ES2254459T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen mdha a partir de corynebacterium glutamicum. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen mdha a partir de corynebacterium glutamicum.Info
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Abstract
Una bacteria corineforme aislada en la cual se ha eliminado la expresión del gen mdhA constituido por un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de malato-deshidrogenasa y y que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican el gen
mdhA a partir de Corynebacterium glutamicum.
La invención proporciona secuencias de
nucleótidos de bacterias corineformes que codifican el gen mdhA y un
proceso para la preparación de aminoácidos por fermentación, en
particular L-lisina, por atenuación del gen
mdhA.
Los L-aminoácidos, en particular
lisina, se utilizan en medicina humana y en la industria de
productos farmacéuticos, en la industria alimentaria y muy
particularmente en nutrición animal.
Es sabido que los aminoácidos se preparan por
fermentación a partir de cepas de bacterias corineformes, en
particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran
importancia, se está trabajando constantemente para mejorar los
procesos de preparación. Las mejoras en el proceso pueden estar
relacionadas con las condiciones de fermentación, tales como, por
ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición del
medio nutriente, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar
durante la fermentación, o el acabado hasta la forma del producto
mediante, por ejemplo, cromatografía en intercambio iónico, o las
propiedades intrínsecas de producción del microorganismo propiamente
dicho.
Se utilizan métodos de mutagénesis, selección y
selección de mutantes para mejorar las propiedades de producción de
estos microorganismos. De esta manera se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas para metabolitos de
importancia reguladora y que producen aminoácidos.
Desde hace algunos años se han empleado también
métodos de la técnica del DNA recombinante para aumentar la
variedad de cepas de Corynebacterium que producen
L-aminoácidos. Eikmanns et al., "Molecular
Aspects of Lysine, Threonine and Isoleucine Biosynthesis in
Corynebacterium glutamicum", describe bacterias
corineformes que contienen plásmidos recombinantes que expresan una
enzima bacteriana corineforme para producción mejorada de
aminoácidos, tales como lisina.
Los autores de la invención se propusieron como
objetivo proporcionar nuevas medidas para preparación mejorada de
aminoácidos, en particular L-lisina, por
fermentación.
Los L-aminoácidos, en particular
lisina, se utilizan en medicina humana y en la industria de
productos farmacéuticos, en la industria alimentaria y muy
particularmente en nutrición animal. Existe por consiguiente un
interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la
preparación de aminoácidos, en particular
L-lisina.
La presente invención proporciona una bacteria
corineforme aislada en la cual se elimina la expresión del gen mdhA
constituido por un polinucleótido que codifica un polipéptido que
tiene actividad de malato-deshidrogenasa y que
tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un
90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
La invención describe también un polipéptido
aislado con actividad de malato-deshidrogenasa, que
comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO.
1.
La invención describe también:
- un DNA que es capaz de replicación y comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 2,
- un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, punto d, en particular pEMmdhAint, depositado en E. coli DSM 13494 en fecha 18.05.2000 en la DSMZ [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células], Braunschweig (Alemania),
- y bacterias corineformes que contienen una deleción o inserción en el gen mdhA, utilizando en particular el vector pEMmdhAint.
La invención describe también polinucleótidos que
comprenden sustancialmente una secuencia de polinucleótidos, que
pueden obtenerse por escrutinio mediante hibridación de una genoteca
génica correspondiente, que comprende el gen mdhA completo con la
secuencia de polinucleótidos correspondiente a SEQ ID NO. 2, con una
sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado, de
acuerdo con SEQ ID NO. 2 o un fragmento de la misma, y aislamiento
de la secuencia de DNA mencionada.
Los polinucleótidos que contienen secuencias
descritas por la invención, son adecuados como sondas de hibridación
para RNA, cDNA y DNA, a fin de aislar, en la longitud total, ácidos
nucleicos, o polinucleótidos o genes que codifican
malato-deshidrogenasa o aislar aquellos ácidos
nucleicos o polinucleótidos o genes que tienen una alta semejanza de
secuencia con la del gen de
malato-deshidrogenasa.
Los polinucleótidos que contienen secuencias
descritas por la invención, son adecuados además como iniciadores
con ayuda de los cuales puede prepararse DNA de genes que codifican
malato-deshidrogenasa por la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR).
Dichos polinucleótidos que sirven como sondas o
iniciadores comprenden al menos 30, preferiblemente al menos 20, de
modo muy particularmente preferible al menos 15 nucleótidos
sucesivos. Son también adecuados oligonucleótidos que tienen una
longitud de al menos 40 ó 50 nucleótidos.
"Aislado" significa apartado de su entorno
natural.
"Polinucleótido" se refiere en general a
polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible
que éstos sean RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado.
El término "polipéptidos" se entiende con el
significado de péptidos o proteínas que comprenden dos o más
aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos.
Los polipéptidos descritos por la invención
incluyen los polipéptidos de acuerdo con SEQ ID NO. 3, en particular
aquéllos que tienen la actividad biológica de
malato-deshidrogenasa, y también aquéllos que son al
menos 70%, preferiblemente al menos 80% y en particular al menos 90%
a 95% idénticos al polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO. 3 y tienen
la actividad mencionada.
La invención proporciona además un proceso para
la preparación de lisina por fermentación, utilizando bacterias
corineformes que producen ya en particular los aminoácidos, y en el
cual se eliminan las secuencias de nucleótidos que codifican el gen
mdhA.
El término "eliminación" en este contexto
describe la eliminación de la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) de un microorganismo que son codificadas por el
DNA correspondiente, por ejemplo por utilización de un promotor
débil o utilización de un gen, o alelo, que codifica una enzima
correspondiente con una actividad baja, o desactiva el gen o la
enzima (proteína) correspondiente, y combinación opcional de estas
medidas.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden preparar aminoácidos, en particular lisina, a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Aquéllos pueden
ser representativos de bacterias corineformes, en particular del
género Corynebacterium. Del género Corynebacterium, se
puede mencionar en particular la especie Corynebacterium
glutamicum, que es conocida entre los expertos por su capacidad
para producir L-aminoácidos.
Cepas adecuadas de género Corynebacterium,
en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son
en particular las cepas conocidas de tipo salvaje
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13689
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes o cepas productores(as) de
L-aminoácidos, preparados a partir de ellos, tales
como, por ejemplo, las cepas productoras de
L-lisina
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum
DM58-1
Corynebacterium glutamicum
DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM5714 y
Corynebacterium glutamicum DSM12866.
Se ha encontrado el nuevo gen mdhA de C.
glutamicum que codifica la enzima
malato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.37).
Para esto, se purifica primeramente la proteína
enzimática malato-deshidrogenasa hasta homogeneidad
por métodos cromatográficos. Métodos e instrucciones para
purificación y preparación de proteínas se describen, v.g., en el
texto de Schleifer y Wensink: Practical Methods in Molecular Biology
(Springer Verlag, Berlín, Alemania, 1981); en el manual de Harris y
Angal: Protein Purification Methods: A Practical Approach (IRL
Press, Oxford, Reino Unido, 1989); en el texto de Scopes: Protein
Purification: Principles and Practice, 3ª edición (Springer Verlag,
Nueva York, EE.UU., 1993) y en textos y manuales de conocimiento
general. La proteína enzimática pura puede fragmentarse luego en
péptidos por tratamiento con enzimas adecuadas, tales como, por
ejemplo, tripsina o quimotripsina. La secuencia de aminoácidos de
estos péptidos puede determinarse por el método de secuenciación
N-terminal descrito por Edman (Archives of
Biochemistry 22, 475 (1949)). Asimismo, es posible determinar los
aminoácidos N-terminales de la proteína enzimática
purificada directamente. Métodos e instrucciones para secuenciación
de proteínas se describen, por ejemplo, en Smith: Protein Sequencing
Protocols: Methods in Molecular Biology, vol. 64 y vol. 112 (Humana
Press, Totowa, NJ, EE.UU., 1996) y en Kamp et al.: Protein
Structure Analysis: Preparation, Characterization, and
Microsequencing (Springer Verlag, Nueva York, NY, EE.UU., 1997). De
esta manera la secuencia de aminoácidos de la proteína enzimática
malato-deshidrogenasa puede determinarse en parte o
en su totalidad, dependiendo del desembolso. Los 20 aminoácidos
N-terminales de la proteína enzimática
malato-deshidrogenasa aislados se muestran en SEQ ID
NO. 1.
Utilizando el uso conocido de codones para
bacterias corineformes (Malumbres et al. (Gene 134,
15-24 (1993)), pueden sintetizarse oligonucleótidos
sintéticos y se pueden emplear como iniciadores para amplificación
de los segmentos cromosómicos de DNA correspondientes por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Instrucciones para
esto se encuentran por el experto, entre otros lugares, por ejemplo
en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en Newton y
Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania,
1994). El fragmento de DNA del gen sod obtenido de esta manera se
somete luego a clonación por métodos conocidos, como se describe
v.g. en Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU.,
1989) y puede emplearse como sonda para la búsqueda del gen
completo, con inclusión de sus flancos 5' y 3', en genotecas
génicas.
Asimismo, es posible aislar el gen completo, con
inclusión de sus flancos 5' y 3', por el método de "rescate de
plásmidos". En este método, un fragmento del gen de interés, que
se ha obtenido, por ejemplo, de la manera arriba descrita, se
somete a clonación en un vector plasmídico que no es replicativo
para bacterias corineformes. El vector plasmídico que contiene el
fragmento de gen se incorpora o se integra en el gen diana del
hospedador por transformación y recombinación homóloga
subsiguiente. el gen diana se marca de este modo. El DNA cromosómico
de la cepa marcada de esta manera se aísla luego y se digiere con
una enzima de restricción adecuada. Enzimas de restricción
adecuadas son, en particular, aquéllas que no escinden dentro del
DNA vector empleado. Los fragmentos de DNA resultantes se
circularizan por tratamiento con ligasa y un hospedador adecuado
para replicación del vector plasmídico, típicamente Escherichia
coli, se transforma con la mezcla de ligación. El DNA plasmídico
se aísla de los transformantes y las secciones de DNA clonadas se
secuencian. El método de "rescate de plásmido" ha sido
descrito, por ejemplo, por Niaudet et al. (Gene 19,
277-284 (1982)). Métodos de secuenciación de DNA
han sido descritos, entre otros lugares, por Sanger et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 74:5463-5467, 1977) o en el
protocolo de Zimmerman et al. (BioTechniques 17:302
(1994)).
Las secuencias de DNA resultantes pueden
investigarse luego con algoritmos conocidos o programas de análisis
de secuencias, tales como v.g. el de Staden (Nucleic Acids Research
14, 217-232 (1986)), el de Marck (Nucleic Acids
Research 16, 1829-1836 (1988)) o el programa GCG de
Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97
(1998)).
La nueva secuencia de DNA de C. glutamicum
que codifica el gen mdhA y que, al igual que SEQ ID NO. 2, es un
constituyente de la presente invención, se ha encontrado de esta
manera. La secuencia de aminoácidos del producto de traducción o
producto génico correspondiente ha sido derivada además de la
presente secuencia de DNA por los métodos arriba descritos. La
secuencia de aminoácidos resultante del producto del gen mdhA se
muestra en SEQ ID NO. 3. Es sabido (O'Regan et al., Gene 77,
237-251 (1989)), que el aminoácido metionina o
formil-metionina codificado por el codón de parada
ATG es removido de diversas proteínas por las enzimas del huésped.
Secuencias codificantes de DNA que resultan de SEQ ID NO. 2 por la
degeneración del código genético son también un constituyente de la
invención. De la misma manera, secuencias de DNA que se hibridan con
SEQ ID NO. 2 o partes de SEQ ID NO. 2 son un constituyente de la
invención. Finalmente, secuencias de DNA que se preparan por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores que
resultan de SEQ ID NO. 2 son un constituyente de la invención.
Instrucciones para identificación de secuencias
de DNA por medio de hibridación pueden ser encontradas por el
experto, entre otros lugares, en el manual "The DIG System Users
Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International
Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:
255-260). Instrucciones para la amplificación de
secuencias de DNA con la ayuda de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros
lugares, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A
Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en
Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Alemania, 1994).
Se ha encontrado que las bacterias corineformes
producen aminoácidos, en particular L-lisina, de una
manera mejorada después de eliminación del gen mdhA.
Para lograr la eliminación, o bien la expresión
del gen mdhA o las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas pueden reducirse o eliminarse. Las dos medidas pueden
combinarse opcionalmente.
La reducción en la expresión del gen puede tener
lugar por cultivo adecuado o por modificación genética (mutación) de
las estructuras señal de la expresión génica. Estructuras señal de
la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes
activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación
de ribosoma, el colon de iniciación y terminadores. El experto puede
encontrar información acerca de esto v.g. en la solicitud de patente
WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170:5949
(1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26:3548
(1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191
(1998)), en Patek et al. (Microbiology 142:1297 (1996)),
Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181:6188 (1999)) y
en textos de genética y biología molecular conocidos, tales como
v.g. el texto de Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular
Genetics]", 6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania,
1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]",
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990.
Mutaciones que conducen a un cambio o reducción
en las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas son
conocidas por la técnica anterior; ejemplos que pueden mencionarse
son los trabajos publicados por Qiu y Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et
al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61:1760-1762 (1997)) y Möckel ("Die
Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung
der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Threonine
dehydratase from Corynebacterium glutamicum: Cancelling the
allosteric regulation and structure of the enzyme]", Reports from
the Jülich Research Centre, Jül-2906, ISSN09442952,
Jülich, Alemania, 1994). Descripciones extensas pueden encontrarse
en textos conocidos de genética y biología molecular, tales como
v.g. el de Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]",
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones posibles son transiciones,
transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo del efecto del
cambio de aminoácido sobre la actividad de la enzima, se hace
referencia a mutaciones con sentido o mutaciones sin sentido.
Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen
conducen a mutaciones de cambio de marco, como consecuencia de las
cuales se incorporan aminoácidos incorrectos o se interrumpe
prematuramente la traducción. Las deleciones de varios codones
conducen típicamente a una pérdida completa de la actividad
enzimática. Instrucciones acerca de la generación de tales
mutaciones constituyen técnica anterior y pueden encontrarse en
textos conocidos de genética y biología molecular, tales como v.g.
el texto de Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular
Genetics]", 6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania,
1995), el de Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]",
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann
("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Un método común de mutación de genes de C.
glutamicum es el método de rotura génica y reemplazamiento
génico descrito por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9,
84-87 (1991)).
En el método de rotura génica, una parte central
de la región codificante del gen de interés se clona en un vector
plasmídico que puede replicarse en un hospedador (típicamente E.
coli), pero no en C. glutamicum. Vectores posibles son,
por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1,
784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et
al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or
pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega
Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman
(1994), Journal of Biological Chemistry
269:32678-84; la Patente U.S. 5.487.993), pCR®Blunt
(Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of
Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) or pEM1
(Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology
173:4510-4516). El vector plasmídico que contiene la
parte central de la región codificante del gen se transfiere luego a
la cepa deseada de C. glutamicum por conjugación o
transformación. El método de conjugación ha sido descrito, por
ejemplo, por Schäfer et al. (Applied and Environmental
Microbiology 60, 756-759 (1994)). Métodos para
transformación han sido descritos, por ejemplo, por Thierbach et
al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29,
356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology
7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).
Después de recombinación homóloga por medio de un suceso de
"cruzamiento", la región codificante del gen en cuestión es
interrumpida por la secuencia vector y se obtienen dos alelos
incompletos, uno que carece del extremo 3' y uno que carece del
extremo 5'. Este método ha sido utilizado, por ejemplo, por
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) para eliminar el gen recA de
C. glutamicum.
La Figura 1 muestra a modo de ejemplo el vector
plasmídico pEMmdhAint, con ayuda de la cual puede romperse o
eliminarse el gen mdhA.
En el método de reemplazamiento génico, se
establece in vitro en el gen de interés una mutación, tal
como v.g. una deleción, inserción o cambio de base,. El alelo
preparado se clona a su vez en un vector que no es replicativo para
C. glutamicum y éste se transfiere luego al hospedador
deseado de C. glutamicum por transformación o conjugación.
Después de recombinación homóloga por medio de un primer suceso de
"cruzamiento" que efectúa la integración y un segundo suceso
adecuado de "cruzamiento" que efectúa la escisión en el gen
diana o en la secuencia diana, se logra la incorporación de la
mutación o del alelo. Este método fue utilizado, por ejemplo, por
Peters-Wendisch (Microbiology 144,
915-927 (1998)) para eliminar el gen pyc de C.
glutamicum por una deleción.
Una deleción, inserción o un cambio de base puede
incorporarse de esta manera en el gen mdhA.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-aminoácidos, en particular
L-lisina, intensificar, en particular
sobre-expresar, una o más enzimas del camino de
biosíntesis particular, de glicólisis, de anaplerosis, del ciclo
pentosa-fosfato o de la exportación de aminoácidos,
además de la eliminación del gen mdhA.
Así, por ejemplo, para la preparación de
L-lisina, puede intensificarse, en particular
sobre-expresarse, al mismo tiempo uno o más de los
genes seleccionados del grupo constituido por
- \bullet
- el gen dapA que codifica dihidrodipicolinato-sintasa (documento EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen eno que codifica enolasa (documento EP-A-1090998),
- \bullet
- el gen zwf que codifica el producto del gen zwf (documento JP-A-09224661),
- \bullet
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- \bullet
- el gen lysE que codifica la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222).
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de aminoácidos, en particular L-lisina,
además de la eliminación del gen mdhA, eliminar al mismo tiempo uno
o más de los genes seleccionados del grupo constituido por
- \bullet
- el gen pck que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (documentos EP-A-1094111 y DSM 13047),
- \bullet
- el gen pgi que codifica glucosa-6-fosfato-isomerasa (documentos US-B-6.586.214 y DSM 12969),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato de oxidasa (documentos EP 1096013 y DSM 13114).
Además de la atenuación del gen mdhA puede ser
ventajoso adicionalmente para la producción de aminoácidos, en
particular L-lisina, eliminar reacciones secundarias
indeseables, (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academic Press,
Londres, Reino Unido, 1982).
La invención proporciona también los
microorganismos preparados de acuerdo con la invención, y éstos
pueden cultivarse continua o discontinuamente en el proceso de lotes
(cultivo de lotes) o en el proceso alimentado (proceso de
alimentación) o proceso de lotes alimentados repetidos (proceso
repetitivo de alimentación) para el propósito de producción de
L-aminoácidos, en particular
L-lisina. Un sumario de métodos de cultivo conocidos
se describe en el texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction
to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991)) o
en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
[Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden,
1994)).
1994)).
El medio de cultivo a utilizar tiene que cumplir
los requisitos de las cepas particulares de una manera adecuada.
Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos
están contenidas en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., EE.UU., 1981). Como fuente de carbono pueden utilizarse
azúcares y carbohidratos, tales como v.g. glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y
grasas, tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol,
aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como, por
ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, y ácido linoleico,
alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos
orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla. Como fuente
de nitrógeno pueden utilizarse compuestos nitrogenados orgánicos,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y
urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, y nitrato
de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse
individualmente o en forma de mezcla. Como fuente de fósforo pueden
utilizarse ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o
hidrogenofosfato dipotásico o las sales correspondientes que
contienen sodio. El medio de cultivo tiene que comprender
adicionalmente sales metálicas, tales como, por ejemplo, sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, pueden emplearse sustancias de crecimiento
esenciales, tales como aminoácidos y vitaminas, además de las
sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse además al medio de
cultivo precursores adecuados. Las sustancias de partida
mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de un lote
simple, o pueden incorporarse en la alimentación durante el cultivo
de manera adecuada.
Para controlar el pH pueden emplearse de manera
adecuada compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio,
hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o compuestos
ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar
el desarrollo de espuma pueden emplearse antiespumantes, tales como,
por ejemplo, poliglicol-ésteres de ácidos grasos. Pueden añadirse al
medio sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, tales
como, por ejemplo, antibióticos, para mantener la estabilidad de los
plásmidos. Para mantener condiciones aerobias, se introducen en el
cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales
como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo es usualmente
20ºC a 45ºC, y preferiblemente 25ºC a 40ºC. El cultivo se continúa
hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Este
objetivo se alcanza usualmente dentro de 10 horas a 160
horas.
horas.
Métodos para la eliminación de
L-aminoácidos se conocen por la técnica anterior.
Así, el análisis puede llevarse a cabo así, por ejemplo, como ha
sido descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30,
(1958) 1190) por cromatografía de intercambio aniónico con
derivatización subsiguiente de ninhidrina, o puede llevarse a cabo
por HPLC en fase inversa, por ejemplo como ha sido descrito por
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979)
51:1167-1174).
El microorganismo siguiente fue depositado en el
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig,
Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest en 18.05.200:
\bulletEscherichia coli
DH5\alphamcr/pEMmdhAint como DSM13494
El proceso de acuerdo con la invención se utiliza
para la preparación por fermentación de aminoácidos, en particular
L-lisina.
La presente invención se explica con mayor
detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El aislamiento del DNA plasmídico de
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción,
tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevaron
a cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning. A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, EE.UU. En este manual se describen también
métodos para transformación de Escherichia coli.
La composición de los medios nutrientes usuales,
tales como medio LB o TY puede encontrarse también en el manual de
Sambrook et al.
La actividad de
malato-deshidrogenasa se determinó como ha sido
descrito por Sanwal (Journal of Biological Chemistry 244 (7):
1831-1837 (1969) y Smith (Methods of Enzymatical
Analysis, 1985, ed. 3, volumen 3 (Bergmeyer et al.
(compiladores)), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania). Las
concentraciones de proteína se midieron por el método de Smith et
al. (Analytical Biochemistry 150: 76-85
(1995)).
Se inocularon cuatro veces 100 ml de 2 x TY con
una colonia en cada caso de la cepa de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 y se cultivaron en cada caso en matraces
cónicos de 250 ml durante 16 horas a 30ºC y 200 revoluciones por
minuto. Las células se lavaron dos veces en tampón A (fosfato de
potasio 50 mM, pH 7,5, ditiotreitol 1 mM, ácido
etilenodiaminatetraacético 2 mM) a 4ºC, y se resuspendieron en 20 ml
del mismo tampón. Las células se disgregaron tres veces en una Celda
de Presión Francesa preenfriada de Spectronic Unicam (Rochester, NY,
EE.UU.) a una presión de 165 MPa. Los residuos celulares se
sedimentaron luego en una centrífuga a 4ºC durante 10 minutos a
75600 x g. La proteína malato-deshidrogenasa se
purificó en tres pasos.
Paso
1
Se separó el sobrenadante y se trató
ulteriormente con una precipitación con sulfato de estreptomicina.
Para esto, se añadió lentamente una solución al 10% (peso/volumen)
de sulfato de estreptomicina, mientras se agitaba a 0ºC, hasta que
se alcanzó una concentración final de 0,75%. Se incubó el lote
durante 15 minutos en hielo y se centrifugó luego durante 10 minutos
a 4ºC y 15000 x g. Se introdujo luego el sobrenadante en un circuito
de diálisis pretratado de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes (Medicell, Londres, Reino Unido) y se dializó dos veces
en cada caso en 1 litro de tampón B (fosfato de potasio 10 mM, pH
7,5, ditiotreitol 1 mM, ácido etilenodiaminatetraacético 2 mM)
durante 1,5 horas a 4ºC. El dializado se centrifugó luego durante
15 minutos a 4ºC y 75600 x g.
Paso
2
Se separó el sobrenadante del Paso 1 y se
introdujo en una columna de intercambio aniónico del tipo
"Resource Q" (1 ml de volumen de columna, Amersham Pharmacia,
Freiburg, Alemania) equilibrada con 4 volúmenes de columna de tampón
B. La columna se lavó abundantemente con 4 volúmenes de columna de
tampón B y se eluyó luego con un gradiente lineal desde tampón B a
tampón C (fosfato de potasio 10 mM, pH 7,5, ditiotreitol 1 mM, ácido
etilenodiaminatetraacético 2 mM, NaCl 1 M) en 15 volúmenes de
columna. La cromatografía de intercambio aniónico se realizó a 20ºC
y las fracciones se recogieron a 4ºC. La
malato-deshidrogenasa se eluyó a aproximadamente
NaCl 0,5 M. Las fracciones que contenían actividad de
malato-deshidrogenasa se reunieron y se desalaron
después por medio de filtración en gel sobre columnas
PD-10 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania) con
tampón D enfriado en hielo (fosfato de potasio 10 mM, pH 7,5) de
acuerdo con las instrucciones del fabri-
cante.
cante.
Paso
3
Se introdujeron menos de 10 mg de proteína total
procedente del paso 2 en una columna llena con 2,5 ml del material
de columna "Reactive Brown 10" (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y
equilibrada con 12,5 ml de tampón D. La columna se lavó
abundantemente con 15 ml de tampón D enfriado en hielo y la
malato-deshidrogenasa se eluyó con 2,5 ml de tampón
E (fosfato de potasio 10 mM, pH 7,5, NADH 1 mM). El material eluido
se desaló por medio de filtración en gel sobre columnas
PD-10 como se ha descrito arriba.
Paso
4
Se repitió el paso 3. La proteína purificada de
esta manera se guardó a -20ºC. Para estabilización de la actividad,
la muestra se complementó con 1 mg/ml de seroalbúmina bovina. La
complementación con seroalbúmina bovina se omitió en el caso de las
muestras empleadas para determinación de la secuencia
N-terminal de la proteína
malato-deshidrogenasa. Para la medida de la
actividad de la enzima purificada Se utilizó un espectrofotómetro
Lambda-10 de Perkin Elmer (Foster City, CA, EE.UU.).
La malato-deshidrogenasa purificada tenía una
actividad específica máxima de reducción de oxalacetato de 1200 a
1300 \mumol/min y mg de proteína a una concentración de
oxalacetato 0,1 mM y NADH 0,3 mM.
La pureza de la
malato-deshidrogenasa aislada se determinó por medio
de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. El
análisis demostró que la malato-deshidrogenasa
purificada estaba presente como una proteína homogénea con un peso
molecular aparente de 33 kDa.
La secuencia de aminoácidos de la posición N de
la proteína malato-deshidrogenasa purificada se
determinó por degradación Edman (Edman, Molecular Biology
Biochemistry Biophysics 8: 211-55 (1970)) por medio
del secuenciador automático modelo 476A de PE Biosystems (Foster
City, CA, EE.UU.). La secuencia de aminoácidos resultante (véase
también SEQ ID NO. 1) era:
- Asn-Ser-Pro-Gln-Asn-Val-Ser-Thr-Lys-Lys-Val-Thr-Val-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Gln-Ile.
Se amplificó un segmento del gen mdhA por medio
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de DNA
cromsómico [sic] de la cepa ATCC13032 y se clonó luego.
Con ayuda de la secuencia de aminoácidos de la
posición N determinada en el Ejemplo 2, se desechó el iniciador
degenerado P1. Este iniciador tenía la secuencia:
- 5'-AARGTYACYGTYACYGGY-3'.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Como segundo iniciador degenerado se empleó el
iniciador P2, que tenía la secuencia siguiente:
- 5'-CGRTTRTGRTCVARRCG-3'.
La abreviatura R' representa las nucleobases A o
G, la abreviatura Y representa C o T y la abreviatura V representa
A, G o C.
Los iniciadores indicados fueron sintetizados por
MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). La reacción PCR se llevó a cabo
por el método PCR estándar de Innis et al., (PCR protocols. A
guide to methods and applications, 1990, Academic Press, Nueva York,
EE.UU.). Como molde se utilizó el DNA genómico de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032, que se aisló por el método descrito por
Pospiech y Neumann (Trends in Genetics 11: 217-218
(1995)).
En la reacción en cadena de la polimerasa, se
repitió 30 veces un ciclo que comprendía desnaturalización (30
segundos, 94ºC), reasociación (60 segundos, 63ºC) y síntesis (90
segundos, 72ºC). Finalmente se llevó a cabo una última síntesis de
10 minutos a 72ºC. Se utilizaron la polimerasa Taq de Promega
(Madison, WI, EE.UU.) y un termociclador de Techne (Cambridge, Reino
Unido).
El fragmento de DNA del gen mdhA de aprox. 470 pb
de longitud preparado de esta manera se purificó con ayuda del Kit
de Purificación PCR QIAQuick de Qiagen (Hilden, Alemania) y se clonó
en el sitio de restricción EcoRV del vector pBlueskript II SK(+)
(Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). El fragmento se aisló luego con
ayuda de las Enzimas de restricción BamHI y HindIII y se clonó en el
vector pEM1 tratado con las Enzimas de restricción BamHI y HindIII
(Schrumpf et al. Journal of Bacteriology 173,
4510-4516 (1991)) en E. coli DH\alpha,
teniendo lugar la selección sobre medio LB complementado con 50
\mug/ml de kanamicina. El plásmido formado de esta manera se
denominó pEMmdhAint.
En la cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC13032, el gen mdhA se desactivó con ayuda de plásmido
pEMmdhAint.
La cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 se transformó con el plásmido pEMmdhAint como ha sido
descrito por Van der Rest et al (Applied Microbiology and
Biotechnology 52, 541-545 (1999)). La selección de
los transformantes se llevó a cabo sobre agar LBHIS, que se había
complementado con 25 mg/l de kanamicina. El agar LBHIS comprende
medio LB, que se ha complementado con 18,5 g/l de caldo
cerebro-corazón (Becton Dickinson, Sparks MD,
EE.UU.), 91 g/l de sorbitol y 15 g/l de agar-agar.
De esta manera se formó la cepa
ATCC13032-mdhA::pEMmdhAint, en la cual el plásmido
pEMmdhAint está integrado en el gen mdhA.
Se aisló el DNA cromosómico a partir de la cepa
ATCC13032mdhA::pEMmdhAint como ha sido descrito por Pospiech y
Neumann (Trends in Genetics 11: 217-218 (1995)), y
se digirió completamente en dos lotes diferentes, una vez con la
enzima de restricción StuI y una vez con la enzima de restricción
XbaI. Los fragmentos cromosómicos de restricción se ligaron como ha
sido descrito por Niaudet et al. (Gene 19,
277-284 (1982)) y se transformó Escherichia
coli DH5\alphaMCR (Grant et al Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A. 87, 4645-4649
(1990)) con el lote de ligación. Los transformantes se seleccionaron
sobre agar LB con 50 mg/l de kanamicina. El DNA plasmídico se aisló
a partir de los transformantes y se sometió a un análisis de
restricción. De esta manera se identificaron los plásmidos
pEMmdhAint-StuI y pEMmdhAint-XbaI,
que, además del fragmento interno del gen mdhA de 470 pb de longitud
clonado ya en el plásmido pEMmdhAint, llevaban regiones del extremo
5' y del extremo 3' del gen,. El plásmido
pEMmdhAint-StuI, obtenido por la digestión con StuI,
tenía adicionalmente 0,56 kb en el extremo 5' y 0,40 kb en el
extremo 3' de la región de 470 pb. El plásmido
pEMmdhAint-XbaI, obtenido por la digestión con
XbaI, tenía adicionalmente 1,2 kb en el extremo 3' de la región de
470 pb.
Los plásmidos obtenidos fueron secuenciados por
Seqlab (Göttingen, Alemania), utilizando el protocolo
Cycle-Sequencing de Zimmerman et al.
(BioTechniques 17:302 (1994)). Las secuencias se evaluaron con la
versión PC/Gene 6.60 de Intelligenetics Inc. (Ginebra, Suiza). La
secuencia de la agrupación génica mdhA se muestra en
\hbox{SEQ
ID NO. 2.}
Se llevan a cabo experimentos con diversos
productores conocidos de lisina de C. glutamicum a fin de
investigar el efecto de la eliminación del gen mdhA sobre la
producción de lisina.
La cepa MH20-22B se describe en
el documento EP-B 0435132 y ha sido depositada como
DSM5715 de acuerdo con el Tratado de Budapest. La cepa
DM58-1 se describe en el documento
EP-B-0358940. El transformante
DM58-1/pDM6 descrito en dicho lugar ha sido
depositado como DSM4697 de acuerdo con el Tratado de Budapest. La
cepa DM58-1 puede prepararse a partir de DSM4697 por
métodos de curado, tales como, por ejemplo, por el método de
"curado de plásmidos" descrito por Schäfer et al.
(Journal of Bacteriology, 176, 7309-7319 (1994)). La
cepa DG 52-5 se describe en el documento
DE-C-3823451. El transformante DG
52-5/pZ1-asd descrito en dicho lugar
ha sido depositado como DSM4421 de acuerdo con el Tratado de
Budapest. La cepa DG52-5 puede prepararse también a
partir de DSM4421 por el método de "curado de plásmidos".
\global\parskip0.990000\baselineskip
La cepa Corynebacterium glutamicum
MH20-22B se transformó con el plásmido pEMmdhAint
como ha sido descrito por Van der Rest et al (Applied
Microbiology and Biotechnology 52, 541-545 (1999)).
La selección de los transformantes se llevó a cabo en agar LBHIS,
que se había complementado con 25 mg/l de kanamicina. De este modo
se formó la cepa MH20-22BmdhA::pEMmdhAint. A partir
de las cepas DG52-5 y DM58-1, se
formaron en cada caso de la misma manera las cepas
DG52-5mdhA::pEMmdhAint y
DM58-1mdhA::pEMmdhAint.
Para confirmar el éxito de la mutagénesis de
inserción, se midió la actividad de
malato-deshidrogenasa en las cepas
MH20-22B, DM58-1 y
DG52-5 y en los mutantes de inserción
MH20-22BmdhA::pEMmdhAint,
DG52-5mdhA::pEMm-dhAint y
DM58-1mdhA::pEMmdhAint. Para esto, se inoculó en
cada caso una colonia de las cepas en 50 ml de medio 2 x TY y se
incubó durante 16 horas en un matraz cónico de 250 ml a 30ºC y 200
revoluciones por minuto. Los medios para las cepas
MH20-22BmdhA::pEMmdhAint,
DG52-5mdhA::pEMmdhAint y
DM58-1mdhA::pEMmdhAint recibieron en este caso
adicionalmente 25 \mug/ml de kanamicina. Los cultivos se
sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 10000 x g, se
lavaron dos veces con fosfato de potasio 50 mM de pH 7,5, y se
suspendieron luego en 5 ml del mismo tampón. Las suspensiones de
células se rompieron con dos pasadas a través de una Celda de
Prensa Francesa enfriada en hielo bajo 165 MPa. Las muestras se
centrifugaron luego durante 10 minutos a 75000 x g y 4ºC. El
sobrenadante claro se utilizó como el extracto bruto para las
medidas de la actividad de malato-deshidrogenasa.
La malato-deshidrogenasa se determinó utilizando
como tampón
3-amino-1-propanol
100 mM (pH 9,2) que contenía adicionalmente MgCl2 [sic] 4,5 mM y
NAD^{+} 2,9 mM. El lote de ensayo contenía 1 ml de este tampón y
50 \mul del extracto bruto. El lote se incubó primeramente
durante 30 minutos a 30ºC. Después de ello, se inició la reacción
de malato-deshidrogenasa por la adición de
L-malato 25 mM neutralizado. La absorción se midió
a una longitud de onda de 340 nm en un espectrofotómetro
Lambda-10 de PE Biosystems (Foster City, CA,
EE.UU.). La medida con el lote de reacción completo sin
L-malato sirvió como control de la tasa de reducción
específica de NAD^{+}.
Las cepas de partida MH20-22B,
DM58-1 y DG52-5 tenían una actividad
específica de malato-deshidrogenasa de 301, 380 y
354 nmol/min x mg de proteína respectivamente, mientras que los
mutantes de inserción de mdhA no exhibían actividad detectable
alguna de malato-deshidrogenasa. El límite inferior
de detección para la actividad era en este caso 2 nmol/min x mg de
proteína.
Las cepas descritas en el Ejemplo 5 se incubaron
en medio 2 x TY, que se había complementado con kanamicina (25
\mug/ml) en el caso de los mutantes de inserción, durante 24 horas
a 30ºC. Para cultivo en un medio líquido, se utilizó el medio CgIII
(Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175:
5595-5603), que se había complementado
adicionalmente con kanamicina (25 mg/l) para los mutantes de
inserción. Para ello, se inocularon 10 ml de medio contenido en un
matraz cónico de 100 ml con una colonia de la cepa y el cultivo se
utilizó luego adicionalmente como pre-cultivo.
Se utilizó medio mínimo
CGXII-glucosa (Keilhauer et al., Journal of
Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) como el medio de
producción y de ensayo. El medio no contenía cantidad alguna de
kanamicina. El cultivo se llevó a cabo en matraces cónicos de 500 ml
equipados con una espiral metálica que tenía un diámetro de 2 cm
que descansaba a lo largo del borde sobre la base. Estos matraces se
llenaron con 60 ml de medio mínimo CGXII-glucosa.
Los cultivos se inocularon con el pre-cultivo de tal
modo que la densidad óptica tenía al comienzo un valor comprendido
entre 0,5 y 0,6. El cultivo se llevó a cabo durante 72 horas a 30ºC.
Los matraces se agitaron mediante sacudidas con una frecuencia de
140 revoluciones por minuto.
Después de la incubación durante 72 horas, se
determinaron la densidad óptica del cultivo y la concentración de
lisina en el medio de producción.
La densidad óptica (DO) se determinó con un
espectrofotómetro Lambda B de Perkin-Elmer a una
longitud de onda de 600 nm.
La L-lisina se determinó por
medio de "Cromatografía Líquida de Alta Resolución",
utilizándose una columna "Hypersil ODS 5 \mu" (dimensiones:
125 x 4 mm) de Chromatographie-Service, Langerwehe,
Alemania. La separación se llevó a cabo por medio de un gradiente
lineal de fases móviles A: acetato de sodio 0,1 mM, pH 7,5 y B:
metanol (relación A:B de 85:15 a 0:100). Cinco minutos antes de la
aplicación, los aminoácidos se derivatizaron con
orto-ftalodialdehído (reactivo OPA, Pierce, Rockford
IL, EE.UU.). La detección se llevó a cabo por medida de la
fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 243 nm y una
longitud de onda de emisión de 436 nm. El resultado del experimento
se muestra en la Tabla 1.
| Cepa | Densidad Óptica | L-lisina (mM) |
| MH20-22B | 37,1 | 26,1 |
| MH20-22BmdhA::pEMmdhAint | 36,5 | 29,3 |
| DG52-5 | 32,4 | 13,6 |
| DG52-5mdhA::pEMmdhAint | 48,7 | 44,4 |
| DM58-1 | 42,0 | 32,2 |
| DM58-1mdhA::pEMmdhAint | 38,7 | 42,2 |
Figura 1: Mapa del plásmido pEMmdhAint.
Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente. Los números de pares de bases
indicados son valores aproximados obtenidos en el contexto de la
reproducibilidad de las medidas.
- mdhAint
- Fragmento interno del gen mdhA, bases 566 a 1035 de Seq. ID. NO. 1
- gen Km
- Gen de resistencia a Km (Tn5)
- oriV
- Origen de replicación de E. coli
- OriT
- Origen para la transferencia (movilización) del plásmido RP4
- BamHI:
- Sitio de escisión de la enzima de restricción BamHI
- HindIII:
- Sitio de escisión de la enzima de restricción HindIII
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas secuencias de nucleótidos que
codifican el gen mdhA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00219 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Término N
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val
Thr Val Thr Gly Ala}
\sac{Ala Gly Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (536)..(1519)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen mdhA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
Claims (18)
1. Una bacteria corineforme aislada en la cual se
ha eliminado la expresión del gen mdhA constituido por un
polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de
malato-deshidrogenasa y que tiene una secuencia de
aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de
aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
2. La bacteria corineforme de la reivindicación
1, en la cual dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos
N-terminal de SEQ ID NO: 1.
3. La bacteria corineforme de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la cual dicho polipéptido tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
4. La bacteria corineforme de las
reivindicaciones 1 a 3, en la cual dicho polipéptido está codificado
por los nucleótidos 536 a 1519 del polinucleótido expuesto en SEQ ID
NO: 2.
5. La bacteria corineforme de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho polipéptido está codificado
por el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 2.
6. Un proceso para la preparación de
L-lisina que comprende realizar los pasos
siguientes,
- a)
- fermentación de las bacterias de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas bacterias producen L-lisina,
- b)
- concentración de L-lisina en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento de L-lisina.
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que se emplean bacterias en las cuales genes adicionales del
camino de biosíntesis del L-aminoácido deseado se
amplifican adicionalmente.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que se emplean bacterias en las cuales se eliminan los caminos
metabólicos que reducen la formación del
L-aminoácido deseado.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que se elimina la expresión del (o de los)
polinucleótido(s) que codifica(n) el gen mdhA.
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
6, en el que se reducen las propiedades catalíticas del polipéptido
(proteína enzimática) codificado por el polinucleótido mdhA.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
6, en el que, para la preparación de L-aminoácidos,
en particular L-lisina, se fermentan bacterias en
las cuales se intensifica(n), preferiblemente se
sobre-expresa(n) al mismo tiempo uno o más de
los genes seleccionados del grupo constituido por
- a)
- el gen dapA que codifica dihidrodipicolinato-sintasa,
- b)
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- c)
- el gen eno que codifica enolasa,
- d)
- el gen zwf que codifica el producto del gen zwf, y
- e)
- el gen lysE que codifica la exportación de lisina.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
6, en el que se elimina(n) al mismo tiempo uno o más de los
genes seleccionados del grupo constituido por:
- a)
- el gen pck que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa,
- b)
- el gen pgi que codifica glucosa-6-fosfato-isomerasa,
- c)
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa.
13. Un proceso de acuerdo con cualquiera o más de
las reivindicaciones anteriores, en el que se emplean
microorganismos del género Corynebacterium glutamicum.
14. Un proceso para producción de
L-lisina por fermentación de bacterias corineformes,
en el que dichas bacterias tienen una actividad
intra-celular eliminada de la enzima
malato-deshidrogenasa y en el que la secuencia de
aminoácidos es idéntica al menos en un 90% al polipéptido de acuerdo
con SEQ ID NO: 3.
15. Proceso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos
N-terminal de SEQ ID NO: 1.
16. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
14 ó 15, en el que dicho polipéptido tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
17. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
14 a 16, en el que dicho polipéptido es codificado por los
nucleótidos 536 a 1519 del polinucleótido expuesto en SEQ ID NO:
2.
18. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
14 a 17, en el que dicho polipéptido es codificado por el
polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 2.
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