto A liofilizado Purificación cromatográfica del extracto A

Se rellenó una columna con gel de sílice seco (406,6 g, dimensiones de la columna: 7,5 cm x 18 cm). Se pesó el extracto A liofilizado (13,59 g) y se disolvió en metanol (250 ml). Se añadió gel de sílice (106 g), y se secó la suspensión hasta un polvo fino mediante evaporación. Entonces se aplicó la suspensión en la parte superior de la columna de sílice y se añadió una capa de arena silícea (1 cm aproximadamente). Se lavó la columna con acetona (1 litro) antes de la elución de los glicoalcaloides. Se eluyó la columna con una velocidad de flujo de 1 litro/h con un gradiente de 4 etapas de metanol:acetona tal como sigue:

Etapa 1: metanol (30% (v/v)):acetona (70% (v/v)), 2 litros

Etapa 2: metanol (40% (v/v)):acetona (60% (v/v)), 2 litros

Etapa 3: metanol (60% (v/v)):acetona (40% (v/v)), 1 litro

Etapa 4: metanol (100% (v/v)), 1,5 litros

1.4.1 Combinación de las fracciones

Se recogieron las fracciones (51 x 25 ml) cuando se aplicó la etapa 1 del gradiente, con el fin de monitorizar dónde comenzaban a eluir la solamargina y la solasonina. Después de esto, se recogieron fracciones más grandes de 500 ml sin parar hasta después de la etapa 4. Se monitorizó el progreso de la purificación mediante CCF. Se combinaron las fracciones que contenían los productos finales deseados (solamargina, solamargina más solasonina, así como la solasonina). Se secaron las fracciones mediante evaporación rotatoria y se procesaron inmediatamente tal como se describe a continuación.

1.4.2 Precipitación con amoniaco

Se disolvieron las fracciones combinadas secas en ácido acético (900 ml, 3% (v/v)) y se ajustaron a pH 9 mediante la adición de amoniaco concentrado. Se recogió el precipitado resultante mediante centrifugación (6.000 rpm/20 min).

1.4.3 Lavado de los precipitados y liofilización

Se lavó tres veces con agua el precipitado resultante, se recogió mediante centrifugación, y se congeló a -20ºC, antes de su redisolución en ácido acético (1,6 litros, 0,1% (v/v)). Entonces se dividió equitativamente la muestra en 8 recipientes y se liofilizó.

1.4.4 Rendimientos y purezas de los productos purificados finales

Se pesaron y se almacenaron desecados a vacío a +4ºC los productos liofilizados. Entonces se analizaron las muestras para determinar la pureza (frente a un patrón de BEC) mediante HPLC. Se presentan los resultados en la tabla 2.

TABLA 2 Rendimientos y purezas del producto final

	Análisis mediante HPLC
Muestra	Rendimiento G	*% de recuperación	% de solasonina	% de solamargina	% total mediante
					HPLC
A	8,49	88,0	40,5	55,3	97,5

1.5 Análisis químico y microbiológico del extracto vegetal de BEC original y del producto final preparado según la invención

Se analizaron muestras del producto de BEC de la técnica anterior así como un producto según la presente invención para determinar el contenido en humedad y para determinar el contenido microbiano, de pesticidas y de metales pesados.

1.5.1 Análisis microbiano

Se enviaron para el análisis microbiano, análisis de humedad, metanol, cenizas y metales pesados una muestra del producto de BEC de la técnica anterior, junto con el producto purificado final de la invención.

Los resultados de estos análisis se resumen en la tabla 3.

TABLA 3 Resumen de los resultados analíticos para el material vegetal de BEC y el producto A purificado

Ensayo	Producto de BEC	A
Recuento bacteriano	> 1500 por cada 50 mg	< 1 por cada 10 mg
Recuento fúngico	> 1500 por cada 50 mg	< 1 por cada 10 mg
Residuo por ignición, %	6,7	0,4
Agua, % m/m	1,99	5,66
Metanol, \mug/g	350	< 50
Metales pesados, ppm como Pb	10	< 10
Metales pesados:
\hskip0,5cm Cd, mg/kg	< 0,02
\hskip0,5cm Pb, mg/kg	< 0,01
\hskip0,5cm Hg, mg/kg	0,10
\hskip0,5cm As, mg/kg	0,03

2. Conclusiones

Resultó que la extracción con disolventes usando metanol es muy satisfactoria en la extracción de los triglicósidos selectivos solasonina y solamargina con poca o ninguna contaminación con el diglicósido.

Con el fin de obtener el producto de alta pureza final se sometió el extracto a cromatografía en gel de sílice. Preferiblemente, con el fin de optimizar la recuperación de solasonina, que tiene una baja solubilidad en acetona, se debería aplicar un eluyente escalonado que comprenda metanol y acetona.

Se mostró que el procedimiento de la presente invención elimina de manera eficaz el tercer componente que está presente en BEC en cantidades superiores al 30%.

Tras la evaporación del disolvente de la muestra, una reprecipitación simple con amoniaco y un lavado dan lugar a un producto limpio, que puede liofilizarse fácilmente a partir de una disolución en acetato de amonio acuoso. Se eliminan los componentes volátiles durante el proceso de liofilización. Es preferible que la etapa de purificación final se lleve a cabo en un periodo de 24 horas con el fin de optimizar el aspecto del producto final.

2.1 Pureza del producto

El procedimiento desarrollado en el presente documento da un producto significativamente mejorado comparado con el obtenido mediante el procedimiento Cham (2), en cuanto a su aspecto, pureza, humedad y contenido en metales pesados. El producto liofilizado final fue un polvo granular blanquecino. La pureza del producto estaba en el intervalo del 92,7 - 99,3% (análisis de HPLC), comparado con una pureza normal del 65 - 70% obtenida con el método previo. El contenido en humedad también era menor (4,0 - 5,7% comparado con el 7% obtenido previamente), y la contaminación por metales pesados era extremadamente baja.

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un extracto de glicósido que comprende las siguientes etapas:

a): se somete tejido vegetal seco, molido, de una especie de Solanum a una extracción con alcohol usando metanol;

b): se seca el extracto obtenido y se disuelve en un ácido volátil débil y se centrifuga;

c): se precipita el sobrenadante usando una base volátil;

d): se lava el precipitado a conciencia y se seca.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las etapas b) y c) se repiten varias veces.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido volátil es ácido acético.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la base es amoniaco concentrado.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido vegetal seco es un fruto liofilizado de Solanum sodomaeum.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el aislamiento de un extracto de los triglicósidos solasonina y solamargina en una forma sustancialmente pura, que comprende además someter el extracto a cromatografía en gel de sílice.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el eluyente usado es un gradiente de metanol/acetona.

8. Extracto del triglicósido solasodina que puede obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende los triglicósidos solasonina y solamargina que tienen una pureza superior al 90%.

9. Extracto del triglicósido solasodina según la reivindicación 8, en el que la razón de solasonina:solamargina está en el intervalo de 0,3 - 0,7:0,4 - 0,8.

10. Extracto de triglicósidos de solasodina según la reivindicación 8 ó 9, en el que la razón de solasonina:solamargi-
na está en el intervalo de 0,4 - 0,6:0,5 - 0,7.

11. Extracto del triglicósido solasodina según la reivindicación 8, en el que la razón de solasonina:solamargina es 0,7:0,5.

12. Extracto del triglicósido solasodina según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que puede obtenerse según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.