ES2842723T3 - Método de detección para Neisseria Gonorrhoeae - Google Patents

Método de detección para Neisseria Gonorrhoeae

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ES2842723T3 ES15770606T ES15770606T ES2842723T3 ES 2842723 T3 ES2842723 T3 ES 2842723T3 ES 15770606 T ES15770606 T ES 15770606T ES 15770606 T ES15770606 T ES 15770606T ES 2842723 T3 ES2842723 T3 ES 2842723T3
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Abstract

Un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, que comprende un paso de detectar una secuencia objetivo de NG01642 o una fragmento de la misma, en donde la secuencia objetivo o el fragmento de la misma comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 1 o su complemento; por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 2 o su complemento, en donde opcionalmente la secuencia objetivo comprende por lo menos 30 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de detección para Neisseria Gonorrhoeae
CAMPO TÉCNICO
Esta invención pertenece al campo de los métodos de detección y cebadores, sondas y composiciones usados en esos métodos. Más específicamente, la invención se refiere a métodos para detectar Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae) y cebadores, sondas y composiciones usados en esos métodos y kits para realizar los métodos.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
La N. gonorrhoeae es una especie de bacteria diplococcica gramnegativa responsable de provocar la infección de transmisión sexual gonorrea.
El diagnóstico de gonorrea se consigue habitualmente mediante una prueba de laboratorio que incluye un cultivo durante la noche. El ensayo usado para detectar la presencia de N. gonorrhoeae tiene un rango de sensibilidad del 75 al 95%.
Es un objeto de la invención proporcionar un método rápido, fiable, sensible y específico para detectar N. gonorrhoeae.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en la identificación de secuencias particulares que están presentes en el ADN genómico de N. gonorrhoeae y que permite una detección particularmente eficaz de N. gonorrhoeae.
Los inventores han identificado dos genes particulares dentro del genoma de N. gonorrhoeae, NGO1642, que se ha anotado como que codifica una proteína asociada a fagos putativa hipotética y NGO1012, que también se ha anotado como una proteína asociada a fagos. Estas anotaciones sugieren que es probable que estos genes se hayan integrado en el genoma de N. gonorrhoeae en algún momento durante la evolución del cromosoma de N. gonorrhoeae, ya sea por transposición o por lisogenia de fagos. Sin embargo, a pesar de su función putativa, no se encontró que los genes estuvieran presentes en otras especies de Neisseria cuando se probaron en ensayos de exclusividad y están bien conservados en varias cepas de N. gonorrhoeae incluso cuando provienen de áreas geográficas muy diferentes. Esta capacidad para distinguir N. gonorrhoeae de otras especies de Neisseria es muy útil en un método de detección de N. gonorrhoeae.
El gen NGO1642 es particularmente adecuado para la detección de la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra porque hay cuatro copias del gen presentes en el genoma de N. gonorrhoeae y, por lo tanto, es más fácil de detectar (porque menos rondas de amplificación proporcionan una gran cantidad de ácido nucleico amplificado) que las secuencias presentes solo una vez en el genoma.
Se identificaron dos secuencias objetivo separadas porque, debido a la baja prevalencia poblacional del 0,5% para N. gonorrhoeae, es necesario demostrar una especificidad clínica del 99,5% para lograr un valor predictivo positivo (VPP) mayor del 90%. Para lograr un nivel tan alto de especificidad, los inventores identificaron dos objetivos específicos que, cuando se usan juntos, podrían proporcionar la especificidad combinada apropiada.
Además, los inventores han demostrado que las dos secuencias son compatibles entre sí en términos de ser susceptibles de amplificación y detección simultáneas. Se han diseñado cebadores y sondas que son capaces de amplificar las dos secuencias simultáneamente en las mismas condiciones y, posteriormente, detectar las dos secuencias simultáneamente en las mismas condiciones.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, que comprende un paso de detectar una secuencia objetivo de NGO1642 o un fragmento de la misma; en donde la secuencia objetivo comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 1 o su complemento, por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o su complemento; o por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 2 o su complemento, en donde opcionalmente la secuencia objetivo comprende por lo menos 30 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o la SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un par de cebadores que son capaces de amplificar una secuencia objetivo dentro de NGO1642 para proporciona un amplicón en una reacción en cadena de polimerasa en donde la secuencia objetivo comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 1 o su complemento.
La invención también proporciona un cebador directo que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende de 18 a 22 nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 4 puede estar mutada mediante hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
La invención también proporciona un cebador inverso que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 5; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 5 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
La invención también proporciona una sonda de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de a) la SEQ ID NO: 26 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 26 o su complemento puede mutarse mediante hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales; o b) la SEQ ID NO: 3 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o su complemento puede mutarse mediante hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales; y en donde la sonda de ácidos nucleicos comprende un marcador.
La invención también proporciona una composición que comprende un cebador directo de la invención y un cebador inverso de la invención.
La invención también proporciona un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra que comprende un paso de amplificar una secuencia objetivo y un paso de detectar la secuencia objetivo, en donde la secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 2, y dicho paso de detección comprende hibridar la secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 3 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificar la secuencia objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso del cebador directo que consiste de la SEQ ID NO: 4 y el cebador inverso que consiste de la SEQ ID NO: 5, en donde opcionalmente la secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 25, y dicho paso de detección comprende hibridar la secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 26 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificar el objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso de cebadores directos que consisten de la SEQ ID NO: 4 y cebadores inversos que consisten de la SEQ ID NO: 27.
La invención también proporciona un método de diagnóstico de gonorrea que comprende un método o usar un cebador, sonda o composición de la invención.
La invención también proporciona un método para detectar N. gonorrhoeae, C. trachomatis y T. vaginalis en una muestra., el método comprendiendo además un paso de detectar una secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatisa y/o comprendiendo además un paso de detectar una secuencia objetivo específica de Trichomonas vaginalis.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
En la presente se divulga un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra que comprende un paso de detectar: una primera secuencia objetivo de NGO1642 o un fragmento de la misma; y/o una segunda secuencia objetivo de NGOl0l2 o un fragmento de la misma.
También se divulga en la presente una pareja de cebadores que es capaz de amplificar una secuencia dentro de NGO1642 para proporcionar un amplicón en una reacción en cadena de polimerasa.
También se divulga en la presente un cebador directo que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 18 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 4 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
También se divulga en la presente una pareja de cebadores que es capaz de amplificar una secuencia dentro de NGO1012 para proporcionar un amplicón en una reacción en cadena de polimerasa.
También se divulga en la presente un cebador directo que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 9, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 9 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
También se divulga en la presente un cebador directo que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 10, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 10 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
También se divulga en la presente una sonda de ácidos nucleicos que es capaz de hibridar con la secuencia de NGO1642 o un fragmento de la misma.
También se divulga en la presente una sonda de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de a) la SEQ ID NO: 26 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 26 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales; o b) la SEQ ID NO: 3 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
También se divulga en la presente una sonda de ácidos nucleicos que es capaz de hibridar con la secuencia de NGO1012 o un fragmento de la misma.
También se divulga en la presente una sonda de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 20 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 8 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
También se divulga en la presente un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra que comprende un paso de amplificar una primera secuencia objetivo y una segunda secuencia objetivo y un paso de detectar la primera secuencia objetivo y la segunda secuencia objetivo, en donde la primera secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 2 y la segunda secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO 7, y dicho paso de detección comprende hibridar la primera secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 3 y un marcador de ferroceno, hibridar la segunda secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 8 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificar la primera secuencia objetivo y la segunda secuencia objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso de cebadores directos que consisten de las SEQ ID NO: 4 y 10 y cebadores inversos que consisten de las SEQ ID NO: 5 y 11.
También se divulga en la presente un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra que comprende un paso de amplificar una primera secuencia objetivo y una segunda secuencia objetivo y un paso de detectar la primera secuencia objetivo y la segunda secuencia objetivo, en donde la primera secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 25 y la segunda secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 7, y dicho paso de detección comprende hibridar la primera secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 26 y un marcador de ferroceno, hibridar la segunda secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 8 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificar la primera secuencia objetivo y la segunda secuencia objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso de cebadores directos que consisten de las SEQ ID NO: 4 y 10 y cebadores inversos que consisten de las SEQ ID NO: 5 y 11.
También se divulga en la presente un método para detectar N. gonorrhoeae, C. trachomatis y T. vaginalis en una muestra.
Secuencia(s) objetivo
En la presente se divulgan métodos, cebadores, sondas, composiciones y kits para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra mediante la detección de una primera secuencia objetivo y/o una segunda secuencia objetivo. Las secuencias objetivo son secuencias de ácidos nucleicos que son específicas de N. gonorrhoeae, pero no deben estar presentes en ninguna especie distinta de N. gonorrhoeae para reducir la aparición de resultados falsos positivos. Las secuencias objetivo deben estar presentes en sustancialmente todos los aislados de N. gonorrhoeae independientemente del origen geográfico para reducir la aparición de resultados falsos negativos. Las secuencias objetivo son secuencias que son particularmente susceptibles de detección mediante métodos de detección rápida. La primera secuencia objetivo y la segunda secuencia objetivo son tales que permiten la detección multiplex, por ejemplo, pueden detectarse secuencias objetivo de otros patógenos simultáneamente con al primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo.
El método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra puede implicar la detección tanto de la primera secuencia objetivo como de la segunda secuencia objetivo. El método puede implicar además la detección de otras secuencias objetivo además de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. El método puede implicar la detección de por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez secuencias objetivo de N. gonorrhoeae adicionales. El método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra puede implicar la detección de solo una secuencia objetivo, es decir, la primera secuencia objetivo o la segunda secuencia objetivo.
La secuencia o las secuencias objetivo pueden tener cualquier longitud que permita identificar la secuencia objetivo como específica de N. gonorrhoeae. En particular, la secuencia o secuencias objetivo pueden tener una longitud de 50-1000, 100-500, 200-400, 250-350, 200-300, 100-200 o 100-150 nucleótidos.
La secuencia(s) objetivo que se detecta pueden ser ADN o ARN. Por lo general, es ADN, en particular ADN genómico.
La primera secuencia objetivo es una secuencia objetivo de NGO1642. La segunda secuencia objetivo es una secuencia objetivo de NGO1012. El método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra puede implicar la detección de la primera secuencia objetivo, o la segunda secuencia objetivo, o tanto la primera secuencia objetivo como la segunda secuencia objetivo. Los términos "primero" y "segundo" se usan simplemente por conveniencia, y el método puede implicar la detección de la segunda secuencia objetivo independientemente de si el método implica la detección de la primera secuencia objetivo y viceversa.
Primera secuencia objetivo El método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae puede comprender un paso de detectar una primera secuencia objetivo que es la secuencia de NGO1642 o un fragmento de la misma. En la cepa FA 1090, NGO1642 se refiere a los nucleótidos 1600891 a 1601214 de GI no. 59717368. Cuando la primera secuencia objetivo es un fragmento de NGO1642, la primera secuencia objetivo puede tener cualquier longitud dentro de la secuencia de NGO1642. Por ejemplo, la primera secuencia objetivo puede tener 50-350, 50-300, 100­ 250, 150-200, 50-100 o 50-150 nucleótidos de longitud.
La primera secuencia objetivo puede ser la secuencia NGO1642 de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, o su complemento o un fragmento de la misma. Como alternativa, la primera secuencia objetivo puede ser cualquier alelo o variante de origen natural de NGO1642 o un fragmento de los mismos, o su complemento o un fragmento del mismo. La primera secuencia objetivo puede ser por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% idéntica a un fragmento de la SEQ ID NO: 1 sobre la longitud del fragmento.
La SEQ ID NO: 25 es una región particular dentro de la secuencia NGO1642 que se ha descubierto que es particularmente útil como la primera secuencia objetivo. La primera secuencia objetivo puede comprender 20-128 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento o la SEQ ID NO: 25 o su complemento. La primera secuencia objetivo puede comprender por lo menos 22, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 70, por lo menos 75, por lo menos 80, por lo menos 85, por lo menos 90, por lo menos 95, por lo menos 100, por lo menos 105, por lo menos 110, por lo menos 115, por lo menos 120, o por lo menos 125, nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento o de la SEQ ID NO: 25 o su complemento. Preferiblemente, la primera secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 23 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento. Más preferiblemente, la primera secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 25 o su complemento.
La SEQ ID NO: 2 es una región particular dentro de la secuencia NGO1642 que se ha descubierto que es particularmente útil como la primera secuencia objetivo. La primera secuencia objetivo puede comprender 20-140 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento o la SEQ ID NO: 2 o su complemento. La primera secuencia objetivo puede comprender por lo menos 22, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 70, por lo menos 75, por lo menos 80, por lo menos 85, por lo menos 90, por lo menos 95, por lo menos 100, por lo menos 105, por lo menos 110, por lo menos 115, por lo menos 120, o por lo menos 125, por lo menos 130, por lo menos 135 o por lo menos 140 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento o de la SEQ ID NO: 2 o su complemento. Preferiblemente, la primera secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 23 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento. Más preferiblemente, la primera secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 17 nucleótidos contiguos de la s Eq ID NO: 2 o su complemento.
Las SEQ ID NO 25 y 2 tienen secuencias superpuestas que son similares entre sí. La secuencia de la SEQ ID NO: 25 carece de los 12 nucleótidos más 3' de la SEQ ID NO: 2.
La primera secuencia objetivo puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento, o la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o la SEQ ID NO: 2 o su complemento. Alternativamente, la primera secuencia objetivo puede consistir en la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1 o su complemento, o la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o la SEQ ID NO: 2 o su complemento.
La primera secuencia objetivo puede ser ADN o ARN. Habitualmente, es ADN, en particular ADN genómico. Habitualmente, la primera secuencia objetivo será parte de una molécula de cadena doble.
Segunda secuencia objetivo
El método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae puede comprender un paso de detectar una segunda secuencia objetivo que es la secuencia NGO1012 o un fragmento de la misma. En la cepa FA 1090, NGO1012 se refiere a los nucleótidos 979764 a 978886 de GI no. 59717368. Cuando se usa un fragmento, la segunda secuencia objetivo puede tener cualquier longitud dentro de la secuencia NGO1012. Por ejemplo, la segunda secuencia objetivo puede tener una longitud de 50-900, 100-500, 200-400, 250-350, 200-300, 100-200 o 100-150 nucleótidos.
La segunda secuencia objetivo puede ser la secuencia NGO1012 de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de la misma, o su complemento o un fragmento de la misma. Como alternativa, la segunda secuencia objetivo puede ser cualquier alelo o variante de origen natural de NGO1012 o un fragmento de los mismos, o su complemento o un fragmento de la misma. La segunda secuencia objetivo puede ser por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 6 o por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% idéntica a un fragmento de la SEQ ID NO: 6 sobre el longitud del fragmento.
La SEQ ID NO: 7 es una región particular dentro de la secuencia NGO1012 que se ha descubierto que es particularmente útil como segunda secuencia objetivo. La segunda secuencia objetivo puede comprender 20-91 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 o su complemento o la SEQ ID NO: 7 o su complemento. La segunda secuencia objetivo puede comprender por lo menos 22, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 70, por lo menos 75, por lo menos 80, por lo menos 85 o por lo menos 90 nucleótidos contiguos de la s Eq ID NO: 6 o su complemento o de la SEQ ID NO: 7 o su complemento. Preferiblemente, la segunda secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 24 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 o su complemento. Más preferiblemente, la segunda secuencia objetivo a detectar comprende por lo menos 22 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7 o su complemento.
La segunda secuencia objetivo puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 6 o su complemento, o la SEQ ID NO: 7 o su complemento. Alternativamente, la segunda secuencia objetivo puede consistir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 6 o su complemento, o la SEQ ID NO: 7 o su complemento.
La segunda secuencia objetivo puede ser ADN o ARN. Habitualmente es ADN, en particular ADN genómico.
Habitualmente, la segunda secuencia objetivo será parte de una molécula de cadena doble.
Muestra
La muestra es una composición en la que se realizan los métodos para determinar si están presentes la secuencia o secuencias objetivo. La muestra puede ser una composición en la que se sospecha que están presentes la secuencia o secuencias objetivo, o puede ser una composición en la que la secuencia o secuencias objetivo están potencialmente presentes. Los métodos para detectar la presencia de N. gonorrhoeae incluyen métodos que se realizan en muestras que se sabe o se sospecha que contienen la secuencia o secuencias objetivo, así como composiciones en las que la secuencia o secuencias objetivo solo están potencialmente presentes. Incluso si un método se realiza en una composición en la que la secuencia o secuencias objetivo no están realmente presentes, el método todavía se considera un método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae si el método se realiza para detectar cualquier N. gonorrhoeae. que podría estar presente. De manera similar, el paso de detección se refiere a realizar el paso con el objetivo de detectar la secuencia o secuencias objetivo, independientemente de si están presentes. Incluso si se realiza un paso de detección en una composición en la que la secuencia o secuencias objetivo no están realmente presentes, el paso todavía se considera un paso de detección si se realiza para detectar cualquier secuencia objetivo que podría estar presente. Por ejemplo, identificar la presencia de hibridación (ver más abajo) se refiere a identificar la presencia de cualquier hibridación que se haya producido. Por lo tanto, incluso si no se ha producido hibridación, se considera que el paso comprende identificar la presencia de hibridación si el paso se realiza para identificar cualquier aparición de hibridación que pudiera haberse producido.
La muestra puede ser material obtenido de un sujeto. La muestra puede ser una muestra celular, es decir, una muestra que contiene células humanas y/o bacterianas. La muestra puede obtenerse con mínima invasión o de manera no invasiva, por ejemplo, la muestra puede ser un fluido corporal que puede obtenerse de un sujeto usando un hisopo. Preferiblemente, la muestra se obtiene de un hisopo genital, por ejemplo, un hisopo vaginal. Como alternativa, la muestra puede ser un fluido corporal, como la orina, idealmente la primera orina recogida.
La muestra puede haber sido tratada desde que se obtuvo del sujeto. Por ejemplo, un experto en la técnica apreciará que las muestras pueden purificarse, diluirse, concentrarse, centrifugarse, congelarse, etc. antes de la detección del objetivo.
El sujeto es habitualmente humano, y puede ser hombre o mujer.
Métodos
Los métodos para detectar la presencia de N. gonorrhoeae pueden implicar detectar la presencia de una primera secuencia objetivo y/o una segunda secuencia objetivo usando cualquier técnica. Los métodos pueden implicar un paso de detección de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo que es capaz de detectar específicamente la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo en lugar de cualquier otra secuencia de ácidos nucleicos. Los métodos son, por tanto, específicos de secuencia. Preferiblemente, los métodos son métodos de detección rápida que permiten el diagnóstico en el punto de atención.
Habitualmente, el método implica un paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo además del paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. El método puede ser específico de la secuencia en virtud de un paso específico de la secuencia de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. Cuando se usa un paso específico de secuencia para amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo, el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo no necesita ser específico de la secuencia. Como alternativa, el método puede ser específico de la secuencia en virtud de un paso específico de secuencia de detección de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. Cuando se usa un paso específico de secuencia para detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo, el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo no necesita ser específico de la secuencia. Habitualmente, sin embargo, tanto el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo como el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo son específicos de secuencia, ya que esto puede maximizar la especificidad general.
Por lo tanto, los métodos pueden implicar un paso específico de secuencia de amplificación de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo y/o un paso específico de secuencia de detección de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo.
Paso de amplificación
Los métodos pueden comprender un paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. Este es particularmente el caso si el paso de detección requiere que haya un gran número de copias de la secuencia o secuencias objetivo. Como se ha mencionado anteriormente, el paso de amplificar la secuencia o secuencias objetivo es preferiblemente específico de la secuencia.
El paso de amplificación puede implicar cualquier método de amplificación de ácidos nucleicos conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a, la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la reacción en cadena de ligasa (LCR)1, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)2, amplificación mediada por transcripción3, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA)4, amplificación dependiente de helicasa5 y amplificación isotérmica mediada por giros6. Preferiblemente, se usa PCR.
Una mezcla de amplificación estándar para PCR comprende: un cebador directo y un cebador inverso en donde los dos cebadores son complementarios a los extremos 3' de la cadena de sentido y antisentido de la secuencia objetivo; una ADN polimerasa termoestable; trifosfatos de desoxinucleósido (dNTP); tampón; cationes divalentes (por ejemplo, iones de magnesio o manganeso); y cationes monovalentes (por ejemplo, iones de potasio). La mezcla de amplificación puede comprender dUTP en lugar de dTTP y opcionalmente uracilo-ADN glicosilasa, por ejemplo, para uso en métodos de descontaminación. Las UTP pueden incorporarse en las secuencias amplificadas, permitiendo realizar la descontaminación usando uracilo-ADN glicolasa antes de las amplificaciones posteriores. Usando tales métodos, las secuencias contaminantes de amplificaciones anteriores contendrán uracilo y pueden eliminarse sin eliminar secuencias de ADN presentes de manera natural en la muestra (que no contendrán uracilo).
Una polimerasa termoestable típica es una polimerasa Taq de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Una alternativa es la polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus que tiene una actividad de lectura de pruebas ausente de la polimerasa Taq y, por lo tanto, es una enzima de mayor fidelidad.
El paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo puede implicar el uso de uno o más cebadores, que se describen con más detalle a continuación.
El paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo puede realizarse antes o simultáneamente con el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. La amplificación tendrá lugar típicamente antes de la detección, siendo la amplificación y la detección pasos distintos en un método general.
Paso de detección
En cuanto a los métodos de detección, como se ha mencionado anteriormente, el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo será generalmente específico de la secuencia. Como alternativa, el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo puede no ser específico de secuencia, por ejemplo, si el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo es en cambio específico de la secuencia.
El paso de detección puede implicar la hibridación de la secuencia o secuencias objetivo con una sonda de ácidos nucleicos y la posterior identificación de la hibridación. A continuación se describen detalles adicionales de tales técnicas de hibridación. Como alternativa, el paso de detección puede implicar la secuenciación de la secuencia o secuencias objetivo.
Como se ha mencionado anteriormente, el paso de detección puede implicar hibridar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos. La sonda de ácidos nucleicos puede ser cualquier sonda que sea capaz de hibridar específicamente con la secuencia objetivo. Por lo tanto, una sonda usada para hibridar con la primera secuencia objetivo generalmente comprenderá un fragmento de la SEQ ID NO: 1 (o su complemento) o la SEQ ID NO: 25 (o su complemento) o la SEQ ID NO: 2 (o su complemento). Una sonda usada para hibridar con la segunda secuencia objetivo generalmente comprenderá un fragmento de la SEQ ID NO: 6 (o su complemento) o la SEQ ID NO: 7 (o su complemento). A continuación se proporcionan detalles adicionales de las sondas de ácidos nucleicos.
El paso de detección puede implicar identificar la presencia de hibridación después de que una sonda haya hibridado con una secuencia objetivo. Los métodos para identificar la presencia de hibridación incluyen métodos no específicos de la secuencia. Tales métodos incluyen el uso de un colorante intercalante de ácidos nucleicos, por ejemplo, bromuro de etidio o un colorante de cianina asimétrico, como Verde SYBR®. Estos colorantes aumentan su señal fluorescente cuando se unen a un ácido nucleico de cadena doble y pueden detectarse mediante un sistema de detección de fluorescencia estándar.
Los métodos preferidos para identificar la presencia de hibridación son métodos específicos de secuencia, por ejemplo, usando una sonda de ácidos nucleicos marcada. Una o más sondas marcadas pueden hibridar con la secuencia objetivo de una manera específica de la secuencia. Las sondas de ácidos nucleicos pueden marcarse de manera fluorescente, radiactiva, enzimática o electroquímica. Se prefiere el marcado electroquímico. La secuencia objetivo puede detectarse después de la hibridación con una secuencia complementaria inmovilizada (por ejemplo, en una matriz de ADN o "chip").
El paso de detección puede incluir la detección semi-específica del producto. Tales métodos de identificación incluyen, pero no se limitan a resolver el peso molecular aproximado del producto, por ejemplo, llevando a cabo una electroforesis de los productos de la reacción antes de la detección.
Algunos métodos para identificar la presencia de hibridación implican la detección de una sonda hibridada intacta, pero otros implican la digestión o hidrólisis de la sonda. Por tanto, la sonda de ácidos nucleicos puede degradarse tras la hibridación con la secuencia objetivo. Esto puede lograrse usando una exonucleasa específica de cadena doble. Esto permite la detección de un marcador unido a la sonda después de la hidrólisis de la sonda, por ejemplo, cambiando el entorno del marcador de tal manera que pueda detectarse para determinar la presencia o ausencia de la secuencia objetivo. Este tipo de detección es útil con marcadores electroquímicamente activos, como se divulga en Pearce et al7. La exonucleasa puede ser cualquier exonucleasa específica de cadena doble de 5' a 3'. La exonucleasa puede seleccionarse del grupo que consiste de una exonucleasa de Thermus aquaticus 5' a 3', una exonucleasa T7 y una exonucleasa T5. Preferiblemente, la exonucleasa es una exonucleasa T7.
La identificación de la presencia de hibridación puede implicar la detección del cambio en el entorno del marcador que se produce cuando el marcador se hidroliza de la sonda. Con un marcador electroquímico, este cambio en el entorno de la sonda puede detectarse aplicando una diferencia de potencial a la muestra y observando cambios en el flujo de corriente.
Los métodos para identificar la presencia de hibridación pueden implicar la medición de la hidrólisis de la sonda concomitante con la amplificación de la secuencia objetivo. Tales métodos pueden hacer uso de la actividad de exonucleasa de ácidos nucleicos de una polimerasa de ácidos nucleicos usada en el paso de amplificar la secuencia objetivo. En los métodos de la invención pueden usarse los métodos de amplificación y detección que usan cebadores modificados como se describe en la solicitud de patente internacional WO 2015/008091.
Cebadores de amplificación
También se divulgan en la presente cebadores que son capaces de hibridar específicamente con las secuencias objetivo. Los cebadores pueden extenderse usando uno de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos descritos anteriormente. Los cebadores de la invención pueden usarse en los métodos de la invención, donde se usa un paso de amplificación de la secuencia o secuencias objetivo.
Un cebador generalmente tendrá una longitud de por lo menos 10 nucleótidos, por ejemplo, el cebador puede tener 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Se prefieren longitudes de sonda más cortas si el contenido de GC de la sonda es alto. El cebador puede ser completamente complementario con su objetivo, pero (por ejemplo, en TMA) un cebador puede incluir una primera región que es complementaria con su objetivo y una segunda región que no lo es.
La amplificación de una secuencia objetivo usará típicamente dos cebadores. A estos se hace referencia habitualmente como cebadores "directo" e "inverso", pero los términos "directo" y "inverso" se usan simplemente por conveniencia, y las direcciones especificadas con respecto a cada una de las secuencias de cebador son arbitrarias. Por lo tanto, los cebadores descritos como directos pueden ser cebadores inversos, y los cebadores descritos como inversos pueden ser cebadores directos. Se pretende que los cebadores de la invención se usen en parejas, donde los extremos 3' de los dos cebadores se dirigen uno hacia el otro para que sean útiles en un paso de amplificación.
Los cebadores de la invención pueden comprender por lo menos un nucleótido modificado. El por lo menos un nucleótido modificado puede proteger al cebador de la degradación por exonucleasa. La presencia de el por lo menos un nucleótido modificado en el cebador puede significar que la región amplificada en sentido descendente no puede ser hidrolizada por la exonucleasa. La protección del producto amplificado puede ser útil para aumentar la señal producida durante la detección. Preferiblemente, solo uno del cebador directo y el cebador inverso comprende por lo menos un nucleótido modificado.
Nucleótido modificado
Un nucleótido modificado puede ser cualquier nucleótido que comprenda por lo menos una fracción de azúcar modificado, por lo menos un enlace internucleosídico modificado y/o por lo menos una nucleobase modificada. La modificación puede evitar que el nucleótido sea hidrolizado por una exonucleasa. Un nucleótido modificado comprende por lo menos una modificación en comparación con un nucleótido de ARN o ADN de origen natural.
El por lo menos un nucleótido modificado puede comprender por lo menos una fracción de azúcar modificado. La fracción de azúcar modificado puede ser una fracción de azúcar 2'-O-metil. La fracción de azúcar modificado puede ser una fracción de azúcar 2'-O-metoxietilo. El azúcar modificado puede ser un azúcar modificado con 2'fluoro. Como alternativa, la fracción de azúcar modificado puede ser un azúcar bicíclico. Lo azúcares bicíclicos incluyen puentes 4'-(CH2)nO-2', en donde n es 1 o 2; y puentes 4'-CH(CH3)-O-2'.
El por lo menos un nucleótido modificado puede comprender por lo menos un enlace internucleosídico modificado. El por lo menos un enlace internucleosídico modificado puede ser por lo menos un enlace de fosforamidita. El por lo menos un enlace internucleosídico modificado puede ser por lo menos un enlace de fosforotioato.
El por lo menos un nucleótido modificado puede comprender por lo menos una nucleobase modificada. El por lo menos un nucleótido modificado puede comprender más de una modificación, por ejemplo, un nucleótido modificado puede comprender una fracción de azúcar modificado y un enlace internucleosídico modificado. Alternativamente, el nucleótido modificado puede comprender una fracción de azúcar modificado y una nucleobase modificada, o un enlace internucleosídico modificado y una nucleobase modificada. El nucleótido modificado puede comprender una fracción de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado y una nucleobase modificada.
El por lo menos un nucleótido modificado puede estar presente en cualquier posición del cebador. Por ejemplo, el por lo menos un nucleótido modificado puede estar presente en el extremo 5' del cebador, o puede estar presente en el extremo 3' del cebador, o puede estar presente en la sección central del cebador, o puede estar intercalado a lo largo del cebador. Habitualmente, el por lo menos un nucleótido modificado está presente en el extremo 5' del cebador. Cuando un nucleótido modificado comprende un enlace internucleosídico modificado en el extremo 5' del cebador, esto significa que el enlace internucleosídico entre el primer y el segundo nucleótido está modificado.
El cebador modificado puede comprender múltiples nucleótidos modificados. Por ejemplo, el cebador modificado puede comprender por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9 o por lo menos 10 nucleótidos modificados. Específicamente, el cebador modificado puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 nucleótidos modificados. Cada uno de los nucleótidos del cebador modificado pueden ser nucleótidos modificados.
Cuando el cebador modificado comprende múltiples nucleótidos modificados, los nucleótidos modificados son preferiblemente nucleótidos contiguos en el cebador. Como alternativa, los nucleótidos modificados pueden estar espaciados a lo largo del cebador, es decir, pueden estar presentes uno o más nucleótidos no modificados entre los nucleótidos modificados. Los espacios de nucleótidos no modificados pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos no modificados.
Preferiblemente, el cebador comprende 3 o 4 nucleótidos modificados idealmente contiguos. Estos pueden estar en el extremo 5'. Preferiblemente, los 3 o 4 nucleótidos modificados comprenden enlaces de fosforotioato. En algunas realizaciones, el cebador comprende 3 enlaces de fosforotioato contiguos en el extremo 5', es decir, los enlaces entre cada uno de los nucleótidos primero a cuarto son enlaces de fosforotioato. En algunas realizaciones, el cebador comprende cuatro enlaces de fosforotioato contiguos en el extremo 5', es decir, los enlaces entre cada uno de los nucleótidos primero a quinto son enlaces de fosforotioato.
Cebadores de amplificación capaces de hibridar específicamente con la primera secuencia objetivo
Un cebador directo puede comprender cualquier secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 1 o su complemento, la SEQ ID NO: 25 o su complemento o la SEQ ID NO: 2 o su complemento.
Un cebador directo puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 4. Esta secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 4, siempre que el cebador todavía sea todavía capaz de hibridar específicamente con la primera secuencia objetivo. En algunas realizaciones, hay 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 4. Sin embargo, en otras realizaciones no hay adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales realizadas a la SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, el cebador directo comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20 o por lo menos 21 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 4. Incluso más preferiblemente, el cebador directo comprende toda la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 4. El cebador directo puede consistir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 4.
En una realización, el cebador directo puede comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos de A*A*G*A*ACCCGCAACCGTCTGCAC (SEQ ID NO: 4) o A*A*G*AACCCGCAACCGTCTGCAC.
N* indica que el nucleótido en la posición especificada es un nucleótido modificado. Cuando el nucleótido modificado N* comprende un enlace internucleosídico modificado, el enlace internucleosídico modificado está entre el nucleótido especificado y el siguiente nucleótido en la dirección 3'.
Por lo tanto, el cebador directo puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados. Los nucleótidos del cebador se numeran desde el extremo 5'. Por lo tanto, los nucleótidos 1-3 o 1-4 son los 3 o 4 nucleótidos en el extremo 5' del cebador. Los nucleótidos modificados pueden comprender enlaces de fosforotioato.
Un cebador inverso puede comprender cualquier secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 1 o su complemento, la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o la SEQ ID NO: 2 o su complemento. Puede usarse un cebador inverso de la invención en combinación con un cebador directo de la invención que sea capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 1 o su complemento, la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o la SEQ ID NO: 2 o su complemento, para amplificar la primera secuencia objetivo. Preferiblemente, el cebador inverso de la invención es capaz de hibridar con la cadena de la primera secuencia objetivo que es complementaria con la cadena de la primera secuencia objetivo con la que hibrida el cebador directo de la invención.
El cebador inverso puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 27. Esta secuencia puede estar mutada por hasta 5adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones hay 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 27. Sin embargo, en otras realizaciones no hay adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales realizadas a la SEQ ID NO : 27. Preferiblemente, el cebador inverso comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 22 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 27. Incluso más preferiblemente, el cebador directo comprende toda la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27. El cebador directo puede consistir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27.
El cebador inverso puede comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos de A*A*G*T*TCCCGGACACGTCGAAAG (SEQ ID NO: 27) o A*A*G*TTCCCGGACACGTCGAAAG, es decir, el primer cebador puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden comprender enlaces de fosforotioato.
El cebador inverso puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 5. Esta secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones hay 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 5. Sin embargo, en otras realizaciones no se realizan adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales a la SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, el cebador inverso comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, por lo menos 21, por lo menos 22, por lo menos 23, por lo menos 24 o por lo menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 5. Incluso más preferiblemente, el cebador inverso comprende toda la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 5. El cebador inverso puede consistir en la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 5.
El cebador inverso puede comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos de C*T*C*C*GTCTCCATAAGTTCCCGGACAC (SEQ ID NO: 5) o C*T*C*CGTCTCCATAAGTTCCCGGACAC, es decir, el primer cebador puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden comprender enlaces de fosforotioato.
En la presente se divulga una pareja de cebadores que es capaz de amplificar una primera secuencia objetivo dentro de NGO1642 para proporcionar un amplicón. Las parejas de cebadores de la invención de interés particular son los útiles en la PCR, y una de estas parejas se incorpora como las SEQ ID NO: 4 y 5. Otra de tales parejas se incorpora como las SEQ ID NO: 4 y 27. La invención también proporciona parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la s Eq ID NO: 4, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 27, en donde la SEQ ID NO: 27 no está modificada, es decir, no comprende nucleótidos modificados. La invención también proporciona parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la SEQ ID NO: 27, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde la SEQ ID NO: 4 no está modificada, es decir no comprende nucleótidos modificados.
La invención también proporciona parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 5, en donde la SEQ ID NO: 5 no está modificada, es decir, no comprende nucleótidos modificados. La invención también proporciona parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la SEQ ID NO: 5, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde la SEQ ID NO: 4 no está modificada, es decir, no comprende nucleótidos modificados. Cebadores de amplificación capaces de hibridar específicamente con la segunda secuencia objetivo Un cebador directo puede comprender cualquier secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 6 o su complemento o la SEQ ID NO: 7 o su complemento.
Un cebador directo puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 9. Esta secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 9, siempre que el cebador todavía sea capaz de hibridar específicamente con la segunda secuencia objetivo. Puede haber 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 9. Sin embargo, también puede no haber adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales realizadas a la SEQ ID NO: 9. Preferiblemente, el cebador directo comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, por lo menos 21, por lo menos 22, por lo menos 24, por lo menos 25 o por lo menos 26 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 9.Incluso más preferiblemente, el cebador directo comprende toda la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 9. El cebador directo puede consistir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 9.
El cebador directo puede comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos de C*g *c*AAACGGAGGTCTTACGGATTTAG (SEQ ID NO: 9) o A*C*G*CAAACGGAGGTCTTACGGATTTAG.
N* indica que el nucleótido en la posición especificada es un nucleótido modificado. Cuando el nucleótido modificado N* comprende un enlace internucleosídico modificado, el enlace internucleosídico modificado está entre el nucleótido especificado y el siguiente nucleótido en la dirección 3'.
Por lo tanto, el cebador directo puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados. Los nucleótidos del cebador se numeran desde el extremo 5'. Por lo tanto, los nucleótidos 1-3 o 1-4 son los 3 o 4 nucleótidos en el extremo 5' del cebador. Los nucleótidos modificados pueden comprender enlaces de fosforotioato.
Un cebador inverso puede comprender cualquier secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 6 o su complemento, o la SEQ ID NO: 7 o su complemento. Puede usarse un cebador inverso en combinación con un cebador directo que sea capaz de hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 6 o su complemento, o la SEQ ID NO: 7 o su complemento, para amplificar la segunda secuencia objetivo. Preferiblemente, el cebador inverso es capaz de hibridar con la cadena de la segunda secuencia objetivo que es complementaria a la cadena de la segunda secuencia objetivo con la que hibrida el cebador directo.
El cebador inverso puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10. Esta secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 10. Puede haber 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 10. Sin embargo, también puede no haber adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales realizadas a la SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, el cebador inverso comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, por lo menos 21, por lo menos 22, por lo menos 23, por lo menos 24, por lo menos 25 o por lo menos 26 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10. Incluso más preferiblemente, el cebador inverso comprende toda la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 10. El cebador inverso puede consistir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 10.
El cebador inverso puede comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos de C*G*T*T*GGCGCAATTTCCATATAGTCCTG (s e q id NO: 10) o C*G*T*TGGCGCAATTTCCATATAGTCCTG, es decir, el primer cebador puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden comprender enlaces de fosforotioato.
También se divulga una pareja de cebadores que son capaces de amplificar una primera secuencia objetivo dentro de NGO1012 para proporcionar un amplicón. Las parejas de cebadores divulgadas en la presente son aquellas útiles en la PCR, y una de tales parejas se incorpora como las SEQ ID NO: 10 y 11. También se divulgan en la presente parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 10, en donde la SEQ ID NO: 10 no está modificada, es decir, no comprende nucleótidos modificados. También se divulgan en la presente parejas de cebadores que comprenden un cebador que comprende la SEQ ID NO: 10, en donde los nucleótidos 1-3 o 1-4 son nucleótidos modificados que comprenden opcionalmente enlaces de fosforotioato, y un cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en donde la SEQ ID NO: 9 no está modificada, es decir, no comprende nucleótidos modificados.
Sondas de ácidos nucleicos
En la presente se divulgan sondas de ácidos nucleicos que pueden hibridar específicamente con una secuencia objetivo. Las sondas de ácidos nucleicos pueden usarse en el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo en los métodos divulgados en la presente. Las sondas normalmente están marcadas.
Las sondas de ácidos nucleicos tienen típicamente de 15 a 45 nucleótidos de longitud, es decir, la sonda de ácidos nucleicos puede tener 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44 o 45 nucleótidos de longitud.
Como se ha mencionado anteriormente, una sonda capaz de hibridar específicamente con la primera secuencia objetivo comprenderá generalmente un fragmento de la SEQ ID NO: 1 o su complemento o un fragmento de la SEQ iD NO: 25 o su complemento o un fragmento de la SEQ ID NO: 2 o su complemento. Uno de tales fragmentos es la SEQ ID NO: 3. Otro de tales fragmentos es la SEQ ID NO: 26. La sonda de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia que comprende por lo menos 19, por lo menos 20 o por lo menos 21 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 26 o su complemento; en donde la secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos simples con respecto a la SEQ ID NO: 26 o su complemento, siempre que la secuencia todavía sea capaz de hibridar específicamente con la primera secuencia objetivo y que se pueda identificar la presencia de la hibridación. En algunas realizaciones hay 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 26 o su complemento. Sin embargo, en otras realizaciones no hay adiciones, deleciones o sustituciones con respecto a la SEQ ID NO: 26 o su complemento. La sonda de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia que comprende por lo menos 19, por lo menos 20 o por lo menos 21 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 3 o su complemento; en donde la secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 3 o su complemento, siempre que la secuencia aún sea capaz de hibridar específicamente con la primera secuencia objetivo y que pueda identificarse la presencia de la hibridación. En algunas realizaciones, hay 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 3 o su complemento. Sin embargo, en otras realizaciones no hay adiciones, deleciones o sustituciones con respecto a la SEQ ID NO: 3 o su complemento.
Una sonda capaz de hibridar específicamente con la segunda secuencia objetivo comprenderá generalmente un fragmento de la SEQ ID NO: 6 o su complemento o un fragmento de la SEQ ID NO: 7 o su complemento. Uno de tales fragmentos es la SEQ ID NO: 8. La sonda de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia que comprende por lo menos 20, por lo menos 21, por lo menos 22, por lo menos 23, por lo menos 24, por lo menos 25, por lo menos 26, por lo menos 27 o por lo menos 29 nucleótidos contiguos de la s Eq ID NO: 8 o su complemento; en donde la secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 8 o su complemento, siempre que la secuencia aún sea capaz de hibridar específicamente con la segunda secuencia objetivo y que pueda identificarse la presencia de la hibridación. Puede haber 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 8 o su complemento. Sin embargo, puede no haber adiciones, deleciones o sustituciones con respecto a la SEQ ID NO: 8 o su complemento.
Las sondas de ácidos nucleicos pueden incluir una o más fracciones adicionales distintas de la región capaz de hibridar con la secuencia objetivo. Las fracciones adicionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos adicionales o fracciones que no son de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la sonda puede incluir una región conectora que la une a una matriz. La fracción adicional puede ser una fracción marcador. Los tipos particulares de marcadores que pueden usarse se describen con más detalle a continuación.
Marcadores
Las sondas y/o cebadores de ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden unirse a un marcador para ayudar en su detección. Ese marcador puede ser radiactivo, enzimáticamente activo, fluorescentemente activo, luminiscentemente activo o electroquímicamente activo.
Cuando la detección de múltiples secuencias de ácido nucleico se realiza simultáneamente, por ejemplo, cuando se detectan tanto la primera secuencia objetivo como la segunda secuencia objetivo; o cuando la detección de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo y la detección de una secuencia de ácidos nucleicos de control interna se llevan a cabo simultáneamente; o cuando la detección de la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo y la detección de una o más secuencias objetivo adicionales se llevan a cabo simultáneamente, los marcadores usados para ayudar en la detección de las múltiples secuencias de ácidos nucleicos son preferiblemente distinguibles entre sí. Por ejemplo, pueden ser diferentes fluoróforos o pueden ser diferentes agentes electroquímicamente activos o marcadores electroquímicamente activos que proporcionan una actividad electroquímicamente distinguible.
La presente invención es especialmente adecuada para su uso con sondas marcadas electroquímicamente. En particular, el marcador electroquímico puede incluir aquellos que comprenden complejos pi metalo-carbocíclicos, es decir, complejos orgánicos con electrones pi parcial o totalmente deslocalizados. Los marcadores adecuados incluyen aquellos que comprenden compuestos intercalados en los que dos anillos carbocíclicos son paralelos, y también intercalados doblados (compuestos angulares) y monociclopentadienilos. Preferiblemente, los marcadores electroquímicamente activos son marcadores de metaloceno. Más preferiblemente, son marcadores de ferroceno. Estos pueden usarse como se divulga en Pearce et al7. Ejemplos de marcadores que pueden usarse en los métodos de la invención pueden encontrarse en las WO03/074731, la WO2012/085591 y la WO2013/190328. Por ejemplo, el marcador de ferroceno puede tener la estructura de la fórmula I en la WO2012/085591. Como alternativa, el marcador de ferroceno puede tener la estructura de fórmula I en la WO 2013/190328.
Control interno
Los métodos de la invención incluirán generalmente un ácido nucleico de control interno. Este se usa para proporcionar confirmación de que el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo y/o el paso de detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo funciona correctamente.
El control interno comprende una secuencia de ácidos nucleicos que no estará presente en la muestra. La secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede tomarse de una planta o bacteria, en donde la secuencia de ácidos nucleicos no está presente en animales y es altamente específica para esta planta o bacteria. Un ejemplo de una posible bacteria de la que se puede tomar el ácido nucleico de control para una muestra animal es Pectobacterium atrosepticum, aunque puede usarse cualquier ácido nucleico de control que no estará presente en la muestra.
La secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede ser ADN o ARN, pero preferiblemente es ADN. Las técnicas descritas anteriormente para detectar y amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo también pueden usarse para la detección y amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos de control interno. De manera similar, las características de los cebadores y las sondas pueden ser las mismas que las descritas anteriormente.
Por tanto, el ácido nucleico de control interno puede tener cualquier longitud siempre que pueda identificarse como el ácido nucleico de control interno. Por ejemplo, el ácido nucleico de control interno puede tener 50-1000, 100-500, 100-200 o 100-150 nucleótidos de longitud. En particular, la secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede tener 50, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 nucleótidos de longitud. Idealmente, la longitud del ácido nucleico de control interno es similar a la longitud de la secuencia objetivo.
El ácido nucleico de control interno puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 11, o su complemento, o un fragmento de la SEQ ID NO: 11 o su complemento; en donde la secuencia está mutada por hasta 5 adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos individuales. La secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 11 o su complemento.
El paso de detectar la secuencia de ácidos nucleicos de control interno se lleva a cabo idealmente usando la misma técnica o técnicas que se usan para detectar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo.
Cuando el paso de detectar la secuencia de ácidos nucleicos de control interno implica la hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno con una sonda de ácidos nucleicos, la sonda de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos que contienen la SEQ ID NO: 12 o su complemento; en donde la secuencia puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 12 siempre que la secuencia aún sea capaz de hibridar específicamente con la secuencia de ácidos nucleicos de control interno. Puede haber 1, 2, 3, 4 o 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales con respecto a la SEQ ID NO: 12. Sin embargo, también puede que no haya adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales realizadas en la SEQ ID NO: 12.
Cuando se usa, un paso de amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede implicar la misma técnica(s) que el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo, o puede implicar diferentes técnicas que el paso de amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. Preferiblemente, el paso de amplificar la secuencia de ácidos nucleicos de control interno se lleva a cabo usando la misma técnica que la usada para amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo.
Cuando la secuencia de ácidos nucleicos de control interno es la de SEQ ID NO: 11, un cebador de control directo que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 13 y un cebador de control inverso que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 14 puede usarse como la pareja de cebadores usada en un paso de amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno. Sin embargo, los cebadores de control directo e inverso pueden ser más largos o más cortos que las SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente. Los cebadores de control directo e inverso pueden tener una longitud de 12 a 60 nucleótidos, es decir, los cebadores pueden tener 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud. Se prefieren longitudes de sonda más cortas si el contenido de GC de la sonda es alto.
Uso de cebadores y sondas más cortos
Los cebadores y las sondas pueden ser más cortos que los especificados anteriormente, particularmente si se toman medidas para aumentar la temperatura de apareamiento del cebador. En particular, se contemplan longitudes de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de nucleótidos más cortas que las longitudes e intervalos divulgados específicamente con anterioridad.
El uso de cebadores y sondas más cortos puede facilitarse mediante el uso de fracciones de unión a surcos menores y también ácidos nucleicos bloqueados (LNA) que aumentan la estabilidad térmica de los cebadores y sondas y aumentan la temperatura de apareamiento del cebador o sonda. El uso de tales modificaciones se contempla como parte de la presente invención junto con sondas y cebadores como se ha divulgado anteriormente, pero con longitudes oligoméricas e intervalos acortados en 5 residuos de los especificados anteriormente. La presente invención contempla el uso de cebadores y sondas más cortos en donde se facilita la estabilidad térmica aumentada mediante el uso de fracciones de unión a surcos menores y/o LNA en combinación con sondas y cebadores descritos en la presente que no tienen estabilidad térmica aumentada como se facilita mediante el uso de fracciones de unión a surcos menores y/o LNA así como el uso exclusivo de cebadores y sondas que tienen estabilidad térmica aumentada como se facilita mediante el uso de fracciones de unión a surcos menores y/o ácidos nucleicos bloqueados.
Ácidos nucleicos bloqueados
Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son bien conocidos en la técnica. Un LNA es un ácido nucleico que incorpora uno o más residuos de nucleótidos de ARN o ADN modificados (en combinación con residuos de ADN o ARN ordinarios). En el residuo modificado, un puente covalente extra conecta los carbonos 2' y 3' y "bloquea" el azúcar ribosa en la conformación endoestructural 3' como se encuentra normalmente en la forma A de ARN y ADN. Los LNA incluyen todos los ácidos nucleicos que incorporan residuos bloqueados en algunas o todas las posiciones de los residuos. El bloqueo puede lograrse mediante cualquier puente químico que conecte los carbonos 2' y 3' de la fracción de azúcar. Preferiblemente, el bloqueo se logra en un enlace metileno 2'-O, 4'-C.
Los LNA muestran una estabilidad térmica aumentada, con un aumento de la temperatura de fusión de aproximadamente 5° C en comparación con los oligómeros de ADN o ARN correspondientes. Debido a la elevada temperatura de fusión, aumenta el riesgo de que los cebadores y las sondas de LNA formen estructuras en horquilla perjudiciales para las reacciones de PCR eficaces. Por lo tanto, un buen diseño de cebadores y sondas se vuelve aún más esencial y, en relación con la presente solicitud, se prefieren especialmente cebadores y sondas LNA correspondientes a los divulgados en las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 7, 8 y 9 opcionalmente acortados en 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de cada extremo.
Los LNA pueden prepararse fácilmente y están disponibles comercialmente de varios proveedores.
Fracciones de unión a surcos menores
Las sondas de ácidos nucleicos y los cebadores de la invención (incluyendo las sondas y los cebadores de LNA) pueden conjugarse con fracciones de unión a surcos menores (MGB)9. Las fracciones de MGB son grupos de forma isométrica que se unen en el surco menor de una hélice doble que se forma entre la sonda o cebador y el objetivo. Estabilizan la región de cadena doble y aumentan la temperatura de fusión y la especificidad de la sonda/cebador, permitiendo usar sondas/cebadores más cortos. Los fracciones de unión a surcos menores pueden prepararse y unirse fácilmente a cebadores y sondas y están disponibles comercialmente de varios proveedores. Secuencias objetivo adicionales
Como se ha mencionado anteriormente, los métodos de la invención para detectar la presencia de N. gonorrhoeae pueden comprender además un paso de detección de una o más secuencias objetivo adicionales. Los métodos de la invención pueden comprender además amplificar una o más secuencias objetivo adicionales. Los métodos de la invención pueden comprender además un paso de detección de por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez secuencias objetivo adicionales. Los métodos de la invención pueden comprender además un paso de amplificar por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez secuencias objetivo adicionales.
Las técnicas descritas anteriormente para detectar y amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo también pueden usarse para la detección y amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos de control interno. De manera similar, las características de los cebadores y las sondas pueden ser las mismas que las descritas anteriormente.
Una o más de las secuencias objetivo adicionales pueden ser secuencias objetivo adicionales de N. gonorrhoeae. Una o más de las secuencias objetivo adicionales o pueden ser secuencias objetivo de otros patógenos. El uso de una o más secuencias objetivo adicionales de otros patógenos permite la detección simultánea de múltiples patógenos.
Detección de múltiples patógenos
Los métodos de la invención pueden usarse para detectar múltiples patógenos simultáneamente. Por ejemplo, los métodos pueden implicar la detección de N. gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis (C. trachomatis). Los métodos pueden implicar detectar, además de N. gonorrhoeae, uno o ambos de C. trachomatis y Trichomonas vaginalis (T. vaginalis) en la muestra. Los métodos también pueden implicar la detección de otros patógenos, particularmente patógenos que provocan infecciones de transmisión sexual.
Las técnicas descritas anteriormente para detectar y amplificar la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo también pueden usarse para la detección y amplificación de secuencias objetivo de C. trachomatis y T. vaginalis. De manera similar, las características de los cebadores y las sondas pueden ser las mismas que las descritas anteriormente.
Cuando se detecta adicionalmente C. trachomatis, el método comprende además un paso de detección de una secuencia objetivo específica de C. trachomatis. Este paso puede realizarse como se describe en la WO 2011/073675. La secuencia objetivo específica de C. trachomatis puede comprender por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25 o por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90 o por lo menos 100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma o la SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma. El paso de detectar la secuencia objetivo específica de C. trachomatis puede comprender un paso de hibridar la secuencia objetivo específica de C. trachomatis con una sonda de ácidos nucleicos específica de C. trachomatis e identificar la presencia de hibridación. Puede usarse cualquier sonda que sea capaz de hibridar con una secuencia objetivo específica de C. trachomatis. La sonda de ácidos nucleicos específica de C. trachomatis puede comprender por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 22, por lo menos 24, por lo menos 26, por lo menos 28, por lo menos 30 o por lo menos 32 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17. La sonda de ácidos nucleicos específica de Chlamydia trachomatis puede comprender la SEQ ID NO: 17. La sonda de ácidos nucleicos específica de Chlamydia trachomatis puede consistir de la SEQ ID NO: 17.
El método puede comprender además un paso de amplificación de la secuencia objetivo específica de C. trachomatis. Esta amplificación puede realizarse usando cualquier técnica de amplificación mencionada anteriormente. Preferiblemente se usa PCR. El paso de amplificar la secuencia objetivo específica de C. trachomatis puede implicar cualquier pareja de cebadores que sea capaz de amplificar la secuencia objetivo específica de C. trachomatis. Preferiblemente, se usan un cebador directo que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 18 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 18 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales y/o un cebador inverso que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 19 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 19 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
Cuando se detecta adicionalmente T. vaginalis, el método comprende además un paso de detectar una secuencia objetivo específica de T. vaginalis. Este paso puede realizarse como se describe en la solicitud de patente del Reino Unido 1401605.9. La secuencia objetivo específica de T. vaginalis puede comprender por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25 o por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90 o por lo menos 100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 20 o un fragmento de la misma o la s Eq ID NO: 21 o un fragmento de la misma. En cuanto a las secuencias objetivo de N. gonorrhoeae mencionadas anteriormente, la secuencia objetivo específica de T. vaginalis puede tener cualquier longitud.
El paso de detectar la secuencia objetivo específica de T. vaginalis puede comprender un paso de hibridar la secuencia objetivo específica de T. vaginalis con una sonda de ácidos nucleicos específica de Trichomonas vaginalis e identificar la presencia de hibridación. Puede usarse cualquier sonda que sea capaz de hibridar con la secuencia objetivo específica de T. vaginalis. La sonda de ácidos nucleicos específica de T. vaginalis puede comprender por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18, por lo menos 20 o por lo menos 22 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 22. La sonda de ácidos nucleicos específica de T. vaginalis puede comprender la SEQ ID NO: 22. La sonda de ácidos nucleicos específica de T. vaginalis puede consistir de la SEQ iD NO: 22.
El método puede comprender además un paso de amplificar la secuencia objetivo específica de T. vaginalis. Esta amplificación puede realizarse usando cualquier técnica de amplificación mencionada anteriormente.
Preferiblemente se usa PCR. El paso de amplificar la secuencia objetivo específica de T. vaginalis puede implicar cualquier pareja de cebadores que sea capaz de amplificar la secuencia objetivo específica de T. vaginalis. Preferiblemente, se usan un cebador directo que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 23 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 23 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales y/o un cebador inverso que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 24 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 24 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
Como se ha mencionado anteriormente, los marcadores incluidos en las sondas de ácidos nucleicos usadas para ayudar en la detección de secuencias de ácidos nucleicos de diferentes patógenos son preferiblemente distinguibles entre sí. Por ejemplo, pueden ser fluoróforos diferentes o pueden ser agentes electroquímicamente activos diferentes o marcadores electroquímicamente activos que proporcionan una actividad electroquímicamente distinguible.
Por consiguiente, también se divulgan métodos para detectar N. gonorrhoeae, C. trachomatis y T. vaginalis en una muestra. El método puede comprender un paso de detectar por lo menos una secuencia objetivo de N. gonorrhoeae, por lo menos una secuencia objetivo específica de C. trachomatis y por lo menos una secuencia objetivo específica de T. vaginalis. Preferiblemente, la por lo menos una secuencia objetivo de N. gonorrhoeae se selecciona de NGO1642 o un fragmento de la misma y NGO1012 o un fragmento de la misma. Preferiblemente, la secuencia objetivo específica de C. trachomatis es la SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma o la SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma. Preferiblemente, la secuencia objetivo específica de T. vaginalis es TVAG_003780 (SEQ ID NO: 20) o un fragmento de la misma o la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma.
Composiciones
También se divulgan en la presente composiciones que comprenden uno o más de los cebadores y/o sondas de ácidos nucleicos descritos anteriormente.
Las composiciones pueden comprender por lo menos un cebador directo y por lo menos un cebador inverso capaz de hibridar con la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. La composición puede comprender además por lo menos una sonda de ácidos nucleicos capaz de hibridar con la primera secuencia objetivo y/o la segunda secuencia objetivo. La composición puede comprender además una ADN polimerasa. Estas composiciones son adecuadas para realizar la amplificación del objetivo, por ejemplo, mediante PCR.
Las composiciones pueden comprender además una secuencia de ácidos nucleicos de control interno. Las composiciones pueden comprender además un cebador de control directo y un cebador de control inverso capaz de hibridar específicamente con la secuencia de ácidos nucleicos de control interno. La composición puede comprender además una sonda de ácidos nucleicos de control capaz de hibridar específicamente con la secuencia de ácidos nucleicos de control interno.
Estas composiciones pueden añadirse a una muestra y pueden aplicarse las condiciones requeridas para la detección y cuando se usa amplificación aplicada a la composición para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en la muestra.
También se divulgan kits que comprenden una composición de la invención. Un kit puede comprender además instrucciones de uso.
Las composiciones pueden comprender además cebadores y/o sondas útiles en la detección de secuencias objetivo adicionales. Tales secuencias objetivo adicionales pueden ser de diferentes patógenos como C. trachomatis y/o T. vaginalis, como se ha descrito anteriormente.
Cartucho
También se divulga en la presente un cartucho para su uso en un método para detectar la presencia de N. gonorrhoeae en una muestra. El cartucho permite la detección rápida en el punto de atención de N. gonorrhoeae cuando se usa en combinación con un aparato de detección adecuado (lector de cartuchos).
El cartucho comprende una entrada de muestras para recibir una muestra, una parte en la que puede tener lugar un paso de amplificación del objetivo, y una parte en la que puede tener lugar un paso de detección de la secuencia o secuencias objetivo.
El cartucho también puede comprender una parte en la que puede tener lugar un paso de extracción de ácidos nucleicos de la muestra. El cartucho puede ser un cartucho controlado neumáticamente.
El cartucho puede usarse adicionalmente para detectar la presencia de patógenos adicionales como C. trachomatis y/o T. vaginalis.
General
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10%.
El término "hibrida específicamente" significa capaz de hibridar con la secuencia del objetivo pretendido y no con secuencias que no están presentes en el objetivo pretendido.
A menos que se indique específicamente lo contrario, un proceso que comprende un paso de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. Por tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, pueden combinarse dos componentes entre sí, y luego la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.
El texto anterior se refiere en varios lugares a la adición, eliminación o sustitución de un nucleótido individual dentro de una secuencia particular. La secuencia puede estar mutada por una serie de adiciones y una serie de deleciones dentro de la secuencia especificada. Alternativamente, la secuencia puede estar mutada por una serie de adiciones y una serie de sustituciones dentro de la secuencia especificada. Alternativamente, la secuencia puede estar mutada por una serie de sustituciones y una serie de deleciones dentro de la secuencia especificada. Alternativamente, la secuencia puede estar mutada por una serie de adiciones, una serie de deleciones y una serie de sustituciones dentro de la secuencia especificada. En todos los casos, el número de nucleótidos mutados puede ser 1, 2, 3, 4 o 5.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. La secuencia de NGO1642 (SEQ ID NO: 1), que muestra la localización de la hibridación de dos cebadores específicos (SEQ ID NO: 4 y 5) que amplifican la secuencia de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae SEQ ID NO: 1, y una sonda de ácidos nucleicos específica (SEQ ID NO: 3).
Figura 2. La secuencia de un fragmento de NGO1642 (SEQ ID NO: 25), que muestra la localización de la hibridación de dos cebadores específicos (SEQ ID NO: 4 y 27) que amplifican la secuencia de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae SEQ ID NO: 25, y una sonda de ácidos nucleicos específica (SEQ ID NO: 26).
Figura 3. La secuencia de NGO1012 (SEQ ID NO: 6), que muestra la localización de la hibridación de dos cebadores específicos (SEQ ID NO: 10 y 11) que amplifican la secuencia de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae SEQ ID NO: 1, y una sonda de ácidos nucleicos específica (SEQ ID NO: 8).
Figura 4. Sensibilidad del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1642) después de la extracción, amplificación y detección de ácidos nucleicos usando PCR simétrica y una variedad de parejas de cebadores. Figura 5. Prueba de inclusividad del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1642) usando 92 aislados y cebadores de N. gonorrhoeae diferentes que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
Figura 6. Prueba de inclusividad adicional del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1642) usando 25 aislados y cebadores de N. gonorrhoeae diferentes que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 26 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 27.
Figura 7. Prueba de inclusividad inicial del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1012) usando 9 cepas y cebadores de N. gonorrhoeae diferentes que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8.
Figura 8. Prueba de inclusividad adicional del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1012) usando 25 cepas y cebadores de N. gonorrhoeae diferentes que tienen las secuencias de s Eq ID NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8.
Figura 9. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN de una variedad de especies de Neisseria no gonocócicas y otras especies estrechamente relacionadas usando cebadores que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
Figura 10. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN aislado de una variedad de bacterias que provocan otros cebadores de infecciones de transmisión sexual que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
Figura 11. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN aislado de bacterias que forman parte de la flora normal en cebadores del tracto genitourinario que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
Figura 12. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN aislado de bacterias que provocan una variedad de otros cebadores de enfermedades que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
Figura 13. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN de "Nivel 1" aislado de una variedad de especies de Neisseria no gonocócicas y otras especies estrechamente relacionadas usando cebadores que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 26 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 27. La sección izquierda del diagrama de caja informa de los niveles de detección
del ácido nucleico de control interno. La sección de la derecha del diagrama de caja informa de los niveles de
detección de la secuencia objetivo NGO1642.
Figura 14. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NGO1642) usando ADN de "Nivel 2" aislado de una
variedad de especies de Neisseria no gonocócicas usando cebadores que tienen las secuencias de las SEQ ID
NO: 4 y 26 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 27. La sección de la
izquierda del diagrama de caja informa de los niveles de detección del ácido nucleico de control interno. La sección de la derecha del diagrama de caja informa de los niveles de detección de la secuencia objetivo NGO1642.
Figura 15. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NG01012) usando ADN de "Nivel 1" aislado de una
variedad de especies de Neisseria no gonocócicas y otras especies estrechamente relacionadas usando
cebadores que tienen las secuencias de las SEQ ID NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la
secuencia de la SEQ ID NO: 8. La sección de la izquierda del diagrama de caja informa de los niveles de
detección del ácido nucleico de control interno. La sección de la derecha del diagrama de caja informa de los
niveles de detección de la secuencia objetivo NGO1012.
Figura 16. Ensayo de exclusividad (secuencia objetivo NG01012) usando ADN de "Nivel 2" aislado de una
variedad de especies de Neisseria no gonocócicas usando cebadores que tienen las secuencias de las SEQ ID
NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. La sección de la
izquierda del diagrama de caja informa de los niveles de detección del ácido nucleico de control interno. La sección de la derecha del diagrama de caja informa de los niveles de detección de la secuencia objetivo NGO1012.
Figura 17. Detección de la secuencia objetivo NGO1642 de N. gonorrhoeae y el ADN de control interno usando
amplificación dúplex.
Figura 18. Sensibilidad del ensayo de N. gonorrhoeae cuando la secuencia objetivo NGO1642 de Neisseria
gonorrhoeae y el ADN de control interno se amplifican y detectan en paralelo.
Figura 19. Sensibilidad del ensayo de N. gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1642) en presencia de una alta
concentración de una secuencia objetivo de C. trachomatis y del ensayo de C. trachomatis en presencia de una
alta concentración de una secuencia objetivo de N. gonorrhoeae.
Figura 20. Distribución de frecuencia de las muestras clínicas probadas usando el ensayo de Neisseria
gonorrhoeae (secuencia objetivo NGO1642) para determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo.
Figura 21. Sensibilidad del ensayo de Neisseria gonorrhoeae usando secuencias objetivo tanto NGO1642 como
NGO1012 con el ADN de control interno amplificado y detectado en paralelo con las dos secuencias objetivo.
MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Diseño de cebadores
Se diseñaron parejas de cebadores y sondas de ácidos nucleicos para evitar cualquier base variable entre
diferentes cepas de Neisseria gonorrhoeae y tramos de bases comunes entre otras especies de Neisseria. Los
cebadores y las sondas se probaron usando PCR asimétrica de un número conocido de copias del genoma usando
una de las parejas de cebadores y la posterior adición de la sonda de ácidos nucleicos para determinar las regiones
óptimas para las detecciones (ver las Figs. 1-3).
Ensayo de Neisseria gonorrhoeae
Se produjo un ensayo de subcircuito que imita un cartucho de punto de atención en el que se llevan a cabo
tres pasos secuencialmente: extracción de los ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae de las células, amplificación de la
secuencia o secuencias objetivo SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 7 por PCR; y detección de la secuencia objetivo
mediante la hibridación de la secuencia objetivo con una sonda o sondas de ácido nucleico que consiste de la SEQ
ID NO: 3 (que se hibrida con la SEQ ID No : 2) y/o la SEQ ID NO: 8 (que hibrida con la SeQ ID NO: 7), ambas
conjugadas con un marcador de diferroceno.
Los cebadores que tienen las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 4 y 5 se incluyeron en los
reactivos de PCR en el ensayo de subcircuito para amplificar la secuencia de la SEQ ID NO: 2 usando PCR
simétrica. Los cebadores que tienen las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 10 y 11 se incluyeron en
los reactivos de PCR en el cartucho para amplificar la secuencia de la SEQ ID NO: 7 usando PCR simétrica. Ambas
reacciones de amplificación usadas fueron reacciones de amplificación semirrápidas que se completan en menos de
una hora.
Las sondas de ácidos nucleicos que consisten de las SEQ ID NO: 3 y 9 se marcaron con marcadores de ferroceno. Después de la hibridación de una sonda con su objetivo, el producto de cadena doble se hidrolizó específicamente mediante exonucleasa T7 provocando que el marcador de diferroceno se escindiera del resto de la sonda. El cambio en el entorno del marcador que se produce cuando el marcador se escinde de la sonda se detectó aplicando una diferencia de potencial a una región de detección del subcircuito de detección y observando cambios en la corriente que fluye a través de la región de detección.
El ensayo de subcircuito también permitió un paso de amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos de control interno de P. atrosepticum y un paso de detección de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno de P. atrosepticum mediante la hibridación del ácido nucleico de control interno con una sonda de ácidos nucleicos de control e identificación de hibridación. La extracción y amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno tuvo lugar simultáneamente con la extracción y amplificación de la secuencia o las secuencias objetivo. Los cebadores que tienen las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 14 y 15 se incluyeron en los reactivos de PCR en el subcircuito para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos de control interno de la SEQ ID NO: 11, que también se incluyó con los reactivos de PCR.
Una sonda de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 12 y marcada con un marcador de diferroceno se incluyó en el subcircuito para realizar el paso de hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos de control interno con una sonda de ácidos nucleicos. Después de la hibridación del producto de amplificación del control interno con la sonda de ácidos nucleicos de control, el producto de cadena doble se hidrolizó específicamente y se detectó de la misma manera que para la secuencia objetivo (ver más arriba).
Se produjo un segundo ensayo de subcircuito que es idéntico al descrito anteriormente excepto que amplifica la SEQ ID NO: 25 en lugar de la SEQ ID NO: 2, incluye un cebador inverso que consiste de la SEQ ID NO: 27 en lugar de la SEQ ID NO: 5 e incluye una sonda de ácidos nucleicos que consiste de la SEQ ID NO: 26 en lugar de la SEQ ID NO: 3.
Determinación de la sensibilidad del ensayo
La secuencia objetivo de N. gonorrhoeae de la SEQ ID NO: 2 (NGO1642) se amplificó y se detectó usando los cebadores y sondas mencionados anteriormente en muestras que contenían diferentes números de copias del genoma de N. gonorrhoeae en la mezcla de la reacción. La primera secuencia objetivo (SEQ ID NO: 2) se detectó en todas las muestras que contenían 4.000.000, 400.000, 40.000, 4.000, 400, 40 o 4 copias genómicas (ver Fig. 4). La primera secuencia objetivo no se detectó en el control negativo (ver Fig. 4). Por lo tanto, se descubrió que la sensibilidad preliminar del ensayo de N. gonorrhoeae era de 4 copias del genoma del ADN genómico de N. gonorrhoeae. El hecho de que haya cuatro copias de la primera secuencia objetivo en cada genoma significa que la sensibilidad aumenta porque incluso con una copia muy baja del genoma presente, está presente un alto nivel de secuencia objetivo que permite la detección.
Este número de copias también significa que se requieren menos rondas de amplificación sin perder la sensibilidad de la prueba, porque incluso muy pocas rondas de amplificación de la secuencia objetivo darán como resultado una gran cantidad de secuencia objetivo amplificada. Para lograr una prueba de punto de atención es necesario utilizar técnicas de amplificación rápida. Sin embargo, tales técnicas pueden llevar a resultados falsos negativos si se pierde la secuencia porque no se toma suficiente tiempo para que tenga lugar la hibridación adecuada de cebadores, etc. Sin embargo, la presencia de múltiples copias de la secuencia objetivo en el genoma permite que se use una amplificación rápida sin la posibilidad de que se pierda la secuencia objetivo. Además, el hecho de que se haya identificado una segunda secuencia objetivo para su uso junto con la primera secuencia objetivo significa que la sensibilidad del ensayo aumenta. Combinando una primera secuencia objetivo que proporciona un ensayo con una sensibilidad ya alta con una segunda secuencia objetivo, el resultado es un ensayo con una sensibilidad extremadamente alta.
Determinación de inclusividad del ensayo
Es importante que el ensayo sea capaz de detectar diferentes cepas de N. gonorrhoeae. Existe una diversidad genética significativa entre las diferentes cepas de N. gonorrhoeae. De modo que el ensayo fue capaz de amplificar y detectar la mayoría, si no todas, las cepas conocidas de N. gonorrhoeae, el ADN de 92 cepas diferentes (incluyendo las 35 cepas de control de la OMS y caracterizadas, 50 aislados clínicos con diferentes tipos de NG-MAST y 7 cepas con características inusuales que incluyen PPNG y TRNG sin plásmido) y la SEQ ID NO: 2 se amplificó y detectó usando PCR a 25 fg de ADN/reacción (equivalente a 10 células) usando los cebadores NGO1642 que consisten de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda que consiste de la SEQ ID NO: 3. Los resultados de la prueba de inclusividad se proporcionan en la Figura 5. Todas las cepas se detectaron usando el ensayo. La N. gonorrhoeae no se detectó en la muestra de control negativo. El alto nivel de inclusión del ensayo reduce la incidencia de resultados falsos negativos.
La prueba de inclusividad descrita anteriormente también se realizó usando cebadores NGO1642 que consisten de las SEQ ID NO: 4 y 27 y una sonda que consiste de la SEQ ID NO: 26. Los resultados de la prueba de inclusividad se proporcionan en la Figura 6. Todas las cepas se detectaron usando el ensayo. La N. gonorrhoeae no se detectó en la muestra de control negativa. El alto nivel de inclusividad del ensayo reduce la incidencia de resultados falsos negativos.
El trabajo inicial relacionado con la secuencia NGO1012 mostró que esta secuencia objetivo también es inclusiva. Los resultados usando 7 cepas diferentes se muestran en la Figura 7.
Posteriormente se realizaron pruebas adicionales de inclusión de la secuencia NGO1012 usando cebadores de NGO1012 que consisten de las SEQ ID NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 8. Los resultados de las pruebas de inclusividad se proporcionan en la Figura 8 Todas las cepas se detectaron usando el ensayo. LA N. gonorrhoeae no se detectó en la muestra de control negativo. El alto nivel de inclusividad del ensayo reduce la incidencia de resultados falsos negativos.
Los inventores también han demostrado la inclusividad cuando la secuencia objetivo NGO1642 y la secuencia objetivo NGO1012 se prueban por triplicado con el control interno.
Determinación de la exclusividad del ensayo
Es importante que el ensayo sea capaz de distinguir la presencia de N. gonorrhoeae de la presencia de otros patógenos. Por lo tanto, la amplificación y detección de la SEQ ID NO: 2 se realizó en muestras que contenían una variedad de organismos para verificar la exclusividad usando cebadores que consisten de las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 5 y una sonda de ácidos nucleicos que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 3. Todas las muestras se analizaron por triplicado. Los resultados de las pruebas de exclusividad usando especies de Neisseria no gonocócicas y especies estrechamente relacionadas se proporcionan en la Figura 9. Los resultados de las pruebas de exclusividad usando otros organismos que provocan infecciones de transmisión sexual (y que, por lo tanto, es probable que estén presentes en los mismos sitios de muestreo) como C. trachomatis y VIH I y II se muestran en la Figura 10. Los resultados de las pruebas de exclusividad usando flora normal encontrada normalmente en el tracto genitourinario se muestran en la Figura 11. Los resultados de las pruebas de exclusividad usando otros organismos que no están en el panel de reactividad cruzada de las directrices de la FDA para N. gonorrhoeae se proporcionan en la Figura 12. No se demostró reactividad cruzada cuando el ensayo se probó contra el panel de organismos, es decir, no se detecto otro organismo distinto de N. gonorrhoeae a niveles más altos que los presentes en el control negativo.
La amplificación y detección de la SEQ ID NO: 25 también se realizó en muestras que contenían una variedad de organismos para verificar la exclusividad usando cebadores que consisten de las secuencias de las SEQ ID NO: 4 y 27 y una sonda de ácidos nucleicos que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 26. Todas las muestras se analizaron por triplicado. Los organismos incluidos en las muestras usadas se proporcionan en la Tabla 1 a continuación.
Figure imgf000022_0001
Los resultados de las pruebas de exclusividad para NGO1642 usando muestras de "Nivel 1" se proporcionan en la Figura 13 y los resultados de las pruebas de exclusividad para NGO1642 usando muestras de "Nivel 2" se proporcionan en la Figura 14. También se descubrió que la secuencia objetivo de NGO1012 tiene buena exclusividad. La amplificación y detección de la SEQ ID NO: 7 se realizó en muestras que contenían una variedad de organismos para verificar la exclusividad usando cebadores que consisten de las secuencias de las SEQ ID NO: 9 y 10 y una sonda de ácidos nucleicos que consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 8 Todas las muestras se analizaron por triplicado. Los organismos incluidos en las muestras usadas se proporcionan en la Tabla 1 anterior. Los resultados de las pruebas de exclusividad usando muestras de "Nivel 1" para NGO1012 se proporcionan en la Figura 15 y los resultados de las pruebas de exclusividad usando muestras de "Nivel 2" para NGO1012 se proporcionan en la Figura 16.
Aunque en la Figura 13 se muestra que NGO1642 se detecta hasta cierto nivel en las cepas 3 y 4 del panel "Nivel 1", NGO1012 no se detectó en absoluto en ninguna de las muestras analizadas. Por lo tanto, los ensayos en los que deben detectarse tanto NGO1642 como NGO1012 para proporcionar un resultado positivo no proporcionarían un resultado positivo para estas cepas.
De nuevo, para el panel de "Nivel 2", aunque se detectó NGO1642 en algunas de las muestras y se detectó NGO1012 en algunas de las muestras. NGO1642 y NGO1012 nunca se detectaron en una sola muestra. Por lo tanto, los ensayos en los que deben detectarse tanto NGO1642 como NGO1012 para proporcionar un resultado positivo no proporcionarían un resultado positivo para estas cepas.
Prueba de la compatibilidad del ensayo con el control interno y el ensayo de C. trachomatis
Para optimizar un método que pudiera usarse para detectar simultáneamente N. gonorrhoeae y otros patógenos como C. trachomatis simultáneamente, se confirmó que tanto las secuencias objetivo de N. gonorrhoeae como el control interno y una secuencia objetivo específica de C. trachomatis podían amplificarse y detectarse simultáneamente bajo las mismas condiciones de amplificación y detección.
Prueba de ensayos dúplex para una primera secuencia objetivo de N. gonorrhoeae y un control interno En primer lugar, se realizó el ensayo de subcircuito (que imita estrechamente el ensayo que se realiza en un cartucho) para amplificar y detectar simultáneamente la secuencia objetivo NGO1642 de la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de control interno. Se usó una temperatura de fusión de 94° C, una temperatura de apareamiento de 66° C y una temperatura de extensión de 72° C en el paso de amplificación de la secuencia objetivo. Los resultados de esta prueba se proporcionan en la Figura 17. La Figura 17 muestra que la señal obtenida de 50CFU es fácilmente distinguible de la de una muestra negativa. También muestra que una secuencia de control interno conocida por ser compatible con un método de detección de C. trachomatis (como se demuestra en la WO 2011/073675) también es compatible con un método de detección de N. gonorrhoeae.
Se realizaron dieciocho réplicas discretas usando 50 CFU con un número equivalente de réplicas negativas. La PCR se realizó usando un programa de ciclos "semirrápido" usando una temperatura de fusión de 95° C y una temperatura de apareamiento de 65° C. Se ha demostrado que este método de PCR de dos pasos es útil para amplificar secuencias objetivo específicas de C. trachomatis. Los resultados de esta prueba se proporcionan en la Figura 18. La Figura 18 muestra que hay una clara diferenciación entre las señales electroquímicas para una muestra de 50CFU y una muestra negativa, y también muestra que la secuencia de ácidos nucleicos de control interno puede amplificarse de manera fiable en un ensayo dúplex con N. gonorrhoeae usando PCR "semirrápida". Prueba de muestras con una secuencia objetivo de N. gonorrhoeae y una secuencia objetivo de C. trachomatis
Se probaron muestras para garantizar que la extracción de una secuencia objetivo presente a una concentración baja no se inhibiera por la presencia de una secuencia objetivo a una concentración alta y que la PCR se no se viese afectada por las concentraciones relativas de ADN en la muestra.
Se probó una concentración negativa (sin objetivo), baja (100 CFU/IFU), media (1.000 CFU/IFU) y alta (100.000 CFU/IFU) de cada objetivo con un nivel alto constante (100.000 CFU/IFU) del otro organismo presente.
La concentración requerida de cada organismo se dosificó en un hisopo y luego el hisopo se suspendió en tampón de transporte. Se usaron tres muestras replicadas usando tres hisopos separados para cada condición de prueba. Se añadió ADN de control interno antes de la extracción de la muestra. Esta se extrajo y se amplificó simultáneamente, con la PCR realizada como un dúplex. Esto se usó para verificar que la prueba había funcionado, cuando falló el control interno, estos resultados se omitieron. No se observaron fallos de control interno. Los resultados de esta prueba se proporcionan en la Figura 19. La Figura 19 confirma que la presencia de un organismo a una concentración alta no afecta a la extracción de ADN de otro organismo presente a una concentración más baja.
Prueba de rendimiento del ensayo en muestras clínicas
Se obtuvieron 123 muestras para las pruebas. Las muestras eran una mezcla de hisopos y muestras de orina y habían sido tipificadas previamente, como 100 muestras negativas y 23 muestras positivas.
Se realizó en cada muestra el ensayo de subcircuito de N. gonorrhoeae de NGO1642 (SEQ ID NO: 2). El ADN de control interno se añadió a la muestra antes de la extracción. El ADN de control interno se extrajo y se amplificó simultáneamente con la secuencia objetivo NGO1642 como un dúplex. El control interno se usó para verificar que la prueba había funcionado, y cuando falló el control interno, se omitieron los resultados.
Se asignó un valor de “corte” de ensayo preliminar en base a la media negativa más 2,58 x desviación estándar de la media (un intervalo de confianza del 99%). Todos los resultados de las muestras positivas son significativamente más altos que el valor de corte impuesto, lo que demuestra que hay una clara diferenciación entre las muestras negativas y positivas probadas. Usando estos criterios, el ensayo muestra un 100% de sensibilidad clínica y un 100% de especificidad clínica. Solo se omitió un resultado de muestra debido a un fallo del control interno a amplificar y detectar. Estos resultados se proporcionan en la Figura 20.
Prueba de un ensayo por triplicado para detectar dos objetivos de N. gonorrhoeae
Se realizaron pruebas para confirmar que un ensayo por triplicado en el que tanto la secuencia objetivo NGO1642 (SEQ ID NO: 2) como la secuencia objetivo NGO1012 (SeQ ID NO: 7) podrían detectarse hasta 25 fg, o 10 copias, de cada secuencia. También se confirmó que el ADN de control interno de P. atrosepticum podría amplificarse simultáneamente por triplicado con las secuencias objetivo de N. gonorrhoeae.
Se usó un programa de termociclado de valor de referencia para amplificar las secuencias objetivo que implica una temperatura de fusión de 94° C durante 5 segundos, una temperatura de apareamiento de 65° C durante 30 segundos y una temperatura de extensión de 75° C durante 30 segundos. Se amplificó y se detectó una mezcla de ADN de N. gonorrhoeae y ADN de control interno por triplicado juntas. Los resultados de esta prueba se proporcionan en la Figura 21. La Figura 21 muestra que N. gonorrhoeae puede detectarse usando el ensayo por triplicado hasta un número de copias del genoma muy bajo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, que comprende un paso de detectar una secuencia objetivo de NG01642 o una fragmento de la misma, en donde la secuencia objetivo o el fragmento de la misma comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 1 o su complemento; por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o su complemento, o por lo menos 10 nucleótidos contenidos en la SEQ ID NO: 2 o su complemento, en donde opcionalmente la secuencia objetivo comprende por lo menos 30 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 25 o la SEQ ID NO: 2.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho paso de detección comprende hibridar la secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos e identificar la presencia de hibridación.
3. El método de la reivindicación 2, en donde:
i. el paso de detección comprende usar una primera sonda de ácidos nucleicos que comprende a) por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 25 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad; o b) por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad.
ii. el paso de detección comprende usar una sonda de ácidos nucleicos que comprende o consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 3; y/o
iii. el paso de detección comprende la detección de un marcador electromecánicamente activo.
4. Una pareja de cebadores que es capaz de aparearse con y amplificar una secuencia objetivo dentro del gen de Neisseria gonorrhoeae NG01642 para proporcionar un amplicón en una reacción en cadena de polimerasa, en donde la secuencia objetivo comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos contenidos en la SEQ ID NO: 1 o su complemento.
5. Un cebador directo que comprende:
i. una secuencia de ácidos nucleicos que comprende de 18 a 22 nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 4 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad, en donde opcionalmente el cebador directo comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 4.
6. Un cebador inverso que comprende:
i. una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 5; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 5 puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad, en donde opcionalmente el cebador inverso comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la EQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 5.
7. Una sonda de ácidos nucleicos que comprende:
i. una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 19 o más nucleótidos contiguos seleccionados de a) la SEQ ID NO: 26 o su complemento, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 26 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad; o b) la SEQ ID NO: 3 o su complemento; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales en su totalidad, en donde opcionalmente la sonda de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 3, en donde además opcionalmente la sonda de ácidos nucleicos consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 3; y en donde la sonda de ácidos nucleicos comprende un marcador.
8. El método de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, el cebador directo, cebador inverso, pareja de cebadores o sonda de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el cebador o cebadores y/o la sonda de ácidos nucleicos comprende una fracción de unión a surcos menores; o comprende por lo menos un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA).
9. El cebador directo, cebador inverso, pareja de cebadores o sonda de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en donde el cebador o cebadores y/o la sonda de ácidos nucleicos se conjuga con un marcador electroquímicamente activo.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, que comprende un paso de amplificar la secuencia objetivo usando la reacción en cadena de la polimerasa, amplificación mediada por transcripción, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación dependiente de helicasa, amplificación de recombinasa polimerasa, amplificación por desplazamiento de cadena o amplificación isotérmica mediada por giro, en donde opcionalmente el paso de amplificar la secuencia objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa, en donde además opcionalmente:
i. dicho paso de amplificación de la secuencia objetivo implica el uso de un cebador directo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 o 9;
ii. dicho paso de amplificación de la secuencia objetivo implica el uso de un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9; y/o
iii. dicho método implica el uso de una sonda de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 8 o 10, en donde dicho método incluye además un paso de detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos de control interno, en donde opcionalmente i. dicha secuencia de ácidos nucleicos de control interno es una secuencia de ácidos nucleicos de Pectobacterium atrosepticium, en donde opcionalmente dicha Pectobacterium atrosepticium es de la cepa ATCC BAA-672; y/o
ii. dicho paso de detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos para su uso como control interno positivo comprende:
a) un paso de amplificar dicha secuencia de ácidos nucleicos para su uso como un control interno positivo, y/o b) un paso de hibridar la secuencia de ácidos nucleicos para su uso como un control interno positivo con una sonda y un paso de identificar la presencia de hibridación.
12. Una composición que comprende un cebador directo como se define por cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 o 9 y un cebador inverso como se define por cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9, en donde opcionalmente: i. la composición comprende además una sonda de ácidos nucleicos como se define por cualquiera de las reivindicaciones 7-9;
ii. la composición comprende además una secuencia de ácidos nucleicos de Pectobacterium atrosepticium para su uso como control interno positivo, en donde opcionalmente dicha Pectobacterium atrosepticium es de la cepa ATCC BAA-672; y/o
iii. la composición comprende además un cebador de control directo y un cebador de control inverso que son capaces de amplificar la secuencia de ácidos nucleicos de Pectobacterium atrosepticium; y/o
iv. la composición comprende además una sonda de ácidos nucleicos de control que es capaz de hibridar con la secuencia de ácidos nucleicos de Pectobacterium atrosepticium.
13. Un método para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra que comprende un paso de amplificación de una secuencia objetivo y un paso de detección de la secuencia objetivo, en donde la secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 2 y dicho paso de detección comprende hibridar la secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 3 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificación de la secuencia objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso de cebador directo que consiste de la SEQ ID NO: 4 y cebador inverso que consiste de la SEQ ID NO: 5,
en donde opcionalmente la secuencia objetivo consiste de la SEQ ID NO: 25, y dicho paso de detección comprende hibridar la secuencia objetivo con una sonda de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 26 y un marcador de ferroceno, e identificar la presencia de hibridación detectando el estado de las sondas marcadas, y en donde dicho paso de amplificación del objetivo usa la reacción en cadena de polimerasa e implica el uso de cebadores directos que consisten de la SEQ ID NO: 4 y cebadores inversos que consisten de la SEQ ID NO: 27.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 8, 10 o 13, que comprende además
i. detectar la presencia de Chlamydia trachomatis en la muestra, el método comprendiendo además un paso de detección de una secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatis, en donde opcionalmente la secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatis comprende por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25 o por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 15.
en donde además opcionalmente el paso de detectar una secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatis comprende un paso de hibridación de la secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatis con una sonda de ácidos nucleicos específica de Chlamydia trachomatis e identificar la presencia de hibridación, en donde opcionalmente la sonda de ácidos nucleicos específica de Chlamydia trachomatis comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17,
que además comprende adicionalmente un paso de amplificar la secuencia objetivo específica de Chlamydia trachomatis usando PCR, en donde opcionalmente el paso de amplificación implica el uso de un cebador directo que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 18 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 18 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales y el uso de un cebador inverso que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 19 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 19 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
ii. detectar la presencia de Trichomonas vaginalis en la muestra, el método comprendiendo además un paso de detección de una secuencia objetivo específica de Trichomonas vaginalis,
en donde opcionalmente la secuencia objetivo específica de Trichomonas vaginalis comprende la SEQ ID NO: 20 o un fragmento de la misma o la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma,
en donde además opcionalmente el paso de detección comprende un paso de hibridar la secuencia objetivo específica de Trichomonas vaginalis con una sonda de ácidos nucleicos específica de Trichomonas vaginalis e identificar la presencia de hibridación, en donde opcionalmente la sonda de ácidos nucleicos específica de Trichomonas vaginalis comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 22.
que comprende además opcionalmente un paso de amplificar la secuencia objetivo específica de Trichomonas vaginalis usando PCR, en donde opcionalmente el paso de amplificar implica el uso de un cebador directo que comprende 12 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 23 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 23 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales y el uso de un cebador inverso que comprende 15 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la SEQ ID NO: 24 en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 24 o su complemento puede estar mutada por hasta 5 adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos individuales.
ES15770606T 2014-09-17 2015-09-17 Método de detección para Neisseria Gonorrhoeae Active ES2842723T3 (es)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3538668B8 (en) 2016-11-10 2025-04-23 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis
CN109486973A (zh) * 2018-12-13 2019-03-19 中国医学科学院病原生物学研究所 一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法
US11047007B1 (en) 2020-03-23 2021-06-29 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for amplification and detection of SARS-CoV-2
CN114774565B (zh) * 2022-03-30 2024-10-18 吉林大学 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US6277607B1 (en) * 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
GB0103424D0 (en) * 2001-02-12 2001-03-28 Chiron Spa Gonococcus proteins
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
GB0922097D0 (en) * 2009-12-17 2010-02-03 Atlas Genetics Ltd Microbial assay
US9731297B2 (en) * 2011-01-06 2017-08-15 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges and methods of using the same
GB201021896D0 (en) 2010-12-22 2011-02-02 Atlas Genetics Ltd Novel compounds and their use in analytical methods
GB201211157D0 (en) 2012-06-22 2012-08-08 Atlas Genetics Ltd Novel compounds and their use in analytical methods
CA2888987A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Jack TAWIL Modular telemedicine enabled clinic and medical diagnostic assistance systems
US9890428B2 (en) * 2013-05-14 2018-02-13 Ohio State Innovation Foundation MiRNA biomarkers for radiation biodosimetry
GB201401605D0 (en) 2014-01-30 2014-03-19 Atlas Genetics Ltd Method of detecting trichomonas vaginalis
WO2019099998A1 (en) 2017-11-17 2019-05-23 University Of Washington Connected system for information-enhanced test results

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