ES2255707T3

ES2255707T3 - Uso de una membrana a base de colageno para preparar un implante destinado a la regeneracion guiada de tejidos.

Info

Publication number: ES2255707T3
Application number: ES95904642T
Authority: ES
Inventors: Peter Geistlich; Zdenek Eckmayer; Philip Boyne
Original assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Current assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Priority date: 1994-01-06
Filing date: 1995-01-04
Publication date: 2006-07-01
Anticipated expiration: 2015-01-04
Also published as: DE69534713T2; JP3577083B2; WO1995018638A1; US5837278A; GB9400163D0; EP1676592B1; ATE314102T1; DE69534713D1; JPH09507144A; CA2180659C; EP0738161A1; EP1676592A1; EP0738161B1; CA2180659A1; ES2400947T3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA MEMBRANA DE COLAGENO REABSORBIBLE PARA USARSE EN LA REGENERACION GUIADA DE TEJIDOS, SIENDO FIBROSA UNA CARA DE LA CITADA MEMBRANA Y PERMITIENDO CON ELLO QUE CREZCAN LAS CELULAS SOBRE ELLA, Y SIENDO SUAVE LA CARA OPUESTA DE LA CITADA MEMBRANA, INHIBIENDO DE ESTA FORMA LA ADHESION DE CELULAS SOBRE ELLA. UNA MEMBRANA DE ESTE TIPO ES ESPECIALMENTE UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE HERIDAS Y LESIONES.

Description

Uso de una membrana a base de colágeno para preparar un implante destinado a la regeneración guiada de tejidos.

La presente invención se refiere a la cicatrización de heridas y en particular a la utilización de una membrana que contiene colágeno en la regeneración guiada de tejidos.

En cualquier situación, por ejemplo tras una operación quirúrgica, especialmente tras cirugía oral o dental, en las que resulta deseable la cicatrización de las heridas, ha demostrado ser difícil proporcionar condiciones que eviten el crecimiento de otros tejidos hacia el interior del área en la que se requiere la regeneración. De esta manera, por ejemplo en el caso de la extracción de una parte sustancial de una raíz dental por caries o por una enfermedad, resulta deseable que se produzca la regeneración de hueso sano en sustitución del tejido óseo extraído. Sin embargo, se ha descubierto que la cavidad dejada por la extracción del hueso se ve rápidamente rellenada por tejido conectivo y que este crecimiento hacia dentro de tejido conectivo impide efectivamente la regeneración ósea.

Con el fin de resolver dichas dificultades, se ha desarrollado la técnica conocida como "regeneración ósea guiada". En este procedimiento, se inserta quirúrgicamente una membrana alrededor de la periferia de la cavidad de la herida. La membrana impide o dificulta la invasión de la cavidad de la herida por tipos celulares no deseados y permite de esta manera que las células preferidas crezcan hacia el interior de la cavidad, cicatrizando de esta manera la
herida.

En la actualidad se utilizan dos tipos de membrana en la regeneración guiada de tejidos:

1) Membranas sintéticas de PTFE no reabsorbibles, tales como Goretex (marca comercial), y

2) Membranas sintéticas reabsorbibles formadas a partir de copolímeros de glicólido y láctido.

Sin embargo, ambos tipos de membrana adolecen de graves desventajas. La membrana de PTFE, aunque muestra características adecuadas de porosidad, resistencia y flexibilidad, sigue siendo no reabsorbible y por lo tanto se requiere una segunda operación quirúrgica para extraerla. La necesidad de procedimientos quirúrgicos adicionales puede resultar traumática para el paciente y también puede dañar el nuevo tejido regenerado, extendiendo de esta manera el periodo de tratamiento.

El segundo tipo de membrana se teje a partir de fibras de copolímero de glicólido y láctido. Aunque este tipo de membrana es reabsorbible, los productos de descomposición son irritantes y esta irritación puede presentar efectos no deseables sobre el paciente.

Ambos tipos de membrana de la técnica anterior actúan como filtros, permitiendo el libre paso de líquidos y formando una barrera a las células. Sin embargo, la superficie de las membranas no resulta un ambiente favorable para las células, es decir, no estabiliza los coágulos sanguíneos ni presta soporte al crecimiento celular. En consecuencia, ninguna de dichos tipos de membrana de la técnica anterior proporciona condiciones óptimas para el crecimiento celular ni para la cicatrización de heridas.

Tanto en el ser humano como en los animales, determinadas membranas que rodean a órganos importantes y que separan diferentes tejidos y células están constituidas de colágeno. Entre los ejemplos de estas membranas se encuentran, a escala macroscópica, las membranas del pericardio y la membrana placentaria, y a escala microscópica, las membranas basales.

En la actualidad se utilizan ampliamente en medicina los productos de colágeno. Se encuentran disponibles una variedad de materiales de colágeno, incluyendo colágeno soluble, fibras de colágeno, esponjas, membranas e implantes óseos, permitiendo usos diversos de este material, por ejemplo en fibras y esponjas de colágeno para la hemostasis, membranas de colágeno para la cobertura de heridas o para implantes, y las inyecciones de colágeno soluble en la cirugía plástica.

En la técnica anterior se han descrito y propuesto diversas membranas artificiales que contienen colágeno para el vendaje o cobertura de heridas. De esta manera, en la patente WO nº A-8808305 (The Reagents of The University of California), se describe un sustituto compuesto de piel que consiste en una capa de células epidérmicas humanas junto a una capa de una membrana biosintética que puede estar formada de colágeno y mucopolisacáridos. Sin embargo, la parte de colágeno/mucopolisacárido es totalmente de textura uniforme y no muestra las propiedades de la membrana propuesta en la presente memoria para la regeneración guiada de tejidos. Además, dichas membranas son fuertemente inmunorreactivas y únicamente pueden utilizarse en el donante de las células. En el documento DE nº A-2631909 (Massachusetts Institute of Technology) se describe otra membrana artificial que contiene colágeno. Esta membrana consiste en un mínimo de dos capas, siendo la primera capa una combinación de colágeno y mucopolisacáridos, y la segunda capa, un polímero sintético, tal como un poliacrilato. Sin embargo, esta membrana es totalmente no reabsorbible, estando la capa de colágeno tan fuertemente reticulada internamente que la reabsorción no puede producirse.

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El documento EP nº A-0331786 (Chemokol Gesellschaft zur Entwicklung von Kollagenprodukten) describe un procedimiento para la preparación de membranas de colágeno para su utilización en la hemostasis, en el vendaje de heridas y como material de implante. Las membranas están diseñadas para presentar una superficie de hinchado rápido y una estructura suelta similar a una esponja que facilite la detención de la hemorragia en situaciones en las que la sangre se escapa bajo presión.

El documento DE nº A-3607075 (American Hospital Supply Corp.) se refiere a un procedimiento para el tratamiento de las fracturas óseas en las que se aplica tejido bioprostético a la superficie de hueso alrededor de una fractura con el fin de prevenir la formación de adhesiones fibrosas entre el hueso en cicatrización y los tejidos corporales circundantes. El tejido bioprostético puede ser una membrana de colágeno que presente caras opuestas lisas y fibrosas. En estas formas de realización la cara fibrosa puede colocarse contra la superficie ósea con el fin de permitir un mejor anclaje a la misma; la cara lisa proporciona de esta manera una superficie externa ventajosamente lubricada. El tejido bioprostético no participa en el proceso de cicatrización que tiene lugar entre los extremos fracturados bajo la superficie del hueso y preferentemente se trata para que sea sustancialmente resistente a la calcificación, es decir para que inhiba cualquier crecimiento de tejido óseo hacia el interior del tejido bioprostético.

El documento WO nº A-9013302 (Brigham and Women's Hospital) da a conocer material reabsorbible para la utilización en la regeneración guiada de tejidos, que comprende membranas de colágeno que incluyen una o más sustancias biológicamente activas, tales como fármacos, hormonas, factores de crecimiento, péptidos o proteínas.

El documento WO nº A-9302718 (Colectica) da a conocer membranas de colágeno reticulado de bioabsorción lenta que contienen glicosaminoglicano para la utilización en la regeneración guiada de tejidos.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las membranas de colágeno que se derivan directamente de membranas de origen natural y que, hasta donde sea posible, conservan sus estructuras de colágeno natural, forman membranas con características ideales para la regeneración guiada de tejidos.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona la utilización de una membrana de colágeno fisiológicamente aceptable y reabsorbible que se obtiene mediante purificación de una membrana de colágeno natural de manera que conserva sustancialmente su estructura de colágeno natural y que presenta caras opuestas fibrosa y lisa, en la manufacturación de un implante de regeneración guiada de tejidos para la orientación en el cuerpo de un ser humano o de un animal no humano de manera que dicha cara fibrosa se encuentre encarada hacia el área de dicho cuerpo en el que se requiere la regeneración de tejidos y permita el crecimiento celular sobre la misma, y dicha cara opuesta, de superficie lisa, inhiba la adhesión celular sobre sí misma y actue como barrera que evite el paso de células a través de la membrana.

Los dos lados o caras opuestas de la membrana presentan diferentes texturas que afectan al crecimiento celular de maneras diferentes. De esta manera, la cara lisa actúa como barrera o filtro que impide el crecimiento hacia adentro de células e impide que tipos celulares no deseables colonicen la cavidad descrita por la membrana al separarla físicamente. En contraste, el lado fibroso de la membrana es hemostático (estabiliza los coágulos sanguíneos) y ayuda al crecimiento celular al proporcionar un soporte adecuado para las nuevas células. Por este motivo la membrana debe insertarse con el lado liso orientado hacia afuera y el lado fibroso enfrentado a las células donde se desea la regeneración.

Debido a su origen natural, la membrana para la utilización en la presente invención es totalmente reabsorbible en el cuerpo y no forma productos tóxicos de degradación.

Además, la membrana presenta una resistencia al desgarro y a la propagación del desgarro que resultan comparables a las de un material textil tanto en estado mojado como seco. Por lo tanto, la membrana puede suturarse quirúrgicamente si resulta necesario. El material de membrana es fuertemente hidrófilo y presenta una buena adherencia cuando se encuentra mojado, permitiendo apilar varias capas. En estado húmedo, el material es muy elástico, permitiendo cubrir adecuadamente heridas de forma irregular o de superficie no lisa.

Entre los orígenes naturales de las membranas de colágeno se incluyen las secciones de piel animal con una cara de pelo, los tendones, diversas membranas animales, etc. Una fuente preferente de membrana es la membrana peritoneal de origen natural, especialmente la procedente de un ternero o lechón. Las membranas peritoneales procedentes de lechones de 6 a 7 semanas de edad (de peso entre 60 y 80 kg) resultan especialmente preferentes.

El material de membrana fisiológicamente aceptable para la utilización de acuerdo con la presente invención debe consistir preferentemente de colágeno puro, nativo (es decir, no desnaturalizado) e insoluble. Sin embargo, en el cuerpo de un animal, el colágeno se encuentra acompañado de varias sustancias que presentan propiedades no deseables químicas, físicas y/o fisiológicas. Por lo tanto, el colágeno debe liberarse de estas sustancias mediante purificación. Debido a que la naturaleza de estas sustancias varía considerablemente, la purificación enzimática resulta prácticamente imposible. De esta manera, resulta preferente llevar a cabo la purificación químicamente, procurando minimizar cualquier alteración de la estructura química del colágeno y mantener de esta manera sus propiedades originales nativas.

De acuerdo con una forma de realización preferente de la presente invención, la membrana fisiológicamente aceptable requerida se prepara sometiendo una membrana de colágeno de mamífero que presenta una cara lisa y una cara fibrosa, a tratamiento con álcali para saponificar las grasas y eliminar las sustancias sensibles a álcali y seguidamente a acidificación para eliminar las sustancias sensibles a ácido, seguido del lavado, secado, desgrasado y opcionalmente, reticulado.

Durante la purificación, tienen lugar los cambios siguientes:

-: las proteínas no colágenas resultan eliminadas

-: los glicosaminoglicanos y proteoglicanos resultan disueltos y eliminados

-: las grasas resultan parcialmente saponificadas y totalmente eliminadas.

Durante dicho tratamiento, también pueden tener lugar los siguientes cambios no deseables:

-: la hidrólisis de los grupos amida de la asparagina y de la glutamina

-: un desplazamiento del punto isoeléctrico

-: la rotura de los enlaces de entrecruzamiento

-: la transamidación, con la formación de isopéptidos

-: la racemización de los aminoácidos

-: la rotura de los enlaces peptídicos.

El nivel de nitrógeno amídico en la membrana sirve de indicador de dichos cambios. Por ejemplo, se ha descubierto que si el contenido de nitrógeno amídico cae a aproximadamente la mitad (es decir, de 0,7 mmoles/g a 0,35 mmoles/g), más del 95% del colágeno todavía se encontrará presente en su estado nativo. La base de esta medición es la hidrólisis de los grupos amida en los aminoácidos asparagina y glutamina:

\melm{\delm{\para}{\delm{CO}{\para}}}{C}{\uelm{\para}{\uelm{NH}{\para}}}

H -- CH_{2} -- CH_{2} -- CONH_{2} {}\hskip0,2cm NaOH {}\hskip0,2cm

\melm{\delm{\para}{\delm{CO}{\para}}}{C}{\uelm{\para}{\uelm{NH}{\para}}}

H -- CH_{2} -- CH_{2} -- COONa + NH_{3}

El grado de purificación del colágeno puede determinarse mediante análisis de los aminoácidos. El colágeno se hidroliza para formar aminoácidos, lo que significa que este análisis indica si el colágeno es puro y si se han eliminado las proteínas no colágenas pero no si se ha desnaturalizado el colágeno.

Junto al análisis de los aminoácidos del colágeno, también puede analizarse el contenido de glicosamina y de proteoglicanos. Estos contaminantes resultan hidrolizados y el contenido de glicosamina y hexosamina monoméricas de la membrana se determina mediante cromatografía. Se ha descubierto que la cantidad de glicosamina y de galactosamina tras la purificación es de aproximadamente 1 molécula por cada 10.000 moléculas de amino-
ácido.

En un procedimiento de preparación de las membranas, las materias primas en primer lugar se tratan con álcali. Para esta etapa, se utilizan soluciones de NaOH en concentraciones de entre el 0,2 y el 4% en peso. Las grasas se saponifican y cualquier proteína acompañante sensible a los álcalis se elimina junto con cualquier otra sustancia sensible a los álcalis, tal como glicosaminoglicanos, proteoglicanos, etc. El procedimiento se controla determinando el nitrógeno amídico. Al final del tratamiento alcalino, el nivel de nitrógeno amídico debe encontrarse entre 0,3 y
0,5 mmoles/g.

La segunda etapa es el tratamiento del material con un ácido inorgánico, habitualmente HCl. Los contaminantes sensibles a los ácidos resultan eliminados, las fibras se hinchan mucho y de esta manera se afloja la estructura fibrosa. La acidificación se continúa hasta que la materia queda acidificada homogéneamente.

Tras lo anterior, se lava el material. Ha demostrado ser útil lavar el material hasta que el pH ha cambiado de valores entre 0,5 y 1,5 (durante la acidificación con HCl) y valores entre 2,5 y 3,5. El lavado preferentemente se lleva a cabo con agua destilada.

El material hinchado a continuación puede nivelarse (dividido) con el fin de conseguir un grosor uniforme. Entre las etapas adicionales se incluyen una operación de deshinchado, la neutralización y el lavado profundo del material. Para ello, en primer lugar el material se trata con una solución salina común (concentración en peso entre el 5 y el 10%) ácida (pH entre 2,8 y 3,5). De esta manera, el material se deshincha por completo. A continuación se lava con un exceso de agua destilada ligeramente alcalina hasta que el pH del material alcanza valores entre 5,8 y 6,5. Después, el material se lava en profundidad con agua destilada (pH 6,0). Con ello se finaliza la primera etapa de la producción, es decir, la purificación. Seguidamente se lleva a cabo el secado y el desgrasado.

El material se seca mediante lavado repetido con acetona. Esto provoca el encogimiento de las fibras de colágeno y, en consecuencia, queda una estructura abierta. El desgrasado se lleva a cabo con n-hexano. Ello elimina los últimos restos de sustancias hidrofóbicas del material.

El grosor seco de la membrana para la utilización en la regeneración guiada de tejidos de acuerdo con la presente invención idealmente debe encontrarse entre 0,1 y 1,0 mm, aunque puede verse influido por el hinchado del material.

De esta manera, la membrana puede dividirse o seccionarse con el fin de conseguir el grosor deseado, con la condición de que se mantenga la doble textura de la membrana.

La membrana puede tratarse adicionalmente con el fin de adaptar sus propiedades para adecuarlas a un tipo particular de herida. De esta manera, puede reticularse el colágeno de la membrana con el fin de estabilizarla y reducir su tasa de absorción por parte del cuerpo.

Pueden utilizarse para las membranas todos los agentes de entrecruzamiento conocidos hasta el momento y que han sido utilizados para productos médicos (por ejemplo formaldehído, glutardialdehído, hexametilendiisocianato, diciclohexilcarbodiimida, etc.). Físicamente el entrecruzamiento puede llevarse a cabo mediante la aplicación de calor. En este caso, el efecto de entrecruzamiento realmente es menor pero resulta suficiente para la mayoría de aplicaciones. Convenientemente el colágeno de la membrana se entrecruza físicamente calentando hasta temperaturas entre 100ºC y 120ºC (durante 30 minutos a 5 horas), extendiendo de esta manera el tiempo de degradación.

Convenientemente, el grado de entrecruzamiento introducido será uno con el que la tasa de reabsorción de la membrana se correlacione con el crecimiento de tejido nuevo y de cicatrización de la herida. Por ejemplo, los osteocitos tardan aproximadamente 6 semanas en regenerar una cavidad dental y de esta manera resultaría adecuada para recubrir este tipo de herida una membrana que fuese absorbida en un periodo de 8 a 12 semanas. Evidentemente la membrana no debe encontrarse fuertemente reticulada, o de otro modo la tasa de absorción sería demasiado lenta y en casos extremos la membrana llegaría a no ser reabsorbible.

Otra modificación de la membrana que puede llevarse a cabo es el recubrimiento o impregnación del lado fibroso con un glicosaminoglicano (GAG), tal como el ácido hialurónico, el condroitín sulfato, el dermatán sulfato o el queratán sulfato.

Los glicosaminoglicanos tales como el ácido hialurónico son importantes como moléculas reguladoras que afectan a la estructura de los tejidos. Presentan una influencia favorable sobre:

-: la infiltración celular

-: la formación y degradación de la matriz de fibrina

-: el hinchado de la matriz

-: la fagocitosis

-: la vascularización

Poco después de producirse la lesión, el contenido de GAG en una herida se incrementa. El ácido hialurónico y los GAGs relacionados se unen a la fibrina y forman una matriz tridimensional (coágulo) que se entrelaza dentro de la matriz de fibrina. De esta manera, la matriz de fibrina original se deforma, se hincha y se hace más porosa. Esto permite una mejor y más rápida infiltración y migración de las células hacia el interior de la matriz.

El ácido hialurónico y el fibrinógeno reaccionan específicamente entre sí, incluso si cualquiera de las dos moléculas se encuentra en estado sólido.

En la etapa inflamatoria de la lesión, el ácido hialurónico estimula la función de los granulocitos, altera las propiedades de la superficie de los leucocitos polimorfonucleares y regula la actividad fagocítica de las células.

Durante la conversión y degradación de la matriz de fibrina-ácido hialurónico, se producen fragmentos más pequeños de ácido hialurónico. Los fragmentos pequeños de ácido hialurónico estimulan la construcción de nuevos vasos sanguíneos.

Además, los GAGs tales como el ácido hialurónico hacen que el colágeno sea incapaz de provocar una reacción inmunológica en un animal huésped. Con el fin de conseguir esto, el colágeno debe reaccionar con por lo menos un uno por ciento en peso de ácido GAG.

Los GAGs son portadores para las proteínas estructural y biológicamente activas. Se ha descubierto que el complejo de proteína-GAG desempeña un papel muy importante en la curación sin cicatrices que se produce en el feto.

Por dichos motivos, la impregnación de la membrana de colágeno con GAGs tales como el ácido hialurónico causa una mejor regeneración de los tejidos en una herida o lesión ósea.

Preferentemente, la concentración de GAG se incrementa en todo el grosor de la membrana, estando la concentración más elevada de GAG en el lado fibroso de la membrana.

El material GAG puede introducirse en la membrana en forma de un gel que se esparce sobre el lado fibroso de la membrana y después se deja secar. Este enfoque consigue un gradiente decreciente de concentraciones hacia el interior de la membrana aunque sin que el GAG atraviese completamente la membrana.

Aunque sin deseo de limitarse a consideraciones teóricas, se cree que las cadenas de los GAGs de elevado MW (PM) actúan guiando las nuevas células sobre la superficie de la membrana, la cual puede entonces actuar como soporte para el crecimiento celular.

De esta manera, resulta particularmente beneficioso que el lado fibroso de la membrana se encuentre en la forma de una matriz compuesta que incluya GAGs.

El ácido hialurónico y otros GAGs se encuentran presentes naturalmente en el cuerpo, con un contenido de ácido hialurónico del 19% en la piel y del 13% en el peritoneo (en peso). Debido a que son sustancias naturales, los GAGs no provocan ningún problema de toxicidad ni de reabsorción, sino que se cree que actúan como una sustancia nutricional natural para las células.

El ácido hialurónico y otros GAGs se producen industrialmente y de esta manera se encuentran fácilmente disponibles en cantidades comerciales.

Convenientemente, las membranas para la utilización de acuerdo con la presente invención contienen entre el 0,1 y el 30,0% en peso de un GAG, por ejemplo de ácido hialurónico, ventajosamente entre el 2 y el 10% en peso.

Si resulta necesario, también pueden incorporarse en las membranas otros fármacos, tales como antibióticos (por ejemplo la tetraciclina), fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo la taurolidina) y otros fármacos.

Una aplicación particularmente beneficiosa de las membranas para la utilización en la regeneración guiada de tejidos de acuerdo con al invención es tras la cirugía orofacial o dental. En éstas con frecuencia es importante que tenga lugar la regeneración ósea, por ejemplo tras la extracción parcial de una raíz dental o de una sección de mandíbula. La estrechez del área orofacial complica la cirugía y de esta manera un implante completamente reabsorbible y no tóxico para la regeneración guiada de tejidos resulta altamente ventajosa. Además, la naturaleza de la membrana resulta particularmente adecuada para estimular el crecimiento de los osteocitos (tejido óseo).

La Figura 1 muestra una membrana de acuerdo con la presente invención siendo utilizada para la regeneración ósea de un diente (1) que ha sufrido de una pérdida grave de hueso alrededor de la raíz (2), resultando en una cavidad (3) normalmente ocupada por una raíz sana. La raíz (2) sobresale a través de una capa de tejido conectivo o encía (4) hacia el interior de una cavidad ósea (5). Con el fin de evitar el crecimiento de tejido conectivo (4) hacia el interior de la cavidad (3), se coloca una cubierta de membrana (6) alrededor del margen más externo de la herida. La membrana (6) se extiende en toda la periferia de la cavidad de la herida (3). La membrana (3) presenta un lado liso (7) que se encara hacia afuera de la cavidad (3) y un lado fibroso (8) que se encara hacia el interior de la cavidad (3). El lado fibroso (8) proporciona una superficie de soporte para las nuevas células que crecen hacia afuera desde la raíz (2), mientras que el lado liso (7) de la membrana (6) evita que las células de tejido conectivo (4) invada la cavidad de la herida. La membrana (6) resulta lentamente reabsorbida por el cuerpo, en condiciones óptimas la absorción de la membrana se correlaciona con el tiempo necesario para la cicatrización de la herida.

La presente invención puede ilustrarse adicionalmente por medio del siguiente Ejemplo no limitativo:

Ejemplo

Se separaron las membranas peritoneales de carne y tejido adiposo por medios mecánicos en terneros jóvenes, se lavaron bajo agua corriente y se trataron con una solución de NaOH al 2% durante 12 horas. A continuación, las membranas se lavaron bajo agua corriente y se acidificaron con HCl al 0,5%. Tras acidificar el material en todo su grosor (aproximadamente 3 horas), el material se lavó hasta obtener un pH de 3,5. Después, el material se encogió con solución salina al 7%, se neutralizó con solución de NaHCO_{3} al 1% y se lavó bajo agua corriente. Seguidamente, el material se deshidrató con acetona y se desgrasó con N-hexano. El contenido de nitrógeno de las amidas del material era de 0,47 mmoles/g.

Determinación del contenido de nitrógeno amídico:

(Eastoe, E.; Courts, A.; Practical Analytical Methods for Connective Tissue Proteins (1963)).

Reactivos

1.: HCl 2 N (160 ml de HCl concentrado enrasado a 1 litro)

2.: Borax 0,05 M -solución de NaOH 0,15 N (19,1 g de Na_{2}B_{4}O_{7}·10H_{2}O) + 6 g de NaOH en 1 litro, enrasado con H_{2}O destilada fría)

3.: Indicador - mezclado en etanol (azul de metileno al 0,33% + rojo de metileno al 0,05%)

4.: Ácido bórico al 1% con el indicador

: 10 g de ácido bórico en 1 litro de H_{2}O destilada fría

: 8 ml de indicador

: 0,7 ml de NaOH 0,1 N

: 5. HCl 0,01 N

Procedimiento

1.: Se dispersó 1 g de masa seca de colágeno en 50 ml de HCl 2 N y se sometió a ebullición durante 1 hora. El volumen se enrasó a 50 ml a 20ºC.

2.: 5 ml de la dispersión anterior se introdujo en un matraz microkjehldahl junto con 20 ml de solución 2; la mezcla se destiló en 20 ml de solución 4. La destilación tardó 6 minutos.

3.: La solución se valoró con reactivo 5.

Cálculo

ml de ácido consumido x 20 = % de mmoles de N amídico

Ejemplo

1,36 ml de HCl 0,01 N x 20 {}\hskip0,4cm= 27,2 % mmoles

{}\hskip4,4cm= 0,27 mmoles/g de N amídico

Claims

1. Utilización de una membrana de colágeno fisiológicamente aceptable y reabsorbible obtenida mediante purificación de una membrana de colágeno natural de manera que se conserva sustancialmente su estructura de colágeno natural y que presenta lados opuestos fibroso y liso, para la manufacturación de un implante de regeneración guiada de tejidos para la orientación en el cuerpo de un ser humano o de un animal no humano, de manera que dicha membrana se introduce con dicho lado fibroso encarado hacia el área de dicho cuerpo en el que se requiere la regeneración de tejidos y se permite el crecimiento celular sobre el mismo, y dicho lado liso opuesto inhibe la adhesión celular sobre sí mismo y actúa como barrera que evite el paso de células a través de la membrana.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha membrana se deriva de una membrana peritoneal o pericárdica de mamífero, de membrana placentaria o de membrana basal.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicha membrana peritoneal se deriva de terneros o lechones.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que dicha membrana peritoneal se deriva de lechones de 6 a 7 semanas de edad.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha membrana se encuentra sustancialmente libre de grasa.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha membrana presenta un grosor de entre 0,1 y 1,0 mm en estado seco.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el colágeno se encuentra entrecruzado sin llegar a ser no reabsorbible.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el lado fibroso de la membrana se encuentra impregnado con un glicosaminoglicano.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que el glicosaminoglicano es el ácido hialurónico.

10. Utilización según la reivindicación 8, en la que el glicosaminoglicano es condroitín sulfato, dermatán sulfato y/o queratán sulfato.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que la membrana impregnada contiene entre el 0,1 y el 30,0% en peso de glicosaminoglicano.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que la membrana impregnada contiene entre el 2 y el 10% en peso de glicosaminoglicano.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el implante manufacturado contiene uno o más fármacos.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que el implante manufacturado contiene taurolidina.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el implante manufacturado es para la regeneración guiada de tejido óseo dentro de dicho cuerpo.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el implante manufacturado es para la regeneración guiada de tejidos en la región orofacial de dicho cuerpo.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que una membrana de colágeno de mamífero que presenta una cara lisa y una cara fibrosa se somete a tratamiento con álcali con el fin de saponificar las grasas y eliminar las sustancias sensibles a álcali y después se acidifica con el fin de eliminar las sustancias sensibles a ácidos, seguido del lavado, secado y desgrasado, de manera que se forma la membrana de colágeno fisiológicamente aceptable y reabsorbible que se requiere, que conserva sustancialmente su estructura de colágeno natural.