ES2621326T3 - Proteínas recombinantes derivadas del colágeno con actividad de enlace al factor Willebrand - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Willebrand en un paciente, caracterizado por que comprende las etapas siguientes: a) Proporcionar un polipéptido seleccionado de entre: - el polipéptido que comprende la secuencia de la posición 24 a la posición 184 de la SEC ID nº 2, - el polipéptido que comprende la secuencia de la posición 24 a la posición 205 10 de la SEC ID nº 4, - el polipéptido que comprende la secuencia de la posición 24 a la posición 226 de la SEC ID nº 5, - un polipéptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptídico Z1- GPRGQPGVMGFP-Z2-GPRGQPGVMGFP y el motivo peptídico (GPP)k en los que, independientemente Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoácidos, Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoácidos, K es un número entero comprendido entre 4 y 15; b) Poner en contacto la muestra biológica, previamente extraída del paciente, con dicho polipéptido; c) Medir el enlace del factor Willebrand presente en la muestra biológica del polipéptido de la etapa a) para medir la actividad de enlace del factor Willebrand al colágeno.
Description
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DESCRIPCION
Protefnas recombinantes derivadas del colageno con actividad de enlace al factor Willebrand.
La invencion se refiere a unas protefnas recombinantes que comprenden por lo menos dos motivos derivados del colageno que permiten que estas protefnas se unan especfficamente al factor vonWillebrand (vWF). Estas protefnas pueden ser utilizadas en diferentes ensayos biologicos in vitro con el fin de medir la capacidad del factor Willebrand para unirse al colageno.
El factor Willebrand es una glicoprotefna adhesiva formada por multfmeros de alto peso molecular producida por las celulas endoteliales y los megacariocitos. Se almacena en las plaquetas y se presenta en forma circulante en el plasma. La protefna madura de Willebrand esta formada por monomeros de 250 kDa agrupados en multfmeros por unos puentes disulfuros que pueden alcanzar una masa del orden de 20 MDa y representar hasta un centenar de monomeros. La multimerizacion es un proceso principal ya que si todos los multfmeros son capaces de unir el factor VIII, sea cual sea su tamano, los multfmeros de alto peso molecular son las formas mas activas para asegurar la adhesion plaquetaria. La formacion de estos multfmeros esta relacionada con la presencia en la secuencia del monomero de dominios denominados "estructurales", a saber un dominio rico en cistefna (Cysteinknotdomain) y un dominio D3 que permite una multimerizacion optima de los dfmeros de Willebrand (Springer TA, J ThrombHaemost. 9 de julio de 2011; Supl. 1:130-43). Existen varios dominios D en la secuencia del monomero que se distinguen por la presencia de secuencias de consenso que permiten el enlace de las isomerasas disulfidos. Al lado de estos dominios "estructurales" estan presentes unos dominios denominados "funcionales" que incluyen tres dominios: A1, A2 y A3 con los dominios A1 y A3 que contienen un sitio de enlace al colageno, el dominio Al un sitio de enlace a los receptores plaquetarios Gplb y allpIII y el dominio A2, de los sitios de escision proteolfticos (Schneppenheim R, Thromb Res.2011;128 Supl. 1:S3-7).
La formacion de los multfmeros de Willebrand esta regulada por la protefna ADAMTS13 (A Disintegrinand Metalloprotease with Thrombospondin Motifs) por corte proteolftico a nivel del dominio A2. Una deficiencia de ADAMTS13 conduce al purpura trombotico trombocitopenico (PTT) consecutivo a la adhesion de las plaquetas a unos multfmeros de factor Willebrand de tamano muy grande en el origen de trombiplaquetaria en la microcirculacion y de una hemolisis.
El factor Willebrand desempena por lo tanto papel importante permitiendo 1) la adhesion de las plaquetas consecutivamente a una lesion del endotelio y a la exposicion del colageno, volviendose esta adhesion muy dependiente del factor Willebrand en caso de velocidades de flujo o fuerzas de cizallamiento elevadas y 2) el transporte y la proteccion del factor VIII de la coagulacion en la sangre circulante. A nivel plasmatico, su concentracion es del orden de 10 pg/ml y los valores plasmaticos de este factor estan situados entre 50 y 150 UI/dl en actividad.
La enfermedad de Willebrand es la enfermedad hemorragica mas frecuente con una prevalencia del orden del 1% en la poblacion general. Se caracteriza por unos sangrados principalmente a nivel de las mucosas. Existen diferentes tipos y sub-tipos de la enfermedad de Willebrand caracterizados por unos defectos cuantitativos y cualitativos de este factor. Es asf que se distingue:
- el tipo 1, que corresponde a una deficiencia cuantitativa parcial en factor Willebrand. Representa del 70 al 80% de los pacientes afectados,
- el tipo 3, que corresponde a una deficiencia cuantitativa total de este factor, asociado a hemorragias severas y a un derrumbe marcado del factor VIII,
- el tipo 2, que corresponde a una deficiencia cualitativa en Willebrand. Se divide en varios sub-tipos, a saber
1) el sub-tipo 2A que presenta una disminucion de la afinidad para las plaquetas relacionada con la ausencia
de multfmero de alto peso molecular, 2) el sub-tipo 2B, caracterizado por un aumento de la afinidad para el
receptor plaquetario GpIb, que se traduce por una eliminacion o una perdida de los multfmeros de alto peso molecular, 3) el sub-tipo 2N que posee una disminucion de la afinidad para el Factor VIII que se traduce por una deficiencia en factor VIII con un porcentaje de Willebrand normal y 4) el sub-tipo 2M, que agrupa todos los otros tipos de deficiencia de la funcion del factor Willebrand que no estan relacionados con una perdida de los multfmeros de alto peso molecular.
El factor Willebrand desempena un papel importante en la interaccion indirecta entre el receptor plaquetario GpIb y el colageno. Las formas multimericas de alto peso molecular permiten el reclutamiento de las plaquetas a nivel de los sitios lesionados de los territorios vasculares sometidos a velocidades de flujo elevadas. El factor Willebrand se fija al colageno por medio de sus dominios A3 y A1, mientras que el dominio A1 une ademas el receptor GpIb plaquetario.
Los colagenos son los constituyentes estructurales principales de la matriz extracelular de todos los organismos
multicelulares. Se trata de una familia de protefnas compuesta por 28 tipos diferentes que desempenan un papel
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durante el desarrollo y en la homeostasis tisular. Son capaces de ensamblarse en diferentes estructuras supramoleculares en forma de fibrillas, de microfibrillas o tambien de redes. Los colagenos presentan la caracterfstica comun de contener uno o varios dominios que tienen una estructura en triple helice formada por tres cadenas polipeptfdicas, o cadenas a, enrolladas unas alrededor de las otras. Esta caracterfstica se permite gracias a la presencia, cada tres aminoacidos, de una glicina a nivel de los motivos helicoidales que estan constituidos por secuencias repetidas de tipo G-X-Y en la que X es frecuentemente una prolina e Y una hidroxiprolina (Chen C y Raghunath M. Fibrogenesis Tissue Repair. 15 de diciembre de 2009; 2:7).
Los colagenos de tipo II y III poseen un sitio unico, de alta afinidad, para el dominio A3 del factor Willebrand (Herr AB y Farndale RW, J BiolChem. 24 de julio de 2009; 284(30):19781-5). Este motivo peptfdico esta localizado entre los aminoacidos 403 a 413 y se compone de GPRGQOGVMGFO con ciertos aminoacidos crfticos para la fijacion al factor Willebrand (Usman T et al., Blood. 1 de diciembre de 2006; 108(12): 3753-6). Esta secuencia peptfdica esta tambien implicada en la interaccion entre el colageno de tipo II, III, IV y los receptores DDR1 y DDR2 (Discoidin Domain Receptor) (Xu H et al., Matrix Biol. Enero de 2011; 30(1): 16-26), expresados por las celulas epiteliales y las celulas de origen mesenquimal respectivamente, asf como con la protefna SPARC (SecretedProteinAcidic and Rich in Cysteine, tambien denominada osteonectina), implicada en las interacciones celula-matriz extracelular (Giudici C et al., J BiolChem. 11 de julio de 2008;283(28):19551-60). Mas recientemente, Brondijk et al. han descrito los motivos de reconocimiento eventualmente implicados en el enlace del colageno de tipo I al factor Willebrand, a saber el motivo RGQAGVMF para la cadena alfa 1 y RGEOGNIGF para la cadena alfa 2 que son unos motivos denominados "degenerades" con respecto al motivo RGQOGVMGF presente en la secuencia del colageno de tipo III (Brondijk TH et al. Proc NatlAcadSci U S A. 3 de abril de 2012;109(14):5253-8). Por otro lado, Verkleij et al. habfan identificado como potencial sitio de enlace los aminoacidos 541 a 558 compuestos por GAAGPOGPOGSAGTOGLQ (Verkleij et al., Blood. 15 de mayo de 1998; 91 (10): 3808-16). Este motivo peptfdico esta localizado entre el motivo Willebrand descrito por Lisman et al. y el motivo de enlace a la integrina a1p2 (motivo GMOGER). Este motivo no se ha recogido despues en otros trabajos.
Se senala que Bonnefoy et al. han demostrado que el dominio A1 del factor Willebrand podia subsistir al dominio A3 para permitir la fijacion de las plaquetas al colageno para unas velocidades de flujo elevadas sin que haya podido precisar si esta interaccion se efectuaba a nivel del mismo sitio de enlace al colageno que para el dominio A3 (Bonnefoy A et al. J ThrombHaemost. Octubre de 2006;4(10):2151-61).
La clasificacion de los pacientes que padecen la enfermedad de Willebrand necesita la utilizacion de diferentes ensayos de laboratorio. La determinacion del antfgeno del factor de Willebran (VEF:Ag) se realiza frecuentemente en primera lfnea en caso de sospecha, pero no permite cuantificar la actividad del factor Willebrand. La utilizacion de ensayos denominados funcionales, que miden la actividad del factor Willebrand es indispensable para detectar las anomalfas funcionales del factor Willebrand que permite la clasificacion de los pacientes en los diferentes sub-tipos, en particular cuando estas anomalfas no estan asociadas a una baja concentracion de factor Willebrand. Como se ha precisado anteriormente, el factor Willebrand permite la adhesion de las plaquetas al colageno haciendo el enlace entre el colageno y el receptor plaquetario GpIb. Los ensayos funcionales utilizados en la actualidad tienen sobre todo como objetivo el enlace Willebrand/plaquetas.
La medicion del enlace del factor Willebrand al colageno no se utiliza de forma rutinaria, y esto principalmente debido a que los ensayos actuales no son adecuados para urgencias y ni para caso por caso. Sin embargo, la medicion del enlace del factor Willebrand al colageno o VWF:CB (von Willebrand Factor:Collagen Binding) posee una mejor sensibilidad para detectar la presencia de Willebrand de alto peso molecular (Favaloro EJ, Thromb Haemost. Noviembre de 2010;104(5):1009-21).
Con el fin de facilitar la clasificacion de los pacientes en funcion de los sub-tipos, se calcula la relacion (ratio) entre la actividad enlace de Willebrand a las plaquetas o del colageno al Willebrand y la concentracion del antfgeno Willebrand (vWF:Ag). Para los pacientes normales se obtiene una relacion actividad/Ag igual o superior y de tipo I a 0,7 y una relacion inferior a 0,7 es caracterfstica de los sub-tipos 2A, 2B y 2M. Los sub-tipos 2N no se pueden detectar mediante esta medicion.
Los ensayos ELISA basados en la medicion del enlace de Willebrand al colageno permiten una buena discriminacion entre los pacientes de tipo 1 y de tipo 2A/2B (Favaloro EJ, Thromb Haemost. Noviembre de 2010;104(5):1009-21) y entre los tipos 2A y 2M (Baronciani L et al. J Thromb Haemost. Septiembre de 2006;4(9):2088-90).
Aunque estos resultados parecen prometedores, existe un debate en cuanto al interes de este ensayo para la clasificacion de los pacientes. Este debate se refiere principalmente a la caracterizacion de la ausencia o no de los multfmeros de alto peso molecular, que es una apuesta importante, tanto para ayudar a la clasificacion de los pacientes con Willebrand como para los que tienen una deficiencia adquirida de multfmeros de alto peso molecular. Existen en la actualidad no menos de 7 kits ELISA comercializados, sin contar los que se desarrollan internamente por algunos laboratorios. Estos kits utilizan unas preparaciones de colageno de origen y de naturaleza diferentes, lo que complica la comparacion de los resultados entre los diferentes estudios. A esto se anade la falta de homogeneidad entre los lotes producidos. Los colagenos clasicamente utilizados son el colageno de tipo I, de tipo III, de tipo IV y de tipo VI. Estos colagenos de origen animal no son puros al 100% y pueden ser el origen de los
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resultados discordantes descritos. De ahf, una necesidad importante de homogeneidad de las preparaciones de colageno utilizadas, tanto para los ensayos ELISA como para los ensayos que miden el enlace de Willebrand al colageno en condiciones de flujo. Este punto se ha detallado ampliamente y discutido en una directiva del subcomite Biorheologie de ISTH que tiende a una estandarizacion de los ensayos que utilizan el colageno (Heemskerk JWM et al. J Thromb Haemost. Abril de 2011;9(4):856-8).
La ingenierfa de protefnas derivadas de la matriz extracelular permite en la actualidad disponer de protefnas que poseen unas propiedades equivalentes a las protefnas nativas (Werkmeister J y Ramshaw J. Biomed Mater. Febrero de 2012;7(1):012002). Utilizando las tecnologfas del ADN recombinante, es posible obtener, de manera reproducible, unos lotes estables de estas protefnas en cantidad muy alta. A pesar de que los colagenos nativos ya se han producido en celulas eucariotas con exito (patente EP 2383338), la produccion de protefnas recombinantes derivadas del colageno procedentes de un procedimiento de ingenierfa es un enfoque reciente que no se ha utilizado hasta la fecha para producir unas protefnas derivadas del colageno capaces de unirse al factor Willebrand y que se utilizan en un ensayo de actividad de este factor, tales como los polipeptidos de la presente invencion.
Al contrario que el ensayo de actividad de enlace de Willebrand al receptor plaquetario Gplb que existe en forma automatizada, no existe en la actualidad un ensayo automatizado para la medicion del enlace de Willebran al colageno. Los ensayos automatizados se basan generalmente en el principio de la aglutinacion de partfculas recubiertas de un reactivo. El ensayo de aglutinacion mas utilizado en diagnostico utiliza unas perlas de latex que, por ahora, no se han podido recubrir de colageno para su utilizacion como reactivo. Las propiedades fisicoqufmicas de los colagenos utilizados clasicamente y, en particular, el hecho de ser soluble unicamente a pH acido, complican la utilizacion de este tipo de perlas. A la inversa, los polipeptidos segun la invencion son solubles a pH fisiologico, que permite una adsorcion optima en superficie de partfculas. Por otro lado, su masa es mas pequena que la de los colagenos nativos, lo que deberfa permitir una mejor adsorcion sobre las partfculas. Finalmente, la posible adicion por ingenierfa de cistefnas en la secuencia del polipeptido permite realizar un injerto dirigido entre una partfcula funcionalizada con una funcion de tipo maleimida en la superficie de la partfcula y la cistefna presente en la protefna. Las ventajas especfficas de los polipeptidos segun la invencion acoplados a su actividad permiten el desarrollo del primer ensayo automatizado de la medicion del enlace de Willebrand plasmatico al colageno.
Resumen de la invencion
La presente invencion tiene por objeto un procedimiento para determinar la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno en una muestra biologica que comprende las etapas siguientes:
a) Proporcionar un polipeptido seleccionado de entre:
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
- un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Zi-
GPRGQPGVMGFP-Z2-GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Zi representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
K es un numero entero comprendido entre 4 y 15;
b) poner en contacto la muestra biologica con dicho polipeptido;
c) medir el enlace del factor Willebrand de la muestra biologica al polipeptido de la etapa a) para medir la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno.
Los polipeptidos descritos anteriormente presentan una actividad y una afinidad de enlace al factor Willebrand equivalente a la de los colagenos de tipo I y III. Estos polipeptidos presentan unas caracterfsticas fisicoqufmicas ventajosas, en particular debido a que son estables a un pH fisiologico, y tambien por que son capaces de unirse al factor Willebrand en forma no fibrilar.
Preferentemente, Z1 y Z2 representan independientemente un motivo peptfdico de formula
(GAA1AA2)n1(GAA3AA4)n2(GAA5AA6)n3(GAAyAA8)n4
en la que, independientemente:
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• AAi, AA3, AA5 y AA7 representan independientemente los aminoacidos D o A,
• AA2, AA4, AA6 y AA8 representan independientemente los aminoacidos A o P,
• n1, n2, n3 y n4 se seleccionan independientemente de entre 0, 1, 2, 3 o 4 y la suma n1+n2+n3+n4 es igual a 2, 3 o 4.
Mas preferentemente, Zi y Z2 representan el motivo peptfdico GDAGAPGAP de la SEC ID n° 7.
Un segundo objeto de la presente invencion es un procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Willebrand en un paciente que comprende las etapas siguientes:
a) Proporcionar un polipeptido seleccionado de entre:
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
- un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-
GPRGQPGVMGFP-Z2-GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
k es un numero entero comprendido entre 4 y 15;
b) Poner en contacto una muestra biologica previamente extrafda en el paciente con dicho polipeptido;
c) Medir el enlace del factor Willebrand presente en la muestra biologica al polipeptido de la etapa a) para medir la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno.
De manera ventajosa, el procedimiento de diagnostico se utiliza para diagnosticar los tipos 1, 2, 2A, 2B, 2M y 3 de la enfermedad de Willebrand.
Preferentemente, Z1 y Z2 representan independientemente un motivo peptfdico de formula
(GAA1AA2)n1(GAA3AA4)n2(GAA5AA6)n3(GAA7AA8)n4
en el que, independientemente
• AA1, AA3, AA5 et AA7 representan independientemente los aminoacidos D o A,
• AA2, AA4, AAa et AA8 representan independientemente los aminoacidos A o P,
• n1, n2, n3 y n4 se seleccionan independientemente de entre 0, 1, 2, 3 o 4 y la suma n1+n2+n3+n4 es igual a 2, 3 o 4.
Mas preferentemente, Z1 y Z2 representan el motivo peptfdico GDAGAPGAP de la SEC ID n° 7.
En modos de realizacion ventajosos de la invencion, los procedimientos de diagnostico de la enfermedad de Willebrand comprenden ademas la determinacion de la cantidad de factor Willebrand presente en la muestra biologica.
Preferentemente, el polipeptido de la etapa a) se fija sobre un soporte solido.
Preferentemente, las etapas b) y c) se realizan en condiciones de flujo.
La invencion tiene tambien por objeto un polipeptido seleccionado de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
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• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 5,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Zi-GPRGQPGVMGFP- Z2-GPRGQPGVMGFP et el motivo peptfdico (GpP)k
en los que, independientemente
Zi representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
k es un numero entero comprendido entre 4 et 15.
En modos de realizacion preferidos, los polipeptidos segun la presente invencion se fijan sobre un soporte solido.
La invencion se refiere asimismo a unos kits para determinar la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno que comprende un polipeptido seleccionado de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido de por lo menos 100 aminoacidos que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo
peptfdico Z1-GPRGQPGVMGFP-Z2- GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
k es un numero entero comprendido entre 4 et 15;
un reactivo de deteccion para determinar el enlace del factor Willebrand al colageno.
Ventajosamente, los kits segun la presente invencion comprenden ademas un anticuerpo que se une al factor Willebrand.
Preferentemente, el polipeptido se fija sobre un soporte solido.
Listado de secuencias
SEC ID n° 1: Polinucleotido que codifica para un polipeptido que comprende dos motivos de enlace al factor Willebrand
SEC ID n° 2: Polipeptido que comprende dos motivos de enlace al factor Willebrand
SEC ID n° 3: Polipeptido que comprende un motivo de enlace al factor Willebrand
SEC ID n° 4: Polipeptido que comprende tres motivos de enlace al factor Willebrand
SEC ID n° 5: Polipeptido que comprende cuatro motivos de enlace al factor Willebrand
SEC ID n° 6: Motivo de enlace al factor Willebrand SEC ID n° 7: Enlazador
SEC ID n° 8: Enlazador-motivo de enlace al factor Willebrand-enlazador-motivo de enlace al factor Willebrand. Descripcion detallada de la invencion
El factor Willebrand se une al colageno y unas alteraciones de la actividad de enlace de este factor al colageno son
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el origen de los diferentes tipos de la enfermedad de Willebrand. El colageno es una protefna diffcilmente producida o purificada y cuya manipulacion no es facil. En efecto, debido a su estructura, el colageno se adhiere a las superficies y no es soluble en agua. La presente invencion propone unos polipeptidos recombinantes capaces de sustituir el colageno en todos los ensayos y unos kits de medicion del enlace del factor Willebrand al colageno. Los polipeptidos de la presente invencion pueden ser producidos en diferentes sistemas celulares de los cuales las celulas CHO. Son facilmente purificados y forman unos trfmeros en solucion cuya estructura es similar a la del colageno. Estos polipeptidos son, por otro lado, solubles y en particular a pH fisiologico, lo que permite fijarlos facilmente sobre soportes solidos tales como perlas de latex por ejemplo.
De manera destacable, los datos experimentales detallados a continuacion muestran que los polipeptidos segun la invencion presentan una actividad y una afinidad de enlace al factor Willebrand igual a la del colageno III humano. Los polipeptidos segun la presente invencion encuentran por lo tanto numerosas aplicaciones en los procedimientos, ensayos y en los kits basados en la determinacion/medicion del enlace del factor Willebrand al colageno.
La invencion se refiere en primer lugar a unos polipeptidos que se unen al factor Willebrand seleccionados de entre:
• el polipeptido de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido de la SEC ID n° 5,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Zi-GPRGQPGVMGFP- Z2- GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GpP)k
en los que, independientemente
Zi representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
k es un numero entero comprendido entre 4 y 15.
La invencion se refiere tambien a unos polipeptidos que se unen al factor Willebrand seleccionados de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 5,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-GPRGQPGVMGFP- Z2- GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
k es un numero entero comprendido entre 4 y 15.
Preferentemente, Z1 y Z2 representan independientemente un motivo peptfdico de formula
(GAA1AA2)n1(GAA3AA4)n2(GAAsAA6)n3(GAAyAA8)n4
en la que, independientemente
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AAi, AA3, AA5 et AA7 representan independientemente los aminoacidos D o A,
AA2, AA4, AA6 et AA8 representan independientemente los aminoacidos A o P,
n1, n2, n3 et n4 se seleccionan independientemente de entre 0, 1, 2, 3 o 4 y la suma n1+n2+n3+n4 es igual a 2, 3 o 4. Mas preferentemente, Zi y Z2 representan el motivo peptfdico GDAGAPGAP de la SEC ID n° 7.
Los polipeptidos segun la presente invencion comprenden por lo menos dos motivos de enlace al factor Willebrand de formula GPRGQPGVMGFP (SEC ID n° 6) separados por un enlazador. Unos enlazadores de este tipo se describen a continuacion.
Preferentemente, los polipeptidos segun la presente invencion comprenden un motivo de tipo GPRGQPGVMGFP- Enlazador-GPRGQPGVMGFP y mas preferentemente un motivo de tipo "Enlazador -GPRGQPGVMGFP- Enlazador - GPRGQPGVMGFP - Enlazador".
En un modo de realizacion preferido de la invencion, los polipeptidos comprenden un motivo de tipo (GPP)k - Enlazador -GPRGQPGVMGFP- Enlazador -GPRGQPGVMGFP o un motivo de tipo GPRGQPGVMGFP- Enlazador -GPRGQPGVMGFP - Enlazador - (GPP)k.
En un modo de realizacion de la presente invencion, los polipeptidos segun la presente invencion comprenden el motivo de la SEC ID n° 8.
Se puede utilizar como enlazador cualquier secuencia de aminoacidos. Preferentemente, el enlazador comprende de 6 a 12 aminoacidos.
En un modo de realizacion preferido, el enlazador representa un motivo peptfdico de formula
(GAA1AA2)n1(GAA3AA4)n2(GAA5AA6)n3(GAA7AA8)n4
en la que, independientemente
AA1, AA3, AA5 et AA7 representan independientemente los aminoacidos D o A,
AA2, AA4, AAa et AA8 representan independientemente los aminoacidos A o P,
n1, n2, n3 y n4 se seleccionan independientemente de entre 0, 1, 2, 3 o 4 y la suma n1+n2+n3+n4 es igual a 2, 3 o 4. Mas preferentemente, el enlazador representa el motivo peptfdico GDAGAPGAP de la SEC ID n° 7.
El motivo peptfdico de formula (GPP)k, en la que k es un numero entero comprendido entre 4 y 15, permite la
trimerizacion del polipeptido segun la presente invencion. Preferentemente, en la formula (GPP)k, k es igual a 10.
Este motivo de trimerizacion se situa ventajosamente en uno de los extremos del polipeptido con respecto al motivo de enlace al factor Willebrand y separado de este ultimo por un numero variable de aminoacidos.
La invencion se refiere tambien a los polipeptidos que tienen por lo menos un 50%, un 60%, un 70%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95% de identidad con uno de los polipeptidos siguientes:
• el polipeptido de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido de la SEC ID n° 5,
• el polipeptido de la position 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5.
Por aminoacidos identicos, se entienden unos aminoacidos invariables o sin alterar entre dos secuencias. Estos polipeptidos pueden presentar una delecion, una adicion o una sustitucion de por lo menos un aminoacido con respecto al polipeptido de referencia.
Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoacidos, en el sentido de la presente invencion, se entiende un porcentaje de restos de aminoacidos identicos entre las dos secuencias a comparar, obtenido despues de la mejor alineacion (alineacion optima), siendo este porcentaje puramente estatico y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas al azar y sobre toda su longitud. Este porcentaje de identidad entre dos polipeptidos puede ser determinado por un algoritmo de identidad global tal como se describe por Neddleman y Wunsch (1970).
Preferentemente, los polipeptidos que presentan un porcentaje de identidad con los polipeptidos de la presente invencion conservan las propiedades del polipeptido de referencia. Preferentemente, estos polipeptidos conservan su capacidad de enlace al factor Willebrand y su solubilidad en agua, en particular a pH fisiologico.
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Los polipeptidos de la presente invencion comprenden tfpicamente entre 150 y 300 aminoacidos.
Para su utilizacion en ensayos de enlace al factor Willebrand, los polipeptidos de la presente invencion pueden ser fijados sobre cualquier tipo de soporte solido, tal como microplacas para ensayos ELISA o sobre perlas, incluyendo las perlas de latex o las perlas de oro.
La invencion tiene tambien por objeto unos polinucleotidos que codifican para los polipeptidos de la presente invencion, tales como el polinucleotido de la SEC ID n° 1.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento para determinar la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno en una muestra biologica que comprende las etapas siguientes:
a) Proporcionar un polipeptido seleccionado de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-
GPRGQPGVMGFP-Z2-GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos, k es un numero entero comprendido entre 4 y 10;
b) Poner en contacto la muestra biologica con dicho polipeptido;
c) Medir el enlace del factor Willebrand de la muestra biologica al polipeptido de la etapa a).
En la ultima etapa del procedimiento, la medicion del enlace del factor Willebrand de la muestra biologica al polipeptido segun la invencion da una medicion del enlace del factor Willebrand al colageno y en particular al colageno III humano.
Este procedimiento se puede utilizar con los polipeptidos segun la presente invencion tales como se han descrito anteriormente.
La invencion se refiere tambien a un procedimiento de diagnostico en un paciente que padece o que se sospecha que padece una forma de la enfermedad de Willebrand que comprende las etapas siguientes:
a) Proporcionar un polipeptido seleccionado de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-
GPRGQPGVMGFP-Z2- GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos, k es un numero entero comprendido entre 4 y 10;
b) Poner en contacto una muestra biologica previamente extrafda en el paciente con dicho polipeptido;
c) Medir el enlace del factor Willebrand presente en la muestra biologica al polipeptido de la etapa a).
La invencion se refiere tambien a un metodo de diagnostico en un paciente que padece o que se sospecha que
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padece una forma de la enfermedad de Willebrand que comprende las etapas siguientes:
a) Extraccion de una muestra biologica del paciente,
b) Poner en contacto la muestra biologica extrafda del paciente con un polipeptido seleccionado de entre:
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
• el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,
• un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Zi-
GPRGQPGVMGFP-Z2- GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k
en los que, independientemente
Zi representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,
Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos, k es un numero entero comprendido entre 4 y 15;
c) Medir el enlace del factor Willebrand presente en la muestra biologica al polipeptido de la etapa a).
En los procedimientos de la presente invencion, la ultima etapa del procedimiento que comprende la medicion del enlace del factor Willebrand de la muestra biologica al polipeptido segun la invencion da una medicion del enlace del factor Willebrand al colageno y en particular al colageno III humano.
Estos procedimientos pueden ser utilizados con los polipeptidos segun la presente invencion, tales como se han descrito anteriormente.
Por muestra, se entiende en particular cualquier muestra que contiene o que es susceptible de contener el factor Willebrand, del cual se busca determinar la actividad de enlace al colageno y en particular al colageno de tipo III humano. Puede tratarse en particular de una muestra biologica, previamente extrafda en un paciente. En unos modos de realizacion preferidos, la muestra biologica es sangre, plasma, plasma rico en plaquetas, tejido biologico, organo biologico o un fluido corporal.
Los procedimientos segun la presente invencion comprenden una puesta en contacto de la muestra con por lo menos un polipeptido segun la presente invencion. Esta puesta en contacto se efectua segun unos metodos clasicos bien conocidos por el experto en la materia. Esta puesta en contacto se efectua asf tfpicamente en un medio acuoso y mas preferentemente en un tampon que garantiza la estabilidad tridimensional de los polipeptidos y desprovisto de proteasas. En un modo de realizacion preferido, esta etapa se realiza en un tampon fosfato.
Ventajosamente, el polipeptido segun la invencion se puede fijar sobre un soporte solido. El polipeptido puede ser fijado sobre cualquier tipo de soporte natural o sintetico, en particular cualquier polfmero natural o sintetico. Este soporte solido se selecciona, por ejemplo, de entre el plastico, el poliestireno, el vidrio, el metal.
En un modo de realizacion, el polipeptido segun la invencion se fija en por lo menos un pocillo de microplaca de tipo placa ELISA por ejemplo.
En otro modo de realizacion, el polipeptido se fija sobre perlas de vidrio, de plastico, de polfmero o de metal, tales como perlas de latex o de oro, por adsorcion o enlace covalente en particular.
La medicion del enlace del factor Willebrand de la muestra biologica al polipeptido segun la invencion se efectua segun cualquier metodo apropiado. Estos metodos son bien conocidos por el experto en la materia. Se citaran en particular los metodos ELISA o los ensayos de aglutinacion y de agregacion y los ensayos en condicion de flujo.
Esta medicion se puede realizar en condiciones estaticas en ausencia de cualquier agitacion del medio en el que se efectua el enlace.
En otros modos de realizacion, la medicion del enlace se realiza en condiciones de flujo con el fin de reproducir las condiciones de circulacion sangufnea. Esta determinacion permite medir la actividad del enlace del factor Willebrand con colagenos humanos o animales de tipo diferente (tipos I, II, III, VI por ejemplo) en las condiciones fisiologicas de la circulacion sangufnea. Los equipos y metodos para realizar estas mediciones son bien conocidos por el experto en la materia, como la resonancia plasmonica de superficie.
La medicion del enlace del factor Willebrand a los polipeptidos segun la invencion puede ser suficiente para
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establecer un diagnostico de la enfermedad de Willebrand. En particular, los procedimientos segun la presente invencion permiten establecer el diagnostico de tipos 1, 2, 2A, 2B, 2m y 3 de la enfermedad de Willebrand.
En algunos modos de realizacion, los procedimientos segun la invencion comprenden ademas una cuantificacion del factor Willebrand presente en la muestra. Esta cuantificacion puede efectuarse segun cualquier tecnica habitual. En un modo de realizacion, esta cuantificacion del factor Willebrand en la muestra biologica se efectua con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra el factor Willebrand. En este modo de realizacion, el procedimiento segun la invencion comprende una medicion de la actividad del factor de Willebrand y mas particularmente de su actividad de enlace al colageno (determinacion funcional) y una medicion de la cantidad de factor Willebrand presente en la muestra biologica (determinacion cuantitativa).
Clasicamente, la medicion de la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno combinado con la cuantificacion del factor Willebrand en la muestra permite determinar la relacion:
r_ ______factor Willebrand unido al polipeptido (actividad)______
factor Willegrand presente en la muestra biologica (antfgeno)
La determinacion de esta relacion permite en particular establecer un diagnostico o afinar el diagnostico de la enfermedad de Willebrand y mas particularmente distinguir los tipos 1 y 3 (deficiencia cuantitativa) y los tipos 2 (deficiencia cualitativa) de la enfermedad de Willebrand. Los procedimientos de la presente invencion permiten tambien distinguir y/o establecer un diagnostico de los tipos 1, 2, 2A, 2B, 2M y 3 de la enfermedad de Willebrand.
La invencion se refiere tambien a unos kits para determinar la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno que comprende un polipeptido tal como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, el polipeptido se fija sobre un soporte solido tal como una perla de latex o una perla de oro.
El kit comprende ademas un reactivo de deteccion para determinar el enlace del factor Willebrand al colageno. Este reactivo de deteccion puede ser cualquier reactivo utilizado habitualmente. Puede tratarse de un marcador tal como un fluoroforo fijado sobre el polipeptido segun la presente invencion. En un modo de realizacion, se trata de un anticuerpo que se fija al polipeptido segun la invencion o al factor Willebrand. Este anticuerpo puede ser marcado con el fin de facilitar su deteccion. Preferentemente, el kit comprende ademas un anticuerpo que se une al factor Willebrand.
Figuras
Figura 1: Perfil proteico representativo de las fracciones purificadas del polipeptido segun la invencion (SEC 2) digerido o no con pepsina. N _ fraccion normal no digerida, P _ fraccion digerida con pepsina y M _ marcador de peso molecular. En la fraccion N, se observa una banda mayoritaria de 70 kDa que se encuentra en la fraccion P. Esta banda corresponde por lo tanto al polipeptido segun la invencion estructurado en triple helice.
Figura 2: Medicion de la actividad de enlace del factor Willebrand purificado (Wilfactin) sobre diferentes polipeptidos segun la invencion que poseen un motivo (SEC 39 o dos motivos (SEC 2) asf como sobre el colageno de tipo III que sirve de referencia (BD Biosciences) y sobre unas protefnas endogenas o HCP (Host CellProtein) que sirve de control negativo. A _ polipeptidos recubiertos a 10 pg/ml y B _ polipeptidos recubiertos a 2 pg/ml. Se observa que se necesitan por lo menos 2 motivos de enlace al factor Willebrand para obtener un enlace del factor Willebrand equivalente al del colageno de tipo III nativo. Media +/- DE, siendo n _ 2.
Figura 3: Medicion del enlace del factor Willebrand (Wilfactin) con 2 UI/dL sobre el polipeptido segun la invencion (Sec 2) digerido o no por la pepsina y recubierto con 2 pg/ml. Se observa un aumento de un factor 3 de la actividad de enlace del factor Willebrand cuando el polipeptido segun la invencion es digerido con pepsina. Media +/- DE siendo n_ 2.
Figura 4: Medicion del enlace al polipeptido segun la invencion (SEC 2) y al colageno de tipo III recubierto con 2 pg/ml para diferentes concentraciones en factor Willebrand (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 1 y 2 UI/dL). El polipeptido segun la invencion posee la misma actividad de enlace del factor Willebrand y la misma sensibilidad que el colageno III nativo. Media +/- DE siendo n _ 2.
Figura 5: Medicion del enlace de factor Willebrand utilizado con 2 UI/dL para diferentes concentraciones de polipeptido segun la invencion (SEC 2) y de colageno de tipo III (0; 0,032; 0,062; 0,125; 0,25; 0,5; 1 y 2 pg/ml). Media +/- DE siendo n_ 2.
Figura 6: Medicion del enlace del factor Willebrand plasmatico sobre el polipeptido segun la invencion recubierto con 2 pg/ml para diferentes diluciones de un plasma control. Los resultados muestran una linealidad del enlace del factor Willebrand con el polipeptido segun la invencion con una curva de regresion lineal que presenta un R2 a 0,9976. Se observa tambien una buena reproducibilidad de los resultados obtenidos con el polipeptido segun la invencion. Media +/- DE siendo n =10.
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Ejemplos
Ejemplo 1. Construccion del vector que codifica para el polipeptido segun la invencion que contiene una etiqueta 6xHIS
La secuencia nucleotfdica que codifica para los polipeptidos segun la invencion procede del vector pUC57-NVH020B que contiene el peptido senal del colageno de tipo III (posicion 1 a 23 de la secuencia nucleotfdica del polipeptido segun la invencion). Esta secuencia se inserta en un vector de expresion dedicado a las celulas de mamffero: pcDNA3.1 + (INVITROGEN). Este vector contiene, entre otros, los elementos siguientes:
O Un promotor CMV,
O Un sitio de clonacion multiple para insertar la secuencia nucleotfdica de interes,
O Un casete de resistencia a la geneticina para la expresion en celulas de mamffero,
O Un casete de resistencia a la amicilina para la expresion en bacterias.
Para permitir la insercion del polipeptido segun la invencion, se han insertado unos sitios de restriccion a ambos lados de la secuencia nucleotfdica. Se trata del sitio de restriccion NheI en 5' y del sitio de restriccion BamHI en 3'. Para facilitar la purificacion del polipeptido segun la invencion, se anade un tag 6 X histidina en 5' o en 3' de la secuencia del polipeptfdico. Con el fin de poder retirar este tag posteriormente, se ha insertado una secuencia de escision a la TEV (TabaccoEtch Virus) entre la secuencia nucleotfdica del tag 6 X histidina y la secuencia que codifica para el polipeptido segun la invencion.
Todos los plasmidos finales se secuencian para verificar que no se ha introducido ninguna mutacion en el ADN de la protefna de interes y en los elementos aportados.
Ejemplo 2. Expresion de la protefna de fusion segun la invencion en las celulas CHO
Se ha realizado un pre-cultivo de las celulas CHO-S (INVITROGEN) de 3 semanas antes de la transfeccion. Las celulas se mantienen en un medio dedicado a las celulas CHO (Power-CHO, EXCEL 302, proCHO4, proCHO5, etc.) complementado con 4 mM de L-glutamina (LONZA) y 1X de proHT (LONZA) en un matraz de agitacion (shakeflask) de 125 ml y en condiciones agitadas (80 rpm) en una incubadora a 37°C con un 5% de CO 2. Dos dfas antes de la transfeccion, las celulas se pasan a 5105 celulas viables/ml mediante un cambio completo del medio utilizado y se cultivan en 12,5 ml de medio dedicado a las celulas CHO completo en un matraz de agitacion (shakeflask) de 125 ml.
El dfa de la transfeccion, 5-106 celulas viables se peletizaron por centrifugacion (5 min. a 1000 g), despues recogidas en 5 ml de medio RPMI (Lonza) complementado con 4 mM de L-Glutamina (Lonza) y 1X de ProHT (Lonza). Se reparten entonces cuatro ml de suspension en 4 matraces de agitacion (shakeflasks) de 25 ml (1 ml por flask) que contiene 9 ml de medio RPMI completo (1106 celulas viables por matraz de agitacion (shakeflask)). Las celulas CHO-S son entonces transfectadas con el vector que contiene la secuencia que codifica para el polipeptido segun la invencion descrito anteriormente. Un control positivo de transfeccion se realiza transfectando las celulas con el vector pMAX-GFP y un control negativo de la transfeccion se realiza transfectando las celulas con un vector que no posee el casete de resistencia a la geneticina. La transfeccion se realiza con la ayuda del agente de transfeccion Fecturine (PolyMas Transfeccion) o cualquier otro agente de transfeccion adecuado y segun el protocolo comercial del producto optimizado. Para la Fecturina, las condiciones de transfeccion elegidas son 6 pg de ADN para 12 pl de Fecturina (relacion ADN/Agente de transfeccion = 1X). El experto en la materia sabra definir el agente de transfeccion mas adecuado para una transfeccion denominada transitoria o para una transfeccion denominada estable. Ya se trate de un modo de transfeccion denominado transitorio o estable, las celulas se incuban en presencia de complejos de transfeccion en condiciones estaticas a 37°C y u n 5% CO2. A 4h post-transfeccion, las celulas se resuspenden en un medio dedicado a las celulas CHO completo, y a 24h post-transfeccion, se realiza una cuantificacion de la eficacia de transfeccion sobre los controles positivos y negativos de transfeccion por citometrfa de flujo.
Para la produccion del polipeptido segun la invencion en modo denominado transitorio, se realiza una primera extraccion de sobrenadante a D+3, despues se detiene el cultivo a D+5. El medio que contiene el polipeptido segun la invencion segregado por las celulas se recupera despues de la centrifugacion a 3 000 g durante 10 minutos, permitiendo la eliminacion de las celulas, y se congelo a -2013.
Para la produccion del polipeptido segun la invencion en modo denominado estable, las celulas se resuspenden y se realiza un recuento celular a las 48 horas de la post-transfeccion. La totalidad de las celulas se centrifuga despues a 1000 g durante 5 min y despues se inoculan a 3105 celulas viables/ml en un medio dedicado a las celulas CHO complementado + geneticina (G418 Merck) a 700 pg/ml. Las celulas se mantienen despues tres veces por semana. La totalidad de las celulas se inocula en 12,5 ml final de medio completo + g418 en matraz de agitacion (ShakeFlasks) de 125 ml. Se observa una disminucion de la concentracion celular y/o de la viabilidad celular en la primera semana de cultivo bajo presion de seleccion. La viabilidad celular aumenta de nuevo despues de 2-3 semanas bajo presion de seleccion. Cuando el cultivo alcanza mas del 95% de viabilidad, se realiza una
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crioconservacion con 5106 celulas viables/ampolla (con un total de 10 ampollas). Las celulas se congelan en el medio dedicado a las celulas CHO + 20% de dMsO.
Ejemplo 3. Produccion de la protefna de fusion segun la invencion en las celulas CHO
Las celulas modificadas geneticamente para producir el polipeptido segun la invencion se descongelan y se mantienen en un medio adecuado. Las celulas se mantienen a 3105 celulas viables/ml durante una a dos semanas. Las celulas se colocan en 12,5 ml de medio final y se colocan en un matraz de agitacion (shakeflask) de 125 ml en un agitador LabTherm® Kuhner agitado a 80 rpm, regulado con el 5% de CO2 y con una humedad comprendida entre el 40 y el 80 %. Despues, las celulas se amplifican con el fin de obtener la cantidad necesaria para realizar una produccion. La amplificacion consiste en mantener las celulas en unos volumenes mas elevados en cada mantenimiento para guardar todas las celulas a una concentracion viable.
Cuando se obtiene la cantidad de celulas necesaria para la produccion, se puede poner en marcha la produccion. Las celulas se inoculan a 3105 celulas viables/ml. La produccion se puede realizar en diferentes equipos: matraces de agitacion (shakeflask) dispuestos en un agitador LabTherm® Kuhner, Cultibag RM 20/50® (Sartorius), CellReady® (Merck Millipore), BioBundle® (Applikon) y otros equipos equivalentes, de misma escala o de escala superior. El cultivo de las celulas se realiza durante 5 dfas o mas, con un maximo de 10 dfas, segun las condiciones de realizacion del cultivo. Cada dfa, los parametros de la produccion se controlan, asf como la concentracion celular y la viabilidad celular. Durante la produccion, se pueden anadir unos componentes tales como unos aminoacidos, unas vitaminas, glucosa o cualquier otro elemento que presenta un interes para la produccion o para las celulas. En este caso, se trata de un cultivo en modo "fed - batch" o "semicontunuo" que permite cultivar las celulas durante como maximo 21 dfas. Si no se anade ningun compuesto durante el cultivo, se habla de cultivo en modo "batch" o "discontinuo".
Ejemplo 4. Aislamiento por cromatograffa de afinidad de la protefna de fusion
Las celulas y restos celulares presentes en el medio que contiene el polipeptido segun la invencion se eliminan por centrifugacion o filtracion en profundidad (POD Millistak+® Merck Millipore o cualquier otro tipo de soporte equivalente) o filtracion tangencial sobre una membrana que presenta un lfmite de corte de 0,2 pm. El sobrenadante obtenido se purifica por cromatograffa de afinidad sobre una columna quelada con un metal tal como el nfquel, el cobalto, el zinc o el cobre. Con el fin de favorecer el enlace del polipeptido segun la invencion, se anade un tampon que contiene de 0 a 50 mM imidazol, de 0 a 500 mMNaCl, de 5 a 20 mM (Na2HPO4, 2H2O) y de 5 a 20 mM (NaH2PO4, H2O) al sobrenadante y se ajusta a un pH entre 7 y 8. La elucion del polipeptido segun la invencion o bien se realiza mediante un gradiente utilizando una mezcla de dos tampones (tampon 1: 500 mM imidazol, 500 mMNaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) y 10 mM (NaH2PO4, H2O); tampon 2: 20 mM imidazol, 500 mMNaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) y 10 mM (NaH2PO4, H2O)), o bien de manera isocratica, con un tampon que contiene de 50 a 500 mM imidazol, de 0 a 500 mMNaCl, de 5 a 10 mM (Na2HPO4, 2H2O)) y de 5 a 10 mM (NaH2PO4, H2O). Eventualmente, con el fin de mejorar la pureza del polipeptido segun la invencion, se pueden anadir otras etapas de purificacion. Puede tratarse de filtraciones, de cromatograffa de intercambio de iones, de cromatograffa de afinidad, de cromatograffa de interaccion hidrofoba, de exclusion esterica, o de cualquier otro tipo de cromatograffa.
Las fracciones de elucion de interes se separan en un gel de electroforesis en condiciones nativas y se tinen con azul de Coomasie, antes de ser agrupadas segun su perfil y se dializan en agua o un tampon fosfato o cualquier otro tampon adecuado para la conservacion del polipeptido segun la invencion. La concentracion del polipeptido se determina mediante el kit Sircol® (TebuBio) segun las instrucciones del fabricante o por el ensayo de Bradford o cualquier otro ensayo adecuado para la cuantificacion del polipeptido de la invencion. En algunos modos de realizacion de la invencion, el extracto proteico obtenido se digiere por la pepsina con el fin de determinar si el polipeptido segun la invencion esta estructurado en triple helice debido a la presencia, en la secuencia del polipeptido segun la invencion, de una repeticion de 10 veces el motivo GPP, descrito como que permite la trimerizacion de protefnas y peptidos derivados del colageno. En un modo privilegiado de realizacion, la digestion por la pepsina se realiza incubando el extracto proteico que contiene el polipeptido segun la invencion durante 5-6 horas en un bano maria a 37°C en presencia de pepsina en una relacion (concentracion extracto proteico)/(concentracion pepsina) de 20 por 1. La pepsina se reconstituye en un tampon 20 mM acetato de sodio ajustado a pH 4 con acido acetico. La mezcla extracto proteico/pepsina debe tener un pH acido. El pH se ajusta con acido acetico y se verifica sobre papel de pH. Despues de la digestion, la reaccion se detiene con 1/10 del volumen de mezcla de reaccion de 2 M Tris pH 11,4 con el fin de obtener una solucion a pH basico. La mezcla de reaccion se pasa despues o no sobre unos "cut off" para eliminar los fragmentos digeridos, concentrar y/o dializar la muestra contra cualquier tampon adecuado para la conservacion del polipeptido segun la invencion asf digerido. La digestion de las fracciones se verifica por migracion de estas ultimas sobre un gel de electroforesis, en condiciones nativas y se tine de azul de Coomasie.
La figura 1 presenta un perfil de electroforesis que muestra la presencia del polipeptido segun la invencion en el conjunto de las diferentes fracciones obtenidas despues de la purificacion sobre columna de afinidad. La banda principal obtenida tiene un peso molecular alrededor de 70 kDa. Se puede tambien observar la presencia de bandas que corresponden a protefnas de pesos moleculares de 14, 15, 17, 18, 30, 50, 60, 80, 150, 190, 250 y >250 kDa.
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Cabe senalar que el colageno se describe como no migrando a la masa molecular esperada, aquf aproximadamente 50 kDa para el polipeptido de la SEC 2 cuando esta en forma de trfmero. La digestion por la pepsina del extracto proteico obtenido confirma que la banda a 70 kDa corresponde claramente al polipeptido segun la invencion, estructurado en forma de una triple helice resistente a la digestion por la pepsina. El peso molecular de 70 kDa puede tambien explicarse por la presencia de modificaciones post-traduccionales a nivel de las cadenas alfa del polipeptido segun la invencion.
Ejemplo 5. Metodo de determinacion de la actividad de enlace del Willebrand mediante un ensayo ELISA
Uno de los modos de realizacion de la presente invencion consiste en la medicion de la actividad de enlace del factor Willebrand al polipeptido segun la invencion mediante la tecnica denominada ELISA, realizada en placas de 96 pocillos (Nunc Maxisorp). Para ello, se anade un volumen de 100 pl de una solucion que contiene el polipeptido a 2 o 10 pgml en un tampon fosfato o cualquier otro tampon adecuado, en cada pocillo y se incuba durante 18-20 h a 22°C. Despues de tres lavados con 200 pl de PBS-0,05% Tween, se anaden 200 pl de una solucion de BSA al 1% en un tampon fosfato (Euromedex, filtrada sobre 0,45 pm) en cada pocillo y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente (22°C). Despues de tres lavados con 200 pl de PBS-0,05% Tween, 100 pl de diferentes concentraciones (expresadas en UI/dL) de factor Willebrand purificado (Wilfactin 100 UI/mL, LFB) y/o de plasma de paciente diluido en tampon fosfato o cualquier otro tampon adecuado se incuban durante 1h30 a temperatura ambiente (22°C). Despues de tres nuevos lavados, se incuban durante 1 h a 22°C 100 pl de una solucion que contiene un anticuerpo primario anti-vWF acoplado con peroxidasa de rabano picante (Rabbit anti-human VWF/HRP, DAKO) diluido al 1/8000 en un tampon fosfato o cualquier otro tampon adecuado, despues se realizan 4 lavados como se ha descrito anteriormente. Se anaden despues 125 pl de solucion de tetrametilbencidina como sustrato para la peroxidasa (TMB, Sigma), despues se incuba durante 10 a 45 minutos maximo en oscuridad. La reaccion se interrumpe mediante adicion de 125 pl de GCl 2N (Sigma). La absorbancia se mide rapidamente a 450 nm en un espectrofometro (Wallaxvictor 3). Se realiza un blanco sustituyendo el vWF o el plasma por un tampon fosfato o cualquier otro tampon adecuado.
La figura 2 presenta un resultado obtenido por ELISA del enlace del factor Willebrand purificado (Willfactin, LFB) utilizado a 0; 0,4 y 2 UI/dL final con los polipeptidos segun la invencion que corresponden a la SEC 2, a la SEC 3, al colageno de tipo III (BD Biosciences, control positivo) y a las HCP (Host CellProteins, obtenidas de la misma manera que los polipeptidos segun la invencion a partir de celulas CHO no transfectadas, control negativo), que contiene respectivamente dos (SEC 2) y un (SEC 3) motivos de reconocimiento al factor Willebrand. Estos diferentes polipeptidos se utilizan a 10 o 2 pg/ml (Fig. 2A y 2B). Los resultados muestran que solo el polipeptido segun la invencion que contiene por lo menos dos motivos (SEC 2) de reconocimiento al factor Willebrand es capaz de unir este factor de manera equivalente al colageno de tipo III de referencia.
La figura 3 presenta un resultado obtenido por ELISA del enlace del factor Willebrand purificado (willfactin, LFB) utilizado a 2 UI/dL al polipeptido segun la invencion (SEC 2) despues de la digestion o no por la pepsina y obtencion de una fraccion pura que contiene la forma en triple-helice del polipeptido segun la invencion. El enlace de Willebrand se mide para una concentracion de 5 pg/ml de cada polipeptido. Los resultados muestran un fuerte aumento de la capacidad de enlace del polipeptido segun la invencion cuando esta unicamente en forma de un tiple- helice. Estos resultados indican que el tratamiento con pepsina permite digerir los contaminantes proteicos eventuales, procedentes de las celulas CHO-S y capaces de unirse a la columna de afinidad a base de nfquel o de cobalto, y/o digerir los polipeptidos segun la invencion no estructurados en triple-helice. Este resultado sugiere tambien que es la forma en triple helice que lleva la actividad del polipeptido segun la invencion.
La figura 4 presenta la medicion del enlace para diferentes concentraciones en factor Willebrand (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 1 y 2 UI/dL) del polipeptido segun la invencion (SEC 2) y del colageno de tipo III recubierto de 2 pg/ml. Se observa que el polipeptido segun la invencion tiene una sensibilidad equivalente a la del colageno de tipo iIi para las bajas concentraciones en Willebrand. Este punto es particularmente importante ya que el objetivo del ensayo que utiliza el polipeptido segun la invencion es determinar una actividad para unos valores plasmaticos en Willebrand muy bajos, tales como se observan para los pacientes de tipo 2.
La figura 5 presenta un resultado obtenido por ELISA del enlace del factor Willebrand purificado (Willfactin, LFB), utilizado a 2 UI/dL al polipeptido segun la invencion (SEC 2) y al colageno de tipo III utilizados a 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 y 0,03125pg/mL. Los resultados confirman que el polipeptido segun la invencion es capaz de unirse al factor Willebrand de manera equivalente al colageno de tipo III utilizado como referencia con la misma sensibilidad.
La aplicacion del polipeptido segun la invencion se refiere a la medicion de la actividad de enlace al factor Willebrand presente en el plasma de pacientes sanos o portadores de la enfermedad de Willebrand. La figura 6 presenta la medicion del enlace del factor Willebrand plasmatico al polipeptido segun la invencion para diferentes diluciones de un plasma de referencia, es decir al 1/50, al 1/100, al 1/200, al 1/400 y al 1/800. Estas diluciones son las clasicamente utilizadas para la determinacion de la curva estandar obtenida a partir de un plasma de referencia e indispensable para el calculo de la actividad de enlace del colageno al Willebrand para un paciente dado. Los resultados muestran la linealidad del enlace del factor Willebrand plasmatico al polipeptido segun la invencion con
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una recta de regresion lineal que posee un coeficiente de correlacion R2 igual a 0,9976.
La medicion del enlace del factor Willebrand al colageno debe permitir facilitar la clasificacion de los pacientes en los diferentes grupos de la enfermedad de Willebrand. La tabla I presenta los valores obtenidos por ELISA de plasmas de pacientes que pertenecen al tipo I, al tipo II o con sospecha de la presencia de anticuerpos anti-vWF (que imita un tipo III) frente a pacientes sanos, y la relacion medicion de actividad (CollagenBinding)/medici6n antigenica (Ag). Se constata que esta relacion es muy superior a 0,7 para los pacientes de tipo I, inferior a 0,7 para los pacientes de tipo II, y que los pacientes de tipo III o que poseen unos anticuerpos anti-vWF tienen unos % Cb y % Ag casi nulos, lo que confirma el interes del polipetpido segun la invencion para la clasificacion de estos pacientes. Cabe senalar que el polipetpido segun la invencion distingue mejor los pacientes de tipo I y II que el colageno de tipo III (un 100% de correlacion con los datos clfnicos frente al 78%).
Tabla I: Clasificacion de los pacientes sanos y patologicos en funcion de su relacion factor Willebrand CB/Ag (medicion de la actividad /CollagenBinding)/medicion antigenica (Ag)), siendo la medicion o bien sobre el polipeptido que tiene la o que es de secuencia SEC 2, o bien en el colageno de tipo III que sirve de referencia (BD Biosciences) recubierto con 2 pg/ml. El polipepido de secuencia SEC 2 permite distinguir los pacientes de tipo I de los pacientes de tipo II, con un porcentaje de correlacion a los datos clfnicos mejor que con el colageno de tipo III (un 100% frente al 78%).
- Sec 2 Colageno III
- pacientes
- %CB med. %AG Rel. CB/Ag interpre- tacion clasifi cacion Corre- lacion % CB med. %AG Rel. Co/Ag interpre- tacion Clasifi cacion Corre- lacion
- paciente 1
- 150 117 1,28 normal normal si 164 117 1,40 normal normal si
- paciente 2
- 150 86 1,74 normal normal si 105 86 1,22 normal normal si
- paciente 3
- 59 45 1,31 tipo 1 tipo 1 si 37 45 0,82 tipo 1 tipo 1 si
- paciente 4
- 22 17 1,29 tipo 1 tipo 1 si 24 17 1,41 tipo 1 tipo 1 si
- pacientes
- 33 22 1,50 tipo 1 tipo 1 si 17 22 0,77 tipo 1 tipo 1 si
- paciente 6
- 11 23 0,48 tipo 2 tipo 2 si 17 23 0,74 tipo 1 tipo 2 non
- paciente 7
- 20 40 0,50 tipo 2 tipo 2 si 19 40 0,48 tipo 2 tipo 2 si
- paciente 8
- 16 27 0,59 tipo 2 tipo 2 si 24 27 0,89 tipo 1 tipo 2 no
- paciente 9
- 1 5 0,20 AcvWF AcvWF si 0 5 0,00 AcvWF AcvWF si
- correlacion
- 100% 78,0%
El principal interes de la medicion del enlace del factor Willebrand al colageno VWF:CB (Von WillebrandFactor:CollagenBinding), por oposicion a la medicion de su enlace a GpIb despues de la activacion por la ristocetina, reside en el hecho de que esta determinacion es muy sensible a la perdida de los multfmeros de alto peso molecular, elementos que determinan la actividad del factor Willebrand. Permite entonces discriminar unos pacientes de tipo 2 y en particular los sub-tipos 2A y 2M.
Un reciente estudio ha demostrado el interes de la utilizacion de la N-acetilcistefna (NAC) en el tratamiento del purpura trombotico trombicutopenico (PPT) consecutivo a la adhesion de las plaquetas a unos multfmeros de factor Willebrand de tamanos muy elevados (Chen J et al., J Clin Invest. 2011 121(2):593-603). Estos multfmeros son la consecuencia de una deficiencia en la enzima de maduracion del factor Willebrand, ADAMTS13 (adisintegrinand metalloproteinasewithathrombospondin type 1 motif, member 13). El tratamiento de un conjunto de plasmas por NAC conduce a la perdida de los multfmeros de alto pesos moleculares y esta asociado a una disminucion del enlace de Willebrand al colageno.
Ejemplo 6. Comparacion del ensayo ELISA segun la invencion y de dos kits ELISA comerciales (a base de colageno) en el marco de un estudio clmico multicentrico
Como se ha descrito anteriormente, uno de los usos de la presente invencion consiste en la medicion de la actividad de enlace del factor Willebrand al polipeptido segun la invencion mediante la tecnica denominada ELISA. Con el fin de verificar este ensayo frente a kits ELISA a base de colageno ya comercializados, se ha realizado un estudio clfnico multicentrico (6 centros; autorizacion 2012/58 - ID RCB n° 2012-A01537-36) que incluyen 121 pacientes. Los plasmas recogidos provienen de pacientes que se distribuyen de la siguiente manera:
- 31 sujetos control,
- 28 pacientes con deficiencia de tipo 1,
- 9 pacientes con deficiencia de tipo 3,
- 18 pacientes con deficiencia tipo 2A,
- 17 pacientes con deficiencia tipo 2B,
- 18 pacientes con deficiencia tipo 2M.
Los kits ELISA comerciales seleccionados para este estudio contienen colageno de tipo I (TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA Collagen type I; ref: 5450311; TechnocloneGmbH), o bien colageno de tipo III (ASSERACHROM® VWF:CB;
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ref: 00239; Stago). La medicion de la actividad de enlace al factor Willebrand para estos dos kits se ha realizado segun las instrucciones proporcionadas por el proveedor.
En lo que se refiere al ensayo ELISA a base del polipeptido segun la invencion, se ha realizado a una concentracion final de 2 pg/ml del polipeptido que tiene la o de secuencia SEC 2 y la medicion efectuada sobre unos plasmas diluidos al 1/400 siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La gama estandar utilizada para la determinacion de la actividad de enlace al factor Willebrand se ha obtenido a partir del plasma estandar del kit ASSERACHROM® VWF:CB.
Los resultados presentados en la tabla II muestran las medias y desviaciones estandar obtenidas para cada uno de los ensayos. Se ha observado una buena correlacion entre los valores de actividad de los plasmas normales y patologicos obtenidos con el ensayo ELISA utilizando el polipeptido segun la invencion y los obtenidos con los kits comerciales.
Tabla II: Medicion de la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno para cada uno de los ELISA en funcion del tipo de deficiencia.
- CBA Stago Coll type III CBA Cryopep Coll type I ELISA Polipeptido SEC 2 2 pg/mL
- Pacientes (numero)
- Media (DE) Media (DE) Media (DE)
- Control (31)
- 103 (22,1) 161 (40,7) 98,1 (28,1)
- Tipo 1 (28)
- 23,9 (8,9) 22,2 (11,7) 19,7 (7,5)
- Tipo 3 (9)
- 1 (0,3) 0,2 (0,4) 1,6 (2,1)
- Tipo 2A (18)
- 15,0 (8,8) 10,0 (10,8) 16,9 (11,3)
- Tipo 2B (17)
- 29,5 (17,1) 31,4 (26,6) 31,8 (19,5)
- Tipo 2M (18)
- 21,8 (13,1) 15,9 (19,8) 22,5 (17,7)
Estos resultados refuerzan los datos que se refieren a la capacidad del polipeptido segun la invencion a:
• unir el factor Willebrand de manera equivalente a unos colagenos nativos,
• discriminar unos pacientes portadores de una deficiencia en factor Willebrand con respecto a unos controles,
• ser utilizado en un ensayo ELISA en sustitucion de los colagenos nativos.
Referencias
Referencias de patente
WO2010034718 WO2007052067 EP 1 870 460 EP 2383338
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Listado de secuencias
<110> NVH Medicinal
5
10
15
20
25
30
<120> Protefnas recombinantes derivadas del colageno con actividad de enlace al factor Willebrand
<130> 364053D29804
<150> FR 1259996 <151 > 19 octubre de 2012
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 552 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia derivada del colageno
<220>
<221> CDS <222> (1)..(552)
<220>
<221> sig_peptido <222> (1)..(69)
<400> 1
- atg
- atg
- age ttc gtg cag aag ggg age tgg ctg ett etc get ctg ett
- Met
- Met
- Ser Phe Val Gin Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu
- 1
- 5 10 15
- cat
- cct act att ate ctg gca cag ggg ege ccc gga get cct gga gag
- His
- Pro Thr lie He Leu Ala Gin Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Glu
- 20 25 30
- aga
- gga ttg cct gga cct cca ggg ccc aga gga get get gga gaa cct
- Arg
- Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro
- 35 40 45
- ggc
- aga gat ggc gtc cct gga gga cca gga atg agg ggc atg ccc gga
- Gly
- Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro
- Gly
- 50 55 60
- age
- cca gga gga cca gga age gat ggg aag cca ggg cct ccc gga
- age
- Ser
- Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly
- Ser
- 65
- 70 75 80
- cag
- gga gaa age ggc aga cca gga cct cct gga gag aac gga ttc cct
- Gin
- Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Phe Pro
- 85 90 95
- gga
- gaa agg ggg gat gca ggc get cct ggg gca cca gga cct cgt ggc
- Gly
- Glu Arg Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg
- Gly
- 100 105 110
- cag
- ccc ggg gtg atg gga ttc ccc ggg gat gcc ggg gca cct ggt gca
48
96
144
192
240
288
336
- Gin
- Pro Gly 115 Val Met Gly Phe Pro 120
- cct
- ggc cca cgt ggg cag cct gga
- Pro
- Gly 130 Pro Arg Gly Gin Pro 135 Gly
- ggc
- cca cca ggc cct ccc gga cca
- Gly 145
- Pro Pro Gly Pro Pro 150 Gly Pro
- cct
- cct
- gga CCt cct gga cca
- cct
- Pro
- Pro
- Gly Pro Pro 165 Gly
- Pro
- Pro
- aag
- gga cct cct gga cct gga tct
- Lys
- Gly Pro Pro 180 Gly Pro Gly Ser
Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala 125
gtc atg ggg ttc cct gga cca cct
Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Pro
140
cct gga cct cca ggc cct cct ggc
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
155 160
gga cct cca ggc cca aga ggc gac
Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asp
170 175
432
430
528
552
10
<210>2 <211 > 184 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia derivada del colageno <400> 2
Met Met Ser Phe Val Gin Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 10 15
His Pro Thr lie lie Leu Ala Gin Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Glu 20 25 30
Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro 35 40 45
Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly 50 55 60
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser 65 70 75 80
Gin Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Phe Pro 85 90 95
Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly 100 105 110
Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala 115 120 125
Pro Gly Pro Arg Gly Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Pro
5
130
135
140
- Gly
- Pro Pro Gly Pro
- 145
- Pro
- Pro
- Gly
- Pro
- Pro
- 165
- Lys
- Gly Pro Pro Gly
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 150 155 160
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asp 170 175
10
Pro Gly Ser
180
<210>3 <211 > 163 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia derivada del colageno <220>
<221> SENAL <222> (1)..(23)
15 <400>3
Met Met Ser Phe Val Gin Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 10 15
His Pro Thr lie lie Leu Ala Gin Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Glu 20 25 30
Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro 35 40 45
Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly 50 55 60
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser 65 70 75 80
Gin Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Phe Pro 85 90 95
Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly 100 105 110
Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 115 120 125
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 130 135 140
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Pro Gly 145 150 155 160
Pro Gly Ser
5
<210>4 <211> 205 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia derivada del colageno
10 <220>
<221> SENAL <222> (1)..(23)
<400> 4 15
Met Met Ser Phe Val Gin Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 10 15
His Pro Thr lie lie Leu Ala Gin Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Glu 20 25 30
Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro 35 40 45
Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly 50 55 60
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser 65 70 75 80
Gin Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Phe Pro 85 90 95
Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly 100 105 110
Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala 115 120 125
Pro Gly Pro Arg Gly Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Asp Ala 130 135 140
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly Gin Pro Gly Val Met Gly 145 150 155 160
Phe Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 165 170 175
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 180 185 190
Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Pro Gly Pro Gly Ser 195 200 205
20 <210>5
<211> 226 <212> PRT
10
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia derivada del colageno <220>
<221> SENAL <222> (1)..(23)
<400>5
Met Met Ser Phe Val Gin Lys 1 5
His Pro Thr lie lie Leu Ala 20
Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro 35
Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly 50 55
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser 65 70
Gin Gly Glu Ser Gly Arg Pro 85
Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly 100
Gin Pro Gly Val Met Gly Phe 115
Pro Gly Pro Arg Gly Gin Pro 130 135
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 145 150
Phe Pro Gly Asp Ala Gly Ala 165
Pro Gly Val Met Gly Phe Pro 180
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 195
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 210 215
Gly Ser 225
Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala 10
Gin Gly Arg Pro Gly Ala Pro
25 30
Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly 40 45
Gly Pro Gly Met Arg Gly Met 60
Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro 75
Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly 90
- Ala
- Pro 105 Gly Ala Pro Gly Pro 110
- Pro 120
- Gly Asp Ala Gly Ala 125 Pro
- Gly
- Val Met Gly Phe Pro
- Gly
140
Pro Arg Gly Gin Pro Gly Val 155
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg 170
- Gly
- Pro 185 Pro Gly Pro Pro Gly 190
- Pro 200
- Pro Gly Pro Pro Gly 205 Pro
- Arg
- Gly Asp Lys Gly 220 Pro Pro
Leu Leu 15
Gly Glu Glu Pro Pro Gly
Gly Ser 80
Phe Pro 95
Arg Gly
Gly Ala
Asp Ala
Met Gly 160
Gly Gin 175
Pro Pro
Pro Gly
Gly Pro
5
10
15
20
25
30
35
<210>6 <211 > 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Motivo de enlace al factor Willebrand <400>6
Gly Pro Arg Gly Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro 15 10
<210>7 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador <400> 7
Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro 1 5
<210>8 <211> 42 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> (Enlazador y motivo de enlace al factor Willebrand)x2 <400> 8
Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly Gin Pro Gly 15 10 15
Val Met Gly Phe Pro Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro 20 25 30
Arg Gly Gin Pro Gly Val Met Gly Phe Pro 35 40
Claims (9)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Willebrand en un paciente, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:a) Proporcionar un polipeptido seleccionado de entre:
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,- un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-GPRGQPGVMGFP-Z2-GPRGQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)ken los que, independientementeZ1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,K es un numero entero comprendido entre 4 y 15;b) Poner en contacto la muestra biologica, previamente extrafda del paciente, con dicho polipeptido;c) Medir el enlace del factor Willebrand presente en la muestra biologica del polipeptido de la etapa a) para medir la actividad de enlace del factor Willebrand al colageno. - 2. Procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Willebrand en un paciente segun la reivindicacion 1, caracterizado por que Z1 y Z2 representan independientemente un motivo peptfdico de formula (GAA1AA2)n1(GAA3AA4)n2(GAA5AA6)n3(GAAyAA8)n4, en el que, independientemente:• AA1, AA3, AA5 y AA7 representan independientemente los aminoacidos D o A,• AA2, AA4, AAa y AA8 representan independientemente los aminoacidos A o P,• n-i, n2, n3 y n4 se seleccionan independientemente de entre 0, 1, 2, 3 o 4 y la suma n-i+n2+n3+n4 es igual a 2, 3 o 4.
- 3. Procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Willebrand en un paciente segun una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que Z1 y Z2 representan el motivo peptfdico GDAGAPGAP de la SEC ID n° 7.
- 4. Procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Willebran segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que comprende ademas la determinacion de la cantidad de factor Willebrand presente en la muestra.
- 5. Procedimiento de diagnostico segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el polipeptido de la etapa a) se fija sobre un soporte solido.
- 6. Procedimiento de diagnostico segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que las etapas b) y c) se realizan en condiciones de flujo.
- 7. Polipeptido, caracterizado por que se selecciona de entre:- el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 2,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 184 de la SEC ID n° 2,- el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 4,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 205 de la SEC ID n° 4,- el polipeptido que comprende la secuencia de la SEC ID n° 5,
- el polipeptido que comprende la secuencia de la posicion 24 a la posicion 226 de la SEC ID n° 5,- un polipeptido que se une al factor Willebrand y que comprende el motivo peptfdico Z1-GPRGQPGVMGFP-Z2-GPR-GQPGVMGFP y el motivo peptfdico (GPP)k en los que, independientemente5 Z1 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos,Z2 representa un enlazador que comprende de 6 a 12 aminoacidos, k es un numero entero comprendido entre 4 y 15. - 8. Kit para determinar la actividad de enlace del factor Willebran al colageno, caracterizado por que comprende:10a) un polipeptido segun la reivindicacion 7;b) un reactivo de deteccion para determinar el enlace del factor Willebrand al colafeno.
- 9. Kit segun la reivindicacion 8, caracterizado por que comprende un anticuerpo que se une al factor Willebrand. 15
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