ES2255168T3 - Metodo de dosificado de l-fenilalanina y detector de l-fenilalanina. - Google Patents
Metodo de dosificado de l-fenilalanina y detector de l-fenilalanina.Info
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Abstract
Un método para determinar L-fenilalanina, caracterizado porque se añade una muestra a un sensor de L- fenilalanina compuesto de un sistema de electrodos que comprende, como mínimo, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo integrados en un soporte aislante, y una capa de reacción de reactivos que contiene, como reactivos de reacción, al menos L-fenilalanina deshidrogenasa, NAD+ o NADP+ como coenzima, y un mediador de electrones, y está integrada con dicho sistema de electrodos; en donde dicha capa de reactivos consta de un soporte absorbente para la introducción de una cantidad concreta de una muestra dentro de la capa de reactivos, y después se cuantifica electroquímicamente la L-fenilalanina.
Description
Método de dosificado de
L-fenilalanina y detector de
L-fenilalanina.
Esta invención tiene que ver con un biosensor
mediante el que se puede cuantificar rápida y convenientemente, sin
hacer uso de ningún pretratamiento fastidioso, la concentración de
L-fenilalanina contenida en diversas muestras.
Hablando más concretamente, se refiere a un biosensor que es útil
para cuantificar la L-fenilalanina contenida en
muestras biológicas (sangre, orina, saliva, sudor, etc.), muestras
alimentarias y otras, mediante un método de medición electroquímico
con el empleo de L-fenilalanina deshidrogenasa, etc.
Este método es particularmente importante en el cribado neonatal de
masas para detectar fenilcetonuria (FCU), que es un error metabólico
de los aminoácidos, a edad temprana, u observando la vida diaria de
pacientes que padezcan esta enfermedad.
La L-fenilalanina es un
aminoácido importante, el cual es uno de los aminoácidos esenciales,
y contenido en un gran número de muestras biológicas así como en
alimentos y bebidas empleados como fuentes de
L-fenilalanina. Por otra parte, la enfermedad
conocida como FCU es uno de los errores metabólicos de los
aminoácidos, típicamente hereditario, en donde no se sintetiza
tirosina debido a la deficiencia en L-fenilalanina
deshidrogenasa y, de este modo, la L-fenilalanina
está combinada a un nivel anormalmente alto en la sangre. Cuando se
deja estar, la FCU induce discapacidad intelectual grave, alteración
del lenguaje, síntoma amelanótico, etc.
Para prevenir esta enfermedad, en Japón y en los
países extranjeros se ha llevado a cabo extensamente el cribado
neonatal de masas. Como ejemplo típico de los métodos para
determinar la concentración de L-fenilalanina en la
sangre, se ha empleado el método de Guthrie con el uso de la mancha
de sangre seca, y ha contribuido en gran parte a su diagnosis
temprana.
Los pacientes con FCU, así descubiertos, deberían
tener una terapia dietética que restringiera su ingesta de
L-fenilalanina. Esto es, tales pacientes deberían
tener platos especialmente preparados con la eliminación o reducción
de L-fenilalanina, al menos hasta abarcar la mayor
parte, preferentemente desde el principio hasta el fin, de sus
vidas. Puesto que la L-fenilalanina es uno de los
aminoácidos esenciales para el cuerpo humano, se debería regular
estrictamente la concentración de L-fenilalanina
para que pueda ser tomada al nivel máximo sin inducir discapacidad
cerebral, etc., pero aun al nivel mínimo necesario para el
crecimiento del cuerpo. Al tratar la FCU, es esencial por lo tanto
observar no solamente el nivel de fenilalanina en la sangre sino
también la ingesta de fenilalanina en la dieta diaria.
De acuerdo con estas circunstancias, los ejemplos
de métodos para determinar la L-fenilalanina,
utilizando sangre como muestras, incluyen el método por
cromatografía líquida [Journal of Chromatography, Vol. 274, pág. 318
(1983)] y el método de bioensayo con el empleo de la mancha de
sangre seca, esto es, el método ampliamente conocido como el método
de Guthrie [Pediatrics, Vol. 32, pág. 338 (1963)]. En el primer
método es necesario someter las muestras a un tratamiento específico
y utilizar instrumentos de medición caros. Aunque el último método
se puede llevar a cabo con comodidad, tarda mucho tiempo para
completar la reacción y es necesario examinar los resultados a
simple vista. Es decir, cada uno de estos métodos adolece de algunos
problemas desde el punto de vista de comodidad o rapidez en la
cuantificación.
También se ha informado de métodos de
determinación con el uso de enzimas, por ejemplo, un método con el
empleo de L-fenilalanina amonia liasa [Methods of
Enzymatic Analysis, Vol. 8, pág. 405 (1985)], un método con el
empleo de L-fenilalanina oxidasa [Clinica Chimica
Acta, Vol. 136, pág. 131 (1984)], y un método con el uso de
L-fenilalanina deshidrogenasa [Publicación de
Patente Abierta Japonesa Nº 63-129996 (A)]. En estos
documentos, se indica la utilidad de estos métodos para la
cuantificación. En concreto, el método para determinar fenilalanina
en la sangre, con el empleo de L-fenilalanina
deshidrogenasa, es reportado detalladamente por Hummel y col.
[Analytical Biochemistry, Vol. 170, pág. 397 (1988)] y Wendel y col.
[Analytical Biochemistry, Vol. 180, pág. 91 (1989), Clinica Chimica
Acta, Vol. 192, pág. 165 (1990)]. En cada uno de estos métodos, la
sangre empleada como muestra es sometida a diversos pretratamientos,
y después se lleva a cabo una reacción enzimática. Además, no se
puede realizar la cuantificación a menos que se empleen instrumentos
de medida caros y relativamente a gran escala (un espectrofotómetro,
etc.).
En estos últimos años, se han desarrollado con
vigor los biosensores, en particular los sensores con el empleo de
enzimas. Por medio de todos ellos, ha llegado a ser posible
determinar, cómodamente y con suma exactitud, el nivel de glucosa en
sangre como se revela en EP 351891 y WO 86/07632. US 5.695.947
describe un sensor para el ensayo amperométrico de colesterol, para
la medición directa de colesterol libre y total en fluidos
biológicos tales como suero, plasma o sangre entera, y en
preparaciones alimenticias. Aunque recientemente se han hecho
intentos por Huang y col. para determinar la
L-fenilalanina [Analytical Chemistry, Vol. 70, pág.
991 (1998)], todavía existen algunos problemas a resolver para poner
el sensor en uso práctico.
En este método, se rellena un tubo (1'2 mm x 1'5
mm x 30 mm), que se suministra con un hilo metálico de cobre como
hilo conductor, con una pasta de carbono conteniendo
L-fenilalanina deshidrogenasa mezclada con otras dos
enzimas (esto es, salicilato hidroxilasa y tirosinasa). Después de
pulir la superficie del electrodo, se emplea como electrodo de
trabajo. Se conecta una unidad de detección, compuesta de este
electrodo de trabajo, un electrodo de referencia fabricado en
plata/cloruro de plata (Ag/ClAg), y un contraelectrodo fabricado en
platino, a un reactor para, de ese modo, fabricar una unidad de
determinación. La determinación se lleva a cabo mezclando un tampón,
una solución de ácido salicílico y nicotinamida adenina dinucleótido
oxidada (NAD^{+}) en el reactor, añadiendo una muestra, y
calculando la concentración de L-fenilalanina,
utilizando un ordenador, a partir de la corriente de respuesta
obtenida después de la reacción. De este modo, se puede cuantificar
la fenilalanina en un intervalo de concentración de 20 a 150 \muM,
y la sensibilidad de detección es 5 \muM. Sin embargo, todavía
quedan problemas por resolver en, por ejemplo, la estabilidad de la
respuesta y la estabilidad de almacenamiento del electrodo
enzimático así construido.
Aunque la tecnología de biosensores, como se
describió antes, está haciendo posible determinar la
L-fenilalanina utilizando
L-fenilalanina deshidrogenasa, todavía es imposible
una cuantificación rápida y cómoda puesto que en este método es
necesario preparar reactivos e instrumentos, y ejecutar
procedimientos y operaciones dificultosos. Aunque es conveniente
para los pacientes con FCU que la L-fenilalanina
pueda ser convenientemente determinada en casa a fin de controlar el
nivel de L-fenilalanina en sangre, y examinar los
alimentos y bebidas a preparar, aún es difícil en la fase
actual.
Bajo estas circunstancias, es un objeto de la
presente invención proporcionar un biosensor mediante el cual se
pueda cuantificar la L-fenilalanina, con suma
exactitud, rápida y convenientemente, sin recurrir al empleo de
muchos reactivos, dispositivos o instrumentos de medición a gran
escala, pretratamientos dificultosos o técnicas especiales, y un
método de determinación de la misma.
Para lograr el objeto anteriormente descrito, la
presente invención proporciona un sensor para
L-fenilalanina compuesto de un sistema de
electrodos, el cual consta de al menos un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo integrados en un soporte aislante, y una capa de
reacción de reactivos que contiene, como reactivos de reacción, al
menos L-fenilalanina deshidrogenasa, NAD^{+} o
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado (NADP^{+}) como
coenzima, y un mediador de electrones, y que está integrada en el
anterior sistema de electrodos, en donde dicha capa de reactivos
consta de un soporte absorbente para la introducción de una cantidad
concreta de una muestra dentro de la capa de reactivos, y un método
para determinar la L-fenilalanina mediante el cual
se pueda cuantificar electroquímicamente la
L-fenilalanina, añadiendo simplemente una muestra al
sensor descrito anteriormente, sin recurrir a ningún pretratamiento
dificultoso.
En el sensor de L-fenilalanina
según la presente invención, como capa de reacción de reactivos se
coloca un soporte absorbente conteniendo, como reactivos de
reacción, al menos L-fenilalanina deshidrogenasa,
NAD^{+} o NADP^{+}, y un mediador de electrones, entre los
electrodos de un sistema de electrodos que consta de al menos un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo suministrados opuestos
entre sí en un soporte aislante, e integrado con el sistema de
electrodos. Debido a esta estructura, se puede llevar a cabo la
reacción enzimática y la reacción electródica entre el mediador de
electrones y la superficie del electrodo y, además, el sensor puede
ser redimensionado. El empleo del soporte absorbente también hace
posible añadir una muestra de modo uniforme, en una cantidad
concreta.
El biosensor según la presente invención,
teniendo la estructura descrita arriba, hace posible cuantificar,
convenientemente y con suma exactitud, la
L-fenilalanina contenida en una muestra, sin
utilizar ningún instrumento especial caro o añadir a la muestra
reactivos tales como una enzima.
Según la presente invención, se añade una muestra
a un sensor de L-fenilalanina conforme a la
reivindicación 4, en donde están integrados juntos un electrodo y
una capa de reacción de reactivos. De este modo, la
L-fenilalanina contenida en la muestra es
introducida en la reacción enzimática mediante la
L-fenilalanina deshidrogenasa y NAD^{+} o
NADP^{+}. Por consiguiente, se forma fenilpiruvato y el
NAD(P)^{+} es reducido a NAD(P)H. En
asociación con eso, se reduce el mediador de electrones debido a la
transferencia de electrones del NAD(P)H. Después se
aplica un potencial y, de este modo, el mediador de electrones
reducido es oxidado como reacción electródica, provocando de ese
modo la generación de una corriente de oxidación. Así, la
L-fenilalanina puede ser cuantificada
electroquímicamente, con la orientación de la corriente de respuesta
correspondiente a la concentración del sustrato.
La presente invención proporciona además un
sensor de L-fenilalanina compuesto de un sistema de
electrodos, el cual consta de al menos un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo integrados en un soporte aislante, y una capa de
reacción de reactivos que contiene los reactivos de reacción y está
integrada en el sistema de electrodos descrito arriba. En este
sensor de L-fenilalanina, la capa de reacción de
reactivos consta de un soporte absorbente conteniendo al menos
L-fenilalanina deshidrogenasa, NAD^{+} o
NADP^{+}, y un mediador de electrones, y está ubicada en una parte
donde se produce la reacción electródica entre estos electrodos,
dando de ese modo una estructura integral.
El uso del soporte absorbente en la capa de
reacción de reactivos hace posible el proporcionar un método para
mantener convenientemente los reactivos de reacción, mientras se
logra una excelente estabilidad al almacenamiento de los reactivos y
una excelente estabilidad de respuesta sin someter a tratamiento el
sistema de electrodos y ni afectando a los mismos (por ejemplo,
empeorando la ejecución). Además, por esa razón se puede introducir
rápidamente una cantidad concreta de una muestra dentro de la capa
de reacción de reactivos. De este modo, se puede cuantificar la
L-fenilalanina con suma exactitud y
convenientemente, dentro de un corto periodo de tiempo.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de los
componentes de una forma de realización del sensor de
L-fenilalanina según la presente invención.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra los datos de
respuesta para el mediador de electrones en el Ejemplo 2.
La Fig. 3 es un gráfico que muestra los datos de
respuesta para L-fenilalanina (soluciones estándar)
en el Ejemplo 3.
La Fig. 4 es un modelo de reacción de la
determinación de L-fenilalanina.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra los datos de
respuesta para L-fenilalanina (muestras sanguíneas)
en el Ejemplo 4.
La Fig. 6 es una ilustración esquemática que
muestra la composición de una forma de realización del sensor
portátil de L-fenilalanina según la presente
invención.
La Fig. 7 es un gráfico que muestra la
correlación entre las concentraciones de
L-fenilalanina determinadas mediante el sensor
portátil de L-fenilalanina del Ejemplo 6 y las
concentraciones de L-fenilalanina determinadas
mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La Fig. 8 es un gráfico que muestra la
correlación entre las concentraciones de
L-fenilalanina determinadas mediante el sensor
portátil de L-fenilalanina del Ejemplo 7 y las
concentraciones de L-fenilalanina determinadas
utilizando un juego de cuantificación química clínica de aminoácidos
del tipo método enzimático.
En estos dibujos, cada símbolo tiene el
significado siguiente:
1: soporte aislante; 2: electrodo
de trabajo; 3: contraelectrodo; 4: capa aislante; 5: soporte
absorbente; 11: muestra; 12: sensor de
L-fenilalanina; 13: medidor portátil para el sensor
de L-fenilalanina; 14: interruptor; 15:
temporizador; 16: aplicador de potencial; 17: detector; 18: unidad
central de proceso; y 19: pantalla
luminosa.
El sistema de electrodos a utilizar en la
presente invención puede ser fabricado en un material conductivo
arbitrario, sin restricción particular. Como material, se puede
hacer uso de iridio, osmio, carbono, oro, plata, plata/cloruro de
plata, hierro, cobre, níquel, platino, negro de platino, paladio,
lutecio, rodio, etc., y aleaciones de estos metales. A consecuencia
de examinar diversos materiales, se sabe que los materiales de
carbono son favorables como electrodo de trabajo, en el sistema de
electrodos del sensor de L-fenilalanina según la
presente invención, puesto que son menos caros y estables
químicamente.
El término "materiales de carbono", como se
utiliza aquí, significa en general materiales que contienen carbono.
No están restringidos los materiales de carbono utilizables aquí. Es
decir, se pueden emplear aquellos comúnmente usados en los
denominados electrodos de carbono. Por ejemplo, se pueden fabricar
de fibra de carbono, negro de humo, pasta de carbono, carbono
vítreo, grafito y otros.
Utilizando tal material de carbono, los
electrodos son integrados en el soporte aislante mediante un método
convencional. Generalmente, el material de carbono es procesado en
una pasta, con el empleo de una resina aglutinante, etc. Después, se
somete la pasta a impresión con retícula y se seca mediante
calentamiento, formándose de ese modo los electrodos. También es
posible que se suministre un hilo de plomo para conectar la pieza
del electrodo a la unidad de determinación, mediante la impresión
con retícula, de manera tal que la pieza de plata y plomo entre en
contacto con la pieza de carbono del electrodo.
Los ejemplos de soporte aislante incluyen vidrio,
epoxi vítreo, productos cerámicos, plásticos y otros. Para eso se
puede utilizar un material arbitrario sin limitación concreta, con
tal que no se deteriore en la etapa de la impresión para formar la
pieza del electrodo, o en la etapa de la adición de la muestra. Por
ejemplo, son baratas las películas de plástico fabricadas de
poliéster, polietileno, tereftalato de polietileno, poliestireno,
polipropileno, etc. Teniendo además en consideración la adherencia a
una tinta conductiva y la procesabilidad, se ha descubierto que aquí
es favorable una película de poliéster.
El método de impresión no está limitado a
impresión con retícula, sino que también se pueden aplicar otros
métodos (impresión en huecograbado, impresión offset, impresión por
chorro de tinta, etc.).
La L-fenilalanina deshidrogenasa
a utilizar en la presente invención puede ser una arbitraria con tal
que está acompañada por NAD^{+} o NADP^{+} como coenzima. Es
decir, para ello se pueden utilizar enzimas con orígenes diversos, y
aquellas obtenidas de ahí mediante técnicas de recombinación
genética. Los ejemplos de las mismas incluyen enzimas producidas por
bacterias pertenecientes al género Actinomyces, microorganismos
pertenecientes al género Sporosarcina, bacterias pertenecientes al
género Bacillus, bacterias pertenecientes al género Brevibacterium,
y bacterias pertenecientes al género Rhodococcus. De entre todas, la
L-fenilalanina deshidrogenasa que se origina
en
Thermoactinomyces intermedius es poco afectada en la etapa de secado para formar la capa de reacción de reactivos debido a su naturaleza termófila, y es excelente en especificidad y reactividad para el sustrato. De este modo, se prefiere como enzima que constituye el sensor de L-fenilalanina en la presente invención.
Thermoactinomyces intermedius es poco afectada en la etapa de secado para formar la capa de reacción de reactivos debido a su naturaleza termófila, y es excelente en especificidad y reactividad para el sustrato. De este modo, se prefiere como enzima que constituye el sensor de L-fenilalanina en la presente invención.
En la presente invención no está particularmente
limitado el mediador de electrones a utilizar, con tal que sea una
sustancia que sea reducida electroquímicamente mediante NADH o NADPH
formados por la reacción enzimática, y oxidada en el electrodo. Por
ejemplo, para eso se puede hacer uso de quinonas, citocromos,
viológenos, fenazinas, fenoxazinas, fenotiazinas, ferricianuros,
ferredoxinas, ferroceno y derivados de los mismos. De entre todos,
las fenazinas son excelentes en estabilidad de la respuesta. En
particular, se ha descubierto que en la presente invención es
favorable el metilsulfato de
1-metoxi-5-fenazinio
(1-metoxi PMS) como mediador de electrones, puesto
que es excelente en estabilidad al almacenamiento en la capa de
reacción de reactivos, y en estabilidad de la respuesta en la
reacción electródica.
El término "capa de reacción de reactivos",
como se utiliza aquí, significa una capa que está en contacto con el
sistema de electrodos y sostiene los reactivos de reacción, y en la
que los reactivos reaccionan con la L-fenilalanina
en la muestra. Contiene al menos L-fenilalanina
deshidrogenasa, NAD^{+} o NADP^{+}, y un mediador de electrones.
A consecuencia de la reacción enzimática y la reacción electródica
entre el mediador de electrones y la superficie del electrodo, en
esta capa se puede medir electroquímicamente la corriente de
respuesta. Para formar esta capa de reacción de reactivos, se pueden
emplear varios métodos utilizados en la técnica.
Por ejemplo, se echa una solución de reactivos
sobre los electrodos y después se seca. Alternativamente, una
solución de reactivos es absorbida por un material poroso (una tela
de nylon no tejida, etc.), secada y puesta después en los
electrodos. Después de examinar diversos métodos, en la
determinación según la presente invención se despejó que era
preferible que la capa de reacción de reactivos tuviera una
estructura formada para proporcionar un soporte absorbente, la cual
se obtiene utilizando un material polímero, etc., echando los
reactivos por separado o una mezcla de los mismos en eso y secando,
o sumergiendo un material polímero, etc., en una solución de
reactivos y secando, en una pieza donde ocurra la reacción
electródica entre al menos el electrodo de trabajo y el
contraelectrodo, en el sistema de electrodos.
Utilizando la capa de reacción de reactivos que
consta del soporte absorbente, se puede añadir rápidamente una
cantidad concreta de una muestra sin recurrir al empleo de ningún
instrumento especial en la etapa de añadir la muestra, debido a la
absortividad del soporte absorbente. Además, el sensor de
L-fenilalanina puede ser convenientemente fabricado
de ese modo, sin procesar directamente la pieza de reacción del
electrodo.
El soporte absorbente puede ser fabricado de un
material arbitrario, con tal que tenga naturaleza hidrófila y pueda
absorber una solución. Por ejemplo, se puede hacer uso de fibras
(fibra de vidrio, fibra de sílice, fibra de celulosa, etc.),
carboximetilcelulosa, dietilaminoetilcelulosa, acetato de celulosa,
éster mixto de celulosa, tela de nylon no tejida, nitrocelulosa,
poliéter sulfona, tela de poliéster no tejida,
politetrafluoroetileno (PTFE), polipropileno, etc. De entre todas,
se sabe que la fibra de celulosa es favorable como soporte
absorbente en el sensor de L-fenilalanina según la
presente invención. Esto es porque cuando se añaden una enzima,
NAD^{+} o NADP^{+}, y un mediador de electrones a la fibra de
celulosa, estas sustancias pueden permanecer estables sin sufrir
ningún deterioro en la función, y no son afectadas
inconvenientemente en la etapa de detección, asegurando de ese modo
una cuantificación sumamente
exacta.
exacta.
Ahora, la presente invención será ilustrada con
más detalle, aludiendo a los Ejemplos siguientes. Sin embargo, se
comprende que la invención no está construida para estar limitada a
ellos.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de los
componentes de una forma de realización del sensor de
L-fenilalanina según la presente invención.
En un soporte aislante 1, fabricado de una
película de poliéster (fabricada por Diafoil Hoechst), fueron
integrados un electrodo de trabajo 2 y un contraelectrodo 3 mediante
el método de impresión con retícula, respectivamente, con el empleo
de una tinta de grafito conductiva (fabricada por Acheson), y una
tinta conductiva de plata/cloruro de plata (fabricada por Acheson),
y desecadas mediante calentamiento (60ºC, 1 hora). Posteriormente,
se formó una capa aislante 4 como parte de cada electrodo mediante
el método de impresión con retícula, con el empleo de una tinta
aislante (fabricada por Acheson) y secada mediante calentamiento
(60ºC, 1 hora), formándose de ese modo un sistema de electrodos
mediante el método de impresión.
La L-fenilalanina deshidrogenasa
(PheDH: EC 1.4.1.20, fabricada por Unitika), la NAD^{+}
(fabricada por Oriental Yeast) empleada como coenzima, y el
1-metoxi PMS (fabricado por Dojin Kagaku Kenkyusho)
empleado como mediador de electrones, fueron disueltos en un tampón
de borato (pH 8'0, 20 mM) para dar una solución mixta de reactivos
de reacción, la cual fue después absorbida por un soporte absorbente
5 fabricado en fibra de celulosa (fabricada por Advantec Toyo) y
secada mediante calentamiento (40ºC, 15 minutos). De este modo, se
obtuvo un soporte absorbente 5 conteniendo los reactivos de
reacción.
Se proporcionó el soporte absorbente 5,
conteniendo los reactivos de reacción, como capa de reacción en la
pieza de reacción del electrodo del sistema de electrodos constando
del electrodo de trabajo 2 y el contraelectrodo 3 colocados opuestos
entre sí, fabricándose de ese modo un sensor de
L-fenilalanina.
Acerca de la determinación de la reacción
electrónica, la Fig. 2 muestra los datos de respuesta
oxidación-reducción para el 1-metoxi
PMS empleado como mediador de electrones.
En este Ejemplo se utilizó el sensor de
L-fenilalanina fabricado en el Ejemplo 1, y se
añadió 5 \mul de un tampón sin L-fenilalanina (pH
10'5, glicina-ClK-KOH 0'2M) a la
cara terminal del soporte absorbente 5 en el sensor. Es decir, no se
produjo ninguna reacción enzimática puesto que la muestra no
contenía sustrato (esto es, L-fenilalanina). Por
consiguiente, estos datos muestran el voltamograma cíclico (rango de
barrido: 20 mV/seg, Modelo HZ-3000 fabricado por
Hokuto Denko) del 1-metoxi PMS.
En este caso, en cada determinación se ajustaron
las concentraciones finales de los reactivos de reacción como sigue:
PheDH, 1 U; NAD^{+}, 5 mM; y 1-metoxi PMS, 0'5
mM.
El potencial máximo apareció a alrededor de -220
mV en el lado de oxidación, y alrededor de -300 mV en el lado de
reducción. De este modo, se observó una buena respuesta de
oxidación-reducción sin adolecer de ningún efecto
indeseable tal como la alteración por el soporte absorbente o por
los reactivos de reacción contenidos allí dentro.
Utilizando como muestras soluciones estándar
conteniendo L-fenilalanina, se llevó a cabo la
determinación con el sensor de L-fenilalanina
fabricado en el Ejemplo 1. La Fig. 3 muestra los resultados.
Se añadió 5 \mul de cada muestra. Después de 60
segundos, se aplicó un potencial de -220 mV frente a Ag/ClAg (esto
es, el contraelectrodo) y se midió la corriente de respuesta (Modelo
HZ-3000 fabricado por Hokuto Denko).
En este caso, en cada determinación se ajustaron
las concentraciones finales de los reactivos de reacción como sigue:
L-fenilalanina deshidrogenasa, 1 U; NAD^{+}, 5 mM;
y 1-metoxi PMS, 0'5 mM.
Cuando se añadió la muestra al soporte absorbente
5 que sirve como capa de reacción de reactivos, la
L-fenilalanina en la muestra experimentó la reacción
enzimática con la L-fenilalanina deshidrogenasa y el
NAD^{+}, para que se formara fenilpiruvato. Así, el NAD^{+} fue
reducido a NADH y, a su vez, el 1-metoxi PMS se
redujo debido a la transferencia de electrones. Posteriormente,
mediante la reacción electrónica se obtuvo una corriente de
oxidación del 1-metoxi PMS reducido debido a la
aplicación de potencial como se describió antes. Este nivel de
corriente dependió de la concentración de
L-fenilalanina, la cual era el sustrato. La Fig. 4
ilustra este modelo de reacción de la determinación de
L-fenilalanina según la presente invención.
De este modo, se obtuvieron datos lineales
sumamente favorables dentro de un intervalo de concentración de
L-fenilalanina de 0 a 2 mM.
Haciendo referencia al Ejemplo 3, se determinó la
L-fenilalanina utilizando muestras de sangre
conteniendo L-fenilalanina. La Fig. 5 muestra los
resultados.
Se añadió 7'5 \mul de cada muestra al soporte
aislante 5 del sensor. Después de 120 segundos, se aplicó un
potencial de -180 mV frente a Ag/ClAg (esto es, el contraelectrodo)
y se midió la corriente de respuesta.
En este caso, en cada determinación se ajustaron
las concentraciones finales de los reactivos de reacción como sigue:
L-fenilalanina deshidrogenasa, 2 U; NAD^{+}, 5 mM;
y 1-metoxi PMS, 0'5 mM.
De este modo, se obtuvieron datos lineales
sumamente favorables dentro de un intervalo de concentración de
L-fenilalanina de 0 a 2 mM.
La Fig. 6 es una ilustración esquemática que
muestra un sensor portátil 12 de L-fenilalanina
diseñado para seguir la marcha de la L-fenilalanina
durante la vida diaria en consideración, y un medidor portátil 13
para su determinación simplificada. Ahora, se describirá el
procedimiento de determinación.
El sensor de L-fenilalanina 12 se
pone en el medidor portátil 13 para el sensor de
L-fenilalanina. Después de añadir una muestra 11, se
conecta el interruptor 14 para, de ese modo, iniciar la
determinación de L-fenilalanina. Después de que
continúe la reacción enzimática durante un cierto periodo de tiempo
controlado por el temporizador 15, mediante el aplicador de
potencial 16 se aplica un potencial concreto al sensor. El nivel de
corriente de respuesta así formado en el sensor es transformado por
diversos métodos (transformación
corriente-potencial, transformación
analógica-digital, etc.) mediante el detector 17. A
continuación, mediante una CPU el nivel de corriente de respuesta se
calcula en concentración de L-fenilalanina, y el
resultado se transfiere a una pantalla luminosa 19.
Por lo que se refiere a las muestras conteniendo
L-fenilalanina, se examinó la correlación utilizando
el sensor portátil de L-fenilalanina, fabricado en
el Ejemplo 5 anterior, y HPLC. La Fig. 7 muestra los resultados.
En el caso de HPLC (fabricado por Hitachi), las
muestras fueron desproteinizadas y sometidas después a la
determinación de la concentración de L-fenilalanina
según el método de Hayashi y col. descrito anteriormente [Journal of
Chromatography, Vol. 274, pág. 318 (1983)]. En el caso del sensor
portátil de L-fenilalanina, las mismas muestras de
sangre fueron sometidas a la determinación sin
desproteinización.
De este modo, se observó una sumamente favorable
correlación (coeficiente de correlación: 0'971) dentro del intervalo
de concentración de L-fenilalanina de 0 a 1'5
mM.
Como en el Ejemplo 6 anterior, muestras de sangre
conteniendo L-fenilalanina fueron sometidas a la
determinación utilizando el sensor portátil de
L-fenilalanina, fabricado en el Ejemplo 5, y un
juego de cuantificación de aminoácidos para, de ese modo, examinar
la correlación. La Fig. 8 muestra los resultados.
En el caso del juego de cuantificación química
clínica de aminoácidos (Enzaplate PKU-R, fabricado
por Tomakomai Clinical Laboratory), se determinaron las intensidades
de fluorescencia (Fluororite 1000, fabricado por Dynatec
Laboratories) correspondientes a las concentraciones de
L-fenilalanina, según las instrucciones del
fabricante.
De este modo, se observó una sumamente favorable
correlación (coeficiente de correlación: 0'959) dentro del intervalo
de concentración de L-fenilalanina de 0 a 1'5
mM.
Aunque se hizo uso de un sistema de dos
electrodos, constando de un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo, se realizó la determinación con una exactitud
incrementada utilizando un sistema de tres electrodos, implicando un
electrodo de referencia.
Como se trató anteriormente, la presente
invención hace posible fabricar cómodamente un sensor de
L-fenilalanina, en donde están integrados juntos los
reactivos de reacción, tales como una enzima y un electrodo,
utilizando el método de impresión. De este modo, se puede
cuantificar electroquímicamente, con suma exactitud y comodidad, la
L-fenilalanina contenida en una muestra, en un corto
periodo de tiempo, añadiendo simplemente una cantidad traza de la
muestra, sin recurrir a ningún dispositivo o instrumento especial de
medición, a técnicas o pretratamientos fastidiosos.
Además, utilizando el sensor de
L-fenilalanina y un medidor portátil para este
sensor, se pueden suavizar las diversas condiciones de medida y, de
este modo, la cuantificación puede ser realizada con comodidad, sin
limitaciones de tiempo o lugar.
Claims (10)
1. Un método para determinar
L-fenilalanina, caracterizado porque se añade
una muestra a un sensor de L-fenilalanina compuesto
de un sistema de electrodos que comprende, como mínimo, un electrodo
de trabajo y un contraelectrodo integrados en un soporte aislante, y
una capa de reacción de reactivos que contiene, como reactivos de
reacción, al menos L-fenilalanina deshidrogenasa,
NAD^{+} o NADP^{+} como coenzima, y un mediador de electrones, y
está integrada con dicho sistema de electrodos; en donde dicha capa
de reactivos consta de un soporte absorbente para la introducción de
una cantidad concreta de una muestra dentro de la capa de reactivos,
y después se cuantifica electroquímicamente la
L-fenilalanina.
2. El método para determinar
L-fenilalanina, como se reclama en la Reivindicación
1, caracterizado porque dicho sistema de electrodos es
formado mediante el método de impresión con el empleo de un material
conductivo, y dicho electrodo de trabajo está fabricado de un
material que comprende carbono principalmente.
3. Un método para determinar
L-fenilalanina, como se reclama en la Reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque dicho mediador de electrones
comprende una fenazina.
4. Un sensor de L-fenilalanina
caracterizado por tener una estructura compuesta por un
sistema de electrodos que comprende, como mínimo, un electrodo de
trabajo y un contraelectrodo integrados en un soporte aislante, y
una capa de reacción de reactivos que contiene, como reactivos de
reacción, al menos L-fenilalanina deshidrogenasa,
NAD^{+} o NADP^{+} como coenzima, y un mediador de electrones, y
está integrada con dicho sistema de electrodos; en donde dicha capa
de reactivos consta de un soporte absorbente para la introducción de
una cantidad concreta de una muestra dentro de la capa de
reactivos.
5. El sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en la Reivindicación 4, caracterizado porque
dicho sistema de electrodos es formado mediante el método de
impresión con el empleo de un material conductivo, y dicho electrodo
de trabajo está fabricado de un material que comprende carbono
principalmente.
6. Un sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en la Reivindicación 4 ó 5, caracterizado
porque dicho mediador de electrones comprende una fenazina.
7. Un sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en alguna de las Reivindicaciones 4 a 6,
caracterizado porque el sistema de electrodos comprende como
mínimo un electrodo de trabajo y un contraelectrodo integrados
opuestos entre sí en un soporte aislante, dicho soporte absorbente
está situado en una parte donde ocurre la reacción electródica entre
estos electrodos.
8. El sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en la Reivindicación 7, caracterizado porque,
en dicho sistema de electrodos comprendiendo como mínimo un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo, el soporte absorbente
conteniendo los reactivos de reacción, que está situado entre dichos
electrodos, sirve como capa de reacción para la reacción enzimática
entre una muestra y los reactivos de reacción y la reacción
electródica entre el mediador de electrones y la superficie del
electrodo.
9. Un sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en la Reivindicación 7 u 8, caracterizado
porque dicho soporte absorbente, que contiene los reactivos de
reacción y sirve como capa de reacción para la reacción enzimática y
la reacción electródica, tiene naturaleza hidrófila.
10. Un sensor de L-fenilalanina,
como se reclama en alguna de las Reivindicaciones 7 a 9,
caracterizado porque dicho soporte absorbente, que contiene
los reactivos de reacción y sirve como capa de reacción para la
reacción enzimática y la reacción electródica, está parcialmente
protegido del contacto con el exterior mediante dicho sistema de
electrodos constando de, como mínimo, un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo suministrados opuestos entre sí, y dicho sistema de
electrodos sirve al menos como capa protectora para dicho soporte
absorbente.
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