ES2260033T3 - Uso de los inhibidores p38 mapk en efermadades oftalmicas. - Google Patents

Uso de los inhibidores p38 mapk en efermadades oftalmicas.

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ES2260033T3 ES00948576T ES00948576T ES2260033T3 ES 2260033 T3 ES2260033 T3 ES 2260033T3 ES 00948576 T ES00948576 T ES 00948576T ES 00948576 T ES00948576 T ES 00948576T ES 2260033 T3 ES2260033 T3 ES 2260033T3
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Abstract

El uso de un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren glaucoma, neuropatía óptica, neuritis óptica, isquemia retinal, lesiones ópticas inducidas por láser, o vitreoretinopatía proliferativa inducida por cirugía o trauma; un paciente que sufre lesión neuronal o apoptosis que implique las células ganglionares de la retina; o un paciente que sufra un estado médico que provoque estrés nitrosativo u oxidativo a las células ganglionares de la retina por la activación excesiva de receptores aminoácidos excitatorios o la generación de radicales libres.

Description

Uso de los inhibidores p38 MAPK en enfermedades oftálmicas.
La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades del sistema nervioso, entre las que se incluyen aquellas mediadas por el receptor NMDA, por ej. responde al glutamato.
Se ha demostrado que la glicoproteína gp120 del VIH-1, la proteína de recubrimiento del VIH, produce daños neuronales y apoptosis en cultivos celulares de roedores y humanos. Véase, p. ej., Brenneman et al., Nature 335:639-642 (1988); Dreyer et al., Science 248:364-367 (1990); y Müller et al., Eur. J. Pharmacol. 226:209-214 (1992). Los ratones transgénicos que expresaban la gp120 desarrollaron características neuropatológicas con muchas similitudes con la demencia mediada por VIH. Véase Toggas et al., Nature 367:188-193 (1994). A pesar de que el propio FHV-1 no infecta aparentemente las neuronas, puede producirse la transfección del VIH-1 en otras células del cerebro (por ej. macrófagos/microglia) y esto puede conducir a lesiones, daños o muerte neuronal por apoptosis en los cerebros de pacientes con SIDA. Además de afectar a las neuronas del cerebro, la infección por VIH-1 también afecta a otros tipos de células nerviosas, por ej., las células ganglionares de la retina y pueden conducir a la pérdida de la visión.
Los inhibidores de la proteína quinasa activada con mitógenos (MAPK) p38 son bien conocidos y se han propuesto para el tratamiento de una serie de enfermedades específicas. Véase: Nagarkatti, D.S., et al. "Role of p38 MAP Kinase in Myocardial Stress", J Mol Cell Cardiol 30, 1651-1664 (1998); Ma, X.L., et al. "Inhibition of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Decreases Cardiomyocyte Apoptosis and Improves Cardiac Function After Myocardial Ischemia and Reperfusion", American Heart Association Vol. 99, No. 13, 1999, 1685-1691; Lieu, C-H, et al. "Role of Mitogen-activated Protein Kinase in Taxol-Induced Apoptosis in Human Leukemic U937 Cells", Cell Growth & Differentiation Vol. 9, 1998, 767-776; WO 99/00357 Vertex Pharmaceuticals Inc.; WO 98/27098 Vertex Pharmaceuticals Inc.; WO99/61039 Max-Planck-Gesellschaft zur Fórderung der Wissenschaften E.V.; US 6288089 Zawada et al.; y Courtney et al. "CA on STN2, Chemical Abstracts Service, Accession No. 129:14783".
La presente invención propone el uso de los inhibidores de la p38 MAPK en medicamentos para el tratamiento de una serie de enfermedades médicas especificas en las que no se han utilizado previamente dichos inhibidores, particularmente, glaucoma, neuropatía óptica, neuritis óptica, isquemia retinal, daño óptico inducido por láser o vitreoretinopatía proliferativa inducida por cirugía o trauma, lesiones neuronales o apoptosis que impliquen células ganglionares de la retina, o estados médicos que provoquen estrés nitrosativo u oxidativo a las células ganglionares de la retina por la activación excesiva de receptores aminoácidos excitatorios o la generación de radicales libres.
Según un primer aspecto, la presente invención propone usar un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren glaucoma, neuropatía óptica, neuritis óptica, isquemia retinal, lesiones ópticas inducidas por láser o vitreoretinopatía proliferativa inducida por cirugía o trauma; un paciente que sufre lesión neuronal o apoptosis que implique las células ganglionares de la retina; o un paciente que sufra un estado médico que provoque estrés nitrosativo u oxidativo a las células ganglionares de la retina por la activación excesiva de receptores aminoácidos excitatorios o la generación de radicales libres.
Adecuadamente, el inhibidor p38 MAPK es un compuesto con la capacidad de inhibir TNF-a en los modelos conocidos, tales como el modelo que usa células mononucleares de sangre humana periférica que has sido estimuladas con LPS tal y como se describe en Henry et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett. 8:3335-3340 (1998), incorporada a la presente memoria como referencia. Dicha inhibición puede demostrarse con un IC50 de no más de 500 nM en dichos ensayos. El ión de inhibición más fuerte se caracteriza preferiblemente por un IC50 de no más de 100 nM al ser evaluado en dichos ensayos.
En una realización, el inhibidor p38 MAPK es de fórmula (1):
1
A es N ó CR\alpha. Cada R\alpha, Ra, Rb, y Rc, es independientemente, hidrógeno, alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, amida, halo, ciloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo, pudiendo sustituir opcionalmente cada cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo por alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, alquilsulfinilo o halo. Opcionalmente Rc y Rd se unen para formar cicloalquilo, heterocicloalquilo o heteroarilo; cada una de las cuales puede ser sustituida por alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, alquilsulfinilo o halo.
La utilización de la sal del inhibidor p38 MAPK de fórmula (I) está también dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, puede formarse una sal entre un sustituyente amino cargado positivamente (por ej, -N+(CH3)3) con un contraión cargado negativamente (es decir, cloruro, bromuro, nitrato o sulfato). Como otro ejemplo, un sustituyente carboxilato cargado negativamente puede formar una sal con un contraión cargado positivamente tal como ión de sodio, ión de potasio o un ión de magnesio.
En una realización, el inhibidor p38 MAPK es un imidazol (es decir, A es N) siendo Ra hidrógeno, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo (es decir, piperidina; Siendo Rb hidrógeno arilo o heteroarilo (por ej., 4-alquilsulfinilfenil); Siendo Rc hidrógeno, arilo, o heteroarilo (por ej., 4-halofenil); y Rd es 4-piridil.
En otra realización, el inhibidor p38 MAPK es un pirrol (es decir, A es CR\alpha, en donde Ra puede ser hidrógeno, arilo, o heteroarilo). Rc y Rd pueden unirse para formar heteroarilo (es decir, piridina) que puede sustituirse opcionalmente con alquilo, alcoxilo, ariloxilo, amino, o halo (es decir, -OC3 ó NH2).
El inhibidor p38 MAPK puede seleccionarse de entre uno o más de los siguientes: compuestos triariloimidazol o triarilopirrol de SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, PA) tales como el fármaco Smith Kline nº SB 203580 (es decir, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol), SB 202190 (es decir, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol), SB 220025 (es decir, 5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1-(4-piperidinil)-1H-imidazol), el fármaco SmithKline Beecham nº SB 239063, SC 68376 (es decir, 2-metil-4-fenil-5-(4-piridil)oxazol, disponible de Alexis Biochemicals, San Diego, CA), el fármaco francés SmithKline nº SKF-104,351, SKF-86002 (es decir, 6-(4-fluorofenil)-2,3-dihidro-5-(4-piridil)imidazo-[2,1-b]-tiazol); R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Raritan, NJ) fármacos de pirrolopiridina tales como RWJ 68354 (es decir, 6-amino-2-(4-fluorofenil)-4-metoxi-3-(4-piridil)-1H-pirrolo [2,3-b]piridina); fármaco Vertex Pharmaceuticals nº VK-19911 (es decir, 1-(4-piperidinil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)imidazol); o derivados o congéneres de cada uno de los compuestos mencionados.
El paciente tratado sufre de glaucoma u otras neuropatías ópticas tales como neuritis óptica, isquemia retinal, lesión óptica inducida por láser, vitreorretinopatía proliferativa inducida, por ej., por cirugía o trauma; desde lesiones neuronales o apoptosis que implica las células ganglionares de la retina; o desde un estado médico que provoca estrés nitrosativo u oxidativo en las células ganglionares de la retina por la activación excesiva de receptores de aminoácidos excitatorios o la generación de radicales libres.
La apoptosis neuronal puede estar inducida por infección por VIH (por ej. a través de la proteína gp120), una \alpha-quemoquina (es decir, SDF-1), o una combinación de ambas.
En un caso particular, la invención se refiere con el tratamiento del glaucoma. A un paciente que padece glaucoma puede administrársele una cantidad efectiva de un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38. En una realización el inhibidor p38 MAPK es 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol, 4-(4-fluorofenil)-(4-hidroxilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol, 5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1-(4-piperidinil)-1H-imidazol, 2-metil-4-fenil-5(-4-piridil)oxazol, fármaco francés SmithKline nº SKF-104351, 6-(4-fluorofenil)-2,3-dihidro-5-(4-piridil)imidazo-[2,1-b]-tiazol, 6-amino-2-(4-fluorofenil)-4-metoxi-3-(4-piridil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina, o 1-(4-piperidinil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol.
Según se utiliza en la presente memoria, alquilo es una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene 1 a 8 átomos de carbono. Ejemplos de alquilo incluyen sin limitarse a ellas, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutil, tertbutilo, n-pentilo, y 2-metilhexilo.
Por cicloalquilo o se hace referencia a un grupo alquilo cíclico que contiene 3 a 8 átomos de carbono. Alguno ejemplos de cicloalquilo o son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo, y norborailo. Heterocicloalquilo o es un grupo cicloalquilo o que contiene 1-3 heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno o sulfuro. Ejemplos de heterocicloalquilo o incluyen piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofurilo, y morfolinilo.
Según se utiliza en la presente memoria, arilo es un grupo aromático que contiene 6-12 anillo de átomos y que puede contener anillos fusionados, que pueden ser saturados, insaturados o aromáticos. Ejemplos de un grupo arilo incluyen fenilo, naftilo, bifenilo, fenantrilo y antracilo. Heteroarilo es arilo que contiene 1-3 heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno o sulfuro y pueden contener anillos fusionados. Algunos ejemplos de heteroarilo son piridilo, fivanilo, pirrolilo, tienilo, tiazolilo, oxazolilo, imidazolilo, indolilo, benzofuranilo, y benztiazolilo.
Debe tenerse en cuenta que un grupo amino puede estar sin sustituir, monosustituido o disustituido. Puede sustituirse con grupos tales como alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo. Halo se refiere a fluoro, cloro, bromo, o yodo.
Otras características y ventajas resultarán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada.
En los dibujos:
La Fig. 1(A) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, la \beta-quemoquina RANTES, o una combinación de gp120 y RANTES.
La Fig. 1(B) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, la \beta-quemoquina MIP-1\beta, o una combinación de gp120 y MIP-1\beta.
La Fig. 2 es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, las \alpha-quemoquinas SDF-1\beta. (20 nm), SDF-1\beta (50 nm), SDF-1\alpha,(50 nm), y una combinación de gp120 y cada una de SDF-1\beta. (20 nm), SDF-1\beta.(50 nm), y SDF-1\alpha, (50 nm).
La Fig. 3(A) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, el tripéptido TKP, o una combinación de gp120 y TKP.
La Fig. 3(B) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, SDF-1\beta, o una combinación de gp120 y SDF-1\beta.
La Fig. 3(C) es un gráfico de barras de la producción de nitrito (que refleja el óxido nítrico) en presencia de citoquinas o una combinación de TKP y citoquinas.
La Fig. 4(A) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de gp120, el fármaco Smith Kline nº SB 203580, o una combinación de gp120 y SB 203580.
La Fig. 4(B) es un gráfico de barras de apoptosis neuronal en presencia de SDF-1\beta, el fármaco Smith Kline nº SB 203580, o una combinación de SDF-1\beta y SB 203580.
La Fig. 5 es un gráfico en el que se muestran los efectos de la axotomía en la densidad de RGC.
La Fig. 6 es un gráfico de barras en el que se muestra el efecto de SB 203580.
La Fig. 7 es un gráfico de barras en el que se muestra que la inhibición de la actividad de p38 protege los RGC cultivado de la apoptosis inducida por N-metil-D-aspartato (NMDA).
La Fig. 8 es un gráfico de barras en el que se muestra el efecto de MK801 contra la apoptosis in vivo de RGC inducida por axotomía.
En la siguiente descripción detallada se explica que los inhibidores de la quinasa proteína activada por mitógenos (MAPK) p38 han demostrado reducir las lesiones neuronales, daños o muerte, por ej., apoptosis neuronal inducida por transfección por VIH. En base a este trabajo, también se ha demostrado que dichos inhibidores proporcionan un tratamiento eficaz del glaucoma y una serie de enfermedades retinales neurodegenerativas asociadas.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría, un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 protege a las neuronas de lesiones o muerte por apoptosis resultado de una infección por VIH en base a los siguientes descubrimientos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria se incorporan en su totalidad a modo de referencia.
Cultivos cerebrocorticales de rata según
Modelo in vitro de ensayos de apoptosis neuronal
A pesar de que algunas proteínas gp120 de VIH-1 pueden señalar directamente a través de receptores de quemoquina a líneas de células neuronales y a neuronas aisladas de roedores, la importancia de las interacciones célula-célula en las órdenes del cerebro que se enfoque la patogénesis in vitro de la enfermedad en un sistema de cultivo que recapitule el tipo y proporción de células que se encuentran normalmente en el cerebro tales como neuronas, astrocitos y macrófagos/microglia.
El modelo utilizado en los ensayos descritos a continuación, es decir, cultivos cerebrocorticales de rata, preparados a partir de embriones de ratas Sprague-Dawley entre los días 15 y 17 de gestación. Véase Lei et al., Neuron 8:1087-1099 (1992) y Lipton et al., Nature 364:626-632 (1993). Los cultivos se utilizaron en experimentos tras estar 17 a 24 días en cultivo. Dichos cultivos contienen neuronas, astrocitos y macrófagos/microglia, según se determinó con un inmunomarcado específico. Previo a algunos experimentos, se redujeron los macrófagos/microglia o neuronas del cultivo por exposición a 7,5 mM de L-metiléster leucina o 2 mM N-metil-D-aspartato (NMDA), respectivamente. Véase Lipton, NeuroReport 3:913-915 (1992). Se confirmó inmunoquímicamente la ausencia de macrófagos/microglia o neuronas en dichos cultivos, utilizando anticuerpos de ED-1 y la proteína asociada al microtúbulo-2 (MAP-2), respectivamente. En algunos experimentos se utilizó la reacción de Griess para medir los niveles de nitrito en el medio de cultivo como un índice de liberación del óxido nítrico(NO). Véase Chao et al., Glia 16:276-284 (1996).
Ensayos sobre apoptosis neuronal
Se transfirieron los cultivos a solución de sal equilibrada de Earle (BBSS) y se incubó durante 24 horas con gp120, quemoquinas y fragmento 1-3 de Tuftsina, es decir, Thr-Lys-Pro (TKP), inhibidos p38 MAPK SB 203580 (es decir, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)imidazol, Calbiochem, San Diego, CA), o combinaciones de ellos. Se aplicaron quemoquinas o TKP durante 5 minutos y SB 203580 durante 15 minutos antes de su exposición a gp120.
Se obtuvo TKP de Sigma (St. Louis, MO). Recombinante humano MIP-1\beta. SDF-1\alpha, SDF-1\beta, y se adquirió RANTES recombinante de rata de R&D Systems (Minneapolis, WI) y Endogen (Wobum, MA), respectivamente. La glicoproteína de envoltura del VIH-1 gp120 de la cepa SF2 se obtuvo del NIH AIDS Research and Reference Program Reagent Programa, Division of AIDS, NIAID, NIH. Véase Scandella et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1233-1244 (1993). Gp12 adicional de cepas IIIB y RF2 de HTV-1 se obtuvieron de Genentech y del National Cancer Institute, respectivamente. TNF\alpha, IFN\gamma, y IL-1\beta, eran de Genzyme (Cambridge, MA), Gibco BRL (Grand Island, NY) y Endogen (Woburn, MA), respectivamente.
Evaluación de apoptosis neuronal
Se evaluó la apoptosis neuronal en los ensayos anteriormente descritos utilizando una variedad de técnicas, por ejemplo, tinción de células permeabilizadas con yoduro de propidio para determinar la morfología apoptópica y un anticuerpo específico para neuronas (contra NeuN o MAP-2) para identificar el tipo de células. En breve, se fijaron las células durante 5 minutos con acetona helada a -20ºC y, tras tres lavados en PBS, durante 4 minutos con solución de paraformaldehído al 2% (w/v) en PBS a temperatura ambiente (RT). Se permeabilizó las células fijadas con acetonaparaformaldehído utilizando Tween 20 al 0,2 ó Tween 20 en PBS (PBST), y se bloquearon los sitios de unión no específicos mediante incubación durante 1 hora con una solución al 10% de suero de cabra inactivado por calor en PBST. Para teñir específicamente neuronas, se incubaron células durante 4 horas a RT o durante la noche a 4ºC con diluciones 1:500 de anti-MAP-2 (Sigma) o de anticuerpo monoclonal anti-NeuN (AM; Chemicon, Temecula, CA). Sus anticuerpos de isotipo no específico respectivos sirvieron como controles. Tras tres lavados, se incubaron las células en un anticuerpo policlonal secundario (pAb) conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) o a peroxidasa de rábano picante (HRP). En el caso de pAb acoplada a HRP, diaminobenzidina (DAB) sirvió como el sustrato de color desarrollado por incubación en una mezcla de 1 mg/ml DAB y 0,8% H_{2}O_{2} a una proporción de 3:1. Posteriormente se tiñeron los núcleos celulares con 20 mg/ml yoduro de propidio durante 5 minutos a oscuras y se montaron los cubreobjetos en los portaobjetos de cristal. Se replicaron los experimentos al menos 3 veces con valores triplicados en cada experimento. Se juzgó la importancia estadística mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido por una prueba post hoc Scheffé o Bonferroni/Dunn.
\beta-quemoquinas anulan la apoptosis neuronal inducida por gp120; \alpha-quemoquinas inducen apoptosis neuronal
En relación con la Fig. 1(A) y Fig. 1(B), se anuló la apoptosis neuronal inducida por gp120 (200 pM) mediante la presencia de \beta-quemoquinas, es decir, RANTES y MIP-1\beta,(cada uno a 20 nM), mientras que BSA (0,001% =144 nM) y la presencia de \alpha-quemoquinas, es decir, SDF-1\alpha ó SDF-1\beta, (20-50 nM), no redujeron el daño o apoptosis neuronal. De hecho, dichas \alpha-quemoquinas aumentaron la apoptosis neuronal (aproximadamente un aumento de 2 veces la apoptosis neuronal en comparación con el control). Véase la Fig. 2. MIP-1\beta, y RANTES inhibieron el efecto neurotóxico de gp120SF2 de forma indirecta puesto que RANTES se une a los receptores de \beta-quemoquina CCR1, CCR3, y CCR5, y MIP-1\beta, se une a CCR5 (o un homólogo funcional de rata), mientras que gp120SF2 (y SDF-1\alpha/\beta) interactúa con el receptor de \alpha-quemoquina CXCR4. Debe tenerse en cuenta que aunque gp120SF2 también puede interactuar en menor grado con el receptor de el \beta-quemoquina CCR5 en algunas líneas celulares transfectadas, no se ha demostrado que esto suceda en las células primarias, tal y como aquí se utiliza.
Debe señalarse que los cultivos cerebrocorticales de roedores son un sistema modelo adecuado para estudiar estas acciones de gp120 puesto que estas especies expresan homólogos de CXCR4 que, al igual que la CXCR4 humana, pueden mediar la infección por VIH-1 a través de la unión con gp120.
Modo de acción de gp120 y quemoquinas
Para investigar si el efecto neuroprotector de estas \beta-quemoquinas y el efecto neurotóxico de gp120 están mediados por macrófagos, astrocitos, neuronas o mediante la acción simultánea de dos o de los tres tipos de células, se utilizó en el ensayo el tripéptido inhibidor de macrófagos Thr-Lys-Pro (TKP). Se ha demostrado que TKP evita específicamente la activación de macrófagos/microglia y la posterior liberación de sus factores tóxicos tanto in vitro como in vivo, mientras que los péptidos de control no tuvieron efecto alguno. Véase, p. ej., Auriault et al., FEBS Lett. 153:11-15 (1983). En nuestros ensayos, TKP (50 PM) protegió a las neuronas de la apoptosis inducida por gp120. Véase la Fig. 3(A). Por el contrario, la apoptosis neuronal inducida por SDF-1\beta no se anuló con TKP. Véase la Fig. 3(B).
Diversas líneas de pruebas confirmaron informes previos acerca de que TKP ejercía su efecto inhibidor específicamente en macrófagos/microglia, y no en astrocitos o neuronas. Por ejemplo, en ausencia de macrófagos/microglia, TKP no inhibió NINGUNA liberación de los astrocitos activados por citoquina. Véase la Fig. 4(C), y TKP no interfirió en la apoptosis neuronal inducida por NMDA. Estos descubrimientos indican que son necesarios macrófagos activados para la apoptosis neuronal inducida por gp120, pero no en la inducida por \alpha-quemoquina.
El número de células VHI-1 infectadas en el cerebro es relativamente pequeño y las células infectadas productivamente son exclusivamente de linaje monocitoide. Véase Lipton and Gendelman, N. Engl. J. Med. 332:934-940 (1995). Esto sugiere que el VIH-1 inicia un proceso neurodegenerativo que implica la amplificación para producir una lesión CNS pronunciada. En efecto, en sistemas de cultivo de cerebro humano y de roedor, se ha descubierto que los macrófagos y microglia infectados con HTV-1 o estimulados con gp120 contribuyen al proceso neurodegenerativo, al menos en parte, mediante la estimulación excesiva del subtipo NMDA del receptor de glutamato. El hecho de que ratones con gp120 transgénico manifiesten lesiones neuronales similares a las encontradas en cultivos de cerebro humano y de roedor con demencia asociada al VIH indica que, incluso en ausencia del VIH-1 intacto, basta un fragmento del virus para disparar importantes aspectos de esta cascada de amplificación en el proceso neurodegenerativo en nuestro sistema in vitro, lo cual posee relevancia para la patogenicidad en vivo.
La inhibición de la quinasa proteína activada con el mitógeno p38 mejora la apoptosis neuronal inducida gp120 y SDF-1
En otra serie de experimentos, hemos ensayado una serie de inhibidores de cascadas de señalización intracelular para comprobar su capacidad para evitar la apoptosis asociada con gp120. En estos inhibidores se incluyó el fármaco Parke-Davis nº PD 98059 (2 PM) (es decir, 2'-amino-3'-metoxiflavona; Calbiochem, La Jolla, CA) que inhibe la quinasa extracelular regulada (ERK) MAPK, pirrolidina ditiocarbamato (PDTC, 5 PM) que inhibe NF-kB, y SB 203580 (10 PM) que inhibe específicamente p38 MAPK. Entre dichos compuestos, solo SB 203580 atenuó sustancialmente la apoptosis neuronal inducida por gp120SF2. Véase la Fig. 4(A). Esto apoya la conclusión de que la vía p38 MAPK está implicada en la señalización de muerte activada por gp120. La inhibición de p38 MAPK también mejoró la neurotoxicidad SDF-1. Véase la Fig. 4(B). Esto indica que los procesos neurotóxicos iniciados por gp120SF2 y SDF-1 utilizan la vía de señalización MAPK común que implica p38 MAPK. Puesto que se produce neurotoxicidad inducida por SDF-1 en ausencia virtual de macrófagos/microglia, p38 MAPK debe activarse como una respuesta al estrés en neuronas o astrocitos. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que gp120 y SDF-1 también activen p38 en macrófagos/microglia. De hecho, es probable que suceda puesto que los experimentos inmunocitoquímicos realizados en nuestros sistemas de cultivo han revelado p38 activada (difosforilada) en neuronas y macrófagos tras la estimulación de gp120.
Otros inhibidores p38 MAPK
Existen otros inhibidores p38 MAPK que inhiben la vía de señalización de forma similar a SB 203580. En estos inhibidores se incluye triarilimidazol de SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, PA) o compuestos de triarilpirrol tal como el fármaco Smith Kline nº SB 202190 (es decir, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxilfenil)-5-(4-piridil)imidazol), SB 220025 (es decir, 5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1-(4-pipendinil)imidazol), fármaco SmithKline Beecham nº SB 239063, fármaco francés SmithKline nº SKF-104351; R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Raritan, NJ) fármacos de pirrolopiridina tales como RWJ 68354 (es decir, 6-amino-2-(4-fluorofenil)-4-metoxi-3-(4-piridil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina); fármaco Vertex Pharmaceuticals nº VK-19911 (es decir, 1-(4-piperidinil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)imidazol); fármaco Alexis Biochemicals nº SC 68376 (es decir, 2-metil-4-fenil-5-(4-piridil)oxazol); y derivados y congéneres de cada uno de los compuestos mencionados.
Estos inhibidores p38 MAPK pueden elaborarse mediante una serie de métodos diferentes. Por ejemplo, estos inhibidores pueden elaborarse mediante la síntesis de indol de Fisher tal y como se describe en Henry et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8:3335-40 (1998). Véase también Gallagher et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5(1):49-64 (1997) y Henry et al., J. Med. Chem. 22:4196-8 (1998).
Ensayo para el tratamiento del glaucoma
Como modelo para estudiar el tratamiento del glaucoma, se emplearon células ganglionares de la retina dañadas (axotomizadas). Específicamente, la transección del nervio óptico próximo al cuerpo celular provoca muerte apoptópica de las células ganglionares de la retina (RGC), similar a la encontrada en el glaucoma. En ratas adultas, las RGC se marcaron retrógradamente con Fluoro-Gold^{TM} (es decir, hidroxistilbamidina) inyectada en el colículo superior. Pasados tres días, el nervio óptico restante se transeccionó intraorbitalmente a 1 mm del globo. Pasado un día tras la axotomía, no se observó ningún cambio destacable en el patrón de fluorescencia de las RGC en comparación con el de los controles. La densidad de las RGC, evaluada según el número de células marcadas con fluorescencia, empezó a declinar entre 4 y 7 días postaxotomía. Pasados 14 días, se perdió un número sustancial de RGC marcadas con fluorescencia. Morfológicamente, en retinas totalmente montadas teñidas con violeta de cresilo, la capa de células ganglionares (GCL) de las retinas de control sin lesionar no manifestó ningún perfil apoptópico o núcleo picnótico. En contraposición, pasados 10 días tras la axotomía fueron aparentes múltiples cuerpos celulares degenerativos en la GCL, y se observó que la densidad celular de esta capa se había reducido enormemente. Al cuantificar la fluorescencia de hidroxistilbamidina en la GCL, en las retinas de control sin lesionar, la densidad media de RGC fue 2533 \pm 104 células/mm^{2} (media \pm SD). En el transcurso de 14 días tras la axotomía, la densidad RGC media disminuyó a 348 \pm 107 (14% del control). Véase la Fig. 5.
Un día tras la axotomía, se visualizó la p18 activada (difosforilada) en la capa RGC mediante inmunocitoquímica, pero no en las retinas de control. Mediante la prueba de transferencia Western, se detectó la p30 fosforilada en primer lugar pasadas 12 horas tras la axotomía y alcanzó su máximo pasadas 24 horas antes de empezar a disminuir. Se administró SB 203580 intravitrealmente en el momento de la axotomía y se repitió la administración a los 5 y a los 
\hbox{10 días.}
Ensayado pasados 14 días postaxotomía, SB203580 aumentó el número de RGC supervivientes de forma dependiente de la dosis. Véase la Fig. 6. Se observó un grado significativo de neuroprotección tras la inyección de tan poco como 0,2 nmol de SB203580, correspondiente a una concentración intravitreal de 1,6 PM, dado que se ha informado que el volumen del humor vítreo de rata es de \sim120 Pl. SB 203580 (10 nmol) aumentó el número de RGC supervivientes de 348 a 1.347 células/mm^{2}, 14 días postaxotomía (control: 2.511 células/mm^{2}).
Para determinar si la neurotoxicidad de glutamato a través de la activación del receptor NMDA afectaría la apoptosis a través de la vía de señalización p38 en RGC, se examinaron los efectos de SB203580 en la apoptosis in vitro de RGC inducida por NMDA. En cuanto a la Fig. 7, el tratamiento con 1 PM de SB203580 aumentó significativamente la supervivencia de RGC durante una exposición a NMDA capaz de provocar apoptosis. Este descubrimiento sugiere que la activación p38 participa en la apoptosis de RGC mediada por el receptor NMDA.
También se investigó in vivo el efecto del antagonista MK801 del receptor NMDA no competitivo. Se inyectó MK801 en el humor vítreo del mismo modo que con SB 203580. En cuanto a la Fig. 8, MK801 no solo aumentó el número de RGC supervivientes pasados 14 días postaxotomía, sino que también inhibió la fosforilación/activación de p38 en una forma dependiente de la dosis. La adición de SB 203580 a MK801 no ofreció mayor protección que la de MK801 solo en este paradigma.
A continuación se describen los procedimientos detallados para realizar los experimentos mencionados.
Marcado retrógrado de células ganglionares de la retina
Se obtuvieron ratas macho adultas Long-Evans de 200 a 250 g de peso de un criador local y, para todas las manipulaciones del experimento, se anestesiaron con 1-2% de isoflurano y 70% N2O. Se marcaron retrógradamente las RGC con hidroxistilbamidina (sondas moleculares, Eugene, OR, también conocidas como Fluoro-Gold^{TM}) para permitir el recuento preciso de cuerpos celulares tal y como se describe en Vorwerk et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40:813-816. Se anestesiaron las ratas y se colocaron en un pequeño instrumento estereotáctico. Se expuso el cráneo y se mantuvo seco. Se identificó y se marcó el bregma, y se perforó una pequeña ventana sobre el hemisferio derecho, dejando intacta la duramadre. Utilizando un dispositivo de medición estereotáctico y un inyector Hamilton, se inyectó la solución de hidroxistilbamidina en cuatro (4) regiones del colículo superior derecho usando las siguientes coordenadas desde el bregma (anterior-posterior; medio-lateral; profundidad, todas ellas indicadas en mm): (1) -5,8, +1,0, -4,4; (2) -6,5, +0,7, -4,0; (3) -6,5, +1,0, -4,0; y (4) -7,3, +1,5, -3,7.
Axotomía. Se realizó la axotomía del nervio óptico en el ojo izquierdo pasados 4 días tras el marcado retrógrado. Tras la incisión del tejido conjuntivo dorsolateral, se transeccionó el músculo lateral extraocular y se expuso el nervio óptico bajo un microscopio estereoscópico. A continuación se transeccionó el nervio óptico a una distancia de alrededor de 1 mm del bulbo óptico. Durante la operación, debe procurarse evitar dañar el suministro sanguíneo a la retina.
Aplicación del fármaco. Las inyecciones intravitreales se realizaron utilizando una aguja de calibre 33 sujeta a una jeringa de 25 Pl tras la dilatar la pupila con 1% de sulfato de atropina. La punta de la aguja se introdujo a través del limbo dorsal del ojo bajo visualización estereomicroscópica. Las inyecciones se completaron durante un periodo de 1 minuto. Las inyecciones intravitreales de SB 203580 (Calbiochem, San Diego, CA), MK801 (Research Biochemicals International, Natick, MA) o las soluciones de control (como un volumen igual de diluyente salino) se efectuaron en los ojos operados inmediatamente tras la axotomía y se repitieron 5 y 10 días postaxotomía.
Cuantificación de la supervivencia e histología de RGC axotomizada
En diversos momentos, se administró a las ratas una sobredosis de pentobarbital y se extrajeron los ojos. Se diseccionó cuidadosamente la retina del ojo, preparada como un conjunto planto en una solución al 4% de paraformaldehído, y se examinaron las células ganglionares teñidas con un microscopio de epifluorescencia para determinar la densidad. Se determinó el número de RGC supervivientes en las retinas experimentales y de control contando las neuronas marcadas con hidroxistilbamidina en tres áreas estándar del cuadrante de la retina en una sexta parte, la mitad y cinco sextas partes del radio de la retina, para un área total de 2,25 mm^{2} tal y como se describe en Kermer et al., J Neurosci 18:4656-4662 (1998). Los datos de supervivencia RGC de cada grupo de animales se presentan como la densidad media (RGCs/mm^{2}) y la desviación estándar de n = 3 a 6 retinas. La importancia estadística de los datos se determinó mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido por una prueba post-hoc de Dunnett. Para los estudios histológicos, se prepararon conjuntos completos de retinas y se tiñeron según el método de Nissl usando violeta de cresilo (0,1%).
Inmunohistoquímica. Tras la enucleación, se sumergieron los ojos en fijador compuesto de 4% de paraformaldehído en fosfato tamponado salino (PBS; pH 7,4) a 4ºC. Diez minutos más tarde, se hemiseccionaron los ojos en el fijador y se desecho el segmento anterior, la lente y el cuerpo vítreo. Se conservó la parte posterior del globo ocular restante en solución fijadora nueva durante la noche a 4ºC. Se colocó el globo en parafina. Se cortaron secciones de 5 Pm de grosor con un microtomo y se transfirieron a placas de cristal recubiertas de gelatina. Tras rehidratarlas, las secciones se trataron durante 30 min. a temperatura ambiente con metanol para aumentar la permeabilidad de la membrana, seguido de 4% de peróxido de hidrógeno durante hr para bloquear la actividad intrínseca de la peroxidasa. A continuación se incubaron las secciones con 20% de suero de cabra normal (NGS) durante 1 hr. Tras secarlas, las secciones se incubaron durante la noche a 4ºC en PBS con 0,3% de Triton-X 100, 1% de NGS, y uno de los siguientes anticuerpos específicos: 1: 1000 anticuerpos anti-p38\alpha ,(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), 1:250 p38 específica anti-fosfo (New England BioLabs Inc., Beverly, MA), o 1:50 anticuerpo anti-rata ED1(Serotech, UK). A continuación se incubaron las secciones con anti-IgG biotinilado(Sigma Immunochemicals) durante 2 hr a temperatura ambiente. Se efectuó el desarrollo del color con un juego de sustrato Vector AEC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) o un juego Sigma Rapid DAB. Cuando se localizó la inmunoreactividad exclusivamente en el núcleo, fue necesario contrateñido para definir el soma celular, y se usó hematoxilina de Meyer.
Inmunotransferencia. Se homogenizaron las retinas en tampón de muestra de dodecilsulfato (SDS) (2% de SDS, 0,6% de 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 50 mM de Tris, pH 7,2) y se centrifugaron. Tras estimar la concentración de proteínas sobrenadante con un ensayo de proteína de BIO-RAD(Bio-Rad Lab., Hercules, CA), se separaron alícuotas que contenían 70 Pg de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amercham Pharmacia Biotech, UK). A continuación se bloquearon las membranas con 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 137 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl y 0,1% de Tween 20 con 5% de leche desnatada durante 1 hr a temperatura ambiente. Se sondaron las membranas con 1:1500 de anticuerpos anti-p38\alpha, 1:200 de anticuerpos anti-p38\beta (Santa Cruz Biotechnology), o 1: 500 de p38 específico anti-fosfo según las instrucciones del fabricante. Las bandas reactivas al anticuerpo se visualizaron mediante detección quimioluminescente (ECL western detection kit, Amercham Pharmacia Biotech UK, Limited).
Cultivos de células retinales. Se prepararon células retinales de ratas Long-Evans de 6-10 días de edad tal y como se describe en Leifer et al., Science 224:303-306 (1984). En breve, tras la disociación en papaína, se colocaron las células retinales en placas de cristal recubiertas de poli-L-lisina en medio esencial mínimo Eagle. Se identificaron las RGC mediante tinción inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo anti-Thy-1 (2G12), que es específico de las células ganglionares en las células de la retina de las ratas.
Evaluación de la apoptosis inducida por NWDA- en RGC cultivadas. Para inducir apoptosis predominante (Véase Bonfoco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7162-7166 (1995); Dreyer et al., Neuroreport 6:942-944 (1995)), se expusieron los cultivos de células retinales 300 PM NMDA/5 PM de glicina durante 18 hr en medio con calcio elevado (3 mM). Para marcar específicamente las RGC, se incubaron los cultivos con anticuerpo anti-Thy-1 durante 1 hr. Tras 3 lavados con PBS, se incubaron las células en IgG-FITC de cabra-anti-ratón durante 1 hr. Para evaluar la apoptosis, las células retinales se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con 20 Pg/ml de yoduro de propidio durante 5 min, tal y como se describe en Ankarcrona et al., Neuron 15:961-973 (1995). En breve, los cubreobjetos que contenías las células se lavaron una vez con PBS y se permeabilizaron con 85% de metanol durante 10 min. Tras otro lavado con PBS, se fijaron los cubreobjetos en acetona durante 5 min. y posteriormente se tiñeron con yoduro de propidio durante 5 min. en la oscuridad. A continuación se montaron los cubreobjetos en los portaobjetos de vidrio en glicerol:PBS (1:1), y se visualizaron bajo microscopio de epifluorescencia. Se marcaron los núcleos apoptópicos en células que también estaban teñidas con anti-Thy-1, y se expresaban como una fracción del total de RGC. El inhibidor p38 MAPK puede incluirse en un preparado farmacéutico, utilizando un vehículo farmacéutico (por ejemplo, salino fisiológico); la formulación exacta de la mezcla terapéutica depende de la vía de administración, por ejemplo, oralmente, parenteralmente (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea), intravitreal, instilados tópicamente en el ojo, intracerebroventricularmente o intratecalmente.
Ejemplos de formas de administración parenteral incluyen soluciones acuosas del agente activo, en un salino isotónico, 5% de glucosa u otro excipiente conocido farmacéuticamente aceptable. Agentes solubilizantes tales como ciclodextrinas u otros agentes solubilizantes conocidos por los expertos en la técnica, pueden utilizarse como excipientes farmacéuticos para la administración de los compuestos terapéuticos. Para la administración oral, puede formularse la composición del inhibidor p38 MAPK puede formularse en una cápsula, cápsula de gel o un comprimido. Las cápsulas pueden comprender cualquier material farmacéuticamente aceptable estándar tal como gelatina o un derivado de celulosa. Los comprimidos pueden formularse según el procedimiento convencional comprimiendo mezclas de los inhibidores p38 MAPK y un vehículo sólido y un lubricante. Ejemplos de vehículos sólidos incluyen almidón y bentonita de azúcar. El inhibidor p38 MAPK también puede administrarse en forma de un comprimido duro o cápsula que contiene, por ejemplo, lactosa o manitol como aglutinante, un relleno convencional y un agente para comprimir. Para composiciones que vayan a ser administradas a los ojos, pueden utilizarse formulaciones tópicas y pueden incluir conservantes, tensioactivos, potenciadores de la viscosidad, tampones, cloruro sódico y agua oftalmológicamente aceptables para formar soluciones y suspensiones oftálmicas estériles. Una cantidad efectiva de inhibidor p38 MAPK se define como la cantidad de compuesto que, tras su administración a un paciente que la necesita, confiere efecto terapéutico al paciente tratado. La cantidad efectiva que vaya a administrarse a un paciente se basa normalmente en la edad, superficie corporal, peso y estado del paciente La interrelación entre dosis para animales y para humanos (basada en miligramos por metro cuadrado de superficie corporal) se describe en Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219. El área de superficie corporal puede determinarse aproximadamente a partir de la altura y peso del paciente. Véase, p. ej., Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537. Una cantidad efectiva de un inhibidor p38 MAPK puede oscilar desde alrededor de 1-10.000 mg/kg (es decir, aprox. 1-500 mg/kg). Las dosis efectivas también variarán, tal y como podrán apreciar los expertos en la material, en función de la ruta de administración, la utilización de excipientes y de la posibilidad de coutilización con otros tratamientos terapéuticos.

Claims (10)

1. El uso de un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren glaucoma, neuropatía óptica, neuritis óptica, isquemia retinal, lesiones ópticas inducidas por láser, o vitreoretinopatía proliferativa inducida por cirugía o trauma; un paciente que sufre lesión neuronal o apoptosis que implique las células ganglionares de la retina; o un paciente que sufra un estado médico que provoque estrés nitrosativo u oxidativo a las células ganglionares de la retina por la activación excesiva de receptores aminoácidos excitatorios o la generación de radicales libres.
2. El uso según la Reivindicación 1, en donde el inhibidor p38 MAPK es de la siguiente fórmula:
2
donde
A es N ó CR\alpha, y
cada R\alpha, Ra, Rb, y Rc, es independientemente, hidrógeno, alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, amida, halo, ciloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo, pudiendo sustituir opcionalmente cada cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo por alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, alquilsulfinilo o halo; Rc y Rd se unen opcionalmente para formar cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, cada uno de los cuales puede sustituirse opcionalmente con alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tio, amino, amida, carboxilo, éster, alquilsulfinilo, o halo; o sales de ellos.
3. El uso según la Reivindicación 2, en donde A es N, y Ra es hidrógeno, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo.
4. El uso según la Reivindicación 2, en donde A es N, y Rb es hidrógeno, arilo, o heteroarilo.
5. el uso según la Reivindicación 4, en donde Rb es fenilo, sustituido en la posición 4 con alcoxilo, alquilsulfinilo, halo, o amino.
6. El uso según la Reivindicación 2, en donde A es N, y Rc es hidrógeno, arilo, o heteroarilo.
7. El uso según la Reivindicación 6, en donde Rc es es fenilo, sustituido con alcoxilo, alquilsulfinilo, halo, o amino.
8. El uso según la reivindicación 2, en donde A es N y Rd es 4-piridil, preferiblemente sin sustituir.
9. El uso según la Reivindicación 2, en donde A es CR\alpha, y Rc y Rd se unen para formar heteroarilo que puede sustituirse opcionalmente con alquilo, alcoxilo, ariloxi, amino, o halo.
10. El uso según la Reivindicación 1, en donde el inhibidor p38 MAPK es 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol, 5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1-(4-piperidinil)-1H-imidazol, 2-metil-4-fenil-5(-4-piridil)oxazol, fármaco francés SmithKline nº SKF-104351, 6-(4-fluorofenil)-2,3-dihidro-5-(4-piridil)-imidazo-[2,1-b]-tiazol, 6-amino-2-(4-fluorofenil)-4-metoxi-3-(4-piridil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina, o 1-(4-piperidinil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol.
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