ES2253835T3 - Polipeptidos de cadena unica que contienen troponina i y troponina c. - Google Patents
Polipeptidos de cadena unica que contienen troponina i y troponina c.Info
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Abstract
Un polipéptido de cadena única, el cual contiene una troponina I cardíaca en el término N, unida mediante una secuencia de un péptido de empalme, a una troponina C cardíaca en el término C, en donde la secuencia del péptido
Description
Polipéptidos de cadena única que contienen
troponina I y troponina C.
Esta invención se refiere a polipéptidos de
cadena única expresados recombinantemente, los cuales contienen
subunidades de troponina I y C, y a sus correspondientes secuencias
genéticas.
El temprano y exacto dictamen de la sospecha de
un infarto de miocardio agudo depende críticamente de la sensible y
específica detección y cuantificación en sangre, suero o plasma de
los componentes intracelulares liberados del músculo cardíaco, con
el fin de distinguir un suceso potencialmente letal que requiere
medidas de emergencia a partir de condiciones no amenazantes para
la vida, tales como angina y dolor no cardíaco de pecho tal como
la dispepsia. Los cambios electrocardiográficos tempranos no son
adecuadamente específicos ni sensibles, por lo que la profesión
médica ha puesto su confianza, para un diagnóstico temprano, en los
marcadores bioquímicos en suero, de posibles daños en el tejido
cardíaco. Inicialmente se emplearon marcadores en suero de creatina
quinasa (CK) y específicamente la isoforma cardíaca
CK-MB, y a continuación la mioglobina como el
indicador temprano más sensible de la lesión cardíaca. Más
recientemente, el complejo troponina cardíaca y sus subunidades han
venido siendo preferidas como marcadores de la lesión miocárdica
debido a su alta especificidad. Estos ensayos en combinación,
juntamente con otros marcadores de la lesión muscular esquelética,
proporciona un alto grado de exactitud en el diagnóstico. Si se
efectúa en la sala de urgencias, un temprano y exacto diagnóstico
de la lesión de miocardio, esto ofrece una gran ventaja para la
víctima con sospecha de un ataque de corazón.
Los ensayos de diagnóstico empleando marcadores
cardíacos están descritos por ejemplo en las patentes U.S. n^{os}
5.604.105 y 5.290.678. Estos y otros procedimientos ofrecen la
rapidez de diagnosticar el infarto de miocardio en el marco de la
sala de urgencias y ofrecen un importante beneficio médico para los
pacientes. Los ensayos de diagnóstico en los cuales el nivel de
subunidades de troponina o complejos, se mide en fluidos
corporales, utilizan frecuentemente subunidades purificadas de
troponina o complejos como antígenos para la preparación de
anticuerpos empleados en el procedimiento de ensayo, así como
también las subunidades purificadas o complejos empleados como
controles y calibradores en la realización de los ensayos. Los
calibradores del ensayo se emplean para preparar series de
diluciones mediante las cuales se prepara una curva estándar a
través del margen operativo de un ensayo: los controles del ensayo
se emplean para confirmar que un ensayo es debidamente operativo al
asegurar que el valor ensayado de muestras predeterminadas, cae
dentro de un margen aceptable alrededor de sus valores señalizados.
Con el fin de calibrar el ensayo adecuadamente, los controles de
troponina y calibradores deben permanecer estables y en una forma
que sea inmunodetectable por el anticuerpo.
La patente
WO-A-97/39132 describe un ensayo
para medir niveles de troponina en sangre empleando una proteína de
fusión recombinante que contiene la troponina I cardíaca humana y la
troponina C cardíaca humana expresadas como una proteína única, en
donde el N-terminal es la troponina I cardíaca
humana, y el C-terminal es la troponina C cardíaca
humana.
La troponina es una proteína del músculo,
íntegramente implicada en la regulación, dependiente del calcio, de
la contracción del músculo. La troponina existe tanto en el músculo
cardíaco como en el músculo esquelético, como un complejo de tres
subunidades unidas no covalentemente, las isoformas de la troponina
C, la subunidad de unión al calcio, troponina I, la unidad
inhibidora, y la troponina T, la cual localiza el complejo de
troponina sobre la tropomiosina. In vitro, en las
condiciones adecuadas, las subunidades de troponina se asociarán
espontáneamente para formar complejos unidos no covalentemente, p.
ej., la troponina I y la C, y la troponina I, la C y la T. Existen
diferencias entre las secuencias de aminoácidos del músculo cardíaco
y las isoformas de troponina del músculo esquelético.
Después de una lesión del músculo cardíaco y la
necrosis, la troponina se vierte desde el tejido cardíaco al
torrente circulatorio, en donde su detección sensible puede ayudar a
diagnosticar un ataque cardíaco. Las diferencias en las secuencias
de aminoácidos entre las isoformas del músculo cardíaco y el músculo
esquelético de las subunidades de troponina se aprovechan en los
ensayos de diagnóstico que miden específicamente la isoforma
cardíaca de las subunidades y complejos de troponina. Hay
disponibles ensayos de diagnóstico para la troponina I
cardíaca.
Sin embargo, la troponina I es inherentemente de
poca estabilidad estructural, y está sujeta a una escisión
proteolítica mediante las proteasas presentes en las muestras
biológicas. Un estándar de troponina I preparado en una matriz
fluida corporal, está sujeta por lo tanto a una alteración
conformacional y degradación y es inadecuada como calibrador o
control. Además, los complejos de troponina inherentemente más
estables, son conocidos por disociarse durante el almacenamiento,
con lo que se vuelven susceptibles a la degradación proteolítica.
En el caso de la troponina I, debe formarse el complejo con
troponina C con el fin de mantener su estructura conformacional y
estabilidad; sin embargo, debido a la naturaleza de la afinidad de
las subunidades en el complejo, la fracción de troponina I presente
en forma de un complejo es dependiente de la concentración. Esto
limita su utilidad como calibrador o control del ensayo. La
extensión de las interacciones entre las subunidades puede
calcularse a partir de la constante de disociación K_{d} [por
ejemplo, como se describe en Biochemistry ("Bioquímica") 33:
12729 (1994)]. Mediante el cálculo y mediciones experimentales,
solamente una cantidad limitada de troponina I está unida a la
troponina C, especialmente por encima del margen que se encontraría
en muestras de suero del paciente, y por lo tanto los niveles a los
cuales los calibradores y controles deberían utilizarse. Por
ejemplo, a 50 ng/ml, el margen superior de la mayoría de ensayos de
troponina I, solamente un 10% de la troponina I está unida a la
troponina C cuando las dos subunidades están presentes en un ratio
de 1:1. Con hasta 10 veces más troponina C que troponina I, y en
presencia de cationes divalentes, una reivindicación (Larue et
al., patente U.S. 5.583.200) de la estabilidad del complejo a
baja temperatura fue mínima, a saber, "un día por lo menos".
Manteniendo mayores concentraciones de complejo, aumenta el grado
de asociación; sin embargo, después de la dilución al nivel
necesario para calibrar un ensayo, las subunidades se disocian y se
vuelven inmunológicamente inestables. A continuación, la disociación
somete las subunidades a un ataque proteolítico, reduciendo además
la utilidad de dichos calibradores y controles.
Por lo tanto, existe una necesidad de disponer de
calibradores y controles estables de troponina que satisfagan las
necesidades de la industria.
Han sido descritas numerosas preparaciones de
troponina tanto de fuentes naturales como de fuentes recombinantes,
que contienen troponina I juntamente con troponina C. Malnic y
Reinach (1994, Eur. J. Biochem., v.222, pp. 49-54)
obtuvieron un complejo recombinante in vivo mediante la
clonación de todas las subunidades de troponina del músculo
esquelético de tres pollos, en uno o más plásmidos de expresión.
Dentro del vector de expresión cada gen de troponina tenía su
propio promotor, y las proteínas fueron expresadas dentro de la
bacteria como subunidades individuales de troponina, las cuales
formaron a continuación complejos dentro de la bacteria.
Fujita-Becker et al., (1993, J. Biochem.,
v.114, pp. 438-444) describieron la reconstitución
del complejo de troponina esquelético del conejo, a partir de
subunidades recombinantes expresadas en E. coli. No se ha
demostrado que alguno de estos productos recombinantes tuviera una
estabilidad adecuada para emplear como estándar o calibrador de un
ensayo de diagnóstico. Como se ha mencionado más arriba, incluso los
complejos de subunidades de troponina no son estables y no
permanecerán unidos juntos en solución, en cualquier gran
extensión.
Como será evidente más adelante, un objeto
principal de la presente invención, es el de proporcionar una
preparación estable de troponina para ensayo y otros empleos, la
cual contenga troponina I y troponina C sobre una cadena única de
polipéptido, preparada como una construcción recombinante y
expresada en un sistema de expresión bacteriano como un polipéptido
único. La presente invención se distingue por las subunidades de
troponina y sus fragmentos que han sido químicamente reticulados
para estudios bioquímicos empleando métodos tales como el
reticulado de carbodiimida y la química del fotorreticulado, por
ejemplo las descritas por Jha et al., (1996, Biochemistry,
vol. 35, pp. 11026-11035). Kobayashi et al.,
(1996, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1294, pp.
25-30) y Kobayashi et al., (1995,
Biochemistry, vol. 34, pp. 10946-10952). En estas
referencias, se reticularon químicamente fragmentos específicos de
diferentes proteínas de troponina con el fin de investigar las
conformaciones de las subunidades y sus interacciones naturales en
complejos de troponina.
Por lo tanto, existe la necesidad de un material
de troponina el cual satisfaga los requerimientos de estabilidad y
facilidad de preparación y purificación, que pueda emplearse como un
antígeno y como controles y calibradores en los ensayos de
troponina. Como no existe ningún control o calibrador universalmente
aceptado para la troponina, no es posible estandarizar el ensayo
entre laboratorios o incluso instrumentos, pues cada ensayo
particular de troponina juntamente con sus controles y
calibradores, produce resultados únicos para dicho laboratorio y la
selección de los componentes del ensayo. Por lo tanto, es por el
momento imposible proporcionar márgenes normales y anormales que
sean reconocidos por todos los laboratorios y médicos. Existe pues
la necesidad de poder disponer de calibradores y controles
universales que puedan emplearse en todos los instrumentos de ensayo
comerciales disponibles.
Se ha descubierto ahora que un polipéptido de
cadena única que contiene la troponina I cardíaca humana y la
troponina C cardíaca humana, es estable y tiene utilidad para la
finalidad antes mencionada. Además, el producto debe poderse
obtener fácilmente por una persona experta. Esta facilidad de
producción maximiza la reproducibilidad de los productos de la
invención.
Un objetivo principal de la presente invención es
el de proporcionar un polipéptido de cadena única que contenga
troponina I y troponina C. La presencia de troponina I y troponina C
en la misma cadena polipeptídica confiere una estabilidad
conformacional e inmunoestabilidad al producto. El polipéptido de
cadena única puede incluir preferentemente una secuencia de empalme
interpuesta entre las secuencias de troponina I y troponina C. La
secuencia del péptido de empalme se escoge de manera que no
interfiera con la estructura terciaria del producto y por lo tanto
sus características antes mencionadas. Un polipéptido de cadena
única en el cual la troponina I y la troponina C están unidas
opcionalmente a través de un péptido de empalme, proporciona un
material estable, reproducible y fácilmente purificable para el
desarrollo de ensayos de troponina, un antígeno para la preparación
de anticuerpos de troponina, así como material para emplear como
controles y calibradores para los ensayos de troponina.
El polipéptido de cadena única de la presente
invención se prepara más fácilmente mediante técnicas recombinantes,
mediante la construcción de una clonación replicable o vehículo de
expresión tal como un plásmido que sea portador de la secuencia
genética para el polipéptido de cadena única, y transformando una
célula hospedadora, tal como la E. coli con el vehículo o
plásmido, y expresando el polipéptido mediante la célula
hospedadora. La construcción de cadena única contiene de
preferencia una secuencia peptídica de empalme entre las secuencia
de aminoácidos de la troponina I y la troponina C, introduciendo
tales secuencias por medios recombinantes. Pueden hacerse ciertas
modificaciones en la secuencia genética de las moléculas de
troponina, con o sin cambios en la consiguiente secuencia de
aminoácidos del polipéptido, con el fin de mejorar la expresión del
polipéptido en la célula hospedadora. Estos cambios no alteran la
utilidad del polipéptido de cadena única para emplear para los
fines antes mencionados.
Otro objeto de la presente invención es el de
proporcionar una secuencia genética para un polipéptido de cadena
única que contenga las secuencias genéticas de troponina I y
troponina C. La secuencia genética puede también incluir la
secuencia genética de un empalme interpuesto entre las secuencias
genéticas de troponina I y troponina C. Una célula hospedadora
puede ser transformada con el clonado replicable o el vehículo de
expresión que contiene la secuencia genética antes mencionada.
Como se ha mencionado más arriba, pueden hacerse
ciertos cambios en la secuencia genética de las troponinas con el
fin de facilitar la expresión en la célula hospedadora.
Otro objeto de la presente invención es el de
proporcionar una célula hospedadora que contenga una clonación o
vehículo de expresión o plásmido que sea portador de la secuencia
genética para una cadena polipeptídica de cadena única que contenga
las secuencias genéticas de la troponina I y troponina C, y sea
capaz de expresar un polipéptido de cadena única que contenga la
troponina I y la troponina C.
Estos y otros aspectos de la presente invención
se apreciarán mejor con referencia a los siguientes dibujos y
descripción detallada.
La figura 1 representa el ADN y la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente) de un
polipéptido de cadena única que contiene la troponina I y la
troponina C separadas por un péptido de empalme de 19 radicales
aminoácidos. Los nucleótidos 1 hasta el 630 contienen la troponina
I, los nucleótidos 631 hasta el 687 contienen la secuencia del
péptido de empalme, y los nucleótidos 688 hasta el 1170 contienen
la de la troponina C.
La figura 2 representa los resultados de los
ensayos hora a hora de la troponina I de un paciente sometido a un
ataque cardíaco. La troponina I se midió empleando los ensayos
Stratus(R), Access(R) y Opus(R).
La figura 3 representa la estabilidad en el
tiempo, a 4ºC de diferentes preparaciones conteniendo troponina I:
troponina I recombinante, un complejo no covalente de troponina I y
troponina C, y un polipéptido de cadena única de esta invención que
contiene troponina I y troponina C.
La medición en el torrente circulatorio de la
proteína troponina asociada al músculo cardíaco, ha demostrado ser
un temprano y específico indicador de la sospecha de un infarto
agudo de miocardio. Como tales, se han desarrollado y están
desarrollándose, métodos para detectar rápida y exactamente la
troponina y sus subunidades en la sangre, para el diagnóstico del
ataque de corazón en una situación de emergencia, e incontables
vidas han sido y serán salvadas como resultado de los mismos. Sin
embargo, con el fin de desarrollar ensayos de diagnóstico exactos y
fiables, y para asegurar la validez de estos ensayos empleando
controles y calibradores de ensayo, la disponibilidad de controles
y calibradores estables de troponina cardíaca humana, de alta
calidad, es crítica para el control de calidad y fines analíticos,
así como antígenos de troponina para generar anticuerpos para
ensayos. Además, aunque se han hecho y se están desarrollando
ensayos comerciales para la troponina, estos ensayos dan diferentes
resultados sobre las mismas muestras. Los varios instrumentos y
metodologías de ensayo para la troponina en combinación con la
ausencia de un estándar universal para la troponina han impedido el
desarrollo de márgenes normales y anormales ampliamente aceptados
para niveles de troponina, obscureciendo así la interpretación de
los resultados del laboratorio e impidiendo la investigación clínica
entre laboratorios que implicaba los marcadores cardíacos. Estas
deficiencias pueden remediarse mediante la disponibilidad de
controles y calibradores universales de troponina. Los controles y
calibradores universales serían detectables por todos los ensayos
disponibles y serían empleados para estandarizar la lectura
proporcionada por todos los ensayos de troponina.
Para la utilidad como calibradores y controles
para ensayos de troponina, la presente invención mejora la
inherente inestabilidad conformacional y la sensibilidad
proteolítica de la troponina I libre, y la inestabilidad de
asociación del complejo troponina I - troponina C. La mejora
consiste en un polipéptido de cadena única que contiene la
troponina I cardíaca y la troponina C cardíaca humanas. Las
subunidades de troponina están así covalentemente empalmadas a
través de un enlace peptídico y residen en el mismo polipéptido
lineal. Este polipéptido proporciona un estable complejo troponina
I-troponina C para satisfacer las necesidades de la
industria. El polipéptido de cadena única puede prepararse mediante
técnicas recombinantes, y de preferencia incluye una secuencia
polipeptídica de empalme interpuesta entre las secuencias de
troponina I y troponina C. La longitud y secuencia de esta
secuencia de empalme está limitada solamente a que no interfiera con
la inmunodetectabilidad del producto y sus otras aplicaciones antes
mencionadas.
Por ejemplo, una versión del polipéptido de
cadena única troponina I-troponina C, puede contener
la secuencia de troponina I en la parte N-terminal
del polipéptido, con el término C de la secuencia de troponina I
acoplado a una unión peptídica con el término N de la secuencia de
troponina C. En una segunda y preferida versión en la cual, una
secuencia del péptido de empalme está interpuesta entre las
secuencias de aminoácidos de la troponina I y la troponina C, una
disposición preferente comprende la secuencia de troponina I en la
parte del terminal N del polipéptido, su término C acoplado a un
enlace peptídico con el término N del péptido de empalme, y el
término C del péptido del empalme acoplado a continuación en un
enlace peptídico con el término N de la secuencia de la troponina
C. Un ejemplo de esta construcción es la secuencia de aminoácidos
representados en SEQ ID NO:4. En este ejemplo, la secuencia de
aminoácidos del empalme está representada en SEQ ID NO:2. Contiene
19 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos en el ejemplo
anterior corresponden a las secuencias de nucleótidos del ADNc que
codifica estos polipéptidos. La secuencia genética en el primer
ejemplo contiene la secuencia genética de la troponina I en el
extremo 5' del ADNc, su extremo 3' seguido inmediatamente por el
extremo 5' de la secuencia genética de la troponina C. En la
versión preferida en donde un empalme está interpuesto entre las
secuencias de troponina I y troponina C, el extremo 5' de la
secuencia de ADNc empieza con la secuencia genética de la troponina
I, su extremo 3' seguido por el extremo 5' de la secuencia genética
del empalme opcional interpuesto, y su extremo 3' seguido por el
extremo 5' de la secuencia genética de la troponina C, terminando en
el extremo 3' del ADNc. En el ejemplo específico anterior, la
secuencia genética está representada en SEQ ID NO:3. La secuencia
de ADNc del empalme está representada en SEQ ID NO:1.
Como se ha descrito más arriba, la selección de
la longitud y la secuencia específica del polipéptido de empalme
opcional está limitada solamente en que no debe interferir con la
inmunodetectabilidad de la troponina I y troponina C sobre el
polipéptido de cadena única. Se cree que con una secuencia de
empalme adecuada, los segmentos de troponina I y troponina C del
polipéptido de cadena única están asociados entre sí de una manera
similar a como lo hacen en un complejo no covalente troponina
I-troponina C y las uniones de las subunidades en la
cadena única del polipéptido mantienen la conformación de la
asociación y así la consistente
inmuno-detectabilidad de la troponina. Además, un
complejo troponina I-troponina C estabilizado de
esta manera es menos susceptible al ataque proteolítico en
presencia de fluidos corporales y otros componentes. Dentro de esta
versión preferida, se prefiere un empalme de aproximadamente 6 a
aproximadamente 50 aminoácidos (y un correspondiente número de
codones en el ADNc), para la facilidad y economía de la
preparación.
Se prefiere producir el polipéptido de cadena
única troponina I-troponina C de esta invención con
un segmento de empalme relativamente corto, debido a que con estos
productos hay poca o ninguna interferencia con la estructura
terciaria del producto. Por ello hay poca o ninguna interferencia
con la disponibilidad de epitopos para la reacción con anticuerpos
fácilmente disponibles. Ya es sabido que en el complejo normal
troponina I-troponina C el terminal amino del
componente troponina I está completamente próximo al terminal
carboxilo del componente troponina C. Sin embargo, si estas
unidades forman sin un empalme, esta proximidad puede ser estorbada,
y la cepa resultante sobre la estructura terciaria ocasiona que
algunos epitopos se vuelvan no disponibles para la reacción. De
manera similar, los empalmes que son demasiado largos pueden
modificar la estructura terciaria o el propio empalme puede
esconder algunos de los epitopos.
Por ejemplo, una útil secuencia polipeptídica de
empalme es (Gly_{4}Ser)_{3}, la cual proporciona una
secuencia peptídica flexible que permite que las dos subunidades se
asocien. Con el fin de construir la secuencia genética con un
empalme, están presentes 2 codones adicionales en cada extremo del
empalme, los cuales son necesarios con el fin de proporcionar
sitios de restricción únicos para crear la construcción genética del
polipéptido de cadena única deseado. En un ejemplo, los codones
correspondientes a Thr-Ser en el termino N del
empalme y a Ala-Cys en el término C, pueden ser
incluidos. Así, puede preparase un empalme adecuado de 19 radicales
(secuencia genética SEQ ID NO:1 y péptido SEQ ID NO:2).
Los métodos recombinantes pueden emplearse para
preparar la secuencia de ADN que contiene las subunidades de
troponina y la secuencia opcional de empalme y para introducir la
secuencia en una célula hospedadora, y se emplean métodos de
expresión estándar, para expresar y purificar el polipéptido
recombinante. Estos métodos son similares a los empleados para la
preparación de las proteínas de fusión tales como se describe para
las dos enzimas de levaduras metabólicamente copuladas, citrato
sintasa y malato deshidrogenasa (Lindbladh et al.,
Biochemistry ("Bioquímica")
33:11692-11698[1994]); en la preparación de
polipéptidos de cadena única que contienen el sitio de unión del
antígeno de anticuerpos (patente U.S. 4.946.778): y la preparación
de proteínas de fusión para exponer el fago (patente U.S.
5.516.637). Estos métodos son conocidos por el experto.
En el caso en el cual no se desea ninguna
secuencia de empalme, las secuencias de ADNc de la troponina I y
troponina C pueden unirse a través de técnicas adecuadas ya
conocidas en la técnica, tales como el método SOEing empleando
pares de cebadores parcialmente solapados, por ejemplo, como se
describe por Hu et al., [1996, Protein Expression and
Purification ("Expresión y purificación de proteínas")
7:289-293] en el cual codones raros en la troponina
T cardíaca humana se reemplazan con codones principales sinónimos.
Estos métodos son también conocidos por el experto en la
técnica.
La construcción recombinante se prepara como un
vehículo o plásmido de expresión o clonación, y se introduce en una
célula hospedadora para la expresión. Métodos para la expresión de
proteínas recombinantes son ya conocidos en la técnica. Una vez
expresado el polipéptido de cadena única, puede purificarse mediante
métodos estándar de purificación de proteínas.
Además, las secuencias genéticas de la troponina
I y troponina C pueden ser modificadas con el fin de mejorar la
expresión del polipéptido de cadena única en un sistema de expresión
bacteriano. Estas alteraciones genéticas pueden alterar o no, la
secuencia de amino ácidos del polipéptido. Como ya es conocido en la
técnica, ciertos codones raros presentan en un vehículo de
expresión, una reducida eficiencia de expresión, y cambiando estos
codones en codones sinónimos especiales, se mejora la expresión
bacteriana (por ejemplo como el descrito para la troponina I en la
solicitud copendiente serie nº 08/862.613, registrada el 23 de Mayo
de 1997, y métodos de Hu et al., supra. Además, la inclusión
de una corta secuencia de nucleótidos en el extremo 5' del ADNc de
la troponina I (tal como el descrito en Ser. nº 08/ 862.613),
aumenta la expresión bacteriana, y proporciona un polipéptido de
troponina I con seis aminoácidos N-terminales. Estas
modificaciones opcionales para aumentar la expresión bacteriana no
disminuyen la utilidad del polipéptido de cadena única para las
finalidades antes mencionadas.
Comercialmente, se dispone de diferentes ensayos
de troponina I, todos los cuales operan empleando diferentes
formatos, instrumentos y controles de ensayo y calibradores. Por
ejemplo, el ensayo Stratus(R) para troponina I, de Dade,
utiliza un anticuerpo de captura monoclonal y un anticuerpo
monoclonal como detector. El material calibrador/control es un
péptido N-terminal de la troponina I cardíaca
humana. El margen operativo del ensayo es de 0-50
ng/ml, con una sensibilidad de 0,6 ng/ml y un valor de separación de
1,5 ng/ml. El ensayo Access (R) para troponina I de Sanofi utiliza
también un anticuerpo de captura monoclonal y un anticuerpo
monoclonal como detector, pero su calibrador/control es un complejo
de troponina I y troponina C cardíaca nativa. Este ensayo tiene un
margen operativo de 0-50 ng/ml, una sensibilidad de
0,03 ng/ml, y un valor de separación de 0,1 ng/ml. El ensayo Opus
(R) para troponina I de Behring utiliza anticuerpos policlonales
tanto para la captación como para la detección, tiene un margen de
0-300 ng/ml, una sensibilidad de 1 ng/ml y un valor
de separación de 2 ng/ml.
Debido a las diferencias en la metodología y
componentes entre los ensayos antes mencionados, los
calibradores/controles no pueden emplearse intercambiablemente
entre los ensayos. Por ejemplo los calibradores/controles del ensayo
Stratus(R), que emplean un péptido
N-terminal de la troponina I cardíaca, no son
detectables en los ensayos Access(R) y Opus(R),
puesto que los últimos anticuerpos de ensayos no están dirigidos a
la misma porción del péptido N-terminal de la
troponina I empleada para los controles/calibradores. Por otra
parte, los controles del ensayo Access(R) los cuales son
detectables en el ensayo Access(R) con el nivel más alto de
sensibilidad y un valor de separación de todos los tres ensayos,
medición aproximadamente cuatro veces más alta en el ensayo
Opus(R). En contraste, los controles del ensayo
Opus(R) se detectan muy pobremente mediante el ensayo
Stratus(R). Estos resultados indican que no es posible
intercambiar los calibradores/controles de ensayo, entre ensayos, y
que los valores proporcionados por los controles de un ensayo de
fabricante pueden solamente emplearse en la interpretación de
ensayos efectuados con este ensayo. Esta pobre relación se muestra
además mediante la gráfica de la figura 2, la cual representa una
serie de niveles de troponina I medidos en un paciente que sufre un
ataque de corazón, empleando los ensayos Access(R),
Stratus(R) y Opus(R). Como se muestra, aunque todos
los tres ensayos muestran una subida evidente, a continuación caen
en niveles de troponina entre la primera y sexta hora, siendo los
valores absolutos de troponina I en cada momento, muy
diferentes.
Estas amplias diferencias se atribuyen a la
individualidad de los ensayos y sus calibradores/controles, como se
han elaborado más arriba.
Un polipéptido de cadena única de esta invención,
que contiene troponina I y troponina C puede emplearse también para
la purificación de proteínas y otras substancias incluyendo los
anticuerpos con una afinidad para la unión de troponina I ó
troponina C. Por ejemplo, el polipéptido de cadena única de la
presente invención puede unirse covalentemente a una matriz
insoluble o polímero y situado en una columna cromatográfica. Un
extracto celular o tejido que se sospecha contiene un material que
se une a la troponina, o una preparación de anticuerpo generada
contra la troponina, puede pasarse a través de la columna, en la
cual se adherirá al polipéptido covalentemente unido. Después de
lavar la matriz, el material adherente puede ser eluido empleando
una solución concentrada de sal, un agente caotrópico, u otros
métodos estándar empleados en la purificación de proteínas.
Un polipéptido de cadena única de la presente
invención puede también ser útil para la preparación de anticuerpos
monoclonales o policlonales anti troponina, empleando métodos
estándar de inmunización animal o preparación de hibridomas.
El polipéptido de cadena única de la presente
invención, que contiene troponina I y troponina C tiene utilidad
para la preparación de ensayos sensibles de troponina y para la
calibración de dichos ensayos. Como se verá a partir de los
siguiente ejemplos, no limitativos, el polipéptido de cadena única
presenta superiores prestaciones cuando se la compara con otros
calibradores de troponina.
El ADNc de la troponina I cardíaca humana, y la
troponina C se clonaron mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) empleando cebadores designados por la secuencia del
ADNc de la troponina I cardíaca publicada (Vallins et al.,
FEBS Letters 270, 57-61 [1990]) y la secuencia de la
troponina C (GenBank AC: X07897). El ADNc del término C de la
troponina I estaba unido con el ADNc del término N de la troponina C
a través de un empalme sintético codificado para (Gly,Ser)
[secuencias genéticas y secuencias peptídicas de SEQ ID NO:1 y SEQ
ID NO:2, respectivamente] con un único sitio de restricción montado
por ingeniería genética sobre cada extremo. La construcción del
ADNc de la troponina I de cadena única fue confirmada mediante el
secuenciado del ADN y clonación en el vector de expresión pET21
(Novagen). Células de E. coli BL21(DE3), adquiribles
también en Novagen, se transformaron con el plásmido resultante y la
expresión de la proteína se verificó tanto mediante
SDS-PAGE como mediante inmunoensayos. El polipéptido
de cadena única descrito más arriba tiene un peso molecular de
43.700 daltons. Las secuencia genéticas y del polipéptido están
detalladas en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 respectivamente.
La troponina de cadena única I-C
descrita en el ejemplo 1 y un complejo formado a partir de troponina
I cardíaca nativa y troponina C, se evaluaron en los ensayos
Stratus(R) y Access(R), siguiendo los procedimientos
del fabricante para cada ensayo. Los resultados fueron como
sigue:
| Preparación de troponina | Stratus(R) | Access(R) |
| (ng/ml) | (ng/ml) | |
| Complejo troponina I - troponina C cardíaco nativo | 7,9 | 5 |
| Polipéptido de cadena única que contiene la troponina I y la troponina C del ejemplo 1 | 8 | 3,8 |
Estos resultados muestran que el polipéptido de
cadena única que contiene troponina I y troponina C dieron en el
ensayo, resultados similares a los del complejo de troponina I y
troponina C cardíaca nativa, de forma que el ensayo
Stratus(R) dio valores más altos similares, y el ensayo
Access(R) produjo valores más bajos similares.
Se siguió la estabilidad de tres preparaciones
que contenían troponina I durante el almacenamiento a 4ºC durante 7
días. Las preparaciones fueron (I) troponina I recombinante
preparada mediante métodos estándar; (2) un complejo unido no
covalentemente de troponina I recombinante y troponina C
recombinante, y (3) el polipéptido de cadena única conteniendo
troponina I y troponina C con un péptido de empalme interpuesto,
como muestra la SEQ ID NO:4. El complejo unido no covalentemente de
la troponina I recombinante y la troponina C recombinante preparada
por los procedimientos de las patentes U.S. de propiedad común,
5.834.210 y 6.060.278 registradas el 31 de Octubre de 1997.
Brevemente, la troponina C cardíaca humana y una
troponina I modificada, fueron expresadas en E. coli. La
troponina I fue creada por ingeniería genética como un producto
recombinante con seis radicales aminoácidos
N-terminales adicionales, para aumentar la
expresión: la troponina C se expresó con su secuencia nativa de
aminoácidos. La troponina I modificada en presencia de urea se
combinó con troponina C, CaCl_{2} y MgCl_{2}, y se agitó
suavemente para provocar la formación de complejos troponina
I-troponina C.
Las tres preparaciones se almacenaron en suero
humano normal. La troponina se ensayó empleando el ensayo Stratus II
(R) de Dade.
Como se muestra en la figura 3, la troponina I
recombinante y el complejo recombinante, mostraron una variable
detectabilidad durante el período de 7 días, el primero de ellos
subiendo primeramente y luego cayendo, y el último aumentando
ligeramente durante el período del ensayo. Estas preparaciones
fueron por lo tanto, inestables. En contraste, el péptido de cadena
única, troponina I-troponina C mantuvieron una
inmunodetectabilidad constante durante el período del ensayo,
demostrando con ello la estabilidad del material.
Claims (9)
1. Un polipéptido de cadena única, el cual
contiene una troponina I cardíaca en el término N, unida mediante
una secuencia de un péptido de empalme, a una troponina C cardíaca
en el término C, en donde la secuencia del péptido de empalme está
especificada en SEQ ID NO:2.
2. El polipéptido de cadena única de la
reivindicación 1, en donde el polipéptido de cadena única contiene
la secuencia especificada en SEQ ID NO:4.
3. Un polinucleótido que codifica el
polipéptido de cadena única de la reivindicación 1.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en
donde el polipéptido de cadena única codificado, contiene la
secuencia especificada en SEQ ID NO:4.
5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en
donde el polinucleótido contiene la secuencia especificada en SEQ ID
NO:3.
6. Un vector de clonación o expresión que
contiene el polinucleótido de la reivindicación 3.
7. Una célula hospedadora transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 6.
8. La célula hospedadora de la
reivindicación 7, la cual es la E. coli.
9. Una composición de control o
calibrador para un ensayo de troponina I que contiene el polipéptido
de cadena única de la reivindicación 1.
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