ES2255484T3 - Terapia con chaperonina 10 y beta-interferon para la esclesosis multiple. - Google Patents
Terapia con chaperonina 10 y beta-interferon para la esclesosis multiple.Info
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Abstract
Uso de la chaperonina 10 (cpn10) e interferón-b (IFN-b) en la fabricación de un medicamento para tratar la esclerosis múltiple (MS).
Description
Terapia con chaperonina 10 y
\beta-interferón para la Esclerosis Múltiple.
Esta invención se refiere al tratamiento de la
Esclerosis Múltiple usando la terapia combinada con cpn10 e
interferón-\beta. Esta invención se refiere
también a una composición farmacéutica y a un equipo que comprenden
la cpn10 y el interferón-\beta.
La esclerosis múltiple (MS) es la enfermedad
autoinmune más común que implica el sistema nervioso, afectando
aproximadamente 1 de cada 250.000 individuos en los Estados Unidos.
Clínicamente, la MS se caracteriza por la desmielinación dispersa
del sistema nervioso central (SNC) que conduce a debilidad,
parestesias, pérdida sensorial, y generalmente un control reducido
sobre la función neuromuscular.
El IFN-\beta es una citocina
antiviral y antineoplásica producida por los fibroblastos en
respuesta a la estimulación viral. Actúa como un modulador del
sistema inmunitario y es el único tratamiento que ha alterado
sustancialmente la historia natural de la MS en un ensayo clínico
convenientemente controlado (The IFN-\beta
Multiple Sclerosis Study Group, Neurology,
43:655-661 (1993)). Sin embargo, a partir de este
estudio quedó claro que, aunque la dosis elevada de
IFN-\beta (8 millones de unidades internacionales
(MIU) inyectadas cada dos días) era bien tolerada y tenía un efecto
beneficioso sobre el curso de recidivas-remisión de
la MS, sólo era parcialmente efectiva. Estos pacientes continuaban
teniendo exacerbaciones, aunque con una frecuencia reducida y de una
gravedad clínica relativamente suave. Sin embargo, esta dosis no
podía incrementarse, puesto que un estudio piloto anterior mostró
que dosis incrementadas (16 MIU), administradas tres veces a la
semana, producían una toxicidad inaceptable. A continuación de la
administración de las dos dosis (1,6 y 8 MIU), usadas en el ensayo
clínico de control mencionado más arriba, la incidencia de efectos
secundarios notables fue baja.
La anormalidad de laboratorio más comúnmente
asociada con el tratamiento con IFN-\beta fue la
linfopenia no asociada con cambios significativos en el recuento
total de leucocitos. Otros efectos secundarios notados fueron los
síntomas parecidos a la gripe y las reacciones en el sitio de la
inyección. Los estudios in vitro han mostrado que el
IFN-\beta puede inhibir efectivamente la
proliferación estimulada por mitógenos de células mononucleares de
la sangre periférica derivadas de ambos, pacientes con MS e
individuos sanos. Este efecto anti-proliferante
estaba asociado con una expresión reducida de la
IL-2R (Rudick et al., Neurology,
43:2080-2087 (1993)).
Se han llevado a cabo estudios minuciosos en
ratas y ratones de laboratorio para investigar el efecto del
IFN-\beta como un tratamiento de la
encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). La EAE es el mejor
modelo animal disponible de la MS, y es una enfermedad
desmielinizante inflamatoria del SNC en roedores mediada por
células T CD4+ (Pettinelli & McFarlin, J. Immunol.,
127:1420-1423 (1981)). La EAE puede inducirse
mediante la inoculación de animales susceptibles con antígenos del
SNC (proteína básica de la mielina, proteína proteolípido de la
mielina, glicoproteína de oligodendrocito de la mielina) y
adyuvantes. El desarrollo de los síntomas de la EAE está asociado
con la infiltración del sistema nervioso por parte de linfocitos T y
macrófagos (Raine, Lab. Invest., 50:608-635
(1984)). Durante la recuperación espontánea de la EAE hay una
declinación en el número de células inflamatorias en el sistema
nervioso (McCombe et al., J. Neurol. Sci.,
113:177-186 (1992)), debida en parte a la apoptosis
de los linfocitos T y macrófagos en el sistema nervioso central
(Tabi et al., Eur. J. Immunol.,
24:2609-2617 (1994); McCombe et al., J.
Neurol. Sci., 139:1-6 (1996)). La recuperación
de la EAE está asociada también con la producción de citocinas
desreguladoras, tales como la IL-10 y el
TGF-\beta (Kennedy et al., J.
Immunol., 149:2496-2505 (1992)).
En estudios de Ruuls et al., J.
Immunol., 157:5721-5731 (1996)), se indujo la
EAE en ratas Lewis mediante inoculación con un péptido MBP
sintético, residuos 63-88. El tratamiento de estas
ratas con IFN-\beta recombinante de rata (3
\times 10^{5} U/día sc) desde el día 8 hasta el día 17 después
de la inoculación protegió completamente a los animales de la
enfermedad durante el período de tratamiento. Sin embargo, con la
finalización del tratamiento, la mayoría de los animales
desarrollaron un curso de enfermedad crónico y remitente con una
gravedad fuertemente potenciada. Si el tratamiento se continuaba
hasta el día 26, los animales no recaían después de la interrupción
del tratamiento. A partir de estos resultados, parecería que la
interrupción del tratamiento durante la fase de recuperación de la
EAE está asociada con la rápida aparición de la enfermedad
paralítica grave.
Una de los rasgos característicos de la EAE es la
progresiva pérdida de peso durante la fase clínica de la enfermedad,
la cual se revierte rápidamente cuando los animales se recuperan
(Ruuls et al., 1996, supra). El tratamiento con
IFN-\beta desde el día 8 hasta el 26 inhibió la
reducción de peso, cuando se comparaba con el grupo control. Sin
embargo, a continuación del tratamiento, todos los animales
mostraron un retraso en el crecimiento, el cual se hizo evidente
aproximadamente 25 días después de la inoculación. La incapacidad
para ganar peso se ha observado también como uno de los efectos
secundarios más comunes y limitantes de la dosis en pacientes
durante el tratamiento con IFN-\beta de diversas
enfermedades.
Usando un modelo en ratón de la EAE, Yu et
al., J. Neuroimmunol., 64:91-100 (1996)
determinaron el efecto del tratamiento con
IFN-\beta de ratón sobre el curso de la EAE en
ratones (SWR \times SJL)F_{1}, a continuación de la
inmunización con el péptido inmuno-dominante de la
proteína proteolípido de mielina (PLP), p139-151.
Ellos mostraron una marcada disminución en el déficit neurológico
medio, un retraso significativo en la aparición de la exacerbación
y en la velocidad de exacerbación, y una disminución en la DTH. El
tratamiento con IFN-\beta produjo una mejora a
largo plazo en la valoración clínica media, una mejora
histopatológica clara, y un retraso en la progresión hacia la
incapacidad. In vitro, el IFN-\beta inhibió
la proliferación de las células de nodo linfático cebadas con el
determinante de manera dependiente de la dosis. En conclusión, estos
autores notaron que había una mejora histopatológica clara en los
ratones tratados con IFN-\beta, pero que la mejora
estaba lejos de ser una cura. Se ha descrito un efecto terapéutico
similar, pero modesto a largo plazo, sobre la gravedad e incidencia
de la inflamación del SNC en pacientes de la MS
(IFN-\beta Multiple Sclerosis Study Group,
1993).
El EPF fue descrito en primer lugar por Morton
et al., Nature, 249:459-460 (1974) y
Morton et al., Proc. R. Soc. Lond.,
193:413-419 (1976).
El EPF aparece en el suero materno dentro de las
6-24 h posteriores a la fertilización, está presente
durante al menos la primera mitad del embarazo en todas las especies
estudiadas, y es esencial para el crecimiento y supervivencia
embrionario continuado (Morton et al., Current Topics in
Developmental Biology, 23:73-92 (1987);
Athanasas-Platsis et al., J. Reprod.
Fert., 87:495-502 (1989);
Athanasas-Platsis et al., J. Reprod.
Fert., 92:443-451 (1991)). El EPF es también un
factor de supervivencia autocrino para las células tumorales (Quinn
et al., Clin. Exp. Immunol.,
80:100-108 (1990); Quinn & Morton, Cancer
Immunol. Immunother., 34:265-271 (1992)) y para
las células hepáticas en regeneración a continuación de una
hepatectomía parcial (Quinn et al., Hepatology,
20:1294-1302 (1994)). Como muchos otros factores de
crecimiento, el EPF está presente en las plaquetas, sugiriendo que
podría tener un papel fisiológico en la cicatrización de las heridas
(Cavanagh & Morton, Eur. J. Biochem.,
222:551-560 (1994)).
El EPF tiene también propiedades
inmunomoduladoras. Esto se propuso primero cuando se observó que el
EPF es capaz de aumentar las propiedades inhibidoras de rosetas de
un suero anti-linfocitos inmunosupresor (Morton
et al., 1974, supra; Morton et al., 1976,
supra), y de anticuerpos anti-CD4 pero no
anti-CD8 (Morton et al., 1982, Pregnancy
Proteins, Eds. B. Grudzinskas, B. Teisner, M. Seppala, Academic
Press, Sydney, 391-405). Estudios adicionales
mostraron que el EPF puede suprimir la reacción de hipersensibilidad
del tipo retardado (DTH) contra el triclorobenceno (TNCB) en ratones
(Noonan et al., Nature, 278:649-651
(1979)), suprimir la proliferación de linfocitos inducida por
mitógeno (Athanasas-Platsis, 1993, Tesis doctoral,
The University of Queensland) y suprimir la producción de
IFN-\gamma por parte de células T unidoras del
EPF. La acción inmunosupresora del EPF está mediada por la inducción
secuencial de factores supresores y/o linfoquinas. El EPF se une a
las células T CD4+, liberando secuencialmente dos factores
supresores genéticamente restringidos, el EPF-S y
EPF-S2 (Rolfe et al., Clin. Exp.
Immunol., 73:219-225 (1988); Rolfe et
al., Immunol. Cell Biol., 67:205-208
(1989)). Aunque el EPF no está restringido por la especie ni por la
cepa en su acción, la actividad del EPF-S1 está
restringida a la región I del MHC del ratón y HLA-DR
en humanos, mientras que la acción del EPF-S2 se
localiza en la región Igh.
La secuenciación de aminoácidos del EPF
purificado a partir de plaquetas humanas (Cavanagh & Morton,
1994, supra) ha mostrado que comparte la secuencia de
aminoácidos con la chaperonina 10 (cpn10), un miembro de la familia
de proteínas de choque térmico (Hartman et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3394-3398 (1992)).
Por tanto, el EPF y la cpn10 parecen ser homólogos. La cpn10 está
presente en una variedad de organismos, desde bacterias hasta
humanos. La estructura de la cpn10 está altamente conservada entre
especies de mamíferos, aunque menos entre bacterias y mamíferos. La
cpn10 está presente en las mitocondrias, en donde desempeña un papel
en el plegamiento de proteínas (Ellis & van der Vies, Annu.
Rev. Biochem., 60:321-347 (1991)), y como otras
proteínas del choque térmico, la cpn10 celular está regulada al alza
durante el estrés celular.
Al igual que el EPF, la cpn10 es activa en los
ensayos de inhibición de rosetas y presenta actividad
inmunosupresora tal como es evidenciado por prolongar la viabilidad
de los injertos de piel alogénicos en ratas. Con respecto al EAE, se
hace referencia a la Publicación Internacional Nº W095/15338, en
donde se mostró que la cpn10 retrasaba la aparición de la EAE y
modificaba las características clínicas de la enfermedad en un
modelo en rata.
Por tanto, es evidente a partir de la literatura
que ambos, la cpn10 y el IFN-\beta son
inmunosupresores.
En experimentos subsiguientes, los presentes
inventores han comparado la cpn10 y el IFN-\beta
con respecto a tratar la EAE en ratones, y han descubierto
sorprendentemente que la cpn10 y el IFN-\beta
actúan a través de mecanismos diferentes. A resultas de este
descubrimiento, nos hemos percatado ahora que la cpn10 y el
IFN-\beta pueden cooperar entre ellos para
proporcionar un tratamiento mejorado de la EAE. La implicación es,
por tanto, que la cpn10 y el IFN-\beta podrían
actuar cooperativamente para proporcionar un tratamiento mejorado de
la MS en humanos.
\newpage
Por tanto, es un objeto de la invención
proporcionar una composición farmacéutica para tratar la Esclerosis
Múltiple (MS) y su uso.
En un primer aspecto, la presente invención
reside en la reivindicación 1.
En una realización preferida, la invención se usa
para prevenir la recidiva de la MS.
En un segundo aspecto, se proporciona una
composición farmacéutica para el tratamiento de la MS, la cual
comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta y un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, se proporciona un equipo
que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta junto con un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, dicho
IFN-\beta está en forma deshidratada, la cual,
cuando se usa, es rehidratada por dicho portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
En una realización, dicha cpn10 está en forma
deshidratada y, cuando se usa, es rehidratada por dicho portador o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, dicha cpn10 está en forma de
tableta o cápsula.
De acuerdo con los aspectos antes mencionados,
preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 5-60 mg de
cpn10.
Más preferiblemente, la cantidad
farmacéuticamente efectiva de cpn10 e IFN-\beta
comprende 10-30 mg de cpn10.
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
efectiva de cpn10 e IFN-\beta comprende
1-10 MIU de IFN-\beta.
Más preferiblemente, la cantidad
farmacéuticamente efectiva de cpn10 e IFN-\beta
comprende 4-6 MIU de
IFN-\beta.
A lo largo de esta especificación y de las
reivindicaciones que siguen, "comprende", "comprenden" y
"comprendiendo" se usan de forma inclusiva en vez de exclusiva,
por lo cual un entero o grupo de enteros declarado podría incluir
uno o más enteros o grupos de enteros no declarados.
Figura
1
Cpn10 recombinante administrada
intraperitonealmente a ratas EAE comenzando el día de inoculación
con MBP. Los valores representan la discapacidad media \pm el
error estándar de la media (SEM). El tratamiento con cpn10 disminuyó
significativamente la puntuación de discapacidad total (p = 0,001;
ensayo de suma de rangos de Mann-Whitney, Sigma
Stat 2.0, Jandel Scientific).
Figura
2
Cpn10 recombinante administrada oralmente a ratas
EAE comenzando el día de inoculación con MBP. Los valores
representan la discapacidad media \pm el error estándar de la
media (SEM). El tratamiento con cpn10 disminuyó significativamente
la puntuación de discapacidad total (p = 0,005; ensayo de suma de
rangos de Mann-Whitney, Sigma Stat 2.0, Jandel
Scientific).
Figura
3
Cpn10 pGEX recombinante administrada
intraperitoneal (i/p) u oralmente (O/F) a ratas EAE comenzando el
día de inoculación con MBP. Los valores representan el % de pérdida
de peso
\hbox{por grupo (comparado con el peso en el día
10).}
Figura
4
Reacción de hipersensibilidad del tipo retardado
(DTH) al MBP en ratas, administrado con cpn10 recombinante
intraperitoneal (i/p) u oralmente, o tratadas con vehículo de
control, comenzando el día de inoculación con MBP. Se inocularon
cuatro grupos de ratas (n=4 por grupo) con MBP el día 0, y
recibieron la cpn10 (50 \mug/rat) mediante alimentación oral (O/F;
grupo 2) o ip (grupo 3), o vehículo solo ip (grupos 1 y 4),
diariamente desde el día 0 hasta el 16. El día 15, se midió el
grosor de la oreja en ambas orejas de las ratas, a continuación se
inyectaron 20 \mug de MBP en 10 \mul de solución salina en la
base de ambas orejas en los grupos 2-4. El grupo 1
recibió inyecciones de solución salina. Transcurridas 24 h, se
midieron de nuevo ambas orejas y se determinó la hinchazón de las
orejas mediante sustracción. *** p<0,001; **p=0,003 en
comparación con el grupo 4 (ensayo t de Student).
Figura
5
Efecto de la cpn10 recombinante administrada ip
diaria y oralmente a ratas (n=3), comenzando el día de la
inoculación con MBP (día 0), sobre los recuentos totales y
diferenciales de leucocitos. Los recuentos (mostrados con las
desviaciones estándares) se obtuvieron el día 16.
Figura
6
Supresión de la proliferación in vitro de
linfocitos estimulada por el MBP mediante la cpn10 recombinante. Se
recuperaron los linfocitos, a partir de nódulos linfáticos de
drenaje procedentes de ratas, 10 días después de la inoculación con
MBP. Se prepararon diluciones de la cpn10 para proporcionar una
concentración final sobre la placa, y se dispensaron 100 \mul por
triplicado. A cada pocillo se le añadieron 50 \mul de linfocitos
lavados (4 \times 10^{6}/ml) y 50 \mul de MBP (80 \mug/ml).
Los pocillos control contenían: a) células con MBP, sin cpn10, o b)
células sin MBP, sin cpn10. Se incubaron las placas durante 72 horas
y se pulsaron durante al menos 18 horas con 0,5 \muCi
[methyl-^{3}H] timidina. La proliferación se
verificó midiendo la radiactividad incorporada (cpm + desviaciones
estándares) en células incubadas con o sin cpn10. ***p < 0,001;
**p = 0,005 (ensayo t de Student).
Figura
7
Disminución en la puntuación de discapacidad
media de la EAE en ratones SJL tratados con cpn10 recombinante en
comparación con ratones tratados con vehículo solo. Se indujo la EAE
en ratones (n = 10 por grupo) con el péptido PLP
p139-151 y la cpn10 (10 \mug/ratón/48 h ó 2,5
\mug/ratón/48 h) o vehículo solo, administrados ip desde el día 0
hasta el día 20. A partir del día 8, se monitorizaron diariamente
los signos clínicos y se registró la discapacidad total de cada
ratón. Los resultados se expresan como discapacidad media/grupo.
Figura
8
Puntuación de la discapacidad media de la
PLP-EAE en ratones SJUJ (sem) tratados con a) cpn10
recombinante (rcpn10) o rcpn10+IFN-\beta, b)
IFN-\beta o rcpn10+IFN-\beta,
comparados con ratones tratados con vehículo solo. La EAE se indujo
mediante inoculación con péptido PLP el d 0, y los ratones (n =
10/grupo) recibieron a) rcpn10 (2,5 ug/ratón) ip cada dos días desde
d 0 hasta d 20, b) IFN-\beta (5 \times 10^{3}
unidades/ratón) sc cada dos días desde d 10 hasta d 20, o una
combinación de ambos. Los ratones control recibieron vehículo solo.
Desde d 8 hasta d 60, se monitorizaron diariamente los signos
clínicos y se registró la puntuación de discapacidad media de cada
grupo. Los resultados se expresan como puntuación de discapacidad
media por grupo.
Figura
9
Puntuación de la discapacidad media total (\pm
sem) de la PLP-EAE en ratones SJUJ, tratados con
cpn10, IFN-\beta o una combinación de ambos,
durante el ataque primario y el período de recidiva. Se indujo la
EAE mediante inoculación con péptido PLP en d 0, y los ratones se
trataron con rcpn10 ip (2,5 \mug/ratón cada dos días desde d 0
hasta d 20), IFN-\beta sc (5.000 unidades/ratón en
días alternos, desde d 10 hasta d 20), o una combinación de ambos.
Los ratones control recibieron vehículo solo. Los signos clínicos se
monitorizaron desde d 8 hasta d 21 y desde d 22 hasta d 60. El
tratamiento combinado con rcpn10 e IFN-\beta
suprimió significativamente la discapacidad durante el ataque
primario en comparación con el grupo control (*p = 0,050), tal como
lo hicieron la rcpn10 o la rcpn10+IFN-\beta
durante el período de recidiva (**p = 0,030, ***p = 0,014).
Figura
10
Secciones de la médula espinal sacra de (A) ratón
control y (B) ratón tratado con cpn10 recombinante (2,5
\mug/ratón, ip en días alternos desde d 0 hasta d 20) obtenidas en
d 14. En el ratón control (A) había inflamación (flecha grande) y
áreas de desmielinación prominentes (flechas pequeñas) en muchas
fibras. En el ratón tratado con cpn10 (B), se observó inflamación
(flecha grande) en las regiones subpiales con poca desmielinación
evidente.
Figura
11
Supresión in vitro de la proliferación de
linfocitos estimulados por el MBP mediante la rcpn10, cpn10
sintética (scpn10) e IFN-\beta. Se recuperaron
linfocitos, a partir de nódulos linfáticos de drenaje de ratas, 10
días después de la inoculación con MBP y se incubaron (2 \times
10^{5} células) con MBP (20 \mug/ml) y rcpn10, scpn10 e
IFN-\beta en las concentraciones mostradas. Los
pocillos control contenían: a) células con MBP, sin cpn10, ó b)
células sin MBP, sin cpn10. Las placas se incubaron durante 3 días y
se pulsaron durante las últimas 18 horas con 0,5 \muCi
[metil-3H]timidina. La proliferación se
verificó mediante la radiactividad incorporada en las células, y se
expresó como índice de estimulación (media de los pocillos con
MBP/media de los pocillos sin MBP; se indican las desviaciones
estándares). Los resultados en los pocillos con cpn10 ó
IFN-\beta se compararon con aquéllos en los
pocillos sin cpn10 ó IFN-\beta. ***p < 0,001,
*p = 0,05 (ensayo t de Student).
\newpage
Figura
12
Actividad del IFN-\beta, de la
cpn10 sintética (scpn10), y de la cpn10 recombinante (rcpn10) en el
ensayo de inhibición rosetas. Las preparaciones de cpn10 (50
\mug/ml) e IFN-\beta (0,5 \mug/ml) se
diluyeron 10 veces y se determinó el título de inhibición rosetas de
cada dilución. La dosis limitante (logaritmo de la inversa de la
dilución de la muestra, con la desviación estándar indicada) se
registró como la dilución más elevada de una muestra que
proporcionaba un resultado positivo en el ensayo.
Tabla
1
Lista de preparaciones de
IFN-\beta usadas actualmente en el tratamiento de
la MS. sc = inyección subcutánea; im = inyección intramuscular.
Tabla
2
El tratamiento con cpn10 recombinante disminuye
la puntuación clínica total media de la MBP-EAE en
ratas Lewis. Las ratas se inocularon con MBP en una planta de pie
posterior el día 0. La cpn10 o el vehículo solo se administraron
intraperitonealmente (ip) u oralmente (7 ratas por grupo) a los
intervalos de tiempo indicados, comenzando el día 0 hasta el día 17.
Los signos clínicos se registraron diariamente (ver procedimientos)
desde el día 10 hasta el día 20, y el examen de estos grupos se
continuó hasta el día 35 (indicado con *), y se determinó la
puntuación clínica media por rata para cada grupo. La puntuación
clínica total media por rata en el grupo de ensayo se comparó con la
puntuación clínica total media por rata en el grupo que recibía el
vehículo solo, ensayado de forma concurrente (ensayo de suma de
rangos de Mann-Whitney).
Tabla
3
El tratamiento con rcpn10 disminuye la puntuación
de discapacidad total de la PLP-EAE en ratones
SJL/J. Se indujo la EAE en ratones SJL/J con el péptido PLP
139-151 (Greer et al., J. Immunol.,
156:171-179 (1996)). Los ratones (10 por grupo) se
trataron con rcpn10 ó vehículo, y se ensayaron clínicamente desde el
día 8 hasta el día 42 ó el día 60. Los resultados se registraron
como puntuación de discapacidad media total/ratón, a lo largo del
período de examen, en el grupo tratado con rcpn10 y comparados con
los del grupo que recibía el vehículo solo ensayado concurrentemente
(ensayo de la suma de rangos de Mann-Whitney).
Tabla
4
El tratamiento de combinación con cpn10
recombinante (rcpn10) e IFN-\beta disminuyó la
puntuación clínica total de la PLP-EAE en ratones
SJL/J. Se indujo la EAE en ratones SJL/J con el péptido PLP
139-151. Los ratones (n = 10 por grupo) se trataron
con rcpn10, IFN-\beta, o ambos en combinación, o
con vehículo solo, tal como se describió previamente. Los ratones de
verificaron clínicamente desde el día 8 hasta el día 60, y desde el
día 8 hasta el día 21, y desde el día 22 hasta el día 60. Los
resultados se registraron como puntuación clínica media total por
ratón en cada grupo a lo largo del período de examen. Los resultados
en los grupos de tratamiento con rcpn10, IFN-\beta
y rcpn10 + IFN-\beta se compararon con los del
grupo que recibía el vehículo solo tratado concurrentemente (ensayo
de suma de rangos Mann-Whitney).
Tabla
5
Prevención de la muerte anafiláctica inducida por
el antígeno en ratones SJL/J. Se indujo la EAE en 4 grupos de
ratones SJL/J con el péptido PLP 139-151 en d 0. El
día 0, los Grupos 1 y 2 recibieron 2,5 \mug cpn10 por ratón/48 h
ip, mientras que los Grupos 3 y 4 recibían vehículo solo. El día 10,
el Grupo 1 y el Grupo 3 recibieron 0,5 \times 10^{4} unidades
de IFN-\beta de ratón en PBS/0,1% BSA, y los
Grupos 2 y 4 recibieron PBS/BSA. Desde el día 8, los ratones se
pesaron y examinaron diariamente en busca de signos clínicos de la
EAE. Los datos muestran el número de ratones en cada grupo que
murieron de 8 a 12 días después del comienzo del tratamiento con
IFN-\beta en PBS/0,1% BSA o PBS/BSA solo, como
una fracción del total de ratones en los respectivos grupos. Una
comparación estadística de las proporciones de muertes entre los
Grupos 1 y 2 vs los Grupos 3 y 4 reveló un valor de p < 0,02
usando el análisis de Chi-cuadrado.
Se apreciará que la presente invención ha
surgido, al menos en parte, del descubrimiento realizado por los
presentes inventores de que la cpn10 y el
IFN-\beta actúan a través de mecanismos distintos
para cooperativamente aliviar ratones y ratas de los síntomas de la
EAE. En particular, el tratamiento combinado con
IFN-\beta y cpn10 mostró una capacidad
marcadamente mejorada para prevenir la recidiva de la EAE a
continuación del cese del tratamiento. En consecuencia, este
descubrimiento tiene implicaciones para el tratamiento de la MS en
humanos, siendo la EAE el mejor modelo animal experimental de la MS
humana. En relación a esto, la administración de
IFN-\beta es un tratamiento bien conocido de la
MS, pero produce efectos secundarios, particularmente a dosis más
elevadas de IFN-\beta. Por tanto, la presente
invención proporciona una terapia de combinación en donde la cpn10 y
el IFN-P proporciona un alivio mayor de los síntomas
de la enfermedad que el IFN-\beta solo, y de ese
modo reduce la necesidad de que el IFN-\beta se
administre a dosis que producen efectos secundarios. Debería
apreciarse que el IFN-\beta se ha hecho un
tratamiento tal indispensable para la MS que la terapia combinada
usando la cpn10 y el IFN-\beta, será
extremadamente atractiva ya que a los pacientes no tiene porque
retirárseles el tratamiento con IFN-\beta, o se
les puede retirar con
\hbox{una probabilidad reducida de
recidiva de la MS.}
En un primer aspecto, la presente invención
ofrece por tanto la reividicación 1.
En una realización preferida, la invención se usa
para prevenir la recidiva de la MS.
Tal como se usa en ésta, "recidiva de la MS"
es la recurrencia de los síntomas de la MS después de la
recuperación del ataque primario. La recidiva de la MS puede
ocurrir, por ejemplo, si se retira a un individuo de la terapia con
IFN-\beta o si se reduce la cantidad de
IFN-\beta debido al riesgo de aparición de efectos
secundarios. El procedimiento de la invención podría prevenir la
recidiva de la MS, en tanto que la reaparición de los síntomas de
la MS podría retrasarse, o en tanto que los síntomas se reducen en
gravedad.
Por "cantidad farmacéuticamente efectiva" se
quiere indicar una cantidad de medicamento o droga, por ejemplo,
cpn10 e IFN-\beta, que, cuando se administra a un
individuo, previene, alivia, reduce o elimina los síntomas de la
enfermedad en dicho individuo, y/o reduce la gravedad o duración de
dichos síntomas de la enfermedad. Se entenderá también que la
presente invención contempla la administración de cpn10 e
IFN-\beta en cantidades en las que solos, la
cpn10 o el IFN-\beta podrían se inefectivos o
subóptimos, pero en combinación son farmacéuticamente efectivos.
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
efectiva de cpn10 e IFN-\beta comprende
5-60 mg de cpn10.
Más preferiblemente, la cantidad
farmacéuticamente efectiva de cpn10 e IFN-\beta
comprende 10-30 mg de cpn10.
Preferiblemente, la cantidad farmacéuticamente
efectiva de cpn10 e IFN-\beta comprende
1-10 millones de Unidades Internacionales (MIU) de
IFN-\beta.
Más preferiblemente, la cantidad
farmacéuticamente efectiva de cpn10 e IFN-\beta
comprende 4-6 MIU de
IFN-\beta.
La persona capacitada apreciará que las
cantidades farmacéuticamente efectivas antes mencionadas se calculan
en términos de un individuo típico de 70 kg. En consecuencia, las
dosis podrían variar dependiendo del peso, edad, sexo, salud general
y forma física del individuo, y de cualesquier otros tratamientos a
los que el individuo se esté sometiendo. Además, la cantidad de
cpn10 e IFN-\beta administrada será
interdependiente con la frecuencia y programación de la
administración.
En relación a esto, se contempla que la
frecuencia y programación de administración de la cpn10 e
IFN-\beta podría variar. En consecuencia, será
evidente que hay dos modos de tratamiento contemplados dentro del
ámbito de la invención:
- (i)
- tratamiento combinado con IFN-\beta y cpn10, en donde cada uno se administra en instantes diferentes y/o con frecuencia diferentes; y
- (ii)
- tratamiento en los que el IFN\beta- y la cpn10 se administran juntos.
Preferiblemente, la cpn10 se administra
diariamente, aunque también es posible la administración de forma
menos frecuente (por ejemplo, dos o tres veces semanalmente).
Tal como se discutirá en ésta más adelante, el
IFN-\beta usualmente se administra una vez por
semana o tres veces por semana, dependiendo de la fuente de
IFN-\beta. Tales frecuencias de administración
podrían mantenerse con independencia de cuán frecuentemente se
administra la cpn10. Sin embargo, es preferible que el
IFN-\beta y la cpn10 se administren juntos
diariamente. Este último modo de administración sería
particularmente apropiado cuando la cpn10 y el
IFN-\beta están combinados en dicha composición
farmacéutica para la inyección subcutánea o intramuscular.
En una realización, el
IFN-\beta se administra mediante inyección
subcutánea o intramuscular, y la cpn10 se administra mediante
inyección o oralmente.
Preferiblemente, la cpn10 se administra
oralmente, tal como en forma de tableta o cápsula.
En otra realización, el
IFN-\beta y la cpn10 se administran juntos
mediante inyección intramuscular o subcutánea.
La cpn10 se proporciona preferiblemente en forma
sintética recombinante purificada. Alternativamente, la cpn10 podría
producirse mediante síntesis química. Sin embargo, una persona
capacitada entenderá que el tamaño de la cpn10 podría hacer de la
síntesis química un opción menos preferida.
En relación a esto, se conocen en la técnica
secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cpn10 apropiadas,
aunque, por conveniencia, se remite la persona capacitada a las
siguientes secuencias de cpn10 de mamífero:
- (i)
- cpn10 humana (Nº de acceso de la NCBI Entrez U07550; Chen et al., Biochim. Biophys. Acta., 1219:189-190 (1994));
- (ii)
- cpn10 de ratón (Nº de acceso de la NCBI Entrez U09659; Dickson et al., J. Biol. Chem., 269:26858-26864 (1994)); y
- (iii)
- cpn10 de rata (Nº de acceso de la NCBI Entrez X71429; Ryan et al., FEBS Lett., 337:152-156 (1994)); las cuales se incorporan en ésta por referencia.
En ésta se proporciona a continuación un ejemplo
de producción y purificación de cpn10 sintética recombinante usando
el sistema pGEX. Otra estrategia útil podría ser usar sistemas de
expresión en eucariotas, tales como los sistemas de expresión en
levaduras o baculovirus, para la producción de cpn10 sintética
recombinante. Las ventajas potenciales de tales sistemas respecto la
expresión en bacterias son que la cpn10 sería producida en una
célula eucariota y sin un extremo N-terminal
modificado. Esto podría conducir a una actividad específica mayor y
una estabilidad mejorada. Los ejemplos de procedimientos útiles para
la expresión de proteínas recombinantes pueden hallarse en los
Capítulos 5-7 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN
SCIENCE (Eds. Coligan et al., John Wiley & Sons Inc.,
1995-99), los cuales se incoporan en ésta por
referencia.
Hay actualmente tres fuentes de
IFN-\beta usadas en el tratamiento clínico de la
MS. Éstas, junto con otra información relevante se listan en la
Tabla 1.
Por ejemplo, Betaseron (o Betaferon) es
usualmente suministrado por Schering en forma deshidratada, junto
con dextrosa y albúmina de suero humana como portador o diluyente.
También se incluye NaCl al 0,54% para actuar como un portador o
diluyente acuoso, el cual rehidrata el
IFN-\beta/dextrosa/albúmina de suero humana
deshidratado antes de la inyección.
De forma apropiada, la composición farmacéutica
comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Por "portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable" se quiere significar un agente de relleno, diluyente
o sustancia de encapsulación sólido o líquido, el cual puede usarse
de forma segura en la administración sistémica. El antes mencionado
portador o diluyente acuoso de NaCl al 0,54%, el cual rehidrata el
IFN-\beta/dextrosa/albúmina de suero humana
deshidratado, es un ejemplo. Otros ejemplos de portadores
particularmente apropiados para el IFN-\beta se
proporcionan en las patentes estadounidenses nº 4.992.271 y
5.643.566, las cuales se incorporan en ésta por referencia.
Dependiendo de la ruta de administración
concreta, podrían usarse una variedad de portadores
farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Estos
portadores podrían seleccionarse a partir de un grupo que incluye
azúcares, almidones, la celulosa y sus derivados, la malta, la
gelatina, el talco, el sulfato de calcio, aceites vegetales,
aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas
con fosfato, emulsionantes, la solución salina isotónica, y agua
libre de pirógenos.
Las formas de dosificación incluyen las tabletas,
las dispersiones, las suspensiones, las inyecciones, la soluciones,
los jarabes, las pastillas, las cápsulas, los supositorios, los
aerosoles, los parches transdérmicos, y similares. Estas formas de
dosificación podrían incluir también los dispositivos de liberación
controlada y otras formas de implantes modificados para actuar de
esta forma. La liberación controlada del agente terapéutico podría
efectuarse recubriendo el mismo, por ejemplo, con polímeros
hidrofóbicos, incluyendo las resinas acrílicas, las ceras, los
alcoholes alifáticos superiores, los ácidos polilácticos y
poliglicólicos, y ciertos derivados de la celulosa tales como la
hidroxipropilmetilcelulosa. Además, la liberación controlada podría
efectuarse usando matrices de polímero, liposomas y/o
microesferas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención apropiadas para su administración oralmente o mediante
inyección podrían presentarse como unidades discretas, tales como
cápsulas, bolsitas o tabletas, o como un polvo o gránulos, o como
una solución o una suspensión en un líquido acuoso, un líquido no
acuoso, una emulsión de
aceite-en-agua o una emulsión de
agua-en-aceite. Tales composiciones
podrían prepararse mediante cualquiera de los procedimientos de
farmacia, pero todos los procedimientos incluyen el paso de poner la
cpn10 y/o el IFN-\beta en asociación con el
portador. En general, las composiciones se preparan mezclando
uniforme e íntimamente la cpn10 y/o el IFN-\beta
con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o
ambos, y, a continuación, si es necesario, moldeando el producto en
la presentación deseada.
También se contemplan los portadores que asisten
en la administración pulmonar, tal como a través de aerosoles o
inhaladores nasofaríngeos, tal como es bien conocido en la
técnica.
Será por tanto evidente que se contempla un
equipo para el tratamiento de la MS. En tal caso, el
IFN-\beta y la cpn10 podrían proporcionarse en
forma deshidratada junto con el portador o diluyente, y rehidratarse
ambos antes de la inyección. Alternativamente, el equipo podría
incluir la cpn10 en forma de tableta o cápsula, en cuyo caso la
cpn10 se administra oralmente, mientras que el
IFN-\beta se rehidrata en el portador o diluyente
para su administración mediante inyección.
También se contempla, en relación a dicho equipo,
las agujas, jeringas, inhaladores, los contenedores de aerosol, y
similares, para asistir en la administración de cantidades
farmacéuticamente efectivas de cpn10 e
IFN-\beta.
De forma la invención pueda entenderse con más
detalle, se remite la persona capacitada a los siguientes ejemplos
no limitantes.
Las ratas Lewis hembra (cepa JC), de
8-10 semanas de edad, se obtuvieron del Central
Animal Breeding House, The University of Queensland. Los ratones
SJL/J hembra, de 8 a 12 semanas de edad, se obtuvieron del Animal
Resources Centre, Western Australia. Los ratones Quackenbush no
consanguíneos hembras maduras se obtuvieron del Central Animal
Breeding House.
Todos los animales se mantuvieron con un aporte
continuo de comida seca para ratón/rata y agua, en habitaciones con
temperatura (22-26ºC) y luz (12 h luz, 12 h
oscuridad) controladas. Antes de los procedimientos quirúrgicos, las
ratas (peso promedio, 170 g) se anestesiaron con una mezcla
anestésica intraperitoneal (0,2 ml) que contenía 10 ml de ketamina
(100 mg/ml), 6,2 ml de xilazina (20 mg/ml), 0,8 ml de atropina (600
\mug/ml) y 10 ml de solución salina (0,9% w/v). Todas las
investigaciones en animales se realizaron de acuerdo con las
indicaciones del Australian National Health and Medical Research
Committee, con aprovación ética del Animal Experimentation Ethics
Committee de The University of Queensland.
La cpn10 humana recombinante se preparó usando el
sistema de expresión bacteriano del plásmido pGEX-2T
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) tal como se describe
en la Publicación Internacional Nº W095/15338, la cual se incorpora
en ésta por referencia. De forma resumida, usando una tecnología en
lotes, se recuperó la proteína de fusión con la
S-transferasa de glutatión a partir del lisado de
células con un gel glutatión-Sepharose 4B (Amersham
Pharmacia Biotech), se separó la cpn10 con trombina [tampón
Tris-HCl 0,05 M pH 8,0/NaCl 0,15 M/CaCl_{2} 2,5
mM, 1000 unidades de trombina (Sigma T6884;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); tampón 1] y se
recuperó en el sobrenadante (muestra 1). A continuación se lavó el
gel con un tampón de salinidad elevada (Tris-HCl
0,05 M pH 8,0/NaCl 2 M; tampón 2) (muestra 2). Para su inclusión en
el ensayo de proliferación de linfocitos (ver más abajo), la cpn10
se purificó en una columna Resource RPC (Amersham Pharmacia
Biotech); como preparación de control se usó un ensayo en vacío. La
concentración de proteína en el sobrenadante (muestra 1 de la
cpn10) y en el lavado con salinidad elevada (muestra 2 de la cpn10)
es estimó mediante el procedimiento de Lowry et al., J.
Biol. Chem., 193:265-275 (1951). La pureza de
las preparaciones se determinó mediante SDS-PAGE
usando geles de 15% Tris-Tricina (Schagger & von
Jagow, Analytical Biochem., 166:368-379
(1987)). La concentración de cpn10 se determinó mediante un ELISA en
sándwich con doble anticuerpo, y la bioactividad se determinó en el
ensayo de inhibición de rosetas (Cavanagh & Morton, Today's
Life Sciences, 8:24-27 (1996)). La secuencia de
aminoácidos de la cpn10, preparada usando el sistema de expresión
pGEX-2T, es idéntica a la de la cpn10 humana con la
adición de G-S-M en el extremo
N-terminal, y la molécula no está acetilada.
La cpn10 sintética (scpn10) se preparó paso a
paso mediante técnicas en fase sólida en una forma acetilada
N-terminalmente (Love et al., 1998, en:
New Methods for the Study of Biomolecular Complexes, Vol.
510, Serie C: Mathematical and Physical Sciences. Ed. Standing &
Chernushevich. NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers,
Holanda, pp. 171-179.
IFN-\beta de ratón recombinante
(Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla CA, EE.UU.),
se suministró en PBS que contenía un 0,1% p/v de BSA a 48,4 \mug
de proteína (4,5 \times 10^{5} unidades) por ml. El
IFN-\beta de rata recombinante (0,1 mg/l \times
10^{5} unidades; BioSource International, Camarillo, CA, EE.UU.)
se ensayó en el ensayo de proliferación de linfocitos. El
IFN-\beta de rata se disolvió en 1,0 ml de agua
destilada y se congeló en alícuotas a -70ºC, descongelándose sólo
una vez. El vehículo solo consistía en PBS con 0,1% p/v de BSA
(PBS/BSA; Sigma #9418).
El péptido PLP encefalitogénico, residuos
139-151 (HCLGKWLGHPDKF; Greer et al., J.
Immunol., 156:371-379 (1996)), se sintetizó
mediante técnicas de fase sólida paso a paso, y se purificó mediante
HPLC en fase inversa. La pureza se determinó mediante espectrometría
de masas con electrospray (\leq 90% puro).
La proteína básica de mielina (MBP) se preparó a
partir de cerebros de cobayas mediante el procedimiento de Deibler
et al., Prep. Biochem., 2:139-165
(1972). La MBP en 0,9% p/v de NaCI (solución salina) se emulsionó en
un volumen igual de adyuvante de Freund incompleto que contenía 4
mg/ml de Mycobacterium butyricum. El día 0, bajo anestesia,
se inocularon las ratas en la planta de un pie posterior con 0,1 ml
de emulsión (50 \mug MBP/rata). A partir del día 10, las ratas se
pesaron y monitorizaron en busca de signos clínicos diariamente; el
grado de debilidad de la cola, miembros posteriores y miembros
anteriores se valoró separadamente en una escala de 0 (sin
debilidad) hasta 4 (parálisis total), tal como describió Pender,
J. Neurol. Sci., 75:317-328 (1986)). Cada día
de examen, se registró la discapacidad total de cada rata, y los
resultados se expresaron como la puntuación de discapacidad
media/grupo. Las ratas usualmente se recuperaron de la enfermedad
hacia el día 20, aunque en algunos casos se observó una recidiva en
la semanas siguientes después de la recuperación.
Se trataron ratas con cpn10 o un vehículo de
control apropiado, empezando el día de la inoculación hasta el día
17, en dosis que oscilaban desde 1 \mug hasta 50 \mug,
administradas cada 24 ó 58 horas (ver Tabla 2). La muestra 1 de
cpn10 o el tampón 1 se administraron a ratas sin tratamiento
adicional. La muestra 2 de cpn10 o el tampón 2, a continuación de la
adición de un 1% de suero de rata normal, se dializaron durante la
noche frente a PBS, antes de su administración. La cpn10 se
administró bien intraperitoneal (ip) u oralmente con un aguja de
alimentación curvada (O/F, alimentación oral), y el peso y
valoración clínica de cada rata se registró hasta el día 20. Las
ratas que recibían 50 \mug/24 h se examinaron hasta el día 35.
El tratamiento de ratas EAE con cpn10, bien
intraperitoneal u oralmente, resultó en una disminución dependiente
de la dosis de la discapacidad y de la pérdida de peso entre los
días 10 a 20 (Tabla 2). En los grupos de ratas que recibían 50
\mug/día, no hubo diferencia en la disminución total en la
discapacidad entre las ratas que recibieron la cpn10 i.p. u
oralmente (Figuras 1 y 2). No se observó incidencia de recidivas en
ninguno de estos grupos, en comparación con un bajo nivel de
recidiva en el grupo control. Se observó una disminución inesperada
en la pérdida de peso, en comparación con el grupo control (Figura
3). Una vez las ratas habían entrado en la fase de recuperación, su
ganancia de peso era paralela a la de los ratones control (Figura
3).
En las dosis de cpn10 ensayadas, los animales no
estaban completamente protegidos frente a los signos clínicos de la
EAE, pero no fue posible ensayar dosis más elevadas debido al
suministro limitado de cpn10. También se consideró que esta molécula
no era ideal debido a la alteración en su extremo
N-terminal, la cual interfería con la unión a las
proteínas portadoras del suero. Sin embargo, se demostró una
disminución significativa en la puntuación clínica y en la pérdida
de peso con la dosis elevada. No se observaron recidivas en los
ratones tratados con la cpn10 al cesar el tratamiento el día 17, y
no hubo un efecto a largo plazo sobre la ganancia de peso. Estos
resultados contrastan con los observados a partir del tratamiento de
ratas con IFN-\beta (Ruuls et al., 1996,
supra).
Se inocularon ratas con MBP, a continuación se
dividieron en 4 grupos, 4 ratas/grupo. Los Grupos 1 y 4 recibieron
el vehículo solo, los Grupos 2 y 3, cpn 10 (50 \mug/rata/24 h)
respectivamente oral e intraperitonealmente, desde el día 0 hasta el
día 16. El día 15, se midió el grosor de la oreja en ambas orejas de
las ratas usando un micrómetro de ingeniero (Mitutoyo), a
continuación se inyectaron 20 \mug de MBP en 10 \mul de solución
salina en la base de ambas orejas en los Grupos 2 a 4. Las ratas del
Grupo 1 recibieron solución salina sola. Transcurridas 24 horas,
ambas orejas se midieron de nuevo y la inflamación de las orejas se
determinó mediante sustracción.
Se observó una inflamación sustancial de la oreja
en las ratas del Grupo 4 que recibían el vehículo control,
desafiadas con MBP (Figura 4). Una inflamación significativamente
menor se desarrolló en las ratas que recibieron tratamiento con
cpn10, bien oralmente (Grupo 2) o intraperitonealmente (Grupo 3),
antes del desafío con MBP. Las ratas del Grupo 1 tratadas con
vehículo control y desafiadas con solución salina no mostraron
diferencia en el grosor de la oreja. Visualmente, esta diferencia
era muy marcada, puesto que había una considerable área roja
inflamada alrededor de la base de la oreja en las ratas del Grupo 4,
la cual no era aparente en los Grupos 2 y 3. No hubo una diferencia
significativa en la inflamación de la orejas entre los Grupos
1-3.
\hbox{Se obtuvieron resultados similares
en experimentos duplicados.}
Estos resultados confirman que la cpn10, al igual
que el IFN-\beta, suprime la respuesta inmune Th1
y que la cpn10, administrada oralmente, es tan efectiva como la
cpn10 i. p. en este aspecto.
El día 16 del tratamiento de las ratas EAE con
vehículo solo, o cpn10 (50 \mug/rata/24 h), i.p. u oralmente (n =
3/grupo), se obtuvieron muestras de sangre a partir de la cola, y se
mezclaron con EDTA para los recuentos de WBC, y se prepararon frotis
de sangre teñidos con Wright-Giemsa para los
recuentos diferenciales.
Los resultados se muestran en la Figura 5. No
hubo una diferencia significativa en los recuentos de neutrófilos,
linfocitos y WBC totales entre los tres grupos. Se obtuvieron
resultados similares en experimentos duplicados.
Estos hallazgos, junto con aquéllos que
demuestran que la administración de 50 \mug de cpn10 diariamente a
ratas no afecta su ganancia de peso durante el período de
recuperación, sugieren que la cpn10 no tiene ningún efecto
secundario adverso obvio. Una vez más, esta es una característica no
compartida con el IFN-\beta. En los humanos, el
tratamiento con IFN-\beta puede causar una
linfopenia marcada y, en ratones, Soos et al., J.
Immunol., 155:2747-2753 (1995) hallaron un 31,7%
de depresión en el recuento de linfocitos 12 horas después de la
inyección de IFN-\beta (10^{5} U/inyección).
El día 10 después de la inoculación, se
anestesiaron 2 ratas, se desangraron mediante punción cardíaca, y el
nódulo linfático poplíteo que drenaba la extremidad inoculada en
cada rata se retiró en condiciones estériles. Los nódulos linfáticos
de laminaron finamente y se suspendieron en
RPMI-1640 (ICN, Costa Mesa, CA, EE.UU.) que contenía
L-glutamina 2 mM, HEPES 25 mM,
2-mercaptoetanol 50 \muM,
Na-piruvato 1 mM, 50 \mug/ml de gentamicina, y 1%
de suero de rata Lewis desactivado mediante calor (medio de
incubación). A continuación de retirar los restos, los linfocitos
suspendidos se juntaron, se lavaron \times2, y la concentración de
células se ajustó a 4 \times 10^{6} células/ml. Antes de
ensayarla en el ensayo de proliferación, la cpn10 purificada
mediante HPLC se dializó durante 48 h (con 1% de suero de rata
normal) frente a PBS, a continuación se transfirió a medio de
incubación sobre una columna NAP-5 (Amersham
Pharmacia Biotech) y se esterilizó mediante filtración pasándola a
través de una Unidad de Filtrado Millex-GV4 de 0,22
\mum (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). El medio de control (ensayo
en blanco procedente de la HPLC) se trató de forma similar. La
concentración de cpn10 en las preparaciones filtradas se confirmó en
un ELISA en sándwich con doble anticuerpo.
Se prepararon diluciones de cpn10 en medio de
incubación desde 100 \mug/ml (10,0 \muM) hasta 20 \mug/ml
(2,0 \muM) (ver Figura 6) y se dispensaron 100 \mul de cada
dilución por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano
(placas Nuncion TMA MicroWell, Nunc, Roskilde, Dinamarca). A cada
pocillo se añadieron la MBP (50 \mul, 80 \mug/ml medio de
incubación) y la suspensión de células de nódulo linfático preparada
(50 \mul; 4 \times 106 células/ml). Los pocillos de control (6
pocillos de cada) contenían bien (a) células con MBP pero sin
cpn10, o (b) células sin MBP ni cpn10. Las placas se incubaron en
una atmósfera humedecida, a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 72 h.
Durante las últimas 18 horas, se pulsó cada pocillo con 0,5 \muCi
[metil-3H] timidina (Amersham Pharmacia Biotech) y
la radiactividad incorporada se midió en un contador de centelleo
(EG&G Wallac, Turku, Finlandia). La radiactividad incorporada
en los pocillos que contenían la cpn10 se comparó con la de los
pocillos sin cpn10. Se prepararon placas en paralelo para verificar
la viabilidad celular. Transcurridas 72 h de incubación, se retiró
el medio sobrenadante, se resuspendieron las células en 0,1% p/v de
trypan-blue en PBS (20 \mul). La viabilidad
celular se verificó mediante la exclusión del
trypan-blue.
La cpn10 suprimió la proliferación de linfocitos
inducida por la MBP de forma dependiente de la dosis (Figura 6). Por
tanto, la cpn10 puede regular a la baja las células T que reaccionan
a la MBP, tal como lo hace el IFN-\beta (van der
Meide et al., J. Neuroimmunol.,
84:14-23 (1998)).
La actividad de la cpn10 y del
IFN-\beta de rata recombinante (BioSource
International, Camarillo, CA, EE.UU.) se ensayó en el ensayo de
inhibición de rosetas usando el procedimiento descrito previamente
(Morton et al., 1976, supra; Cavanagh & Morton,
1996, supra). Se prepararon soluciones que contenían 1) 1,0
\mug de cpn10 en 0,5 ml de PBS/0,01% de BSA p/v (PBS/0,01% BSA) y
2) 1,0 \mug rIFN-\beta en 0,5 ml de PBS/0,01 %
de BSA, a continuación se transfirieron a solución salina
equilibrada de Hank/0,01% de BSA (HBSS/0,01% de BSA) sobre una
columna NAP-5 (concentración final de cpn10 e
IFN-\beta: 1,0 \mug/ml). Las muestras se
diluyeron 10 veces en HBSS/0,01% de BSA desde 10^{-5} hasta
10^{-15}, y se determinó el título de inhibición de rosetas (RIT)
de cada dilución. El título de la cpn10 (logaritmo de la inversa de
la dilución de la muestra) se registró como la dilución más elevada
de una muestra que proporcionaba un resultado positivo en el
ensayo.
La muestra de cpn10 (1,0 \mug/ml) proporcionó
un título de 10-12 en el ensayo, mientras que la
muestra de FN no dio actividad a ninguna concentración.
La cpn10 se une a las células Th1, liberando
factores supresores genéticamente restringidos, los cuales son
activos en el ensayo de inhibición de rosetas. Estos resultados
muestran que el mecanismo mediante el cual el
IFN-\beta suprime la respuesta inmune de Th1
difiere del de la cpn10.
En el modelo en rata, los resultados han mostrado
que el tratamiento con cpn10:
- (i)
- disminuye la discapacidad y la pérdida de peso en los animales con la EAE;
- (ii)
- suprime la reacción de DTH in vivo; y
- (iii)
- regula a la baja la actividad de las células encefalitogénicas (que reaccionan con la MBP) in vitro.
Por tanto, al igual que el
IFN-\beta, la cpn10 suprimirá la respuesta de Th1.
Sin embargo, los medios por los cuales esta respuesta está regulada
a la baja parecen diferir.
La cpn10 es activa en el ensayo de inhibición de
rosetas, una medida de su capacidad para liberar factores
específicos, restringidos genéticamente, desde las células T CD4+.
El IFN-\beta no tiene actividad en este
ensayo.
La administración de la cpn10 a ratas no afecta
el recuento total de linfocitos, mientras que Soos et al.,
1995, supra, han mostrado que los ratones
pre-tratados con IFN-\beta
desarrollan una linfopenia marcada. Esto se ha observado también en
pacientes que reciben el tratamiento con
IFN-\beta. A diferencia del tratamiento con
IFN-\beta, el tratamiento con cpn10 no tiene
ningún efecto a largo plazo sobre el bienestar de las ratas, tal
como se verificó mediante la ganancia de peso subsiguiente al
tratamiento.
Estos resultados han mostrado que el modo de
acción del IFN-\beta y de la cpn10 difiere, pero
que ambos pueden suprimir la respuesta inmune de Th1, y, al hacerlo,
modificar los síntomas de la EAE. Se desarrollo un modelo en ratón
de la EAE para determinar si podía conseguirse la terapia combinada
entre el IFN-\beta y la cpn10 en el tratamiento de
EAE.
La EAE se indujo en ratones SJL/J mediante
inyección sc en el flanco con 100 \mug de PLP
p139-151 y 400 \mug de H37Ra de Mycobacterium
tuberculosis (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) en una
emulsión de agua y adyuvante completo de Freund
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.; Greer et
al., 1996, supra). Cada ratón se inyectó también iv en d
0 y d 3 con 0,3 \mug de toxina de Pertussis (Bordetella
pertussis, List Biological Laboratories, Inc, CA, EE.UU.) en 0,3
ml de 0,9% p/v NaCl (solución salina). Diariamente, a partir de d 8,
los ratones se evaluaron clínicamente como sigue: 0 = sin
enfermedad; 1 = tono de la cola disminuido y andares ligeramente
torpes; 2 = atonía de la cola y/o andares moderadamente torpes y/o
pobre capacidad de estabilidad; 3 = debilidad de las extremidades; 4
= parálisis de las extremidades; 5 = estado moribundo. Los ratones
se examinaron hasta d 42 ó d 60 (ver la Tabla 3). Cada día de
examen, se determinó la puntuación de discapacidad media/ratón en
cada grupo de tratamiento.
A lo largo del período de examen, se calculó la
puntuación de discapacidad media total/ratón/grupo. Este valor se
expresó también como la puntuación de discapacidad media total en el
ataque primario (d 8 a d 21) y durante el período de recidiva (d 22
a d 42 ó d 60; ver Tabla 4) que ocurría durante le período de
examen. En los dos grupos de ratones (Experimentos #4 y #5, ver
Tabla 3), el período de examen se extendió desde d 60 hasta d 68, y
se registró la puntuación de discapacidad media total desde d 61
hasta d 68.
Se trataron grupos de ratones (n = 10/grupo) con
cpn10 recombinante (rcpn10) en dosis de 2,5 \mug, 5 \mug, 10
\mug ó 20 \mug/ratón, administradas ip cada dos días. El
tratamiento comenzó el día de la inoculación (día 0) o en el
instante de aparición de la enfermedad (día 8) y se continuó hasta
el día 18 ó 20 (ver Tabla 3). El período de examen se muestra en la
Tabla 3. Con los diferentes regímenes de dosis, la puntuación de
discapacidad media total en el grupo que recibía la rcpn10 se
comparó con la del grupo que recibía el vehículo solo ensayado
concurrentemente (ensayo de la suma de rangos de
Mann-Whitney, Sigma Stat 2.0, Jandel
Scientific).
A continuación de la inoculación con el péptido
de PLP 139-151, los ratones (10/grupo) desarrollaron
una forma recidivante crónica de la EAE. El inicio de los signos
clínicos apareció entre el día 8 y el día 10, tuvieron su máximo en
d 14 a 16, y disminuyeron hacia el día 21 (Figura 8A). Los ratones
experimentaron una recuperación incompleta y subsiguientemente
tuvieron episodios adicionales de enfermedad clínica. El tratamiento
con 2,5 \mug, 5 \mug ó 10 \mug de rcpn10 en días alternos
desde d 0 hasta el día 18 ó día 20 suprimió significativamente la
discapacidad total a lo largo del período de examen, en comparación
con el grupo que recibía el vehículo solo (Tabla 3). Mientras que 20
\mug de rcpn10/dosis proporcionaban la supresión de la enfermedad,
los resultados no eran significativamente diferentes de los del
grupo que recibía el vehículo (Tabla 3). No se observó diferencia
alguna en la respuesta de los grupos de tratamiento si el
tratamiento se iniciaba en el instante del inicio de la enfermedad
(día 8) en vez de en el momento de la inoculación (día 0; Tabla 3).
Después del día 60, los ratones en los grupos tratados con rcpn10
desarrollaron signos clínicos de EAE con una puntuación de
discapacidad media total desde el día 61 hasta el día 68 que no
eran significativamente diferentes de aquélla en los grupos de
ratones que recibían el vehículo solo (no se muestran los
datos).
Para determinar si la rcpn10 y el
IFN-\beta actúan cooperativamente en la supresión
de los signos clínicos de la EAE, se trataron grupos de ratones con
rcpn10 e INF-\beta, por separado y conjuntamente
(Figuras 8A y 8B). Se seleccionaron dosis subóptimas de rcpn10 e
IFN-\beta de forma que el efecto cooperativo
pudiera observarse fácilmente si estaba presente. Se ensayaron
cuatro grupos de ratones (n = 10/grupo). En el día de la
inoculación, los Grupos 2 y 4 recibieron 2,5 \mug de rcpn10 ip
cada dos días desde el día 0 hasta el día 20, y los Grupos 1 y 3
recibieron el vehículo. El IFN-\beta se diluyó
hasta 10^{5} unidades/ml en solución salina, y los ratones en los
Grupos 3 y 4 recibieron 5.000 unidades (0,5 \mug ; Yu et
al, 1996, supra) sc en 50 \mul de solución salina cada
dos días desde el día 10 hasta el día 20. Los ratones en los Grupos
1 y 2 recibieron 50 \mul de BSA al 0,1% en PBS, diluidos 1/4 en
solución salina. En el día 18 y el día 20, todos los ratones
recibieron tratamiento con antihistamínico (Pirilamina,
Sigma-Aldrich), 10 \mug/g de peso corporal, ip
(Jose et al., J. Exp. Med., 179:881-887
(1994)) para prevenir la anafilaxis a consecuencia de la
administración del portador de BSA presente en las preparaciones de
IFN-\beta y vehículo de control. Los ratones se
examinaron diariamente tal como se describió más arriba, hasta el
día 60, y los resultados de los grupos que recibían la cpn10,
IFN-\beta, cpn10+IFN-\beta se
compararon con el grupo que recibía el vehículo solo (ensayo de
suma de rangos de Mann-Whitney). Este experimento se
realizó por duplicado.
El tratamiento con 2,5 \mug de rcpn10 en días
alternos desde d 0 hasta el día 20 suprimió la puntuación de
discapacidad media total a lo largo del período de examen, desde el
día 8 hasta el día 60, cunado se comparaba con ratones que recibían
el vehículo solo (Figura 8A, Tabla 4). A la luz de estos resultados,
los presentes inventores compararon la eficacia de la rcpn10 e
IFN-\beta, dado que el IFN-\beta
es un tratamiento bien conocido de la MS y también presenta
actividad contra la EAE (Yu et al., 1996, supra). La
administración de 5.000 unidades de IFN-\beta en
días alternos desde el día 10 hasta el día 20 no proporcionó una
supresión significativa durante el mismo período de examen (Figura
8B, Tabla 4). Sin embargo, si se administraban juntos, la
combinación de rcpn10 e IFN-\beta proporcionaba
una supresión mayor, cuando se comparaba con el grupo control, qye
cualquiera de los reactivos suministrado solo (Figuras 8A, 8B,
Tabla 4). El efecto supresor sobre la discapacidad fue más evidente
durante el período de recidiva (día 22 a día 60) que en el ataque
primario (día 8 a día 21). Mientras que ni el tratamiento con cpn10
sola ni con IFN-\beta proporcionó una supresión
significativa durante el ataque primario, el tratamiento de
combinación fue efectivo (Figura 9, Tabla 4). Durante el período de
recidiva, la supresión de la puntuación de discapacidad media total,
comparada con el grupo control, estuvo potenciada por el uso de la
terapia de combinación (Tabla 4). Se obtuvieron resultados similares
en el experimento duplicado (no se muestran los datos).
Durante los experimentos preliminares (no se
muestran los datos), aproximadamente el 50% de los ratones moría de
10 a 12 días (es decir, día 20-día 22) después del
suministro de BSA sc, fuera en la preparación del
IFN-\beta o en el vehículo de control. Se
consideró que esto se debía al choque anafiláctico producto de la
sensibilidad a la BSA. En los experimentos descritos más arriba, los
ratones se trataron con antihistamínico en el día 18 y día 20 (Jose
et al., 1994, supra) y no ocurrieron más muertes.
El día 14 después de la inoculación, dos ratones
del grupo que recibía 2,5 \mug de cpn10 recombinante/ratón ip en
días alternos, y dos procedentes del grupo que recibía el vehículo
solo, se anestesiaron y perfundieron con el fijador de Karnovsky's
(McCombe et al., 1992, supra). Los ratones
seleccionados de cada grupo para perfusión tenían una puntuación de
discapacidad representativa de la media del grupo en ese día. Se
retiraron las médulas espinales y se impregnaron en Epox 8112 y se
tiñeron con azul de toluidina secciones semi-finas
procedentes de la médula espinal cervical (C5), torácica (T6),
lumbar (L4) y sacra (S2) y de la cauda equina. Las secciones se
examinaron en busca de evidencia de inflamación y
desmielinación.
Las secciones de múltiples niveles de la médula
espinal de un ratón control y un ratón tratado con rcpn10 se
muestran en la Figura 10. En el ratón control, puede observarse la
inflamación en las regiones subpiales y en las regiones
perivasculares dentro parénquima. Había evidencia de desmielinación,
más severa en la médula sacra y lumbar que en la médula cervical. En
el ratón tratado con rcpn10, puede demostrarse menos inflamación,
particularmente en el parénquima, y menos desmielinación.
Se determinó la actividad del
IFN-\beta, de la cpn10 recombinante, y de la cpn10
sintetizada químicamente (scpn10) en un ensayo de proliferación
in vitro de linfocitos. Antes de su uso, la rcpn10 (200
\mug/ml) y la scpn10 (100 \mug/ml), con un 1% de suero de rata
autólogo, se dializaron durante 3 días frente a una solución salina
tamponada con fosfato (PBS; tampón de fosfato sódico 0,05 M, pH
7,4/cloruro sódico 0,15 M), se transfirieron a medio de incubación
(RPMI-1640 que contenía L-glutamina
2 mM, HEPES 25 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM,
Na-piruvato 1 mM, 50 \mug/ml de gentamicina, y un
1% de suero de rata autólogo desactivado mediante calor) en una
columna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech) y se
esterilizaron mediante filtración a través de una Unidad de Filtrado
Millex-GV4 de 0,22 \mum (Millipore, Bedford, MA,
USA). El vehículo de control se trató similarmente. La
MBP-EAE se indujo en ratas Lewis mediante
inoculación con MBP. El día 10, se retiraron en 2 ratas los nódulos
linfáticos popliteales que drenaban la extremidad inoculada, y se
preparó una suspensión de células (4 \times 10^{6}/ml) en medio
de incubación. Se ensayaron células de nódulo linfático (2 \times
10^{5}/pocillo) por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo
plano en presencia de MBP (concentración final: 20 \mug/ml) e
IFN-\beta o cpn10 a concentraciones finales en el
rango 0,1-50 \mug/ml tal como se muestra en la
Figura 11. Los pocillos de control (6 pocillos cada uno) contenían
(a) células con MBP pero sin cpn10, y (b) células sin MBP y sin
cpn10. Las placase se incubaron a 37ºC, en 5% CO_{2}, durante 72
h. Durante las últimas 18 horas, se pulsó cada pocillo con 0,5
\muCi [metil-^{3}H] timidina (Amersham Pharmacia
Biotech) y se midió la radiactividad incorporada. Los resultados se
expresan como índice de estimulación, es decir, media de los
pocillos con MBP/media de los pocillos sin MBP. El índice de
estimulación con varias diluciones de cpn10 se comparó con el índice
de estimulación sin cpn10 (ensayo de la t de Student).
A continuación de 72 h en cultivo, todos, la
rcpn10, la scpn10 y el IFN-\beta, suprimían la
proliferación inducida por la MBP de células procedentes de nódulos
linfáticos de ratas MBP-EAE (Figura 11). El
IFN-\beta fue el más potente, con un 50% de
inhibición de la proliferación celular a una concentración de 1,9
\mug/ml (96 nM), en comparación con los 11 \mug/ml de scpn10
(1,1 \muM) y 28 \mug/ml de rcpn10 (2,8 \muM) para conseguir
este nivel de inhibición.
Se ensayó la actividad de la scpn10, rcpn10 y el
IFN-\beta en el ensayo de inhibición de rosetas,
el bioensayo para la cpn10 (Cavanagh & Morton, 1996,
supra). La rcpn10 y la scpn10 (50 \mug) se diluyeron 10
veces en solución salina equilibrada de Hank/0, 01% de BSA
(HBSS/BSA), desde 10^{-5} hasta 10^{-15}. El
IFN-\beta (0,5 \mug/ml) se diluyó 10 veces en
HBSS/BSA hasta 10^{-3}. El título de inhibición de rosetas (RIT)
de cada dilución se determinó usando células de bazo procedentes de
ratones Quackenbush. La dosis limitante (logaritmo de la inversa de
la dilución de la muestra) se registró como la dilución más elevada
de una muestra que proporcionaba un resultado positivo en el
ensayo.
ensayo.
En estos experimentos, la rcpn10 y la scpn10 se
comportaron idénticamente en el ensayo de inhibición de rosetas
(Figura 12). Por contra, el IFN-\beta no tenía
actividad en este ensayo en ninguna concentración.
A la luz de los experimentos discutidos en el
Ejemplo 6, se investigaron aún más las muertes de ratones
resultantes de lo que parecía ser un choque anafiláctico. Se
inocularon cuatro grupos de ratones con PLP
p139-151. El día 0 dos grupos recibieron cpn10 y dos
grupos recibieron el vehículo control. El día 10, uno de cada grupo
de cpn10 recibió IFN-\beta o PBS/BSA, mientras que
uno de cada grupo de vehículo control recibió
IFN-\beta o PBS/BSA.
Tal como se muestra en la Tabla 5, entre el día 8
y el día 12 después del inicio de las inyecciones de
IFN-\beta en PBS/BSA o PBS/BSA, 4/9 y 6/10 ratones
murieron en los grupos que recibían la BSA pero no la cpn10,
mientras que 3/10 y 0/9 ratones murieron en los grupos que recibían
la BSA y la cpn10. Se cree que estos ratones murieron de anafilaxis
a consecuencia de la administración de la proteína portadora BSA. Se
concluyó que los ratones que recibían la cpn10 estaban protegidos
frente al choque anafilático causado por la inmunización con BSA,
mientras que el IFN-\beta no proporcionaba esta
protección. También hubo una inflamación reducida en el sitio de
administración cuando se administró la cpn10.
Los resultados presentados aquí demuestran que la
cpn10 suprimía los signos clínicos de la EAE inducida con proteína
proteolípido de mielina en ratones SJL/J. Este modelo es una forma
recidivante crónica de la EAE que imita el curso clínico de la MS en
humanos. Los pacientes con MS tienen respuestas de células T
potenciadas contra el péptido PLP (Greer et al.,
Brain, 120:1447-1460 (1997)), sugiriendo aún
más que la EAE inducida con PLP es un buen modelo de la MS. La
dosis más efectiva para suprimir la discapacidad durante el período
de examen fueron 5 \mug y 10 \mug, suministrados en días
alternos. Dosis más elevadas fueron menos efectivas. Previamente,
en un estudio que demostraba que la cpn10 suministrada localmente en
el sitio del injerto podía prolongar el tiempo de supervivencia del
injerto de piel alogénica en ratas, se ha observado una reducción
similar en eficacia a dosis más elevadas. El efecto supresor de la
cpn10 en los ratones EAE fue más evidente durante el período de
recidiva que durante el ataque primario. La razón para la mayor
supresión de la discapacidad durante el período de recidiva que en
el ataque primario podría ser que la cpn10 aumenta los mecanismos
supresores naturales, activos durante este período, o que las
recidivas tienen una patofisiología diferente de la del primer
episodio. Durante los episodios más tardíos de la EAE crónica,
podría haber una extensión de la respuesta inmune contra otros
antígenos y respuestas de anticuerpos potenciadas, de forma que la
patogénesis de los episodios más tardíos difiere de la del ataque
primario. Este estudio también mostró que la cpn10 y el
IFN-\beta cooperaban en su capacidad para
suprimir la EAE. La administración de cpn10 e
IFN-\beta juntos proporcionó una mayor supresión
de la discapacidad que cualquiera sustancia administrada sola.
Aunque esto era particularmente evidente en el período de recidiva
de la enfermedad, en todo momento la cpn10 y el
IFN-\beta cooperaron en su capacidad para
suprimir la enfermedad y no se observó un efecto
antagónico.
antagónico.
La cpn10 y el IFN-\beta
reaccionaron de forma diferente en el ensayo de inhibición de
rosetas y en el ensayo de proliferación de linfocitos, sugiriendo
que difieren en su mecanismo de acción. El ensayo de inhibición de
rosetas es el ensayo mediante el cual se descubrió primero el EPF
(Morton et al., 1976, supra) y ha permanecido como el
bioensayo para el EPF y la cpn10. La acción del EPF en el ensayo de
inhibición de rosetas está mediada por linfoquinas, el
EPF-S_{1} y el EPF-S_{2},
inducidos secuencialmente a continuación de la unión del EPF a
células CD4+ en ratones y humanos (Rolfe et al., 1988,
supra ; Rolfe et al., 1989, supra). Estas
linfoquinas se denominaron factores supresores debido a su
capacidad para suprimir la reacción de hipersensibilidad del tipo
retrasado (Rolfe et al., 1988, supra). Ellas están
genéticamente restringidas en su actividad. La restricción del
EPF-S_{1} (p.m. 14-18.000) se ha
cartografiado contra la región I de la H-2 de ratón
y la HLA-DR en humanos, mientras que la del
EPF-S_{2} (p.m. \sim55.000) está localizada
contra la región Igh (Rolfe et al., 1988, supra ;
Rolfe et al., 1989, supra; Rolfe et al., 1995,
supra). La supresión de signos clínicos a continuación del
tratamiento con rcpn10 se mantuvo hasta el día 60 a pesar del cese
del tratamiento después del ataque primario. Esto sugiere la
inducción de actividad supresora a largo plazo. El
IFN-\beta no está activo en el ensayo de
inhibición de rosetas, mostrando que no usa la misma vía
supresora-inductora en la regulación a la baja de la
actividad de los linfocitos.
El IFN-\beta es
considerablemente más activo que la cpn10 en su capacidad para
suprimir la proliferación in vitro de linfocitos activados
por la MBP en respuesta a la MBP. Ambos, el
IFN-\beta (Arnason, Neurology,
43:641-643 (1993)) y la cpn10 suprimen la producció
de IFN-\gamma por parte de células T activadas. El
IFN-\beta inhibe la secreción del
IFN-\gamma, aumenta la actividad supresora
defectuosa en pacientes con MS, e inhibe la expresión de antígeno
del complejo de histocompatibilidad principal de clase II (MHC)
inducida por el IFN-\gamma sobre la superficie de
células que presentan el antígeno (The IFNB Multiple Sclerosis Study
Group, Neurology, 43:655-661 (1993)). La
cpn10 se une a subpoblaciones de células CD4+, de células CD8+ y
monocitos. La unión de la cpn10 a una subpoblación de células T CD4+
activadas resulta en la supresión de la producción de
IFN-\gamma. Los medios mediante los cuales la
cpn10 induce efectos inmunomoduladores, y cómo esto se relaciona con
su capacidad para suprimir la discapacidad en la EAE todavía ha de
determinarse.
Estos estudios han mostrado que la cpn10 puede
suprimir la EAE crónica y puede aumentar la capacidad del
IFN-\beta para suprimir los signos clínicos de la
EAE en ratones. Crucialmente, los diversos mecanismos de acción de
la cpn10 y del IFN-\beta elucidados por los
presentes inventores han abierto una nueva perspectiva sobre estos
agentes como tratamiento cooperativo de la EAE y MS. Si la cpn10 y
el IFN-\beta actuaran vía mecanismos
inmunosupresores similares, tal como sugería de hecho la literatura,
entonces no podría haber un efecto cooperativo o sinérgico
observable en el modelo de EAE. Por contra, sus diversos mecanismos
de acción y los datos de la EAE presentados en ésta, han
proporcionado una explicación para la proposición de que la cpn10 y
el IFN-\beta serán una terapia combinada útil de
la MS en humanos.
El IFN-\beta se usa ampliamente
como un tratamiento modificador de la enfermedad para la esclerosis
múltiples (MS) en humanos. Reduce la velocidad de recidiva clínica,
retrasa el momento de aparición del progreso continuado de la
discapacidad, y reduce el número de nuevas lesiones de MRI en
pacientes con esclerosis múltiple
recidivante-remitente (European Study Group on
Interferon\beta-1b, Lancet,
352:1491-1497 (1998)). Sin embargo, algunos
pacientes experimentan una progresión continuada de la discapacidad
dentro de los 2 años del inicio del tratamiento, lo que sugiere una
necesidad de estudiar aún más para investigar la eficacia del
IFN-\beta con la del IFN-\beta
más otras terapias prometedoras.
En resumen, los resultados del modelo animal
presentados en ésta sugieren que la cpn10 es un candidato potencial
para su uso en combinación con el IFN-\beta en el
tratamiento de la MS en humanos. En primer lugar, la cpn10 parece
sinergizar con el IFN-\beta en la reducción de los
síntomas de la EAE/MS. En segundo lugar, una reducción pronunciada
en la recidiva de la EAE a continuación del cese de la terapia
combinada con cpn10 e IFN-\beta sugiere que esta
podría ser un tratamiento útil, si se debiera interrumpir
temporalmente la administración del IFN-\beta
debido a sus efectos secundarios. En tercer lugar, la cpn10 parece
reducir la probabilidad de reacciones anafilácticas contra los
antígenos de la proteína portadora (tal como la BSA) típicamente
presente en composiciones farmacéuticas que incluyen el
IFN-\beta.
Se apreciará que la invención descrita en detalla
en ésta es susceptible de modificación y variación por parte de
personas capacitadas en la técnica, no obstante, tales
modificaciones y variaciones se hallan dentro del amplio espíritu y
ámbito de la invención establecidad en ésta.
| Betaseron | Avonex | Rebif | |
| Fabricante | Schering | Biogen | Ares-Serono |
| Sitio de inyección | sc | im | sc |
| Frecuencia de inyección | tres veces por semana | una vez por semana | tres veces por semana |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Suministro | Dosis | Tiempo | Período de | Puntuación | Puntuación | valor de P |
| (\mug) | (h) | tiempo de | clínica total | clínica total | ||
| examen diario | media/rata | media/rata | ||||
| (SEM) vehículo | (SEM) cpn10 | |||||
| ip | 1 | 48 | 10-20 | 34,7 (3,8) | 39,7 (2,2) | 0,252 |
| ip | 1 | 24 | 10-20 | 30,7 (3,2) | 28,3 (2,3) | 0,552 |
| ip | 20 | 48 | 10-20 | 34,7 (3,8) | 33,4 (0,5) | 0,534 |
| ip | 20 | 24 | 10-20 | 34,2 (1,4) | 24,6 (1,9) | <0,001 |
| oral | 20 | 24 | 10-20 | 38,2 (3,6) | 32,1 (2,4) | 0,180 |
| ip | 50 | 24 | 10-20* | 34,8 (3,2) | 25,4 (0,8) | 0,001 |
| ip | 50 | 24 | 10-35 | 51,0 (12,3) | 25,7 (1,0) | 0,001 |
| oral | 50 | 24 | 10-20* | 41,0 (3,4) | 27,3 (2,1) | 0,008 |
| oral | 50 | 24 | 10-35 | 52,2 (11,6) | 27,6 (2,1) | 0,005 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de | rpcn10/ | Período de | Período de | Puntuación de discapacidad | ||
| experimento | ratón/48 h | tratamiento | examen | media total / ratón \pm SEM | ||
| (\mug) | (d) | (d) | ||||
| Vehículo | cpn10 | Valor de | ||||
| recombinante | P | |||||
| #1 | 2,5 | 0-20 | 8-60 | 89,1 \pm 17,9 | 38,8 \pm 8,4 | 0,038 |
| #2 | 5 | 0-18 | 8-42 | 59,6 \pm 4,7 | 36,2 \pm 4,5 | 0,004 |
| #3 | 10 | 0-18 | 8-42 | 57,6 \pm 4,7 | 34,4 \pm 6,8 | 0,015 |
| #4 | 20 | 0-18 | 8-60 | 76,3 \pm 12,6 | 49,3 \pm 8,6 | 0,121 |
| #5 | 20 | 8-18 | 8-60 | 80,0 \pm 12,9 | 40,3 \pm 5,9 | 0,065 |
| Tratamiento | Puntuación de discapacidad media total/ratón | |||||
| Enfermedad | Ataque | Período de | ||||
| Total | Primario | recidiva | ||||
| (d 8 a d 60) | (d 8 a d 21) | (d 22 a d 60) | ||||
| Media \pm SEM | P | Media \pm SEM | P | Media \pm SEM | P | |
| Vehículo | 89,1 \pm 17,9 | 24,6 \pm 4,1 | 64,5 \pm 14,6 | |||
| cpn10 (2,5 \mug/ ratón/ 48 h desde | ||||||
| el día 0 hasta el día 20 | 38,8 \pm 8,4 | 0,038 | 14,1 \pm 2,3 | 0,065 | 24,6 \pm 8,2 | 0,050 |
| IFN-\beta (5.000 unidades/ ratón/ 48 h | ||||||
| desde el día 10 hasta el día 20 | 44,6 \pm 9,2 | 0,052 | 17,4 \pm 2,5 | 0,211 | 27,1 \pm 8,5 | 0,061 |
| cpn10 (2,5 \mug/ ratón/ 48 h desde el | ||||||
| día 0 hasta el día 20 combinada | 31,4 \pm 12,3 | 0,014 | 13,6 \pm 2,1 | 0,039 | 17,9 \pm 10,9 | 0,014 |
| con IFN-\beta (5.000 IU/ ratón/ 48 h | ||||||
| desde el día 10 hasta el día 20 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| IFN-\beta en PBS/BSA sc | PBS/BSA sc | |
| Cpn10 ip | Grupo 1: 3/10 | Grupo 2: 0/9 |
| Vehículo control ip | Grupo 3: 6/10 | Grupo 4: 4/9 |
Claims (25)
1. Uso de la chaperonina 10 (cpn10) e
interferón-\beta (IFN-\beta) en
la fabricación de un medicamento para tratar la esclerosis múltiple
(MS).
2. Uso acorde con la reivindicación 1, en donde
el medicamento es para un tratamiento para prevenir la recidiva de
la MS.
3. Uso acorde con la reivindicación 1 ó
reivindicación 2, en donde el IFN-\beta y la cpn10
se administran juntos.
4. Uso acorde con la reivindicación 1 ó
reivindicación 2, en donde el IFN-\beta y la cpn10
se administran separadamente.
5. Uso acorde con la reivindicación 3, en donde
el IFN-\beta y la cpn10 se administran mediante
inyección.
6. Uso acorde con la reivindicación 4, en donde
la cpn10 es para administración oral.
7. Uso acorde con la reivindicación 4 ó
reivindicación 6, en donde el IFN-\beta es para
administración mediante inyección.
8. Uso acorde con la reivindicación 1 ó
reivindicación 2, en donde el medicamento comprende
5-60 mg de
cpn10.
cpn10.
9. Uso acorde con la reivindicación 8, en donde
el medicamento comprende 10-30 mg de cpn10.
10. Uso acorde con la reivindicación 1 ó
reivindicación 2, en donde el medicamento comprende
1-10 Millones de Unidades Internacionales (MIU) de
IFN-\beta.
11. Uso acorde con la reivindicación 10, en donde
el medicamento comprende 4-6 MIU de
IFN-\beta.
12. Composición farmacéutica para tratar la MS,
comprendiendo dicha composición una cantidad farmacéuticamente
efectiva de chaperonina 10 (cpn10) e
interferón-\beta (IFN-\beta), y
un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. La composición de la reivindicación 12, en
donde la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 5-60 mg de
cpn10.
14. La composición de la reivindicación 13, en
donde la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 10-30 mg de
cpn10.
15. La composición de la reivindicación 12, en
donde la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 1-10 MIU de
IFN-\beta.
16. La composición de la reivindicación 15, en
donde la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 4-6 MIU de
IFN-\beta.
17. Equipo que comprende una cantidad
farmacéuticamente efectiva de chaperonina 10 (cpn10) e
interferón-\beta (IFN-\beta), y
un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
18. El equipo de la reivindicación 17, en donde
dicho IFN-\beta está en forma deshidratada, el
cual, cuando se usa, es rehidratado por dicho portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
19. El equipo de la reivindicación 18, en donde
dicho cpn10 está en forma deshidratada y, cuando se usa, es
rehidratada por dicho portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
20. El equipo de la reivindicación 17 ó
reivindicación 18, en donde dicha cpn10 está en forma de tableta o
de cápsula.
21. El equipo de la reivindicación 17, en donde
la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 5-60 mg de
cpn10.
22. El equipo de la reivindicación 21, en donde
la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 10-30 mg de
cpn10.
23. El equipo de la reivindicación 17, en donde
la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 1-10 MIU de
IFN-\beta.
\newpage
24. El equipo de la reivindicación 23, en donde
la cantidad farmacéuticamente efectiva de cpn10 e
IFN-\beta comprende 4-6 MIU de
IFN-\beta.
25. Producto que contiene chaperonina 10 (cpn10)
e interferón-\beta (IFN-\beta)
como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o
secuencial en el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS).
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