ES2255283T3 - Archivo de vectores. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir una o más células que contienen uno o más vectores que comprenden: a) poner en contacto un medio o soporte sólido con célula(s) huésped que llevan uno o más vectores para obtener un medio o soporte sólido que comprende uno o más vectores; y b) transformar o transfectar una o más células con dicho uno o más vectores mediante: (i) poner en contacto dicho medio o soporte sólido con dichas una o más células; o (ii) poner en contacto dichas una o más células con uno o más vectores obtenidos a partir del medio o soporte sólido; (i) en el que dicho medio o soporte sólido es una matriz la cual protege contra degradación de ácido nucleico incorporado sobre la matriz en la que dicha matriz comprende, una matriz absorbente basada en celulosa o papel o una micromalla de material plástico sintético, y/o (ii) una composición que comprende una base débil, un agente quelante, un tensioactivo aniónico o un detergente aniónico, en la que dicha composición se absorbe en o se incorpora dentro de dicha matriz.
Description
Archivo de vectores.
La presente invención se refiere a un medio o
soporte sólido para usar en el almacenaje (preferiblemente el
almacenaje a largo plazo) de ácidos nucleicos (por ejemplo DNA y
RNA, RNA ribosomal y RMA mensajero), particularmente uno o más
vectores y especialmente uno o más plásmidos, y a procedimientos los
cuales comprende el uso de este medio o soporte sólido. En
particular, la invención se refiere a un procedimiento para
almacenaje y transporte de tales ácidos nucleicos o vectores en el
medio sólido, igual que a procedimientos los cuales implican bien
recuperación o bien purificación de los ácidos nucleicos o vectores
del medio sólido, o bien el uso o manipulación de los ácidos
nucleicos o vectores obtenidos a partir de o contenidos por o sobre
el medio sólido. Tal uso o manipulación incluye, por ejemplo,
digestión (por ejemplo, con una o más nucleasas, exonucleasas o
endonucleasas tales como enzimas de restricción), síntesis (por
ejemplo, con una o más polimerasas y/o transcriptasas reversas),
amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa con
una o más polimerasas), secuenciación (por ejemplo con una o más
polimerasas), o transformación o transfección en una o más células
huésped usando, por ejemplo, células químicamente competentes o
electrocompetentes o usando reactivos y técnicas de transfección
conocidos. El medio o soporte preferido es una matriz la cual
protege contra degradación de ácido nucleico incorporado en la
matriz. Una matriz tal puede comprender una matriz basada en
celulosa absorbente o papel, o una micromalla de material plástico
sintético tal como aquellos descritos en la Patente de los Estados
Unidos Nº.: 5.496.562. Preferiblemente, la matriz comprende una
composición que comprende una base débil, un agente quelante, un
tensioactivo aniónico o un detergente aniónico, y opcionalmente
ácido úrico o una sal urato, en los que dicha composición se
absorbe sobre o se incorpora dentro de dicha matriz. El papel FTA™ y
derivados, variantes y modificaciones del mismo están incluidos
entre tales soportes.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
medio o soporte sólido tal para usar en el muestreo, purificación
y/o análisis de uno o más DNA no cromosómicos (por ejemplo
mitocondrias, cloroplastos, F') y a procedimientos los cuales
comprenden el uso de este medio o soporte sólido para tales
propósitos.
Para muchos proyectos, la generación de numerosas
muestras de DNA a partir de especímenes biológicos es rutina.
Manejar y archivar una gran colección puede llegar a ser un problema
logístico para el laboratorio. Una solución, usada en laboratorios
forenses, es el medio de almacenamiento de sangre tarjetas FTA™. Una
tarjeta FTA™ almacena DNA genómico en forma de gotas secas de
sangre completa humana, las células de las cuales se lisan sobre el
papel. Almacenado a temperatura ambiente, se comunica que DNA
genómico en papal FTA™ es estable al menos 7,5 años (Burgoyne, y
col., Conventional DNA Collection and Processing Disposable
Toothbrushes and FTA™ Paper as a Non-theating
Buccal-Cell Collection Kit Compatible with
Automatable DNA Processing, 8º Simposio Internacional sobre
Identificación Humana, 17 al 20 de septiembre, 1997). Antes de
análisis del DNA captado, unas pocas etapas simples de lavado
eliminan los productos químicos estabilizados y los inhibidores
celulares de reacciones enzimáticas. Dado que el DNA permanece con
el papel, las manipulaciones para purificar el DNA se simplifican y
son susceptibles de automatización. Las muestras de DNA en tarjetas
FTA™ ofrecen un sistema de archivos muy compacto comparado con
viales de vidrio o tubos de plástico situados en sitio muy
congelado.
Los DNA bacterianos esparcidos en tarjetas FTA™
pueden ser un sistema eficaz para almacenar y también recuperar.
Recientemente, Rogers y Burgoyne caracterizaron mediante ribotipado
con PCR muestras de cultivos de diversas cepas de bacterias de
Staphylococcus y E. coli almacenadas en tarjetas FTA™
(Rogers y col., (1997) Anal. Biochem. 247: 223).
Adicionalmente, el plásmido de DNA purificado se recuperó
eficientemente después de esparcirse sobre papel tratado, sin
embargo, el encerramiento del papel en poliestireno se usó para
almacenamiento (Burgoyne, Patente de los Estados Unidos
5.496.562).
De acuerdo con la presente invención,
cualesquiera ácidos nucleicos (por ejemplo RNA y DNA y en particular
vectores de RNA y DNA) se pueden archivar y más tarde recuperar y/o
manipular mediante un procedimiento simple y eficaz en el cual el
huésped que lleva el uno o más ácidos nucleicos o vectores se pone
en contacto con un medio sólido (preferiblemente papel FTA™ o
derivados, variantes o modificaciones del mismo), sin la necesidad
de encerrar el soporte o usar coberturas protectoras (tales como
poliestireno) para almacenar los ácidos nucleicos o vectores. Así,
la invención evita la necesidad de usar disolventes orgánicos o
productos químicos fuertes para eliminar tales coberturas
protectoras antes de que pueda tener lugar uso, manipulación,
purificación o aislamiento de las moléculas o vectores de ácidos
nucleicos. En otro aspecto, las moléculas o vectores de ácidos
nucleicos purificados se pueden usar, aunque en un aspecto
preferido, las preparaciones crudas (preparaciones de vectores no
purificadas) que contienen la una o más moléculas de ácido nucleico
o vectores se pueden poner en contacto con el medio o soporte
sólido. Así, la invención proporciona procedimientos para aislar y/o
purificar moléculas de ácido nucleico o vectores a partir de
cualquier muestra que contenga uno o más vectores tales como
células huésped, virus, placas virales, y/o preparaciones en bruto a
partir de materiales biológicos (tales como células huésped o
extracto de virus, lisados, restos, hidrolisados, y similares).
Tales moléculas o vectores de ácidos nucleicos aislados y/o
purificados obtenidos a partir de o contenidos por el soporte
sólidos o matriz se pueden usar o manipular en una o más técnicas
estándar de biología molecular tales como reacciones de digestión,
secuenciación, amplificación, síntesis y
transformación/transfección. En un aspecto particularmente
preferido, una o más células huésped que contienen las moléculas o
vectores de ácidos nucleicos para aislarse, almacenarse y/o
manipularse pueden ponerse en contacto directamente con el medio o
soporte. De acuerdo con la presente invención, se pueden usar los
cultivos de células huésped o colonias de placas. Las células
huésped preferidas para usar en la invención incluyen células
huésped procariotas y eucariotas, particularmente bacterias gram
positivas y gram negativas tales como Escherichia,
Streptomyces, Pseudomonas y similares.
Otras realizaciones preferidas de la presente
invención serán patentes para alguien de habilidad ordinaria a la
luz de lo que se conoce en la técnica, a la luz de los siguientes
dibujos y a la descripción de la invención, y a la luz de las
reivindicaciones.
El documento WO 96/39813 describe un medo sólido
seco para almacenar material genético en una forma adecuada para
análisis subsiguientes. El medio sólido seco incluye una matriz
sólida seca y una composición que incluye una agente
desnaturalizador de la proteína, y un agente quelante.
Figura 1 es un análisis de PCR de DNA genómico
bacteriano en una tarjeta FTA™. El análisis de gel de agarosa de
los productos de amplificación representados se muestra como sigue:
carriles 1-3: cepa LBA4404 de Agrobacter
tumefaciens; carriles 4-6: cepa EHA101 de
Agrobacter tumefaciens; carriles 7-9: cepa
DH10B de E. coli; carriles 10-12:
Streptomyces coelicolor; carriles 13-15:
S. lividans; y carriles 16-18: S.
paralus. Los estándares de tamaño molecular son una Escalera de
Low DNA Mass™ (M1) y una Escalera de DNA de 1 Kb (M2).
Figura 2 es un análisis de PCR de DNA plasmídico
de E. coli (DH10B) en una tarjeta FTA™.
Figura 3 es un análisis de PCR de DNA plasmídico
y genómico de Saccharomyces cerevisiae en una tarjeta
FTA™.
En la descripción que sigue, se utilizan
extensivamente un número de términos usados en los campos de
tecnología de biología molecular y DNA recombinante. Con el fin de
proporcionar una comprensión aclaratoria y consistente de la
especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance para darse
tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
Amplificación. Como se usa en el presente
documento, "amplificación" se refiere a cualquier procedimiento
in vitro para incrementar el número de copias de una
secuencia nucleotídica con el uso de una polimerasa. La
amplificación de ácidos nucleicos da como resultado la incorporación
de nucleótidos dentro de una molécula de ácido nucleico (por
ejemplo, DNA) o cebador que forma de este modo una nueva molécula de
ácido nucleico complementaria a la plantilla de ácido nucleico. La
molécula de ácido nucleico formada y su plantilla se pueden usar
como plantillas para sintetizar moléculas de ácido nucleico
adicionales. Como se usa en el presente documento, una reacción de
amplificación puede consistir en muchas rondas de síntesis de ácidos
nucleicos. Las reacciones de amplificación incluyen, por ejemplo,
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Una reacción de PCR
puede constar de 5 a 100 "ciclos" de desnaturalización y
síntesis de una molécula de ácido nucleico.
Las polimerasas (incluyendo DNA polimerasas y RNA
polimerasas) útiles de acuerdo con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, DNA polimerasa de Thermus thermophilus
(Tth), DNA polimerasa de Thermus acuaticus (Taq), DNA
polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne), DNA polimerasa de
Thermotoga marítima (Tma), DNA polimerasa de Thermococcus
litoralis (Tli o VENT™), DNA polimerasa de Pyrococcus
furiosus (Pfu), DNA polimerasa de DEEPVENT™, DNA polimerasa de
Pyrococcus woosii (Pwo), DNA polimerasa de Bacillus
sterothermophilus (Bst), DNA polimerasa de Bacillus
caldophilus (Bca), DNA polimerasa de Sulfolobus
acidocaldarius (Sac), DNA polimerasa de Thermoplama
acidophilum (Tac), DNA polimerasa de Thermus flavus
(Tfl/Tub), DNA polimerasa de Thermus ruber (Tru), DNA
polimerasa de Thermus brockianus (DINAZYME™), DNA polimerasa
de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth), DNA polimerasa
de Mycobacterium (Mtb, Mlep), y mutantes, y variantes y
derivados de los mismos. RNA polimerasas tales como T3, T5 y SP6 y
mutantes, variantes y derivados de las mismas se pueden usar
también de acuerdo con la invención.
Las polimerasas usadas de acuerdo con la
invención pueden ser cualquier enzima que pueda sintetizar una
molécula de ácido nucleico a partir de una plantilla de ácido
nucleico, típicamente en la dirección 5'-3'. Las
polimerasas de ácidos nucleicos usadas en la presente invención
pueden ser mesófilas o termófilas, y preferiblemente son
termófilas. Las DNA polimerasas mesófilas preferidas incluyen DNA
polimerasa de T7, DNA polimerasa de T5, fragmento Klenow de la DNA
polimerasa, DNA polimerasa III y similares. Las DNA polimerasas
termoestables preferidas que se pueden usar en los procedimientos
de la invención incluyen DNA polimerasas Taq, Tne, Tma, Pfu,
Tfl, Tth, fragmento Stoffel, VENT™ y DEEPVENT™, y mutantes,
variantes y derivados de los mismos (patente de los Estados Unidos
Nº.: 5.436.149; patente de los Estados Unidos Nº.: 4.889.818;
Patente de los Estados Unidos 4.965.188; patente de los Estados
Unidos Nº.: 5.079.352; patente de los Estados Unidos Nº.: 5.614.365;
patente de los Estados Unidos Nº.: 5.374.553; patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.270.179; patente de los Estados Unidos Nº.:
5.047.342; patente de los Estados Unidos Nº.: 5.512.462; documento
WO 92/06188; documento WO 92/06200; documento WO 96/10640; Barnes
W.N., Gene 112: 29-35 (1992); Lawyer, F.C., y
col., PCR Meth. Appl. 2: 275-287 (1993);
Flaman, J-M, y col., Nucl. Acids Res. 22(15):
3259-3260 (1994)). Para amplificación de moléculas
de ácido nucleico largas (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico
más largas que aproximadamente 3-5 Kb en longitud),
se usan típicamente al menos dos DNA polimerasas (una carece
sustancialmente de actividad 3' exonucleasa y la otra tiene
actividad 3' exonucleasa). Véase patente de los Estados Unidos Nº.:
5.436.149; y patente de los Estados Unidos Nº.: 5.512.462; Barnes
W.N., Gene 112: 29-35 (1992), las
descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento
en sus totalidades. Ejemplos de DNA polimerasas que carecen
sustancialmente de actividad exonucleasa 3' incluyen, pero no se
limitan a, Taq, Tne(exo^{-}), Tma(exo^{-}),
Pfu(exo^{-}), Pwo(exo^{-}) y polimerasas de DNA
Tht, y mutantes, variantes y derivados de las mismas.
Huésped. Cualquier célula procariota o
eucariota que es receptora de un vector de expresión replicable o
vector de clonación. Los términos "huésped" o "célula
huésped" se pueden usar intercambiablemente en el presente
documento. Para ejemplos de tales huéspedes, véase Maniatis y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982). Los huéspedes
procarióticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, bacterias
de los géneros Escherichia (por ejemplo, E. coli),
Bacillus, Staphylococcus, Agrobacter (por ejemplo
Agrobacter tumefaciens), Streptomyces, Pseudomonas,
Salmonella, Serratia, Caryophanon, etc. El huésped procariota
más preferido es E. coli. Los huéspedes bacterianos de
interés particular en la presente invención incluyen E. coli
K12, DH10B, DH5\alpha y HB101. Los hospedadores eucariotas
preferidos incluyen, pero no se limitan a, hongos, células de pez,
células de levaduras, células de plantas y células animales. Las
células animales particularmente preferidas son células de insecto
tales como células de Drosophila, células de
Spodoptera Sf9 y Sf21 y células
"High-Five" de Trichoplusa; células de
nematodos tales como C. elegans; y células de mamífero tales
como células COS, células CHO, células VERO, células 293, PERC6,
células BHK y células humanas.
Vector. Un vector es una molécula de ácido
nucleico (preferiblemente DNA) capaz de replicación autónoma en una
célula huésped. Tales vectores se pueden caracterizar también por
tener un pequeño número de sitios de endonucleasas de restricción
en secuencias tales a las cuales se puede cortar sin pérdida de su
función biológica esencial y dentro de las cuales se pueden unir
mediante "splicing" moléculas de ácido nucleico para ocasionar
su replicación y clonación. Ejemplos incluyen plásmidos, secuencias
de replicación autónoma (ARS), centrómeros, cósmidos y fagémidos.
Los vectores pueden proporcionar adicionalmente sitios cebadores,
por ejemplo, para PCR, sitios de iniciación y/o regulación
transcripcional y/o traduccional, señales de recombinación,
replicones, etc. El vector puede contener adicionalmente uno o más
marcadores seleccionables adecuados para usar en la identificación
de células transformadas o transfectadas con el vector, tales como
kanamicina, tetraciclina, amplicilina, etc.
De acuerdo con la invención, se puede usar
cualquier vector. En particular, los vectores conocidos en la
técnica y aquellos comercialmente disponibles (y variaciones y
derivados de los mismos) se pueden usar de acuerdo con la
invención. Tales vectores se pueden obtener, por ejemplo, de Vector
Laboratories Inc., InVitrogen, Promega, Novagen, NEB, Clontech,
Boehringer Mannheim, Pharmacia, EpiCenter, OriGenes Technologies
Inc., Stratagene, Perkin Elmer, Pharmigen, Life Technologies, Inc.,
y Research Genetics. Tales vectores pueden entonces por ejemplo
usarse para clonar subclonar moléculas de ácidos nucleicos de
interés. Las clases generales de vectores de particular interés
incluyen vectores de clonación procariotas y/o eucariotas, vectores
de expresión, vectores de fusión, vectores del ensayo de doble
híbrido o vectores del ensayo de doble híbrido reverso, vectores
lanzadera para usar en diferentes huéspedes, vectores de
mutagénesis, vectores de transcripción, vectores para recibir
grandes insertos y similares.
Otros vectores de interés incluyen vectores de
origen viral (vectores M13, vectores de fagos \lambda
bacterianos, vectores de baculovirus, vectores de adenovirus, y
vectores de retrovirus), vectores de número de copias alto, bajo y
ajustable, vectores los cuales tienen replicones compatibles para
usar en combinación en un huésped único (pACYC184 y pBR322) y
vectores de replicación episomal eucarióticos (pCDM8).
Los vectores particulares de interés incluyen
vectores de expresión eucarióticos tales como pcDNA II, pSL301,
pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHisA, B, y C, pRSet A, B, y C
(Invitrogen, Inc.), pGMEX-1, y
pGEMEX-2 (Promega, Inc.), los vectores pET
(Novagen, Inc.), pTrc99A, pKK223-3, los vectores
pGEX, pEZZ18, pRIT2T, y pMC1871 (Pharmacia, Inc.),
pKK233-2 y pKK388-1 (Clontech,
Inc.), y pProEx-HT (Life Technologies, Inc.) y
variantes y derivados de los mismos. Los vectores pueden también
ser vectores de expresión eucariota tales como pFastBac, pFastBac
HT, pFastBac DUAL, pSFV, y pret-Splice (Life
Technologies, Inc.), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo,
pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA y pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL,
pMSG, pCH110, y pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS,
pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, y pOG44 (Stratagene, Inc.), y
pYES2, pAC360, pBlueBacHis A, B, y C, pVL1392, pBsueBacIII, pCDM8,
pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3, pREP4, pCEP4, y pEBVHis (Invitrogen, Inc.) y
variantes o derivados de los mismos.
Otros vectores de interés particular incluyen
pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, cósmidos, fagémidos, fórmidos
(pFOSI), YAC (cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas
artificiales de bacterias), pBAC108L, pBACe3.6, pBeloBAC11
(Research Genetics), PAC, P1 (fago de E. coli), pQE70, pQE60,
pQE9 (Qiagen), vectores pBS, vectores PhageScript, vectores
BlueScript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3
(InVitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5,
pET-9, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORT1,
pSPORT2, pCMVSPORT2.0, pSV-SPORT1 (Life
Technologies, Inc.), y los vectores descritos en la Solicitud
Provisional de Patente Nº.: 60/065.930, presentada el 24 de octubre
de 1997.
Vectores adicionales de interés incluyen pTrxFus,
pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2,
pcDNA3.1/His, pcDNA3-1(-)/Myc-His,
pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO2815, pPICZ, pPICZ\alpha,
pGAPZ, pGAPZ\alpha, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5,
pSinHis, pIND, pIND(SPI), pVgRXR, pcDNA2.1,
pYES2, pZErO1.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR\cdot3.1-Uni, y pCRBac de Invitrogen; \lambdaExCell, \lambda gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1\lambdaT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, y pUC4K de Pharmacia; pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32 LIC, pET-30 LIC, pBAC-2p LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, \lambdaSCREEN-1, \lambdaBlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-, pET-17xb, pET19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET23-abcd(+), pET24-abcd(+), pET25b(+), pET26b(+), pET27b(+),
pET28-abc(+), pET29-abc(+), pET30-abc(+), pET31-abc(+), pET32-abc(+), pET33-abc(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg y Selecta Vecta-Gtp de Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Básico, pSEAP-Contral, pSEAP2-Promotor, pSEAP-Potenciador, p\betagal-Básico, p\betagal-Control, p\betagal-Promotor, p\betagal-Potenciador, pCMV\beta, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, p-Retro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLXCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAM-neo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX 43T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, \lambdagt10, \lambdagt11, pWE15, y Triples \lambda de Clontech, Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pWE15, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo, pMC1neo Poli A, pOG44, pOG45, pFRT\betaGAL, pNEO\betaGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, y pRS416 de Stratagene, y derivados o variantes del mismo.
pYES2, pZErO1.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR\cdot3.1-Uni, y pCRBac de Invitrogen; \lambdaExCell, \lambda gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1\lambdaT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, y pUC4K de Pharmacia; pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32 LIC, pET-30 LIC, pBAC-2p LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, \lambdaSCREEN-1, \lambdaBlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-, pET-17xb, pET19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET23-abcd(+), pET24-abcd(+), pET25b(+), pET26b(+), pET27b(+),
pET28-abc(+), pET29-abc(+), pET30-abc(+), pET31-abc(+), pET32-abc(+), pET33-abc(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg y Selecta Vecta-Gtp de Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Básico, pSEAP-Contral, pSEAP2-Promotor, pSEAP-Potenciador, p\betagal-Básico, p\betagal-Control, p\betagal-Promotor, p\betagal-Potenciador, pCMV\beta, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, p-Retro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLXCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAM-neo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX 43T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, \lambdagt10, \lambdagt11, pWE15, y Triples \lambda de Clontech, Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pWE15, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo, pMC1neo Poli A, pOG44, pOG45, pFRT\betaGAL, pNEO\betaGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, y pRS416 de Stratagene, y derivados o variantes del mismo.
Vectores de doble híbrido y vectores de doble
híbrido reverso de interés particular incluyen pPC86, pDBLeu,
pDBTrp, pPC97, p2.5, pGADI-3, pGAD10, pACt, pACT2,
pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9,
pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi,
pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202,
pJG4-5, pNLexA, pYESTrp y variaciones o derivados
de los mismos.
Almacenaje. Como se usa en el presente
documento, "almacenaje" se refiere a mantener los
soportes/vectores durante un periodo de tiempo a una temperatura o
temperaturas de interés. Preferiblemente, al almacenaje se lleva a
cabo a aproximadamente 20-30ºC (preferiblemente a
temperatura ambiente, por ejemplo 25ºC), pero puede ser a
temperaturas más altas o a más bajas dependiendo de la necesidad.
Las temperaturas de almacenaje bajas pueden variar entre
aproximadamente 0-20ºC, -20-0ºC, y
-80- -20ºC. El almacenaje a largo plazo en concordancia con la
invención es mayor de un año, preferiblemente mayor de 2 años, aún
más preferiblemente mayor de 3 años, aún más prefe-
riblemente mayor de 5 años, aún más preferiblemente mayor de 10 años, y lo más preferiblemente mayor de 15 años.
riblemente mayor de 5 años, aún más preferiblemente mayor de 10 años, y lo más preferiblemente mayor de 15 años.
Otros términos usados en los campos de tecnología
de DNA recombinante y biología molecular y celular y biología
celular como se usan en el presente documento se entenderán
generalmente por alguien de habilidad normal en las técnicas
aplicables.
Se entenderá por alguien de habilidad normal en
las técnicas relevantes que otras modificaciones y adaptaciones
adecuadas a los procedimientos y aplicaciones descritos en el
presente documento y fácilmente patentes a partir de la descripción
de la invención contenida en el presente documento en vista de
información conocida para el técnico de habilidad normal, y se
puede hacer sin salir del alcance de la invención o alguna
realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente
invención en detalle, se entenderá más claramente la mima mediante
referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen
adjuntos sólo para propósitos de ilustración y no se desea que sean
limitantes de la invención.
Todos los reactivos fueron de Life Technologies,
Inc. Rockville, Maryland, a menos que se haga notar lo
contrario.
Preparaciones de Muestras en una tarjeta
FTA™. A partir de cultivos de bacterias crecidos durante toda
una noche, se esparcieron 5 \mul en ubicaciones distintas sobre
una tarjeta FTA™ (Cat. Nº.: 10786) y se dejó secar durante toda una
noche a temperatura ambiente. Las colonias de bacterias de placas
de Petri se esparcieron sobre una tarjeta FTA™ suspendiendo una
colonia en 5 \mul de PBS, aplicando el volumen completo como una
mancha única, después dejando secar al papel durante toda una noche
a temperatura ambiente.
Para el DNA genómico de levaduras y los DNA de
plásmidos de levaduras (de doble híbrido), se obtienen placas las
cuales tienen diversas colonias de cada 2 cepas control de doble
híbrido (ProQuest, Cat. Nº.: 10835-023). Para cada
placa, se toman diversas colonias individuales. Cada colonia
individual se suspendió en 5 \mul de PBS y cada alícuota de 5
\mul se esparció en gotas individuales sobre una tarjeta FTA™.
Usando un Aparato HARRIS MICRO PUNCH™ con
esterilla, se tomó una muestra tomada por punción de 2 mm de una
mancha de bacterias o levaduras secada (\sim6 mm de diámetro),
después se lavó con Reactivo de Purificación de FAT™ (Cat. Nº.:
10876) y tampón TE de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. La muestra tomada por punción lavada se secó al aire
durante 1 hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 60ºC. Las
muestras tomadas por punciones de tarjeta FTA™ Card
procesadas se ensayaron inmediatamente o se almacenaron a 4ºC.
Amplificación. DNA se amplificó
directamente a partir de una muestra tomada por punción de tarjeta
FTA™ situada en 50 \mul de tampón PCR 1X, Mg^{++} 1,5 mM, dNTP
0,2 \muM, 1,25 unidades de DNA polimerasa Taq de
Platinum™, y cebadores 0,2 \muM (Tabla 1). Para la secuencia
genónica de Agrobacter tumefaciens, la amplificación fue: un
ciclo de 94ºC durante 1 minuto, 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto,
55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 3 minutos y un ciclo de 72ºC
durante 10 minutos. Para muestras de DNA genómico de E. coli
DH10B™ y Streptomyces, la amplificación fue: un ciclo de 94ºC
durante 1 minuto, 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 36 ciclos de
94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1
minuto y un ciclo de 72ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Amplicón | Secuencia cebadora | ||
| Diana | Tamaño (pb) | ||
| Agrobacterium | RNAr 16S | 284 | GGGAA AGATT TATCG GGGAT G GGCTG CTGGC ACGAA |
| tumefaciens | GTTA | ||
| (SEQ. ID Nº.: 1) | |||
| Células de E. | rrsE | 372 | CTGAG ACACG GTCCA GACTC CTACG TCACC GCTAC |
| coli DH10B | ACCTG GGATT CTACC | ||
| (SEQ. ID Nº.: 2) | |||
| Streptomyces | RNAr 16S | 1500 | AGAGT TTGAT GATCC TGGCT CAG AAGGA GGTGA |
| TCCAG CCGCA | |||
| (SEQ. ID Nº.: 3) | |||
| Plásmido | pSUsrmB2 | 1503 | CCCAG TCACG ACGTT GTAAA ACG AGCGG ATAAC |
| AATTT CACAC AGG | |||
| (SEQ. ID Nº.: 4) | |||
| Plásmido | PMAB32 | 1800 | GAATA AGTGC GACAT CATCA TC GTAAA TTTCT GGCAA |
| GGTAG AC | |||
| (SEQ. ID Nº.: 5) | |||
| Plásmido | pJH11104 | 1200 | ACTTC TTCGC CCCCG TTTTC GCTGA CTTGA CGGGA |
| CGGCG | |||
| (SEQ. ID Nº.: 6) |
\vskip1.000000\baselineskip
Plásmidos pSUsrmB2 y pJH11104 se amplificaron en
la misma mezcla de reacción anteriormente descrita. La
amplificación de pMAB32 fue en una mezcla de reacción usando Sistema
de Amplificación de eLONGasa™ a Mg^{++} 1,5 mm. Para todos los
tres plásmidos, el perfil de incubación fue un ciclo de 94ºC durante
1 minuto, un ciclo de 94ºC durante 15 segundos, y 30 ciclos de 94ºC
durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 3
minutos.
Para amplificaciones plasmídicas y genómicas de
levaduras (Saccharomyces cerevisiae), las condiciones de
reacción usando Sistema de Amplificación de eLONGasa™ fueron: un
ciclo de 94ºC durante 2 minutos, 40 ciclos de 94ºC durante 15
segundos, 55ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 5 minutos.
Secuencias cebadoras usadas para amplificación de levaduras se
muestran en la Tabla 2.
| Amplicón | Secuencia cebadora | ||
| Diana | Tamaño (pb) | ||
| Plásmido | pPC97 | 255 | GAATA AGTGC GACAT CATCA TC |
| Plásmido | pPC97-RB | 2088 | GTAAA TTTCT GGCAA GGTAG AC |
| Plásmido | pPC97-dE2F | 834 | (SEQ. ID Nº.: 5) |
| Plásmido | pPC97-Fos | 447 | |
| Plásmido | pCL1 | 2853 | |
| Saccharomyces | Promotor | 350 | GCGAG GCATA TTTAT GGTGA AGG CATTT CCGTG |
| cerevisiae | SPAL | CAAAG GTACT ACC | |
| MaV203(MATa) | (SEQ. ID Nº.: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
Alícuotas de cada producto de reacción se
analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa/TAE al 1,5%
(p/v).
Transformación. Las células se
transformaron con DNA plasmídico a partir de muestras tomadas por
punción de tarjeta FTA™, bien añadiendo una muestra tomada por
punción directamente a la reacción o añadiendo 5 \mul de un
extracto de TE, el cual ha remojado la muestra tomada por punción
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tanto las células MAX
Efficiency DH5\alpha™ como las células MAX Efficiency DH10B se
transformaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Diversas diluciones del volumen de reacción de transformación de 1
ml final (100 \mul de una disolución 1/100, 100 \mul de una
disolución 1/10, 100 \mul de células no diluidas, y 100 \mul de
células no diluidas) se sembraron en el medio apropiado y se
incubaron durante toda una noche a 37ºC.
Usando muestras de cultivos líquidos durante toda
una noche esparcidos sobre tarjetas FTA™, Rogers y
Burgoynegeneraron los patrones de PCR diagnósticos para cada una de
seis cepas bacterianas probadas (Rogers, y col., (1997) Anal.
Biochem. 247:223). Sin embargo, de acuerdo con la presente
invención, se probaron las colonias de bacterias situadas en una
tarjeta FTA™. De modo distinto a Rogers y Burgoynr quienes probaron
dos procedimientos complejos, todas las tarjetas FTA™ en este
estudio se procesaron con lavados simples.
Las dianas de DNA genómico bacteriano
amplificadas directamente a partir de muestras tomadas por punción
lavadas dieron las bandas esperadas (Figura 1). Las tarjetas FTA™
fueron útiles para rastrear e identificar colonias de bacteria
Agrobacter a partir de plantas, una bacteria E. coli
gram-negativa, y una bacteria de
Streptomyces gram-positiva, difícil de lisar.
El éxito se debió en parte de la naturaleza robusta de la reacción
de amplificación, no requiriendo cuantificación del DNA de antemano.
Los cultivos líquidos de las mismas bacterias esparcidos sobre la
tarjeta FTA™ pueden funcionar además de las colonias. Además, se
puede usar la transferencia de bacterias levantando la colonia de la
superficie del medio de crecimiento sólido con una tarjeta FTA™ de
tamaño adecuado. De forma consistente con las propiedades conocidas
de tarjetas FTA™, las bacterias no se podrían rescatar después de
lavadas, las muestras tomadas por punción de bacterias esparcidas
se situaron en medios de crecimiento sólidos y se incubaron durante
> 3 días.
Se probó la retención del DNA plasmídico sobre
tarjetas FTA™. Burgoyne comunicó que el DNA plasmídico purificado
esparcido sobre papel tratado se eliminó eficientemente con tampón
TE (después del tratamiento con disolventes orgánicos para eliminar
el recubrimiento de protección de poliestireno) como se mide por PCR
y transformación (Burgaoyne, patente de los Estados Unidos
5.496.562). Sin embargo, usar el DNA purificado no emplea la
ventaja de esparcir directamente las bacterias que contienen
plásmido en una tarjeta FTA™. Tres cultivos de E. coli se
esparcieron sobre una tarjeta FTA™, y las muestras tomadas por
punción procesadas se amplificaron. El DNA plasmídico se retuvo
sobre la tarjeta FTA™ mientras se observaron los amplicones
esperados (Figura 2). Sin embargo, la cantidad de DNA plasmídico
que permanece con el papel es probablemente bajo. La secuenciación
cíclica fluorescente estándar de DNA plasmídico directamente de una
muestra tomada por punción lavada no detectó ninguna señal (datos
no mostrados) incluso aunque DNA plasmídico en una colonia
individual se ha mostrado que es suficiente para secuenciación
cíclica (Young, A. Blakesley, R. (1991) Focus 13, 137). Sin
embargo, la secuenciación del DNA plasmídico se pudo llevar a cabo
después de que el DNA plasmídico se amplificó inicialmente como se
describe anteriormente. Además, la secuenciación se pudo llevar a
cabo directamente a partir de la muestra de FTA™ bajo condiciones
apropiadas las cuales permiten suficientes cantidades de DNA
plasmídico para retenerse en el papel FTA™.
Aunque algún DNA plasmídico permaneció con la
tarjeta FTA™ hasta el fin de un procedimiento de lavado extensivo,
es probable que el DNA esté asociado débilmente y algo de él se
libere durante cada lavado. Esto se confirmó por la generación del
amplicón correcto cuando una extracción con 5 \mul tampón TE de
una muestra tomada por punción lavada se amplificó mediante PCR
(datos no mostrados). Este resultado sugiere que el DNA plasmídico
liberado de muestras tomadas por punción lavadas se puede recuperar
también mediante amplificación biológica, es decir, transformación
bacteriana. Las células DH\alpha5 y DH10B se transformaron
sucesivamente con 5 \mul a partir de una extracción mediante un
tampón TE de una muestra tomada por punción lavada previamente
esparcida con bacterias que albergan de uno a tres plásmidos (datos
no mostrados). El rescate efectivo de los tres plásmidos conduce a
probar una muestra tomada por punción lavada introducida
directamente en la reacción de transformación de la célula (Tabla
3). Las reacciones de transformación probadas (dos tipos celulares y
dos procedimientos de introducción de DNA) dieron resultados
comparables (datos no mostrados). En todos los casos, los clones
bacterianos se recuperaron fácilmente, fabricando tarjetas FTA™
potencialmente muy convenientes y con buena relación
calidad-precio para el almacenaje a largo plazo de
los clones bacterianos. De forma similar, otros clones bacterianos
que dan cobijo a DNA tales como cósmidos, BAC o PAC, se pueden
recuperar a partir de muestras archivadas en tarjetas FTA™.
| Plásmido | Tamaño (kb) | Número de copias | Transformantes/muestra tomada |
| por punción | |||
| pSUsrmB2 | 5,3 | 6-10 | 7.000 |
| pJH11104 | 2,7 | \sim 100 | 28.000 |
| pMAB32 | 11,2 | > 100 | 5.700 |
| Los resultados son la media de 4 diluciones. |
En un esfuerzo para hacer más efectivo el
procedimiento requerido para utilizar tarjetas FTA™ para el
archivado de vectores, se emprendieron estudios adicionales sobre la
transformación de células competentes con DNA plasmídico o tarjetas
FTA™. Un cultivo durante toda una noche de células huésped
bacterianas (DH5\alpha) que contenía el plásmido pSUsrmB2 se
esparció sobre tarjetas FTA™. Se cree que la etapa de procesamiento
del protocolo de FTA™ se podría optimizar para muestras que no
contienen sangre (ejemplos de tales muestras son células
bacterianas, células de cultivos celulares, algodones con muestras
bucales, concentrados de ciertos fluidos corporales tales como
saliva u orina, etc.). El Reactivo de Procesamiento de FTA™ se
diseñó inicialmente para purificar el DNA de muestras de sangre
esparcidas sobre tarjetas FTA™. Este reactivo se requiere para la
purificación óptima de muestras de sangre cundo los ensayos basados
en enzimas se utilizan para eliminar hemoglobina y otros inhibidores
enzimáticos.
Los protocolos de procesamiento modificados se
probaron para aplicación en PCR procesando muestras tomadas por
punción en una manera específica y después intentando amplificar el
DNA plasmídico en la muestra tomada por punción usando cebadores de
PCR (véase Tabla 1) específicos para DNA plásmídico pSUsrmB2. Las
muestras tomadas por punción bien no se procesaron en ningún modo,
bien se procesaron de acuerdo a las directrices del fabricante
usando tres remojados de 5 minutos en Reactivo de Procesamiento de
FTA™ seguidos por dos remojados de 5 minutos en TE, o procesados
usando dos aclarados con TE abreviados. TE se eligió al ser un
tampón biológico comúnmente usado disponible en el laboratorio,
aunque se pueden usar cualesquiera disoluciones o sistemas tampón
(por ejemplo, PBS, TAE, TBE, Hepes, disolución de Ringer, disolución
salina tamponada de Dulbecco, disolución de sal equilibrada de
Earle, disolución de sal equilibrada de Gey, disolución de sal
equilibrada de Hank, etc., véase catálogo de Life Technologies) o
incluso agua en este procedimiento de procesamiento modificado.
Preferiblemente, se usan disoluciones las cuales no destruyen o
degradan moléculas de ácidos nucleicos. No se obtuvo amplificación
con muestras tomadas por punción que no se procesaron, pero esas
muestras tomadas por punción que recibieron dos breves lavados con
TE se amplificaron al mismo nivel que aquellas procesadas usando el
protocolo completo. No es inesperado que la muestra tomada por
punción de FTA™ no procesada no produzca amplificación dado que los
reactivos en el papel no procesado se esperaría que vuelvan inactiva
la polimerasa.
Los resultados anteriores se obtuvieron con
metodologías de PCR estándar que generalmente no son útiles para el
análisis de cantidades relativas de DNA en cualquier muestra dada.
Para determinar si hubo una diferencia en la cantidad de DNA que se
retiene en el filtro con los diferentes procedimientos de
procesamiento, se llevó a cabo PCR cuantitativa usando la máquina
Perkin Elmer 7700 TaqMan. Las muestras tomadas por punción (2 mm)
se eliminaron de tarjetas FTA™ que contenían manchas de células HeLa
(5 x 10^{7} células/ml) secadas sobre la superficie del papel.
Estas muestras tomadas por punción se procesaron usando bien el
protocolo completo o bien los lavados con TE abreviados sometidos
después a amplificación usando la sonda de b-actina
y cebadores de Perkin Elmer en el Kit Reactivo de PCR de TaqMan
(Cat. Nº.: N808-0230, PE Applied Biosystems, Foster
City, CA). La señal de las muestras tomadas por punción de FTA™
procesadas usando dos lavados de TE fue consistentemente
aproximadamente 2 veces mayor que la señal de muestras tomadas por
punción de FTA™ que se procesaron usando las directrices del
fabricante.
Para probar la mejora en la eficiencia de las
etapas de procesamiento para transformación de DNA plasmídico, se
tomaron 2 mm de muestras tomadas por punción de las tarjetas FTA™
conteniendo cultivos durante toda una noche de pSUsrmB2 y
procesados de diferentes maneras antes de la transformación de
células DH\alpha5 competentes. Las muestras tomadas por punción
se procesaron bien de acuerdo a las directrices del fabricante, o
se procesaron usando dos aclarados abreviados de TE, o se usaron sin
procesar, directamente a partir de las tarjetas FTA™. Los
resultados en la Tabla 4 muestran que los dos lavados con TE
producen el máximo número de colonias por muestra tomada por
punción pero una muestra tomada por punción sin procesar también
produce números de colonias suficientes para propósitos archivales.
Los números de colonias más bajos se obtuvieron usando el protocolo
de procesamiento del fabricante completo, indicando de nuevo que el
DNA se eliminó de la muestra tomada por punción con las etapas de
lavado adicionales. Estudios adicionales han mostrado que una
muestra tomada por punción lavada justo una vez en TE da ligeramente
más colonias que una muestra tomada por punción no procesada y
ligeramente menos que una muestra tomada por punción lavada dos
veces en TE, lavados adicionales con TE por encima de dos
disminuyen el número de colonias obtenidas. Mientras que la
amplificación de DNA no podría tener lugar con una muestra tomada
por punción no procesada, la transformación plasmídica puede,
aunque no tan eficientemente como con una muestra tomada por punción
mínimamente procesada. Esta ligera pérdida de eficiencia se puede
explicar por la pérdida en viabilidad de algunas de las células
competentes en una reacción con una muestra tomada por punción no
procesada.
\vskip1.000000\baselineskip
| Protocolo de Procesamiento de Muestra | Colonias totales por 2 mm de Muestra |
| tomada por punción | tomada por punción* |
| no procesada | 137 |
| lavados con TE | 193 |
| procesamiento total | 45 |
| *media de tres experimentos separados |
Para mostrar la utilidad de FTA™ sobre otra
colección de dispositivos similar para el archivado de DNA
plasmídico, un cultivo durante toda una noche de células huésped
bacterianas (DH\alpha5) que contienen el plásmido pSUsrm se
esparció sobre tarjetas FTA™ o dispositivos de recogida basados en
papel similares y se dejaron secar al aire. Los otros dispositivos
de recogida usados fueron: Dispositivo de Recogida de Muestras de
DNA PCR Isocode (Schleicher y Schuell, Keene, NH), Kit de Tarjeta de
Captura Generation (Gentra Systems, Minneapolis, MN) y papel de
filtro Whatman # 4 (Clifton, NJ). El papel de filtro Whatman # 4 se
ha usado históricamente por investigadores para almacenaje a largo
plazo de células bacterianas vivas para aplicaciones tales como
transferencia de una cepa de bacteria entre laboratorios mediante
correo o servicio de administración. Las células bacterianas vivas
se pudieron recuperar del papel de filtro situando una parte del
papel de filtro dentro de un medio de cultivo adecuado para el
crecimiento.
Las muestras tomadas por punción (2 mm) se
tomaron de cada uno de estos dispositivos de recolección y los
productos de FTA™, Isocode y Generation se procesaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y con los dos lavados de TE
abreviados descritos anteriormente. El producto de Isocode está
diseñado para liberar DNA del papel, por lo tanto se probaron tanto
la muestra tomada por punción analizada así como un volumen de una
décima parte (5 ml) del DNA liberado. Las muestras tomadas por
punción del papel de filtro Whatman # 4 no se procesaron en manera
alguna. Las muestras tomadas por punción se usaron después en un
experimento de transformación usando células competentes
DH\alpha5. Además, una muestra tomada por punción lavada con TE
(o en el caso del papel de filtro Whatman # 4, una muestra tomada
por punción no procesada) se situó en una transformación fingida
control que contiene 100 ml de medio SOC en vez de 100 ml de células
competentes para probar que todas las colonias obtenidas en los
experimentos de transformación se derivan de los eventos de
transformación reales y no de transferencia al periodo siguiente de
bacterias vivas.
Los resultados en tabla 5 muestran que el
producto de Gentra Generations no produce números de transformantes
en el mismo intervalo que el papel de FTA™. El producto de Isocode
produjo números de colonias en el mismo intervalo que el papel
FTA™, pero sólo cuando el papel se procesó primero. El número total
de colonias obtenidas estará influenciado por el número de copias y
el tamaño del inserto plasmídico usado. Como se esperaba, el papel
Whatman # 4 fue un procedimiento efectivo para almacenaje a corto
plazo de células bacterianas cultivables mostradas mediante los
números equivalentes generados con o sin células competentes, pero
no para recuperación de células a largo plazo. Debido a la
naturaleza de las tarjetas FTA™, el DNA almacenado en papel FTA™ es
probablemente para protegerse de daño durante el largo plazo. Las
células bacterianas en papel FTA™ no han mostrado ninguna pérdida
en eficiencia de transformación durante al menos 3 meses. La sangre
almacenada en papel FTA™ por más de 7 años ha producido DNA para
análisis de PCR.
| Procedimiento de | Número total de colonias por muestra tomada por punción de 2 mm | ||||
| procesamiento | (cultivo de pSUsrmB2) | ||||
| FTA™ | Gentra | Isocode | Whatman # 4 | Whatman # 4 | |
| Generation. | S\amp{1}S | (10 días) | (25 días) | ||
| No procesado | 137 | 2 | 5 | 247 | 0 |
| 2 TE | 193 | 5 | 170 | N.D. | N.D. |
| Protocolo del | 45 | 0 | 15 | N.D. | N.D. |
| fabricante | |||||
| DNA liberado | N.D. | N.D. | 40 | N.D. | N.D. |
| Transfección | 0 | 0 | 0 | 263 | 10 |
| fingida | |||||
| * Datos de FTA™ y Gentra Generations son el promedio de 3 experimentos por separado. | |||||
| N.D.: no determinado |
Se emprendieron estudios adicionales sobre la
utilidad del papel FTA™ con el sistema vector M13. M13 es un
sistema vector bacteriófago que tiene la capacidad de producir
moléculas de DNA de cadena simple que son particularmente útiles
como plantillas de secuenciación de DNA. Sin embargo, la preparación
de plantillas purificadas es tediosa y lleva mucho tiempo. Las
tarjetas FTA™ se probaron para ver si podrían simplificar la
purificación de la plantilla de secuenciación de DNA. Las placas de
M13 bien se transfirieron directamente a papel FTA™ o bien células
DH\alpha5F'IQ huésped infectadas con M13 se aplicaron a papel FTA™
y se dejaron secar. Las muestras tomadas por punción (2 mm) se
tomaron de las tarjetas de FTA™ y se procesaron con TE (ya que
estas muestras no contienen sangre): Después de procesar, las
muestras tomadas por punción se sometieron a secuenciación
automatizada fluorescente usando el Kit de Reacción ABI Prism Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready (Cat. Nº.: 4303149, PE
Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las directrices
del fabricante y las reacciones resultantes se analizaron sobre el
ABI Prism 377.
Se obtuvo una secuencia excelente a partir de la
placa de M13 que se transfirió directamente a la tarjeta FTA™. La
longitud de lectura fue mayor de 600 nucleótidos con ninguna base no
legible en las primeras 600 bases. Cuando esta secuencia se comparó
con la secuencia conocida de M13, hubo 0 errores en los primeros
300 nucleótidos y un error y una mala lectura en los siguientes 300
nucleótidos (tasa de errores 0,33% por cada 600 nucleótidos). Los
datos de secuencia generados a partir de células infectadas con M13
en FTA™ son legibles, pero menos libres de errores indicando que la
información de secuencia se puede obtener de este formato, pero se
puede requerir la optimización de la concentración celular o los
procedimientos de procesamiento. Las placas de M13 situadas
directamente bien en tarjetas de Gentra Generations o bien en
tarjetas de Isocode también produjeron secuencias legibles.
La tarjeta FTA™ se conoce por su utilidad en el
archivado, su facilidad para la preparación de muestras, y la
eliminación de biorriesgos potenciales en DNA a partir de muestras
de sangre. De acuerdo con la presente invención, cualquier matriz o
medio sólido (preferiblemente una matriz basada en celulosa o papel
y en particular tarjetas FTA™) es también útil para archivar DNA a
partir de fuentes bacterianas, tanto genómicas como vectores. Así,
la invención representa un procedimiento para almacenaje,
procesamiento y recuperación convenientes y eficientes de clones
vectoriales o plasmídicos. Este procedimiento podría ser muy útil en
almacenaje de los grandes números de subclones generados, por
ejemplo, en proyectos de secuenciación de genomas a gran escala.
Habiendo descrito actualmente la presente
invención en algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para
propósitos de claridad de comprensión, será obvio para alguien de
habilidad normal en la técnica que la misma se puede llevara cabo
modificando o cambiando la invención en un amplio y equivalente
intervalo de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin
afectar el alcance de la invención o cualquier realización
específica de la misma, y que tales modificaciones o cambios se
desean para abarcarse en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicadoras
del nivel de capacidad de aquellos expertos en la técnica a la cual
pertenece esta invención.
<110> Life Technologies, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Archivado de Vectores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0942.461PC02/RWE/BJD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Para Asignarse
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Adjunto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/093.073
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-7-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/100.737
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-9-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaaagatt tatcggggat gggctgctgg cacgaagtta
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagacacg gtccagactc ctacgtcacc gctacacctg ggattctacc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagtttgat gatcctggct cagaaggagg tgatccagcc gca
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagtcacg acgttgtaaa acgagcggat aacaatttca cacagg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaataagtgc gacatcatca tcgtaaattt ctggcaaggt agac
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttcttcgc ccccgttttc gctgacttga cgggacggcg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaggcata tttatggtga aggcatttcc gtgcaaaggt actaac
\hfill46
Claims (5)
1. Un procedimiento para producir una o más
células que contienen uno o más vectores que comprenden:
a) poner en contacto un medio o soporte sólido
con célula(s) huésped que llevan uno o más vectores para
obtener un medio o soporte sólido que comprende uno o más vectores;
y
b) transformar o transfectar una o más células
con dicho uno o más vectores mediante:
- (i)
- poner en contacto dicho medio o soporte sólido con dichas una o más células; o
- (ii)
- poner en contacto dichas una o más células con uno o más vectores obtenidos a partir del medio o soporte sólido;
- (i)
- en el que dicho medio o soporte sólido es una matriz la cual protege contra degradación de ácido nucleico incorporado sobre la matriz en la que dicha matriz comprende,
- una matriz absorbente basada en celulosa o papel o una micromalla de material plástico sintético, y/o
- (ii)
- una composición que comprende una base débil, un agente quelante, un tensioactivo aniónico o un detergente aniónico, en la que dicha composición se absorbe en o se incorpora dentro de dicha matriz.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que dichas células son células
procariotas.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2 en el que dichas células procariotas son células
de Escherichia coli.
4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en el que el citado medio o
soporte sólido de transporte es una matriz la cual protege contra
degradación de ácidos nucleicos incorporados sobre la matriz y en
el que la matriz comprende una composición que consta de una base
débil, un agente quelante, un tensioactivo aniónico o un detergente
aniónico, y ácido úrico o una sal urato, en la que dicha
composición se absorbe en o se incorpora dentro de dicha matriz.
5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en el que la matriz no se
encierra o recubre con poliestireno y en el que la matriz sólida se
ha usado para almacenar los vectores durante al menos un año.
Applications Claiming Priority (4)
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