JPH10502918A - 核酸を含有する組成物、その製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一種またはそれ以上の核酸およびカチオン性ポリマーを含有する組成物、並びに遺伝子治療、特に生体内核酸移入のためのそれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸を含有する組成物、その製造および使用 本発明は、核酸を基材とする組成物、それらの製造およびそれらの使用に関す る。さらに詳しくは、本発明は、少なくとも１種の核酸および幾つかのカチオン 性ポリマーを含んでなる組成物、および細胞中への核酸の移入、特に遺伝子治療 での利用に関する。 遺伝子治療は、欠失または異常（突然変異、異常発現など）を修正すること、 または遺伝情報を感染細胞もしくは器官中に導入することによって治療的価値を もつタンパク質を発現させることにある。この遺伝子情報は、器官から抽出され た細胞中に生体外で導入し次いで改変細胞を体内に再導入するか、または適切な 組織中に生体内で直接に導入することができる。この遺伝情報を移入するために 、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏ等，Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａ 等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（ Ｆｅｌｇｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，８４（１９８７）７４１３）、ＤＮＡとポリリジ ンとの複合体、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ，２５５（１９８０）１０４３１）などを含む各種トランスフェクション技術を 含む各種技術が記載されてきた。さらに最近では、遺伝子移入のためのベクター として、ウイルスの使用が、これらの物理化学的なトランスフェクション技術に 代わる有望な別法であることが分かった。この関係において、種々のウイルスが 、ある一定の細胞集 団に感染する能力について試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ 、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイルスおよびアデノウイルスを 挙げることができる。 しかし、現在までに開発された技術によっては、細胞および／または体内への 遺伝子移入に伴う困難性を満足に解決することはできない。特に、細胞中への核 酸の移入に関連する問題点は完全には解決されない。実際に、特に核酸のポリア ニオン的性質によって、それらの核酸が細胞膜を通過することが妨害される。裸 の核酸は生体内で幾つかの細胞型の原形質膜を通過することができることが分か っているが（特に、国際公開第９０／１１０９２号明細書を参照のこと）、トラ ンスフェクションの効率はむしろ低い。さらに、裸の核酸は、酵素による分解お よび尿中への排出のために、血漿中半減期が短い。さらに、組換えウイルスによ って、核酸の移入効率を改善することができるが、それらの使用は、病原性、伝 染、複製、組換え、形質転換、免疫抗原性などのような幾つかの危険性がある。 さらに、医薬品製造基準の説明書に従ってそれらを製造する際に幾つかの困難点 がある。 本発明は、これらの種々の問題点に対する有利な解決法を提供する。出願人は 実際に、幾つかのカチオン性ポリマーが、生体外および生体内で細胞中への核酸 の移入のために特に有利な性質を有することを示した。さらに、これらのポリマ ーは容易に入手できそして安価であるという利点を有する。また、本発明のよる カチオン性ポリマーの使用によって、ウイルス性ベクターの使用に関連する欠点 （潜在的危険性、移入される遺伝子の大きさの限定、高い経費など）を回避する ことができる。 さらに具体的には、本発明は、式（Ｉ） （式中、 −Ｒは水素原子または式 で示される基であることができ、 −ｎは２〜１０の間の整数であり、 −ｐおよびｑは整数であるが、 ただし、合計ｐ＋ｑが、ポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷Ｄａの間になる ようなものであることを理解するものとする） で示されるポリマーのトランスフェクション特性を示すことにある。 式（Ｉ）において、ｎの値が種々の単位ｐの間を変化することができることは 理解される。従って、式（Ｉ）はホモポリマーおよびヘテロポリマーの両方を包 含する。 それ故、本発明の第一の主題は、少なくとも１種の核酸および上記の一般式（ Ｉ）で示されるカチオン性ポリマーを含んでなる組成物である。 本発明はまた、核酸の細胞中への移入のために、式（Ｉ）で示されるカチオン 性ポリマーを使用することに関する。 さらに好適には、式（Ｉ）では、ｎは２〜５の間である。特に、ポリエチレン イミン（ＰＥＩ）ポリマーおよびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）ポリマーは共 に有利な性質を有する。 本発明を行うために好適なポリマーは、分子量が１０³〜５×１０⁶の間にある ポリマーである。例として、平均分子量５０，０００Ｄａのポリエチレンイミン （ＰＥＩ５０Ｋ）または平均分子量８００，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ ＰＥＩ８０Ｋ）を挙げることができる。 本発明に関して使用されるポリマーは種々の方法で得ることができる。それら は、まず第一に、対応するモノマーからアニオン性重合条件下か（例えば、エチ レンイミンの重合）、または二酸とジアミンとの重縮合によって得られたポリア ミドの還元によってか、または 別法としてジアルデヒドとジアミンとの重縮合によって得られたイミンの還元に よって、化学的に合成することができる。さらに、特にＰＥＩ５０ＫまたはＰＥ Ｉ８００Ｋのような多くのこれらのポリマーは市販されている。 本発明の組成物の最適効果を得るためには、ポリマーと核酸との各比率は好適 には、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルが（モル比Ｒ＝）０．５〜５０の間 、さらに好適には５〜３０の間であるように決定される。最も特に有利な結果は 、核酸電荷当たり５〜１５当量のポリマーアミンを使用して得られる。この比率 はもちろん、当業者によって、使用ポリマー、補助剤（下記を参照のこと）の存 在、核酸、標的細胞および使用した投与方式に従って、適用されることができる 。 本発明の組成物では、核酸はデオキシリボ核酸またはリボ核酸であることがで きる。問題の配列は天然起源または人工起源のもの、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ Ａ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列または合成もしくは半合 成配列であることができる。さらに、核酸の大きさは、オリゴヌクレオチドから 染色体までの範囲に亙って、非常に 可変的であることができる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイル スなどの起源のものであることができる。それらは、当業者に既知であるいずれ の技術によっても、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学的合成に よって、または別法として、ライブラリーのスクリーニングにより得られた配列 の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。 さらに、それらは、プラスミドベクターのようなベクター中に取り込まれること ができる。 さらに特に、デオキシリボ核酸に関して、後者は一本鎖または二本鎖であるこ とができる。これらのデオキシリボ核酸は治療的遺伝子、転写または複製を調節 する配列、アンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域などを有する ことができる。 本発明の目的のためには、治療的遺伝子は特に、治療効果を有するタンパク質 性生成物をコードしているいずれの遺伝子をも意味すると理解される。このよう にコードされたタンパク質性生成物は、タンパク質、ペプチドなどであることが できる。このタンパク質性生成物は標的細胞に関して相同的であることができる （即ち、標的細胞がいずれの疾病にも罹患していない場合、その標的細胞中で通 常に発現する生成物）。この場合、タンパク質の発現によって、例えば、細胞中 での不十分な発現または修飾のために不活性かもしくはわずかに活性であるタン パク質の発現を治すか、或いは別法として前記タンパク質を過発現（ｏｖｅｒｅ ｘｐｒｅｓｓ）することが可能になる。治療的遺伝子はまた、安定性が増強され 、活性などが改変された細胞タンパク質の変異体をコードすることができる。タ ンパク質性生成物はまた、標的細胞に関して不均質であることができる。この場 合、発現したタンパク質は、例えば、細胞中 で欠失している活性を補足または供給することができ、そのことによって細胞が 疾病を駆除するかまたは免疫応答を剌激することができる。治療的遺伝子はまた 体内に分泌されたタンパク質をコードすることができる。 本発明の目的のための治療的生成物として、さらに具体的に、酵素、血液誘導 体、ホルモン、リンホカイン、即ちインターロイキン、インターフェロン、ＴＮ Ｆなど（フランス特許出願公開第９２／０３１２０号明細書）、増殖因子、神経 伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子、即ちＢＤＮＦ、 ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、Ｈ ＡＲＰ／プリオトロンピンなど；アポリタンパク質、即ちＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡ ＩＶ、ＡｐｏＥなど（フランス特許出願公開第９３／０５１２５号明細書）、ジ ストロピンもしくはミニジストロピン（フランス特許出願公開第９１／１１９４ ７号明細書）、嚢胞性繊維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑圧遺伝子、 即ちｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（フランス特許出願公 開第９３／０４７４５号明細書）、血液凝固に関与する因子をコードしている遺 伝子、即ち因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡ修復に参加する遺伝子、自殺遺 伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）などを挙げることができる。 治療的遺伝子はまた、アンチセンス遺伝子または配列であることができ、標的 細胞中でのその発現によって、遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写が調節 される。かかる発現は、例えば、標的細胞中で、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的 であるＲＮＡ中に転写されることができ、従って欧州特許第１４０，３０８号明 細書に記載の技術に従って、タンパク 質へのそれらの翻訳を遮断することができる。他の可能な発現として、場合によ り修飾された合成オリゴヌクレオチド（欧州特許第９２，５７４号明細書）が挙 げられる。アンチセンス発現はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊することができ るリボザイムをコードしている配列を含んでなる（欧州特許第３２１，２０１号 明細書）。 上記のように、核酸はまた、人体または動物中で免疫応答を発生させることが できる抗原ペプチドをコードしている一つまたはそれ以上の遺伝子を含有するこ とができる。この特定の態様では、それ故、本発明は、ワクチンの製造または特 に微生物、ウイルスまたは癌に対して人体または動物に応用される免疫治療的処 置剤の製造を可能にする。かかるペプチドとして、特にエプスタイン・バールウ イルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許第１８５，５７３号明細書 ）または仮性狂犬病ウイルスに特異的な抗原ペプチド、またはその他として腫瘍 特異性ペプチド（欧州特許第２５９，２１２号明細書）が挙げられる。 好適には、核酸はまた、治療的遺伝子の発現および／または所望の細胞もしく は器官中の抗原ペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にする配列を含ん でなる。これらの配列は、これらの配列が感染細胞中で機能することができる場 合、本来問題の遺伝子の発現の原因となるものであることができる。それらはま た、種々の起源の配列（他のタンパク質または合成配列の発現の原因である）で あることができる。特に、それらは真核生物遺伝子またはウイルス遺伝子のプロ モーター配列であることができる。例えば、それらは、感染することが望まれる 細胞のゲノムから生成するプロモーター配列であることができる。同様に、それ らは、ウイルスのゲノムから生成するプロモーター配列であることがで きる。この点において、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなど遺伝子の プロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化もし くは調節配列または組織特異性発現を可能にする配列の添加によって、改変され ることができる。 さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、合成された治療的生成物を 標的細胞の分泌の経路中に指向するシグナル配列を含有することができる。この シグナル配列は治療的生成物の天然シグナル配列であることができるが、それは またいずれの他の機能的シグナル配列または人工シグナル配列であることもでき る。 さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、核局在配列のような、合成 された治療的生成物を選択細胞区画の方向に指向させる配列を含有することがで きる。 本発明による組成物は、そのまままたは他の化合物と組合せて使用することが できる。従って、特定の態様では、本発明による態様は、さらに、ポリマー／核 酸複合体と配合することができ、そしてトランスフェクション力を増強すること ができる補助剤を含んでなる。出願人は、実際に、本発明の組成物のトランスフ ェクション力が、ポリマー／核酸複合体と配合することができるある一定の補助 剤（例えば、脂質、タンパク質、リポポリアミン、合成ポリマー）の存在下でさ らに増強されることができることを示した。本明細書の実施例で示されるように 、この増強は生体外および生体内で現れる。 本発明による組成物中で優先的に使用される補助剤は、カチオン性脂質（それ らの極性部分中に一つまたはそれ以上のカチオン性電荷を含有する）および中性 脂質である。 カチオン性脂質に関して、それらは、さらに特別に、リポポリアミン、即ち化 学的腕を介して相互に共有結合的に結合している少なくとも１種のポリアミン親 水性領域および１種の親油性領域を含んでなるいずれの両親媒性分子であること もできる。有利的には、本発明に関して使用されるリポポリアミンのポリアミン 領域は、一般式Ｈ₂Ｎ−(−(ＣＨ)_m−ＮＨ−)_l−Ｈ（式中、ｍは２を超えるかま たは等しい整数であり、ｌは１を超えるかまたは等しい整数であるが、ただしｍ は２つのアミンの間に在る各種炭素基の間を変化することが可能である）に対応 する。好適には、ｍは２から６までの間であり、ｌは１から５までの間である。 さらにもっと好適には、ポリアミン領域は、ＤＮＡに結合する性質を保持したス ペルミンまたはスペルミン相似体によって表される。 親油性領域は、層状または六角相を形成することができる１種もしくは数種の 飽和または不飽和炭化水素鎖、コレステロール、天然脂質または合成脂質である ことができる。 有利的には、欧州特許第３９４，１１１号明細書に記載のようなリポポリアミ ンは本発明の文脈で使用される。この特許出願はまた、これらのリポポリアミン の製造に使用することができる方法を記載している。本発明の文脈では、ジオク タデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）またはパルミトイルホスファチ ジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）を使用す ることが特に有利である。 本発明の組成物を製造するのに特に好適である他の補助剤は中性脂質によって 表される。中性脂質の使用は、（アミン／リン酸エステル）電荷比Ｒが低い場合 、特に有利である。さらに好適には、本発明の文脈で使用される中性脂質は、２ つの脂肪鎖を含有する脂質である。 両性イオンであるかまたは生理学的条件下でイオン性電荷を欠く天然または合 成脂質を使用することは特に有利である。さらに特別に、ジオレオイルホスファ チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジル エタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、−パルミトイル−および− ミリストイルホスファチジルエタノールアミン並びにそれらの１〜３重Ｎメチル 化誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジ アシルグリセロール、セレブロシド（特に、ガラクトセレブロシドのような）、 スフィンゴ脂質（特に、スフィンゴミエリンのような）またはその他としてアシ アロガングリオシド（特に、アシアロＧＭ１および−ＧＭ２のような）から選択 することができる。 これらの各種脂質は、合成的かまたは器官（例えば、脳）もしくは卵からの抽 出によって、当業者によく知られている標準技術によって得ることができる。特 に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと）。 好適には、本発明の組成物は、上記の比率のカチオン性ポリマーの外に、核酸 リン酸エステルのモル当量当たり０．１〜２０モル当量、さらに好適には１〜５ モル当量の補助剤を含んでなる。 特に有利な態様では、本発明の組成物は、核酸の移入を誘導することができる 標的指向要素（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでなる。この標的 指向要素は、核酸の移入を、ある一定の細胞型またはある一定の所望の組織（腫 瘍細胞、肝臓細胞、造血細胞など）の方向に誘導することができる細胞外の標的 指向要素であることができる。それはまた、核酸の移入を、ある一定の所望の細 胞区画（ミトコンドリア、 核など）の方向に誘導することができる細胞内の標的指向要素であることができ る。 さらに好適には、標的指向要素は、式（Ｉ）で示されるポリマーに共有結合的 または非共有結合的に結合する。この結合は、特に、アンモニウム基とのイオン 性相互作用によってか、または求核性基（ハロゲン、トシラートなど）、活性化 エステル（ヒドロキシスクシンイミドなど）、またはその他としてイソチオシア ナートを含有する標的指向要素へのポリマーアミンの求核性攻撃によって得るこ とができる。標的指向要素はまた核酸に結合することができる。 本発明に関して使用することができる標的指向要素として、糖、ペプチド、オ リゴヌクレオチドまたは脂質を挙げることができる。好適には、これらの要素は 、抗体または抗体断片、細胞受容体リガンドまたはそれらの断片、受容体または それらの受容体断片などのような糖および／またはペプチドである。特に、それ らは、増殖因子受容体のための、サイトカイニン受容体のための、細胞レクチン 受容体のための、または接着タンパク質受容体のためのリガンドであることがで きる。トランスフェリン、ＨＤＬおよびＬＤＬ受容体もまた挙げることができる 。標的指向要素はまた、アシアロ糖タンパク質受容体を標的にすることができる 糖、またはその他として免疫グロブリンＦｃ断片受容体を標的にすることができ る抗体Ｆａｂ断片であることができる。 本発明による組成物は、局所的、経皮、経口、経直腸、経腟、非経口、鼻腔内 、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、皮内などの投与を勘案して配合することができ る。好適には、本発明の医薬組成物は、注射剤、特に所望の器官中への直接注射 のためか、または局所投与（皮膚および／また は粘膜に）のための薬学的に許容される賦形剤を含有する。問題の生成物は、特 に、等張無菌溶液、または滅菌水または生理食塩水を適切に添加すると、注射液 を生成することができる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。注射に 使用される核酸の用量、並びに投与回数は、種々のパラメーターに従って、特に 使用される投与方式、問題の疾病、発現する遺伝子またはその他として治療の所 望期間に従って適用することができる。 上記のように、本発明の組成物は、生体内、生体外または半生体内で、核酸の 細胞中への移入のために使用することができる。特に、実施例は、本発明のカチ オン性ポリマーが、核酸を多種類の細胞型中に特にトランスフェクションが通常 困難であるある一定の細胞型中に極めて効率的に移入させるのに使用することが できることを示している。試験された細胞型として、繊維芽細胞、肝細胞、癌腫 、腎細胞およびニューロンを特に挙げることができる。さらに、下記の実施例は また、生体内で遺伝子の移入のための本発明のポリマーの効能を示す。本発明の ベクターを用いて得られた結果は、同一条件下で他のトランスフェクション剤を 用いて得られた結果より優れたものであり、従って本発明の組成物の高い可能性 を示す。 本発明は、特に、前記疾患を補正することができ、上記のようにカチオン性ポ リマーと組合わされる核酸の生体内投与を含んでなる、疾患の治療のための特に 有利な方法を提供する。さらに特別には、この方法は、タンパク質性または核酸 生成物の欠失に起因する疾患に適用でき、そして投与された核酸は前記タンパク 質性生成物をコードするかまたは前記核酸生成物を含有する。 従って、本発明の製薬学的組成物は、投与および生体内での核酸の移入のため に特に有利な道具を構成する。 以下の実施例によって本発明をさらに完全に記載するが、それは本発明を説明 ものであって、限定するものではないと考えるべきである。図の説明 ： 図１：（ポリマーアミン／核酸リン酸エステル）比Ｒの観点からのｐＨ７でのＰ ＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。 図２：ＤＮＡ量の観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクション の効率。 図３：比率Ｒの観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの 効率。 図４：ｐＨの観点からのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。 図５：ＰＥＩ８００Ｋとポリリジンとの比較。 図６：ＰＥＩ５０Ｋの細胞毒性の試験。 図７：補助剤の存在下でのＰＥＩ５０Ｋのトランスフェクションの効率。 図８：ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。 図９：肝細胞および腎細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。 図１０：プラスミドＤＮＡの胚ニューロン中への移入におけるＰＥＩの効率。 図１１：オリゴヌクレオチドの胚ニューロン神経細胞中への移入におけるＰＥＩ の効率。 図１２：生体内ＤＮＡ移入のためのＰＥＩの効率。実施例１ ：生体内遺伝子移入に使用されたプラスミド 本発明の組成物の活性を示すのに、３種類の構築物を使用した。即ち、ルシフ ェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードしている遺伝子を含有するプラスミド、β−ガラク トシダーゼをコードしている遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）を含有するプラスミドお よびクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードして いる遺伝子を含有するプラスミド。 １．１．Ｌｕｃ遺伝子を含有するプラスミド プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃは、制限酵素ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによ る切断によってベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から 抽出され、ルシフェラーゼをコードしている遺伝子の上流に位置し、ベクターｐ ＧＬ基本（ｂａｓｉｃ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のＭｌｕＩおよびＨｉｎ ｄＩＩＩ部位に挿入されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有す る。 プラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃは市販起源のものである（Ｐｒｏｍｅｇａ）。 プラスミドＴ３ＲＥ−Ｌｕｃは、甲状腺ホルモンに対する応答のためのパリン ドローム要素に対応する合成オリゴヌクレオチドを含有する（Ｇｌａｓｓ等、Ｃ ｅｌｌ，５６（１９８９）６９７）。 １．２．ＬａｃＺ遺伝子を含有するプラスミド プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼをコードしているＬａｃＺ遺 伝子の上流に位置するＣＭＶプロモーターを含有する。ベクターｐＳＶ−ｎｌｓ ＬａｃＺ（ｐＡＯｎｌｓＬａｃＺ）は、同一のプロモーター、ＬａｃＺ遺伝子 の枠中でかつ上流に局在する核局在配列（ＳＶ４０ウイルスから生成する）を含 有する。この構築によって、 細胞の核中での融合タンパク質ｎｌｓ−β−ガラクトシダーゼの発現が可能にな る（Ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２を参照のこと）。 １．３．ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミド リポーター遺伝子として、ＲＳＶプロモーター（ｐＲＳＶ−ＣＡＴ）およびＳ Ｖ４０プロモーター（ｐＳＶ４０−ＣＡＴ）の制御下にあるクロランフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしている遺伝子を有するプラ スミドは公開されている（Ｂｏｕｔｉｌｌｅｒ等，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−Ｐｈ ｙｃｈｏＰｈａｒｍａｃｏｌ．ｅｔ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．，１６（１ ９９２）９５９；ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２）。実施例２ ：核酸の繊維芽細胞中への移入 この実施例は、８００，０００Ｄａポリエチレンイミンによる、プラスミドｐ ＧＬ２−ｌｕｃの３Ｔ３繊維芽細胞中への移入について記載する。 プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液 を使用してｐＨを７に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。 トランスフェクション・プロトコール：トランスフェクションの２４時間前に 、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０ ，０００細胞）。それらを、以下のプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇ のプラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃでトランスフェクトする。 プラスミドの２μｇおよびＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液の種 々の容量を、別々に１５０ｍＭ ＮａＣｌの５０μｌ中に希釈し、混合する。１ ０分後、２つの溶液を一緒にして、そしてホモジナイズする。さらに１０分後、 ９００μｌのＤＭＥＭを添加する。このようにして得た溶液をホモジナイズして 、１０分後に、前もって無血清ＤＭＥＭ培地ですすいだ細胞上に散布する。トラ ンスフェクトの２時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ（ウシ胎児血清）を 添加する。２４時間後に発現を停止させる。 ルシフェラーゼ測定：この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素Ａ およびＡＴＰを含有する緩衝液の存在下でインキュベートし、放射された光（一 般的に１０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏ ｔｅｓ，２８）で測定した。 得られた結果を図１に示す。それらは、ＰＥＩによって、プラスミドｐＧＬ２ −Ｌｕｃが繊維芽細胞中に効率的に移入せれることを示している。それらはまた 、ＤＮＡリン酸エステルに対して５〜２０当量の間のＰＥＩアミンを使用する場 合、相対光単位（ＲＬＵ）の活性が特に良好であることを示している。対照実験 では、プラスミド単独は約１００ＲＬＵの信号を与える。実施例３ ：トランスフェクションの効率に及ぼすＤＮＡ量の効果 この実施例はＰＥＩ８００Ｋによる核酸の３Ｔ３繊維芽細胞中への移入の効率 に及ぼす核酸量の効果について記載する。 トランスフェクションの２４時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中で インキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、上記のプロ トコールに従って、ウエル当たり増加する量のプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃおよ び一定電荷比（９当量）でトランスフェクト する。研究中の遺伝子を含有しないプラスミドｐＧＥＭ（ＰＲＯＭＥＧＡ）でプ ラスミド量をウエル当たり２μｇまで補充することによって、２ポイントを製造 した。トランスフェクションの３時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清 を添加する。２４時間後発現を停止させる。 得られた結果を図２に示す。 トランスフェクションの効率はトランスフェクション中に使用したプラスミド 量にしたがって増加する。非転写性キャリヤーＤＮＡ（ｐＧＥＭ）を添加しても トランスフェクションへの寄与はない。実施例４ ：核酸の繊維芽細胞中への移入：アミン／リン酸エステル比の影響の研 究 この実施例は、種々の（アミン／リン酸エステル）比Ｒで核酸およびＰＥＩ８ ００Ｋを含んでなる本発明による組成物を用いる、ｐＨ６での、核酸の繊維芽細 胞中への移入について記載する。 プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液 を使用してｐＨを６に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。 トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中で インキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、実施例２で 使用したプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｌ ｕｃでトランスフェクトする。 得られた結果を図３に示す。それらは、本発明による組成物が６〜２２の間の 比率Ｒの全範囲に亙って特に効率的であることを示している。実施例５ ：ｐＨに観点からのトランスフェクションの効率 この実施例は、核酸およびＰＥＩ８００Ｋを含んでなる本発明による 組成物による、種々のｐＨ条件下での、核酸の繊維芽細胞への移入について記載 する。 使用したプロトコールは実施例２に記載したものと同一である。ｐＨは１Ｎ塩 酸を添加して調節する。 得られた結果を図４に示す。それらは、本発明による組成物が種々のｐＨ値、 特に生理学的ｐＨ範囲内（ｐＨ５−８）で使用することができることを示してい る。実施例６ ：ＰＥＩおよびポリリジンのトランスフェクションの効率の比較 この実施例は、核酸の繊維芽細胞中への移入において、本発明による組成物お よび他のカチオン性ポリマー、ポリリジンを用いて得た比較結果について記載す る。 プロトコール：この実験で使用したポリリジン（ＰＬＬ）は平均分子量５０Ｋ のポリリジン・ＨＢｒである。最終クロロキン濃度は１００μＭである。ＰＥＩ はｐＨ６である。 プロトコール：トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２ ４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それら を、実施例２で使用したプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃで トランスフェクトする。クロロキンの存在下でＰＬＬでトランスフェクトされた 細胞を、２時間後にすすぎ、１０％の血清をもつ培地中入れる。２４時間後に発 現を停止させる。 得られた結果を図５に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって 、ポリリジンのような前者のカチオン性ポリマーベクターよりももっと高い効率 で、核酸が繊維芽細胞中に移入されることを示してい る。実施例７ ：ＰＥＩ５０ＫおよびＰＥＩ８００ＫによるＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞 のトランスフェクションの効率の比較 この実施例は、核酸の細胞中への移入における２種類のポリマー（ＰＥＩ５０ ＫおよびＰＥＩ８００Ｋ）の使用および比較について記載する。 プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフ ェクションの２４時間前に、細胞をインキュベートする。それらを、ＰＥＩと複 合させたプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩアミン／ 核酸リン酸エステルのモル当量比は６当量から４５当量まで変化する。各ウエル について、ＰＥＩおよび２μｇのＤＮＡを別々に５０μｌのＮａＣｌ（１５０ｍ Ｍ）中に希釈する。次いで溶液を混合し、その後ホモジナイズする。１０分後、 この液を細胞に添加する。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解液を遠心分 離して、上澄液をルシフェラーゼ活性の測定に使用する。タンパク質測定は、こ の上澄液のアリコートについて、ＢＣＡ試験法によって行う。ルシフェラーゼ活 性は、光単位（ＲＬＵ）／１０秒の積分／ｍｇのタンパク質で表す。 得られた結果を以下の表に示す。 これらの結果は明らかに、ＰＥＩ５０ＫがＰＥＩ８００Ｋのそれらと同程度に 有利であるトランスフェクション特性を有することを示している。実施例８ ：ＰＥＩの細胞毒性の試験 ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対するＰＥＩ５０Ｋのあるかも知れない毒性を研 究したいと思った。この研究の場合、ＭＴＴ試験法を選択するが、この試験法に よって、ミトコンドリア酵素のコハク酸デヒドロゲナーゼによってＭＴＴテトラ ゾリウムをＭＴＴホルマザンに還元する細胞の能力を評価することができる。ト ランスフェクションのプロトコールは実施例７と同一である（ウエル当たりのＤ ＮＡ量は固定し（２μｇ）、ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルのモル当量数 は９から２４まで変化する。）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰ ＢＳで３回洗浄し、次いで０．０５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴで９０分間インキュベー トする。このインキュベーションの終結時に、細胞培地を除去し、細胞をＰＢＳ で３回洗浄し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ中に１０分間で溶解させた。試料の 光学濃度を５４０ｎｍで読む。 結果を図６に示す。それらは、本研究の条件下で、ＰＥＩ５０ＫがＮＩＨ ３ Ｔ３繊維芽細胞に対し有意の死亡率を起さないことを示している。実施例９ ：トランスフェクション力を増強する補助剤の使用 この実施例は、カチオン性ポリマーおよび補助剤を含んでなる本発明による組 成物の使用について記載する。使用された補助剤は中性脂質（ＤＯＰＥ）または リポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかである。 プロトコール：ＤＯＰＥの添加： ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８およ び２１について研究した。各ウエルについて、１２ナノモルのＤＯＰＥをＰＥＩ およびＤＮＡの混合物に添加する。次いで、この溶液を、実施例７に記載のよう に、トランスフェクションに使用する。 ＤＯＧＳの添加：各ウエルについて、ＤＯＧＳアミン／ＤＮＡリン酸エステル の４モル当量（６ナノモルのリン酸エステルの場合、６ナノモルのＤＯＧＳの当 量）を、ＤＮＡと複合させる工程の前に、ＰＥＩ溶液に添加する。次いでトラン スフェクションを実施例７に記載のように行う。 得られた結果を図７に示す。それらは明らかに、ＤＯＰＥまたはＤＯＧＳの添 加によって、トランスフェクション特性が、特にＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エ ステルの低モル当量比の場合、さらに増加することを示している。実施例１０ ：Ｈｅｌａ細胞中への遺伝子移入 この実施例は、本発明による組成物が、種々の細胞型、特にＨｅｌａ子宮癌細 胞中への遺伝子の移入のために使用することができることを示す。 プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフ ェクションの２４時間前に、Ｈｅｌａ細胞をインキュベートする。次いで、それ らを、ＰＥＩまたはリポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかと複合させたプラス ミドｐＣＭＶ Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩ８００Ｋアミン／ＤＮＡ リン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８、２１について研究した。ア ミン／リン酸エステルの８モル当量（１２ナノモルのＤＯＧＳ）で、リポポリア ミンを使用する。 得られた結果を図８に示す。それらは明らかに、場合により補助剤と組合わさ れたカチオン性ポリマーを含んでなる本発明による組成物によって、従来のシス テム（特にリポポリアミンＤＯＧＳ）よりもずっとさらに効率的に、Ｈｅｌａ細 胞がトランスフェクトされることを示している。実施例１１ ：遺伝子の各種細胞型への移入 この実施例は再び、本発明による組成物が、繊維芽細胞、子宮癌、肝細胞腫ま たは腎細胞のような多種類の細胞型中への遺伝子の移入のために使用することが できることを示す。さらに詳しくは、この実施例は、ＨｅｐＧ２とＫ５６２およ びウサギ平滑筋初代培養細胞を、９電荷当量を含有するＰＥＩで、ｐＨ６でトラ ンスフェクトすることを記載する。 トランスフェクションの２４時間前に（ウエル当たり５０，０００細胞）、Ｈ ｅｐＧ２細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする。それらを、実施例２に記 載のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトす る。トランスフェクションの４時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を 添加する。３０時間後に発現を停止させる。 トランスフェクションの１時間前に、Ｋ５６２細胞を、２４ウエル皿中で、無 血清ＲＰＭＩ培地の０．５ｍｌ中でインキュベートする。それらを、以下のプロ トコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。即ち 、所望量のプラスミドおよびＰＥＩを別々に５０μｌの１５０ｍｍ ＮａＣｌ中 に希釈し、混合する。１０分後、２つの溶液を一緒にして、ホモジナイズする。 さらに１０分間の後、４００μｌのＲＰＭＩを添加する。このようにして得た溶 液をホモジナイズし、１０分後、細胞上に散布する。トランスフェクションの４ 時間後、 ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。３０時間後、発現を停止させ る。 ウサギ平滑筋初代培養物を、Ｆａｌｌｉｅｒ−Ｂｅｃｋｅｒによる記載の通り に調製する。次いで、細胞を、（実施例７に記載のプロトコールに従って）ＰＥ Ｉと複合したプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの１μｇまたは２μｇのいずれかでト ランスフェクトする。トランスフェクションの２４または４８時間後に、ルシフ ェラーゼの発現を停止させる。 得られた結果を図９に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって 、多種類の相違する細胞型を効率的にトランスフェクトすることができることを 示している。実施例１２ ：胚ニューロン初代培養物中へのプラスミドＤＮＡの移入：生物学的 活性の提示 Ｌｅｚｏｕａｌｃ′ｈ等による記載の通りに、ニューロン初代培養物を調製し た。３６時間後、培養物を、２μｌのプラスミドＴＲＥ−Ｌｕｃ（甲状腺ホルモ ンＴ３応答要素の制御下のＬｕｃ遺伝子を含有する）およびウエル当たり０．５ μｇのキャリヤーＤＮＡでトランスフェクトした。 ２つの実験条件について研究した。即ち、 −リン酸エステルに対して９当量のアミン：１μｌのプラスミドを、ＰＥＩ８ ００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２．２８μｌ中に導入した。 −リン酸エステルに対して１３当量のアミン：１μｇのプラスミドを、ＰＥＩ ８００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の３．３３μｌ中に導入した。 複合する前に、プラスミドを５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、そ してＰＥＩも第二の５０μｌアリコートの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。 次いで溶液を混合し、細胞に１時間適用した。次いで、トランスフェクション培 地を除去し、Ｔ３（１ｎＭ）を持つかまたは持たない新しい培養培地に交換した 。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解溶液を遠心分離し、上澄液をルシフ ェラーゼ活性の測定に使用した。 得られた結果を図１０に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によっ て、ＤＮＡがニューロン細胞中にトランスフェクトされ、そしてこのようにトラ ンスフェクトされたＤＮＡは、活性がＴ３の存在下で増幅されるから、機能的で あることを示している。プラスミド単独の存在下で行った対照実験では、ルシフ ェラーゼ活性は全く検出されなかった。実施例１３ ：胚ニューロン初代培養物中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの 移入 実施例１２の通りに調製したニューロン初代培養物について実験を行った。３ ６時間後、培養物を、ＰＥＩ８００Ｋに対して９当量のアミンと複合された２μ Ｍ １８マー（ｍｅｒ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）でトラン スフェクトした。 使用したＯＤＮは、甲状腺ホルモンα−受容体をコードしている遺伝子の領域 に対して指向する。その配列は以下の通りである。 ５′−ＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴ−３′ ２５０μｌの培養培地の４つのウエルの場合、以下の生成物を使用した。即ち 、 −１５０ｍＭ ＮａＣｌの１０μｌ中に希釈されたＯＤＮの０．２５ｍＭ溶液 の８μｌ、および −前もって第二の１５０ｍＭ ＮａＣｌの５１．２μｌアリコート中に希釈さ れたＰＥＩ８００Ｋの１２ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２０．８μｌ。 次いで、溶液を混合し、混合物の２０μｌを細胞に４５分間適用した。次いで トランスフェクション培地を除去し、新しい培養培地に交換した。次いで細胞を ４％パラホルムアルデヒド溶液中に固定し、すすぎ、Ｍｏｗｉｏｌ中に取り付け 、蛍光顕微鏡下で検査した。 得られた結果を図１１に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によっ て、アンチセンスオリゴヌクレオチドがニューロン細胞中にトランスフェクトさ れることを示している。オリゴヌクレオチド単独の存在下で行った対照実験では 、蛍光は全く検出されなかった。実施例１４ ：新生マウスの脳中への核酸の生体内移入のための本発明の組成物の 使用 この実施例は、新生マウスの脳中へのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの生体内移 入について記載する。それは、特に遺伝子治療の応用の場合の本発明による組成 物の特に有利な特性を示す。 ３０μｌのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（４μｇ／μｌを含有するストック溶 液の７．５μｌ）を２２．５μｌの無菌５％グルコース中に希釈した（最終濃度 １μｇ／μｌ）。次いで１００ｍＭ ＰＥＩ８００Ｋ（水中で調製され、そして ｐＨ６．９に緩衝化された）の８．５μｌを添加した。それ故、このようにして 得た組成物はリン酸エステルに対して９当量のアミンを含有する。 この混合物を急速に渦撹拌し、新生マウス中への大脳内注射のために使用した 。この目的のために、マウスを低温度（氷と接触しているアルミニウム箔上に置 かれた）によって麻酔し、次いでマウス当たり２μｌの混合物（２μｇの核酸） を注射した。注射は、皮質中に、両者とも微小電極に連結したマイクロマニピュ レータおよびマイクロシリンジを使用して行った。 ４８時間後に脳を取出し、ホモジナイズし、遠心分離し、上澄液をルシフェラ ーゼの測定に使用した。この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素Ａ およびＡＴＰを含む緩衝液の存在下でインキュベートし、放射した光（一般的に １０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ，２８）で測定した。 得られた結果を図１２に示す。それらは明らかに、組成物によって、プラスミ ドがマウスの脳中に効率的に移入され、一方プラスミド単独によって移入が行わ れる場合、有意のルシフェラーゼ活性は全く観察されないことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 7433−4Ｃ Ａ６１Ｋ 47/48 Ｚ // Ａ６１Ｋ 47/48 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デムネ， バルバラ フランス・エフ−75013パリ・リユウード リ29 (72)発明者 レズアルシユ， フラン フランス・エフ−75010パリ・ケジユマプ 50 (72)発明者 メルニ， モーガン フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユピエール−ムーリ17 (72)発明者 シエルマン， ダニエル フランス・エフ−75013パリ・リユデユデ イスク50

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の核酸および一般式（Ｉ） （式中、 −Ｒは水素原子または式 で示される基であることができ、 −ｎは２〜１０の間の整数であり、 −ｐおよびｑは整数であるが、 ただし、合計ｐ＋ｑが、ポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷の間になるよう なものであることが理解されているものとする） で示されるカチオン性ポリマーを含んでなる組成物。 ２．式（Ｉ）中で、ｎが２〜５の間にあることを特徴とする請求の範囲１に記 載の組成物。 ３．ポリマーが１０³〜５×１０⁶の間の平均分子量を有することを特徴とする 請求の範囲１または２に記載の組成物。 ４．ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリプロピレンイミン（ ＰＰＩ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載 の組成物。 ５．ポリマーが平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ ）および平均分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８０Ｋ）から 選ばれることを特徴とする請求の範囲４に記載の組成物。 ６．ポリマーと核酸との各比率が、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルの比 率Ｒが０．５〜５０の間になるように選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜 ５のいずれか一項に記載の組成物。 ７．比率Ｒが２〜５０の間にあることを特徴とする請求の範囲６に記載の組成 物。 ８．比率Ｒが５〜３０の間にあることを特徴とする請求の範囲７に記載の組成 物。 ９．さらに、ポリマー／核酸複合体と組合せることができ、そしてトランスフ ェクション力を増強することができる１種またはそれ以上の補助剤を含んでなる ことを特徴とする請求の範囲１〜８のいずれか一項に記載の組成物。 １０．補助剤が脂質、タンパク質、リポポリアミンおよび合成ポリマーから選 ばれることを特徴とする請求の範囲９に記載の組成物。 １１．補助剤がカチオン性脂質であることを特徴とする請求の範囲１０に記載 の組成物。 １２．カチオン性脂質が１種またはそれ以上のリポポリアミンであることを特 徴とする請求の範囲１１に記載の組成物。 １３．リポポリアミンが、一般式Ｈ₂Ｎ−(−（ＣＨ）_m−ＮＨ−)_l−Ｈ（式中 、ｍは２を超えるかまたは等しい整数であり、ｌは１を超えるかまたは等しい整 数であるが、ただしｍが２つのアミンの間に在る各 種炭素基の間を変化することが可能である）に対応することを特徴とする請求の 範囲１２に記載の組成物。。 １４．リポポリアミンが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧ Ｓ）またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミン＝５−カルボキシスペ ルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲１３に記 載の組成物。 １５．補助剤が１種またはそれ以上の中性脂質であることを特徴とする請求の 範囲１０に記載の組成物。 １６．中性脂質または中性脂質類が、両性イオンであるかまたは生理学的条件 下でイオン性電荷を欠く合成または天然脂質から選ばれることを特徴とする請求 の範囲１５に記載の組成物。 １７．中性脂質または中性脂質類が２つの脂肪鎖を含有する脂質であることを 特徴とする請求の範囲１６に記載の組成物。 １８．中性脂質または中性脂質類がジオレオイルホスファチジルエタノールア ミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、−パルミトイル−および−ミリストイルホスフ ァチジルエタノールアミン並びにそれらの１〜３重Ｎメチル化誘導体；ホスファ チジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール 、セレブロシド（特に、ガラクトセレブロシドのような）、スフィンゴ脂質（特 に、スフィンゴミエリンのような）またはその他としてアシアロガングリオシド （特に、アシアロＧＭ１および−ＧＭ２のような）から選ばれることを特徴とす る請求の範囲１６に記載の組成物。 １９．核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求の範囲１ に記載の組成物。 ２０．核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。 ２１．核酸が化学的に修飾されることを特徴とする請求の範囲１９または２０ に記載の組成物。 ２２．核酸がアンチセンス配列であることを特徴とする請求の範囲１９〜２１ のいずれか一項に記載の組成物。 ２３．核酸が治療的遺伝子を含有することを特徴とする請求の範囲１９〜２２ のいずれか一項に記載の組成物。 ２４．核酸リン酸エステルのモル当量当たり０．１〜２０モル当量、さらに好 適には１〜５モル当量の補助剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲９に記 載の組成物。。 ２５．標的指向要素（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでなるこ とを特徴とする請求の範囲１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。 ２６．標的指向要素が、抗体もしくは抗体断片のような糖および／またはペプ チド、細胞受容体リガンドもしくはそれらの断片、または受容体もしくは受容体 断片よりなることを特徴とする請求の範囲２５に記載の組成物。 ２７．標的指向要素が、式（Ｉ）で示されるポリマーに共有結合的に結合して いることを特徴とする請求の範囲２５または２６に記載の組成物。 ２８．注射剤のための薬学的に許容される賦形剤を含んでなることを特徴とす る請求の範囲１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。 ２９．皮膚および／または粘膜への適用のための薬学的に許容される賦形剤を 含んでなることを特徴とする請求の範囲１〜２８のいずれか一項に記載の組成物 。 ３０．核酸の細胞中への移入のための、請求の範囲１に記載のカチオン性ポリ マーの使用。