ES2253833T3 - Sustratos cromogenicos de sialidasa y procedimientos para la preparacion y la utilizacion de los mismos. - Google Patents
Sustratos cromogenicos de sialidasa y procedimientos para la preparacion y la utilizacion de los mismos.Info
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Abstract
Compuesto con la fórmula siguiente: en la que por lo menos dos de entre R1, R2, R4 y R5 son H, y el resto son, cada uno, R6, OR6, Cl, Br, I, F o NO2; R3 es -CH=CHNO2, R6 es H, C(CH3)3, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)(CH2)0- 3CH3 o (CH2)0-3CH3; o una sal de los mismos.
Description
Sustratos cromogénicos de sialidasa y
procedimientos para la preparación y la utilización de los
mismos.
La presente invención se refiere a compuestos que
son sustratos cromogénicos para sialidasas de origen bacteriano,
vírico, protozoárico y vertebrado (incluyendo humano), y a su
utilización.
La sialidasa (EC 3.2..1.18, también conocida como
neuraminadasa, acilneuraminil hidrolasa) es un enzima proteico
producido por muchos organismos, tales como bacterias, virus,
protozoos y vertebrados, incluyendo el ser humano (Hirst [1941],
Science 94:22-23). Esta clase de enzimas cataliza la
hidrólisis de un ácido siálico terminal que se encuentra unido a
oligosacáridos mediante un enlace O-glucosídico. La
estructura cristalina de las sialidasas muestra que el enzima
presenta un sitio activo altamente conservado centrado en un lazo de
lámina \beta de forma similar a una hélice (Crennell et
al. [1993], Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:9852-9856).
Las sialidasas llevan a cabo muchas funciones
biológicas críticas. En las bacterias, la sialidasa ayuda a la
adhesión bacteriana a los tejidos, y proporciona fuentes de
nutrición adicionales (Crennell et al. [1994],
Structure 2(6):535-544). En los virus,
ayuda a la liberación de los virus de la progenie (Liu et
al. [1995], J. Virol. 69:1099-1106). En
la práctica, Trypanosoma cruzi, una sialidasa (también
conocida como trans-sialidasa) extrae el ácido
siálico de las células infectadas y decora su propia superficie con
estos ácidos siálicos. En el ser humano, las sialidasas están
implicadas en la digestión de las proteínas, en respuestas
inmunológicas y en la proliferación celular. La producción anormal
de sialidasas puede conducir a enfermedades graves en el ser
humano, tales como la sialidosis o tasas incrementadas de infección
por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis
quística.
Debido a que las sialidasas se asocian a muchas
enfermedades, un sustrato productor de color para la sialidasa
resultaría un excelente reactivo diagnóstico o prognóstico para las
enfermedades relacionadas con sialidasas. Por ejemplo, el nivel de
sialidasa se encuentra elevado en la vaginosis bacteriana (Briselden
et al. [1992], J. Clin. Microbiol.
30:663-666). La medición del nivel de sialidasa en
las muestras vaginales podría utilizarse para diagnosticar la
vaginosis bacteriana. En la enfermedad periodontal causada por
infección bacteriana, se ha demostrado que la presencia de
sialidasa incrementa la colonización por bacterias perjudiciales
(Liljemark et al. [1989], Caries Res.
23:141-145). La forma invasiva de células de T.
cruzi, tripomastigoto, expresa niveles elevados de actividad
trans-sialidasa; por lo tanto, la medición del nivel
de trans-sialidasa podría utilizarse para el
diagnóstico de la infección por T. cruzi y para el
seguimiento de la evolución de la enfermedad (Cross y Takle [1993],
Ann. Rev. Microbiol. 47:385-411). En los
pacientes con fibrosis quística, la infección por Pseudomonas
aeruginosa es una de las causas principales de muerte. Se ha
demostrado que la sialidasa se encuentra implicada en la evolución
de la enfermedad (Cacalano et al. [1992], J. Clin.
Invest. 89:1866-1874). La sialidasa también se
relaciona con la regulación de la proliferación celular (Bratosin
et al. [1995], Glycoconj. J.
12:258-267), la eliminación de las proteínas del
plasma (Bonten et al. [1996], Genes & Devel.
10:3156-3169) y el catabolismo de los gangliósidos y
de las glucoproteínas (Gornati et al. [1997], Mol. Cell
Biochem. 166:117-124).
En la actualidad se encuentra disponible un
sustrato sintético de la sialidasa, el ácido
4-metilumbeliferil-B-acetil-neuramínico
(4-MUN) (Lentz et al. [1987],
Biochemistry 26:5351-5358), que produce un
producto con un espectro de fluorescencia característico al
hidrolizarse. Este cambio de espectro de fluorescencia únicamente
puede medirse con un instrumento especializado
(fluoroespectrómetro).
De acuerdo con la presente invención, los nuevos
compuestos (que pueden funcionar como sustratos cromogénicos de la
sialidasa) presentan la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que por lo menos dos de entre
R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son H y el resto son, cada uno,
R_{6}, OR_{6}, Cl, Br, I, F o
NO_{2};
R_{3} es -CH=CHNO_{2},
R_{6} es H, C(CH_{3})_{3},
CH(CH_{3})_{2},
CH_{2}CH(CH_{3})_{2},
CH(CH_{3})(CH_{2})_{0-3}CH_{3}
o (CH_{2})_{0-3}CH_{3}; o una sal de
los mismos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un compuesto de la invención y un portador. Todavía otro aspecto de
la presente invención es la utilización de un compuesto de la
invención en la detección de un enzima sialidasa.
Las sialidasas son producidas por bacterias,
virus y protozoos; por lo tanto, la detección de la presencia de
sialidasa en una muestra biológica puede ser indicativa de la
presencia de estos microorganismos. En formas de realización
específicas, la detección de las sialidasas puede llevarse a cabo de
acuerdo con la invención con el fin de identificar infecciones
vaginales y periodontales, así como para detectar Pseudomonas
aeruginosa en pacientes con fibrosis quística.
La presencia de sialidasa se detecta, de acuerdo
con la invención, mediante la utilización de nuevos compuestos
sustrato cromogénicos. Estos compuestos proporcionan ventajosamente
un cambio visible de color cuando actúa sobre ellos una sialidasa.
De esta manera, estos sustratos, cuando se utilizan de acuerdo con
las enseñanzas de la invención, pueden utilizarse para detectar con
facilidad y exactitud la presencia de sialidasa en una muestra. En
una forma de realización preferente, la muestra que se somete a
ensayo es una muestra biológica, tal como sangre, moco o
saliva.
Los compuestos de la invención pueden utilizarse
en una amplia diversidad de formatos de ensayo. Típicamente el
ensayo implicará poner en contacto una muestra a ensayar para la
presencia de sialidasa con un sustrato cromogénico del enzima de la
invención. Un cambio de color producido tras la entrada en contacto
de la muestra con el sustrato es indicativo de la presencia de
sialidasa. El ensayo opcionalmente puede utilizar controles
positivos y/o negativos para ayudar en la interpretación y
verificación de los resultados. Los resultados también pueden
cuantificarse utilizando instrumentos ópticos estándar de
medición.
Los métodos generales siguientes son aplicables a
la síntesis de compuestos de la invención. Los expertos en la
materia pueden utilizar fácilmente modificaciones o variaciones de
estos métodos que presentan el beneficio de la invención.
Se trata ácido
N-acetil-D-neuramínico con
Dowex 50W-X4 lavado con metanol disuelto en metanol
bajo agitación a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo,
generalmente 4 horas. La mezcla se filtra y el filtrado se
concentra, proporcionando el producto esterificado deseado tras la
cristalización.
Los expertos en la materia reconocerán que otros
procedimientos estándar se encuentran disponibles para la
esterificación del mismo material, tales como la utilización de
otras resinas de intercambio catiónico, por ejemplo Amberlyst 15 o
Dowex 50W-X8, entre otras.
El tratamiento del producto esterificado con
cloruro de acetilo bajo agitación a temperatura ambiente bajo
condiciones anhidras durante un periodo de tiempo, generalmente 20 a
24 horas, resulta en la formación del cloruro de glucosilo
per-O-acetilado. Obsérvese que en algunos casos resulta
necesario el burbujeo de cloruro de hidrógeno (gas) seco en el
recipiente de reacción para efectuar la formación de cloruro de
glucosilo. La concentración de la mezcla de reacción con una
temperatura del baño maría no superior a 35ºC, y el secado del
residuo al vacío proporciona el producto en forma de espuma
suficientemente pura para las reacciones siguientes.
Los expertos en la materia reconocerán que otros
procedimientos estándar se encuentran disponibles para la
O-acetilación y para la preparación de cloruro de glucosilo
del mismo material, incluyendo un procedimiento en dos etapas
informado con anterioridad (Kuhn et al., 1966) que implica la
per-O-acetilación del mismo material con anhídrido acético
en ácido perclórico, seguido de la formación del cloruro de
glucosilo mediante tratamiento con cloruro de acetilo.
El tratamiento del derivado hidroxibenzaldehído
sustituido con hidruro sódico en tetrahidrofurano bajo agitación a
temperatura ambiente durante un periodo de tiempo, generalmente 1 a
3 horas, resulta en la formación de la sal sódica. El tratamiento
posterior de la sal sódica con el cloruro de glucosilo (compuesto nº
3) bajo agitación durante un periodo de tiempo, generalmente 12 a
60 horas, a temperatura ambiente resulta en la
O-glucosilación. La concentración de la mezcla de reacción,
el tratamiento del residuo con acetato de etilo y agua, la
separación y el secado de la fase orgánica, la concentración de la
fase orgánica y la cromatografía en columna del material crudo
proporciona el O-glucósido deseado.
Los expertos en la materia reconocerán que otros
procedimientos estándar se encuentran disponibles para la
O-glucosilación de los mismos materiales, tales como
procedimientos tradicionales de O-glucosilación mediados
por un ácido de Lewis (Okamoto y Goto, 1990), así como la
utilización de sales alternativas del derivado hidroxilo aromático
sustituido, incluyendo sales de tetrabutilamonio (Baggett y Marsden,
1982) o de plata (Holmquist y Brossmer, 1972), entre otras.
Se introduce el O-glucósido protegido en
hidróxido sódico acuoso y se agita a temperatura ambiente durante
un periodo de tiempo, generalmente 1 a 4 horas. A continuación, se
ajusta el pH de la mezcla a un valor entre 3 y 5 utilizando resina
Dowex 50W-X4 (H^{+}). La filtración, seguida de la
liofilización del filtrado proporcionó el material
des-O-acetilado y desesterificado que se deseaba.
Los expertos en la materia reconocerán que otros
procedimientos estándar se encuentran disponibles para la
des-O-acetilación y desesterificación completas del mismo
material, incluyendo un procedimiento en dos etapas que implica la
des-O-acetilación completa del mismo material con metóxido
sódico en metanol o con una resina de intercambio iónico apropiada,
por ejemplo amberlita IRA-400 (OH^{-}), seguido de
desesterificación bajo condiciones de hidrólisis ácida o de
hidrólisis básica.
Los compuestos con la estructura general I y sus
sales y derivados pueden prepararse utilizando cualquiera de entre
varios procedimientos conocidos de la técnica para la síntesis de
análogos sustituidos de ácido siálico que contienen estructuras
análogas.
A título ilustrativo se resumen algunos enfoques
sintéticos para ejemplos seleccionados de estructura general I en
el esquema de reacción siguiente y que son representativos de los
tipos de procedimiento que pueden utilizarse.
\newpage
Esquema
Los compuestos nº 6, nº 11 y nº 14 (mostrados en
el esquema de reacción) son ejemplos específicos de compuestos de
la invención. Algunos compuestos específicos adicionales de la
invención presentan las fórmulas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, estos compuestos producen un
cambio a color azul cuando actúa sobre ellos una sialidasa.
El esquema de reacción ilustra la construcción de
un esqueleto básico de estructura general I a través de la
esterificación mediada por ácido del ácido disponible comercialmente
N-acetil-D-neuramínico (1),
para proporcionar metil
N-acetil-D-neuraminato (2) y
la posterior per-O-acetilación y generación del cloruro de
glucosilo (3) de acuerdo con las modificaciones de los
procedimientos conocidos (Kuhn et al., 1966; Ogura et
al., 1986; Patel y Richardson, 1986). El tratamiento del
compuesto nº 3 con la sal sódica de numerosos derivados
hidroxibenzaldehído sustituidos proporcionaría los intermediarios
clave de las dianas deseadas (compuestos nº 4, nº 9 y nº 12). La
producción de la sal sódica se conseguiría con hidruro sódico en
tetrahidrofurano. Este procedimiento de O-glucosilación ya ha
sido aplicado en la preparación estereoselectiva de numerosos
-O-glucósidos del ácido
N-acetil-D-neuramínico (Myers
et al., 1980; Eschenfelder y Brossmer, Carbohydr.
Res., 1987; Eschenfelder y Brossmer, Glycoconjugate J.,
1987; Okamoto y Goto, 1990; Warner y O'Brien, 1979) derivados de
hidroxilos aromáticos. Sin embargo, ninguno de los productos
indicados en la presente memoria se encuentran contenidos en las
referencias anteriormente indicadas. Los enfoques sintéticos o las
referencias a los enfoques sintéticos a los intermediarios (1) y (2)
se encuentran contenidos en las referencias anteriormente
indicadas. La posterior des-O-acetilación y desesterificación
de los intermediarios resultantes puede llevarse a cabo con una
solución acuosa de hidróxido sódico y tratamiento final que implique
la acidificación del medio de reacción. Ello proporciona acceso a
los glucósidos O-fenólicos formil-sustituidos
(compuestos nº 5, nº 10 y nº 13).
El tratamiento de las dianas derivadas
(compuestos nº 5, nº 10 y nº 13) con nitrometano, acetato amónico y
ácido acético en etanol bajo reflujo proporciona acceso a las dianas
nitrovinilo deseadas (compuestos nº 6, nº 11 y nº 14). Este
procedimiento se ha utilizado en la preparación de análogos
nitrovinilo de otros monosacáridos (Patel y Richardson, 1986;
Aamlid et al., 1990) como sustratos cromogénicos para el
ensayo de glucosidasas; sin embargo, ninguno de los productos o
intermediarios indicados en la presente memoria se encuentran
contenidos en las referencias anteriormente indicadas.
Debe indicarse que el
p-nitrofenil O-glucósido del ácido
N-acetilneuramínico (estructura general I, en la que
R_{1}=R_{2}=R_{4}=R_{5}=H y R_{3}=NO_{2}, se ha
informado como sustrato cromogénico de las sialidasas (Eschenfelder
y Brossmer, Carbohydr. Res., 1987). La condensación de los
compuestos nº 5, nº 10 o nº 13 con cualquiera de los numerosos
compuestos ceto aromáticos en presencia de amonio y cloruro de
amonio, proporciona acceso a numerosos sustratos cromogénicos de las
sialidasas (para ejemplos representativos, ver los compuestos nº 15
y nº 16, figura 2) de estructura general I.
El origen de la sialidasa era sialidasa
bacteriana recombinante purificada a partir de Salmonella T.,
virus influenza completo, o medio de cultivo que contenía sialidasa
humana secretada por la línea celular 2CFSME0. La preparación de
sialidasa se añadió a un tampón de acetato sódico 0,1 M a pH 6,0 y
se proporcionó el compuesto sustrato nº 14 a una concentración
aproximada de 0,5 mM. La reacción tuvo lugar a temperatura ambiente
durante 20 minutos en un volumen de 100 \mul. Al final de la
reacción, el pH se ajustó mediante adición de una solución (glicina
0,2 M e hidróxido sódico con un valor de pH de 11,0). Se observó con
facilidad un cambio de color a rojo, como ejemplifican las figuras
1a y 1b. El cambio de color se cuantificó midiendo la absorción de
la luz de la mezcla de reacción. La absorción de la luz se escaneó
con un espectrofotómetro. El valor máximo para el compuesto IBX4010
se obtiene a 495 nm. A una concentración de sustrato de 0,2 mM, la
absorción de la luz a 495 nm con un recorrido de 1 cm es de 1,203.
El control en el que se mantuvo la mezcla de reacción bajo las
mismas condiciones durante 10 minutos sin adición de ningún enzima
presentaba una absorción de 0,282 a 495 nm con un recorrido de 1
cm.
El compuesto nº 11 se sometió a ensayo mediante
el mismo procedimiento. Al final de la reacción con ajuste de pH,
se observó fácilmente un cambio de color a naranja, tal como
ejemplifican las figuras 1a y 1b. El cambio de color se cuantificó
midiendo la absorción de la luz de la mezcla de reacción. Diez
minutos después de la reacción, la mezcla del producto de reacción
se ajustó a pH básico y la absorción de la luz se escaneó con un
espectrofotómetro. El valor máximo para el compuesto IBX4023 se
observaba a 480 nm. A una concentración de sustrato de 0,2 mM, la
absorción de la luz a 480 nm con un recorrido de 1 cm era de 4,065.
El control en el que la mezcla de reacción se mantuvo bajo las
mismas condiciones durante 10 minutos sin adición de ningún enzima
presentaba una absorción de 1,452 a 480 nm con un recorrido de 1
cm.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
"cantidad efectiva" de un compuesto de la invención requerido
para la utilización en el procedimiento presentado en la presente
memoria será diferente no sólo según el compuesto particular que se
debe seleccionar, sino también según el modo de aplicación y la
naturaleza del espécimen de muestra. La cantidad exacta se evaluará
sometiendo a ensayo un número suficiente de muestras clínicas en
cada aplicación, por expertos en la materia. Sin embargo, una
concentración generalmente adecuada se encontrará comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mM/ml de las soluciones de
ensayo. Además, los compuestos pueden utilizarse en forma de
compuesto químico puro aplicado a una solución de ensayo, o como
una sal o derivado puro químicamente aceptable. Sin embargo, resulta
preferente proporcionar el compuesto químico activo o su sal o
derivado químicamente aceptable como formulación medicinal, como
material seco (solución de reacción proporcionada separadamente), o
como una solución o suspensión (una solución acuosa u otras
soluciones de disolvente químicamente aceptables) o como una tira
reactiva. El espécimen puede aplicarse al ensayo para medir los
niveles de actividad de las sialidasas. Los expertos en la materia
con el beneficio de la invención apreciarán que las cantidades y
modos de aplicación son fácilmente determinables sin necesidad de
experimentación
indebida.
indebida.
Los ejemplos detallados siguientes de los
procedimientos de preparación se proporcionan únicamente a título
ilustrativo y no limitativo.
En todos los casos, se observó que los
intermediarios y productos sintéticos eran puros según los
estándares conocidos por los expertos en la materia (tales como la
cromatografía en capa fina, los puntos de fusión o de ebullición,
cromatografía de gases, cromatografía de intercambio iónico y/o
cromatografía líquida de alta presión, análisis elemental y
procedimientos espectroscópicos). Además, las estructuras se
caracterizaron y se asignaron mediante procedimientos
espectroscópicos considerados práctica estándar por los expertos en
la materia (tales como espectroscopías de infrarrojos, de
ultravioletas y de masa, espectroscopía de resonancia magnética
nuclear de ^{1}H y de ^{13}C y/o cristalografía de rayos x). Se
proporcionan datos espectrales seleccionados para los
intermediarios y productos.
Se añadió a una suspensión agitada de ácido
N-acetilneuramínico (1) (10,0 g, 32,3 mmoles) en metanol (1,0
litros) Dowex 50W-X4 (25,0 g) lavado con metanol
bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente protegido de
la luz. La mezcla resultante se dejó bajo agitación a temperatura
ambiente durante 4 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se
concentró a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de metanol,
proporcionando el compuesto puro (2) (10,1 g, 96%): p.f.: 178 a
180ºC (d). Una referencia de la literatura (Kuhn et al.,
1966) informa de un p.f. = 179ºC a 180ºC. Una segunda referencia de
la literatura (Ogura et al., 1986) informa de un p.f. =
180ºC a 182ºC.
^{1}H RMN (D_{2}O): (1,73 (dd, 1H,
J_{3a,4}=12,0 Hz, J_{3a,3e}=13,3 Hz,
H-3a), 1,87 (s, 3H, NAc), 2,14 (dd, 1H,
J_{3e,4}=5,0 Hz, H-3e),
3,33-3,48 (m, 2H), 3,52-3,58 (m,
1H), 3,62-3,68 (m, 1H), 3,65 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 3,69-3,76 (m, 1H),
3,84-3,92 (m, 2H).
Se agitó una suspensión de compuesto (2) (3,67 g,
11,3 mmoles) en cloruro de acetilo (225 ml) bajo condiciones
anhidras a temperatura ambiente protegido de la luz durante 24
horas. La solución resultante se concentró a sequedad, el residuo
se coevaporó con éter anhidro (2 x 50 ml), seguido de
coevaporaciones con benceno anhidro (2 x 50 ml). Obsérvese que en
todas las evaporaciones, la temperatura del baño maría se mantuvo a
35ºC o a una temperatura inferior. El residuo se secó al vacío,
proporcionando el compuesto puro (3) (4,8 g, 83%) en forma de
jarabe. Una referencia de la literatura (Ogura et al., 1986)
informa de un p.f. = 116ºC a 118ºC; mientras que una segunda
referencia de la literatura (Kuhn et al., 1966) informa del
compuesto (3) como de un jarabe.
^{1}H RMN (CDCl_{3}): (1,92 (s, 3H, NAc),
2,06, 2,07, 2,10, 2,14 (4s, 12H, 4 X OAc), 2,28 (dd, 1H,
J_{3a,4}=11,3 Hz, J_{3a-3e}=13,5
Hz, H-3a), 2,79 (dd, 1H,
J_{3e-4}=4,5 Hz, H-3e),
3,89 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 4,07 (dd, 1H, J_{8,9'} 5,6
Hz, J_{9',9''}=11,6 Hz, H-9'),
4,13-4,28 (m, 1H, H-5), 4,36 (dd,
1H, J_{6,7}=2,5 Hz, J_{5,6}=10,5 Hz,
H-6), 4,43 (dd, 1H, J_{8,9''}=2,9 Hz,
H-9''), 5,18 (ddd, 1H, J_{7,8}=6,7 Hz,
H-8), 5,40 (ddd, 1H, J_{4,5}=10,4 Hz,
H-4), 5,49-5,52 (m, 2H,
H-7, NH).
Se añadió por partes hidruro sódico (48 mg de una
dispersión al 60% en aceite mineral, 1,2 mmoles) a una solución
agitada de 4-hidroxibenzaldehído (121 mg, 0,98
mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (6,0 ml) bajo una atmósfera de
nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla resultante se dejó bajo
agitación a temperatura ambiente durante 25 minutos. La mezcla se
trató con compuesto (3) (500 mg, 0,98 mmoles) y la mezcla resultante
se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente
durante 52 horas. La mezcla se concentró a sequedad, el residuo se
diluyó con acetato de etilo (15 ml), y se lavó con agua (15 ml). La
fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 15 ml) y las fases
orgánicas agrupadas se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron
y el filtrado se concentró a sequedad. El residuo se cromatografió
(gel de sílice, 1:1 acetona-hexanos como
disolventes de elución), proporcionando el compuesto puro (4) (238
mg, 41%): R_{f} = 0,26 (1:1
acetona-hexanos; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): (1,95 (s, 3H, NAc),
2,07, 2,09, 2,13, 2,22 (4s, 12H, 4 X OAc), 2,32 (ut, 1H,
J_{3a,3e}=J_{3a,4}=13,2 Hz,
H-3a), 2,77 (dd, 1H, J_{3e,4}=5,0 Hz,
H-3e), 3,67 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}),
4,10-4,22 (m, 2H), 4,24-4,32 (m,
1H), 4,63 (dd, 1H, J2,0 Hz, J11,7 Hz),
4,97-5,06 (m, 1H), 5,30 (d, 1H, J12,6 Hz),
5,41 (s, 2H), 7,20 (d, 2H, J9,6 Hz, 2 X ArH), 7,86 (d, 2H,
J9,6 Hz, 2 X ArH), 9,95 (s, 1H, CHO).
Una solución de compuesto (4) (171 mg, 0,29
mmoles) en hidróxido sódico acuoso (5,0 ml de una solución 1,0 M,
5,0 mmoles) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La
mezcla resultante se enfrió hasta 0ºC y se trató con Dowex
50W-X4 lavado con metanol hasta pH 3. La mezcla se
filtró, la resina filtrada se enjuagó con agua y el filtrado se
liofilizó, proporcionando el compuesto (5) (118 mg, 99%):
R_{f} = 0,31 (5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,08 (s, 3H, NAc),
2,05-2,12 (m, 1H, H-3a), 2,84 (dd,
1H, J_{3e-4}=5,6 Hz, J_{3a,3e}=13,1 Hz,
H-3e), 3,58-3,69 (m, 2H),
3,82-3,90 (m, 3H), 3,92-4,10 (m,
1H), 4,21 (dd, 1H, J=1,9 Hz, J=11,3 Hz), 7,32 (d, 2H, J=9,6 Hz, 2 X
ArH), 7,92 (d, 2H, J=9,6 Hz, 2 X ArH), 9,84 (s, 1H, CHO).
Para las preparaciones de metil
N-acetil-\beta-D-neuraminato
(2), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-cloro-2-desoxi-D-neuraminato
(3), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-O-(4-formilfenil)-\alpha-D-neuraminato
(4) y ácido
N-acetil-2-O-(4-formilfenil)-\alpha-D-neuramínico
(5), ver los detalles experimentales para el Ejemplo 1.
A una solución agitada de compuesto (5) (50 mg,
0,10 mmoles) en una mezcla de etanol (2,0 ml) y ácido acético (0,05
ml) se añadió acetato amónico (50 mg, 0,65 mmoles) y nitrometano
(0,20 ml, 3,70 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se calentó bajo reflujo durante 30 minutos, se enfrió hasta
temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se
cromatografió (gel de sílice, 5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro cálcico como disolventes de elución),
proporcionando el compuesto puro (6) (32 mg, 68%): R_{f} = 0,50
(5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro cálcico; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,05 (s, 3H, NAc),
1,95-2,02 (m, 1H, H-3a), 2,89 (dd,
1H, J_{3e,4}5,2 Hz, J_{3a,3e}12,9 Hz,
H-3e), 3,57-3,69 (m, 2H),
3,85-4,00 (m, 4H), 4,06 (dd, 1H, J1,5 Hz,
J10,5 Hz), 7,22 (d, 2H, J=9,0 Hz, 2 X ArH), 7,64 (d,
2H, J9,0 Hz, 2 X ArH), 7,83 (d, 1H, J13,5 Hz,
H-vinílico), 8,13 (d, 1H, J13,5 Hz,
H-vinílico).
Para la preparación de metil
N-acetil-\alpha-D-neuraminato
(2), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-cloro-2-desoxi-D-neuraminato
(3), ver los detalles experimentales presentados anteriormente.
A una solución agitada de
3-metoxifenil (14,9 g, 120 mmoles) en solución
acuosa al 15% de hidróxido de potasio (500 ml) se añadió cloroformo
(100 ml). La solución resultante se calentó bajo reflujo durante 4
horas, se enfrió hasta temperatura ambiente y se trató con solución
acuosa al 10% de ácido hidroclórico hasta pH 4. La suspensión se
filtró y la torta de filtro se enjuagó con cloroformo (150 ml). La
fase cloroformo se separó, la fase acuosa se extrajo con partes
adicionales de cloroformo (3 X 50 ml) y las fases orgánicas
agrupadas se secaron con sulfato de magnesio. A continuación la
solución se filtró a través de una columna corta (gel de sílice,
cloroformo como disolvente de elución), proporcionando el compuesto
(8). La cristalización a partir de acetato de etilo proporcionó el
compuesto puro (8) (1,8 g, 10%): p.f. = 150ºC a 152ºC. Una
referencia de la literatura (Patel y Richardson, 1986) informa de
un p.f. = 154ºC a 156ºC. Referencias adicionales (Tiemann y Koppe,
1881; de Kiewiet y Stephen, 1931) informan de un p.f. = 153ºC.
^{1}H RMN (CDCl_{3}): (3,87 (s, 3H,
OCH_{3}), 6,32-6,48 (m, 2H, 2 X ArH), 7,62 (d, 1H,
J9,6 Hz, ArH), 10,1 (s, 1H, CHO).
A una solución agitada de compuesto (8) (900 mg,
5,92 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (35 ml) se añadió por
partes hidruro sódico (288 mg de una dispersión al 60% en aceite
mineral, 7,2 mmoles) bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura
ambiente. La mezcla resultante se dejó bajo agitación a temperatura
ambiente durante 2,5 horas. La mezcla se trató con compuesto (3)
(2,33 g, 4,58 mmoles) y la mezcla resultante se agitó bajo una
atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 115 horas. La
mezcla se concentró a sequedad, el residuo se diluyó con acetato de
etilo (40 ml) y se lavó con agua (40 ml). La fase acuosa se extrajo
con acetato de etilo (3 X 40 ml) y las fases orgánicas agrupadas se
secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y el filtrado se
concentró a sequedad. El residuo se cromatografió (gel de sílice,
1:1 acetona-hexanos como disolventes de elución),
proporcionando el compuesto puro (9) (1,23 g, 43%): R_{f} =
0,31 (1:1 acetona-hexanos; UV,
H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): (1,96 (s, 3H, NAc),
2,07, 2,09, 2,14, 2,18 (4 s, 12H, 4 X OAc),
2,23-2,45 (m, 1H, H-3a), 2,74 (dd,
1H, J_{3e,4}5,9 Hz, J_{3a,3e}13,7 Hz,
H-3e), 3,73 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,93 (s, 3H,
OCH_{3}), 4,12-4,22 (m, 2H),
4,25-4,30 (m, 1H), 4,60 (dd, 1H, J1,8 Hz,
J12,6 Hz), 4,96-5,08 (m, 1H),
5,28-5,47 (m, 3H), 6,65 (d, 1H, J3,0 Hz,
ArH), 6,74 (dd, 1H, J3,0 Hz, J9,6 Hz, ArH), 7,82 (d,
1H, J9,6 Hz, ArH), 10,33 (s, 1H, CHO).
Se agitó una solución de compuesto (9) (751 mg,
1,20 mmoles) en solución acuosa de hidróxido sódico (20,0 ml de una
solución 1,0 M, 20,0 mmoles) a temperatura ambiente durante 2 horas.
La mezcla resultante se enfrió hasta 0ºC y se trató con Dowex
50W-X4 lavado con metanol hasta pH 3. La mezcla se
filtró, la resina filtrada se enjuagó con agua y el filtrado se
liofilizó, proporcionando el compuesto (10) (288 mg, 54%):
R_{f} = 0,34 (5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,08 (s, 3H, NAc),
2,04-2,12 (m, 1H, H-3a), 2,87 (dd,
1H, J_{3,4}5,6 Hz, J_{3a,3e}15,0 Hz,
H-3e), 3,60-3,68 (m, 2H),
3,81-3,95 (m, 4H), 3,93 (s, 3H, OCH_{3}), 4,23
(dd, 1H, J3,7 Hz, J11,2 Hz), 6,85 (dd, 1H,
J5,7 Hz, J11,4 Hz, ArH), 6,97 (d, 1H, J5,7 Hz,
ArH), 7,75 (d, 1H, J11,4 Hz, ArH), 10,0 (s, 1H, CHO).
En la figura 9 se muestra el esquema de reacción
global. Para la preparación de metil
N-acetil-\beta-D-neuraminato
(2), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-cloro-2-desoxi-D-neuraminato
(3), ver los detalles experimentales presentados anteriormente.
Para las preparaciones de
4-hidroxi-2-metoxibenzaldehído
(8), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-O-(4-formil-3-metoxifenil)-\alpha-D-neuraminato
(9) y ácido
N-acetil-2-O-(4-formil-3-metoxifenil)-\alpha-D-neuramínico
(10), ver los detalles experimentales presentados en el Ejemplo
3.
A una solución agitada de compuesto (10) (120 mg,
0,27 mmoles) en una mezcla de etanol (4,8 ml) y ácido acético (0,12
ml) se añadió acetato amónico (120 mg, 1,56 mmoles) y nitrometano
(0,48 ml, 8,86 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se calentó bajo reflujo durante 30 minutos, se enfrió hasta
temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se
cromatografió (gel de sílice, 5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio como disolventes de elución),
proporcionando el compuesto puro (11) (48 mg, 36%): R_{f}
= 0,64 (5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,06 (s, 3H, NAc),
1,98-2,03 (m, 1H, H-3a), 2,88 (dd,
1H, J_{3e,4}5,1 Hz, J_{3a3e}14,0 Hz,
H-3e), 3,59-3,68 (m, 2H),
3,75-4,00 (m, 4H), 3,95 (s, 3H, OCH_{3}), 4,11
(dd, 1H, J2,5 Hz, J11,4 Hz), 6,82 (d, 1H,
J10,8 Hz, ArH), 6,95 (br s, 1H, ArH), 7,54 (d, 1H,
J10,8 Hz, ArH), 8,00 (d, 1H, J13,5 Hz,
H-vinílico), 8,22 (d, 1H, J13,5 Hz,
H-vinílico).
Para la preparación de metil
N-acetil-\beta-D-neuraminato
(2), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-cloro-2-desoxi-D-neuraminato
(3), ver los detalles experimentales presentados anteriormente.
A una solución agitada de vanillina
(4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído)
(273 mg, 1,8 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (12,0 ml) se
añadió por partes hidruro sódico (86 mg de una dispersión al 60% en
aceite mineral, 2,2 mmoles) bajo una atmósfera de nitrógeno a
temperatura ambiente. La mezcla resultante se dejó bajo agitación a
temperatura ambiente durante 2,5 horas. La mezcla se trató con
compuesto (3) (700 mg, 1,38 mmoles) y la mezcla resultante se agitó
bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 68
horas. La mezcla se concentró a sequedad, el residuo se diluyó con
acetato de etilo (25 ml) y se lavó con agua (25 ml). La fase acuosa
se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml) y las fases orgánicas
agrupadas se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y el
filtrado se concentró a sequedad. El residuo se cromatografió (gel
de sílice, cloroformo, seguido de acetato de etilo como disolvente
de elución), proporcionando el compuesto puro (12) (322 mg, 38%):
R_{f} = 0,64 (1:8 acetona-acetato de etilo;
UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): (1,94 (s, 3H, NAc),
2,08, 2,09, 2,14, 2,19 (4s, 12H, 4 X OAc), 2,33 (ut, 1H,
J_{3a,3e}=J_{3a,4}=13,5 Hz,
H-3a), 2,82 (dd, 1H, J_{3e,4}5,4 Hz,
H-3e), 3,70 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,92 (s, 3H,
OCH_{3}), 4,10-4,18 (m, 2H),
4,23-4,31 (m, 1H), 4,52 (br d, 1H, J11,4 Hz),
4,97-5,12 (m, 1H), 5,20-5,28 (m,
1H), 5,30-5,40 (m, 2H), 7,32 (d, 1H, J9,0
Hz, ArH), 7,41-7,48 (m, 2H, 2 X ArH), 9,92 (s, 1H,
CHO).
Una solución de compuesto (12) (236 mg, 0,38
mmoles) en solución acuosa de hidróxido sódico (6,0 ml de una
solución 1,0 M, 6,0 mmoles) se agitó a temperatura ambiente durante
160 minutos. La mezcla resultante se enfrió hasta 0ºC y se trató
con Dowex 50W-X4 lavada con metanol hasta pH 3. La
mezcla se filtró, la resina filtrada se enjuagó con agua y el
filtrado se liofilizó, proporcionando el compuesto (13) (152 mg,
91%): R_{f} = 0,46 (5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,08 (s, 3H, NAc),
2,03-2,12 (m, 1H, H-3a), 2,92 (dd,
1H, J_{3e,4}5,2 Hz, J_{3a,3e}13,9 Hz,
H-3e), 3,54-3,70 (m, 2H),
3,80-4,20 (m, 5H), 3,92 (s, 3H, OCH_{3}), 7,48 (d,
1H, J9,6 Hz, ArH), 7,52-7,60 (m, 2H, 2 X
ArH), 9,82 (s, 1H, CHO).
Para la preparación de metil
N-acetil-\beta-D-neuraminato
(2), metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-cloro-2-desoxi-D-neuraminato
(3), ver los detalles experimentales presentados anteriormente.
Para la preparación de ácido metil
N-acetil-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-O-(4-formil-2-metoxifenil)-\alpha-D-neuramínico
(12) y ácido
N-acetil-2-O-(4-formil-2-metoxifenil)-\alpha-D-neuramínico
(13), ver los detalles experimentales presentados en el Ejemplo
5.
A una solución agitada de compuesto (13) (25 mg,
0,06 mmoles) en una mezcla de etanol (2,0 ml) y ácido acético (0,02
ml) se añadió acetato amónico (24 mg, 0,32 mmoles) y nitrometano
(0,10 ml, 1,9 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción
se calentó bajo reflujo durante 30 minutos, se enfrió hasta
temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se
cromatografió (gel de sílice, 5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio como disolventes de elución),
proporcionando el compuesto puro (14) (19 mg, 70%): R_{f}
= 0,64 (5:2:1 acetato de
etilo-metanol-solución acuosa al
0,02% de cloruro de calcio; UV, H_{2}SO_{4}).
^{1}H RMN (D_{2}O): (2,07 (s, 3H, NAc),
1,97-2,04 (m, 1H, H-3a), 2,87 (dd,
1H, J_{3e,4}5,1 Hz, J_{3a,3e}14,0 Hz,
H-3e), 3,54-3,69 (m, 2H),
3,81-4,05 (m, 5H), 3,93 (s, 3H, OCH_{3}), 7,45 (d,
1H, J9,6 Hz, ArH), 7,48-7,55 (m, 2H, 2 X
ArH), 8,02 (d, 1H, J13,3 Hz, H-vinílico),
8,20 (d, 1H, J13,3 Hz, H-vinílico).
Claims (23)
1. Compuesto con la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que por lo menos dos de entre
R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son H, y el resto son, cada uno,
R_{6}, OR_{6}, Cl, Br, I, F o
NO_{2};
R_{3} es -CH=CHNO_{2},
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{6} es H, C(CH_{3})_{3},
CH(CH_{3})_{2},
CH_{2}CH(CH_{3})_{2},
CH(CH_{3})(CH_{2})_{0-3}CH_{3}
o (CH_{2})_{0-3}CH_{3}; o una sal de
los mismos.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} y R_{2} son H.
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} y R_{4} son H.
4. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} y R_{5} son H.
5. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{2} y R_{4} son H.
6. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{2} y R_{5} son H.
7. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{4} y R_{5} son H.
8. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1}, R_{2} y R_{5} son H.
9. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1}, R_{4} y R_{5} son H.
10. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{2}, R_{4} y R_{5} son H.
11. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son H.
12. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que R_{3} es
-CH=CHNO_{2}.
13. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que R_{3} es:
14. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que R_{3} es:
15. Compuesto según la reivindicación 13 ó 14,
en el que R_{6} es H.
16. Compuesto según la reivindicación 13 ó 14,
en el que R_{6} es -CH(CH_{3})_{2}.
17. Compuesto según la reivindicación 13 ó 14,
en el que R_{6} es
-(CH_{2})_{0-3}CH_{3}.
18. Compuesto según la reivindicación 17, en el
que R_{6} es CH_{3}.
19. Compuesto según la reivindicación 17, en el
que R_{6} es C_{2}H_{5}.
20. Compuesto según la reivindicación 17, en el
que R_{6} es C_{3}H_{7}.
21. Compuesto según la reivindicación 17, en el
que R_{6} es C_{4}H_{9}.
22. Composición que comprende un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador.
23. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 21 en la detección de un enzima
sialidasa.
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