ES2255659T3 - Derivado cationico de (alquil) acrilamida, polimero basdo en estos derivados, y sistema de transfeccion que comprende dicho polimero. - Google Patents

Derivado cationico de (alquil) acrilamida, polimero basdo en estos derivados, y sistema de transfeccion que comprende dicho polimero.

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Abstract

Polímero basado en un monómero de fórmula (I) CH2=C(R1)-C(O)NH-CH2-CHCH3-O-C(O)-O-CH2-CH2-N(CH3)2 (I) en la que R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6.

Description

Derivado catiónico de (alquil)acrilamida, polímero basado en estos derivados, y sistema de transfección que comprende dicho polímero.
La presente invención se refiere al sector de los sistemas de transfección sintéticos o de bloqueo adecuados para la distribución de construcciones génicas, fragmentos de ARN o ADN en las células, especialmente en células de organismos vivos. Más en particular, la presente invención se refiere a polímeros catiónicos que son adecuados para utilizarse como sistema de distribución de ADN, ARN o genes, que se puede utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica.
En particular, la presente invención se refiere a derivados catiónicos de acrilamida, y derivados catiónicos de (alquil)acrilamida. Además, la presente invención se refiere a polímeros en base de dichos derivados como monómeros. Además, la presente invención se refiere a un sistema de transfección que comprende dicho polímero.
La terapia génica se ve como un método prometedor para corregir defectos hereditarios o para tratar enfermedades mortales, tales como el cáncer y el SIDA. En la terapia génica, los fragmentos de ácidos nucleicos o construcciones génicas se introducen en células diana para compensar la falta de un gen o para introducir una nueva funcionalidad en dichas células. Estos fragmentos de ácidos nucleicos o construcciones génicas se incorporan, preferiblemente, en plásmidos.
Si los plásmidos reconstruidos se aplican a un organismo de por sí, esto conduce, generalmente, a una baja expresión del gen introducido o a una ausencia de expresión. Existen tres razones principales para esta baja expresión. En primer lugar, los plásmidos apenas alcanzarán la población de la célula a la que se van a incorporar debido a procesos de degradación y eliminación. En segundo lugar, si los plásmidos alcanzan las células diana, no pueden pasar de manera simple la membrana celular debido a la naturaleza fuertemente polar y al tamaño de los plásmidos. En tercer lugar, si un plásmido invade una célula diana, normalmente, será incluido en un endosoma, que lo convertirá en un lisosoma. En el lisosoma, el plásmido se degradará, de manera que el gen incorporado no puede ser expresado.
Por las razones anteriores, en la terapia génica los plásmidos u otras construcciones génicas se complejan con un transportador o vehículo.
En los últimos años, se han realizado numerosos esfuerzos en la investigación de sistemas de transfección potencialmente adecuados, de origen viral y no viral (lípidos catiónicos y polímeros catiónicos). Estos sistemas de transfección deberían distribuir el gen o fragmento de ADN deseado en la célula diana y provocar su expresión en un alto grado.
La presente invención se refiere a sistemas de transfección sintéticos, y particularmente a sistemas de transfección dentro de la familia de los poliacrilatos y poli(alquil)acrilatos catiónicos y las correspondientes acrilamidas. Esta familia de polímeros catiónicos se describe en WO-A-97/15680. Dicha Solicitud de Patente Internacional muestra un sistema de transfección sintético basado en poliacrilatos, poliacrilamidas, poli(alquil C_{1-6})acrilatos o poli(alquil C_{1-6})acrilamidas que contienen sustituyentes catiónicos. En general, y más en particular, a sistemas de transfección solubles en agua o dispersables en agua, en los que los grupos orgánicos catiónicos se unen al esqueleto de los poliacrilatos o poli(alquil)acrilatos o al esqueleto de las correspondientes acrilamidas.
Preferiblemente, los grupos catiónicos unidos al grupo carboxilo tienen la fórmula -R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), en la que R_{3} representa un grupo alquileno C_{1-6} o puede sustituirse por sustituyentes inertes, y en la que R_{4} y R_{5}, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} o un grupo arilo. En lugar de los grupos acrilato mencionados anteriormente, en WO-A-97/15680 también puede haber grupos acrilamida, preferiblemente grupos con la fórmula C(O)NR_{4}R_{5}.
Más preferiblemente, el grupo catiónico comprende un grupo dimetilaminoetilo. Los grupos dimetilaminoetilo, así como otras aminas terciarias, presentes en polímeros de base acrilo, estarán, como mínimo, parcialmente protonados en condiciones fisiológicas, dando lugar a una estructura catiónica que es capaz de unir electroestáticamente estructuras de ácidos nucleicos, tales como ARN y ADN, y de este modo condensar los ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona una mejora con respecto a los sistemas de transfección catiónicos conocidos descritos en WO-A-97/15680 en la que se proporcionan polímeros para utilizar en sistemas de transfección en los que los polímeros tienen una velocidad de degradación elevada en condiciones fisiológicas, y especialmente en un medio acuoso a una temperatura de 35-39ºC y a un pH de 6,5-8. Esta mejora se consigue mediante un grupo concreto de derivados catiónicos de poliacrilamida y poli(alquil)acrilamida.
Particularmente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polímero basado en un monómero de fórmula (I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de hidrógeno, o un grupo alquilo C_{1-6}; y preferiblemente, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}, y más preferiblemente un grupo metilo. En una realización preferida, el polímero es un homopolímero.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al monómero, tal como se ha definido en el párrafo anterior. En la realización más preferida, el compuesto tiene como sustituyente R^{1} un grupo metilo; este compuesto se identifica de aquí en adelante en la presente invención como HPMA-DMAE.
Este monómero se puede preparar de forma adecuada mediante una síntesis de dos etapas, en la que en la etapa (i) se activa el N,N'-dimetilaminoetanol (DMAE) mediante 1,1'-carbonildiimidazol; en la etapa (ii) se hace reaccionar el alcohol activado con N-(2-hidroxipropil)-(R^{1}-sustituido) acrilamida (HPR^{1} A). Este proceso forma un aspecto adicional de la presente invención.
Se presume que las propiedades de degradación ventajosas del monómero de la presente invención se atribuyen al grupo de carbonilo introducido entre el grupo de dimetilaminoetanol de partida y el compuesto de acrilamida de partida. En el Ejemplo 3, a continuación en la presente invención, se muestran las características de degradación del HPMA-DMAE. En los Ejemplos 5 y 6 se muestra la degradación del polímero complejado con ADN, en los que se utiliza como referencia el comportamiento de degradación del metacrilato de poli(dimetilaminoetilo) (p(DMAEMA), uno de los polímeros más preferidos dentro del alcance de WO-A-97/15680. Adicionalmente, se muestra que este comportamiento de degradación se retiene en la forma polimerizada. En la figura 7 se muestra el posible proceso de degradación. La degradación se basa en la hidrólisis del enlace -O-C(O)-O-. Esta hidrólisis no tiene lugar o sustancialmente no tiene lugar a un pH de aproximadamente 5 ni en un medio que no favorezca la hidrólisis, tal como en DMSO.
Por esta razón, el polímero de la presente invención se puede preparar de forma adecuada mediante la polimerización radicalaria del monómero de fórmula (I) y, opcionalmente, otros monómeros (véase a continuación) en un medio acuoso que tenga un pH de aproximadamente 5,0, pH que se puede ajustar, por ejemplo, utilizando HCl; o alternativamente en DMSO u otro disolvente apolar aprótico. Cuando no se utiliza agua como medio de reacción, un iniciador de polimerización adecuado es el 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN). En G. Odian, "Principles of Polymeration" ("Principios de polimerización"), capítulo 3 "Radical Chain Polymerization" ("Polimerización radicalaria en cadena"), John Wiley and Sons, Inc. Nueva York (1991), así como en las referencias a las que hace referencia este manual, se describen algunas técnicas de preparación adecuadas.
Preferiblemente, la polimerización radicalaria se lleva a cabo en presencia de un reactivo de transferencia de cadena, por ejemplo, \beta-mercaptoetanol, 2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético. Los copolímeros se pueden obtener mezclando los monómeros en las proporciones y cantidades deseadas y sometiendo posteriormente esta mezcla a polimerización radicalaria.
El polímero basado en monómeros de fórmula (I) puede, como parte del esqueleto del polímero, comprender otros grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. Por lo tanto, la presente invención comprende tanto homopolímeros de acrilamidas y (alquil C_{1-6})acrilamidas como copolímeros de estas amidas, que comprenden diferentes unidades de acrilato, acrilamida, (alquil)acrilato o (alquil)acrilamida, y otras unidades, tales como el metacrilato de metilo, metacrilato de trietilenglicol, y metacrilato de polietilenglicol, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de glicerilo, metacrilato de laurilo, metacrilato de butilo, N-isopropilacrilamida, metacrilato de N-(3-dimetilamino)propilo, etcétera. Además, no es necesario que todas las unidades del esqueleto tengan grupos similares a acrilamida. Una parte de las unidades pueden estar formadas por, por ejemplo, N-vinilpirrolidona o acetato de vinilo.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un sistema de transfección sintético que comprende como vehículo, como mínimo, un polímero de la presente invención, catiónico y soluble o dispersable en agua, y que comprende adicionalmente un fragmento de ácido nucleico, tal como un fragmento de ARN o ADN, por ejemplo, en forma de plásmido, construcción génica u oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden utilizar como estructuras de bloqueo, por ejemplo, para controlar la síntesis de proteínas, en las células.
El sistema de transfección de la presente invención se forma mediante la incubación de moléculas de ácido nucleico y polímeros de la presente invención. Este proceso se muestra esquemáticamente en la parte izquierda de la figura 8; la parte derecha de dicha figura 8 muestra la degradación del complejo en condiciones fisiológicas. Además, la figura 9 muestra la liberación del ácido nucleico del complejo en una vista esquemática.
Más en particular, los sistemas de distribución por sí mismos se pueden preparar fácilmente poniendo en contacto los polímeros de la presente invención y los fragmentos de ácidos nucleicos, tales como fragmentos de ADN en las condiciones en las que el polímero está cargado positivamente, preferiblemente a un pH de 7,2 en un sistema tampón adecuado (por ejemplo, un tampón de PBS o HEPES) a temperatura ambiente.
En una realización preferida, los complejos polímero-polinucleótido se preparan en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente en presencia de sacarosa. La adición de una sustancia que aumenta la viscosidad posibilita la obtención de partículas más pequeñas.
La preparación del sistema de distribución se completa, normalmente, en un tiempo de complejación de 10 minutos. La etapa de preparación puede ir seguida de una etapa de separación en la que el complejo ácido nucleico-polímero se separa del polímero no enlazado. En una etapa posterior, el complejo que comprende el ácido nucleico y el polímero transportador de la presente invención se puede liofilizar, preferiblemente en presencia de un crioprotector farmacéuticamente aceptable, tal como sacarosa o manitol. En las condiciones de liofilización el complejo se puede guardar durante un largo periodo de tiempo.
Los grupos catiónicos representados en la figura 8 y el esqueleto del polímero no son tóxicos para las células, y se excretan o por el contrario se eliminan del sistema, en el que los complejos se utilizan como sistema de transfección.
La proporción en peso de los polímeros transportadores con respecto a los fragmentos de ácidos nucleicos, y especialmente con respecto a los fragmentos de ADN o ARN, parece crítica. Se obtienen resultados adecuados cuando se utilizan proporciones en peso de polímero con respecto a fragmentos de ácidos nucleicos entre 0,1 y 200; preferiblemente entre 1 y 20, más preferiblemente entre 2 y 5. El peso molecular y/o el número de los polímeros utilizados se pueden ajustar fácilmente a la naturaleza del plásmido a transportar. Habitualmente, los polímeros que tienen un peso molecular entre 1.000 y 500.000 se pueden utilizar de forma adecuada como transportadores de ADN o ARN. Preferiblemente, el peso molecular de los polímeros catiónicos utilizados según la presente invención es superior a 80.000 Da, más preferiblemente superior a 100.000 Da, lo más preferible superior a 250,000 Da. El peso molecular de los polímeros utilizados en la presente invención se puede controlar utilizando y manteniendo unas condiciones de reacción adecuadas en el proceso de polimerización.
Cabe destacar que las partículas condensadas que comprenden el polímero de la presente invención y los fragmentos de ácidos nucleicos se pueden incluir o incorporar en sistemas conocidos de distribución de fármacos, por ejemplo, en liposomas o hidrogeles.
Los genes a incorporar en los sistemas transportadores o vehículos a utilizar en el sistema de transfección sintético son, entre otros, los documentados en:
-
Mckusick, V.A., "Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes" ("Herencia mendeliana en el hombre, catálogos de fenotipos de autosómico dominate, autosómico recesivo, ligados a X"). Octava edición. John Hopkins University Press (1988).
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Stanbury, J.B., Wyngaarden, J.B., Frederickson, D.S., Goldstein, J.L. y Brown, M.S., "The metabolic basis of inherited disease" ("La base metabólica de la enfermedad hereditaria"). Quinta edición. McGraw Hill (1983).
Entre los vehículos a utilizar en las realizaciones de la presente invención se incluyen elementos reguladores virales y no virales de la expresión y/o replicación.
Estos vehículos son conocidos en el sector.
Los sistemas de transfección adecuados son capaces de reconocer una construcción génica en la población celular objetivo. Por lo tanto, el sistema de transfección de la presente invención comprende, preferiblemente, como mínimo, un grupo que reconoce selectivamente las proteínas asociadas a la superficie de las células diana. Dichos grupos de reconocimiento o dispositivos de focalización son conocidos por los técnicos en la materia y comprenden, por ejemplo, clúster de glicósidos tri y tetra antenarios, transferrina u otras construcciones proteicas, anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana celular, ligandos para receptores asociados a la superficie celular y fragmentos de unión de derivados de dichos grupos de reconocimiento. Si el sistema de poliacrilamida o poli(alquil)acrilamida de la presente invención se acopla a fragmentos génicos transportados, se distribuyen en los hepatocitos a través del receptor de galactosa de los hepatocitos. Además, la presencia de estructuras reconocibles acopladas covalentemente o no covalentemente a la parte de polímero de un complejo polímero-ácido nucleico, facilita la incorporación del fragmento de ácido nucleico, por ejemplo, una construcción génica, en la célula diana.
Además, el sistema de transfección se puede adaptar para permitir que la construcción génica libere endosomas en el sistema celular. A estas estructuras desestabilizadoras de membrana, en particular fragmentos de polipéptidos, se conjugan los sistemas de polímeros catiónicos y solubles en agua o dispersables en agua de la presente invención. Esto desestabiliza los sistemas de membranas endosómicas. Los plásmidos que incorporan una construcción génica alcanzan así el citoplasma de la célula diana, en la que la construcción génica se puede expresar en el núcleo. Algunos ejemplos de dichas estructuras desestabilizadoras de membrana, que se utilizan de forma adecuada según la presente invención, son estructuras fusogénicas, por ejemplo, ciertos péptidos y (partes de) proteínas de recubrimiento viral, por ejemplo, péptidos derivados de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (véase en este sentido, por ejemplo, Plank y otros, "The influence of Endosome-Disruptive Peptides on Gene Transfer Using Synthetic Virus-Like Gene Transfer Systems" ("La influencia de los péptidos disruptivos de endosomas en la transferencia de genes utilizando sistemas sintéticos de transferencia de genes utilizando sistemas sintéticos de transferencia de genes de tipo virus"), J. Biol. Chem. 269 (1994), 12918-12924), y particularmente el INF-7.
Otros compuestos útiles según la presente invención son los compuestos desestabilizadores de endosomas, tales como la cloroquina. Cabe destacar que la cloroquina se utiliza solamente en aplicaciones in vitro, debido a su toxicidad in vivo. Dado que la presente invención está dirigida a aplicaciones in vivo e in vitro, esta realización está dentro del alcance de la presente invención.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para introducir fragmentos de ácidos nucleicos en células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos de ácidos nucleicos con un polímero de la presente invención y, posteriormente, poner en contacto el sistema de transfección obtenido con las células
diana.
El sistema transportador de la presente invención se puede utilizar en aplicaciones tanto in vivo como in vitro.
La presente invención se describe adicionalmente en los dibujos, en los que:
La figura 1 muestra el comportamiento de degradación del HPMA-DMAE (\ding{169}) y la correspondiente formación de HPMA (\blacksquare) con el tiempo a 37ºC a pH = 10,0 (A), a pH = 7,4 (B) y a pH 5,0 (C);
la figura 2 muestra la degradación del p(HPMA-DMAE) con el tiempo a 37ºC y a pH = 7,4;
la figura 3 muestra un número de características biofísicas de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE), y particularmente el tamaño de partícula. (Zave; diámetro promedio Z, determinado mediante dispersión dinámica de luz (DLS)) (\ding{169}) y potencial zeta (\blacksquare) en función de la proporción de polímero con respecto a ADN;
la figura 4 muestra la degradación de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) a pH = 7,4 (\blacktriangle) y a pH = 5,0 (\blacksquare), así como basados en p(DMAEMA) (\ding{169}); en la figura 4(A) se monitoriza el tamaño de partícula; en la figura 4(B) se sigue la intensidad de señal con el tiempo;
la figura 5 muestra los resultados de electroforesis en gel de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) a pH = 7,4 y a pH = 5,0 y de poliplejos basados en p(DMAEMA) a pH = 7,4, incubados a 37ºC; banda 1: ADN libre; bandas
2-7: poliplejos basados en p(DMAEMA) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, bandas 8-13: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, y bandas 14-19: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 5,0), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente;
la figura 6 muestra la eficacia de transfección (A) y la toxicidad (B) de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) sin (\blacksquare) y con (\blacktriangle) el péptido disruptivo de membrana INF-7; como referencia se utiliza el p(DMAEMA) (\ding{169});
la figura 7 muestra la degradación del p(HPMA-DMAE) en fórmulas químicas;
la figura 8 muestra la complejación de ADN circular mediante p(HPMA-DMAE) y el proceso de degradación; y
la figura 9 muestra de forma esquemática la liberación del ADN tras la degradación del polímero.
A continuación, se describirá la presente invención basándose en los siguientes ejemplos no limitantes. En los ejemplos, así como en la descripción anterior, todos los porcentajes son porcentajes en peso respecto a la composición total, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1 Síntesis y caracterización del (p)HPMA-DMAE
La síntesis del monómero se llevó a cabo en dos etapas. En la primera etapa se activó el N,N'-dimetilaminoetanol mediante 1,1'-carbonildiimidazol con un rendimiento bueno del 68% y una pureza buena (> 97% por RMN). En la segunda etapa, la reacción entre el alcohol activado y la N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) se siguió en el tiempo hasta que no se detectó HPMA libre con ^{1}H-RMN.
Ejemplo 2 Polimerización de HPMA-DMAE a p(HPMA-DMAE)
La polimerización radicalaria del monómero formado en el Ejemplo 1 se llevó a cabo en una solución acuosa de HCl 1 M, con el pH ajustado a pH 5 para evitar la degradación del monómero; y también se formaron polímeros en DMSO con un rendimiento del 75% (en agua) y 80% (en DMSO). El rendimiento más elevado en DMSO se puede explicar debido a que en DMSO se evita la degradación del monómero en un mayor grado. El peso molecular promedio en peso fue de 160 kDa (en agua) y 63 kDa (en DMSO), el peso molecular promedio en número fue de 20 kDa (en agua) y 14 kDa (en DMSO).
Ejemplo 3 Degradación del monómero y del polímero
La degradación del monómero se siguió mediante RP-HPLC a 37ºC. Las áreas de pico relativas del monómero y su producto de degradación HPMA en función del tiempo se representan en la figura 1(A) para pH 10, 1(B) para pH 7,4 y 1(C) para pH 5,0. A partir de estas curvas se puede calcular la vida media del monómero a estos pH, siendo de 1,1 hora, 9,6 horas y 380 horas, respectivamente.
Para comprobar si el polímero formado en el Ejemplo 2 en agua tenía la misma velocidad de degradación que el monómero, se siguió por ^{1}H-RMN la degradación en D_{2}O tamponada con Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} a pH 7,4. La degradación se siguió mediante la integral del pico a 4,8 ppm de HPMA-DMAE, que se desplaza cuando el alcohol se elimina mediante hidrólisis. La figura 2 muestra la integral del pico de este protón en función del tiempo. Dado que la degradación se siguió durante 19 horas, a partir de esta curva se pudo estimar una vida media de 12 horas. Esta vida media estimada corresponde a la vida media del monómero a pH 7,4, indicando de este modo que la velocidad de degradación del polímero es la misma que la del monómero.
Ejemplo 4 Caracterización biofísica de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE)
Las propiedades de unión y condensación de ADN del p(HPMA-DMAE) se examinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones del potencial zeta en función de la proporción de polímero con respecto a ADN.
Más en detalle, estas características físicas de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) se examinaron en función de la proporción del polímero-nitrógeno con respecto a ADN-fosfato (N/P). El plásmido de ADN, plásmido pCMVLacZ, que contenía un gen bacterial LacZ precedido por una señal de localización nuclear bajo el control de un promotor CMV adquirido de Sanvertech (Heerhugowaard, Holanda), se diluyó en tampón de HEPES 20 mM, pH 7,4, a una concentración de 75 \mug/l. Una solución madre del polímero (5 mg/ml) se diluyó en el mismo tampón a varias concentraciones (7-450 \mug/ml). Los poliplejos se formaron mediante la adición de 700 \mul de una solución de polímero a 175 \mul de solución de ADN, se mezclaron completamente y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los diámetros promedio Z de los poliplejos formados se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) a 25ºC y las mediciones del potencial Z se llevaron a cabo tal como ha descrito Van de Wetering y otros en Bioconjugate Chem. 10 (1999), 589-597. Los diámetros promedio Z de los poliplejos se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) a 25ºC con un sistema Malvern 4700 utilizando un láser de ion argón (488 nm) que funcionaba a 10,4 mW (Unifase) y con un software PCS (espectrometría de correlación de fotones) para Windows versión 1.34 (Malvern, Reino Unido). Para el análisis de los datos, se utilizó la viscosidad y el índice de refracción del agua. El sistema se calibró con una dispersión de poliestireno que contenía partículas de 100 nm. Para el potencial zeta, se realizaron mediciones a 25ºC en una celda 5001 con DTS acuoso con una unidad Zetasizer 2000 (Malvern, Reino Unido) y con un software PCS versión 1.34 (Malvern, Reino Unido). Para la calibración del instrumento, se utilizó una dispersión de poliestireno con un potencial zeta conocido.
La figura 3 muestra que cuando se adiciona un exceso de polímero, el polímero es capaz de condensar ADN en pequeñas partículas con un tamaño aproximado de 110 nm, dando un potencial zeta positivo de aproximadamente +19 mV. Esto es comparable a los poliplejos compuestos de ADN y otros polímeros catiónicos, tales como
pDMAEMA, pDAMA (polidiaminometacrilato y particularmente poli-(éster 2-[(2-dimetil)aminoetil)-metilamino]-etílico del ácido 2-metacrílico) y polifosfacenos (preparados según el Ejemplo 1 de WO-A-97/07226).
Ejemplo 5 Desestabilización de poliplejos de p(HPMA-DMAE) y ADN
La desestabilización de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (preparados tal como se describe en el Ejemplo 4 (véase a continuación)) se examinó a pH 5,0 y 7,4 a 37ºC mediante dispersión dinámica de luz. La figura 4 representa el tamaño de partícula de los poliplejos (A) y la intensidad de la señal (B) en función del tiempo.
Aunque el tamaño de partícula de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) a pH 5,0 o pDMAEMA a pH 7,4 se mantuvieron (casi) igual durante el periodo de tiempo estudiado, el tamaño de partícula de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) a pH 7,4 aumentó de manera espectacular con el tiempo. Esto indica que el p(HPMA-DMAE) en realidad se degrada, y que debido a la disminución de la interacción entre el polímero y el ADN, las partículas se hacen más grandes. Con el tiempo, la intensidad de señal también disminuyó a pH 7,4 para el p(HPMA-DMAE), mientras que permaneció (casi) igual a pH 5,0 y para el pDMAEMA (figura 4B), indicando de nuevo la degradación del p(HPMA-DMAE) a pH 7,4 y no a pH 5,0.
Ejemplo 6 Liberación de ADN de poliplejos mediante degradación
Para investigar si el ADN liberado mediante la degradación de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) se encuentra todavía en su forma intacta, los poliplejos, preparados según el Ejemplo 4 se incubaron a 37ºC durante diferentes tiempos y, posteriormente, se sometieron a electroforesis en gel.
Particularmente, los poliplejos de p(HPMA-DMAE) y ADN plásmido se formaron mezclando 10 \mul de solución de plásmido de 200 \mug/ml con 40 \mul de una solución de pHPMA-DMAE, 200 \mug/ml, que corresponden con una proporción N/P de 5,4 y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto se realizó en HEPES 10 mM a pH 7,4 o acetato sódico 10 mM a pH 5, la fuerza iónica ajustada a 150 mM con NaCl. Como control, también se examinaron poliplejos basados en pDMAEMA a pH 7,4. Estas dispersiones de poliplejo se incubaron posteriormente a 37ºC durante 0, 2, 4, 7, 24 ó 48 horas. Después de enfriarlas hasta temperatura ambiente, se añadieron 10 \mul del correspondiente tampón y 3 \mul del tampón de muestra (0,4% (peso/volumen) de azul de bromofenol, EDTA 10 mM, 50% (v/v) de glicerol en agua) a 20 \mul de cada dispersión de poliplejo. Treinta \mul de estas soluciones se aplicaron a un gel de agarosa del 0,7% que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio y se procesaron a 100 V.
La muestra de poliplejos basados en p(HPMA-DMEA) incubada durante 2 horas a pH 7,4 se perdió aparentemente durante el procesado. La figura 5 muestra los patrones electroforéticos de los poliplejos. Para el pDMAEMA a pH 7,4 o el p(HPMA-DMAE) a pH 5,0, todo el ADN permaneció en la ranura de partida, indicando que todo el ADN estaba todavía complejado con el polímero. A pH 7,4 y 48 horas de incubación, todo el ADN se liberó de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE), indicando que el polímero estaba degradado hasta tal punto, que la complejación no tenía lugar. A las 24 horas y 7 horas de incubación, no se detectó más ADN. Esto mismo se observó para los poliplejos cuando se seleccionó una proporción de polímero con respecto a ADN N/P = 3 en los que se forman agregados grandes, probablemente porque el bromuro de etidio no es capaz de acceder al ADN. De este modo, probablemente a estos tiempos, el p(HPMA-DMAE) estaba parcialmente degradado y debido a la menor interacción entre el ADN y el polímero se formaron agregados grandes. Este fenómeno también se describe para los poliplejos de pEI-ADN en Bieber y otros, J. Control. Release 82 (2002), 441-454.
Ejemplo 7 Eficacia de la transfección y la toxicidad de poliplejos basados en p(HPMA-DMAE)
La figura 6 muestra la eficacia de la transfección y la toxicidad de los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) en células CDS-7 en ausencia o presencia del péptido disruptivo de membrana INF-7 en función de la proporción de polímero con respecto a ADN.
Más en detalle, los estudios de transfección se realizaron en células COS-7 utilizando el plásmido de pCMVLacZ como gen indicador, tal como se describe. Brevemente, se sembraron placas de 96 pocillos con células a una densidad de 3 x 104/cm, 24 horas antes de la transfección. El día de la transfección, los poliplejos se prepararon tal como se indica a continuación: se añadieron 150 \mul de solución de polímero (varias concentraciones) a 50 \mul de solución de plásmido (50 \mug/ml), y tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 50 \mul de tampón o bien, solución de INF-7 (150 \mug/ml) y los poliplejos se incubaron durante otros 15 minutos antes de la adición a las células. Después de lavar la células con HBS, se incubaron 100 \mul de dispersión de poliplejo y 100 \mul del medio de cultivo (con o sin un 10% de suero) con las células durante 1 hora. Después de eliminar el medio del poliplejo, se añadió medio de cultivo nuevo y las células se incubaron durante otras 48 horas. Todos los experimentos de transfección se realizaron en dos series idénticas en placas de 96 pocillos separadas. Una serie se ensayó para la expresión del gen indicador (\beta-galactosidasa) mediante un ensayo colorimétrico ONPG, la otra serie se utilizó para determinar el número de células viables utilizando un ensayo colorimétrico XTT. Como referencia se utilizaron poliplejos de pDMAEMA preparados a la misma concentración de ADN y proporción de N/P de 6. La actividad de transfección de esta formulación de poliplejo se ajustó a 1.
El p(HPMA-DMAE) no es tóxico para las células en todas las concentraciones probadas y es capaz de transfectar células, en cierto grado, especialmente a proporciones elevadas de polímero con respecto a ADN. Las bajas eficacias de transfección pueden ser debidas a la incapacidad de los poliplejos para escapar del endosoma.
Para incrementar el escape del endosoma se pueden utilizar péptidos disruptivos de membrana. Cuando se utilizó el péptido desestabilizador de membrana INF-7 en un experimento de transfección con poliplejos basados en p(HPMA-DMAE), se observó un incremento en la eficacia de transfección. Al mismo tiempo, se observó cierta toxicidad, pero esta toxicidad es independiente de la proporción de polímero con respecto a ADN y, por lo tanto, probablemente está provocada por el péptido.

Claims (9)

1. Polímero basado en un monómero de fórmula (I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}.
2. Polímero, según la reivindicación 1, que es un homopolímero.
3. Polímero, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}.
4. Polímero, según la reivindicación 3, en el que R^{1} es un grupo metilo.
5. Compuesto de fórmula (I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}.
6. Compuesto, según la reivindicación 5, en el que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}.
7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que R^{1} es un grupo metilo.
8. Método para preparar el compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende la activación del N,N'-dimetilaminoetanol mediante el 1,1'-carbonildiimidazol; y en la siguiente etapa (ii) el alcohol activado se hace reaccionar con N-(2-hidroxipropil)-(R^{1}-sustituido) acrilamida.
9. Sistema de transfección sintético que comprende, como mínimo, un polímero catiónico soluble en agua o dispersable en agua, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como transportador, y que comprende adicionalmente un fragmento de ácido nucleico.
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