ES2255114T3 - Proteinas recombinantes de fusion del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcio (prrsv) y su empleo en diagnostico. - Google Patents
Proteinas recombinantes de fusion del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcio (prrsv) y su empleo en diagnostico.Info
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Abstract
LAS PROTEINAS RECOMBINANTES DE FUSION COMPRENDEN LAS PROTEINAS NUCLEOCAPSIDAS DEL VIRUS DEL SINDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO DEL CERDO (PRRSV), OBTENIDO DE UN AISLAMIENTO EUROPEO DEL PRRSV Y DE UN AISLAMIENTO AMERICANO, QUE SE FUSIONO A UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DERIVADA DEL SISTEMA SELECCIONADO PARA LA EXPRESION DE DICHA PROTEINA RECOMBINANTE DE FUSION BIEN DIRECTAMENTE O A TRAVES DE UNA REGION DE UNION FORMADA POR UN PEQUEÑO NUMERO DE AMINOACIDOS. DICHAS PROTEINAS RECOMBINANTES DE FUSION SON ADECUADAS PARA SU USO EN EL DIAGNOSTICO DEL PRRSV.
Description
Proteínas recombinantes de fusión del virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y su empleo en
diagnóstico.
Esta invención se refiere, en general, a
proteínas recombinantes adecuadas para el diagnóstico de un patógeno
porcino, en particular, a proteínas recombinantes de fusión que
comprenden la proteína de la nucleocápsida del virus del síndrome
reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) obtenida tanto de
aislados europeos como de aislados americanos, y a su empleo en el
diagnóstico de PRRSV.
El agente causal del síndrome reproductivo y
respiratorio porcino (PRRS) es un nuevo arterivirus (PRRSV) aislado
por primera vez en Europa [Wensvoort et al., Vet. Quarterly,
13, (1991), 121-130] y posteriormente en los
Estados Unidos [Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4,
(1992), 117-126].
El PRRSV causa una patología importante en la
cabaña porcina caracterizada por trastornos reproductivos en cerdos
hembra (abortos, nacimiento de lechones muertos o débiles), y un
aumento de la mortalidad perinatal así como disnea y neumonía en
lechones [Terpstra et al., Vet. Quarterly, 13, (1991),
131-136].
El PRRSV es un virus RNA con cubierta, de 62 nm
de diámetro aproximadamente, cuyo genoma viral comprende un RNA de
cadena sencilla y polaridad positiva de unas 15 kilobases (kb) de
longitud. El genoma contiene 8 marcos de lectura abiertos (ORF)
solapantes [Meulenberg et al., Virology, 192, (1993),
62-72]. El virión contiene 6 proteínas
estructurales codificadas por los ORFs 2 a 7 [Meulenberg et
al., Virology, 206, (1995), 155-163; van
Nieuwstadt et al., J. Virol., 70, (1996),
4767-4772]. El ORF7 codifica la proteína de la
nucleocápsida (proteína N) que es la proteína más inmunogénica del
PRRSV [Sanz et al., Second Simposium on Aujeszky and PRRS
viruses, Copenhague, Dinamarca (1995)], por lo que es una buena
candidata para la detección de anticuerpos específicos del virus,
y, por consiguiente, para el diagnóstico de la enfermedad.
Se han descrito dos grupos antigénicos distintos
de PRRSV, que corresponden a los aislados americano y europeo. Los
aislados de PRRSV japoneses, así como otros aislados asiáticos están
relacionados antigénicamente con el aislado americano. Un ejemplo
característico de aislado europeo de PRRSV es el depositado en la
ECACC con el número de depósito V93070108 [patente española ES
2.074.950], mientras que un ejemplo representativo de aislado
americano de PRRSV es el identificado como VR-2332
[patente europea EP 0 529 584]. Los aislados europeo y americano de
PRRSV presentan un genotipo distinto [Meng et al., Archives
of Virology, 140 (1995), 745-755] con diferencias
antigénicas importantes [Wensvoort et al., J. Vet. Diagn.
Inves., 4, (1992), 134-138].
Mounir et al. (Advances in Experimental
Medicine and Biology 1995, vol 3 p.317-320)
describen una proteína de fusión recombinante de la nucleocápsida
de ORF7 a partir de la cepa americana de PRRSV con E. coli
MBP.
Las diferencias serológicas entre los aislados
europeo y americano complican el diagnóstico de la enfermedad ya
que en muchas ocasiones no hay reacción cruzada entre los sueros
porcinos respectivos (quizás debido a la ausencia de epítopos
inmunodominantes lineales). Además, la reciente introducción en
Europa de unas vacunas basadas en el aislado americano representa
una complicación adicional en el análisis serológico de animales
infectados y/o vacunados. Por tanto, es necesario desarrollar un
método de diagnóstico que permita discriminar entre ambos aislados
tanto en poblaciones individuales como mixtas con el fin de efectuar
una distinción precisa en cuanto a la procedencia del virus.
Existen kits para la detección de la presencia de
PRRSV o de anticuerpos que reconocen PRRSV específicos para los
aislados europeo y americano.
Los métodos habituales para el diagnóstico de
PRRSV comprenden la realización de un ensayo basado en la
inmuno-peroxidasa (IPMA) o la realización de un
ensayo de tipo ELISA basado en macrófagos alveolares de pulmón de
cerdo o en proteínas recombinantes antigénicas.
Las técnicas basadas en la IPMA son técnicas
caras y cruentas, que requieren el empleo de macrófagos alveolares
de pulmón de cerdo procedentes del sacrificio de animales, pudiendo
estar dichos macrófagos contaminados o infectados con otros
patógenos (salvo que se usen animales gnotobióticos o libres de
patógenos específicos, SPF), y no son susceptibles de
automatización pues requieren una inspección visual por
microscopio.
Las técnicas de ELISA basadas en macrófagos
requieren el empleo de extractos de macrófagos, por lo que presentan
los mismos problemas, en ese sentido, que las técnicas basadas en
IPMA. Además, el empleo de antígeno en forma de extracto celular
requiere una referencia interna con los mismos extractos celulares
pero sin infectar, por si hubiera algún suero de un animal de campo
que tuviera reactividad natural, es decir, que tuviera anticuerpos
naturales, que pudieran enmascarar el resultado.
Las técnicas de ELISA basadas en proteínas
recombinantes de PRRSV requieren la producción de antígeno viral en
cantidades apropiadas y en forma activa. La producción de antígenos
de PRRSV, por ejemplo la proteína de la nucleocápsida, en cultivo
de tejidos, es problemática y costosa. Por otra parte, la producción
de proteínas recombinantes de PRRSV usando baculovirus
recombinantes en células permisivas plantea numerosos problemas ya
que la expresión de dichas proteínas en ese sistema es costosa y
poco eficiente, las proteínas expresadas son insolubles y tan sólo
se recupera una pequeña fracción soluble que es la que se utiliza en
el ELISA. Por otra parte, los productos de los ORF 3, 5 y 7 de
PRRSV expresados por baculovirus recombinantes en células de
insecto son difíciles de purificar. Además, se debe incluir una
referencia de células de insecto sin infectar para descartar la
reactividad
natural.
natural.
En general, los métodos de diagnóstico deben ser
fiables, reproducibles, sensibles, sencillos, baratos, de amplio
espectro y, ventajosamente, deben utilizar antígenos activos cuya
producción en cantidades ilimitadas sea sencilla y económica.
Adicionalmente, en el caso de patógenos que tienen aislados con
diferencias genéticas, antigénicas y patogénicas, es conveniente
que permita discriminar entre los distintos aislados.
Los métodos utilizados para el diagnóstico de
PRRSV actualmente disponibles no cumplen satisfactoriamente todos
los requisitos que se deben exigir a un método de diagnóstico por lo
que sigue existiendo la necesidad de disponer de otros métodos para
el diagnóstico de PRRSV que solucionen todos o alguno de los
problemas mencionados previamente.
La invención proporciona unas proteínas
recombinantes de fusión, que comprenden la proteína de la
nucleocápsida de PRRSV obtenida tanto de aislados europeos como de
aislados americanos, útiles para el diagnóstico de PRRSV. La
invención también proporciona métodos y kits para el diagnóstico de
PRRSV que comprenden el empleo de dichas proteínas recombinantes de
fusión. Las secuencias de ácidos nucleicos que esencialmente
codifican dichas proteínas recombinantes de fusión constituyen un
objeto adicional de la presente invención.
Las proteínas recombinantes de fusión objeto de
esta invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre las secuencias identificadas (véase el apartado relativo a la
LISTA DE SECUENCIAS) como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de
aminoácidos correspondiente a la proteína de la nucleocápsida de un
aislado europeo de PRRSV, concretamente al identificado como Toledo
4/96 [Ejemplo 1], denominado en general "aislado europeo" en
esta descripción, mientras que la SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia
de aminoácidos correspondiente a la proteína de la nucleocápsida de
un aislado americano, en concreto al identificado como Canadá 14/96
[Ejemplo 2], denominado en general "aislado americano" en esta
descripción.
Las proteínas recombinantes de fusión comprenden
además una secuencia de aminoácidos, derivada del sistema elegido
para la expresión de la proteína recombinante de fusión, al que se
fusiona la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 2, bien directamente o
bien a través de una zona de unión formada por un pequeño número de
aminoácidos derivados de la manipulación genética del sistema de
expresión de la proteína recombinante de fusión. Dicha secuencia de
aminoácidos incluye la totalidad del producto del gen 10 del fago
T7.
En una realización particular de esta invención,
las proteínas recombinantes de fusión constan de una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2,
fusionada a un resto de 259 aminoácidos procedentes de la proteína
del gen 10 del fago T7 a través de una zona de unión de
4-6 aminoácidos. En una realización particular y
preferida de esta invención, las proteínas recombinantes de fusión
tienen las secuencias de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO:
8 o SEQ ID NO: 9.
Las proteínas recombinantes de fusión
proporcionadas por esta invención pueden obtenerse por expresión de
la secuencia que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV
fusionada a la secuencia del gen 10 del fago T7, con el plásmido
pET, que contiene el gen 10 del fago T7, en un sistema de expresión
adecuado, tal como un procariota, por ejemplo un microorganismo
perteneciente al género Escherichia, Bacillus,
Salmonella, Listeria, Yersi-
nia, etc.
nia, etc.
La secuencia que codifica la proteína de la
nucleocápsida de PRRSV puede obtenerse a partir del RNA viral por
métodos convencionales que comprenden, por ejemplo, la síntesis de
un DNA copia (cDNA) por transcripción inversa y la amplificación
enzimática del fragmento de ácido nucleico que contiene el gen de el
ORF 7 de PRRSV por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) utilizando los iniciadores apropiados.
A continuación, la secuencia completa que
codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se clona en un
plásmido que se usa para transformar células hospedadoras
apropiadas. En ocasiones, el plásmido con la secuencia completa de
el ORF7 de PRRSV se estabiliza mediante clonaje en un sistema
celular adecuado, donde además se comprueba la orientación y el
tamaño del inserto, y posteriormente se clona en las células
hospedadoras apropiadas para la expresión de la proteína
recombinante de fusión. Puede utilizarse cualquiera de los plásmidos
habitualmente usados en la transformación de procariotas.
La expresión correcta de las proteínas
recombinantes se analizó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y
tinción con azul de Coomassie o por inmunoblotting, mientras que su
antigenicidad se determinó por un ensayo de ELISA.
En una realización particular, la secuencia
completa de el ORF7 de PRRSV, tanto del aislado europeo como del
aislado americano, se ha clonado en el plásmido pET3x, se ha
estabilizado en células de E. coli DH5, de donde, tras
comprobar la orientación y el tamaño, se ha extraído y se ha clonado
en células de E. coli BL21 para la expresión de la proteína
recombinante de fusión correspondiente.
Las proteínas recombinantes de fusión de esta
invención, conteniendo la proteína de la nucleocápsida bien del
aislado europeo o bien del aislado americano de PRRSV, se han
expresado en E. coli BL21 con unos niveles de expresión muy
altos cuando se expresan como proteínas de fusión de gran tamaño [45
ó 46 kilodaltons (KDa)] (véanse los Ejemplos 3.4.1 y 4.4.1). Los
intentos previos para expresar la proteína de la nucleocápsida de
PRRSV sin fusionar a otras proteínas o fragmentos de las mismas, o
como proteínas de fusión pequeñas no permitieron producir niveles
detectables de dicha proteína. Aunque las proteínas recombinantes de
fusión proporcionadas por esta invención producen cuerpos de
inclusión, dichas proteínas se pueden recuperar fácilmente por
solubilización con cloruro de guanidinio. Las proteínas
recombinantes de esta invención, sin ninguna manipulación adicional,
salvo una simple dilución en tampón fosfato salino (PBS), pueden
ser utilizadas para recubrir un soporte sólido adecuado previo a su
empleo con fines de diagnóstico.
La expresión de la proteína de la nucleocápsida
de PRRSV en forma de proteína recombinante de fusión en E.
coli tiene lugar a niveles muy altos y se puede purificar
fácilmente por lo que dicha proteína es una candidata ideal para el
desarrollo de métodos y kits para el diagnóstico de PRRSV.
Las proteínas recombinantes de fusión
proporcionadas por esta invención son útiles como reactivo de
diagnóstico. Esta hipótesis se confirma por el hecho de que unos
anticuerpos monoclonales que compiten eficientemente con sueros
PRRSV-positivos, reconocen solo a la proteína
completa (Ejemplos 3.4.2 y 4.4.2). Además, el epítopo más
inmunodominante, el reconocido por los anticuerpos monoclonales 1CH5
y 1DH10, es un epítopo dependiente de conformación que requiere la
secuencia completa de la proteína de la nucleocápsida a ser
reconocida.
La invención también proporciona un método para
el diagnóstico de PRRSV, en particular, un método para detectar la
presencia de anticuerpos que reconocen específicamente a PRRSV, que
comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con
una proteína recombinante de fusión proporcionada por esta invención
bajo condiciones que permiten la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo, y detectar el complejo
antígeno-anticuerpo formado. En el sentido
utilizado en esta descripción el término "muestra biológica" se
refiere a una muestra procedente de un animal, tal como sangre,
suero, plasma, esputo, saliva o cualquier otro fluido biológico,
mientras que el término "animal" incluye a todos los
mamíferos, más concretamente a cerdos, cerdos hembras y
lechones.
El inmunoensayo puede ser, por ejemplo, un ELISA
indirecto o un ELISA de competición. La detección del complejo
antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante
técnicas convencionales que incluyen la producción de una reacción
coloreada, utilizando, por ejemplo, un reactivo marcado una enzima,
tal como peroxidasa, y un sustrato adecuado.
Adicionalmente, la invención proporciona un kit
para el diagnóstico de PRRSV, en particular, un kit para detectar
la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente a PRRSV en
una muestra biológica de un animal, que incluye una proteína
recombinante de fusión proporcionada por esta invención y unos
medios de detección adecuados del complejo
antígeno-anticuerpo formado que comprenden el
reactivo marcado y el sustrato adecuado. El kit de diagnóstico
también puede contener un control positivo y un control negativo al
objeto de facilitar la evaluación de los resultados del ensayo por
comparación con los resultados obtenidos con la muestra patrón.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención aunque no deben ser considerados como limitativos del
alcance de la misma.
El aislado de PRRSV identificado como Toledo
4/96, denominado "aislado europeo" en esta descripción, se
obtuvo a partir del suero de un animal procedente de una granja
situada en Toledo (España) en la que se habían dado casos de
abortos, anorexia, hipertermia y problemas respiratorios en
lechones.
El ORF7 de dicho aislado se obtuvo por medio de
una reacción de transcripción reversa (RT) seguida de amplificación
enzimática por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del
suero del animal infectado. Para ello, a 100 \mul de suero se le
añaden 600 \mul de tampón Chaos [para preparar 100 ml de tampón
Chaos se mezclan 50 g de tiocianato de guanidinio (GSCN) 4,2 M, 2,5
ml de sarcosilo al 20%, 1,25 ml de Tris-HCl, pH: 8,
2 M, 99,7 ml de agua, se filtra a través de un filtro de 0,22
\mum y se añaden 0,7 moles de
\beta-mercaptoetanol] y se incuba el conjunto
durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añaden
700 \mul de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (IAA)
(25:24:1), se mezcla con ayuda del vortex y se centrifuga a 13.000
r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC recogiéndose la fase acuosa
(aproximadamente 300 \mul). Este proceso de fenolización se
repite dos veces. El RNA se precipita con 1/10 (volumen) de acetato
sódico 3 M pH: 5,2 y 3 volúmenes de etanol absoluto, se lava con
etanol al 70% y el precipitado se seca. El RNA se resuspende en 20
\mul de tampón T:E [Tris:EDTA, 10:1 mM, pH: 7,5].
Para la realización de la RT-PCR
se utilizan 10 \mul de la suspensión formada. Para ello, a 10
\mul de dicha suspensión de RNA se le añaden 500 ng del
oligonucleótido iniciador complementario, identificado como SEQ ID
NO: 4, incubándose el conjunto durante 10 minutos a 65ºC. La mezcla
se deja enfriar lentamente a temperatura ambiente. Posteriormente,
se añaden 2 \mul de tampón 10X de dilución de la enzima Tth, 4
\mul de los desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) [dATP, dGTP,
dCTP y dTTP], los oligonucleótidos iniciadores, identificados como
SEQ ID NO: 3 (iniciador directo) y como SEQ ID NO: 4 (iniciador
inverso), y 1 \mul de transcriptasa inversa del virus de la
mieloblastosis aviar (AMV) y se lleva a un volumen de 20 \mul. La
mezcla se incuba durante 1 hora a 42ºC y posteriormente se inactiva
la transcriptasa reversa por calentamiento a 65ºC durante 5 minutos.
A continuación se lleva el volumen final de reacción a 100 \mul y
se añade 1 \mul de la DNA polimerasa de Thermus
thermofilus [Tfh] (Biotools, España). La mezcla se calienta a
94ºC durante 3 minutos y posteriormente se realizan 35 ciclos, cada
uno comprendiendo:
- desnaturalización: 94ºC durante 1 minuto;
- anillamiento: 60ºC durante 1 minuto; y
- elongación: 72ºC durante 30 segundos,
y una etapa de elongación final de
10 minutos a
72ºC.
Operando de esta manera se amplificó el fragmento
correspondiente al ORF7 completo [384 pares de bases (pb)] del
aislado de PRRSV denominado Toledo 4/96 (aislado europeo).
Los productos de la amplificación se detectaron
por electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de
etidio y se observaron por luz ultravioleta (\lambda: 300 nm) en
un transiluminaddor Fotodyne.
El aislado de PRRSV identificado como Canadá
14/96, denominado "aislado americano" en esta descripción, se
obtuvo del suero de un animal procedente de una granja canadiense
afectada de PRRS.
El ORF7 de dicho aislado se obtuvo por medio de
una reacción RT-PCR según el procedimiento descrito
en el Ejemplo 1, pero utilizando como oligonucleótido iniciador
para la transcripción reversa el identificado como SEQ ID NO: 6, y
como oligonucleótidos iniciadores en la PCR los identificados como
SEQ ID NO: 5 (iniciador directo) y como SEQ ID NO: 6 (iniciador
inverso). Operando de la manera indicada se amplificó y se detectó
el fragmento correspondiente al ORF7 completo [369 pares de bases
(pb)] del aislado PRRSV denominado Canadá 14/96 (aislado
americano).
El producto resultante de la amplificación por
PCR del Ejemplo 1, correspondiente a la secuencia completa del ORF7
del aislado europeo se clonó en el plásmido pMTL25 previamente
digerido con SmaI y tratado con fosfatasa, con el objeto de
proporcionar sitios BamHI compatibles con los vectores de
expresión. El plásmido resultante se denominó
pPRRSE-ORF7. El DNA plasmídico se secuenció según el
método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, (1977), 5463-5467]. La
secuencia putativa de aminoácidos derivada de dicha secuencia de
nucleótidos, correspondiente a la proteína de la nucleocápsida del
aislado europeo de PRRSV se muestra en la SEQ ID NO: 1. El análisis
de la secuencia de la proteína se realizó con el programa PC/GENE y
PredictProtein [Rost et al., Meth. Enzymol., 266, (1996),
525-539].
Posteriormente, la secuencia completa que
codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se subclonó en el
plásmido pET3x [Studier et al., Methods Enzymol., 185,
(1990), 60-89] previamente tratado con fosfatasa y
digerido con BamHI.
El plásmido pET3x que contiene la secuencia
completa de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se denominó
pET-PRRSVORF7E y se utilizó para transformar células
E. coli XL1 blue o DH5 competentes con el fin de estabilizar
el plásmido y comprobar la orientación del inserto. Las colonias
resultantes se rastrearon por digestión con las enzimas de
restricción apropiadas. Para comprobar la orientación, las
secuencias de unión de los insertos se secuenciaron mediante el
método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado
supra] utilizando el oligonucleótido mostrado en la SEQ ID
NO: 7 como iniciador.
Tras verificar que la orientación era correcta,
se transformaron células BL21 (DE3) pLysS [Studier et al.,
citado supra] competentes con el plásmido
pET-PRRSVORF7E anteriormente preparado con el fin de
expresar la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en forma de una
proteína de fusión con el producto del gen 10 del fago T7. Para
seleccionar las células transformadas se utilizaron placas de agar
con cloranfenicol y ampicilina.
Se crecieron clones de células de E. coli
BL21 (DE3) pLysS conteniendo los plásmidos recombinantes
pET-PRRSVORF7E y se indujeron con isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez-Torrecuadrada et al. [Virology, 210, (1995), 391-399]. Después de 3 horas de inducción, tiempo suficiente para acumular la proteína sin que tenga lugar una sobreproducción de células que hubieran perdido el plásmido o que fueran improductivas, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 \mul de PBS por 20 ml de cultivo y se lisaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra].
pET-PRRSVORF7E y se indujeron con isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez-Torrecuadrada et al. [Virology, 210, (1995), 391-399]. Después de 3 horas de inducción, tiempo suficiente para acumular la proteína sin que tenga lugar una sobreproducción de células que hubieran perdido el plásmido o que fueran improductivas, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 \mul de PBS por 20 ml de cultivo y se lisaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra].
La expresión correcta de las proteínas
recombinantes se analizó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y
tinción con azul de Coomassie o por inmunoblotting.
A cada muestra se le añadió un volumen de tampón
de carga (Tris-HCl 10 mM, pH: 6,9, 10% de SDS, 10%
de mercaptoetanol, 0,02% de azul de bromofenol y 35% de glicerol)
y, posteriormente, se calentaron las muestras a ebullición durante
5 minutos antes de efectuar el análisis sobre un gel de
poliacrilamida con 11% de SDS. La detección de las proteínas se
realizó por tinción con azul de Coomassie. Se observa una banda
intensa correspondiente a una proteína de un tamaño conforme con el
peso molecular esperado (46 KDa) y una producción abundante de la
proteína recombinante de fusión (0,1 mg/ml). La secuencia completa
de la proteína recombinante de fusión se muestra en la SEQ ID NO:
8. La proteína recombinante contiene el resto de aminoácidos
derivado del producto del gen 10 de T7 (aminoácidos 1 a 259), una
zona de unión de 6 aminoácidos (aminoácidos 260-265)
y la secuencia de la proteína de la nucleocápsida completa del
aislado europeo de PRRSV (aminoácidos 266-393).
La purificación de dicha proteína se realiza
según la metodología descrita por
Martínez-Torrecuadrada et al. [citado
supra]. La proteína de fusión obtenida es insoluble aunque
puede solubilizarse fácilmente con cloruro de guanidinio 4 M. La
pureza de la proteína de fusión obtenida tras la etapa de
solubilización es superior al 80% (determinado por tinción con azul
de Coomassie).
Las proteínas recombinantes de fusión se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando la técnica de
transferencia semi-seca (Bio-Rad)
durante 20 minutos a 22 Voltios. A continuación, las membranas se
incubaron durante 1 hora en solución de bloqueo (3% de leche
desnatada, 0,05% de Tween® 20 en PBS). Después del bloqueo, se
hicieron reaccionar las proteínas con los sobrenadantes de unos
anticuerpos monoclonales específicos frente a la proteína de la
nucleocápsida (identificados como 1AC7, 1AG11, 1DA4, 1BD11, 1EB9,
1CH5 y 1DH10) [Second Simposium on Aujeszky and PRRS viruses,
Copenhague, Dinamarca (1995)] durante toda la noche a 4ºC. Al cabo
de dos lavados con PBS-Tween® 20, el anticuerpo
unido se detectó con IgG anti-ratón conjugada a
peroxidasa (Pierce) diluida 1:2.000 en el tampón de bloqueo. Para
revelar el color de la reacción se añadió
4-cloro-1-naftol
(0,5 mg/ml) (SIGMA), 17% (v/v) de metanol, y 0,015% de peróxido de
hidrógeno en PBS. La reacción se paró añadiendo agua destilada a
las membranas. Los anticuerpos porcinos se detectaron utilizando la
Proteína A marcada con peroxidasa (SIGMA) siguiendo el mismo
protocolo.
Los resultados obtenidos confirman que los
anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4 reconocen la proteína
recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida
del aislado europeo de PRRSV por inmunoblotting.
Se han observado, por inmunoblotting, 3 patrones
diferentes de reactividad con los anticuerpos monoclonales, lo que
es indicativo de la existencia de 3 sitios antigénicos en la
proteína de la nucleocápsida de PRRSV. La región reconocida por los
anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4 está bien conservada
entre los distintos aislados de PRRSV. Los anticuerpos monoclonales
1BD11 y 1EB9 reaccionaron con la proteína de la nucleocápsida
completa y pudieron reconocer tanto un epítopo discontinuo así como
un epítopo localizado en el sitio de restricción de EcoNI.
Finalmente, los anticuerpos monoclonales 1CH5 y 1DH10 definían otro
sitio antigénico y reconocieron un epítopo discontinuo que requiere
la nucleocápsida completa.
Debido al hecho de que el análisis por inmunoblot
indicaba la presencia de, al menos, dos epítopos discontinuos, la
reactividad de los anticuerpos monoclonales se caracterizó por un
ensayo ELISA indirecto bajo condiciones en las que la proteína
estuviera más próxima a su plegamiento apropiado.
Placas de microtitulación de 96 pocillos
(LabSystem) se recubrieron, durante toda la noche, a 4ºC, con 100
\mul de una dilución 1:100 de la proteína recombinante de fusión
conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de
PRRSV, expresada por E. coli y solubilizada con cloruro de
guanidinio 4 M en tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6. A continuación,
las placas se incubaron con los sobrenadantes sin diluir de los
anticuerpos monoclonales o con diluciones seriadas dobles del suero
del animal correspondiente durante 2 horas a 37ºC. Después de
lavar, las placas se incubaron con los conjugados con peroxidasa, de
anticuerpos IgG anti-ratón (1:1000) o de proteína A
(1:5000) en el mismo tampón que el descrito previamente. La reacción
se detectó añadiendo
2,2'-azino-di[etil]-benzotiazolina
[ABTS] (Sigma) como sustrato y se paró por adición de SDS al 1%. La
densidad óptica de las muestras se determinó a 405 nm en un lector
de ELISA (Bio-Tek Instruments, Estados Unidos).
Los resultados obtenidos por ELISA se muestran en
la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Anticuerpo monoclonal | PRF-E Toledo 4/96 |
| 1CH5 | ++ |
| 1DH10 | ++ |
| 1BD11 | +++ |
| 1EB9 | +++ |
| 1DA4 | +++ |
| 1AG11 | +++ |
| 1AC7 | +++ |
| ++: > 1,0 unidades de absorbancia (405 nm) | |
| +++: > 2,0 unidades de absorbancia (405 nm) | |
| PRF-E: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado | |
| europeo de PRRSV. |
Como puede apreciarse en la Tabla 1, todos los
anticuerpos monoclonales reaccionaban con la proteína recombinante
de fusión expresada por E. coli. Estos datos confirman que
los anticuerpos monoclonales 1CH5 y 1DH10 reconocen un epítopo
discontinuo y requieren que la nucleocápsida permanezca parcialmente
plegada. Como se esperaba, el resto de los anticuerpos monoclonales
dio el mismo patrón de reactividad que el obtenido por
inmunoblotting lo que confirma la presencia de otros dos
epítopos.
Se repitió exactamente el procedimiento descrito
en el Ejemplo 3.1, pero utilizando el producto resultante de la
amplificación por PCR del Ejemplo 2, correspondiente a la secuencia
completa del ORF7 del aislado americano, con lo que al clonarlo en
el plásmido pMTL25 previamente digerido con SmaI y tratado
con fosfatasa se obtuvo el plásmido denominado
pPRRSC-ORF7. El DNA plasmídico se secuenció según el
método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado
supra], mientras que el análisis de la secuencia de
aminoácidos de la proteína se realizó con el programa PC/GENE y
PredictProtein [Rost et al., citado supra]. La
secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida del
aislado americano de PRRSV se muestra en la SEQ ID NO: 2.
Posteriormente, la secuencia completa que
codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se subclonó en el
plásmido pET3x [Studier et al., Methods Enzymol., 185,
(1990), 60-89] tratado previamente con fosfatasa y
digerido con BamHI.
El plásmido pET3x conteniendo la secuencia
completa de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se denominó
pET-PRRSVORFC y se utilizó para transformar células
E. coli XL1 blue o DH5 competentes. Las colonias resultantes
se rastrearon por digestión con las enzimas de restricción
apropiadas. Para comprobar la orientación, las secuencias de unión
de los insertos se secuenciaron mediante el método de los
didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado supra]
utilizando el oligonucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 7 como
iniciador.
Tras verificar que la orientación era correcta,
se transformaron células BL21 (DE3) pLysS [Studier et al.,
citado supra] competentes con el plásmido
pET-PRRSVORF7C anteriormente preparado con el fin de
expresar la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en forma de una
proteína de fusión con el producto del gen 10 del fago T7. Para
seleccionar las células transformadas se utilizaron placas de agar
con cloranfenicol y ampicilina.
Se crecieron clones de células de E. coli
BL21 (DE3) pLysS conteniendo los plásmidos recombinantes
pET-PRRSVORF7C y se indujeron con IPTG 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez-Torrecuadrada et al. [citado supra]. Al cabo de 3 horas de inducción, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 \mul de PBS por 20 ml de cultivo y se lisaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra].
pET-PRRSVORF7C y se indujeron con IPTG 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez-Torrecuadrada et al. [citado supra]. Al cabo de 3 horas de inducción, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 \mul de PBS por 20 ml de cultivo y se lisaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra].
Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo
3.4.1, se observó una banda intensa correspondiente a una proteína
de un tamaño conforme con el peso molecular esperado (45 KDa) y una
producción abundante de la proteína recombinante de fusión (0,1
mg/ml). La secuencia completa de la proteína recombinante de fusión
se muestra en la SEQ ID NO: 9. La proteína recombinante contiene
los restos de aminoácidos derivados del producto del gen 10 de T7
(aminoácidos 1 a 259), una zona de unión de 4 aminoácidos
(aminoácidos 260-263) y la secuencia de la proteína
de la nucleocápsida completa del aislado americano de PRRSV
(aminoácidos 264-386).
La purificación de dicha proteína se realiza
según la metodología descrita por
Martínez-Torrecuadrada et al. [citado
supra]. La proteína de fusión obtenida es insoluble aunque
puede solubilizarse fácilmente con cloruro de guanidinio 4 M. La
pureza de la proteína de fusión obtenida tras la etapa de
solubilización es superior al 80% (determinado por tinción con azul
de Coomassie).
Se siguió el procedimiento descrito en el Ejemplo
3.4.2., pero usando en este caso la proteína recombinante de fusión
conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de
PRRSV.
Los resultados obtenidos muestran que los
anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4, específicos para la
proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV, reconocen
también la proteína recombinante de fusión que contiene la proteína
de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV por
inmunoblotting.
Se siguió el procedimiento descrito en el Ejemplo
3.5 pero utilizando en este caso la proteína recombinante de fusión
conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de
PRRSV. Los resultados obtenidos por ELISA se muestran en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Anticuerpo monoclonal | PRF-C Canadá 14/96 |
| 1CH5 | +/- |
| 1DH10 | - |
| 1BD11 | - |
| 1EB9 | - |
| 1DA4 | ++ |
| 1AG11 | ++ |
| 1AC7 | ++ |
| -: < 0,2 unidades de absorbancia (405 nm) | |
| +/-: 0,2-0,4 unidades de absorbancia (405 nm) | |
| ++: > 1,0 unidades de absorbancia (405 nm) | |
| PRF-C: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado | |
| americano de PRRSV. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la reactividad de una colección de 8
sueros de campo procedentes de cerdos de distintas localizaciones
geográficas europeas por medio de un ELISA indirecto según la
metodología previamente descrita, utilizando como antígenos las
proteínas recombinantes de fusión conteniendo la proteína de la
nucleocápsida bien del aislado europeo (PRF-E) o
bien del aislado americano (PRF-C) obtenidas según
los Ejemplos 3 y 4 respectivamente. Los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 3. Como puede apreciarse, la proteína de la
nucleocápsida de PRRSV expresada en E. coli como proteína
recombinante de fusión fue reconocida por una colección completa de
sueros positivos para PRRSV determinado por ELISA.
| Antígeno utilizado | ||
| \hskip1cm Suero | PRF-E | PRF-C |
| a) Positivos | ||
| \hskip1cm 1036-9 | 1,534 | 1,348 |
| \hskip1cm 1036-2 | 1,449 | 0,611 |
| \hskip1cm 3 Comp | 1,898 | 0,705 |
| \hskip1cm 12 Comp | 1,662 | 0,775 |
| \hskip1cm 1032-68 | 1,619 | 0,518 |
| \hskip1cm 1036-1 | 1,856 | 0,320 |
| b) Negativos | ||
| \hskip1cm 1032-67 | 0,330 | 0,361 |
| \hskip1cm PRRSC- | 0,207 | 0,366 |
| [Valores determinados por absorbancia a 405 nm] | ||
| PRF-E: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado | ||
| europeo de PRRSV (SEQ ID NO: 8). | ||
| PRF-C: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado | ||
| americano de PRRSV (SEQ ID NO: 9). |
Como puede apreciarse, se observa una reacción
más específica y mayoritaria frente a la PRF-E, lo
que permite la identificación de animales positivos a PRRSV así
como distinguir el origen del aislado viral.
Alternativamente al ensayo de ELISA indirecto se
puede realizar un ensayo de ELISA de competición donde se combina
el uso del antígeno recombinante con la especificidad de los
anticuerpos monoclonales. En general, este ensayo es más específico
y más sensible.
Para la realización del ELISA de competición, se
recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (LabSystem)
durante toda la noche, a 4ºC, con 100 \mul (1 \mug/pocillo) de
la proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la
nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV expresada en E.
coli (Ejemplo 3) solubilizada con cloruro de guanidinio 4 M en
tampón carbonato 0,05 M, pH: 9,6. A continuación, se añadieron 100
\mul de las muestras de suero a evaluar (15 muestras, 6 positivas
y 9 negativas), diluidas 1/5 en PBS-Tween® 20
0,05%, y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Sin retirar los
sueros, se añadieron 50 \mul del anticuerpo monoclonal 1CH5
marcado con peroxidasa (1:5000) en el mismo tampón descrito con
anterioridad y se continuó la incubación durante 30 mi-
nutos más.
nutos más.
La reacción se detectó añadiendo ABTS como
sustrato. La reacción se paró por adición de SDS al 1%. La densidad
óptica de las muestras se determinó a 405 nm en un lector de ELISA
(Bio-Tek Instruments, Estados Unidos). Los
resultados obtenidos se resumen en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sueros Positivos | A_{405} | Sueros Negativos | A_{405} |
| C19 | 0,492 | 1984-1996 PPA1 | 1,399 |
| C45 | 0,107 | PPA3 | 1,607 |
| C58 | 0,130 | 5 | 1,646 |
| 270 | 0,710 | 18 | 1,476 |
| 273 | 0,559 | 30 | 1,276 |
| ING-CP | 0,074 | MAT GII | 1,534 |
| POOL N | 1,704 | ||
| LECHON | 1,555 | ||
| ING-CN | 1,571 |
\vskip1.000000\baselineskip
El valor del punto de corte
(Cut-off) se determinó mediante la fórmula
siguiente
Cut-off: CN - (CN
- CP) x
0,5
donde CN es el valor de la
absorbancia a 405 nm del control negativo y CP el del control
positivo.
Se considera que una muestra es positiva si el
valor de la absorbancia de dicha muestra a 405 nm es menor del
valor del cut-off. En caso contrario, la muestra se
considera negativa.
Los sueros se habían tipificado previamente por
medio de un ensayo de referencia basado en la inmunoperoxidasa
(IPMA) [WO 92/21375].
En conclusión, los resultados de los Ejemplos 5 y
6 ponen de manifiesto la capacidad de las proteínas recombinantes
de fusión proporcionadas por esta invención para el diagnóstico
indirecto de PRRSV, por detección de anticuerpos frente al
virus.
El plásmido denominado
pET-PRRSVORF7E, conteniendo la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína de la nucleocápsida (ORF7) del
aislado de PRRSV Toledo 4/96 ha sido depositado el 19 de diciembre
de 1996 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot,
Valencia (España), correspondiéndole el número de depósito CECT
4836.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INMUNOLOGÍA Y GENÉTICA APLICADA, S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Hermanos García Noblejas, 41
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Madrid
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROVINCIA: Madrid
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: España
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 28037
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (91) 368 05 01
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (91) 408 75 98
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE FUSIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRSV) Y SU EMPLEO EN DIAGNÓSTICO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 128 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: EUROPEA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: AMERICANA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: EUROPEA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCGTCAAG TATGGCCGGT A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: EUROPEA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTGTCAAA TTAGCTTGCA CCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: AMERICANA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAATATGCC AAATAACACC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: AMERICANA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCATGAG GGTGATCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATCCGCAA CGTTATGGGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 393 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: EUROPEA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 386 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: PRRSV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: AMERICANA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Una proteína recombinante de fusión que
comprende una secuencia de aminoácidos del virus del síndrome
reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) seleccionada de entre
la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, fusionada a los restos de
aminoácidos 1-259 procedentes de la proteína del gen
del fago T7.
2. Una proteína según la reivindicación 1, en
donde la secuencia de aminoácidos de PRRSV seleccionada entre la
secuencias SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, está fusionada a los
restos de aminoácidos 1-259 procedentes de la
proteína del gen 10 del fago T7 por medio de una zona de unión de 4
a 6 aminoácidos.
3. Una proteína según la reivindicación 1, que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID
NO: 8 y la SEQ ID NO: 9.
4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica
una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un método para el diagnóstico del virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que comprende
poner en contacto una muestra biológica de un animal con una
proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 bajo
condiciones que permiten la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo y la detección del complejo
formado.
6. Un kit para el diagnóstico del virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que comprende
una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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