ES2255170T3 - Inhibidores de butirilcolinesterasa altamente selectivos para el tratamiento y diagnostico de demencias y de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL DESCUBRIMIENTO DE QUE INHIBIDORES DE LA BUTIRILCOLINESTERASA ALTAMENTE SELECTIVOS PUEDEN EVITAR O TRATAR LAS DEFICIENCIAS COGNITIVAS ASOCIADAS CON EL ENVEJECIMIENTO O DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. UN INHIBIDOR PREFERIDO DE LA BUTIRILCOLINESTERASA ES LA CIMSERINA.

Description

Inhibidores de butirilcolinesterasa altamente selectivos para el tratamiento y diagnóstico de demencias y de la enfermedad de Alzheimer.

Resumen de la invención

Se ha sugerido que los defectos en el sistema colinérgico están relacionados con las afecciones cognitivas asociadas con el envejecimiento normal y con la enfermedad de Alzheimer (Bartus y col., Science 217:408-417 (1982); Fisher y col., Neurobiol. Aging 13:9-23 (1992)). El desarrollo de terapia de reemplazo colinomimético como tratamiento potencial para estas afecciones ha sido el enfoque de muchas investigaciones. Entre ellas, se investigaron inhibidores de colinesterasa, tales como fisostigmina (Phy) y tetrahidroaminoacridina (ThA) para lograr un mejoramiento de la memoria, tanto en pacientes animales (Rupniak y col., Neurobiol. Aging 11:09-613; 1990); Murray y col., Psychopharmacology 105:134-136 (1991) como en seres humanos (Mohs y col., J. Am. Geriatr. Soc. 3:749-757 (1985); Summers y col., N. Engl. J. Med. 315:1241-1245 (1986)).

Se propusieron otros agentes como inhibidores selectivos de acetilcolinesterasa (AChE). De este modo se describió a la heptilfisostigmina (Heptyl-Phy), con una mayor lipofilicidad, acción inhibitoria más prolongada sobre la colinesterasa y con aumentos de acetilcolina más persistentes en el cerebro con menos toxicidad que el compuesto del que se origina (Brufani y col., Pharmacol. Biochem. Behav. 26:625-629 (1987)). Existe sin embargo inquietud en cuanto a si la ventana terapéutica del Heptyl-Phy es suficientemente amplia para el uso clínico. Se identificó a la fenserina
((-)-N-fenilcarbamoil eserolina) como un inhibidor selectivo de AChE superior y por lo tanto adecuado como agente para la terapia de afecciones cognitivas asociadas con el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer. (Patente de EEUU Nº 5.409.948, publicada el 25 de Abril, 1995). En la Patente de EEUU Nº 5.171.750 publicada el 15 de Diciembre, 1992, se describe una serie de fenserinas sustituidas señaladas como inhibidores selectivos de AChE o butirilcolinesterasa (BChE). Se ha visto que el cumilcarbamato (4'-isopropilfenilcarbamato), derivado de (-)-fisovenol tiene una especificidad de enzima inversa, es decir, inhibió selectivamente BChE sobre AChE. La patente indica que los compuestos de la invención son útiles "para tratar trastornos colinérgicos tales como glaucoma, Miastenia Gravis, enfermedad de Alzheimer y como antídoto contra el envenenamiento con organofosforados". No se indica qué tipo de inhibidor debería usarse para tratar los trastornos especificados, sin embargo, en otra descripción se señala que la AChE, que se encuentra en glóbulos rojos, cerebro y tejido nervioso, parece ser más específicamente una enzima que se sabe hidroliza acetilcolina (ACh) in vivo en mayor grado que BChE, la que se encuentra en suero, páncreas e hígado. La marcada pérdida colinérgica en AD se acompaña de disminuciones marcadas en las enzimas colinacetil transferasa, involucrada en la síntesis del neurotransmisor colinérgico acetilcolina, Ach y AChE, que completa la acción de Ach. (Perry, y col. Brit. Med. J., 2 6150: 1457-1459, 1978; Whitehouse, y col. Science 215; 1237-1239, 1982).

La Patente de EEUU Nº 5378723, publicada el 3 de Enero de 1995, describe una serie de derivados de ácido tiafisovenol carbámico señalados por exhibir una gran potencia en la de inhibición AChE o BChE. Los compuestos de la invención fueron señalados, como en el caso de la Patente de EEUU Nº 5171750 anteriormente citada, como útiles en el tratamiento de trastornos tales como glaucoma, Miastenia Gravis, enfermedad de Alzheimer y envenenamiento con organofosforados. Como anteriormente, no se brinda indicación específica acerca de qué tipo de inhibidores deberían usarse en cada trastorno especificado.

Geula y Mesulam, en la publicación con título "Cholinesterases and the Pathology of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease and Associated Disorders, Vol. 9, Suppl. 2, pág. 23-28 (1995) hacen en resumen las siguientes observaciones: "La enfermedad de Alzheimer (AD) está acompañada por una marcada pérdida de actividad de acetilcolinesterasa (AChE) asociada con axones colinérgicos corticales y neuronas colinoceptivas. Simultáneamente con esta pérdida, surge actividad de colinesterasa (ChE) en el córtex de AD en forma de actividad de AChE y BChE asociada con placas, ovillos y angiopatía amiloide. Nuestras observaciones mostraron que las ChEs asociadas con lesiones patológicas de AD (ADChEs) tienen diferentes propiedades enzimáticas y muy posiblemente diferente origen que las ChEs asociadas con neuronas y axones normales. Muy probablemente las ADChEs tienen funciones no colinérgicas involucradas en la patogénesis de la AD". En otra sección, en la pág. 26, los autores exponen: "Estas observaciones indican que la glia es probablemente la fuente de ChE, y particularmente de BChE, asociadas con las lesiones patológicas de la AD. También sugieren que una relación alta entre glia positiva para BChE y AChE puede jugar un papel permisible y causante en la neuropatología de esta enfermedad. Es posible que existan otros pooles de ChE con propiedades enzimáticas similares o idénticas a aquellas de ADChEs. Esta posibilidad está aún sin explorar".

Los expertos en la técnica señalaron que la BChE se encuentra en cantidades significativamente mayores en las placas de AD que en las placas de cerebros de las mismas edades de pacientes sin demencia. Además, se vio que la BChE altera la agregación de péptido amiloide beta (A\beta). Se propuso la hipótesis de que puesto que la AChE es inhibida por concentraciones altas de acetilcolina (ACh), mientras la BChE no se ve afectada, es posible que la BChE juegue un papel importante en la regulación in vivo de las concentraciones sinápticas de ACh en el cerebro de pacientes con AD. El inhibidor de BChE, instilado en el cerebro produjo aumento significativo de los niveles de ACh extracelular. (Giacobini, y col., Proc. Soc. Neurosci., 22; 203, 1996).

También se vio que las placas de tres pacientes con AD, que eran de tipo compacto o neurítico, estaban prácticamente siempre asociadas con actividad de BChE intensa. Se concluyó que la actividad de BChE aparece en el estadío intermedio de la formación de placas y que puede por lo tanto constituir uno de los factores involucrados en la transformación de un depósito A\beta inicialmente benigno en una forma neurítica compacta asociada con degeneración neural y demencia.

Resumen de la invención

Se ha descubierto inesperadamente y por lo tanto forma la base de la presente invención que inhibidores altamente selectivos de BChE pueden usarse mediante administración sistémica para prevenir o tratar afecciones cognitivas asociadas con el envejecimiento o la enfermedad de Alzheimer en un huésped. Ya que la actividad de BChE ha sido identificada previamente como presente principalmente en órganos periféricos, tales como el páncreas, hígado y suero o en la circulación y su inhibición se asoció con efectos secundarios observados en terapias de primera generación de la enfermedad de Alzheimer (referencias: Liston y col., Proc. Soc. Neurosci., 20: 608, 1994 y Soreq & Zachnt, Human Cholinestrase and ?, Academic Press, New York, pág. 21-29, 1993), el uso de inhibidores de BChE altamente selectivos en el tratamiento o prevención de afecciones cognitivas asociadas con el envejecimiento o la enfermedad de Alzheimer no fue sugerido en la técnica. Otro factor que descartó la posibilidad de usar inhibidores de BChE altamente selectivos en el tratamiento de enfermedades cognitivas del cerebro y SNC fue el patrón de distribución esperado de tales agentes. Los datos disponibles en la técnica sugieren que tales compuestos se unirían de preferencia a los órganos periféricos donde reside la mayor parte de la actividad de su sustrato. Por lo tanto no era de esperar que concentraciones clínicamente útiles de inhibidores de BChE altamente selectivos administrados sistémicamente a un paciente pudieran pasar a través de la barrera hematoencefálica y estuvieran disponibles en el cerebro ya que (i) sería de esperar que tales compuestos estuvieran unidos a enzimas sistémicas antes de alcanzar el cerebro, restringiendo su acceso, y (ii) muchos inhibidores de BChE conocidos en la técnica no entran fácilmente en el cerebro. De hecho, hasta el presente, los inhibidores de BChE han sido utilizados principalmente como pesticidas en agricultura. (Soreq y Zachut, Human Cholinesterases and Anticholinesterases, Academic Press, N.Y., pág. 21-29, 1993).

El término "altamente selectivo" como se usa en este documento supone la inclusión de aquellos inhibidores de BChE cuya relación de valores de CI (50) frente a BChE de plasma humano comparada con los valores de CI (50) frente a AChE de eritrocitos humanos sea mayor que aproximadamente 15 a 1.

Los valores de CI (50) pueden determinarse para tales inhibidores usando procedimientos bien conocidos en la técnica. En tal ensayo se determina de manera separada la actividad farmacológica de cada compuesto, como una
CI (50), definida como la concentración, en nanomoles, necesaria para inhibir el 50% de la actividad enzimática de AChE y BChE. Para la determinación de los valores de CI (50), la actividad enzimática de cada concentración se expresó como un porcentaje de la actividad determinada en ausencia de cada compuesto. Posteriormente se transformó a un formato logit, donde logit = ln (actividad % / [100 - actividad %]), y se graficó como una función de la concentración logarítmica del compuesto. Los valores de CI (50) (es decir, logit = ln (50/[100-50])= 0) se determinaron sólo de coeficientes de correlación (r^{2}) de menos de -0,985 y cuando se alcanzó más del 50% de inhibición en muestras por duplicado. La relación de selectividad se determina posteriormente comparando los valores de CI (50) obtenidos para cada compuesto con AChE con los de BChE.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A, 1B y 1C representan una tabla de estructuras químicas de compuestos probados en su actividad que incluye compuestos con selectividad conveniente para BChE de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 es una inmunotransferencia (Immunoblot) del ensayo para determinar el efecto de los compuestos indicados en la secreción de \betaAPP in vitro.

La Figura 3 es un gráfico que demuestra que la cimserina disminuye los niveles de \betaAPP\gamma en LCR en ratas.

La Figura 4 es un gráfico que muestra la distribución a través del tiempo en la barrera hematoencefálica en una rata tras la administración de 1 mg/kg I. V. de cimserina.

La Figura 5 es un gráfico que ilustra que la mejora del rendimiento cognitivo en ratas tratadas con cimserina.

Descripción detallada de la invención

Los inhibidores de BChE altamente selectivos útiles en el procedimiento de la presente invención son aquellos compuestos de la Tabla 1 que están señalados por tener una selectividad para BChE de 15 o mayor, mientras que sus estructuras se proveen en la Figura 1A, 1B y 1C (junto con su relación de selectividad) y las que nuevamente para compuestos de la invención la selectividad para BChE es de 15 o mayor. Con el fin de comparar las estructuras, se muestran también otros compuestos relacionados en la Tabla 1 y Figura 1A, 1B y 1C que no exhiben la selectividad adecuada para BChE.

Entre los compuestos expuestos en la Tabla 1 y en la Figura 1 se encuentran ciertos compuestos nuevos que inhiben la butirilcolinesterasa. Los compuestos nuevos de la invención son (el número entre paréntesis corresponden al número de compuesto de la Tabla 1): N^{8}-bencilnorcimserina^{(33)}; N^{8}-norcimserina^{(37)}; N^{1},N^{8}-bisnorcimserina^{(41)};
N^{1},N^{8}-bisbencilnorfisostigmina^{(42)}; N^{1},N^{8}-bisbencilnorfenserina^{(43)}; y N^{1},N^{8}-bisbencilnorcimserina^{(45)}. Estos compuestos nuevos se sintetizaron de la siguiente manera:

(-)-(3aS)-8-Bencil-1,3a-dimetil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol-5-il-N-4'-isopropilfenilcarbamato (N^{8}-Bencilnorcimserina; compuesto 33). Se disolvió (-)-(3aS)-8-Bencil-1,3a-dimetil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo [2,3-b]indol-5-ol^{1} (33 mg, 0,112 mmol) en éter (2 ml), y se agregó Na (1 mg). Se agitó la muestra a t.a. durante 1 min, posteriormente se agregó 4-isopropilfenilisocianato (18,1 mg, 0,112 mmol). Se agitó la mezcla a t.a. durante 5 min. Tras eliminar el solvente, se sometió el residuo a cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH=20/l) para dar 33 (40 mg, 80,0%) como una espuma: [\alpha]_{D} -60,0º (c=0,2, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,40-7,08 (m, 9H, Ar-H), 6,80 (d, J=2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,70 (dd, J=2,2, 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,15 (d, J=8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,45 y 4,35 (AB, J=16,6 Hz, 2H, Ph-CH_{2}), 4,25 (s, 1H, C8a-H), 2,80 (m, 1H, Ph-CH<), 2,68 (m, 2H, C1-H_{2}), 2,32 (s, 3H, N1-CH_{3}), 1,90 (m, 2H, C2-H_{2}), 1,35 (s, 3H, C3a-CH_{3}), 1,15 (d, J=7,0 Hz, 6H, >CMe_{2}); EI-MS m/z (intensidad relativa): 294 (MH+-ArNHCO, 65), 280 (2,2), 265 (3,6), 237 (75), 207(58), 160 (34), 91 (100). HR-MS m/z Calculado para C_{29}H_{33}N_{3}O_{2}: 455,2573; hallado: 455,2569.

(-)-(3aS)-1,3a-Dimetil-1,2,3,3a,8,8a-hexhidropirrolo[2,3-b]indol-5-il-N-4'-isopropil fenilcarbamato (N^{8}-Norci-
merserina; compuesto 37).Se disolvió el compuesto 33 (22 mg, 0,048 mmol) en una mezcla de MeOH (1 ml), H_{2}O
(1 ml) y TFA (0.5 ml). Se agregó hidróxido de paladio en carbono (5 mg). Se agitó la mezcla de reacción bajo hidrógeno a presión atmosférica y t. a. durante 1 h y posteriormente se filtró el catalizador. Se evaporó el filtrado en vacío para dar un residuo el que se disolvió en H_{2}O, se alcalinizó con Na_{2}O_{3}, se extrajo con éter y posteriormente se secó sobre Na_{2}SO_{4}. Tras eliminar el solvente, se cromatografió el residuo en un TLC de preparación (gel de sílice) (CH_{2}Cl_{2}=10/1) para dar el producto 37 (12 mg, 65,7%) como goma: [\alpha]_{D} ^{20} -73,8º (c= 0,2, CHCl_{3}); ^{1}HNMR (CDCl_{3}) \delta 67,30 (d, J= 8,5 Hz, 2H, C2'-H y C6'-H), 7,10 (d, J= 8,5 Hz, 2H, C3'-H y C5'-H), 6,80-6,70 (m, 2H, C4-H y C6-H), 6,50 (d, J= 8,5 Hz, C7-H), 4,65 (s, 1H, C8a-H), 2,85 (m, 2H, C2-H_{2}), 2,64 (m, 1H, -HC <), 2,48 (S, 3H, N1-CH_{3}), 2,00-1,90 (m, 2H, C3-H_{2}), 1,42 (s, 3H, C3a-CH_{3}), 1,20 (d, J= 7,0 Hz, 6H, >CMe_{2}); EI-MS m/z (intensidad relativa): 204 (MH^{+}-ArNHCO, 99), 189 (25), 174 (8,3), 117 (10). HR-MZ m/z Calculado para C _{22}H_{27}N_{3}O_{2}: 365,2105; hallado 365,2100.

(-)-(3aS)-1,8-Dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrol[2,3-b]indol-5-il N-4'-isopropilfenilcarbamato (compuesto 45). Se disolvió (-)-(3aS)-1,8-Dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol-5-ol^{2} (68 mg,
0,18 mmol) en éter anhidro (2 ml) y se agregó un trozo de Na metálico (aprox. 1 mg).

Se agitó la muestra a t. a. durante 1 min, posteriormente se agregó 4-isopropilfenilisocianato (30 mg, 0,18 mmol) y se agitó durante 5 min. La evaporación del solvente dio un producto crudo 20 que se cromatografió directamente para dar 45 (89 mg, 991,3%) como una goma: [\alpha] D-44,7º (C= 0,5, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta7,29 (d, J= 8,5 Hz, 2H, C2'-H y C6'-H), 7,14 (d, J= 8,5 Hz, 2H, C3'-H y C5'-H), 6,78 (d, J= 2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,70(dd, J= 2,5, 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,15 (d, J= 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,48 (s, 1H, C8a-H), 4,30-4,15 (AB, J= 16,6 Hz, 2H, Ph-CH_{2}-N8), 3,73 (s, 2H, Ph-CH_{2}-NI), 2,80 (m, 1H, -HC <), 2,70 (m, 2H, C2-H_{2}), 1,90 (m, 2H, C3-H_{2}), 1,40 (s, 3H, C3a-CH_{3}), 1,15 (d, J= 7,0 Hz, 6H); EI-MS m/z (intensidad relativa): 370 (MH^{+}-ArNHCO-, 1,0), 294 (90), 279 (10), 237 (8,0), 174(95), 160 (92), 132 (60), 104 (55), 91 (100). HR-MZ m/z Calculado para C_{35}H_{37}N_{3}O_{2}: 531,2888; hallado
531,2907.

(-)-(3aS)-3a-Metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrol[2,3-b]indol-5-il N-4'-isopropilfenil carbamato (compuesto 41). Se disolvió el compuesto 45 (42 mg, 0,078 mmol) en isopropanol (1 ml) y se agregó Pd(OH)_{2}/C (5 mg). Se agitó la mezcla de reacción bajo hidrógeno a presión atmosférica y t. a. durante 60 horas, posteriormente se filtró el catalizador. La evaporación del solvente dio un residuo que se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}/MeOH=10/1) para dar el componente más polar, compuesto 41 (14 mg, 51,0%) como una goma: [\alpha]_{D} ^{20} -71,1º C=0,3, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta7,29(d, J= 8,5 Hz, 2H, C2'-H y C6'-H), 7,10 (d, J= 8,5 Hz, 2H, C3'-H y C5'-H), 6,80 (m, 2H, C4-H y C6-H), 6,55 (d, J= 8,5 Hz, C7-H), 5,20 (s, 1H, C8a-H), 2,90 (m, 1H, Ph-CH<), 2,80 (m, 2H, C2-H_{2}), 2,13 (m, 2H, C3-H_{2}), 1,45 (s, 3H, C3a-CH_{3}), 1,18 (d, J= 7,0 Hz, >CMe_{2}); EI-MS m/z (intensidad relativa): 190 (MH^{+}-ArNHCO, 98), 174 (10), 160 (70), 146 (100), 133 (11), 117 (15), 103 (5,0), 91 (14); HR-MS (NH_{3}) m/z: Calculado para C_{21}H_{25}N_{3}O_{2}: 351,1948; hallado: 351,1941.

(-)-(3aS)-1,8-Dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrol[2,3-b-]indol-5-il N-metilcarbamato [compuesto 42]. Se disolvió (-)-(3aS)-1,8-dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidro-5-metoxipirrolo[2,3-b]indol (47,5 mg, 0,13 mol) en éter anhidro (2 ml), y se agregó un trozo de Na metálico (aprox. 1 mg). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 min, posteriormente se agregó metilisocianato (14,6 mg, 0,26 mmol) y se agitó la mezcla durante 10 min. La evaporación del solvente dio un producto crudo que se sometió directamente a cromatografía para dar 42 (50,0 mg, 90,0%) como una goma: [\alpha]_{D} ^{20} -58,2º (C=0,7, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta7,40-7,20 (m, 10H, Ar-H), 6,75 (d, J= 2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,64 (d, J= 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,24 (d, J= 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,65 (s, 1H, N-H), 4,40 (s, 1H, C8a-H), 4,35-4,20 (AB, J= 16,6 Hz, 2H, Ph-CH_{2}-N8), 3,70 (s, 2H, Ph-CH_{2}-N1), 2,80 (d, J= 3,9 Hz, 3H, NH-CH_{3}), 2,70 (m, 2H, C2-H_{2}), 1,90 (m, 2H, C3-H_{2}), 1,35 (s, 3H, C3a-CH_{3}); EI-MS, m/z (intensidad relativa): 370 (MH^{+}-CH_{3}NHCO-, 33), 354 (1,5), 279 (8,5), 264 (3,0), 91 (100). Analizado (C _{27}H_{29}N_{3}O_{3}) C, H, N.

(-)-(3aS)-1,8-Dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,-8,8a-hexahidropirrol[2,2-b]indol-5-il N-fenilcarbamato [compuesto 43]. Se disolvió (-)-(3aS)-1,8-dibencil-3a-metil-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol-5-ol (40,7 mg, 0,11 mmol) en éter anhidro (2 ml), y se agregó un trozo de Na metálico (aprox. 1 mg). Posteriormente se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 min, posteriormente se agregó fenilisocianato (13,1 mg, 0,11 mol) y se agitó durante 5 min. La evaporación del solvente dio un producto crudo que se sometió directamente a cromatografía para dar 43 (48,0 mg, 89,1%) como una goma: [\alpha]_{D} ^{20} -59,1º (C=0,7, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta7,40-6,90 (m, 15H, Ar-H), 6,75 (d, J= 2,5 Hz, 1H, C4-H), 6,73 (d, J= 8,5 Hz, 1H, C6-H)m 6,17 (d, J= 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,45 (s, 1H, C8a-H), 4,30-4,20 (AB, J= 16,6 Hz, 2H, Ph-CH_{2}-N8), 3,72 (s, 2H, Ph-CH_{2}N1), 2,70 (m, 2H, C2-H_{2}), 1,90 (m 2H, C3-H_{2}), 1,38 (s, 3H, C3a-CH_{3}); EI-MS, m/z (intensidad relativa): 370 (MH^{+}-PhNHCO-, 31), 354 (1,0), 279 (8,0), 264 (2,0), 91 (100). Analizado (C_{27}H_{29}N_{3}O_{3}) C, H, N.

La síntesis del resto de los compuestos de la Tabla 1 se conoce y puede encontrarse en las referencias citadas para cada compuesto de la lista en la Figura 1.

Como resumen de la Tabla 1, muchos estudios demostraron mientras que la anticolinesterasa clásica fisostigmina (1) no tiene selectividad de acción inhibitoria entre dos subtipos de enzimas, acetil-(AChE) y butirilcolinesterasa (BChE), sustituciones específicas en la posición 4' (para), (4, 5), del (-)-fenilcarbamato de fisostigmina (2) proveen compuestos con una selectividad para inhibición de BChE. Esto resulta inesperado ya que otras sustituciones en 4', (6), o sustituciones similares en otras posiciones, tal como en la posición 2' (orto) (3, 7), no proveen selectividad para BChE. Estudios recientes mostraron que la sustitución en 3' asimismo no provee selectividad para BChE, por ejemplo la 3'-metil-carbamoileserolina tiene una CI_{50} de 27 nM para AChE y 165 nM para BChE. De hecho, la sustitución en las posiciones 2'-; 2',4'-; 3'-; 2',3'-; 3',5'- o 2',4',6'- no proveen selectividad para BChE. Estudios adicionales demostraron que, de manera independiente, las sustituciones en la posición N^{1}- de fisostigmina (1), tales como
N^{1}-norfisostigmina (8), N^{1}-bencilnorfisostigmina (12), N^{1}-fenetilnorfisostigmina (16) y N^{1}-alilnorfisostigmina (20) proveen selectividad para BChE comparada con fisostigmina (1). Esto resulta inesperado ya que otras sustituciones, tales como aminas (21), no lo hacen. El reemplazo del grupo N^{1} de la fisostigmina (1) para proveer tiafisovenina (22) y fisovenina (26) también provee inesperadamente una selectividad de acción inhibitoria para BChE. Otros estudios demostraron que, de manera independiente, la sustitución en la posición N^{8}- de fisostigmina (1), para proveer
N^{8}-bencilnorfisostigmina (30) y N^{8}-norfisostigmina (34), produce inhibidores potentes y selectivos de BChE. Una combinación de las modificaciones descritas provee compuestos [11, 15, 16, 19, 25, 29, 33, 37] que exhiben o se espera exhiban selectividad espectacular para BChE versus la acción inhibitoria para AChE. Otros compuestos útiles para el objetivo de esta invención incluye a los compuestos [12, 20 y 22].

Las composiciones para uso en los procedimientos de la invención incluyen composiciones en las que el ingrediente activo se encuentra en una cantidad eficaz para lograr el objetivo buscado. Los compuestos pueden administrarse en cualquier cantidad farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, desde 0,001 gramos hasta aproximadamente 1 gramo por kilogramo de peso corporal. En base a la información presentada en este documento, los expertos en la técnica pueden determinar de las cantidades eficaces con facilidad. Los compuestos se usan generalmente en composiciones farmacéuticas (% en peso) conteniendo el ingrediente activo con un vehículo en la composición en una cantidad desde aproximadamente 0,1 hasta 99% en peso y de preferencia aproximadamente 25-85% en
peso.

Pueden prepararse fácilmente formas de dosificación fluidas o sólidas para administración oral. Por ejemplo, los inhibidores de BChE altamente selectivos pueden mezclarse con ingredientes convencionales como fosfato dicálcico, silicato de magnesio y aluminio, estearato de magnesio, sulfato de calcio, almidón, talco, lactosa, acacia, metilcelulosa y materiales funcionalmente similares como excipientes o vehículos farmacéuticos. Puede usarse opcionalmente una formulación de liberación sostenida. Estas formulaciones de liberación sostenida pueden ser de preferencia en pacientes de edad avanzada o pacientes incoherentes. Las cápsulas pueden formularse mezclando el compuesto con un diluyente farmacéutico inerte e insertando esta mezcla en una cápsula dura de gelatina de un tamaño adecuado. Si se quieren cápsulas blandas, se puede formar una cápsula de gelatina conteniendo una suspensión del compuesto con un aceite vegetal aceptable, vaselina u otro aceite inerte.

Para administración oral o formas de dosificación fluida unitaria pueden usarse suspensiones, jarabes y elixires. Para formas oleosas solubles puede usarse una preparación fluida que incluye aceite. Un aceite vegetal tal como aceite de maíz, aceite de maní o aceite de flor, junto con agentes saborizantes, endulzantes y conservantes produce una preparación fluida aceptable. Para dosificaciones unitarias fluidas, puede agregarse un tensioactivo al agua para formar un jarabe. Las preparaciones farmacéuticas hidroalcohólicas pueden usarse con un endulzante aceptable, tal como azúcar, sacarina o un endulzante biológico y un agente saborizante en forma de elixir.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral o como supositorios pueden también obtenerse usando procedimientos estándar en la técnica.

Los usos de preferencia de los compuestos de acuerdo con la invención son como agentes adecuados para administración oral. Otro uso de preferencia de los compuestos es en formulaciones parenterales transdérmicas, las que son particularmente útiles en la prevención o tratamiento de afecciones colinérgicas tal como la enfermedad de Alzheimer. De acuerdo con esto, las composiciones adecuadas para administración en estas áreas son particularmente incluidas dentro de la invención. Las soluciones o suspensiones parenterales anteriormente citadas pueden administrarse de manera transdérmica o administrarse por medio de parches cutáneos. Si se desea pueden administrarse por medio de inyección en un vehículo adecuado tal como aceite de sésamo.

De acuerdo con esto, puede implementarse la incorporación del compuesto activo y una matriz de liberación lenta para administración transdérmica. Los compuestos pueden administrarse por vía transdérmica en cantidades desde aproximadamente 0,01 hasta 99% de la composición y de preferencia desde aproximadamente 25 hasta 85% en peso del ingrediente activo en el vehículo.

Los sistemas terapéuticos transdérmicos son formas de dosificación incorporadas, que cuando se aplican a la piel intacta, administran fármaco(s) en la circulación sistémica a una velocidad controlada. Las ventajas de usar la vía transdérmica incluyen: eficacia terapéutica potenciada, disminución en la frecuencia de dosificación, disminución de los efectos secundarios debido a la optimización de la concentración en sangre durante el tiempo, mayor conformidad en los pacientes debido a la eliminación de programas de dosificación múltiples, desviando el "primer paso" metabólico hepático, evitando incompatibilidades gastrointestinales y proveyendo una duración previsible y prolongable de la actividad. Sin embargo, la principal función de la piel es actuar como barrera para la entrada de compuestos. Como consecuencia, la terapia transdérmica ha sido de preferencia par un limitado número de fármacos que poseen las propiedades fisicoquímicas adecuadas para difundir a través de la barrera de la piel. Un procedimiento eficaz para superar la función de barrera de la piel es incluir un potenciador de penetración en la formulación del sistema terapéutico transdérmico.

El potenciador de penetración es un compuesto químico que, cuando se incluye en una formulación, aumenta temporalmente la permeabilidad de la piel a una línea de fármacos permitiendo que se absorba una mayor cantidad de fármaco en un tiempo menor. Se han descrito varios tipos diferentes de potenciadores de penetración tales como dimetilsulfóxido, n-decilmetilsulfóxido, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 1-dodecilalazacicloheptan-2-ona (Azone), propilenglicol, etanol, pirrolidonas tal como N-metil-2-pirrolidona (NMP) y tensioactivos.

Los compuestos anteriores pueden estar presentes en el reservorio solos o en combinación con vehículos farmacéuticos. Los vehículos farmacéuticos aceptables para los objetivos de esta invención son los vehículos conocidos en la técnica que no afectan adversamente al fármaco, al huésped o al material que comprende el dispositivo de administración del fármaco. Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen agua estéril, solución salina, dextrosa, dextrosa en agua o en solución salina, productos de condensación de aceite de ricino y óxido de etileno combinando aproximadamente 30 a 35 moles de óxido de etileno por mol de aceite de ricino, ácido líquido, alcanoles inferiores, aceites tales como aceite de maíz, aceite de maní, aceite de sésamo y similares, con emulsificantes tales como mono- o diglicéridos de ácidos grasos; o un fosfátido, por ej., lecitina, y similares; glicoles, polialquilenglicoles, medio acuoso en presencia de un agente de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, alginato de sodio, poli(vinilpirrolidona), y similares, solos o con agentes de administración adecuados tales como lecitina, estearato de polioxietileno, y similares. Los vehículos pueden también contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y similares junto con potenciadores de penetración y el compuesto de esta invención.

La dosis eficaz para mamíferos puede variar debido a factores tales como la edad, peso, nivel de actividad o condición del sujeto tratado. Típicamente, una dosificación eficaz de un compuesto de acuerdo con la presente invención es aproximadamente 1 a 800 miligramos cuando se administra por vía oral o rectal de 1 a 3 veces al día. Esto es aproximadamente 0,002 a 50 miligramos por kilogramo de peso del sujeto por día. De preferencia se administran desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 miligramos por vía oral o rectal 1 a 3 veces al día para un ser humano adulto. La dosis necesaria es considerablemente menor cuando se administra por vía parenteral. De preferencia pueden administrarse desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 150 miligramos por vía intramuscular o transdérmica, una o dos veces al día a un ser humano adulto.

Los compuestos para uso en la presente invención pueden administrarse tópicamente en cantidades desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 99% en peso de la composición, y de preferencia desde aproximadamente 25 hasta 85% en peso. El procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención a un mamífero que necesita tal trata-
miento.

En el presente estudio evaluamos los efectos del tratamiento crónico con cimserina (5 días) en el rendimiento de ratas Fischer-344 (F344) de 21-22 meses de edad en un laberinto en T de 14 unidades, conocido como Laberinto Stone. El uso del paradigma del laberinto Stone para este estudio puede sustentarse en dos observaciones: (1) el conocimiento de que el sistema colinérgico está involucrado en el rendimiento como se demostró con estudios farmacológicos y con lesiones y (2) el marcado deterioro relacionado con la edad en el rendimiento demostrado en varias cepas de roedores incluyendo la cepa Fischer 344 (F344). El uso de la rata F344 para este estudio también está justificado por el deterioro documentado relacionado con la edad en los marcadores colinérgicos en regiones específicas del cerebro y la mejora demostrada en el rendimiento de la memoria de ratas con edad avanzada de esta cepa tras varios tratamientos colinérgicos.

Se obtuvieron ratas macho F344 de 21-22 meses de edad de Harlan-Spague-Dawley con contrato del National Institute on Aging. Se mantuvieron en un vivario de a dos por jaula en el Gerontology Research Center bajo condiciones específicas libres de patógenos descritas previamente.

Como se describió anteriormente, el laberinto Stone está construido de plástico translúcido con un suelo cuadriculado conectado para provocar descargas y dificultar la caminata y está rodeado por paredes grises para reducir la disponibilidad de señales extra en el laberinto. El otro único aparato era una pista de llegada (2 m) usada para el entrenamiento previo. De manera similar al laberinto, la pista también se construyó de plástico translúcido y con un suelo cuadriculado conectado para provocar descargas y dificultar la caminata y rodeado por paredes
grises.

Comenzando en el día 1, las ratas recibieron una única inyección i.p. diaria de NaCl 0,9% como solución salina en el grupo control o tartrato de cimserina disuelta en solución salina en dosis de 0,5 y 1,0 mg/kg, lo que continuó en los días 2-5. En los días 3-5 las inyecciones se colocaron 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento.

Comenzando en el día 2, se entrenó a las ratas para esquivar en la pista activamente en un sentido. En cada ensayo, la rata tuvo que dirigirse desde la caja de salida hasta la caja de llegada dentro de 10 segundos para evitar las descargas en las patas (0,8 mA). Las ratas realizaron 10 ensayos en el día 2 y 10 ensayos en el día 3. El entrenamiento terminó cuando la rata alcanzó el criterio de 8 esquives dentro de 10 ensayos consecutivos en un máximo de 30 ensayos. Al día siguiente solo se probaron en el laberinto Stone las ratas que alcanzaron este criterio.

Las ratas recibieron entrenamiento en el laberinto Stone programado como una sesión de 4 ensayos durante la mañana y la tarde en los días 4 y 5. Durante cada ensayo, la rata tuvo que dirigirse desde una caja de salida hasta una caja de llegada a través de cinco segmentos del laberinto separados por puertas guillotina. El plan de contingencia requirió que la rata negociara cada segmento dentro de los 10 segundos para evitar sufrir una ligera descarga en la pata (0,8 mA), que terminaba cuando el animal se movía a través de la puerta hacia el otro segmento. Tras entrar en el siguiente segmento, la puerta del segmento precedente se cerraba para evitar la vuelta hacia atrás. Los errores fueron variable dependientes y se anotaron como desviaciones del camino correcto y se contaron automáticamente por medio de una serie de sensores infrarrojos conectados a un microprocesador. También se anotaron automáticamente los tiempos usados para llegar desde la caja de salida hasta la caja de llegada. Tanto la frecuencia como la duración de las descargas en las patas se anotaron en un reloj operado mecánicamente.

Durante el entrenamiento previo no se observaron efectos por el tratamiento con fármacos. La media (s.e.m.) de esquives para todas las ratas fue 67% (1,7), 65% (2,8), 63% (3,8) y 61% (3,9) para el control, y los grupos con 1, 2 y 3 mg de cimserina, respectivamente. El análisis de varianza ANOVA no reveló diferencias significativas entre los grupos en este parámetro, F(3,40)<1,0.

El tratamiento con cimserina redujo significativamente el número de errores en el laberinto Stone comparado con el control. (Fig. 5). Este efecto fue más importante durante los últimos bloques de entrenamiento y menos eficaz para el grupo con dosis de 3 mg/kg. La confirmación estadística se proveyó en los resultados de un análisis ANOVA de cuatro (grupo con fármaco) por cuatro (bloque de ensayo) con mediciones repetidas en el último factor. Los resultados dieron un efecto de grupo principal significativo, F(3,42) = 3,41, p = 0,03, un efecto de bloque de ensayo principal significativo, F(3,126) = 151,6, p < 0,0001, pero el grupo por interacción de bloque no alcanzó significación estadística F(9,126) = 1,55, p = 0,13. Por lo tanto, se hicieron comparaciones individuales de errores durante todos los ensayos. Solo los grupos tratados con 1 y 2 mg/kg exhibieron mejoras en el rendimiento comparados con el grupo control.

También disminuyeron otras variables de rendimiento (tiempo total, frecuencia y duración de la descarga) en las ratas tratadas con cimserina en un grado menor que el observado para los errores. Los datos para cada variable primero se analizaron con ANOVA de cuatro (fármaco) por cuatro (bloques) con mediciones repetidas en el último bloque. Del análisis no surgieron efectos de los fármacos; sin embargo, la interacción fármaco x bloque fue significativa (p<0.005) en cada uno. Por lo tanto, los datos se analizaron usando comparaciones de pruebas t para los grupos control en cada bloque. Las ratas tratadas con 1,0 mg/kg de cimserina exhibieron reducción significativa del tiempo total, frecuencia y duración de descarga en los bloques 3 y 4 comparados con los controles. En el grupo con 2,0 mg/kg estos parámetros de rendimiento fueron reducidos significativamente en el bloque 4. El grupo con 3,0 mg/kg mostró diferencias significativas solamente en la duración de las descargas en el bloque 4. La duración de las descargas se redujo significativamente también en el bloque 2 en el grupo con 1,0 mg/kg. En resumen, estas variables de rendimiento se afectaron significativamente solo durante lo ensayos tardíos y de manera más importante en el grupo con 1,0 mg/kg. Se detectaron algunos efectos secundarios motores tal como un temblor fino en unas pocas ratas tratadas con dosis de 3 mg/kg; aparte de eso, no se notaron otros efectos secundarios en las ratas tratadas con cimserina.

El tratamiento crónico con cimserina mejoró marcadamente el rendimiento de aprendizaje de las ratas de edad avanzada en el laberinto Stone. Las ratas que recibieron dosis de 1-2 mg/kg de cimserina exhibieron una disminución significativa en los errores así como también mejoras en el rendimiento de otras variables durante los últimos ensayos. Esta respuesta se debió presumiblemente a la neurotransmisión potenciada por la acción de este potente inhibidor de colinesterasa de larga duración.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al descubrimiento de que los inhibidores altamente selectivos de BChE pueden usarse para disminuir la síntesis y secreción de proteína precursora de beta amiloide. La enfermedad de Alzheimer está caracterizada por la deposición de péptido beta amiloide (A\beta) en la forma de amiloide cerebrovascular y placas seniles extracelulares. El constituyente central primario de las placas seniles es el péptido A\beta, una proteína autoagregante de 39 a 43 residuos, que deriva de un grupo de proteínas transmembrana glicosiladas mayores, \beta-APPs, de 695 a 770 aminoácidos. \beta-APP es el origen de péptidos A\beta, conocidos por depositarse en el cerebro de pacientes con AD. Las mutaciones del gen de APP cosegregan con AD en ciertas familias implicando \betaAPP695 a \betaAPP770, algunas de las cuales contienen la familia activa Kunitz del dominio de inhibidor de serinoproteasa (KPI), así como también A\beta y otros fragmentos amiloidogénicos de \beta-APP como centrales en el proceso de la enfermedad. (Selkoe, J. Neuropathol., Exp. Neurol. 53:438-447, 1994). La \beta-APP es procesada/metabolizada por vías proteolíticas alternativas para generar diferentes productos de lisis. Estos incluyen una vía secretoria y una vía lisosomal/endosomal. En la vía secretoria, están implicadas tres secretasas diferentes. En seres humanos, pero no en ratas, la mayor parte de \beta-APP es clivada dentro de la región A\beta por \alpha-secretasa para generar \beta-APP soluble no almiloidogénica, sAPP, que se sabe posee una cantidad de papeles fisiológicos valiosos. Un clivaje alternativo por medio de secretasas, g-secretasa, genera una sAPPg truncada que contiene una secuencia potencialmente amiloidogénica. Esta es la forma producida de preferencia en ratas, y otro clivaje en seres humanos, por una \beta-secretasa postulada, produce la neurotoxina A\beta (Checler, J. Neurochem., 65:1431-1444, 1995).

La síntesis, procesamiento y secreción de \beta-APP y sus derivados tienen lugar in vivo en el cerebro, siendo los productos detectables en el cerebro y en LCR tanto en seres humanos como en modelos animales, y además, tienen lugar in vitro en cultivos celulares, siendo los productos detectables en el medio acondicionado de los cultivos celulares y en los lisados celulares. Los factores que regulan la deposición de A\beta son fundamentales para entender los cambios cerebrovasculares en AD. (Roberson & Harrell, Brain Res. Rev., 25:50-69, 1997). Esta enfermedad también se caracteriza por la pérdida dramática de neuronas colinérgicas que se proyectan hacia el córtex y neuroquímicamente por la disminución de marcadores presinápticos (colina acetil transferasa, ChAT) del sistema colinérgico, particularmente en áreas del cerebro relacionadas con la memoria y el aprendizaje. (Perry, y col., 1978, ibid). Existe una clara relación entre la pérdida de proyecciones colinérgicas hacia el córtex e hipocampo y la síntesis y procesamiento de \beta-APP. (Wallace, y col., PNAS, 98:8712-8716, 1993). Los déficit colinérgicos en AD han sido modelados en ratas por medio de lesiones neurotóxicas en la base del cerebro anterior, siendo la más común la lesión del núcleo basal de Meynert (nbM) (Olton y Wenk, en Psychopharmacology: The Third Generation of Progress (ed, Meltzer) Raven Press, NY, pág. 941-954, 1987). Además, las lesiones colinérgicas del cerebro anterior aumentan significativamente los niveles de ARNm de \beta-APP en el córtex y de \beta-APP secretada, conteniendo toda longitud de A\beta, en el LCR de ratas (Wallace y col., Mol. Brain Res. 10: 173-178, 1991). Tales lesiones en ratas, como la AD en el ser humano, llevan a un sistema colinérgico deplecionado en el córtex de los animales y a trastornos cognitivos con características comunes con la AD (Kesner y col., Behav. Neurosci., 101:451-456, 1987). Además, las lesiones colinérgicas del cerebro anterior aumentan significativamente los niveles de ARNm de \beta-APP en el córtex y de \beta-APP secretada, conteniendo toda longitud de A\beta, en el LCR de ratas (Wallace y col., Mol. Brain Res. 10: 173-178, 1991).

Se investigó en una publicación de Lahiri y col., (ANN.NY. Acad. Science, 828:416-421, 1997) la posibilidad de que el procesamiento de \beta-APP pueda ser regulado por diferentes inhibidores de colinesterasa. Los fármacos con los que se estudiaron los efectos de los inhibidores de colinesterasa en la secreción de formas secretadas de \beta-APP por un número de líneas celulares, por ej. glioblastoma, HeLa, neuroblastoma y PCI2, incluyeron 3,4 diaminopiridina, metrifonato, fisostigmina (compuesto 1, Tabla 1) y tacrina. Los resultados observados condujeron a la afirmación de que tratando células neuronales con tacrina se reguló la secreción de \beta-APP, reduciéndola, mientras que ninguno de los otros fármacos, todos anticolinesterásicos clásicos, produjo un cambio en tal secreción. Se sugirió que cualquier actividad mostrada por estos otros agentes puede ser independiente de su actividad anticolinesterasa. Ninguno de los compuestos usados en estos estudios fue un inhibidor de BChE altamente selectivo.

En otros estudios, se evaluaron las acciones de inhibidores selectivos de AChE (Compuestos 2, 3, (fenserina y tolserina) Tabla 1) e inhibidores selectivos de BChE (Compuesto 4 (cimserina), Tabla 1) frente a líneas celulares de neuroblastoma humano. Se evaluaron los niveles secretados, medidos en el medio acondicionado, y los niveles celulares de \beta-APP, medidos en los lisados celulares, y se compararon con los niveles obtenidos en células sin tratamiento. La cimserina redujo de manera muy importante los niveles celulares de \beta-APP, indicando una síntesis disminuida y, además, redujo los niveles de \beta-APP secretada (Fig. 2).

Un procedimiento que puede usarse para determinar la capacidad de un compuesto seleccionado para regular los niveles de \beta-APP secretados y celulares es el siguiente:

Se cultivan 1 a 1,5 x 10^{7} células de cada tipo (neuronales y no neuronales) en su medio respectivo. Antes de agregar el fármaco, las células se cultivan en medio que contiene solo 0,5% SBF (bajo en suero). Posteriormente se incuban las células en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Tras periodos de incubación de 12 a 48 horas, se recogen los medios acondicionados de cada placa y se centrifugan, los medios y las células a 800 g durante 10 minutos. Se recoge el medio acondicionado y las células lisadas en tampón conteniendo Tris-Cl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, PMSF 2 mM, deoxicolato de sodio 0,5%, 1 \mug/ml de aprotonina, leupeptina y TLCK, 0,1 \mug/ml de pepstatina A. Se centrifugan las células durante 10 minutos a 11.000 g a 4ºC. Se miden las proteínas de la solución sobrenadante (lisado celular) por el procedimiento de Bradford de unión a colorante (Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976).

Para la electroforesis en gel de poliacrilamida y para la inmunotransferencia: en experimentos de control, se usó una concentración equivalente de etanol como vehículo, que es menos del 1% en el medio. Pueden usarse dosificaciones de los compuestos desde aproximadamente 0,15 mM hasta 0,5 mM. Se separan 100 \mul de medio acondicionado o 30 \mug de proteína del lisado celular total en un gel de poliacrilamida al 12% conteniendo SDS (SDS-PAGE). El análisis por inmunotransferencia se llevó a cabo usando un equipo de detección con complejo biotinilado con avidina de Vector Laboratories como describe Lahiri, y col., J. Neurosci: Res. 12:777-787 (1994). El antisuero usado es del clon (anticuerpo monoclonal) mAb22C11 (Boehringer Mannheim) que reconoce todas las formas maduras de \beta-APP encontradas en las membranas celulares así como también formas solubles truncadas en carboxilo secretadas en el medio acondicionado y las proteínas similares a \beta-APP. Además, se usa el mAb6E10m que reconoce los residuos 1 a 28 de A\beta. Para asegurar que los efectos de los fármacos son selectivos para \beta-APP y que no afectas a todas las proteínas sin selectividad, pueden usarse anticuerpos contra proteasa nexina II (PN-II) humana y anti-HSP-70 (un anticuerpo contra proteínas de choque térmico, HSP-70). También se usan anticuerpos secundarios biotinilados, anticuerpos anti ratón de caballo y anti conejo de cabra (Boehringer Mannheim, y Vector Labs). El procedimiento de ensayo anterior se usa para identificar cuál de los inhibidores de BChE altamente selectivos de la presente invención demuestra capacidad para regular la síntesis y secreción de formas celulares y secretadas de \beta-APP, y lo hace cuando se los evalúa con mAb 22C11 y 6E10 para \beta-APP sin afectar otras proteínas secretorias, tales como HSP-70.

La cimserina, un compuesto representativo de los inhibidores de BChE selectivos, además altera la síntesis/procesa-
miento de \beta-APP in vivo. En ratas con lesiones del cerebro anterior colinérgico (núcleo basal de Meynert), los niveles de \beta-APP aumentan inmediatamente y de manera muy importante en el LCR (Fig. 3, grupo control con lesión vs. simulación control), como consecuencia de un sistema colinérgico presináptico deplecionado, como modelo de AD, y disminución de proyecciones colinérgicas hacia centros superiores del cerebro en el córtex y el hipocampo, como se mostró anteriormente (Wallace, y col., 1993 & 1995 ibid). Estudios demostraron que, a diferencia del ser humano, la \beta-APP secretada contiene la longitud total de A\beta, pero no es clivada por la acción secretasa en ratas para producir péptido A\beta tóxico (Wallace y col., J. Neurosci., 15:4896-4905, 1995), y por eso la AD es únicamente del ser humano. Sin embargo, en ratas, el aumento de \beta-APP con la longitud total del péptido A\beta, sirve como modelo de producción aumentada de A\beta en el ser humano.

La administración de cimserina a ratas con lesiones colinérgicas en el cerebro anterior bloquea la elevación de \beta-APP secretada (Fig. 3). Esto está de acuerdo con la acción in vitro de la cimserina en \beta-APP, y adicionalmente demuestra que la cimserina administrada sistémicamente por vía intraperitoneal dos veces al día durante 7 días, puede fácilmente atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro. De hecho, como se muestra en la Fig. 4, la cimserina entra fácilmente y se mantiene en el cerebro en niveles unas 40 veces mayores que en plasma, tras la administración sistémica (1 mg/kg por vía intravenosa). Además, como se muestra en la Fig. 3, la cimserina redujo los niveles de \beta-APP en animales sin lesiones colinérgicas, por ej. en cimserina sola versus ratas control puro.

Un procedimiento que puede usarse para determinar la capacidad de un compuesto seleccionado para regular los niveles de \beta-APP secretados in vivo es el siguiente:

Para producir lesiones del sistema colinérgico del cerebro anterior, las ratas reciben una lesión subcortical unilateral del núcleo basal de Meynert (nbM) usando N-metil-D-aspartato (NMDA) como excitotoxina. Para realizar esto, se anestesia a las ratas y se las coloca en un aparato estereotáctico con la barra de incisión superior a nivel con la línea intra aural. Se hace descender una cánula de infusión de calibre 33 en dos sitios dentro del nbM en un lado del cerebro (AP bregma, ML -2,8 mm, DV -8,0 mm re: cráneo y AP bregma -0,8 mm, ML -3,0 mm, DV -7,8 mm, respectivamente). Se infunde un microlitro de solución de NMDA 50 mM en tampón PBS (pH fisiológico) lentamente en cada sitio. Los controles para la lesión son el vehículo solo y el lado contralateral de los animales tratados con NMDA.

Se recolecta LCR para análisis de los niveles de \beta-APP extrayendo una alícuota desde la cisterna magna de las ratas inmediatamente tras su muerte. Se cuantifica la \beta-APP por medio de análisis de inmunotransferencia usando mAB 22C11.

La determinación de la cinética de la cimserina dependiente del tiempo en plasma y del cerebro en las ratas se lleva a cabo administrando el compuesto en la vena safena de animales anestesiados. Se mata a los animales con exceso de anestesia en tiempos específicos e inmediatamente se toman muestras de sangre y de cerebro. La sangre se centrifuga (10.000 g, 2 min.), se recoge el plasma y, junto con la muestra de cerebro, se almacenan a -80ºC. La cuantificación de las concentraciones de cimserina se lleva a cabo por cromatografía líquida de alto rendimiento.

En otra forma de realización de la presente invención, los inhibidores de BChE altamente selectivos pueden modificarse por introducción de un marcador fluorescente y el reactivo resultante marcado puede usarse en la detección histoquímica de lesiones o estados patológicos asociados con la enfermedad de Alzheimer y otras demencias en cortes de tejidos del cerebro. Puede usarse cualquier marcador fluorescente adecuado conocido en la técnica, tal como por ejemplo, fluoresceína. El derivado marcado del inhibidor de BChE altamente selectivo puede prepararse en una manera conocida per se, tal como, por ejemplo, haciendo reaccionar tal inhibidor con 5-[4,6-diclortriazen-2-il-amino] fluoresceína y el producto de la reacción puede purificarse por medio de procedimientos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, cromatografía en capa fina.

Los derivados de inhibidores de BChE altamente selectivos que pueden usarse para escanear cerebros, particularmente con tomografía por emisión de positrones y tomografía por emisión de fotón único, incluyen los siguientes: compuestos en la Tabla 1 y análogos de los mismos, con mitades adecuadas para proveerlos de fluorescencia o detección para imágenes/cuantificación in vivo o in vitro.

Los siguientes agentes farmacéuticos marcados radiactivamente con las modificaciones adecuadas pueden unirse usando procedimientos bien conocidos en la técnica a cualquier inhibidor de BChE altamente selectivo: talio, tecnecio, iodo^{131} o iodo^{123}, xenón^{133}, kripton^{481}, galio^{67}, indio^{111}, carbono^{11}, nitrógeno^{13} y flúor^{18}. Estos isótopos pueden introducirse, por ejemplo, como equipos fríos y reconstituirse con los químicos adecuados. Los compuestos reconstituidos, tras la administración al paciente, se distribuyen dentro del cuerpo de acuerdo con las propiedades físicas y químicas de los agentes específicos así como la mitad a la que está unido el marcador radiactivo.

Estos agentes pueden usarse para diagnóstico en el cerebro así como también en las áreas periféricas sistémicas del cuerpo; un ejemplo incluye la deposición de amiloide periférico en el bazo, así como en el cerebro en la enfermedad de Alzheimer. La unión de estos agentes radiactivos, usando procedimientos conocidos en la técnica, a moléculas vehículo que atraviesan la barrera hematoencefálica, por ej. cimserina, puede crear agentes de diagnóstico neuropatológico específicos.

Un ejemplo es el uso de pertecnato de tecnecio en la generación de imágenes del cerebro. Este agente, combinado con inhibidores de butirilcolinesterasa altamente selectivos de la presente invención se localizará en ciertas secciones del cerebro tal como el plexo coroideo.

El tipo de agente farmacéutico marcado radiactivamente óptimo tiene la mayor parte de su energía en forma de rayos gamma. El equipamiento diagnóstico usado en medicina nuclear tiene ciertos niveles óptimos de detección de energía. La mayoría de los materiales radiactivos usados para medicina nuclear se producen convirtiendo elementos estables en formas radiactivas. La conversión se lleva a cabo con reactores nucleares o ciclotrones que bombardean el elemento estable con protones o neutrones.

Los avances en detectores sin películas proveen información acerca del número de fotones que inciden en un elemento sensible. Estos datos, combinados con el uso de algoritmos de procesamiento de datos incrementaron el poder de las imágenes médicas. Los dispositivos generadores de imágenes de diagnóstico incluyen Tomografía Computada (CT), Tomografía por Emisión de Positrones (PET), Tomografía Computada por Emisión de Fotón Único (SPC), Angiografía de Substracción Digital (DSA), Imágenes Angiográficas con radiación sincotrónica e Imágenes por Resonancia Magnética (MRI).

Los principales isótopos usados en la generación de imágenes son carbono11, oxígeno^{15} y nitrógeno^{13}. Estos agentes son isótopos pobres en neutrones, emisores de positrones. Se producen con un ciclotrón y se incorporan rápidamente en los compuestos de la presente invención.

Por eso, una forma de realización de este objetivo de la invención son compuestos que exhiben actividad inhibitoria de butirilcolinesterasa altamente selectivos que son preparados incorporando un agente farmacéutico adecuado marcado radiactivamente y por ello proveen un agente adecuado para generar imágenes de pacientes para la detección de presencia de lesiones o estados patológicos asociados con la enfermedad de Alzheimer. Tales agentes pueden introducirse por vías adecuadas conocidas en la técnica. Así, por ejemplo, la mitad carbomil de los inhibidores de butirilcolinesterasa altamente selectivos puede proveerse como una mitad \alpha carbono11 usando los procedimientos generales de Bonnot, J. Label Comp. Radiopharm. 33 [4], 277-284 (1993). Los compuestos resultantes pueden administrarse al paciente por vía parenteral y entrarán al cerebro donde se unirán selectivamente a cualquier lesión o estado patológico y pueden detectarse mediante equipamientos de generación de imágenes adecuados tal como el escáner PET.

Referencias

1. Pei, X. F.; Greig, N. H.; Bi, S.; and Brossi, A. Preparstion and Selective Inhibition of Human Butyrylcholinrsterase by N.sup.1-Phenethylnorphysostigmine Analogues. Med. Chem. Res. 1995, 5, 455-461.

2. Brzostowska, M.; He, X. S.; Greig, N. H.; Rapoport, S. I.; Brossi, A. Phenylcarbamates of (-)-Eseroline,
(-)-N.sup.1Noreseroline and (-)-Physovenol: Selective Inhibitors of Acetyl and, or Butylcholinesterase. Med. Chem. Res. 1992, 2, 238-246.

3. Yu, Q. S.; Atack, J. R.; Rapoport, S.I.; and Brossi, A. Synthesis and Anticholinesterase Activity of (-)-Physostigmine, (-)-Eseramine, and Other N(-)-Substituted Analogues of (-)-Physostigmine. J. Med. Chem. 1997, 31, 2297-2300.

4. He, X. S.; Greig, N. H.; Rapoport, S. I.; Brossi, A. and Li, Y. Q. and Yu, Q. S. Thiaphysovenine and Carbamate Analogues: A Hew Class of Potent Inhibitors of Cholinesterases. Med. Chem. Res. 1992, 2, 229-237.

5. Yu, S. Q.; Liu, C.; Brzostowska, M.; Chrisey, L.; Brossi, A.; Greig, N. H.; Atack, J. R.; Soncrant, T. T.; Rapoport, S. I. and Radunz H. E. Physovenines: Efficient Synthesis of (-)-and (+)-Physovenine and Synthesis of Carbamate Analogues of (-) Physovenine. Anticholinesterase Activity and Analgesic Properties of Optically Active Physovenines. Hel. Cim. Acta 1991, 74, 761-766.

6. Yu, Q. S.; Pei, X. F.; Holloway, H. W.; Greig, N. H.; Brossi, A. Total Syntheses and Anticholinesterase Activities of (3aS)-N(8)-Norphysostigrnine, (3aS)-N(8)-Norphenserine, Their Antipodal Isomers, and Other N(8)-Substituted Analogues. J. Med. Chem. 1997, 40, 2895-2901.

7. Yu, Q. S.; Holloway, H. W, Greig, N. H. and Brossi, A. Syntheses and Anticholinesterase Activities of (3aS)-N(1),N(8)-Norphysostigmine, (3aS)-N(1), N(8)Norphenserine, Their Antipodal Isomers, and Other Potential Metabolites of Phenserine. J. Med. Chem. 1997, 40, 2895-2901.

8. Atack, J. R.; Yu, Q. S.; Soncrant, T. T.; Brossi, A. and Rapoport, S. I. Comparative Inhibitory Effects of Various Physostigmine Analogs Against Acetyl- and Butylcholinesterases. J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 1989, 249, 194-202.

Claims (10)

1. El uso de un inhibidor de butirilcolinesterasa para la fabricación de un medicamento para usar en la prevención o tratamiento de afecciones cognitivas asociadas con el envejecimiento o con la enfermedad de Alzheimer que comprende el tratamiento de un paciente con dicha afección cognitiva o con riesgo de tenerla, con una cantidad eficaz de un inhibidor de butirilcolinesterasa en el que dicho inhibidor de butirilcolinesterasa se selecciona del grupo constituido por N^{8}-bencilnorcimserina; N^{8}-norcimserina; N^{1},N^{8}-bisnorcimserina; N^{1},N^{8}-bisbencilnorcimserina y sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho inhibidor de butirilcolinesterasa se selecciona del grupo constituido por N^{1},N^{8}-bisbencilnorcimserina y sales farmacéuticamente aceptables de la misma.

3. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho inhibidor de butirilcolinesterasa se selecciona del grupo constituido por N^{1},N^{8}-bisnorcimserina y sales farmacéuticamente aceptables de la misma.

4. Un compuesto con la fórmula de N^{8}-bencilnorcimserina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. Un compuesto con la fórmula de N^{8}-norcimserina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. Un compuesto con la fórmula de N^{1},N^{8}-bisnorcimserina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. Un compuesto con la fórmula de N^{1},N^{8}-bisbencilnorcimserina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. El uso de un inhibidor de butirilcolinesterasa para la fabricación de un medicamento para usar en un procedimiento para disminuir la secreción y síntesis de proteína precursora de beta amiloide en líneas celulares o tejidos de origen neuronal, el cual comprende la administración a dichas líneas celulares o tejidos de origen neuronal de una cantidad eficaz de inhibidor de butirilcolinesterasa, en el que dicho inhibidor de butirilcolinesterasa se selecciona del grupo constituido por N^{8}-bencilnorcimserina; N^{8}-norcimserina; N^{1},N^{8}-bisbencilnorcimserina; N^{1},N^{8}-bisnorcimserina y sus sales farmacéuticamente aceptables.

10. El uso de la reivindicación 9 en el que dicho inhibidor de butirilcolinesterasa se selecciona del grupo constituido por N^{1},N^{8}-bisnorcimserina y sales farmacéuticamente aceptables de la misma.