ES2253636T3 - Vacuna contra hpv. - Google Patents

Vacuna contra hpv.

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ES2253636T3 ES03078635T ES03078635T ES2253636T3 ES 2253636 T3 ES2253636 T3 ES 2253636T3 ES 03078635 T ES03078635 T ES 03078635T ES 03078635 T ES03078635 T ES 03078635T ES 2253636 T3 ES2253636 T3 ES 2253636T3
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Abstract

Una vacuna que comprende una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 16L1 una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 18L1, hidróxido de aluminio y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado.

Description

Vacuna contra HPV.
La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, procedimientos para prepararlas y su uso terapéutico. En particular la presente invención se refiere a vacunas combinadas para la administración a adolescen-
tes.
Los Papilomavirus son virus ADN tumorales pequeños que son altamente específicos de cada especie. Hasta ahora, se han descrito aproximadamente 70 genotipos de papilomavirus específicos de humanos (HPV) distintos. Los HPV son específicos habitualmente para la piel (por ejemplo HPV-1 y HPV-2) o superficies mucosas (por ejemplo HPV-6 y -11) y habitualmente producen tumores benignos (verrugas) que persisten desde varios meses a años. Este tipo de tumores benignos pueden ser estresantes para los individuos afectados, pero no suelen suponer riesgo vital, salvo raras excepciones.
Algunos HPV están también asociados con algunos tipos de cáncer. La asociación directa positiva más fuerte que existe entre el HPV y cáncer en humanos es la existente entre el HPV-16 y HPV-18 y el carcinoma de cérvix. El cáncer de cérvix es el cáncer maligno más frecuente en los países en desarrollo, con aproximadamente 500000 nuevos casos al año en el mundo. Ahora es técnicamente posible combatir activamente la infección por HPV-16, e incluso cánceres que contengan el HPV-16, usando vacunas. Para una revisión de las perspectivas de las vacunas profilácticas y terapéuticas contra los cánceres que contengan HPV-16, véase Cason, J., Clin. Immunother. 1994: 1(4) 293-306 y Hagenesee M.E. Infections in Medicine 1997-14(7) 555-556, 559-564.
Otros HPV de interés particular son los serotipos 31, 33 y 45.
Hoy, los diferentes tipos de HPV han sido aislados y caracterizados con la ayuda de sistemas de clonación en bacterias y más recientemente con la amplificación por PCR. La organización molecular del genoma de los HPV ha sido definida según una comparación con el papilomavirus bovino tipo 1 (BPV1), que es bien conocido.
A pesar de que pueden aparecer variaciones menores, todos los genomas de HPV descritos tienen al menos siete genes tempranos, desde E1 hasta E7, y dos genes tardíos, L1 y L2. Además, una región previa a la región reguladora alberga las secuencias reguladoras que parecen controlar la mayoría de las transcripciones del genoma del HPV.
Los genes E1 y E2 están implicados en el control de la replicación y la transcripción viral respectivamente y suelen ser interrumpidos por la integración viral. Los E6 y E7 y el E5, que ha sido implicado recientemente mediante pruebas, están implicados en la transformación viral.
En los HPV implicados en el carcinoma de cérvix como el HPV 16 y el HPV 18, el proceso de oncogénesis comienza después de la integración del ADN viral. La integración lleva a la inactivación de genes que codifican las proteínas L1 y L2 de la cápside y a la instauración de una sobreexpresión continua de las proteínas E6 y E7 que llevarán a la pérdida gradual de la diferenciación normal de la célula y al desarrollo del carcinoma.
El carcinoma de cérvix es frecuente en mujeres y se desarrolla a través de un estadío intermedio precanceroso hasta carcinoma invasivo, que frecuentemente lleva a la muerte. Los estadíos intermedios de la enfermedad se conocen con el nombre de neoplasia cervical intraepitelial y está graduado de I a III en escala ascendente de severidad.
Clínicamente la infección por HPV en el tracto anogenital femenino se manifiesta como condilomas planos, que es la marca de la coilocitosis que afecta predominantemente las células superficiales e intermedias del epitelio escamoso del cerviz.
Los coilocitos que son consecuencia de los efectos citopáticos del virus aparecen como células multinucleadas con corona clara perinuclear. El epitelio adelgaza por una queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de la lesión.
Cuando dichos condilomas planos son positivos para el HPV serotipo 16 ó 18, son factores de alto riesgo para la evolución hacia neoplasia cervical intraepitelial (CIN) y Carcinoma in situ (CIS) que son por sí mismos considerados lesiones precursoras del carcinoma de cérvix Invasivo.
El documento WO 96/19496 describe variantes de las proteínas E6 y E7 del virus papiloma humano, concretamente proteínas de fusión de E6/E7 con eliminación de ambas proteínas, la E6 y la E7. Estas proteínas de fusión de eliminación son consideradas inmunogénicas.
Las vacunas basadas en la HPV L1 son descritas en los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y en WO94/05792. Una vacuna de este tipo puede expresar el antígeno de L1 como un monómero, un capsómero o una partícula similar al virus. Dichas partículas podrían expresar adicionalmente las proteínas L2. Las vacunas basadas en L2 están descritas por ejemplo en el documento WO93/00436. Otras vacunas para el HPV están basadas en proteínas tempranas, como la E7 o proteínas de fusión como la L2-E7.
Roden R B S y cols: ("Assessment of the serological relatedness of genital human papillomaviruses by hemagglutination inhibition" Journal of Virology, The American Society for Microbiology, us, vol. 70. Nº 5, mayo 1996 (1996-05), páginas 3298-3301) describe experimentos para considerar la protección cruzada entre tipos de HPV genitales con vacunas basadas en VLP.
Wheeler C M: ("Preventive Vaccines for Cervical Cancer" Salud Pública de México, México, mx, vol. 39, Nº 4, julio 1997 (1197-07), páginas 283-287) proporciona una revisión de las vacunas para el cáncer de cérvix.
Schiller J T y cols: ("Papillomavirus-like particles and HPV vaccine development" Seminars in cancer biology, Saunders scientific publications, Philadelphia, Pa, us, vol. 7, Nº 6. diciembre 1996 (1996-12), páginas 373-382), describe el uso de VLP en animales para la inducción de anticuerpos.
Suzich J A y cols: ("Systemic immunization with papilomavius L1 protein completely prevents the development of viral mucosal papillomas" Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, national academy of science. Washington, us, vol. 92, 1 de diciembre 1995 (1995-12-01), páginas 11553-11557), describe el uso de partículas L1 provenientes de papilomavirus oral canino para vacunar Beagles.
Lowe R S y cols: ("Human papillomavirus type 11 (HPV-11) neutralizing antibodies in the serum an genital mucosal secretions of African green monkeys immunized with HPV-11 virus-like particles expressed in yeast" Journal of infectious diseases, Chicago, IL, us, vol. 176, Nº 5, 1997, páginas 1141-1145) describe la vacunación de monos con VLP del HPV 11 formuladas con un adyuvante de aluminio.
El documento W09517209 describe vacunas que comprenden una emulsión de aceite en agua.
La presente invención proporciona la composición de una vacuna según la reivindicación 1.
Una respuesta inmune será generalmente dividida en dos categorías extremas, siendo la respuesta inmune por mediación humoral o celular (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos efectores de protección con anticuerpos y con células respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido denominadas respuestas tipo Th1 (respuesta con mediación celular), y respuesta inmune tipo Th2 (respuesta humoral).
Las respuestas extremas tipo Th1 están caracterizadas por la generación de respuestas específicas para el antígeno, restricción del halotipo hacia linfocitos T citotóxicos y linfocitos citolíticos naturales. En ratones las respuestas tipo Th1 están habitualmente caracterizadas por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en los humanos estos corresponden a los anticuerpos del tipo IgG1. Las respuestas inmunes del tipo Th2 están caracterizadas por la generación de un amplio abanico de isotipos de inmunoglobulinas incluidas en el ratón IgG1, IgA, e
IgM.
Se puede considerar que la fuerza motriz que dirige el desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas. Los altos niveles de citocinas del tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de la respuesta mediada por células ante un antígeno dado, mientras que los niveles altos de citocinas del tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de la respuesta humoral contra el antígeno.
La diferencia entre las respuestas inmunes tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un sujeto podrá mantener una respuesta inmune que se describa como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. De todas maneras, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en los términos descritos en clones de células T CD4+ en murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173). Tradicionalmente, las respuestas del tipo Th1 están asociadas con la producción de IFN-\gamma y citocinas del tipo IL-2 por los linfocitos tipo T. Otras citocinas que a menudo están asociadas con la inducción de respuestas inmunes del tipo Th1 no son producidas por células T, como la IL-12. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL10 y el factor de necrosis tumoral-\beta (TNF-\beta).
Se sabe que determinados adyuvantes de vacunas son particularmente idóneos para la estimulación de la respuesta de citocinas del tipo Th1 o de Th2. Tradicionalmente los mejores indicadores del balance de la respuesta inmune entre Th1:Th2 tras una vacunación o una infección incluyen la medición directa de la producción de citocinas del tipo Th1 o Th2 por los linfocitos T in vitro tras la reestimulación con antígeno, y/o (al menos en ratones) la medida de la relación entre la respuesta de anticuerpos específicos del tipo IgG1:IgG2a.
De esta manera, un adyuvante del tipo Th1 es aquel que estimula poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citocinas tipo Th1 cuando son reestimuladas in vitro con el antígeno, e inducen respuestas con isotipos de inmunoglobulinas específicas del tipo Th1.
Los adyuvantes que son capaces de estimular la respuesta celular Th1 de manera preferente están descritos en la solicitud de patentes internacional número WO 94/00153 y WO 95/17209.
El lípido A 3 De-O-monofosforil acilado (3D-MPL) es uno de dichos adyuvantes. Es conocido de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla del lípido A 3 De-O-monofosforil acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida del lípido A 3 De-O-monofosforil acilado está descrita en la patente europea número 0689454 BI (SmithKline Beecham Biologicals SA).
Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (como se describe en la patente europea número 0689454). El 3D-MPL estará presente en un intervalo de 10 \mug-100 \mug preferentemente 25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará presente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.
De acuerdo con la invención también está presente en la composición de la vacuna un vehículo. El vehículo es una sal de aluminio, como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Los antígenos en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención están combinados con 3D-MPL y aluminio.
Para la administración a humanos el 3D-MPL estará presente habitualmente en una vacuna en un intervalo de 1 \mug-200 \mug, como 10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis.
En una forma de realización preferente el antígeno del HPV en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención incluye la proteína mayor de la cápside L1 del HPV y opcionalmente la proteína L2, particularmente del HPV 16 y/o el HPV 18. Al realizarla de esta manera, la forma preferente para la proteína L1 es la forma truncada de la proteína L1. La L1, opcionalmente en una fusión de L1-L2, está en la forma de una partícula similar al virus (VLP). La proteína L1 deberá estar fusionada con otra proteína de HPV, en particular la E7 para formar la fusión L1-E7. Son particularmente preferibles las formas conjugadas que incluyen L1-E o L1-L2.
Las proteínas de la presente invención son expresadas preferentemente en E. coli. En una formulación preferible las proteínas son expresadas con una cola de histidina incluyendo entre 5 y 9 y preferiblemente 6 residuos de histidina. Estas son ventajosas para acrecentar la purificación. La descripción de la fabricación de dichas proteínas está plenamente descrita en la patente británica pendiente de tramitación número GB 9717953,5.
En la composición de la vacuna el antígeno de HPV deberá ser absorbido en Al(OH)_{3}.
Un aspecto preferible de la vacuna es que sea polivalente, por ejemplo tetravalente o pentavalente.
Las formulaciones de la presente invención son muy efectivas en la inducción de inmunidad protectora, incluso con bajas dosis de antígeno.
Proporcionan una protección excelente contra infecciones primarias y estimulan, ventajosamente, ambas respuestas inmunes: respuesta humoral específica (anticuerpos neutralizantes) y también respuesta inmune mediada por células efectoras (DTH).
Un aspecto adicional de la presente invención es que proporciona una formulación de vacuna, como ha sido descrito en este documento, para el uso en la terapia médica, especialmente para su uso en el tratamiento o profilaxis de las infecciones por el papilomavirus humano.
La vacuna de la presente invención contendrá una cantidad inmunoprotectora de los antígenos y podrá ser preparada con las técnicas convencionales.
La preparación de la vacuna está descrita en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design- the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and developments in Vaccines, editado por Soller y cols, University Park Press, Baltimore, Maryland, EE.UU. 1978. La encapsulación dentro de liposomas está descrita por ejemplo por Fullerton, Patente de EE.UU. 4.235.877.
La conjugación de proteínas hasta conseguir macromoléculas está descrita, por ejemplo, por Likhite, Patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y cols., Patente de EE.UU. 4.474.757.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna está seleccionada por ser la cantidad que induce una respuesta inmune protectora sin significativos efectos secundarios en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo del tipo de inmunogen que se utilice. Generalmente se espera que cada dosis incluya 1-1000 \mug de proteína, preferiblemente 2-100 \mug, más preferiblemente 4-40 \mug. La cantidad óptima de una vacuna en particular puede ser averiguada con estudios estándar consistentes en la observación de titulaciones de anticuerpos y otras respuestas en los sujetos. Tras la vacunación inicial, los sujetos deberán recibir una dosis de recuerdo aproximadamente en 4 semanas aproximadamente.
Además de la vacunación de personas susceptibles a infecciones por el HPV, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para tratar, inmunoterapéuticamente, pacientes que sufran las mencionadas infecciones virales.
\newpage
Si se desease, se podrían añadir otros antígenos, en cualquier orden conveniente, para administrar vacunas multivalentes como se ha descrito en este documento.
El siguiente ejemplo ilustra pero no limita la invención.
Ejemplo 1 Comparativa de inmunogenicidad de vacunas de HPV Ags/HBs/gD monovalentes o en combinación formuladas con AS04 Introducción
Se realizó un estudio de inmunogenicidad en ratones Balb/C utilizando cuatro antígenos distintos:
\vskip1.000000\baselineskip
1.
Partícula similar al virus HPV 16 L1 (VLP-16).
2.
Partícula similar al virus HPV 18 L1 (VLP-18).
3.
Antígeno gD de HSP-2.
4.
Antígeno HBs.
\vskip1.000000\baselineskip
formulados con aluminio/3D-MPL (AS04) usando monovolúmenes de antígenos o de 3D-MPL preabsorbidos en Al(OH)_{3} o AIPO_{4}.
Las formulaciones 3D-MPL/Al(OH)_{3} se refieren a AS04D mientras que las 3D-MPL/AIPO_{4} se refieren a AS04C.
Las siguientes vacunas fueron calculadas:
\vskip1.000000\baselineskip
1.
VLP16 + VLP18 AS04D:
2.
gD AS04D;
3.
HBs AS04C;
\vskip1.000000\baselineskip
y se evaluó la posibilidad de combinar estas vacunas.
El objetivo de este experimento era comparar la inmunogenicidad de dos combinaciones distintas de AS04 hechas con cualquiera de:
\vskip1.000000\baselineskip
1.
VLP16+ VLP18 y gD.
2.
VLP16+ VLP18 y gD y antígeno HBs.
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo del experimento está detalladamente descrito en la sección de Material y Procedimientos.
En resumen, grupos de 10 ratones fueron inmunizados intramuscularmente dos veces con intervalo de tres semanas con varias fórmulas basadas en Antígenos. La respuesta de anticuerpos a VLP, gD y Ag HBs y su perfil de isotipo fue monitorizada con ELISA el día 14 post II. A la vez, la producción de citocinas (IFN\gamma/IL5) fue analizada después de la reestimulación in vitro de células esplénicas bien con VLP, gD o antígenos HBs.
Material y procedimientos Formulación Composiciones de formulación
VLP16, VLP18, gD y HBs formulados con 3D-MPL en sal de aluminio.
Componentes usados
Componente Concentración Tampón
HPV 16 VPL 560 \mug/ml Tris 20 mM/NaCl 500 mM
HPV 18 VPL 550 \mug/ml NaCl 500 mM/NaPO_{4} 20 mM
Al (OH)_{3} 10380 \mug/ml H_{2}O
HBs 1219 \mug/ml PO_{4} 10 mM/NaCl 150 mM
gD 443 \mug/ml PBS pH 7,4
3D-MPL 1170 \mug/ml Agua para inyección
AlPO_{4} 5 \mug/ml NaCl 150 mM 
\vskip1.000000\baselineskip
Adsorción a) Adsorción de VLP
Volúmenes de VLP 16 y VLP 18 purificados son ajustados a 500 \mug/ml con el tampón de purificación, entonces el Al(OH)_{3} es añadido para obtener una proporción de 2 \mug de VLP/10 \mug de Al(OH)_{3}. El mezclado magnético se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 60 minutos y la mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación final.
b) Adsorción de gD
Se mezclan 2 \mug de gD con 10 \mug de Al (OH)_{3}. El mezclado magnético se lleva a cabo durante 60 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación final.
c) Adsorción de HBs
Se mezclan 2 \mug de HBs con 10 \mug de AlPO_{4}. El mezclado magnético se lleva a cabo durante 60 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación final.
d) Adsorción de 3D-MPL
Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL con 10 \mug de Al (OH)_{3}. El mezclado magnético se lleva a cabo durante 60 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación final.
Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL con 10 \mug de Al (OH)_{4}. El mezclado magnético se lleva a cabo durante 60 minutos a temperatura ambiente y la mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación final.
Formulación
Se mezclan H_{2}O y NaCl (a una concentración de x10) y después de 10 minutos de agitación a temperatura ambiente, se añaden los siguientes componentes: antígeno absorbido, 3D-MPL absorbido y Al(OH)_{3} (Ver tabla más abajo). Son agitados a temperatura ambiente durante 10 minutos y almacenados a 4ºC hasta que se inyecten.
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos Inmunoestimuladores Vehículo
Grupo Tipo \mug Tipo \mug Tipo \mug
Al(OH)_{3} 10
gD 2 Al(OH)_{3} 10
A VLP16 2 3D-MPL 5 Al(OH)_{3} 10
VLP18 2 Al(OH)_{3} 10
Al(OH)_{3} 10
(Continuación)
Antígenos Inmunoestimuladores Vehículo
Grupo Tipo \mug Tipo \mug Tipo \mug
Al(OH)_{3} 10
gD 2 Al(OH)_{3} 10
B VLP16 2 Al(OH)_{3} 10
VLP18 2 3D-MPL 5 AlPO_{4} 10
HBs 2 Al(OH)_{3} 10
Al(OH)_{3} 10
C gD 2 5 Al(OH)_{3} 10
3D-MPL Al(OH)_{3} 30
Al(OH)_{3} 10
D VLP16 2 Al(OH)_{3} 10
VLP18 2 3D-MPL 5 Al(OH)_{3} 10
Al(OH)_{3} 20
AlPO_{4} 10
E HBs 2 3D-MPL 5 Al(OH)_{3} 10
Al(OH)_{3} 30
Serología en los ratones Serología anti-VPL-16 y antiVPL-18
La cuantificación de anticuerpos contra VLP16 y contra VLP18 se realizó mediante ELISA usando como antígenos marcadores VLP16 503/10 (20/12/99) y VLP18 (25/12/99F). Se utilizaron 50 \mug de solución de antígeno y anticuerpo por pocillo. El antígeno fue diluido a una concentración final de 0.5 \mug en PBS y fue adsorbido toda la noche a 4ºC en los pocillos de placas de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Las placas fueron incubadas entonces durante una hora a 37ºC con PBS que contenía un 1% de albúmina sérica bovina. Se añadieron diluciones dobles de suero (comenzando con una dilución de 1/400) en el tampón de saturación a las placas recubiertas de VLP e incubadas durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y se añadió a cada pocillo Ig contra ratón conjugada con biotina (Amersham, RU) diluida 1/1500 con tampón de saturación para después ser incubado durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Después de lavarlos, se añadió el complejo peroxidasa de estreptavidina con biotina (Amersham, RU) dilución 1/1000 en tampón de saturación durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como previamente y fueron incubadas durante 20 minutos con una solución de O-fenilendiamina (Sigma) 0,04% H_{2}O_{2} 0,03% en 0,1% de Tween 20 0,05 M en tampón de citrato pH 4,5. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490/630 nm. Las titulaciones de ELISA fueron calculadas tomando como referencia SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y expresado en EU/ml.
Respuesta Anti-gD
La cuantificación de antígeno anti gD se realizó mediante ELISA utilizando como antígeno marcador el gD (gD 43B318). Se utilizaron 50 \mul de solución antígeno anticuerpo por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC en los pocillos de una placa de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 0,1% Tween 20 (con tampón de saturación; 100 \mul/pocillo). Se añadieron diluciones dobles de suero (comenzando por una dilución de 1/100) con tampón de saturación a las placas recubiertas con gD y fue incubado posteriormente durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS al 0,1% Tween 20 y se añadió a cada pocillo IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig (Amercham, RU) contra ratón conjugada con biotina diluida 1/1000 en tampón de saturación y fue incubado posteriormente durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Después de lavarlos, se añadió el complejo peroxidasa de estreptavidina con biotina (Amersham, RU) dilución 1/1000 en tampón de saturación durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como previamente y fueron incubadas durante 20 minutos con una solución de O-fenilendiamina (Sigma) 0,04% H_{2}O_{2} 0,03% en 0,1% de Tween 20 0,05 M en tampón de citrato pH 4,5. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490/630 nm. Las titulaciones de ELISA fueron calculadas tomando como referencia SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y expresado en EU/ml.
Serología anti-HBs
La cuantificación de anticuerpo anti-HBs se realizó mediante ELISA utilizando como marcador el HBs (Hep 286). Se utilizaron 50 \mug de solución antígeno anticuerpo por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC en los pocillos de una placa de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% Tween 20 (con tampón de saturación). Se añadieron diluciones dobles de suero (comenzando por una dilución de 1/100) con tampón de saturación a las placas recubiertas con HBs y fue incubado posteriormente durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS al 0,1% Tween 20 y se añadió a cada pocillo Ig contra ratón conjugada con biotina (Amersham, UK) diluida 1/1500 o IgG1, IgG2a e IgG2b (IMTECH, EE.UU.) diluidos respectivamente a 1/4000, 1/8000 y 1/4000 con tampón de saturación y fue incubado después durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Después de lavarlos, se añadió el complejo peroxidasa de estreptavidina con biotina (Amersham, UK) dilución 1/1000 en tampón de saturación durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como previamente y fueron incubadas durante 20 minutos con una solución de O-fenilendiamina (Sigma) 0,04% H_{2}O_{2} 0,03% en 0,1% de Tween 20 0,05 M en tampón de citrato pH 4,5. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490/630 nm. Las titulaciones de ELISA fueron calculadas tomando como referencia SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y expresado en EU/ml.
Producción de citocinas
Dos semanas después de la segunda inmunización se sacrificaron los ratones, se les extrajo el bazo asépticamente y fueron acumulados. Las suspensiones celulares fueron preparadas en un medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía 2 mM de L-Glutamina, antibióticos, 5 x 10^{-5}M de 2-mecaptoetanol, y un 5% de suero fetal de ternera. Las células fueron cultivadas con una concentración final de 5 x 10^{6} células/ml, en placas de 24 pocillos de fondo plano con 1 ml por placa con diferentes concentraciones (10-1 \mug/ml) de cada uno de los antígenos (VLP, gD,o antígeno HBs). El sobrenadante se extraía 96 horas después y se congelaba hasta que se examinaba para determinar la presencia de IFN\gamma e IL5 mediante ELISA.
IFN\gamma (Genzyme)
La cuantificación de IFN\gamma se realizó mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Se utilizaron muestras y soluciones de anticuerpos poniendo 50 \mul por pocillo. Se marcaron placas de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) con 50 \mul de IFN\gamma de hámster contra ratón diluido a 1,5 \mug/ml en tampón de carbonato con pH 9,5 durante la noche a 4ºC. Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina y 0,1% de Tween 20 (con tampón de saturación). Se añadieron a las placas marcadas con IFN\gamma diluciones dobles del sobrenadante proveniente de estimulación in vitro (comenzando con ½) con tampón de saturación y se incubó durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS Tween 0,1% (tampón de lavado) y se añadió IFN\gamma de cabra conjugado con biotina contra ratón diluido con tampón de saturación con una concentración final de 0,5 \mug/ml e incubado durante 1 hora a 37ºC. Después de lavarlo, se añadió el conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 con tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron como previamente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 10 minutos. La reacción se detuvo mediante H_{2}SO_{4} 0,4N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se calcularon mediante una curva estándar (INF\gamma estándar de ratón) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y expresado en pg/ml.
IL5 (Pharmigen)
La cuantificación de IL5 se realizó mediante ELISA utilizando reactivos de Pharmingen. Se utilizaron muestras y soluciones de anticuerpos poniendo 50 \mul por pocillo. Se marcaron placas de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) con 50 \mul de IL5 de rata contra ratón diluido a 1 \mug/ml en tampón de carbonato con un pH 9,5. Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina y 0,1% de Tween 20 (con tampón de saturación). Se añadieron a las placas marcadas con IL5 diluciones dobles del sobrenadante proveniente de estimulación in vitro (comenzando con ½) con tampón de saturación y se incubó durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS Tween 0,1% (tampón de lavado) y se añadió IL5 de rata conjugado con biotina contra ratón diluido con tampón de saturación con una concentración final de 1 \mug/ml e incubado durante 1 hora a 37ºC. Después de lavarlo, se añadió el conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 con tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron como previamente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 15 minutos. La reacción se detuvo mediante H_{2}SO_{4} 0,4N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se calcularon mediante una curva estándar (IL-5 recombinante de ratón) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y expresado en pg/ml.
\newpage
Grupos
Grupos de 10 ratones Balb/C fueron inmunizados intramuscularmente con las siguientes formulaciones:
TABLA 1 Grupos y formulaciones
Grupo Formulación
A VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/gD 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 50 \mug
B VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/HBs 2 \mug/gD 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 40 \mug/AlPO_{4} 10 \mug
C gD 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 50 \mug
D VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 50 \mug
E HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/AlPO_{4} 10 \mug/Al(OH)_{3} 40 \mug
Los detalles de las formulaciones están descritos previamente en Material y Procedimientos.
Resultados 1. Serología a) Respuesta anti VLP16
Las respuestas humorales (Ig) se midieron mediante ELISA utilizando VLP16 503-1 (20/12/99) como el antígeno marcador. El día 14 post II se analizaron los sueros.
La Figura 1 muestra la medición de respuestas de anticuerpos anti-VLP16 en suero individual el día 14 post II.
Los títulos de anti-VLP16 obtenidos después de la inmunización con la combinación de antígenos de VLP, gD y HBs (grupo B), fueron escasamente menores a los obtenidos tanto con la combinación de VLP y gD (grupo A) como con la formulación monovalente de VLP (grupo D) (GMT de 27578 EU/ml, 48105 EU/ml, 44448 EU/ml respectivamente).
Antes del análisis estadístico se aplicó en cada población un test T-Grubbs para la exclusión de datos. Se excluyó del análisis a dos ratones que no respondieron en los grupos A y D.
Se demostró que las diferencias halladas entre los grupos no eran estadísticamente significativas utilizando el test de Student Newman Keuls.
b) Respuesta anti-VLP18
Las respuestas humorales (Ig e isotipos) se midieron mediante ELISA utilizando el VLP18 504-2 (25/10/99) como antígeno marcador. El día 14 post II se analizaron los sueros.
La Figura 2 muestra la respuesta de anticuerpos anti-VLP18 medida en suero individual el día 14 post II.
Los títulos anti-VLP18 obtenidos después de la inmunización con la combinación de antígenos de VLP, gD y HBs (grupo B), fueron de la misma magnitud que los obtenidos tanto con la combinación de VPL y gD (grupo A) como con la formulación monovalente de VLP (grupo D) (GMT de 56078 EU/ml, 88786 EU/ml y 76991 EU/ml respectivamente).
Antes del análisis estadístico se aplicó en cada población un test T-Grubbs para la exclusión de datos. Se excluyó del análisis a dos ratones que no respondieron en los grupos A y D.
Se demostró que las diferencias halladas entre los grupos no eran estadísticamente significativas utilizando test unidireccional de análisis de varianza.
c) Respuesta anti-gD
Las respuestas humorales (Ig e isótopos) se midieron mediante ELISA utilizando el gD como antígeno marcador. El día 14 post II se analizaron los sueros.
La Figura 3 muestra la respuesta de anticuerpos anti-gD medida en suero individual el día 14 post II.
Con respecto a la respuesta anti-gD, se observa un descenso insignificante en el GMT obtenido con la combinación VLP/gS/HBs (grupo B) comparado con gD aislado (grupo C) o la combinación de VLPs/gD (grupo A) (GMT de 18631 EU/ml, 32675 EU/ml, 27058 EU/ml, respectivamente).
Antes del análisis estadístico se aplicó en cada población un test T-Grubbs para la exclusión de datos. Se excluyó del análisis a dos ratones que no respondieron en el grupo A.
Se estudiaron los títulos de anti-gD después de una transformación de los datos post II mediante test unidireccional. No se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las tres formulaciones.
El análisis de los sueros almacenados determinó un reparto de isotipos según se muestra:
\vskip1.000000\baselineskip
Reparto de isotipos (%)
Ig G1 Ig G2a Ig G2b
Grupo A 96 3 2
Grupo B 96 3 2
Grupo C 97 1 1 
\vskip1.000000\baselineskip
No se observó ninguna diferencia en el perfil de isotipos inducido por las tres formulaciones: se indujo principalmente una respuesta IgG (96-97% of IgG1) en los tres grupos como se indica en la tabla más abajo.
d) Respuesta anti-HBs
Se utilizó ELISA para medir las respuestas humorales (Ig e isotipos) utilizando antígeno HBs (Hep286) como antígeno marcador. Se analizó el suero el día 14 post II.
La Figura 4 muestra las respuestas de anticuerpos anti-HBs medidas en suero individual el día 14 post II.
Se observó una respuesta insignificantemente menor de anticuerpos anti-HBs en el grupo de combinación B que contenía los antígenos de VLP, gD y HBs comparado con el HBs aislado (grupo E) (GMT de 28996 EU/ml y 20536 EU/ml, respectivamente).
Se realizó un estudio unidireccional sobre los títulos anti-HBs después de una transformación log de los datos post II. No se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo B (VLP/HBs/gD) y el grupo E (HBs) empleando el test de Student Newman Keuls.
La repartición de isotipos analizada en el suero almacenado fue como se indica y no mostraba diferencias entre los dos grupos, con una proporción de IgG2a conservada en la vacuna combinada.
\vskip1.000000\baselineskip
Repartición de isotipos (%)
IgG1 IgG2a IgG2b
Grupo B 54 24 21
Grupo E 56 23 21 
\vskip1.000000\baselineskip
2. Respuesta inmune mediada por células
Las respuestas mediadas por células (producción de IFN\gamma/IL5) fueron evaluadas el día 14 post II después de haber reestimulado las células esplénicas con los antígenos de VLP, gD o Hbs. Para cada grupo de ratones se constituyeron acúmulos de 5 órganos. El procedimiento experimental está plenamente descrito en Material y Procedimientos.
Producción de Citocinas a) Reestimulación in vitro con VLP16 y VLP18
La Figura 5 muestra la producción de citocinas monitorizada en células esplénicas pasadas 96 horas de la reestimulación in vitro con VLP16.
La Figura 6 muestra la producción de citocinas monitorizada en células esplénicas pasadas 96 horas de la reestimulación in vitro con VLP18.
No se ha observado un claro cambio en el intervalo de la producción de ambas citocinas usando dosis de antígeno de VLP de 10 \mug y 1 \mug en la reestimulación.
Se observó un perfil Th1 claro en todas las formulaciones.
TABLA 2 Proporción de IFN\gamma/IL5 después de la reestimulación in vitro con VLP16 y VLP18
Proporción IFN/IL-5 Grupo A Grupo B Grupo C
VLP16 10 \mug/ml 5,2 8,9 11,8
VLP16 1 \mug/ml 15,1 14,3 16,5 
\vskip1.000000\baselineskip
Proporción IFN/IL-5 Grupo A Grupo B Grupo C
VLP18 10 \mug/ml 19,6 11,1 16,1
VLP18 1 \mug/ml 23,2 14,3 18,2
b) Reestimulación in vitro con gD
La Figura 7 muestra la producción de citocinas monitorizada en células esplénicas pasadas 96 horas de la reestimulación in vitro con el antígeno gD.
No se observó un claro efecto intervalo dependiente cuando se compararon dosis de 10 \mug y 1 \mug en la reestimulación.
El IFN\gamma se produce en una concentración mucho mayor comparado con IL-5 (Tabla 3) indicando el claro perfil Th1 de la respuesta inmune en todos los grupos evaluados (monovalente comparado con combinación).
TABLA 3 Proporción de IFN\gamma/IL-5 después de reestimulación in vitro con gD
Proporción IFN/IL-5 Grupo A Grupo B Grupo C
gD 10 \mug/ml 6,2 7,2 3,1
gD 1 \mug/ml 6,2 11,2 2,3
c) Reestimulación in vitro con HBs
La Figura 8 muestra la producción de citocinas monitorizada en células esplénicas pasadas 96 horas de la reestimulación in vitro con el HBs. Se observó en el grupo B un nivel significativo de IFN\gamma pero no se observó producción de IL-5. Como se muestra en la Tabla 2 se observó una mayor producción de IFN\gamma en el grupo E comparado con el grupo B. De todas maneras se observaron antecedentes de valores altos de IFN\gamma en el grupo E (monovalente de HBs) en el control sin reestimulación con el antígeno. Se observó una proporción muy alta de INF\gamma/IL-5 con la vacuna monovalente indicando que se había inducido una fuerte respuesta tipo Th1. De manera similar, se midió una alta proporción de INF\gamma/IL-5 con la vacuna combinada, confirmando la capacidad de esta formulación para inducir una respuesta Th1.
TABLA 4 Proporción de INF\gamma/IL-5 después de reestimulación in vitro con HBs
Proporción IFN/IL-5 Grupo B Grupo E
HBs 10 \mug/ml 15,8 65,3
HBs 1 \mug/ml 7,6 67,6
Conclusiones
Se evaluó en ratones Balb/C el efecto de la combinación de VLP/gD o VLP/gD/Ag HBs formulados en AS04 sobre la inmunidad:
Con respecto al análisis serológico, no se observó ninguna interferencia de la combinación de antígenos sobre los valores de anticuerpos anti-VLP, angi-gD y anti-HBs.
La combinación de los antígenos VLP y gD o VLP, gD y HBs no interfirió con los perfiles de isotipos de la respuesta de anticuerpos proporcionados por las vacunas monovalentes de la gD y la HBs.
En la evaluación de las citocinas, el perfil de Th1 (proporción IFN\gamma/IL-5) observado con cada vacuna monovalente se confirmó con los grupos de vacunas combinadas.

Claims (6)

1. Una vacuna que comprende una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 16L1 una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 18L1, hidróxido de aluminio y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 en la que las partículas similares al virus están formuladas utilizando monovolúmenes preabsorbidos de antígeno y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado en hidróxido de aluminio.
3. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en la que volúmenes de partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 16L1 y partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 18L1 purificados se añaden a hidróxido de aluminio para obtener una proporción de 2 \mug de VLP/10 \mug de Al(OH)_{3}.
4. Una vacuna consistente esencialmente en una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 16L1, una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 18L1, hidróxido de aluminio y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado.
5. Una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 16L1 formulada con aluminio y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado utilizando monovolúmenes de preabsorbidos de antígeno y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado en hidróxido de aluminio o AlPO_{4}.
6. Una partícula similar al virus del Papilomavirus Humano 18L1 formulada con aluminio y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado utilizando monovolúmenes de preabsorbidos de antígeno y Lípido A 3 De-O-monofosforil acilado en hidróxido de aluminio o AlPO_{4}.
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