ES2255157T3 - Reactivo de tiempo de protrombina basado en el factor tisular recombinante de conejo. - Google Patents

Reactivo de tiempo de protrombina basado en el factor tisular recombinante de conejo.

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ES2255157T3 ES98918354T ES98918354T ES2255157T3 ES 2255157 T3 ES2255157 T3 ES 2255157T3 ES 98918354 T ES98918354 T ES 98918354T ES 98918354 T ES98918354 T ES 98918354T ES 2255157 T3 ES2255157 T3 ES 2255157T3
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Abstract

Un método para preparar un reactivo líquido o liofilizado para determinar el tiempo de protrombina o las concentraciones de fibrógeno en una muestra de plasma, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una solución, suspensión o dispersión que contiene una vesícula de fosfolípido, estando dicha solución, suspensión o dispersión exenta de tensioactivo; (b) mezclar proteína de factor tisular disuelta en tensioactivo con dicha solución, suspensión o dispersión; e (c) incubar la mezcla producida en la etapa (b) en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicha proteína de factor tisular disuelta en tensioactivo se asocie con dicha vesícula de fosfolípido, para producir un reactivo capaz de inducir la coagulación en la muestra de plasma sin eliminación del tensioactivo.

Description

Reactivo de tiempo de protrombina basado en el factor tisular recombinante de conejo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de los reactivos de tiempo de protrombina para determinar las deficiencias en el sistema de coagulación, y más particularmente a reactivos para ensayos del tiempo de protrombina realizados usando factor tisular recombinante de conejo, y fosfolípidos de una fuente natural o sintética. La presente invención también incluye una preparación de factor tisular recombinante de conejo y nuevos métodos de obtención de los reactivos.
Antecedentes de la invención
El factor tisular, también llamado tromboplastina, es una glicoproteína asociada a la membrana que funciona formando un complejo con los factores de coagulación sanguíneos VII y VIIa. La actividad del factor tisular depende de la presencia de fosfolípidos, que están asociados con la proteína. Bach, Ronald R., "Initiation of Coagulation by Tissue Factor", CRC Critical Reviews in Biochemistry, 23 (4):339-368 (1988). La formación de complejos de los factores VII y VIIa con el factor tisular incrementa considerablemente su actividad proteolítica. El complejo activa una serie de enzimas que comprenden las vías común y extrínseca de las cascadas de coagulación, que conducen en última instancia a la formación de trombina, la cual cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina, produciendo la formación de coágulos. Nemerson, Yale, "Tissue Factor and Hemostasis" Blood, 71:1-8 (1998).
Los ensayos diagnósticos, como el ensayo del tiempo de protrombina (PT), utilizan esta serie de sucesos enzimáticos in vitro en condiciones controladas para diagnosticar las deficiencias diagnósticas en el sistema de coagulación sanguínea de los pacientes, y para controlar pacientes sometidos a terapia anticoagulante. En el ensayo PT, un reactivo que induce la coagulación se añade a una muestra de plasma del paciente. Todos los reactivos PT contienen factor tisular como ingrediente inductor de la coagulación. El tiempo que tarda en producirse la formación de los coágulos en la muestra de plasma es el tiempo de protrombina o valor PT. La mayoría de los reactivos PT disponibles contienen factor tisular bruto extraído de fuentes naturales, p.ej., cerebro de conejo, mezclas de cerebro/pulmón de conejo, placenta humana o cerebro bovino. Los extractos brutos, debido a que son productos naturales, a menudo carecen de uniformidad entre lotes. Por ejemplo las tromboplastinas de cerebro de conejo muestran variabilidad estacional. Otro problema con los extractos naturales es la presencia de contaminantes. Por ejemplo, el factor tisular humano puede ser una fuente de HIV u otras enfermedades víricas humanas, y muchas tromboplastinas de fuentes naturales también contienen otros factores de coagulación extraños que pueden afectar negativamente al valor
PT.
En un intento de superar algunos de estos problemas, se han usado factores tisulares recombinantes para obtener reactivos PT. Por ejemplo, en la solicitud PCT publicada WO93/07492 se describe un reactivo de tiempo de protrombina basado en el factor tisular humano recombinante. Sin embargo, el factor tisular humano es sensible a proteínas inducidas por ausencia de vitamina K o antagonistas (PIVKAs), que se ha demostrado que alteran el tiempo PT y producen un resultado impreciso en el ensayo PT (Kovacs M.J. et al, "Assessment of the validity of the INR system for patients with liver impairment". Thromb. Haemost, (1994); 71:727-30 y Spaethe, R. y Shirley, I. "Comparison of a highly sensitive rabbit brain thromboplastin, Dade Thromboplastin FS, with a human brain thromboplastin, Manchester Comparative Thromboplastin" en Thromboplastin Calibration and Oral Anticoagulation Control, A.M.H.P. van den Besselaar, editores H.R. Gralnick y S.M. Lewis, Editores Martinus Nijhoff Publishers, (1984), págs. 197-206). Las PIVKAs están presentes a menudo en pacientes sometidos a terapia anticoagulante, o pacientes que tienen una enfermedad hepática u otra alteración que produzca una deficiencia de vitamina K. Por tanto, los reactivos PT basados en factor tisular humano pueden proporcionar PTs imprecisos cuando se usan con muestras de plasma procedentes de pacientes con concentraciones de PIVKA elevadas.
Sumario de la invención
La invención se refiere a reactivos de tiempo de protrombina que contienen factor tisular recombinante derivado de conejo, una preparación de factor tisular recombinante de conejo y métodos para obtener reactivos basados en factores tisulares recombinantes. La invención se refiere también a métodos para determinar valores PT y concentraciones de fibrinógeno en muestras de plasma, usando los reactivos de la presente invención.
En un aspecto, la invención se refiere a un reactivo para determinar el tiempo de protrombina y/o las concentraciones de fibrinógeno en una muestra de plasma, en la que el reactivo comprende una proteína de factor tisular recombinante, un fosfolípido seleccionado del grupo formado por fosfatidilcolina, fosfatidilserina y sus combinaciones, un sistema tampón e iones calcio. El reactivo puede estar en forma líquida o liofilizado y, opcionalmente, puede contener otros ingredientes, incluyendo estabilizadores, antimicrobianos, biocidas, etc.
En otro aspecto, la invención se refiere a una preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo que tiene propiedades valiosas. El presente factor tisular recombinante de conejo comprende una secuencia aminoácida en la que se definen desde un extremo N-terminal hasta un extremo C-terminal: un dominio extracelular, un dominio de unión a lípidos, un dominio intracelular, y un marcador de afinidad para enriquecer selectivamente el factor tisular recombinante. La preparación purificada se enriquece en proteína de factor tisular recombinante que tiene el dominio de unión a lípidos, respecto a la proteína de factor tisular recombinante de conejo carente de marcador de afinidad.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de nuevo enriquecimiento en lípidos, para preparar un reactivo para determinar PT o las concentraciones de fibrinógeno. El método comprende las etapas de (a) proporcionar una solución, suspensión o dispersión que contiene vesículas de fosfolípido; (b) mezclar proteína del factor tisular con la solución, suspensión o dispersión; y (c) incubar la mezcla en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la proteína se asocie con las vesículas de fosfolípido. El método se puede usar con proteínas de factor tisular naturales o recombinantes. La proteína es preferiblemente una proteína de factor tisular recombinante. En una realización actualmente preferida, la proteína es una proteína de factor tisular recombinante; más particularmente, la preparación de factor tisular recombinante de conejo purificada descrita aquí. La invención comprende además reactivos producidos mediante el método.
Breve descripción de la figura
La Figura es un gráfico que muestra la comparación de concentraciones de fibrinógeno determinada usando un reactivo de tiempo de protrombina basado en factor tisular de conejo convencional frente a un reactivo basado en factor tisular recombinante de conejo.
Descripción detallada
Se ha desarrollado un reactivo basado en un factor tisular recombinante con fosfolípidos definidos y otros estabilizadores. Este reactivo puede ser una formulación líquida o liofilizada, y es útil para determinar las concentraciones de fibrinógeno, el porcentaje de actividad del factor de coagulación, el tiempo de protrombina, el porcentaje de actividad PT, la proporción PT y la Proporción Normalizada Internacional (INR) en una muestra de un paciente usando instrumentos de coagulación clínica o mediante métodos manuales.
El reactivo comprende, como mínimo, proteína de factor tisular recombinante (el "factor tisular" se denomina también aquí algunas veces "tromboplastina"), fosfolípidos seleccionados del grupo formado por fosfatidilcolina, fosfatidilserina y sus combinaciones, un sistema tampón e iones calcio. El reactivo comprende además preferiblemente otros ingredientes, incluyendo, por ejemplo, estabilizadores, antimicrobianos y/o biocidas. En una realización preferida actualmente, la proteína de factor tisular recombinante es la proteína de factor tisular recombinante de conejo, y los fosfolípidos son fosfolípidos sintéticos. La proporción de proteína de factor tisular a lípido puede ser desde aproximadamente 0,05 \mug de proteína por mg de fosfolípido, hasta aproximadamente 30 \mug de proteína por mg de fosfolípido. En una realización preferida, el reactivo comprende una mezcla de fosfatidilserina y fosfatidilcolina en una proporción desde aproximadamente 5:95 hasta aproximadamente 95:5. Una proporción más preferida de fosfatidilserina/fosfatidilcolina es desde aproximadamente 15:85 hasta aproximadamente 60:40. En una realización preferida actualmente, la proporción de fosfatidilserina/fosfatidilcolina es desde aproximadamente 20:80 hasta aproximadamente 30:70.
El reactivo contiene preferiblemente iones calcio en una cantidad necesaria para la coagulación de la muestra de plasma. En una realización preferida actualmente, la concentración de iones calcio es desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM. Los iones calcio se añaden preferiblemente como cloruro cálcico (CaCl_{2}), pero se pueden usar otras sales cálcicas hidrosolubles, por ejemplo, gluconato cálcico.
En la presente invención, el tampón preferido es tampón Hepes, pero se pueden usar otros tampones como, por ejemplo, tampones Tris o Imidazol. La concentración preferida de tampón es la cantidad necesaria para coagulación óptima de la muestra de plasma. La concentración de tampón está preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 100 mM, con la máxima preferencia, aproximadamente 50 mM. El tampón contiene preferiblemente: NaCl (aproximadamente de 25 a 150 mM), glicina (aproximadamente de 0,1 a 100%), albúmina de suero bovino (aproximadamente de 0,1 a 1,0%), dextrano (aproximadamente de 0,1 a 100%), polietilenglicol (aproximadamente de 0,1 a 5%), cloruro cálcico (aproximadamente de 1 a 20 mM), antimicrobianos como omadina sódica (aproximadamente de 0,03 a 0,05%), ciprofloxacina (aproximadamente de 0,05 de 0,1 mg/ml) y/o ácido propiónico (aproximadamente de 20 a 200 mM) y un antagonista de heparina, para ajustar la sensibilidad a heparina del reactivo, como polibreno (aproximadamente de 1 a 50 \mug/ml).
El factor tisular recombinante preferido para uso en la presente formulación de reactivo es el factor tisular recombinante de conejo. El factor tisular recombinante de conejo se puede preparar usando técnicas de clonación bien conocidas. La clonación y secuenciación del factor tisular recombinante de conejo fue descrita por Andrews et al. en Gene, 98:265-269 (1991). Una genoteca de DNAc que contiene el DNA para obtener el gen del factor tisular de conejo está disponible comercialmente en Stratagene. El factor tisular recombinante de conejo de máxima preferencia actualmente para uso en los reactivos de la invención es una preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo, que se enriquece en el dominio de unión a lípidos, que se describe más adelante.
La presente invención se refiere además a una nueva preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo. El factor tisular recombinante de conejo de la presente invención se ha obtenido mediante ingeniería genética de tal forma que facilite la purificación mediante técnicas de afinidad. Usando este diseño de ingeniería genética, la secuencia de unión a lípidos de la proteína, que es importante para la actividad biológica, está intacta en la proteína purificada. Este diseño facilita el enriquecimiento de nuevo en lípidos de la proteína del factor tisular en un liposoma, o vesícula de fosfolípido, o una mezcla de fosfolípidos sintéticos definida.
La presente preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo comprende una secuencia aminoácida en la que se definen desde un extremo N-terminal hasta un extremo C-terminal: un dominio extracelular, un dominio de unión a lípidos, un dominio intracelular, y un marcador de afinidad para enriquecer selectivamente el producto purificado en el dominio de unión a lípidos. La preparación purificada resultante se enriquece en, es decir, tiene una concentración significativamente mayor de proteína de factor tisular recombinante que tiene el dominio de unión a lípidos, comparada con una preparación de proteína de factor tisular recombinante carente de marcador de afinidad. El marcador de afinidad es una secuencia aminoácida que tiene afinidad por una fase sólida seleccionada que se usa en la purificación de la proteína del factor tisular recombinante. El marcador de afinidad preferiblemente es una pluralidad de aminoácidos unidos consecutivamente, con la máxima preferencia histidina. En una realización preferida actualmente, el marcador de afinidad es un hexámero de histidina (His)_{6}.
La presente preparación purificada de proteína de factor tisular recombinante de conejo tiene características valiosas que la hacen especialmente adecuada para uso en los presentes reactivos PT. Por ejemplo, la conservación de la región de unión a lípidos de la proteína a través del método de purificación produce la preparación purificada resultante, que está enriquecida en el dominio de unión a lípidos, más susceptible del nuevo enriquecimiento en lípidos cuando la proteína se pone en contacto con fosfolípidos. La presente preparación de proteína se puede usar para producir un reactivo de tiempo de protrombina que tiene un valor ISI de aproximadamente 1,0, lo cual es deseable. Los reactivos que utilizan proteína de factor tisular de conejo son menos sensibles a las PIVKAs que los reactivos que contienen factores tisulares humanos o bovinos (Hemker, et al., Kinetic aspects of the interaction of blood clotting enzymes. III. Demonstration of an inhibitor of prothrombin conversion in vitamin K deficiency. Thromb Diath Haemorrh, (1968); 19:346-63 y Denson KWE, Thromboplastin-sensitivity, precision and other characteristics. Clin. Lab. Haematol. (1988); 18:315-28.
La presente preparación de proteína de factor tisular recombinante de conejo se puede obtener de células de levadura que se han transformado con un vector de transferencia que alberga el gen para el factor tisular de conejo, usando técnicas conocidas en el estado de la técnica. Según se mencionó anteriormente, la secuencia para el factor tisular de conejo es conocida (Andrews et al., Gene (1991) 98:265-269). Los sistemas de clonación de levaduras están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen. En la presente invención, las células de levadura transformadas que expresan la proteína se disgregan, y la proteína se purifica mediante el método siguiente:
Una cola de histidina que comprende una pluralidad de residuos de histidina ligados consecutivamente, se une covalentemente al extremo C-terminal de la proteína de factor tisular recombinante de conejo. Cuando el complejo proteína-histidina se aplica a una columna de quelato-metal, la porción de histidina de la proteína de unión se unirá a la columna (Hochuli et al., Biotechnology, pág. 1321, Nov. 1988). La columna de metal-quelato comprende una resina derivatizada con una función quelante (p.ej. EDTA) y que tiene un metal formando complejo con la función quelante. Los metales preferidos para este propósito incluyen cobre, zinc, cobalto y níquel. El níquel es actualmente el de mayor preferencia para este propósito.
La proteína marcada con histidina se puede preparar mediante el siguiente procedimiento preferido actualmente, en el que se añaden seis residuos de histidina al extremo C-terminal de la proteína del factor tisular recombinante de conejo. Sin embargo, se pueden preparar otras proteínas unidas a His; por ejemplo, se puede añadir cualquier número de residuos de histidina al extremo C-terminal de la proteína del factor tisular recombinante de conejo, a condición de que la proteína resultante marcada con His conserve su actividad biológica y se pueda retener sobre una columna de metal-quelato. Si se desea, la proteína unida a His se puede purificar de nuevo usando otras técnicas de purificación de proteínas conocidas en la técnica.
Se aísla un fragmento de DNA que contiene el gen del factor tisular de conejo de una genoteca de DNAc, mediante métodos conocidos en la técnica. El fragmento de DNA se digiere a continuación con endonucleasas de restricción para generar un fragmento de restricción que contiene un DNA que codifica factor tisular de conejo. El fragmento de restricción que codifica factor tisular se clona luego en un sitio policonector de un plásmido, lo que permite la expresión del DNA insertado situando el DNA insertado bajo el control de un promotor útil en vectores de expresión de levaduras. El plásmido que codifica el factor tisular de conejo se transforma luego en una cepa hospedadora de levadura apropiada, y se aísla un clon recombinante que contiene DNA que codifica factor tisular de conejo unido a His.
El clon que codifica el factor tisular de conejo se cultiva en condiciones que no permiten la sobreexpresión del gen del factor tisular de conejo, hasta que se alcanza una densidad óptica deseada del cultivo celular. El cultivo se induce a continuación para que produzca proteína de factor tisular de conejo unido a His, y las células se cultivan hasta que se recogen. A continuación, se centrifugan las células y, si se desea, los glóbulos se pueden congelar hasta que estén listos para el uso. El factor tisular de conejo se purifica del glóbulo de células como sigue. El glóbulo de células se descongela (si estaba previamente congelado) y se vuelve a poner en suspensión en tampón de lisis. Las células se disgregan y los desechos celulares se eliminan mediante centrifugación a alta velocidad. El sobrenadante se aplica a una columna de metal-quelato preequilibrada, como níquel, cobalto, cobre o zinc, luego se clarifica y neutraliza para que esté listo para el uso.
El factor tisular de conejo (RTF) es una glicoproteína de 260 residuos aminoácidos. No se conocen los detalles específicos de la unión y activación de FVII por RTF. Sin embargo, basándose en la actividad específica comparable conocida y la homología de secuencia entre RTF y HTF, es científicamente razonable esperar que las regiones en RTF similares a aquellas en HTF son igualmente importantes y realizan funciones equivalentes:
Unión:
Aminoácidos 43 a 80
Aminoácidos 127 a 166
Aminoácidos 184 a 207 (segundo bucle de Cys)
Aminoácidos 218 a 239 (región de unión a lípidos o transmembranar) (indispensable)
Los aminoácidos 155 a 165, y 184 a 207 (2º bucle Cys) comparten funciones de unión y activación, y se localizan centralmente dentro del dominio extracelular de la glicoproteína. La degradación del factor tisular recombinante puede ocurrir durante la expresión in vitro de la proteína, debida a la actividad proteolítica. Estos subproductos degradados carecerían probablemente de regiones aminoácidas, bien desde el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína. Basándose en el conocimiento actual de la relación estructura/función del factor tisular, el siguiente análisis indica el efecto que tendrían las regiones que faltan de los aminoácidos, sobre la actividad funcional del factor tisular.
A.
Si la degradación se produce desde la zona N-terminal de la proteína, el efecto implicaría probablemente las regiones de unión, posiblemente reduciendo la afinidad de unión para FVII. La consecuencia de esta degradación sería atenuar la actividad global del factor tisular.
B.
Si la degradación se produce desde la zona C-terminal de la proteína, presumiblemente no implicaría las propiedades de unión, sino parte o toda la región transmembranar (aminoácidos 218 a 239), esencial para la activación de FVII, haciendo esos productos degradados todavía reactivos a FVIIa, pero no reactivos a FVII. El resultado global sería una mezcla con productos que compiten igualmente para moléculas de FVII, e igualmente reactivos frente a FVIIa, pero con diferente reactividad frente al FVII. Las consecuencias serían una mayor sensibilidad al FVIIa que a FVII, dependiendo de la proporción degradada frente a productos integrales.
Ambos casos anteriores deberían comportarse de forma diferente en muestras que, debido a diferentes circunstancias, presentan una variación con el tiempo de la proporción FVII/FVIIa:
\bullet
Si el factor tisular del caso (B) se usara para ensayar esas muestras en diferentes momentos, sus resultados serían diferentes.
\bullet
Si el factor tisular del caso (A) se usara para ensayar esas muestras en diferentes momentos, los resultados no resultarían afectados por la variación de proporción.
Para solventar el problema descrito anteriormente, se unió una secuencia que codificaba para una cola de seis histidinas ((His_{6})) al extremo 3' de la secuencia de RTF recombinante (equivalente al extremo C-terminal en la proteína). Este diseño logra lo siguiente:
(a)
facilita la purificación, usando cromatografía de afinidad de metales; y
(b)
maximiza la eliminación de productos degradados en su extremo C-terminal (caso B), ya que éstos carecen de la cola de (His)_{6}, y probablemente no se purificarían con los productos integrales.
La unión de la cola (His)_{6} sobre el extremo 3' de la proteína del factor tisular de conejo para purificación, minimiza la aparición de este problema específico. Expuesto de otra forma, el método de purificación usado para obtener la presente preparación purificada de proteína de factor tisular recombinante de conejo conserva la presencia del dominio de unión a lípidos en el producto purificado, produciendo una proteína de factor tisular de conejo que, teóricamente, debería ser menos sensible a cambios en la proporción de Factor VII a Factor VIIa.
Una vez obtenida la proteína de factor tisular recombinante, el reactivo PT se forma "volviendo a enriquecer en lípidos" la proteína, para formar un complejo de la proteína y fosfolípidos asociados, que mimetiza el complejo natural TF-fosfolípido. Los fosfolípidos usados en el método pueden ser naturales o sintéticos.
La invención se refiere asimismo a un método nuevo y único de nuevo enriquecimiento en lípidos. En el protocolo de purificación para la proteína de factor tisular recombinante, la proteína recombinante se extrae en una solución tensioactiva (véase Ejemplo 2). En métodos de la técnica anterior, la proteína de membrana se añade a fosfolípidos disueltos en tensioactivos, lo cual produce una solución isotrópica de fosfolípido-proteína-tensioactivo mezclados. Después, el tensioactivo se tiene que eliminar mediante métodos como diálisis, filtración tangencial, dilución o adsorción. (Moller, J.V. et al., Prog. Protein-Lipid Interact., (1986), 2 :147-196). En el estado de la técnica, los protocolos de enriquecimiento en lípidos para proteínas transmembranares requieren procedimientos complejos para la eliminación de tensioactivos. En el presente procedimiento de enriquecimiento en lípidos, la proteína recombinante disuelta con tensioactivo se combina con la mezcla de fosfolípidos, que está exenta de tensioactivo. Inesperadamente, hemos descubierto que la eliminación del tensioactivo tras mezclar la proteína de factor tisular disuelta en tensioactivos, con fosfolípidos, no es necesaria para obtener una preparación de factor tisular totalmente activa y estable.
En el método de nuevo enriquecimiento en lípidos de la invención, se combina una solución que contiene el factor tisular recombinante con una mezcla de fosfolípidos sintéticos definida. La mezcla de fosfolípidos sintéticos comprende preferiblemente 1,2-dioleoíl-sn-glicerol-3-fosfocolina (fosfatidilcolina) y 1,2-dioleoíl-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina] (fosfatidilserina), en una proporción molar preferida, para producir el tiempo de protrombina deseado. El método comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución, suspensión o dispersión acuosa, que contiene vesículas de fosfolípido o liposomas de los fosfolípidos sintéticos deseados; (b) mezclar proteína de factor tisular disuelta en tensioactivo, con dicha solución, suspensión o dispersión; y (c) incubar la mezcla producida en la etapa (b), en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicha proteína se asocie con dichas vesículas de fosfolípido. El método comprende además las etapas adicionales de mezclar la solución obtenida tras la etapa (c) con un tampón que contenga iones calcio. La formulación resultante puede ser un reactivo en un vial único, que puede ser líquido o liofilizado. Esta estrategia de formulación mejora la constancia entre lotes del reactivo. La sensibilidad a heparina, u otros anticoagulantes, se puede ajustar mediante la adición de un antagonista de heparina, como polibreno.
Los reactivos de la presente invención tienen muchas aplicaciones, incluyendo la medición del tiempo de protrombina, determinación de las concentraciones de fibrinógeno, control de pacientes sometidos a terapia con anticoagulantes orales, y determinación de las concentraciones de factor. El reactivo activa la vía extrínseca de coagulación, que detecta la actividad de los Factores II, V, VII y X. El porcentaje de actividad total de un factor o factores puede sugerir manifestaciones clínicas en esta vía. El reactivo se puede usar asimismo para el control clínico de pacientes sometidos a terapia con anticoagulantes orales, p.ej., cumadina (también conocida como warfarina). La cumadina es un antagonista de vitamina K que, cuando se administra, puede interferir con la capacidad del hígado para carboxilar los residuos glutamilo de los factores II, VII, IX, X, Proteína C y Proteína S, dependientes de vitamina K. Las formas no carboxiladas de los factores II, VII, IX y X, carecen de las modificaciones postraducción correctas y, por tanto, son menos funcionales, originando la prolongación de la formación de coágulos. Estos productos proteicos se denominan típicamente PIVKAs (proteína inducida por ausencia de vitamina K o antagonista). Véanse, Hemker y Jie, Capítulo 5, "Proteins induced by vitamin K absence (PIVKA's): effect of coumarins on circulating clotting factors", Oral anticoagulants, editores Poller y J. Hirsh, Arnold (1996).
El presente factor tisular recombinante de conejo se puede usar también para desarrollar cualquier modificación del tiempo de protrombina (PT). Ejemplos de tales ensayos modificados para los que se pueden usar los reactivos de la invención incluyen los siguientes:
1) Ensayo de consumo de protrombina
Un ensayo de escrutinio generalizado para la detección de deficiencias en los factores V, VII, IX, XI o XII, descrito por Palkuti HS: en "Laboratory of anticoagulant therapy". J. Med. Tech., (1985), 2:81-86; y Owen CA Jr., Thompson JH Jr. en "Soybean phosphatides in prothrombin-consumption and thromboplastin-generation tests: their use in recognizing thrombastenic hemophilia". Am. Clin. Patho., (1960), 33:197-208. Biggs, R., Douglas AS. "The thromboplastin generation test" J. Clin. Pathol. (1953), 6:23-29.
2) Ensayo de proconvertina y protrombina
Un ensayo de escrutinio que refleja el efecto de la terapia anticoagulante sobre los Factores II, VII, IX y X, descrito por Owren PA, A como K. en "The control of dicumarol therapy and the quantitative determination of prothrombin and proconvertin" Scand. J. Clin. Lab. Invest., 3 :201-208 ; y Ware AG, Stragnell R. "An improved on-stage prothrombin method" Am. J. Clin. Pathol., (1952), 22:791-797.
3) Ensayo de inhibición de tromboplastina tisular
Un ensayo de escrutinio que detecta inhibidores de tipo Lupus, incrementando la capacidad de estos inhibidores para interferir con la unión del complejo protrombinasa.
Ref.: Brandt JT, Triplett DA. "The effect of phospholipid on the detection of lupus anticoagulant by the dilute Russell viper venom time" Arch. Pathol. Lab. Med., 1989, 113:1376-1378.
Los presentes reactivos PT basados en factor tisular recombinante de conejo tienen menos sensibilidad a PIVKAs y, por tanto, son útiles para controlar a pacientes sometidos a terapia de anticoagulación oral y a aquellos con insuficiencia hepática (Denson, K.W.E. et al., "The characterisation of recombinant rabbit tissue factor (rRTF) and the PIVKA inhibitor", presentado para publicación). Los reactivos disponibles actualmente , basados en tromboplastina humana pueden no ser útiles para usarlos con estos pacientes, debido a su sensibilidad a PIVKAs. Una diferencia entre los reactivos previos y los reactivos de la presente invención, se puede reflejar en los valores de INR (proporciones normalizadas internacionales), en los que los reactivos basados en tromboplastinas humanas muestran desviaciones en los testigos de warfarina y en los pacientes hepáticos (Kovacs, M.J. et al., "Assessment of the validity of the INR system for patients with liver imparment" Thromb. Haemost. 71:727-730 (1994)). Una ventaja del presente reactivo PT recombinante basado en conejo es la reducción de tales desviaciones INR, lo que permite la aplicación de este reactivo, tanto en el control de la terapia con anticoagulantes orales como en pacientes con insuficiencia hepática. Por tanto, el sistema INR se podría usar en plasma de pacientes sometidos a terapia con anticoagulantes orales, o que tengan cualquier tipo de insuficiencia hepática, sin ninguna interferencia de las PIVKAs en el plasma del paciente.
El tiempo de protrombina y las concentraciones de fibrinógeno se pueden determinar usando los reactivos de la presente invención con analizadores de coagulación clínicos disponibles actualmente (como el ACL® o ACL Futura®, disponibles de Instrumentation Laboratory, Lexington, MA), según protocolos típicos.
En un protocolo típico, 100 \mul del reactivo PT y 50 \mul de plasma se calientan hasta una temperatura de 37ºC. A continuación, las muestras de reactivo y plasma se mezclan, lo cual desencadena la reacción de coagulación. La formación del coágulo se detecta mediante un detector, p.ej. mediante un cambio en densidad óptica, o mediante un cambio en la viscosidad de la muestra. La cantidad de tiempo requerida para que se forme un coágulo es el tiempo de protrombina. Este procedimiento típicamente está totalmente automatizado, pero se puede realizar manualmente. En el procedimiento automatizado, el médico meramente carga el reactivo y la muestra de plasma en el analizador de coagulación automatizado, que realiza las etapas de calentamiento, mezcladura y detección. En estos protocolos, las concentraciones de fibrinógeno se pueden determinar mediante las siguientes etapas. La trombina (factor IIa) generada al final de la cascada extrínseca, convierte el fibrinógeno en fibrina en la muestra de plasma del paciente. Las moléculas de fibrina se agregan entre sí para formar un coágulo. El cambio en la absorbancia o dispersión de la luz es directamente proporcional a la cantidad de fibrinógeno presente en la muestra, y se puede determinar usando un algoritmo apropiado (véase Figura 1).
Los reactivos de la invención se pueden usar en lugar de los reactivos PT usados actualmente en la mayoría de los instrumentos clínicos para ensayos de PT automatizados y semiautomatizados, así como en métodos manuales. La mayoría de los reactivos de tiempo de protrombina que están disponibles actualmente en el mercado se basan en factor tisular de conejo sin tratar, y tienen mayor variabilidad entre lotes que los presentes reactivos. Usando los presentes reactivos, se puede lograr la sensibilidad deseada para la terapia con anticoagulantes orales (ISI \approx 1,0), manteniendo simultáneamente la sensibilidad del factor, similar a la de los reactivos basados en conejo sin tratar usados actualmente. Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar aspectos de realizaciones específicas de la presente invención, y no se pretenden ser limitativos en modo alguno.
Ejemplos Ejemplo 1 Formulación de reactivo PT recombinante-protocolo general
El siguiente protocolo describe la preparación de un reactivo PT, en el que el factor tisular recombinante de conejo se vuelve a enriquecer en lípidos formando una composición de liposoma definida, con una proporción óptima de factor a liposoma. Tras el enriquecimiento en lípidos, el complejo proteína-fosfolípido se añade a un tampón de formulación que contiene calcio, polibreno (antagonistas de heparina), y estabilizadores. La formulación se ajusta para alcanzar un tiempo PT de aproximadamente 10-13 segundos para el testigo normal, mediante la adición de la proteína enriquecida en lípido.
Preparación de suspensión de liposomas y nuevo enriquecimiento en lípidos del factor tisular
Se filtra una mezcla de fosfolípidos sintéticos de 0,5 a 10 mM de composición definida (fosfatidilserina/fosfatidil-
colina, 15:85 a 30:70 M/M), a través de un filtro de fluoruro de polivinilideno hidrófilo. La preparación de proteína de reserva que contiene factor tisular recombinante de conejo en tampón que contiene tensioactivo no iónico al 0,1%, preparada según se describió en el Ejemplo 2, se diluye de 1:10 hasta 1:1500 en el filtrado. La proporción de proteína a fosfolípidos se puede optimizar para lograr el tiempo de protrombina deseado. La proteína de factor tisular se incuba con la suspensión liposómica a 37ºC, durante un mínimo de 30 minutos, para asegurar la asociación de la proteína con las vesículas liposómicas. Tras la etapa de incubación, la proteína/fosfolípido, se formula de tal forma que se logren las propiedades deseadas del reactivo. La proteína/fosfolípido se añade a un tampón de formulación, según se describió anteriormente, en un intervalo de dilución de 10 a 80 veces.
Preparación de una formulación líquida
Se prepara un formulación tampón, preferiblemente Hepes de 50 a 100 mM, que contiene NaCl (150 mM), glicina (al 1%), albúmina de suero bovino (al 0,3%), polietilenglicol (al 2%), cloruro cálcico (10 mM), antimicrobianos como omadina sódica (al 0,05%), ciprofloxacina (0,05 mg/ml) y/o ácido propiónico (20 mM), y un antagonista de heparina como polibreno (5 \mug/ml), para ajustar la sensibilidad a heparina del reactivo. A esta formulación tampón, que se filtra a través de un filtro de 0,2 \mu, se añade la mezcla de proteína-fosfolípido. La formulación líquida se incuba luego a 37ºC durante un tiempo especificado. Para alcanzar el tiempo de protrombina deseado, es decir, un tiempo de PT normal de 10-13 segundos, la cantidad de mezcla proteína-fosfolípido se puede incrementar si es necesario. La formulación se puede optimizar para alcanzar la sensibilidad deseada a factores, e ISI (ISI \approx 1,0), ajustando los excipientes en la formulación.
La Tabla I muestra la reproducibilidad entre lotes de tres lotes de formulación de reactivo líquido preparado según el método descrito anteriormente, usando los intervalos preferidos. El PT se obtiene añadiendo 100 \mul de reactivo (reactivo PT de conejo recombinante) a 50 \mul de plasma del paciente, e iniciando la activación de la vía extrínseca, lo cual produce en última instancia la conversión de fibrinógeno en fibrina, con la formación de un gel sólido. Los tiempos PT se determinaron usando un analizador de coagulación clínico ACL® 300 (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA), según los protocolos recomendados por el fabricante. Los resultados obtenidos demuestran la constancia de los lotes de reactivos con respecto a las determinaciones de ISI y del tiempo de protrombina, que son una consideración clínica importante.
TABLA I Reproducibilidad entre lotes-reactivo líquido
Nº de lote ISI Promedio normal Plasma testigo Plasma testigo
de reactivo (tiempo de protrombina) normal anormal
1 1,00 12,5 11,8 22,9
2 0,9801 12,65 12,4 23,7
3 1,0047 12,62 11,8 22,4
Preparación de una formulación liofilizada
Se prepara un formulación tampón, preferiblemente Hepes de 50 a 100 mM, que contiene NaCl (50 mM), glicina (al 5%), albúmina de suero bovino (al 0,3%), dextrano (al 5%), cloruro cálcico (10 mM), antimicrobianos como omadina sódica (al 0,05%), ciprofloxacina (0,05 mg/ml) y un antagonista de heparina para ajustar la sensibilidad a heparina del reactivo, como polibreno (5 \mug/ml). A esta formulación tampón, que se filtra a través de un filtro de 0,2 \mu, se añade la mezcla de proteína-fosfolípido. La formulación se incuba luego a 37ºC durante un tiempo especificado y luego se liofiliza. Para alcanzar el tiempo de protrombina deseado, es decir, un tiempo PT normal de 10-13 segundos, la cantidad de mezcla proteína-fosfolípido se puede incrementar si es necesario. La formulación se puede optimizar para alcanzar la sensibilidad deseada a factores, e ISI (ISI \approx 1,0), ajustando los excipientes en la formulación.
La Tabla II muestra la reproducibilidad entre lotes de tres lotes de formulación de reactivo liofilizado preparado según el método descrito anteriormente, usando los intervalos preferidos. El reactivo liofilizado se reconstituyó en agua, y se determinó el PT (tiempo de protrombina). El PT se obtiene añadiendo 100 \mul de reactivo (reactivo PT de conejo recombinante) a 50 \mul de plasma del paciente, e iniciando la activación de la vía extrínseca, lo cual produce en última instancia la conversión de fibrinógeno en fibrina, con la formación de un gel sólido. Los tiempos PT se determinaron usando un instrumento ACL® 300, según se describió anteriormente. Estos resultados demuestran la constancia de los lotes de reactivos con respecto a ISI y a la determinación promedio normal, que es una consideración clínica importante.
TABLA II Reproducibilidad entre lotes-reactivo liofilizado
Nº de lote ISI Promedio normal Plasma testigo Plasma testigo
de reactivo (tiempo de protrombina) normal anormal
1 1,0396 11,17 10,6 22,4
2 1,0497 11,20 11,2 23,8
3 1,0722 11,34 10,7 22,3
El reactivo PT de conejo recombinante se puede usar también para determinar las concentraciones de fibrinógeno, lo cual proporciona un valor diagnóstico adicional a los resultados de PT. La Tabla III muestra un ejemplo de los resultados de una curva patrón de PT y fibrinógeno, usando un analizador de coagulación clínica automatizado (ACL Futura®). Los valores de PT y fibrinógeno se obtienen añadiendo 100 \mul de reactivo (reactivo PT de conejo recombinante) a 50 \mul de plasma, e iniciando la activación de la vía extrínseca, según se describió anteriormente. Un plasma patrón, con un valor de fibrinógeno asignado, se diluye para generar la curva patrón. El PT y la concentración fibrinógeno de la muestra de plasma se pueden determinar simultáneamente mediante una medición trombocinética, relacionando la absorbancia o dispersión de luz durante la coagulación. La Figura I muestra los valores de fibrinógeno (mg/dl) de muestras de plasma, determinados usando el reactivo PT de conejo recombinante, comparados con una tromboplastina de conejo convencional (correlación = 0,998). La tromboplastina convencional era IL Test® PT-fib H5 Plus (P/N 84698-10) (disponible de Instrumentation Laboratory, Lexington, MA).
TABLA III PT y curva patrón de fibrinógeno basada en PT, usando reactivo PT de conejo recombinante con un analizador de coagulación clínica automatizado
% de plasma patrón segundos de PT fibrinógeno absorbancia delta
100 11,7 262,0 816,7
50 19,6 131,0 433,7
25 38,8 65,5 195,0
coeficiente de correlación (r) 0,998 0,996
Ejemplo 2 Producción de factor tisular recombinante de conejo de levadura
Se produce factor tisular recombinante de conejo (rRTF) en células de Pichia pastoris, obtenidas según el siguiente protocolo general:
Se aisló un fragmento de DNA que albergaba el gen RTF completo, de una genoteca comercial de DNAc de corazón de conejo en \lambdaZapII, adquirida de Stratagene (nº de catálogo 936902).
Una secuencia que codificaba la cola de (His)_{6} se añadió al extremo 3' de la secuencia traducida del gen RTF, y se transformó mediante ingeniería genética para hacerla compatible con el vector de transferencia pHIL-S1 de Pichia pastoris (obtenido de Invitrogen), y se insertó en él para que estuviera en fase con la secuencia señal PHO1, y bajo la dirección del promotor AOX1.
Otras secuencias de interés incluidas en este plásmido son:
El marco de lectura abierto de HIS4 como marcador de rescate
El gen de resistencia a ampicilina
Las regiones que flanquean los extremos 5' y 3' del gen AOX1, para facilitar la recombinación.
Células GS115 de Pichia pastoris de tipo silvestre (obtenidas de Invitrogen), se transformaron con el vector de transferencia de P. pastoris recombinante mencionado anteriormente, que llevaba el gen RTF. Después de la recombinación, se seleccionó uno de los clones aislados productor de RTF, basándose en su mayor expresión de RTF activo, y su producción se incrementó optimizando las condiciones de fermentación.
Las células de levadura recombinantes que contenían rRTF se disgregaron, y la proteína se extrajo en tampón que contenía tensioactivo no iónico. El tampón preferido es PIPES 50 mM, NaCl 500 mM, Emulphogen® al 0,76%, pH 7,8, pero se puede sustituir por otros tampones y tensioactivos no iónicos, como Triton® o NP-40®.
El homogenado bruto resultante se aclaró y se preparó para cromatografía ajustando la solución hasta pH 7, diluyendo la mezcla de pH ajustado con tampón, seguido de centrifugación a alta velocidad. El rRTF se aisló del homogenado clarificado mediante cromatografía de afinidad de quelato metálico.
Después de la elusión desde la columna, el rRTF se enriqueció nuevamente mediante una precipitación a pH 4, a 24ºC, y se aclaró mediante centrifugación a alta velocidad. Finalmente, la solución de proteína se ajustó hasta pH neutro. La solución final que contenía rRTF estaba compuesta por 100 a 500 \mug de proteína en el tampón preferido de Tris-Acetato 50 mM, NaCl 500 mM, Emulphogen® al 0,1%, pH 7,1. Se pueden usar otras composiciones de tampón que contienen otros tensioactivos no iónicos, como se mencionó anteriormente. El producto se congeló a –70ºC para almacenamiento hasta su uso. Excepto por la incubación a 24ºC, todas las etapas de fabricación se realizaron a 4ºC.

Claims (27)

1. Un método para preparar un reactivo líquido o liofilizado para determinar el tiempo de protrombina o las concentraciones de fibrógeno en una muestra de plasma, que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una solución, suspensión o dispersión que contiene una vesícula de fosfolípido, estando dicha solución, suspensión o dispersión exenta de tensioactivo;
(b) mezclar proteína de factor tisular disuelta en tensioactivo con dicha solución, suspensión o dispersión; e
(c) incubar la mezcla producida en la etapa (b) en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicha proteína de factor tisular disuelta en tensioactivo se asocie con dicha vesícula de fosfolípido, para producir un reactivo capaz de inducir la coagulación en la muestra de plasma sin eliminación del tensioactivo.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de factor tisular aislada de la etapa (b) es una proteína de factor tisular recombinante de conejo.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de mezclar la solución que contiene la vesícula de fosfolípido que contiene la proteína de la etapa (c) con un tampón de formulación.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la proteína de factor tisular aislada de la etapa (b) es una proteína de factor tisular recombinante de conejo.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la vesícula de fosfolípido que contiene proteína, contiene desde aproximadamente 0,05 \mug hasta aproximadamente 30 \mug de factor tisular que contiene proteína aislada por mg de fosfolípido.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la vesícula de fosfolípido que contiene proteína, contiene desde aproximadamente 0,2 \mug hasta aproximadamente 20 \mug de factor tisular que contiene proteína aislada, por mg de fosfolípido.
7. El método de la reivindicación 3, en el que el tampón de formulación comprende iones calcio en una cantidad necesaria para la coagulación de la muestra de plasma.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el tampón de formulación comprende además una fuerza iónica necesaria para la coagulación de la muestra de plasma.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el tampón de formulación comprende además tampón Hepes.
10. Una preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo, comprendiendo dicha preparación:
factor tisular recombinante de conejo, que comprende:
una secuencia aminoácida que define, desde el extremo N-terminal al C-terminal:
(a) un dominio extracelular,
(b) un dominio de unión a lípidos,
(c) un dominio intracelular, y
(d) un marcador de afinidad para usarlo en el enriquecimiento selectivo de dicho factor tisular recombinante de conejo,
en la que la preparación purificada se enriquece en la proteína de factor tisular recombinante de conejo que tiene el dominio de unión a lípidos, respecto a un factor tisular recombinante de conejo sin el marcador de afinidad.
11. La preparación purificada de la reivindicación 10, en la que el marcador de afinidad comprende una pluralidad de aminoácidos de histidina conectados consecutivamente.
12. La preparación purificada de la reivindicación 11, en la que el marcador de afinidad comprende una secuencia (His)_{6}.
13. La preparación purificada de la reivindicación 10, en la que el factor tisular recombinante de conejo reacciona con el factor VII y el factor VIIa.
\newpage
14. La preparación purificada de la reivindicación 10, en la que el factor tisular recombinante de conejo se puede usar para producir un reactivo de tiempo de protrombina que tiene un valor ISI de aproximadamente 1,0.
15. La preparación purificada de la reivindicación 10, en la que el factor tisular recombinante de conejo es menos sensible a PIVKAs en una muestra de plasma respecto al factor tisular humano o bovino.
16. Un reactivo líquido o liofilizado para determinar el tiempo de protrombina o las concentraciones de fibrinógeno en una muestra de plasma, estando constituido dicho reactivo esencialmente por:
(a) una proteína de factor tisular recombinante de conejo disuelta en tensioactivo;
(b) un fosfolípido seleccionado del grupo formado por fosfatidil-colina, fosfatidil-serina y una de sus combinaciones; y
(c) un sistema tampón en el que dicho reactivo comprende además tensioactivo asociado con el componente (a).
17. El reactivo de la reivindicación 16, en el que la proteína de factor tisular comprende una preparación purificada de factor tisular recombinante de conejo que comprende:
una secuencia aminoácida que define, desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal,
(a) un dominio extracelular,
(b) un dominio de unión a lípidos,
(c) un dominio intracelular, y
(d) un marcador de afinidad para usarlo en el enriquecimiento selectivo de dicho factor tisular recombinante de conejo,
en el que la preparación purificada se enriquece en el factor tisular recombinante de conejo que tiene el dominio de unión a lípidos, respecto a un factor tisular recombinante de conejo sin el marcador de afinidad.
18. El reactivo de la reivindicación 16 o 17, en el que la proporción de proteína a lípido es desde aproximadamente 0,05 \mug de proteína/mg de fosfolípido, hasta aproximadamente 30 \mug de proteína/mg de fosfolípido.
19. El reactivo de la reivindicación 18, en el que la proporción de proteína a lípido es desde aproximadamente 0,2 \mug de proteína/mg de fosfolípido hasta aproximadamente 20 \mug de proteína/mg de fosfolípido.
20. El reactivo de la reivindicación 16 o 17, en el que el fosfolípido contiene una mezcla de fosfatidilserina y fosfatidilcolina, en una proporción desde aproximadamente 5:95 hasta aproximadamente 95:5.
21. El reactivo de la reivindicación 16 o 17, en el que el fosfolípido contiene una mezcla de fosfatidilserina y fosfatidilcolina, en una proporción desde aproximadamente 15:85 hasta aproximadamente 60:40.
22. El reactivo de la reivindicación 16 o 17, en el que el fosfolípido contiene una mezcla de fosfatidilserina y fosfatidilcolina, en una proporción desde aproximadamente 20:80 hasta aproximadamente 30:70.
23. El reactivo de la reivindicación 16 o 17, en el que el sistema tampón contiene iones calcio en una cantidad suficiente para la coagulación de la muestra de plasma.
24. El reactivo de la reivindicación 16, 17 o 23, en el que el sistema tampón tiene una fuerza iónica suficiente para soportar la coagulación en la muestra de plasma.
25. El reactivo de la reivindicación 16, 17 o 23, en el que el sistema tampón contiene Hepes.
26. El reactivo de la reivindicación 24, en el que el sistema tampón contiene Hepes.
27. Un método para medir la cantidad de fibrinógeno en una muestra de plasma, que comprende la etapa de usar el reactivo de la reivindicación 16 o 26.
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