ES2254260T3 - Ensayo hematologico y reactivo. - Google Patents
Ensayo hematologico y reactivo.Info
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Abstract
Ensayo hematológico en el que se evalúa el potencial de coagulación sanguínea de un líquido corporal seleccionado de entre sangre o plasma completos, citrados o anticoagulados temporalmente de otra manera, haciendo reaccionar una muestra del líquido corporal con un reactivo activador, si resulta necesario induciendo la coagulación mediante la adición de uno o más aceleradores de coagulación, y estableciendo un valor indicativo del potencial de coagulación, en el que dicho reactivo comprende en combinación: (a) una cantidad predeterminada de factor Xa o un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y (b) una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno.
Description
Ensayo hematológico y reactivo.
La presente invención se refiere al proceso de
coagulación de la sangre, que implica una serie extremadamente
complicada de interacciones generalmente conocidas como cascada de
la coagulación, bien descrito en Thrombosis and Hemorrhage,
segunda edición, 1998, publicado por Williams and Wilkins. Implica
una serie de acciones proteolíticas en secuencia que llevan a la
coagulación y una serie complementaria de acciones inhibitorias
implicadas en la terminación o inhibición de la coagulación. Para
una mejor comprensión de la invención, la figura 1 muestra una
parte de la cascada de coagulación de la sangre. La activación de la
coagulación tiene lugar a lo largo de diferentes rutas, dos de las
cuales se ilustran: la ruta intrínseca y la ruta extrínseca. Las dos
rutas convergen, formando una ruta común que conduce a la formación
del coágulo. Los factores de coagulación son zimógenos inactivos o
cofactores inactivos que, cuando son cortados por una proteasa
activa, se activan (tal como indica el subíndice "a") y, a su
vez, activan el siguiente zimógeno o el precursor de un cofactor en
la cascada.
En la ruta extrínseca, el tejido dañado expone el
factor tisular, que activa el factor VII a su forma activada VIIa.
El factor tisular y el factor VIIa forman un complejo que activa el
factor X en la ruta común.
En la ruta intrínseca, unas superficies cargadas
negativamente quedan expuestas a la acción del factor XII y de
prekallikrein en el flujo sanguíneo. Se activa el factor XII a
factor XIIa, que activa el factor XI a factor XIa. El factor XIa
activa el factor IX a factor IXa. El factor IXa, el factor VIIIa,
los fosfolípidos y los iones de calcio libres resultan necesarios
para la formación del complejo tenasa, que activa el factor X.
El factor Xa, el factor Va, los fosfolípidos y
los iones de calcio libres resultan necesarios para la formación
del complejo protrombinasa, al que la presente invención se refiere
más particularmente, que activa la protrombina a trombina.
La trombina es el "enzima clave" de la
coagulación y se asocia a muchas acciones de retroalimentación
positiva y negativa y también al proceso de formación de coágulo
mismo de la sangre. Entre las retroalimentaciones positivas se
incluyen la activación de los factores V, VIII y XI. Entre las
retroalimentaciones negativas se incluyen la activación de la
proteína C en presencia de trombomodulina. El proceso de formación
de coágulo incluye el corte del fibrinógeno para formar fibrina y
la activación de las plaquetas.
Son importantes varias interacciones inhibidoras
endógenas, y se representan en la figura en cursiva y en línea
discontinua. De esta manera, la antitrombina, un inhibidor con un
espectro relativamente amplio cuya actividad resulta muy
incrementada por las heparinas, los heparinoides y los
glicosaminoglicanos, inhibe el factor Xa, la trombina, el factor
XIa y el factor XIIa. El cofactor II de la heparina es un inhibidor
endógeno más específico que se une a la trombina y cuya actividad
también resulta acelerada por la heparina y adicionalmente por el
dermatán sulfato. La proteína C activada inactiva el factor VIIIa y
el factor Va. El inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI)
inhibe el factor Xa y el complejo factor tisular/factor VIIa de
manera dependiente del factor Xa.
Resulta necesario un equilibrio apropiado entre
los factores activadores e inhibidores para la función fisiológica
del sistema de la coagulación. En determinadas situaciones, por
ejemplo en la hemofilia o en el lupus, se encuentran ausentes
factores esenciales o se encuentran presentes materiales
(anticoagulantes) que interfieren con el sistema de la
coagulación.
Además, algunas sustancias de origen animal
pueden interferir con los factores de coagulación. Por ejemplo la
hirudina, una proteína procedente de la glándula salival de la
sanguijuela medicinal es un inhibidor de la trombina muy potente.
Las proteínas procedentes de los venenos de serpientes pueden
estimular determinados factores y conducir a la coagulación y a la
formación de coágulo. En particular, algunos venenos de serpientes
activan el factor X y/o el factor V y pueden utilizarse en ensayos
in vitro para anticoagulantes.
Debido a que la formación de los complejos
protrombinasa y tenasa depende de la presencia de iones de calcio
libres, resulta posible la anticoagulación temporal, por ejemplo con
citrato (u otro agente acomplejante iónico), de una muestra de
sangre. Ello permite el transporte y centrifugación de una muestra
sin que se produzca la formación de coágulo y también permite
llevar a cabo determinadas reacciones analíticas evitando que se
formen dichos complejos.
La adición posterior de iones de calcio puede
estimular inmediatamente la activación de la protrombina a trombina
en presencia de fosfolípidos.
Con frecuencia resulta necesario tratar la sangre
con sustancias que presentan un efecto coagulante (en el caso de
las complicaciones hemorrágicas) o un efecto anticoagulante (para la
prevención o tratamiento de las complicaciones trombóticas y
durante intervenciones que comportan el contacto de sangre con
materiales artificiales, por ejemplo durante la circulación
sanguínea extracorpórea).
\newpage
Puede llevarse a cabo una anticoagulación de
larga duración utilizando antagonistas de la vitamina K, tal como
la warfarina u otros anticoagulantes orales derivados de la
coumarina. Estas sustancias conducen a la alteración de la
actividad de coagulación de la sangre al interferir con la formación
de determinados factores de coagulación. Sin embargo, debido a que
no inhiben factores de coagulación ya formados, se requieren varios
días para conseguir una anticoagulación estable. En muchas
situaciones resulta necesaria una anticoagulación rápida. Una
estrategia para conseguir la anticoagulación en pacientes es la
inhibición directa o indirecta de los factores de coagulación
activados. Puede conseguirse la inhibición de determinados factores
utilizando heparinas y heparinoides, que requieren antitrombina y/o
cofactor II de la heparina de procedencia plasmática, e inhibidores
directos naturales o sintéticos de los factores IIa (trombina) y Xa
(por ejemplo la hirudina, el argatrobán, y el anticoagulante de
garrapata). Todas estas sustancias reconocen principalmente el
factor X activado (FXa) y/o la trombina. Resulta importante
utilizar una intensidad apropiada de anticoagulación debido a que
una anticoagulación excesivamente elevada, y también una
anticoagulación inapropiadamente baja, podrían provocar una pérdida
de tejido orgánico e incluso la muerte del paciente.
Algunos fármacos anticoagulantes, por ejemplo la
heparina no fraccionada (HNF), poseen una farmacocinética altamente
variable y su utilización exige el seguimiento del estado del
paciente mediante ensayos del plasma del paciente tratado y, en
caso necesario, la adaptación de la dosis anticoagulante
individual.
Otras estrategias de anticoagulación, tales como
la utilización de heparinas de bajo peso molecular (HBPM), no
requieren rutinariamente el seguimiento del efecto anticoagulante,
debido a que la farmacocinética habitualmente es menos variable.
Las HBPM, que contienen únicamente parte de la cadena
glicosaminoglicano de la heparina, es menos activa que la HNF y con
frecuencia se considera de utilización más segura. Además, con las
HBPM existen casos en los que la evaluación de laboratorio del
efecto del fármaco resulta obligada, por ejemplo en el caso de
complicaciones hemorrágicas bajo tratamiento de anticoagulantes,
eliminación del fármaco sospechada o manifiestamente alterada (por
ejemplo debido a una disfunción renal), una farmacocinética no
habitual (por ejemplo en niños o en pacientes muy obesos) o una
dosificación sospechada o potencialmente excesivamente baja o alta.
La prolongación de la coagulación depende de la concentración del
anticoagulante en la muestra.
La European Pharmacopeial Commission ha adoptado
un estándar para la evaluación de potencia de las HBPM en términos
de la actividad antifactor Xa (aXa).
Entre los métodos para la medición del efecto
sobre la coagulación y/o la concentración en sangre o en el plasma
de inhibidores directos o indirectos de factores de coagulación
activados se incluyen:
- a)
- la evaluación de la inhibición de los factores de coagulación (por ejemplo FIIa y FXa) mediante análisis de sustrato cromogénico, y
- b)
- los denominados "métodos de formación de coágulo", por ejemplo el ensayo aPTT (tiempo de la tromboplastina parcial activada), el ensayo ACT (tiempo de formación de coágulo activado), el ensayo TT (tiempo de trombina), el ensayo ECT (tiempo de formación de coágulo de ecarina) y el ensayo Heptest®. Los métodos de coagulación se caracterizan por el hecho de que la coagulación se activa mediante diferentes regímenes y porque se mide el tiempo desde la activación de la coagulación hasta la detección de la misma en la muestra. El tiempo de formación de coágulo puede convertirse en unidades de concentración directa estableciendo una curva de calibración con reactivos de calibración apropiados.
Habitualmente se añade una muestra de plasma a un
reactivo que contiene una cantidad definida de factor IIa o de
factor Xa (en determinados ensayos también se añade antitrombina).
Durante un periodo de incubación, el factor Xa/IIa se inactiva
parcialmente con el anticoagulante mismo o con complejos de
anticoagulante y antitrombina endógena o exógena. Se añade un
sustrato cromogénico, siendo degradado por el factor residual
Xa/IIa, incrementando la densidad óptica, lo que se detecta
ópticamente. Mediante la utilización de una curva de calibración,
se calcula la actividad del antifactor Xa/IIa o la concentración de
anticoagulante.
Estos métodos permiten realizar una evaluación
específica de la concentración de anticoagulante. Sin embargo, son
relativamente caros y requieren instrumentos especializados y por lo
tanto no se aplican ampliamente en la práctica clínica. Además, no
se evalúa la interacción del anticoagulante con el sistema de
coagulación del paciente y no se obtiene un reflejo directo de la
situación in vivo.
Se añade una muestra de sangre o (más
habitualmente) de plasma a un reactivo que contiene un activador de
contacto (con frecuencia sustancias con superficies cargadas
negativamente, tales como el ácido elágico, la celita o el caolín)
y fosfolípidos, y se incuba durante 2 a 10 minutos en ausencia de
iones de calcio. El tiempo registrado desde la adición de Ca^{2+}
a la muestra hasta la detección de la formación de fibrina es el
tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT).
El ensayo aPTT presenta las ventajas de que es un
ensayo ampliamente disponible, el método de formación de coágulo es
simple y existe una amplia base empírica para el seguimiento de la
terapia anticoagulante. Aunque la aPTT es un método relativamente
mal estandarizado, se utiliza con frecuencia para el seguimiento de
la heparina no fraccionada (HNF), mientras que con este ensayo no
puede realizarse el seguimiento de la HBPM debido a su pobre
capacidad de respuesta. Además de su baja sensibilidad a la HBPM, el
ensayo adolece de una relación dosis-respuesta no
lineal a los inhibidores directos de la trombina, tales como la
hirudina, una sensibilidad excesiva a HNF, una mala estandarización
entre los diferentes instrumentos, reactivos, e incluso diferentes
lotes del mismo reactivo. Además, la curva de
dosis-respuesta para la heparina no es lineal.
Con respecto al mecanismo del ensayo de aPTT,
debe indicarse que el inicio de la coagulación mediante activación
por contacto (la denominada etapa de contacto) no es parte de la
ruta hemostática fisiológica en el cuerpo. La etapa de contacto es
difícil de estandarizar, lo que constituye uno de los motivos para
la muy mala estandarización del ensayo. Intervienen muchos factores
en la activación de la coagulación en el ensayo de aPTT (XII, XI,
VIII, IX, X, V, II), mientras que la inhibición de los factores X e
II se cree que es la ruta principal de la terapia anticoagulante
con heparinas, heparinoides y los inhibidores directos. Por estos
motivos, el ensayo de aPTT no proporciona una estimación muy
realista de la anticoagulación alcanzada en el paciente, ni evalúa
la anticoagulación con una especificidad apropiada al tratamiento
anticoagulante. Además, el ensayo también es sensible a la
presencia de anticoagulantes de lupus.
El ensayo del tiempo de formación de coágulo de
ecarina es un ensayo basado en la coagulación que se utiliza para
el seguimiento del efecto de los agentes antitrombina directos. La
ecarina, una proteasa purificada obtenida del veneno de la
serpiente Echis carinatus, convierte la protrombina en
meizotrombina (un precursor de la trombina), produciendo un punto
final de la coagulación en sangre y en plasma completos citrados.
Los agentes antitrombina, tales como la hirudina, se unen a la
meizotrombina, prolongando el tiempo de formación de coágulo de
ecarina. El ensayo ECT se ve muy afectado por niveles bajos de
protrombina en la muestra de plasma.
Este método consiste en principio en la adición
de sangre a caolín o a celite, y en la medición del intervalo de
tiempo hasta la formación de fibrina en la muestra. Este método se
encuentra ampliamente disponible. Es un método realizado junto al
paciente con un tiempo de retorno corto y un intervalo de medición
amplio que permite el seguimiento de heparinización de dosis
elevada durante la cirugía cardiovascular.
El ensayo ACT presenta muchas limitaciones:
presenta una correlación pobre con la concentración de
anticoagulante (según la evaluación realizada mediante análisis de
sustrato cromogénico), una sensibilidad baja a las concentraciones
más bajas de heparina (de hasta 0,7 U de HNF/ml con niveles normales
de ACT), una sensibilidad baja a la HBPM, tiempos de formación de
coágulo prolongados y una dependencia muy elevada de los factores de
coagulación del paciente. Los diferentes métodos ACT aplicados
clínicamente no se encuentran bien estandarizados.
El método consiste en la adición de una cantidad
determinada de trombina a la muestra de plasma y en la evaluación
del intervalo de tiempo hasta la detección de la formación de
coágulo. El método presenta la ventaja de que evalúa
específicamente la inhibición de la trombina. Aunque este ensayo
simple es una medida directa de la actividad antitrombina en el
plasma, no se utiliza ampliamente debido a su baja fiabilidad y mala
estandarización. Además, no resulta posible evaluar la inhibición
del factor Xa. El estrecho intervalo de medición depende
fuertemente de la concentración añadida de trombina y pueden
obtenerse diferentes resultados en respuesta a la concentración de
trombina, la especie, la presencia de calcio y la proporción de
volúmenes entre trombina y muestra.
El ensayo se basa en principio en la incubación
de una muestra de plasma citrado con factor Xa bovino. Tras un
determinado tiempo de incubación, se añade un reactivo que contiene
fosfolípidos y plasma bovino, seguido de una solución de cloruro de
calcio para la recalcificación.
Este ensayo permite una evaluación sensible de la
HBPM y de la HNF mediante un método de formación de coágulo. Sin
embargo, implica un método relativamente complicado en tres etapas y
requiere plasma bovino (que podría limitar el realismo de la
estimación del efecto anticoagulante).
Este ensayo, descrito en la patente US nº
4.946.775, consiste en principio en la incubación de una muestra de
plasma o de sangre con factor Xa. Tras un determinado periodo de
incubación, se añade un reactivo que contiene cloruro de calcio,
fosfolípidos y una fracción de plasma bovino y se registra el tiempo
hasta la detección de coagulación. El fabricante informa de que la
fracción de plasma bovino es rica en factor V y en fibrinógeno,
aunque presenta concentraciones reducidas de protrombina y de otros
factores de coagulación y de esta manera no coagulará por sí
misma.
Al igual que el ensayo original de Yin, el método
proporciona una evaluación sensible de la HBPM y de la HNF en un
ensayo de formación de coágulo relativamente simple. Sin embargo, el
Heptest® presenta una sensibilidad baja a los inhibidores directos
de la trombina, tales como la hirudina; resulta obligada una
estandarización elevada de la fracción de plasma bovino; el efecto
de la fracción de plasma bovino sobre el sistema de coagulación del
paciente no está absolutamente definido y su rendimiento sobre los
analizadores ópticos puede resultar problemática debido a que la
señal óptica no es concluyente, tal como resultará evidente. Aunque
Heptest® es un método simple, no se utiliza muy ampliamente.
La química y la farmacología de la heparina y de
ensayos tales como los que se han descrito de manera general
anteriormente se describen en Thrombosis and Hemorrhage (op.
cit.), y en Kandrotas, R.J., Heparin Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics, Clin. Parhamcokinet. vol. 22, páginas
359-374, 1992.
Aunque la mayoría de los ensayos conocidos se
llevan a cabo utilizando reactivos líquidos, se han desarrollado
sistemas, generalmente para la aplicación junto al paciente, en los
que los reactivos se encuentran soportados en estado seco. Se
describen ejemplos de estos sistemas en las patentes US nº
4.756.884, nº 4.861.712, nº 5.059.525,
nº 5.110.727, nº 5.300.779 y EP nº A-680727.
nº 5.110.727, nº 5.300.779 y EP nº A-680727.
La presente invención está destinada a
proporcionar un ensayo hematológico simple y fiable que sea tanto
sensible como de sensibilidad regulable, con el fin de cubrir el
seguimiento de una diversidad de anticoagulantes, sobre todo HBPM,
HNF, heparinoides, dermatán sulfato, inhibidores naturales o
sintéticos del factor Xa e inhibidores del factor IIa, tales como
el argatrobán o la hirudina, y en su forma preferente proporciona
una línea base estable cuando se utiliza con coagulómetros ópticos.
La invención presenta muchas aplicaciones además del seguimiento
del tratamiento anticoagulante, tal como se pondrá de manifiesto
posteriormente. En adelante son utilizadas las definiciones
siguientes:
En términos generales, el potencial de
coagulación sanguínea representa la capacidad de la sangre de un
paciente de coagular, o más específicamente, su capacidad de
activar o de inhibir los factores de coagulación. Este potencial se
define por conveniencia en la presente especificación como un valor,
que puede proporcionarse en términos de comparación, o de
proporción respecto a un valor normal o estándar, de la capacidad de
una muestra, por ejemplo de sangre o de plasma completos humanos, o
de otro líquido corporal de mamífero que contenga sangre o plasma
completos, de coagular hasta el punto de formación de trombina o de
coagulación. El valor puede medirse en términos de tiempo
transcurrido desde la inducción de la coagulación, por ejemplo
mediante la adición a una muestra de uno o más aceleradores de
coagulación, tales como fosfolípidos e iones de calcio. Sin
embargo, un valor indicativo del potencial de coagulación puede ser
(o puede inferirse a partir de) un valor medido indirectamente, por
ejemplo un valor indicador de un agente analítico accesorio que se
haya añadido, por ejemplo un sustrato cromogénico. Ello puede
proporcionar un valor, por ejemplo de la actividad de un componente,
tal como el factor Xa (que activa la protrombina a trombina), o la
actividad de la trombina.
Se define como un material o sustancia, o mezcla
de los mismos, que acelera considerablemente la tasa de formación
de la trombina. Preferentemente es una sustancia que completa el
grupo de sustancias necesario para establecer el complejo
protrombinasa. De esta manera, el complejo protrombinasa
completamente formado cataliza la formación de trombina a una tasa
que es 300.000 veces más eficiente que la acción del factor Xa por
sí solo. Además de los factores Va y Xa, el complejo protrombinasa
requiere la presencia de fosfolípidos (o plaquetas) y de iones de
calcio (aunque pueden sustituirse por otros iones).
Se define como un agente añadido al sistema de
reacción, por ejemplo a una muestra previamente o, más normalmente,
tras el tratamiento, que permite la provisión de una actividad
convenientemente observable o detectable de otra manera. Un agente
accesorio utilizado con frecuencia es un sustrato cromogénico: un
péptido con grupos de color diferenciado que resultan liberados
cuando se actúa sobre el sustrato, por ejemplo con el factor Xa y/o
con la trombina. Estos agentes pueden diseñarse específicamente para
la detección de la actividad de factor Xa o para la detección de la
formación de trombina. La utilización de sustratos peptídicos se
comenta en Witt, Irene, Test Systems with Synthetic Peptide
Substrates in Haemostaseology, Eur. J. Clin. Chem. Clin.
Biochem. vol. 29, páginas 355-374, 1991.
Huisse et al., Thrombosis Research, vol.
44, nº 1, páginas 11-22, 1986, describen estudios
realizados sobre sangre de un paciente con protrombina anormal.
Como parte del estudio, se incubó una muestra purificada del
paciente con una combinación de factores Xa y Va, y además con una
combinación de factor Xa y veneno de Echis carinatus
(diferente de la víbora de Russell). No se proporciona ninguna
enseñanza de un análisis rutinario de sangre completa o
citrada.
van Rijn et al., Biochemistry, vol. 23, nº
2, páginas 4557-4564, 1984, describen un estudio del
efecto del factor Va y de los fosfolípidos sobre la formación del
"complejo enzima-sustrato" en el curso de este
estudio; describen la incubación de albúmina de suero humano con
factor Xa +/- factor Va. No se da a conocer ningún análisis
rutinario de sangre completa o citrada.
Según un primer aspecto, la invención proporciona
un ensayo hematológico en el que se evalúa el potencial de
coagulación sanguínea de un líquido corporal seleccionado de entre
sangre o plasma completos o citrados (o anticoagulados
temporalmente de otra manera), mediante la reacción de una muestra
del líquido corporal con una cantidad de un reactivo activador,
en caso necesario, induciendo la coagulación
mediante la adición de uno o más aceleradores de coagulación, y
estableciendo un valor indicativo del potencial
de coagulación,
en el que dicho reactivo comprende, en
combinación,
- (a)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o de un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (b)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno.
Aunque resulta normal utilizar una solución
acuosa tampón como un medio para el reactivo activador, la
utilización de un tampón no siempre resulta necesaria.
Aunque los ensayos preferentes que se describen
posteriormente se llevan a cabo en muestras de cantidad
predeterminada, por ejemplo de peso o volumen de sangre o plasma,
la invención resulta aplicable en sistemas junto al paciente que no
requieren necesariamente una cantidad exacta. Un ejemplo de dicho
sistema de junto al paciente es el sistema CoaguChek®, disponible
de Roche Diagnostics, Mannheim.
El valor requerido puede establecerse mediante la
medición del tiempo para que dicha muestra de cantidad
predeterminada alcance un inicio detectado (directa o
indirectamente) de formación de coágulo, por ejemplo utilizando un
coagulómetro óptico o mecánico, o alternativamente mediante la
adición a la muestra tratada de un agente analítico accesorio que
proporcione un valor detectable. El reactivo analítico puede ser un
sustrato sintético específico para la medición de la actividad de
trombina o de la actividad de factor Xa y que detecte la actividad
apropiada. Aunque los sustratos cromogénicos son mejor conocidos y
generalmente resultan preferentes, puede utilizarse un sustrato que
presente propiedades fluorogénicas, amperogénicas o
luminogénicas.
El valor requerido también puede establecerse
mediante la adición al sistema de reacción de partículas que
muestren un comportamiento mecánico, magnético o eléctrico durante
la coagulación y detectando el comportamiento apropiado.
Habitualmente el valor obtenido con dicha muestra
de cantidad predeterminada se compara con el de uno o más
estándares de referencia a fin de evaluar el potencial de
coagulación. La muestra de referencia puede ser una muestra
comparable de líquido corporal normal, por ejemplo de sangre o de
plasma, o puede comprender sangre o
plasma.
plasma.
El ensayo puede utilizarse para la determinación
de un componente de coagulación sanguínea o aditivo de tratamiento
en una muestra de líquido corporal que comprende una cantidad
predeterminada de sangre o de plasma humano o animal mediante la
comparación del potencial de coagulación con el de uno o más
estándares. El potencial de coagulación puede compararse con el de
una muestra comparable de líquido corporal normal y/o con el de una
muestra comparable de líquido corporal que carezca de dicho
componente (o aditivo) o que contenga un exceso conocido de dicho
componente (o aditivo).
En un ensayo preferente, dicho valor se establece
detectando uno de entre:
- (i)
- el tiempo desde dicha adición hasta el inicio de la formación de coágulo,
- (ii)
- el tiempo desde dicha adición hasta la detección de actividad de trombina libre;
- (iii)
- la actividad de trombina, o
- (iv)
- la actividad de factor Xa.
Preferentemente el reactivo activador incluye una
cantidad predeterminada de fosfolípidos o de plaquetas naturales o
sintéticas, y el método incluye la adición en el sistema de reacción
de un acelerador de coagulación que comprende una cantidad
predeterminada de iones de calcio (o de iones funcionalmente
equivalentes).
Resulta preferente utilizar iones de calcio como
acelerador de coagulación.
Normalmente se añaden fosfolípidos,
preferentemente en una cantidad predeterminada en una etapa inicial,
por ejemplo en el reactivo activador y/o previamente a una etapa de
incubación, aunque la invención incluye la posible utilización de
fosfolípidos como acelerador, en este caso pueden añadirse iones de
calcio junto con el reactivo activador.
El ensayo preferentemente se lleva a cabo en
plasma humano, aunque resulta aplicable a sangre completa humana (o
sangre o plasma animal). En el ensayo preferente que utiliza plasma
o sangre completa unida a calcio, preferentemente de origen humano,
no se forma complejo protrombinasa hasta que se inicia la
coagulación añadiendo iones de calcio u otro acelerador de
coagulación. Se cree que, previamente al establecimiento o formación
del complejo protrombinasa, el factor Xa, añadido en el ensayo de
la invención, se ve progresivamente inactivado por cualquier
anticoagulante presente que resulte efectivo contra el factor Xa.
Cuando se ha formado el complejo protrombinasa, se protege el
factor Xa contra cualquier inactivación adicional y puede
determinarse la actividad final de una manera estable.
El ensayo de la invención resulta particularmente
útil para el seguimiento del efecto sobre la coagulación sanguínea
en un paciente de una dosis de anticoagulante, especialmente
inhibidores naturales o sintéticos del factor Xa y/o trombina
(factor IIa), y en particular, de heparina no fraccionada (HNF),
heparina de bajo peso molecular (HBPM), dermatán sulfato,
argatrobán, hirudina modificada e hirudina. Puede utilizarse para
el seguimiento del efecto sobre la coagulación sanguínea en un
paciente de una dosis de anticuerpo contra uno o más componentes de
la coagulación sanguínea o para evaluar el potencial de coagulación
sanguínea de un paciente del que se sospecha una deficiencia o una
superabundancia de uno o más componentes de coagulación sanguínea,
tales como factores de coagulación, que pueden ser enzimas o
proenzimas anticoagulantes o coagulantes.
Puede utilizarse para evaluar el potencial de
coagulación sanguínea de sangre completa o de plasma de la que se
sospecha la presencia de un anticuerpo contra uno o más componentes
de la coagulación sanguínea, por ejemplo anticoagulante de
lupus.
Resulta preferente utilizar como fuente de dicho
enzima activador de factor V endógeno, un veneno de serpiente que
contenga un componente activador del factor V y que presente una
concentración reducida de componente activador del factor X. La
fuente preferente es el activador de factor V procedente de veneno
de víbora de Russell (RVV-V). Éste se describe en,
por ejemplo, Tokunaga et al., The Factor
V-activating Enzyme (RVV-V) from
Russell's Viper Venom, Journal of Biological Chemistry, vol.
263, páginas 17471-17481, 1988, y se puede obtener
comercialmente de Pentapharm AG, Basel. Entre otros posibles venenos
(adecuadamente purificados para reducir la concentración de
componente activador del factor X) se incluyen aquellos procedentes
de Vipera lebetina, especies de Bothrops, especies de
Akgistrodon y especies de Echis.
Un método preferente comprende las etapas
siguientes:
- mezclar una muestra del líquido corporal con una cantidad del reactivo activador, incubar la mezcla,
- añadir dicho acelerador (y opcionalmente un agente analítico accesorio), y
- establecer un valor indicativo del potencial de coagulación.
En particular, el ensayo preferente comprende las
etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- una cantidad predeterminada comprendida entre 0,01 y 10 nkat/ml (entre 0,0053 y 5,3 mg/ml) de factor Xa,
- una cantidad predeterminada comprendida entre 0,05 y 10 (preferentemente 5) U/ml de RVV-V, y (opcionalmente) una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 200 \mug/ml de fosfolípidos, en una solución acuosa tampón que contiene Tris/HCl 10 a 200 mM, entre 0,6% y 1,2% p/v de NaCl y entre 0,01% y 1,0% p/v de albúmina.
- ii.
- mezclar una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 100 \mul de plasma pobre en plaquetas citrado (o unido a Ca de otra manera) con una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 100 \mul del reactivo activador,
- iii.
- incubar la mezcla,
- iv.
- añadir una cantidad predeterminada comprendida entre 10 y 100 \mul de CaCl_{2} de entre 2 y 200 mM (preferentemente de 100 mM),
- v.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporcione un valor detectable, y
- vi.
- establecer dicho valor.
\newpage
El tampón preferentemente presenta un pH
comprendido entre 6 y 10, preferentemente de entre 6 y 9, más
preferentemente de entre 7 y 8, y todavía más preferentemente de pH
7,4.
Más preferentemente el método comprende las
etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- 0,4 nkat/ml (0,021 mg/ml) de factor Xa,
- 4 U/ml de RVV-V, y
- 50 \mug/ml de fosfolípidos procedentes de una cefalina cerebral de conejo,
- en una solución acuosa tampón que contiene Tris/HCl 50 mM, 0,9% p/v de NaCl y 0,5% p/v de albúmina a pH 7,4,
- ii.
- mezclar 50 \mul de plasma citrado pobre en plaquetas con 50 \mul del reactivo activador,
- iii.
- incubar la mezcla durante 3 minutos a 37ºC,
- iv.
- añadir 50 \mul de CaCl_{2} 25 mM, y
- v.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporcione un valor detectable, y
- vi.
- establecer dicho valor.
Aunque normalmente se utiliza una etapa de
incubación, en una modificación del ensayo anteriormente descrito
que resulta útil para evaluar concentraciones elevadas de heparina y
de anticoagulantes similares, el ensayo puede llevarse a cabo en
ausencia de incubación. Un ensayo preferente de este tipo comprende
las etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- 0,2 nkat/ml (0,011 mg/ml) de factor Xa,
- 2 U/ml de RVV-V,
- 25 \mug/ml de fosfolípidos procedentes de cefalina cerebral de conejo,
- en una solución acuosa tampón que contiene Tris/HCl 25 mM, 0,45% p/v de NaCl y 0,25% p/v de albúmina y CaCl_{2} 12,5 mM a pH 7,4,
- ii.
- mezclar 50 \mul de plasma citrado pobre en plaquetas con 100 \mul del reactivo activador,
- iii.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporcione un valor detectable, y
- iv.
- establecer dicho valor.
Preferentemente dicho valor se establece midiendo
el tiempo entre la adición de CaCl_{2} y el inicio de la formación
de coágulo con un coagulómetro óptico.
En un ensayo utilizado para evaluar la presencia
y/o la concentración de un componente coagulante o anticoagulante
sospechado en una muestra de plasma, la muestra puede diluirse en
plasma reducido únicamente en el coagulante o anticoagulante
sospechados y establecer el valor por comparación con el valor
observado en el plasma reducido y/o en el plasma normal.
También puede prediluirse una muestra de plasma
con plasma normal, una fracción de plasma de uno o más factores
individuales de coagulación de manera que se reduzca la influencia
de los efectos de matriz o para reducir la dependencia respecto a
los factores de coagulación en el plasma, o puede tratarse con una
sustancia que inactive la heparina o las sustancias similares a la
heparina, incrementando de esta manera la especificidad para
anticoagulantes no heparínicos. El ensayo puede llevarse a cabo en
una muestra de plasma que ha sido tratada con una sustancia que
activa o inactiva uno o más factores de coagulación.
La invención incluye además la utilización de un
kit de ensayos de coagulación sanguínea tal como se ha descrito
anteriormente, comprendiendo el kit, en combinación:
- (i)
- un reactivo activador tal como se ha indicado anteriormente o componentes separados del mismo,
- (ii)
- muestras de control y/o de calibración, y
- (iii)
- uno o más accesorios opcionales seleccionados de entre una solución acuosa de una sal de calcio (o equivalente) de concentración conocida, un agente analítico accesorio, plasma normal, una o más fracciones de plasma, uno o más factores de coagulación, agua y/o una o más soluciones tampón,
- o preparaciones liofilizadas equivalentes.
Preferentemente el agente analítico accesorio
comprende una o más soluciones o preparaciones liofilizadas de
sustratos sintéticos para la determinación de la trombina y/o del
factor Xa.
A continuación se describen las formas
preferentes de la invención haciendo referencia a los dibujos
adjuntos, en los que:
la figura 1 es un diagrama (descrito
anteriormente) que ilustra la cascada de coagulación sanguínea,
la figura 2 es un gráfico que ilustra las líneas
típicas de dosis-respuesta para HBPM, HNF e hirudina
en un ensayo Heptest®,
la figura 3 es un gráfico que muestra las curvas
de señal óptica producidas en un ensayo Heptest® típico,
la figura 4 es un diagrama que ilustra el
principio del presente ensayo,
la figura 5 es un gráfico similar a la figura 2
que ilustra las líneas típicas de dosis-respuesta
para HBPM, HNF e hirudina en un ensayo según la invención,
la figura 6 es un gráfico similar a la figura 3
que muestra curvas de señal óptica producidas en un ensayo según la
invención,
la figura 7 es un gráfico que ilustra el efecto
producido por la adición de cantidades adicionales de factor Xa,
la figura 8 es un gráfico que ilustra el efecto
producido por la omisión de la etapa de incubación,
la figura 9 es un gráfico que ilustra los
resultados obtenidos utilizando el ensayo de la invención y
utilizando el ensayo Heptest® en un paciente tratado con un
anticoagulante oral,
la figura 10 es un gráfico que muestra la
correlación entre los ensayos según la invención y los ensayos
realizados según el ensayo del antifactor Xa, realizados sobre
voluntarios tratados con HBPM,
las figuras 11a, 11b y 11c son gráficos similares
a la figura 5 que muestran el rendimiento con reactivos secos,
la figura 12 es una ilustración diagramática de
un dispositivo capilar de ensayo, y
la figura 13 es una ilustración diagramática de
una forma diferente de dispositivo capilar de ensayo.
Para la comparación con el ensayo según la
invención, la figura 2 muestra la relación
dosis-respuesta de Heptest® con los anticoagulantes
comunes HBPM, HNF e hirudina recombinante
(r-hirudina) en plasma de referencia normal humano.
Esta figura demuestra que la relativamente pobre capacidad de
respuesta de Heptest® de estos inhibidores directos de trombina, en
este caso de la hirudina.
La figura 3 muestra las señales ópticas del
ensayo Heptest® sobre microcoagulómetro Behring Coagulation System
(BCS) a 405 nm. La línea base de la muestra de combinación (plasma
citrado preparado según recomendaciones en el paquete Heptest®) no
es estable. Una reducción de absorbancia no permite la detección
exacta del inicio de la formación de coágulo. La curva de reacción
entera muestra ruido que podría presentar una influencia negativa
sobre la precisión, una desventaja cuando se utilizan coagulómetros
automatizados modernos para la detección de criterios de
valoración.
Un ensayo preferente según la invención permite
la evaluación del potencial de coagulación de muestras con un
método de formación de coágulo basado en la utilización de dos, y
preferentemente de tres, agentes activadores a concentraciones
predeterminadas junto con la utilización de iones de calcio,
normalmente para iniciar la formación de coágulo. Aunque este
método, al igual que el ensayo de Yin y el ensayo Heptest®, se basa
en la formación de un complejo protrombinasa sobre los
fosfolípidos, se resuelven muchas o la mayoría de las desventajas
indicadas, incluyendo las señales ópticas débiles, tal como se
describe con referencia a la figura 3. Este nuevo método es
sensible a HNF, a HBPM y a hirudina, y a otros inhibidores directos
o indirectos de factor Xa y/o de trombina en los intervalos de
concentración relevantes y en la práctica clínica. Además,
proporciona señales ópticas muy estables.
En el método preferente para llevar a cabo el
ensayo, se incuba una muestra de sangre o de plasma (de la que se
encuentran ausentes los iones de calcio o se han acomplejado o
unido, por ejemplo mediante citrado) con una cantidad definida de
factor Xa, fosfolípidos y enzima activador de factor V,
preferentemente con un reactivo activador especialmente preparado.
Tras un periodo de incubación, se recalcifica la mezcla de
muestra/reactivo, por ejemplo con CaCl_{2}, y se observa y se
registra el tiempo hasta el inicio de la formación de coágulo
(tiempo de formación de coágulo). Mediante la comparación con la
figura 1, la figura 4 ilustra el método de activación de manera
diagramática. Se muestran los componentes del reactivo activador en
letras grandes en negrita. La activación se basa en la formación de
un complejo protrombinasa, consistente en una cantidad
predeterminada de factor Xa, el factor V propio del paciente que ha
sido activado con una cantidad predeterminada de activador de
factor V procedente de veneno de víbora de Russell
(RVV-V), con fosfolípidos y con CaCl_{2}. La
recalcificación de la sangre o plasma citrado se utiliza para
completar la formación del complejo protrombinasa en la superficie
fosfolipídica y se inicia la formación de coágulo.
En contraste con métodos anteriores, tales como
el ensayo de Yin, en el que se genera el factor Va mediante
activación por retroalimentación positiva cuando se forma la
trombina, el método de la invención utiliza una etapa independiente
de la trombina para la activación completa inmediata del factor V en
la muestra a Va. En una modificación, puede añadirse un exceso de
factor V y/o de otros factores con el fin de conseguir que el
sistema de ensayo sea independiente de los cambios de actividad de
este factor. Los factores añadidos pueden ser simplemente plasma o
una fracción de plasma. Pueden utilizarse factores recombinantes o
purificados o mutaciones adecuadas.
Se preparó un reactivo activador que presentaba
la composición siguiente:
| NaCl en solución acuosa | 0,9% p/v |
| Tampón Tris/HCl, pH 7,4^{1} | 50 mM |
| albúmina^{2} | 0,5% p/v |
| factor Xa (Fxa)^{3} | 0,4 nkat/ml (0,021 mg/ml) |
| Activador de factor V procedente de | 4 U/ml |
| veneno de víbora de Russell (RVV-V)^{4} | |
| fosfolípidos^{5} | 50 \mug/ml |
Se mezclaron 50 \mul de plasma citrado pobre en
plaquetas con 50 \mul del reactivo activador y diversas cantidades
de los agentes anticoagulantes HBPM^{6}, HNF^{7} y
r-hirudina^{8} para formar muestras de ensayo. Las
muestras se incubaron durante 180 segundos a 37ºC. A continuación
se añadieron 50 \mul de solución de CaCl_{2} 25 mM a cada
muestra y se midió el tiempo de formación de coágulo en un
coagulómetro óptico BCS (Dade-Behring). En la
figura 5 se muestran los resultados en términos de concentración de
anticoagulante.
La comparación de la figura 5 con la figura 2
muestra una gran mejora de la sensibilidad (que se aproxima a un
factor de 2) sobre el Heptest®. En contraste con Heptest®, el ensayo
de la invención también resulta muy sensible para la hirudina.
Las señales ópticas para el ensayo se muestran en
la figura 6. Se observa una línea base muy estable a aproximadamente
405 nm en el Behring Coagulation System en comparación con la
figura 3, y se produce un acusado incremento de turbidez al
iniciarse la formación de coágulo. Las señales son muy concluyentes
y muestran un nivel de ruido bajo. Por lo tanto, puede esperarse
que el ensayo pueda adaptarse con facilidad a diferentes
instrumentos de detección óptica o mecánica de inicio de la
coagulación.
- 1
- de Sigma, Munich
- 2
- albúmina de suero humano, de Centeon, Marburg
- 3
- Fxa suministrado por Chromogenix, Essen
- 4
- de Pentapharm AG, Basel
- 5
- cefalina cerebral de conejo, de Pentapharm AG, Basel
- 6
- estándar WHO de HBPM, de Chromogenix, Essen
- 7
- heparina no fraccionada, de B. Braun-Melsungen, Melsungen
- 8
- hirudina recombinante (Lepirudin®, de Hoechst Marrion Roussel, Bad Soden).
Se obtuvo el plasma de referencia de Immuno,
Viena, y se reconstituyó siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Inesperadamente se descubrió que variando la
concentración de factor Xa añadido podía regularse la sensibilidad
del procedimiento de activación en un intervalo amplio.
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1, con la
excepción de que se prepararon reactivos activadores a diferentes
concentraciones de factor Xa (FXa), de entre 0,1 y 1,6 nkat/ml, y se
prepararon muestras de ensayo con 0,05 y 1 U/ml de HBPM. En la
figura 7 se muestran los resultados. Puede observarse que se
obtuvieron señales inesperadamente buenas, incluso con una
concentración reducida de factor Xa y se consiguió una línea base
estable incluso con muestras heparinizadas.
Este descubrimiento permite diseñar ensayos para
un amplio espectro de concentraciones de anticoagulantes
desconocidos, y resultan posibles una diversidad de diferentes
aplicaciones, entre ellas:
- a)
- ensayos para la inactivación del factor Xa y de la trombina mediante la evaluación de la actividad de trombina utilizando sustratos (por ejemplo sustratos cromogénicos) que proporcionan señales detectables de la trombina.
- b)
- ensayos para la inactivación del factor V mediante adición de proteína C activada o de proteína C endógena activada utilizando enzimas apropiados (por ejemplo Protac® o trombina/trombomodulina).
- c)
- ensayos para otros desconocidos, tales como activadores, inhibidores o sustratos que proporcionan señales detectables con el factor Xa o con la trombina.
También se descubrió que la realización del
procedimiento de activación sin etapa de incubación conducía a
intervalos de medición muy ampliados, especialmente para la heparina
no fraccionada, lo que resulta útil en la evaluación de
concentraciones elevadas de anticoagulante.
Se diluyó el reactivo activador del Ejemplo 1 con
un volumen igual de solución de cloruro de calcio 0,025 M con el
fin de producir un reactivo que presentase la composición
siguiente:
| NaCl en solución acuosa | 0,45% p/v |
| Tampón Tris/HCl | 25 mM (pH 7,4) |
| albúmina | 0,25% p/v |
| factor Xa (FXa) | 0,2 nkat/ml (0,011 mg/ml) |
| Activador de factor V procedente de | 2 U/ml |
| veneno de víbora de Russell (RVV-V)^{4} | |
| fosfolípidos^{5} | 25 \mug/ml |
| CaCl_{2} | 12,5 mM |
Se mezclaron muestras de ensayo de 50 \mul de
plasma citrado pobre en plaquetas que contenía cantidades variables
de HBPM, HNF y r-hirudina con 100 \mul de reactivo
activador y se midió el tiempo hasta el inicio de la formación de
coágulo, tal como en el Ejemplo 1. Los resultados mostrados en la
figura 8 demuestran un intervalo de medición amplio, con resultados
particularmente buenos para HNF.
El análisis de muestras de pacientes con
actividad reducida de factor tras el tratamiento con anticoagulantes
adicionales, por ejemplo por vía oral, mostró un efecto aditivo
mucho menor de la deficiencia de factor y de anticoagulante en el
nuevo ensayo que en el ensayo Heptest®. Ello puede deberse a la
fuerte activación directa del factor V en el nuevo procedimiento,
que minimiza un retraso potencial en la activación mediada por
trombina del factor V cuando la formación de trombina misma se
retrasa debido a una actividad reducida de factor. De esta manera,
pueden evaluarse las concentraciones de anticoagulante de manera más
fiable mediante el nuevo ensayo bajo estas circunstancias.
En el presente ejemplo, se prepararon muestras
procedentes de sangre de un paciente tratado con un anticoagulante
oral a un cociente internacional normalizado (CIN) de 3,2. Los
anticoagulantes orales utilizados en la actualidad son derivados de
la coumarina, tales como la warfarina. Se trata de inhibidores
competitivos de la vitamina K en la
gamma-carboxilación de los factores de coagulación
dependientes de la vitamina K, y principalmente se forman las
carboxiproteínas respectivas que carecen de la capacidad de unión al
calcio. La actividad de estos factores es
reducida.
reducida.
Las muestras contenían cantidades añadidas de 0,
0,25 y 0,5 U aXa de HBPM. Estas muestras se sometieron a Heptest® y
al procedimiento del Ejemplo 1. Se muestran los resultados
gráficamente en la figura 9. Se observa que el tratamiento de
anticoagulante oral presenta un efecto reducido o nulo sobre los
resultados de actividad de HBPM en el ensayo de la invención,
mientras que en el Heptest® se aprecia una fuerte diferencia.
Puede seguirse el procedimiento siguiente.
Se incuban muestras de 50 \mul de plasma
citrado recién congelado que contiene cantidades de HBPM, HNF y
r-hirudina (tal como en el Ejemplo 1) con 87,4
\mul de reactivo activador (Ejemplo 1) durante 5 minutos a 37ºC. A
continuación se añade una solución aceleradora que contiene:
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón Tris/HCl, 50 mM en 0,9% p/v de NaCl, pH 7,4 | 562,5 \mul |
| Pefabloc®, 10 mg/ml en 0,9% p/v de NaCl | 100 \mul |
| CaCl_{2} 25 mM | 100 \mul |
| Sustrato cromogénico para trombina^{1}, 4 mM en agua^{1}, por | 100 \mul |
| ejemplo Tos-Gly-Pro-Arg-pNaAcOH, de Pentapharma AG |
\vskip1.000000\baselineskip
Las soluciones se mezclan y se miden los cambios
de densidad óptica a 405 nm tras incubación de 5 minutos a 37ºC.
Se comparó el ensayo de la invención con un
ensayo de actividad antifactor Xa utilizando un sustrato
cromogénico. Se sometieron a ensayo 30 muestras obtenidas de
voluntarios tratados con HBPM tras el procedimiento del Ejemplo 1 y
utilizando el "ensayo de actividad antifactor Xa" de
Chromogenix, Möindal, Suecia, siguiendo las instrucciones del
fabricante. Los resultados mostrados en el gráfico de la figura 10
demuestran una buena correlación.
El ejemplo siguiente ilustra que el reactivo
activado de la invención puede reconstituirse tras la liofilización
o el secado al aire en muestras individuales que pueden someterse a
ensayo en cantidades muy reducidas adecuadas para las aplicaciones
de junto al paciente.
Se preparó un reactivo activado con la
composición siguiente:
| NaCl en solución acuosa | 0,9% p/v |
| Tampón Tris/HCl, pH 7,4^{1} | 50 mM |
| Glicina^{2} | 1,0% p/v |
| factor Xa (FXa)^{3} | 0,4 nkat/ml (0,021 mg/ml) |
| Activador del factor V procedente de víbora de | 4 U/ml |
| Russell (RVV-V)^{4} | |
| fosfolípidos^{5} | 50 \mug/ml |
Se introdujeron porciones de 1 ml en viales y se
liofilizaron o se añadieron 50 \mul del reactivo activador a
cubetas de microcoagulómetro KC4 y se secaron al aire durante 24
horas.
Se mezclaron 50 \mul de plasma citrado pobre en
plaquetas con 50 \mul del reactivo activador, reconstituido en
agua tras la liofilización, y diversas cantidades de los agentes
anticoagulantes HBPM^{6}, HNF^{7} y
r-hirudina^{8}, formando las muestras de ensayo.
A título de comparación, se añadieron 50 \mul de agua al reactivo
que se había secado al aire en las cubetas, y las muestras se
mezclaron con 50 \mul del plasma pobre en plaquetas y diversas
cantidades de los mismos agentes anticoagulantes HBPM, HNF y
r-hirudina, formando las muestras de ensayo. Las
muestras se incubaron durante 180 segundos a 37ºC, seguidamente se
añadieron 50 \mul de solución de CaCl_{2} 25 mM a cada muestra
y se midió el tiempo de formación de coágulo en un microcoagulómetro
KC4. Los resultados mostrados en las figuras
11a-11c en términos de anticoagulante demuestran que
el ensayo puede llevarse a cabo fácilmente con reactivos secados de
diferentes maneras y que pueden observarse ligeras diferencias entre
los diferentes métodos de secado en el rendimiento de los
ensayos.
- 1
- de Sigma, Buchs, Suiza
- 2
- de Sigma, Buchs, Suiza
- 3
- FXa, IL, Milano, Italia
- 4
- RVV-V, de Pentapharm AG, Basel, Suiza
- 5
- cefalina cerebral de conejo, Pentapharm Ltd., Basel, Suiza
- 6
- estándar WHO de HBPM, NIBSC, Potters Bar, UK
- 7
- estándar WHO de HNF, NIBSC, Potters Bar, UK
- 8
- hirudina recombinante, Pentapharm Ltd., Basel, Suiza
Se obtuvo plasma de referencia de Immuno, Viena,
y se reconstituyó siguiendo las instrucciones del fabricante.
En muchas situaciones los ensayos de coagulación
sanguínea deben llevarse a cabo directamente junto al paciente sin
transporte de la muestra a un laboratorio de emergencia. Entre las
ventajas del análisis junto al paciente se incluyen:
Un tiempo de retorno corto, debido a que se
requiere poco o nada de tiempo para el transporte de la muestra.
Ello permite adoptar decisiones terapéuticas rápidas dirigidas por
los resultados del seguimiento.
El transporte de una muestra a un laboratorio de
emergencia puede resultar muy caro, especialmente de noche y cuando
sólo se requiere el análisis de pocas muestras.
Resulta posible el autoensayo por parte del
paciente.
Entre los métodos de junto al paciente
disponibles para el análisis de la anticoagulación se incluyen PT
(tiempo de protrombina), aPTT (tiempo de protrombina parcial
activada), ACT (tiempo de formación de coágulo activado) y métodos
relacionados, así como algunos nuevos enfoques para el ensayo de la
heparina.
Los ensayos aPTT de junto al paciente presentan
las mismas limitaciones que la determinación de aPTT en el
laboratorio: dosis-respuesta no lineal para HNF e
hirudina, baja sensibilidad hacia HBPM y elevada variabilidad entre
los diferentes métodos disponibles. Los ensayos de PT presentan
desventajas similares.
El ACT se basa básicamente en la adición de una
sustancia con una superficie de elevada carga negativa
(habitualmente caolín o celite) a sangre no anticoagulada. Entre
las desventajas del ACT se incluyen su baja precisión, la baja
correlación de los valores de ACT con la concentración de heparina
no fraccionada o de hirudina, los largos tiempos de medición, así
como la elevada variabilidad entre los diferentes métodos
disponibles comercialmente. Además, la sensibilidad del ACT hacia
HBPM es muy reducida.
Otro enfoque es la titulación de protamina basada
en ACT: el sulfato de protamina antagoniza la heparina no
fraccionada. 1 U de heparina no fraccionada resulta antagonizada por
1 U de sulfato de protamina. Si se proporciona en exceso, la
protamina misma prolonga el ACT de una manera dependiente de la
concentración. De esta manera, cuando se añade protamina a
concentraciones crecientes en determinaciones de ACT y se analiza
una muestra heparinizada, los tiempos más cortos de formación de
coágulo se alcanzan cuando la concentración de protamina añadida se
corresponde mejor con la concentración de heparina en la
muestra.
En el ensayo de titulación de protamina de
Medtronic (Bull, M.H. et al., Anesthesiology
43(3):346-353, sept. de 1975), se
proporciona un cartucho con 6 cámaras que contienen el activador de
ACT y diferentes concentraciones de protamina. En estas cámaras se
llevan a cabo determinaciones separadas de ACT y se calcula la
concentración de heparina.
Entre las limitaciones de este método se
incluyen:
sólo resulta aplicable al seguimiento de HNF (la
hirudina no es antagonizada por la protamina, debido a que el
ensayo se basa en el ACT, no resulta aplicable al seguimiento de la
HBPM). Se requieren múltiples determinaciones para el análisis de
una muestra y resultan necesarios varios cartuchos diferentes para
el seguimiento de diferentes intervalos de concentración en la
terapia de heparina.
Varias publicaciones han descrito dispositivos de
ensayo de junto al paciente que utilizan cámaras de reacción
separadas por capilares, de manera que el material de la muestra,
tal como sangre u otro líquido corporal, pasa de una manera
controlada, llenando las cámaras con un volumen controlado que puede
contener cantidades predeterminadas de reactivos. De esta manera,
pueden evitarse las mediciones exactas de material de muestra (por
ejemplo las patentes US nº 4.756.884, nº 5.300.779 (Biotrack), nº
5.110.727 (Cardiovascular).
En el sitio de internet de Roche Diagnostics GmbH
se dispone de una bibliografía considerable que cubre la
utilización del dispositivo CoaguChek® anteriormente indicado. Tal
como se describe en van den Besselaar A.M.H.P. et al.,
Multicenter evaluation of a new capillary blood prothrombin time
monitoring system, Blood Coagulation and Fibrinolysis
6:726-732, 1995, el dispositivo utiliza un portador
de ensayo semejante a la figura 11 de la patente US nº 5.110.727.
Para la utilización en un ensayo de PT, el portador (que se describe
como referencia en Oberhardt, B.J. et al., Dry reagent
technology for rapid convenient measurements of blood coagulation
and fibrinolysis, Clin. Chem. 37:520-526, 1991)
contiene partículas de óxido de hierro mezcladas con tromboplastina
cerebral de conejo seca en una cámara de reacción (o "zona de
reacción") conectada a una cámara con entrada abierta (o "zona
de aplicación de la muestra") a través de un capilar. Se aplica
en la cámara de entrada una muestra de sangre de punción en el
dedo, de manera que la sangre se introduce por fuerzas capilares
hacia la cámara de reacción. A continuación, el contacto con la
tromboplastina desencadena la cascada de la coagulación. Las
partículas de óxido de hierro se ven forzadas a alinearse
verticalmente por la acción de imanes, uno de los cuales causa una
pulsación. Una fotocélula registra el patrón de pulsación, que se
reduce y finalmente cesa al formarse la matriz de fibrina. Entre los
dispositivos similares existentes en el mercado se incluyen el
analizador TAS® (Thrombolytic Assessment System), de Cardiovascular
Diagnostics Inc., el dispositivo Coumatrak® de Biotrack Inc., y el
dispositivo Coag-A-Mate®, de Organon
Teknika Inc.
En conclusión, no se dispone de ningún ensayo
simple universal de seguimiento para el análisis de HNF, HBPM e
hirudina de utilización junto al paciente.
Los presentes solicitantes han descubierto que
mediante la activación de la coagulación según el método de la
invención, por ejemplo con una combinación de FXa y un enzima
activador de FV, tal como RVV-V, pueden diseñarse
ensayos mejorados para el análisis junto al paciente de
anticoagulantes. Estos ensayos también pueden llevarse a cabo
directamente en sangre completa, de manera que no resulte necesaria
una etapa de centrifugación.
De esta manera, la invención incluye un ensayo
hematológico de junto al paciente en el que una muestra de reactivo
activado tal como se indica anteriormente se sitúa en una o más
localizaciones de reacción en un aparato de ensayo y se aplica una
muestra de líquido corporal que debe ensayarse (por ejemplo sangre
completa o sangre citrada) en una localización de entrada (por
ejemplo una cámara abierta) en dicho aparato y se dispone para que
entre en contacto y reaccione con el reactivo activador, por ejemplo
mediante un capilar, y se establece un valor que es indicativo del
potencial de coagulación del líquido corporal.
Preferentemente, el reactivo activador se
encuentra en estado seco (preferentemente liofilizado) y se disuelve
en dicho líquido corporal para formar una solución acuosa.
La invención también incluye un kit para llevar a
cabo un ensayo hematológico de junto al paciente tal como se ha
descrito anteriormente, que comprende:
- (a)
- un aparato de ensayo que presenta por lo menos una localización de reacción
- (b)
- un reactivo activador (o componentes separados del mismo) para la aplicación en dicha localización de reacción,
- (c)
- una localización de entrada en comunicación con dicha localización de reacción y en la que se aplica una muestra de líquido corporal que debe ensayarse de manera que entre en contacto con el reactivo activador,
- en el que dicho reactivo comprende:
- (i)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (ii)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo, o un enzima activador del factor V endógeno,
en el que el reactivo activado se encuentra en
estado seco y se encuentra dispuesto para ser disuelto por dicho
líquido corporal, formando una solución acuosa. Preferentemente el
reactivo activador se encuentra en estado seco o liofilizado en una
o más de dichas localizaciones de reacción.
Preferentemente una de dichas localizaciones de
reacción está definida por una cámara de reacción de volumen
predeterminado y la muestra de reactivo activador es de peso
predeterminado de manera que forma con el líquido corporal una
solución acuosa de concentración predeterminada.
Dicho aparato de ensayo puede comprender dos o
más cámaras de reacción interconectadas, por ejemplo mediante
capilares, estando dispuesto dicho líquido corporal para que
reaccione sucesivamente con reactivos en las cámaras respectivas.
De esta manera, dicho líquido corporal puede reaccionar con FXa y
con RVV-V en una primera cámara de reacción y con
CaCl_{2} (o sal equivalente) en una segunda cámara de
reacción.
Los reactivos preferentemente se secan in
situ por liofilización. Sin embargo, puede utilizarse el secado
al aire a temperatura ambiente, el secado al vacío, el secado con
desecante, el secado convectivo y otros métodos de secado. El
recubrimiento de los reactivos secos sobre las paredes de la cámara
reduce el desprendimiento por agitación, aunque no resulta
esencial. Los reactivos secos o acuosos pueden localizarse sobre
matrices, tales como material esponjoso o vellón, o puede
microencapsulares. Aunque los dos componentes esenciales del
reactivo activador preferentemente se localizan juntos, de manera
equivalente podrían localizarse en cámaras separadas a través de
las cuales se pasa la muestra en sucesión.
Los ejemplos siguientes se refieren a las figuras
12 y 13, que muestran dispositivo capilares de ensayo en forma
diagramática. Para los métodos de manufacturación de estos
dispositivos puede hacerse referencia a las patentes US
anteriormente indicadas nº 4.756.884, nº 5.110.727 y nº 5.300.779,
por ejemplo la figura 2a de la patente US nº 5.300.779.
Se introduce en la cámara 1 de entrada del
dispositivo capilar mostrado en la figura 12 una muestra de sangre
completa recién extraída no anticoagulada. Se desplaza suficiente
sangre a lo largo del capilar 3 hacia el interior de la cámara de
reacción 2 por fuerzas capilares para llenar la cámara. La cantidad
de sangre que entra en contacto con los reactivos se estandariza a
través del tamaño de la cámara de reactivo sin necesidad de
dispensar exactamente la muestra. La cámara 2 se encuentra
recubierta con reactivo activador, que comprende FXa y
RVV-V en estado seco, preferentemente liofilizado.
En ella, la muestra de sangre disuelve el reactivo y resulta
activada. La formación de coágulo puede detectarse mediante medios
ópticos en el sitio de la cámara 2 o en un punto a lo largo del
capilar de salida 4, opcionalmente con la adición al reactivo
activador de agentes accesorios, tales como sustratos cromogénicos,
sustratos fluorogénicos, sustratos amperogénicos y partículas
paramagnéticas. Mediante la variación de la concentración añadida de
FXa, puede regularse la sensibilidad y el intervalo de medición
según se requiera.
La reacción que conduce a la formación de coágulo
de la muestra implica la inhibición del FXa añadido por la
antitrombina únicamente, por el complejo
antitrombina-HNF o por el complejo
antitrombina-HBPM, la activación de FV por el
RVV-V añadido, la formación del complejo
protrombinasa sobre estructuras fosfolipídicas endógenas
(especialmente las superficies de las plaquetas) y seguidamente la
formación de trombina libre. Aunque estas reacciones se producen en
el estado líquido, los reactivos pueden introducirse en la cámara de
reactivo en forma líquida o en forma seca. En el caso de que los
reactivos se introduzcan en la cámara en forma seca, los reactivos
resultan disueltos por la muestra. Ello puede facilitarse mediante
la adición de sustancias al reactivo previamente a la liofilización
o a otro proceso de secado. La desventaja principal de la
utilización de reactivos secos puede ser una estabilidad más
prolongada del cartucho en comparación con los reactivos líquidos.
Sin embargo, cuando se utilizan reactivos líquidos, la estabilidad
puede optimizarse tamponando los reactivos a un pH apropiado.
Cuando se añade la muestra, la capacidad tamponadora de la muestra
retorna el reactivo a su pH óptimo, cercano a 7,4. Mediante la
utilización de una capacidad tamponadora baja, por ejemplo 2 mM,
para el reactivo, la capacidad tamponadora de la muestra misma puede
corregir fácilmente el pH para la reacción.
Se introdujo una combinación de FXa,
RVV-V y CaCl_{2} en una cámara de reacción 2 de la
figura 12, preferentemente en estado seco, por ejemplo liofilizada,
y se introdujo una muestra de sangre citrada en la cámara de entrada
1. Tras entrar en la cámara 2 a lo largo del capilar 3, la muestra
se recalcificó simultáneamente a su entrada en contacto con, y
disolución de, FXa y RVV-V. La coagulación puede
detectarse tal como en el Ejemplo 8. Con el fin de reducir la
sensibilidad del ensayo y, de esta manera, incrementar el intervalo
de medición, resulta posible añadir fosfolípidos a la mezcla de
reactivos. En este caso, se forman complejos de fosfolípidos y FXa
en el reactivo (mediados por iones de calcio), que reducen la
capacidad de la antitrombina en la muestra de inhibir el FXa
añadido. Ello puede aplicarse al diseño de ensayos de junto al
paciente para cantidades muy elevadas de heparina, por ejemplo para
la aplicación en el seguimiento de la terapia de heparina durante
la cirugía a corazón abierto.
Se transfirió una muestra de sangre citrada a la
cámara 1a de entrada del dispositivo de la figura 13. El material
de muestra se desplaza bajo fuerzas capilares a lo largo del capilar
5 hasta la cámara 2a, que se encuentra recubierta con FXa y
RVV-V secos. Las fuerzas capilares desplazan el
material de muestra activado hacia el interior de la cámara 3, que
se encuentra recubierta con CaCl_{2} seco. En la cámara de
reacción 3, la muestra se recalcifica por contacto con el
CaCl_{2}. En este ejemplo, la concentración se encuentra más
estandarizada debido a que entra en contacto con los reactivos un
volumen más definido de muestra. El tiempo de incubación de la
muestra con FXa y RVV-V depende de la longitud del
capilar 6 que conecta las dos cámaras de reactivos y de la
velocidad de la mezcla de muestra/reactivos a través de este
capilar, lo que depende del diámetro del mismo. La incubación de la
muestra citrada con FXa y RVV-V en ausencia de
iones libres de calcio resulta en una sensibilidad más elevada del
ensayo para la actividad de antifactor Xa que en los dos ejemplos
anteriores. Ello se basa en el hecho de que FXa se encuentra
protegido frente a la inhibición por la antitrombina al encontrarse
asociado a superficies fosfolipídicas, incluyendo las plaquetas. La
asociación de FXa a superficies fosfolipídicas se encuentra mediada
por iones libres de calcio y por los grupos carboxilo en las
moléculas de FXa, que dependen de la vitamina K durante la
biosíntesis de la molécula en el hígado. En ausencia de iones
libres de calcio, las moléculas de FXa pueden inhibirse con
complejos de antitrombina-heparina. A partir de la
longitud del capilar 6 entre las dos cámaras de reactivos puede
regularse según se requiera la sensibilidad del ensayo para la
actividad anti-Xa.
El presente reactivo activador y el método de
activación dan lugar a numerosas variaciones en ensayos y en otras
aplicaciones. En particular, el método puede variarse para ensayar
una muestra desconocida de uno de los ingredientes indicados. Se
ilustran posteriormente algunas variaciones.
- i)
- La formación de trombina puede detectarse mediante la adición de un sustrato sintético conocido para este fin. El sustrato puede presentar propiedades cromogénicas, fluorogénicas, amperogénicas, luminogénicas u otra propiedad medible. El sustrato puede, por ejemplo, cortarse con trombina dejando un grupo detectable.
- ii)
- pueden utilizarse métodos de detección conocidos para medir la viscosidad, elasticidad, características de flujo, resonancia del coágulo, el movimiento de eritrocitos o el comportamiento de objetos añadidos, tales como partículas que alteran su comportamiento al iniciarse la coagulación. Por ejemplo, puede medirse la oscilación de partículas magnéticas añadidas o las características mecánicas de partículas añadidas.
- iii)
- Pueden aplicarse procedimientos rápidos de detección inmunológica con anticuerpos específicos de trombina, por ejemplo conjuntamente con resonancia de plasmón o técnicas similares.
En lugar de añadir una cantidad definida de
factor Xa de origen bovino, humano o de otro origen a la muestra,
puede utilizarse una sustancia que active el factor Xa endógeno, o
una sustancia con una función similar a la del factor Xa, por
ejemplo mutantes del factor Xa, enzimas de veneno de serpiente, o
cisteína proteinasa activadora de Xa procedente de células
tumorales.
En lugar de activar el factor V endógeno en el
plasma o en otra fuente mediante la adición de activadores
RVV-V o de factor V procedente de otros venenos de
serpiente, tales como especies de Akgistrodon, especies de
Bothrops, Viperia lebetina, especies de Echis, o
sustancia activadora alternativa, determinadas aplicaciones
utilizan factor V ya activado o una sustancia con una función
similar a la del factor V, por ejemplo un mutante del factor V.
Determinadas aplicaciones pueden utilizar otras
fuentes de fosfolípidos, por ejemplo:
- i)
- Puede evaluarse la contribución de las estructuras fosfolipídicas del propio paciente, por ejemplo mediante la utilización de una muestra en la que se encuentren presentes plaquetas.
- ii)
- Pueden someterse a ensayo fosfolípidos mediante la utilización de un procedimiento en dos etapas en el que, en una de las etapas, se añade el fosfolípido desconocido.
- iii)
- Puede ajustarse la concentración de fosfolípidos con el fin de minimizar en caso necesario la interferencia potencial de los anticoagulantes del lupus o los anticuerpos antifosfolípido.
Los fosfolípidos pueden ser de origen humano,
animal, vegetal o sintético, o una mezcla de los mismos.
El procedimiento de ensayo puede hacerse que sea
específico de los inhibidores independientes de heparina del factor
X, II o V mediante la adición de sustancias que inactivan la
heparina, por ejemplo protamina, heparinasa o polibrén.
El procedimiento puede llevarse a cabo con la
adición de plasma, de fracciones de plasma o de factores
individuales con el fin de corregir deficiencias de factores o con
el fin de hacer que el ensayo sea más o menos susceptible a
determinados mecanismos. Esta sustancia añadida puede incluir, por
ejemplo:
- i)
- plasma normal humano o fracciones de plasma o factores separados o mutantes similares.
- ii)
- plasma bovino (o de otro animal) normal o fracciones de plasma o factores individuales o mutantes similares.
El procedimiento puede llevarse a cabo mediante
la adición de sustratos, activadores o inhibidores sintéticos de
cualquier combinación o de una combinación seleccionada de los
factores II, IIa, V, Va, X y Xa.
En conclusión, la presente invención incluye un
ensayo simple de formación de coágulo en plasma basado en
componentes fácilmente disponibles y fáciles de estabilizar. Los
resultados muestran relaciones dosis-respuestas
lineales para HBPM, hirudina y HNF. Estas muy buenas relaciones de
dosis-respuesta aparentemente se basan en la
evaluación de las actividades de antifactor IIa y antifactor Xa, con
independencia de etapas más tempranas de la cascada de coagulación
y con independencia de la activación del factor V durante el inicio
de la coagulación por la trombina generado por los factores de
coagulación de las muestras.
En contraste con las técnicas en las que
activadores de trombina procedentes de venenos de serpiente (por
ejemplo el método ECT para la determinación de la hirudina) activan
la trombina, la presente técnica utiliza la ruta fisiológica de la
activación de la protrombina (utilizando factor Xa, factor Va,
fosfolípidos e iones de calcio), lo que resulta ventajoso para la
evaluación de los mecanismos y procesos de coagulación
fisiológicamente relevantes.
La buena señal óptica, elevada precisión, cortos
tiempos de medición y facilidad de ejecución de los procedimientos
estándar de aPTT y de PT permiten adaptar el nuevo procedimiento a
diferentes analizadores de coagulación.
La comparación de los resultados del nuevo
procedimiento, basado en protrombinasa preformada, y el Heptest®,
que utiliza únicamente factor Xa, previamente a la incubación,
muestra que los dos ensayos presentan diferencias significativas.
El Heptest® presentaba tiempos de formación de coágulo más largos
con las muestras de HBPM en comparación con el ensayo de la
invención, y su sensibilidad era ligeramente menor para HNF y
drásticamente menor para la hirudina. En comparación con el
Heptest®, el nuevo método funciona sobre una base fisiológica
definida, no requiere fracción de plasma bovino, activa el factor V
de manera independiente de la trombina, presenta una señal óptica
mejorada y muestra una sensibilidad elevada para la hirudina. Por lo
tanto, puede utilizarse para realizar un seguimiento no sólo de HNF
y de HBPM sino también de hirudina con el mismo reactivo en
intervalos relevantes de concentración.
En contraste con la invención, el ensayo de
tiempo de veneno de víbora de Russell utiliza la activación de
tanto el factor V como del factor X por parte del veneno, lo que
resulta en concentraciones variables de factor Xa dependiendo de la
concentración de factor X en el paciente. En la invención se
consigue una activación más definida mediante la aplicación de una
actividad definida de factor Xa.
Finalmente, la invención proporciona un
procedimiento que proporciona un ensayo simple para el seguimiento
de HBPM, heparinoides, hirudinas y HNF basado en un principio único.
Resultan posible una diversidad de ensayos adicionales cuando se
combina el régimen de activación con sustancias que activan o
inhiben procesos que afectan al factor V, X ó II directa o
indirectamente (tal como el sistema de la proteína C), o la
utilización de sustratos indicadores.
Claims (42)
1. Ensayo hematológico en el que se evalúa el
potencial de coagulación sanguínea de un líquido corporal
seleccionado de entre sangre o plasma completos, citrados o
anticoagulados temporalmente de otra manera, haciendo reaccionar
una muestra del líquido corporal con un reactivo activador,
si resulta necesario induciendo la coagulación
mediante la adición de uno o más aceleradores de coagulación, y
estableciendo un valor indicativo del potencial
de coagulación,
en el que dicho reactivo comprende en
combinación:
- (a)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (b)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno.
2. Ensayo según la reivindicación 1, en el que
se utiliza un veneno de serpiente que contiene un componente
activador del factor V y reducido en componente activador del factor
X, como fuente de dicho enzima activador del factor V endógeno.
3. Ensayo según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha fuente es el activador del factor V procedente de veneno
purificado de víbora de Russell (RVV-V).
4. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se compara el potencial de
coagulación de dicha muestra de cantidad predeterminada con la de
uno o más estándares.
5. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el establecimiento de dicho valor
comprende la detección de uno de entre:
(i) el tiempo desde dicha adición hasta el inicio
de la formación de coágulo,
(ii) el tiempo desde dicha adición hasta la
detección de actividad de trombina libre,
(iii) la actividad de trombina,
(iv) la actividad de factor Xa.
6. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el reactivo activador incluye una
cantidad predeterminada de fosfolípidos o plaquetas naturales o
sintéticas y el método incluye la adición al sistema de reacción de
un acelerador de coagulación que comprende una cantidad
predeterminada de calcio o de iones funcionalmente equivalentes.
7. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho valor se establece mediante
la medición del tiempo hasta que se detecta en dicha muestra el
inicio de la formación de coágulo con un coagulómetro óptico.
8. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho valor se establece mediante
la adición a la muestra tratada de un agente analítico accesorio que
proporciona un valor detectable.
9. Ensayo según la reivindicación 8, en el que
dicho valor se establece mediante la adición al sistema de reacción
como agente analítico accesorio de un sustrato sintético específico
para la medición de la actividad de trombina o específico para la
medición de la actividad de factor Xa y que detecta la actividad
apropiada.
10. Ensayo según la reivindicación 9, en el que
dicho sustrato presenta propiedades cromogénicas, fluorogénicas,
amperogénicas o luminogénicas.
11. Ensayo según la reivindicación 9, en el que
dicho valor se establece mediante la adición al sistema de reacción
como agente analítico accesorio de partículas que muestran un
comportamiento mecánico, magnético o eléctrico durante la
coagulación y la detección del comportamiento apropiado.
12. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la determinación de un componente
de coagulación sanguínea o aditivo de tratamiento en una muestra
que comprende una cantidad predeterminada de líquido corporal
humano se lleva a cabo mediante la comparación de dicho potencial de
coagulación con el de una muestra comparable de líquido corporal
humano normal y/o con el de una muestra comparable de líquido
corporal humano que carece de dicho componente o aditivo o que
contiene un exceso conocido de dicho componente o aditivo.
\newpage
13. Ensayo según la reivindicación 12 utilizado
para evaluar el potencial de coagulación sanguínea de un paciente
del que se sospecha una deficiencia o una superabundancia de uno o
más componentes de coagulación sanguínea.
14. Ensayo según la reivindicación 12 ó 13, en el
que dicho componente es un factor de coagulación o un enzima o
proenzima anticoagulante.
15. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, utilizado para evaluar el potencial de
coagulación sanguínea de líquido corporal completo del que se
sospecha la presencia de un anticuerpo contra uno o más componentes
de coagulación sanguínea.
16. Ensayo según la reivindicación 15, utilizado
para evaluar la presencia en una muestra de líquido corporal
completo de anticoagulante de lupus.
17. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que el método comprende las etapas
siguientes:
mezclar una muestra de líquido corporal con una
cantidad del reactivo activador,
incubar la mezcla,
añadir dicho acelerador y opcionalmente un agente
analítico accesorio y
establecer un valor indicativo del potencial de
coagulación.
18. Ensayo según la reivindicación 17, que
comprende las etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- una cantidad predeterminada comprendida entre 0,01 y 10 nkat/ml (0,0053 a 5,3 mg/ml) de factor Xa, una cantidad predeterminada comprendida entre 0,05 y 10 U/ml de RVV-V, y
- opcionalmente una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 200 \mug/ml de fosfolípidos,
- en una solución acuosa tampón que contiene entre Tris/HCl 10 y 200 mM, entre 0,6 y 1,2% p/v de NaCl y entre 0,01 y 1,0% p/v de albúmina,
- ii.
- mezclar una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 100 \mul de plasma citrado o ligado a Ca de otra manera, pobre en plaquetas, con una cantidad predeterminada comprendida entre 1 y 100 \mul del reactivo activador,
- iii.
- incubar la mezcla,
- iv.
- añadir una cantidad predeterminada comprendida entre 10 y 100 \mul de CaCl_{2} 2 a 200 mM,
- v.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporciona un valor detectable, y
- vi.
- establecer dicho valor.
19. Ensayo según la reivindicación 18, que
comprende las etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- 0,4 nkat/ml (0,021 mg/ml) de factor Xa,
- 4 U/ml de RVV-V, y
- 50 \mug/ml de fosfolípidos procedente de cefalina cerebral de conejo,
- en una solución acuosa tampón que contiene Tris/HCl 50 mM, 0,9% p/v de NaCl y 0,5% p/v de albúmina a pH 7,4,
- ii.
- mezclar 50 \mul de plasma citrado pobre en plaquetas con 50 \mul de reactivo activador,
- iii.
- incubar la mezcla durante 3 minutos a 37ºC,
- iv.
- añadir 50 \mul de CaCl_{2} 25 mM, y
- v.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporciona un valor detectable, y
- vi.
- establecer dicho valor.
20. Modificación del ensayo según la
reivindicación 18 ó 19 que, resulta útil para evaluar
concentraciones elevadas de anticoagulante, en la que el ensayo se
lleva a cabo en ausencia de incubación.
21. Ensayo según la reivindicación 20, que
comprende las etapas siguientes:
- i.
- preparar un reactivo activador que contiene:
- 0,2 nkat/ml (0,011 mg/ml) de factor Xa,
- 2 U/ml de RVV-V,
- 25 \mug/ml de fosfolípidos procedentes de cefalina cerebral de conejo,
- en una solución acuosa tampón que contiene Tris/HCl 25 mM, 0,45% p/v NaCl y 0,25% p/v de albúmina y CaCl_{2} 12,5 mM a pH 7,4,
- ii.
- mezclar 50 \mul de plasma citrado pobre en plaquetas con 100 \mul de reactivo activador,
- iii.
- opcionalmente añadir un agente analítico accesorio que proporciona un valor detectable, y
- iv.
- establecer dicho valor.
22. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que dicho valor se establece
mediante la medición del tiempo entre la adición de CaCl_{2} y el
inicio de la formación de coágulo utilizando un coagulómetro
óptico.
23. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22 utilizado para evaluar la presencia y/o
concentración de un componente coagulante o anticoagulante
sospechado en una muestra de plasma o de sangre completa en el que
la muestra se diluye en plasma reducido únicamente de coagulante o
de anticoagulante sospechado y se establece el valor comparando el
valor observado con el valor del plasma reducido y/o con el valor
del plasma normal.
24. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que se diluye una muestra de plasma
con plasma normal, una fracción de plasma o uno o más factores
separados de coagulación de manera que se reduce la influencia de
los efectos de matriz.
25. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, en el que se trata una muestra de plasma
con una sustancia que inactiva la heparina o sustancias similares a
la heparina, incrementando de esta manera la especificidad a los
anticoagulantes no heparina.
26. Ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, que se lleva a cabo en una muestra de
plasma que se ha tratado con una sustancia que activa o inactiva uno
o más factores de coagulación.
27. Ensayo según la reivindicación 1, que se
lleva a cabo en un sistema de junto al paciente.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 de seguimiento de la condición de un
paciente tratado con una medicación que presenta, o es probable que
presente, un efecto coagulante o anticoagulante, en el que se evalúa
el potencial de coagulación sanguínea de una muestra de cantidad
conocida de líquido corporal del paciente mediante:
- la reacción de dicha muestra con un reactivo activador,
- si resulta necesario, la inducción de la coagulación mediante la adición de uno o más aceleradores de coagulación, y
- el establecimiento de un valor indicativo del potencial de coagulación,
- en el que dicho reactivo comprende en combinación:
- (a)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o de un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (b)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno.
29. Método según la reivindicación 28, en el que
el anticoagulante se selecciona de entre los inhibidores naturales o
sintéticos del factor Xa y/o de la trombina.
\newpage
30. Método según la reivindicación 28 ó 29, en el
que el anticoagulante se selecciona de entre heparina no
fraccionada (HNF), heparinas de bajo peso molecular (HBPM),
heparinoides, dermatán sulfato, argatrobán, hirudina modificada e
hirudina.
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 30, utilizado para llevar a cabo el
seguimiento del efecto sobre la coagulación sanguínea de un paciente
de una dosis de anticuerpo contra uno o más componentes de
coagulación sanguínea.
32. Ensayo hematológico de junto al paciente
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se
introduce una muestra de reactivo activador en una o más
localizaciones de reacción en un aparato de prueba y se introduce
una muestra de líquido corporal que debe ensayarse en una
localización de entrada en dicho aparato y dispuesta para que entre
en contacto y reaccione con el reactivo activador, y se establece un
valor indicativo del potencial de coagulación,
en el que dicho reactivo comprende en
combinación:
- (a)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (b)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno.
33. Ensayo de junto al paciente según la
reivindicación 32, en el que el reactivo activador se encuentra en
estado seco y se disuelve en dicho líquido corporal formando una
solución acuosa.
34. Ensayo de junto al paciente según la
reivindicación 33, en el que el reactivo activador se encuentra en
estado liofilizado en una o más de dichas localizaciones de
reacción.
35. Ensayo de junto al paciente según cualquiera
de las reivindicaciones 32 a 34, en el que se define dicha
localización de reacción mediante una cámara de reacción de volumen
predeterminado y la muestra de reactivo activador es de peso
predeterminado, de manera que forme con el líquido corporal una
solución acuosa de concentración predeterminada.
36. Ensayo de junto al paciente según cualquiera
de las reivindicaciones 32 a 35, en el que dicho aparato de prueba
comprende dos o más cámaras de reacción interconectadas, estando
dicho líquido corporal dispuesto para que reaccione sucesivamente
con reactivos en las cámaras respectivas.
37. Ensayo de junto a paciente según la
reivindicación 36, en el que dicho líquido corporal reacciona con
FXa y RVV-V en una primera cámara de reacción y con
CaCl_{2} o sal equivalente en una segunda cámara de reacción.
38. Ensayo de junto al paciente según cualquiera
de las reivindicaciones 32 a 37, en el que dicho líquido corporal
comprende sangre completa.
39. Kit para llevar a cabo un ensayo hematológico
de junto al paciente según la reivindicación 32, que comprende:
- (d)
- un aparato de prueba que presenta por lo menos una localización de reacción,
- (e)
- un reactivo activador o componentes separados del mismo para la aplicación en dicha localización de reacción,
- (f)
- una localización de entrada en comunicación con dicha localización de reacción y en la que se aplica una muestra de líquido corporal que debe ensayarse de manera que entre en contacto y reaccione con el reactivo activador,
- en el que dicho reactivo comprende:
- (i)
- una cantidad predeterminada de factor Xa o un mutante hematológicamente equivalente del mismo, y
- (ii)
- una cantidad predeterminada de factor Va, un mutante hematológicamente equivalente del mismo o un enzima activador del factor V endógeno,
en el que el reactivo activador se encuentra en
estado seco y se encuentra dispuesto para ser disuelto por dicho
líquido corporal para formar una solución acuosa.
40. Kit según la reivindicación 39, en el que el
reactivo activador se encuentra en estado seco o liofilizado en una
o más de dichas localizaciones de reacción.
41. Utilización de un kit en ensayos de
coagulación sanguínea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
38, comprendiendo el kit en combinación:
- (i)
- un reactivo activador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o componentes separados del mismo,
- (ii)
- muestras de control y/o de calibración, y
- (iii)
- uno o más accesorios opcionales seleccionados de entre:
una solución acuosa de una sal de calcio o sal
equivalente de concentración determinada, un agente analítico
accesorio, plasma normal, una o más fracciones de plasma, uno o más
factores de coagulación, agua y/o una o más soluciones tampón, o
preparaciones liofilizadas equivalentes.
42. Utilización según la reivindicación 41, en la
que el agente analítico accesorio comprende una o más soluciones o
preparaciones liofilizadas de sustratos sintéticos para la
determinación de la trombina y/o del factor Xa.
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