ES2318115T3

ES2318115T3 - Matrices de hidrogel reticulado bioactivo.

Info

Publication number: ES2318115T3
Application number: ES03709302T
Authority: ES
Inventors: Francis V. Lamberti; Richard Chris Klann; Ronald Stewart Hill
Original assignee: Encelle Inc
Current assignee: Encelle Inc
Priority date: 2002-02-21
Filing date: 2003-02-21
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2023-02-21
Also published as: US8957050B2; US20130189371A1; US9610382B2; AU2003215330A1; EP1476204A1; CA2476656A1; US7303814B2; AU2003213253A1; ATE410198T1; EP1476202B1; US10265436B2; DE60325827D1; CA2476656C; AU2003213253B2; WO2003072155A1; US20100226961A1; WO2003072157A1; JP2005528933A; AU2003215330B2; JP4624678B2

Abstract

Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado, matriz que comprende un poliglicano, un polipéptido reticulado covalentemente con el poliglicano, y al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos polares, quelantes catiónicos divalentes, y sus combinaciones.

Description

Matrices de hidrogel reticulado bioactivo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a matrices de hidrogel reticulado bioactivo que son adecuadas para uso en procedimientos terapéuticos basados en la inducción de vasculogénesis localizada, cicatrización de heridas, reparación de tejidos, y regeneración de tejidos.

Antecedentes de la invención

La sustitución o reparación de tejidos u órganos dañados o enfermos por implante ha sido, y continua siendo, una meta a largo plazo de la medicina hacia la que se han realizado grandes progresos. Trabajando en dirección a dicha meta, hay un interés creciente en las técnicas de ingeniería de tejidos en las que se usan materiales biocompatibles y biodegradables como matriz de soporte, como sustrato para la administración de células cultivadas, o para la reconstrucción tridimensional de un tejido (Park, S., "Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-etil-3-(3-dimetilaminopropyl) carbodiimida cross-linking" Biomaterials 23:1205-1212 (2002)). Sin embargo, uno de los problemas más graves que restringen el uso de materiales implantados es la respuesta a la cicatrización de heridas del cuerpo desencadenada por los materiales extraños implantados (Ratner, B.D., "Reducing capsular thickness and enhancing angiogenesis around implant drug release systems" Journal of Controlled Release 78:211-218 (2002)).

Se define la biocompatibilidad como la adecuada respuesta del huésped a un material extraño usado en su aplicación pretendida. La biocompatibilidad se refiere además a la interacción entre el material extraño y los tejidos y sistemas fisiológicos del paciente tratado con el material extraño. La unión de proteínas y posterior desnaturalización, así como la adhesión y activación celular se han considerado determinantes de la biocompatibilidad de un material. La biocompatibilidad implica también que el implante evita efectos perjudiciales para los diferentes sistemas protectores del huésped y sigue siendo funcional durante un periodo de tiempo significativo. Los ensayos in vitro diseñados para evaluar la citotoxicidad y la unión a proteína se usan de manera rutinaria para la medida de la posible biocompatibilidad de un material. En otras palabras, la biocompatibilidad de un material depende de su capacidad para integrarse completamente con los tejidos circundantes tras la implantación.

La investigación anterior ha demostrado que las interacciones específicas entre células y su matriz extracelular circundante juegan un importante papel en el estímulo y regulación de la reparación celular y de los procesos de sustitución (Hynes, S.O., "Integrins: a family of cell surface receptors" Cell 48:549-554 (1987)). En consecuencia, hay un gran interés en el trabajo relacionado con polímeros biocompatibles útiles en aplicaciones terapéuticas. Un tipo particular de polímeros que se han mostrado útiles en este tipo de aplicaciones, incluyendo materiales para lentes de contacto, tendones artificiales, matrices para ingeniería de tejidos, y sistemas de administración de fármacos, son los hidrogeles (Schacht, E., "Hydrogels prepared by crosslinking of gelatin with dextran dialdehyde" Reactive & Functional Polymers 33:109-116 (1997)). Se acepta normalmente que los hidrogeles son materiales constituidos por una red tridimensional permanente de polímeros hidrófilos con agua rellenando el espacio entre las cadenas poliméricas. Los hidrogeles se pueden obtener copolimerizando monómeros hidrófilos adecuados, por extensión de cadena y reticulando prepolímeros o polímeros hidrófilos.

El trabajo anterior ha demostrado que una matriz de hidrogel termoreversible, que es líquida a temperaturas casi fisiológicas, desencadena la vasculogénesis y modula la cicatrización de heridas en úlceras dérmicas (Usala A.L. y col. "Induction of fetal-like wound repair mechanisms in vivo with a novel matrix scaffolding" Diabetes 50 (Suplemento 2): A488 (2001), y Usala A.L. y col., "Rapid Induction of vasculogenesis and wound healing using a novel injectable connective tissue matrix" Diabetes 49 (Suplemento 1): A395 (2000)). Se ha demostrado también que el material de hidrogel bioactivo mejora la cicatrización en respuesta a materiales extraños implantados; demostrando una disminución en el espesor de la cápsula fibrosa circundante y un aumento persistente en el suministro de sangre inmediatamente adyacente a los materiales implantados expuestos a este hidrogel termoreversible. (Ravin A.G. y col., "Long-and Short-Term Effects of Biological Hydrogels on Capsule Microvascular Density Around Implants in Rats" J Biomed Mater Res 58(3):313-8 (2001)). Sin embargo, el uso de este hidrogel bioactivo termoreversible en aplicaciones terapéuticas que requieren estabilidad tridimensional y térmica no es práctico puesto que el hidrogel se funde a temperaturas fisiológicas. De acuerdo con esto, existe necesidad de un material bioactivo que sea estable a temperaturas corporales y sea así apropiado para uso tanto como dispositivo médico o en aplicaciones médicas, particularmente las pretendidas para uso en mamíferos.

Un biopolímero concreto para uso en aplicaciones médicas se desvela en la Patente de los Estados Unidos Nº 6,132.759, que se refiere a un medicamento que contiene una matriz de biopolímero que comprende gelatina reticulada con polisacáridos oxidados. El biopolímero de la patente '759 se reivindica como útil para tratar heridas en la piel o trastornos dermatológicos cuando se incorpora al anterior un fármaco estimulante de la cicatrización de heridas. De manera similar, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.972.385 describe una matriz formada haciendo reaccionar un polisacárido modificado con colágeno que posteriormente puede usarse para la reparación de tejidos cuando se combina con factores de crecimiento. Varias publicaciones adicionales han descrito polímeros y copolímeros para uso en aplicaciones médicas, tal como administración de fármacos, regeneración de tejidos, cicatrización de heridas, apósitos para heridas, barreras de adhesión y adhesivos para heridas (Véanse, por ejemplo, Draye, J.P. y col., "In vitro release characteristics of bioactive molecules from dextran dialdehyde gel cross-linking hydrogel films" Biomaterials 19:99-107 (1998); Draye, J.P. y col., "In vitro and in vivo biocompatibilidad of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films" Biomaterials 19:1677-1687 (1998); Kawai, K. y col., "Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factor impregnated gelatin microspheres into artificial dermis" Biomaterials 21:489-499 (2000); Edwards, G.A. y col., "In vivo evaluation of collagenous membranes as an absorbable adhesion barrier" Biomed. Mater. Res. 34:291-297 (1997); Patente de los Estados Unidos Nº 4.618.490; y Patente de los Estados Unidos Nº 6,165.488.) Dichos polímeros biocompatibles, sin embargo, son en general terapéuticamente efectivos sólo cuando se combinan con otros agentes terapéuticos como factores de crecimiento, factores de coagulación, antibióticos, y otros fármacos.

Algunos polímeros biocompatibles anteriormente conocidos están basados al menos en parte en colágeno o material derivado de colágeno. Adicionalmente, otros polímeros biocompatibles conocidos están basados en polisacáridos, particularmente dextrano. En algunos casos, se han formado biopolímeros reticulando gelatina y dextrano; sin embargo, la utilidad de estos polímeros para uso a largo plazo en el cuerpo no ha sido demostrada. Está bien documentado que la gelatina y el dextrano son incompatibles en disolución acuosa, haciendo difícil producir copolímeros que sean estables a temperaturas corporales.

Así, sigue existiendo necesidad de hidrogeles activos estabilizados que sean útiles para aplicaciones médicas cuando se desea un uso estable a largo plazo en el cuerpo.

Breve resumen de la invención

Se proporciona una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado útil como gel o pasta terapéuticos. La viscosidad del hidrogel bioactivo de la invención puede variarse en un amplio intervalo controlando las condiciones de procesados usando parámetros bien conocidos de los expertos en la técnica. Estos hidrogeles bioactivos se pueden usar tanto como dispositivos médicos terapéuticos o como colaboradores en otras formas de terapia que requieran una modulación de la cicatrización de heridas e integración tisular localizados. Las matrices de hidrogel de la invención comprenden una matriz de hidrogel bioactivo reticulado, comprendiendo dicha matriz un poliglicano, un polipéptido reticulado covalentemente con el poliglicano, y al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos polares, quelantes catiónicos divalentes, y sus combinaciones. La composición comprende un poliglicano de alto peso molecular, unido covalentemente a un polipéptido de alto peso molecular. Los componentes poliglicano y polipéptido son preferiblemente dextrano y gelatina. Los agentes preferidos incluyen aminoácidos polares, tales como cisteína, arginina, lisina, y ácido glutámico, EDTA o sus sales, y sus mezclas o combinaciones.

Se proporciona también un procedimiento para preparar una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado. El procedimiento comprende proporcionar una mezcla de un poliglicano, un polipéptido, y al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos polares, quelantes catiónicos divalentes, y sus combinaciones; y hacer reaccionar el poliglicano con el polipéptido en condiciones suficientes para reticular covalentemente el poliglicano con el polipéptido. Como se entenderá, los componentes de poliglicano y polipéptido se pueden reticular durante o tras la adición del agente o agentes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una matriz de hidrogel bioactivo reticulado para uso en terapia. En otro aspecto, la invención proporciona una matriz de hidrogel bioactivo reticulado para uso en el estímulo de la regeneración de tejidos. El procedimiento comprende las etapas de identificar un lugar específico necesitado de regeneración de tejidos y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado, como se ha descrito anteriormente, al lugar identificado.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado para uso en la adición de volumen al tejido. El procedimiento comprende las etapas de identificar un lugar específico necesitado de volumen tisular añadido y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado, como se ha descrito anteriormente, al lugar identificado.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar un implante óseo usando una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado de la presente invención. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una cantidad de un material osteoconductivo u osteoinductivo, tal como aluminato de calcio, hidroxiapatito, alúmina, zirconia, silicatos de aluminio, fosfato de calcio, vidrio bioactivo, materiales cerámicos, colágeno, hueso autólogo, hueso alogénico, hueso xenogénico, materiales coralinos, o sus derivados o combinaciones, proporcionando una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado como se ha descrito más arriba, combinando el material osteoconductivo u osteoinductivo con la matriz de hidrogel para formar una pasta de material compuesto que se puede verter y colar, colar la pasta en un molde conformado, dejar endurecer la pasta en el molde conformado, y retirar la pasta colada del molde conformado.

Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado se puede usar en combinación con células viables de tejido para tratamiento terapéutico.

Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado se puede usar para tratar una herida, por ejemplo, para cubrir la herida o como sellante del tejido.

Breve descripción de los dibujos

Habiendo por tanto descrito la invención en términos generales, ahora se hará referencia a los dibujos adjuntos que no están dibujados a escala necesariamente, y en los que:

La figura 1 ilustra la formación de cadenas alfa abiertas derivadas de monómeros de colágeno;

La figura 2A ilustra el efecto de la asociación de las cadenas alfa con dextrano;

La figura 2B ilustra el comportamiento de las cadenas alfa sin asociación con el dextrano;

La figura 3 ilustra el efecto de otros aditivos en la matriz de hidrogel;

La figura 4 ilustra una forma de realización de una matriz de la invención de gelatina/dextrano reticulada covalentemente;

La figura 5 ilustra gráficamente el efecto de una matriz de hidrogel en el estímulo de la agregación celular;

La figura 6 ilustra el uso de una forma de realización reticulada de la matriz bioactiva de la presente invención en la reparación ósea, y

La figura 7 ilustra gráficamente las relaciones de la gelatinización global de la matriz de hidrogel reticulada respecto de la oxidación de dextrano.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora más completamente a continuación en este documento con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran las formas de realización de la invención preferidas. Esta invención puede, sin embargo, realizarse de muchas formas diferentes y no debe considerarse limitada a las formas de realización definidas en este documento; sino más bien, estas formas de realización se proporcionan para que la descripción sea completa y plena, y pondrá el alcance de la invención al alcance de los expertos en la técnica. Números iguales se refieren a elementos iguales en todo lo que sigue.

La formulación de una matriz de hidrogel termoreversible que proporciona un medio de cultivo celular y una composición para preservar la viabilidad celular se enseña en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.231.881. Adicionalmente, se proporciona una matriz de hidrogel útil para potenciar la vascularización en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.261.587.

La matriz de hidrogel termoreversible que enseñan estas referencias es un gel a temperaturas de almacenamiento y se funde a temperaturas fisiológicas, y comprende una combinación de un componente derivado de colágeno, como gelatina, un poliglicano de cadena larga, como dextrano, y cantidades eficaces de otros componentes, tales como aminoácidos polares. La matriz de hidrogel termoreversible enseñada por estas referencias se describe más adelante en relación con las figuras 1-3.

El colágeno es un componente proteico principal de la matriz extracelular de los animales. El colágeno se ensambla en una compleja organización fibrilar. Las fibrillas se ensamblan en madejas que forman las fibras. Las fibrillas están hechas de cinco microfibrillas colocadas en una disposición apilada. Cada microfibrilla es una colección de varillas de colágeno. Cada varilla de colágeno es una triple hélice dextrógira, siendo cada cadena ella misma una hélice levógira. Las fibrillas de colágeno están reforzadas mediante reticulaciones covalentes intra e intermoleculares que hacen que los tejidos de los animales maduros sean insolubles en agua. Cuando se usan los tratamientos adecuados, las varillas de colágeno se extraen y solubilizan manteniendo su conformación en triple hélice. Esto es colágeno desnaturalizado, y se diferencia de la forma nativa del colágeno, pero no ha sufrido suficiente tratamiento térmico o químico para romper los enlaces covalentes intramoleculares estabilizantes que aparecen en el colágeno. Cuando las soluciones de colágeno se calientas extensamente, o cuando los tejidos que contienen colágeno nativo se someten a tratamientos químicos y térmicos, los enlaces de hidrógeno y covalentes que estabilizan las hélices de colágeno se rompen, y las moléculas adoptan una conformación desordenada. Cuando se rompen estos enlaces de hidrógeno, los grupos polares amina y ácido carboxílico están ahora disponibles para enlazarse con grupos polares procedentes de otras fuentes o de sí mismos. Este material es la gelatina, y es soluble en agua a 40-45ºC.

Como se ha indicado anteriormente, la gelatina es una forma de colágeno desnaturalizado, y se obtiene por hidrólisis parcial de colágeno derivado de la piel, tejido conectivo blanco o huesos de animales. La gelatina puede derivarse a partir de un precursor tratado con ácido o un precursor tratado con álcali. La gelatina derivada de un precursor tratado con ácido se denomina Tipo A, y la gelatina derivada de un precursor tratado con álcali se denomina Tipo B. Los cambios estructurales macromoleculares asociados con la degradación del colágeno son básicamente los mismos para la hidrólisis química y térmica parcial. En el caso de la degradación térmica y catalizada por ácido, la rotura hidrolítica predomina entre las cadenas individuales de colágeno. En la hidrólisis alcalina, predomina la rotura de las reticulaciones inter e intra moleculares.

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La figura 1 ilustra la rotura hidrolítica del tropocolágeno (10), formando las cadenas alfa individuales polares de la gelatina (15). Calentar el tropocolágeno (10) rompe los enlacen de hidrógeno que confinan estrechamente los monómeros de triple cadena del colágeno maduro.

Las figuras 2A-2B ilustran la estabilización del andamiaje de la matriz monomérica mediante la introducción de un poliglicano de cadena larga, tal como el dextrano (20). Como se representa en la figura 2A, el dextrano (20) sirve para mantener abierta la gelatina (15), que se ha calentado previamente, por interferencia con la predisposición natural de la gelatina (15) a plegarse por sí misma y formar enlaces de hidrógeno entre sus grupos polares. En ausencia del dextrano (20), como se muestra en la figura 2B, cuando la gelatina (15) comienza a enfriarse, se formarán enlaces de hidrógeno entre los grupos de aminoácidos y ácidos carboxílicos de la porción linear del monómero, y se plegará por sí misma, limitando de esta forma los sitios disponibles para la unión celular.

La matriz termoreversible contiene un poliglicano, como dextrano, en una concentración terapéuticamente eficaz comprendida entre, por ejemplo, 0,01 y 10 mM, preferiblemente entre 0,01 y 1 mM, más preferiblemente entre 0,01 y 0,1 mM. En una forma de realización, el dextrano está presente en una concentración de aproximadamente 0,09 mM.

La matriz termoreversible también contiene gelatina, en una concentración terapéuticamente eficaz comprendida entre, por ejemplo, 0,01 y 40 mM, preferiblemente entre 0,05 y 30 mM, más preferiblemente entre 1 y 5 mM. Ventajosamente, la concentración de gelatina es aproximadamente de 1,6 mM.

Con el fin de aumentar la unión celular, se puede añadir colágeno intacto en pequeñas cantidades a la matriz termoreversible con el fin de proporcionar estructura adicional a las células contenidas en la matriz. La concentración final de colágeno intacto está entre 0 y 5 mM, preferiblemente 0 y 2 mM, más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. En una forma de realización, la concentración de colágeno intacto es de aproximadamente 0,11 mM.

La matriz termoreversible puede adicionalmente contener una cantidad eficaz de aminoácidos polares, que se definen habitualmente para incluir tirosina, cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, e histidina, Para uso en la presente invención, los aminoácidos se seleccionan preferiblemente entre el grupo constituido por cisteína, arginina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico y sus mezclas. Por aminoácido se entiende todos los alfa-aminoácidos naturales en sus dos formas estereoisoméricas D y L. La concentración total de todos los aminoácidos polares está en general entre 3 y 150 mM, preferiblemente entre 10 y 65 mM, y más preferiblemente entre 15 y 40 mM.

Ventajosamente, los aminoácidos polares añadidos comprenden L-cisteína, L-ácido glutámico, L-lisina, y L-arginina. La concentración final de L-ácido glutámico es por lo general de 2 a 60 mM, preferiblemente de 5 a 40 mM, más preferiblemente entre 10 y 20 mM. En una forma de realización, la concentración de L-ácido glutámico es aproximadamente 15 mM. La concentración final de L-lisina es por lo general de 0,5 a 30 mM, preferiblemente de 1 a 15 mM, más preferiblemente entre 1 y 10 mM. En una forma de realización, la concentración de L-lisina es aproximadamente de 5,0 mM. La concentración final de L-arginina es por lo general de aproximadamente 1 a 40 mM, preferiblemente de 1 a 30 mM, más preferiblemente entre 5 y 15 mM. En una forma de realización, la concentración final de arginina es de aproximadamente 10 mM. Las concentraciones finales de L-cisteína, que proporciona enlaces disulfuro, es por lo general de 5 a 500 \muM, preferiblemente 10 a 100 \muM, más preferiblemente entre 15 y 25 \muM. En una forma de realización, la concentración final de cisteína es de aproximadamente 20 \muM.

La matriz termoreversible está preferiblemente basada en un tampón fisiológicamente compatible, siendo una forma de realización Medium 199, una solución nutriente habitual usada en cultivos in vitro de diferentes tipos de células de mamífero (comercializado por Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), que se suplementa adicionalmente con aditivos y cantidades adicionales de algunos componentes del medio, tal como cantidades suplementarias de aminoácidos polares como se ha descrito anteriormente.

Ventajosamente, se puede añadir aminoguanidina a esta formulación; sin embargo, se pueden usar también otros análogos de L-arginina en la presente invención, tales como N-monometil L-arginina, N-nitro-L-arginina o D-arginina. La concentración final de aminoguanidina es por lo general de 5 a 500 \muM, preferiblemente de 10 a 100 \muM más preferiblemente entre 15 y 25 \muM. En una forma de realización, la concentración final es aproximadamente de 20 \muM.

Adicionalmente, la matriz puede incluir uno o más quelantes catiónicos divalentes, que incrementan la rigidez de la matriz mediante la formación de complejos de coordinación con cualesquiera iones metálicos divalentes presentes. La formación de dichos complejos lleva a un aumento en la rigidez de la matriz eliminando la inhibición de la formación de enlaces de hidrógeno entre NH_{2} y -COOH producida por la presencia de iones metálicos divalentes. Un ejemplo preferido de un quelante catiónico divalente que es útil en la presente invención es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una de sus sales. El intervalo de concentración del quelante catiónico divalente, tal como EDTA, es por lo general de 0,01 a 10 mM, preferiblemente de 1 a 8 mM, más preferiblemente entre 2 y 6 mM. En una forma de realización, el EDTA está presente en una concentración de aproximadamente 4 mM.

La figura 3 ilustra el efecto de los aminoácidos polares y la L-cisteína añadida para estabilizar las unidades (25), formadas mediante gelatina (15) y dextrano (20), enlazando los sitios polares expuestos del monómero a, por ejemplo, los grupos amino de la arginina o los grupos carboxílicos del ácido glutámico. Además, se pueden formar uniones disulfuro entre las moléculas de L-cisteína (formando por tanto cistina) que a su vez forman enlaces de hidrógeno con la gelatina (15).

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Las características químicas y térmicas del hidrogel termoreversible anteriormente descrito se determinan en gran cantidad mediante las propiedades termomecánicas de uno de sus principales componentes, la gelatina. Las matrices basadas en gelatina se funden por lo general a temperaturas casi fisiológicas y por tanto no se puede esperar que tengan la durabilidad y propiedades mecánicas necesarias requeridas para su implante como dispositivo médico en algunas aplicaciones. Por tanto, es obligatorio estabilizar estos geles mediante una variedad de interacciones intermoleculares incluyendo enlace de hidrógeno, enlace electrostático o polar mediado por aminoácido, enlace hidrofóbico y enlace covalente. Sin desear quedar ligado por teoría alguna, se cree que los tipos de mecanismos de enlace anteriormente descritos junto con el poliglicano de cadena larga estabilizan polipéptidos como la gelatina. Por ejemplo, como se describe con más detalle más adelante, los grupos polares cargados positivamente de las cadenas alfa derivadas de colágeno, son seguidamente capaces de asociarse con los grupos hidroxilo negativamente cargados de las unidades repetidas de glucosa que aparecen en, por ejemplo, el dextrano. Gelatina y dextrano forman un hidrogel bioactivo de material compuesto que contiene estructuras macromoleculares tipo proteoglicano.

A diferencia de la matriz termoreversible de la técnica anterior previamente descrita, la presente invención proporciona composiciones estabilizadas que comprenden una matriz de hidrogel bioactivo reticulado que se puede usar, por ejemplo, para estimular la cicatrización de heridas o la vasculogénesis. La presente invención se dirige también a un procedimiento para preparar una matriz de hidrogel bioactivo reticulado que es terapéuticamente útil a temperaturas fisiológicas. Por "bioactivo" se entiende la capacidad de facilitar o impedir una respuesta celular o tisular de un huésped a materiales extraños introducidos en el cuerpo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a inducción de vasculogénesis, inhibición de la formación de respuesta a cuerpo extraño, estímulo de la adhesión celular al material de andamiaje, y estímulo de la regeneración de tejidos. Se pretende que el término "estabilizado" o "estable" se refiera a composiciones de materiales que se hinchan en agua, poco solubles, sólidos o semi-sólidos a temperatura fisiológica (es decir, aproximadamente 37ºC) y en fluidos fisiológicos (por ejemplo, fluidos corporales con un pH fisiológico de aproximadamente 7,4), que siguen estando presentes en el huésped durante tiempo suficiente para conseguir la respuesta pretendida.

La matriz de hidrogel bioactivo estabilizada de la invención se forma a partir de un poliglicano y un polipéptido. Por poliglicano de alto peso molecular se entiende un polisacárido constituido por más de aproximadamente 10 restos de monosacárido unidos entre sí mediante uniones glicosídicas. El poliglicano puede estar constituido por los mismos restos de monosacárido, o varios restos de monosacárido o derivados de restos de monosacárido. Dextrano, un polisacárido preferido, sólo comprende restos de glucosa. El dextrano comprende típicamente cadenas lineales de restos de D-glucosa unidos \alpha(1\rightarrow6), a menudo con ramificaciones \alpha(1\rightarrow2), o \alpha(1\rightarrow3). El dextrano nativo, producido por numerosas especies de bacterias de la familia Lactobacilliaceae, es una mezcla polidispersa de componentes.

El componente de poliglicano preferiblemente tiene un intervalo de pesos moleculares de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 8.000.000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 1.000.000 Da. A no ser que se indique otra cosa, el peso molecular se expresa en el presente documento como peso molecular
{}\hskip17cm promedio en número (Mn), que se define como \frac{\Sigma NiMi}{\Sigma Nt} en la que Ni es el número de moléculas de polímero (o el número de moles de dichas moléculas) que tienen un peso molecular Mi.

En la presente invención se puede usar cualquier polisacárido, incluyendo glicosaminoglicanos (GAG) o glucosaminoglicanos, con viscosidad, masa molecular y resto de propiedades deseadas adecuadas. Por glicosaminoglicanos se entiende cualquier glicano (es decir, polisacárido) que comprende una cadena no ramificada de polisacárido con una unidad repetitiva de disacárido, uno de los cuales es siempre un aminoazúcar. Estos compuestos como clase llevan una elevada carga negativa, son fuertemente hidrófilos, y habitualmente se denominan mucopolisacáridos. Este grupo de polisacáridos incluye heparina, sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de keratán, y ácido hialurónico. Estos GAG se encuentran predominantemente en superficies celulares y en la matriz extracelular. Por glucosaminoglicano se entiende cualquier glicano (es decir polisacárido) que contiene predominantemente derivados de monosacárido en los que un grupo hidroxilo alcoholico se ha sustituido por un grupo amino u otro grupo funcional domo sulfato o fosfato. Un ejemplo de un glucosaminoglicano es poli-N-acetil glucosaminoglicano, habitualmente denominado quitosán. Polisacáridos a modo de ejemplo que pueden ser útiles en la presente invención incluyen dextrano, heparán, heparina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, caragenano, amilopectina, amilosa, glicógeno, almidón, celulosa, quitina, quitosán y varios polisacáridos sulfatados tales como sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, sulfato de dermatán, o sulfato de keratán.

Por polipéptido de alto peso molecular se entiende cualquier polipéptido derivado de tejido o sintéticamente producido, tales como colágenos o gelatinas derivadas de colágeno. Aunque la gelatina derivada de colágeno es el componente de polipéptido de alto peso molecular preferido, se pueden usar otros componentes tipo gelatina caracterizados por un esqueleto constituido por secuencias de aminoácidos con grupos polares capaces de interactuar con otras moléculas. Por ejemplo, se pueden usar para producir el componente de polipéptido queratina, decorina, agrecano, glicoproteínas (incluyendo proteoglicanos), y similares. En una forma de realización, el componente de polipéptido es gelatina porcina procedente de colágeno parcialmente hidrolizado derivado del tejido de la piel. Se pueden usar también polipéptidos derivados de otros tipos de tejido. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a extractos tisulares procedentes de arterias, cuerdas vocales, pleura, tráquea, bronquios, tabiques alveolares pulmonares, ligamentos, cartílago auricular o fascia abdominal; la red reticular del hígado; la membrana basal del riñón; o el neurilema, o la aracnoides, dura mater o pia mater del sistema nervioso. También se pueden usar polipéptidos purificados que incluyen, pero no se limitan a, laminina, nidógeno, fibulina, y fibrillina o mezclas de proteínas como las que se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.264.992 y en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.829.000, extractos de caldo de cultivo celular como se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.284.284, tejidos submucosales como los que se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.264.992, o productos génicos como los que se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.303.765. Otro ejemplo de polipéptido de alto peso molecular adecuado es una proteína de fusión formada por diseño genético de una especie reactiva en una proteína. El componente de polipéptido preferiblemente tiene un intervalo de pesos moleculares de 3.000 a 3.000.000 Da, más preferiblemente 30.000 a 300.000 Da.

En una forma de realización preferida, gelatina y dextrano son componentes de la matriz bioactiva de la presente invención. Para facilidad de descripción de la invención, los términos "gelatina" y "dextrano" se usan en toda la memoria sabiendo que se incluyen en la presente invención otras alternativas como componentes de poliglicano y polipéptido como se ha descrito anteriormente, como comprobarán los expertos en la técnica.

En una forma de realización de la presente invención, como se ilustra en la figura 4, dextrano (20) se reticula covalentemente con la gelatina (15) mediante las uniones (70), formando de esta manera una redreticulada (50). Las uniones (709 son el resultado bien de la reacción de grupos funcionales de la gelatina (15) con grupos funcionales del dextrano (20), o bien el resultado de una reacción entre una molécula reticulante bifuncional tanto con el dextrano (20) como con la gelatina (15). Como se explica con más detalle a continuación, un procedimiento para reticular gelatina y dextrano es modificar las moléculas de dextrano (20), como por oxidación, con el fin de formar grupos funcionales adecuados para unión covalente con la gelatina (15). Esta red (50) bioactiva reticulada estabilizada produce geles y pastas terapéuticamente útiles que son insolubles en fluidos fisiológicos a temperaturas fisiológicas. No se necesita sustrato o superficie adicionales. Los geles y pastas así formados son adecuados para el desarrollo de procedimientos terapéuticos basados en la inducción de una vasculogénesis localizada, cicatrización de heridas, reparación de tejidos, y regeneración. Dichos geles y pastas se pueden usar, por ejemplo, para reparar regiones isquémicas del corazón o vasos periféricos, facilitar la reparación ósea, o para proporcionar un andamiaje local para la cicatrización de heridas y reparación de tejidos.

En una forma de realización del procedimiento de fabricación de la matriz de hidrogel reticulada, uno de los componentes de poliglicano o polipéptido debe modificarse para formar grupos reactivos adecuados para reticulación. Por ejemplo, el componente de dextrano u otro poliglicano se puede modificar, como por oxidación, con el fin de reticularse con el componente de gelatina. Una reacción conocida para oxidar polisacáridos es la oxidación con peryodato. El procedimiento básico de la reacción que usa la química del peryodato es bien conocido y apreciado por los expertos en la técnica. La oxidación con peryodato se describe en general en Affinity Chromatography: A Practical Approach, Dean, y col., IRL Press, 1985 ISBN0-904147-71-1. La oxidación de dextrano mediante el uso de la química del peryodato se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.011.008.

En la oxidación con peryodato, los polisacáridos se pueden activar por la oxidación de grupos diol vecinos. En los poliglicanos, esto por lo general se realiza mediante tratamiento con una disolución acuosa de una sal de ácido peryódico, tal como peryodato de sodio (NaIO_{4}), que oxida los dioles del azúcar para generar grupos aldehído reactivos (por ejemplo restos dialdehído). Este procedimiento es una alternativa rápida y conveniente a otros procedimientos de oxidación conocidos, como los que usan bromuro de cianógeno. Los poliglicanos activados mediante oxidación con peryodato se pueden almacenar a 4ºC durante varios días sin pérdida apreciable de actividad.

Poliglicano, materiales, como dextrano, activados de esta forma reaccionan rápidamente con materiales que contienen grupos amino, como la gelatina, produciendo un material reticulado mediante la formación de uniones de base de Schiff. Una base de Schiff es un nombre común para denominar la imina formada mediante una reacción entre una amina primaria y un aldehído o cetona. Los grupos aldehído formados en la superficie celulósica reaccionan con la mayor parte de aminas a valores de pH comprendidos entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6. Las uniones de base de Schiff se forman entre los restos dialdehído del poliglicano y los grupos amino libres de la proteína. El producto reticulado puede posteriormente estabilizarse (es decir, formación de uniones amina estables) por reducción con un borohidruro, tal como borohidruro de sodio (NaBH_{4}) o cianoborohidruro de sodio (NaBH_{3}CN). Los grupos aldehído residuales se pueden consumir con etanolamina u otra especie que contiene amina para modificar adicionalmente la matriz reticulada. Se pueden usar otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para proporcionar grupos reactivos en uno o ambos de los componentes de poliglicano o polipéptido de la matriz.

En la presente invención, se usa la química del peryodato con dextrano para formar un polímero multifuncional que puede reaccionar con gelatina y agentes presentes durante el procedimiento de fabricación. La reacción con peryodato lleva a la formación de polialdehído poliglicanos que son reactivos con aminas primarias. Por ejemplo, polipéptidos de alto peso molecular y poliglicanos de alto peso molecular pueden formar complejos covalentes de hidrogel que son geles reticulados coloidal o covalentemente. Se produce enlace covalente entre los grupos reactivos del dextrano y los grupos reactivos del componente de gelatina. Los puntos reactivos de la gelatina incluyen los grupos amino proporcionados por arginina, asparagina, glutamina, y lisina. Estos grupos amino reaccionan con los grupos aldehído o cetona del dextrano para formar un enlace covalente. Estos hidrogeles pueden prepararse fácilmente a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 34ºC y aproximadamente 90ºC. Adicionalmente, los hidrogeles se pueden preparar a un intervalo de pH comprendido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, preferiblemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8, y más preferiblemente entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7,6.

Controlando la extensión de la activación del dextrano y el tiempo de reacción, se pueden producir materiales estabilizados de andamiaje biomimético de diferente viscosidad y rigidez. Por "biomimético" se entienden composiciones o procedimientos que imitan o estimulan un proceso o producto biológico. Algunos procedimientos biomiméticos se han usado durante algunos años, tales como la síntesis artificial de vitaminas y antibióticos. Más recientemente se han propuesto aplicaciones biomiméticas adicionales, incluyendo anticuerpos nanorobot que buscan y destruyen bacterias causantes de enfermedades, órganos artificiales, brazos, piernas, manos y pies artificiales, y varios dispositivos electrónicos. Los materiales de andamiaje biomimético de la presente invención producen geles y pastas de uso terapéutico que son estables a aproximadamente 37ºC, o a temperatura corporal. Estos geles son capaces de expansión y/o contracción, pero no se disuelven en disolución acuosa.

Como procedimiento alternativo para formar la red reticulada de dextrano/gelatina, se puede usar un agente reticulante multifuncional como resto reactivo que une covalentemente las cadenas de gelatina y dextrano. Dichos agentes reticulantes bifuncionales pueden incluir glutaraldehído, epóxidos (por ejemplo, bis-oxiranos), dextrano oxidado, azidobenzoil hidracida, éster de p-N-[\alpha-maleimidoacetoxi]succinimida, p-azidofenil glioxal monohidrato, bis-[\beta-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro, bis[sulfosuccinimidil]suberato, ditiobis[succinimidil] propionato, suberato de disuccinimidilo, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida, y otros reactivos bifuncionales reticulantes conocidos de los expertos en la técnica.

En otra forma de realización que usa un agente reticulante, se pueden usar materiales poliacrilados, tal como triacrilato de trimetilpropano etoxilado (20), como agente reticulante no específico fotoactivado. Los componentes de una mezcla de reacción a modo de ejemplo incluirían un hidrogel termoreversible mantenido a 39ºC, monómeros de poliacrilato, tal como triacrilato de trimetilpropano etoxilado (20), un fotoiniciador, tal como eosina Y, agentes catalíticos, tal como 1-vinil-2-pirrolidinona, y trietanolamina. La exposición continua de esta mezcla de reacción a luz de longitud de onda larga (> 498 nm) produciría una red de hidrogel reticulado.

La matriz de hidrogel reticulada estabilizada de la presente invención se estabiliza y mejora adicionalmente por la adición de uno o más agentes. Por "agente" se entiende cualquier compuesto añadido a la matriz de hidrogel, además de los componentes de alto peso molecular, que mejoran la matriz de hidrogel proporcionando estabilidad adicional o ventajas funcionales. Los agentes adecuados, con los que se mezclan los componentes poliglicano y polipéptido y se dispersan dentro de la matriz de hidrogel, incluyen muchos de los aditivos descritos anteriormente en relación con la matriz termoreversible descrita anteriormente.

Los agentes para uso con la matriz de hidrogel reticulado estabilizada incluyen aminoácidos polares y quelantes catiónicos divalentes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus sales. Se pretende que los aminoácidos polares incluyan tirosina, cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, e histidina. Los aminoácidos polares preferidos son L-cisteína, ácido L-glutámico, L-lisina, y L-arginina. Las concentraciones adecuadas de cada agente preferido concreto son las mismas que las indicadas anteriormente en relación con la matriz de hidrogel termoreversible. Son agentes preferidos los aminoácidos polares, el EDTA, y sus mezclas. Los agentes se pueden añadir a la composición de la matriz antes o durante el reticulado de los componentes de alto peso molecular.

Los agentes son particularmente importantes en la matriz de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado debido a las propiedades inherentes que estimulan en el interior de la matriz. La matriz de hidrogel muestra una bioactividad intrínseca que resulta más evidente en las formas de realización adicionales descritas más adelante en este documento. Se cree que la bioactividad intrínseca es función de la estereoquímica única de las macromoleculas reticuladas en presencia de los aminoácidos polares potenciadores y reforzantes, así como del resto de agentes.

Por ejemplo, se ha observado la agregación de fibroblastos humanos expuestos a hidrogeles bioactivos, mientras que la agregación no se ha observado cuando los fibroblastos se han expuesto a los componentes individuales del hidrogel bioactivo. Los resultados de numerosos (casi cincuenta) experimentos controlados han demostrado que los fibroblastos de piel de neonato humano forman agregados multicelulares cuando se exponen a la formulación completa de hidrogel termoreversible a 37ºC, mientras que no se demuestra esta actividad de agregación de células usando formulaciones de omisión en las que no se forma el copolímero bioactivo. Las células agregadas formar clústeres celulares estrechamente unidas con procesos citoplasmáticos interdigitantes, mientras que las células tratadas con formulaciones que carecen de copolímero siguen redondas y sin proyecciones superficiales. Como se muestra en la figura 5, en una muestra de fibroblastos humanos expuestos a un hidrogel bioactivo que comprende dextrano y gelatina, al menos el 80% de las células presentes estaban en estado agregado, mientras que menos del 20% de las células presentes permanecían como células simples. Se observó el efecto opuesto en muestras en las que los fibroblastos humanos fueron expuestos a monómero de colágeno sólo, carbohidrato sólo, o se dejaron sin tratamiento. En muestras expuestas a monómero de colágeno sólo, aproximadamente el 75% de las células permanecieron en configuración de una sola célula, con sólo aproximadamente el 25% de las células en estado agregado. Se observó casi el mismo efecto en muestras expuestas a carbohidrato sólo. En las muestras que se dejaron sin tratamiento, aproximadamente el 60% de las células permanecieron en configuración de una sola célula, con sólo aproximadamente el 40% de las células en estado agregado.

En cada uno de los usos terapéuticos detallados más adelante, se usa una cantidad terapéuticamente eficaz de la matriz de la invención. La dosis terapéuticamente eficaz de cualquier matriz de hidrogel variará algo de matriz a matriz, de paciente a paciente, de uso a uso, y dependerá de factores como el estado del paciente, la naturaleza de la dolencia que está siendo tratada, y la ruta de administración. Por ejemplo, un pequeño defecto dérmico de 1 cm de diámetro y 0,5 cm de profundidad requeriría aproximadamente 0,4 cm^{3} de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado para rellenar el hueco, estimular la vasculogénesis y la regeneración de tejidos y tener eficacia terapéutica. Por el contrario, una úlcera de decúbito de 20 cm de diámetro y 5 cm de profundidad requeriría aproximadamente 1600 cm^{3} de hidrogel bioactivo reticulado estabilizado para tener una eficacia similar. Como proposición general, la cantidad de matriz bioactiva reticulada, necesaria para una eficacia terapéutica oscilará entre 0,1 y 2000 cm^{3}, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 100 cm^{3}.

El hidrogel bioactivo reticulado estabilizado se puede usar para regeneración de tejidos específica del emplazamiento, incluyendo vasculogénesis. Es conocido en la técnica el uso de colágeno intacto, gelatina, o dextrano como vehículo para contener y administrar factores de crecimiento y similares en procedimientos diseñados para estimular el crecimiento tisular. (Véanse, por ejemplo, Kawai, K. y col., "Accelerated tissue regeneration Through Incorporation of Basic Fibroblast Growth Factor-Impregnated Gelatin Microspheres into Artificial Dermis" Biomaterials 21:489-499 (2000); y Wissink, M.J.B. y col., "Binding and Release of Basic Fibroblast Growth Factor from Heparinized Collagen Matrices" Biomaterials 22:2291-2299 (2001)). Por el contrario, la actividad intrínseca del hidrogel reticulado estabilizado de la presente invención es suficiente para desencadenar una secuencia específica de respuestas biológicas, tales como estimular la regeneración de tejidos y la vasculogénesis, sin la adición de fármacos o factores de crecimiento exógenos. De hecho, la matriz de la invención reticulada puede estar sustancialmente libre, casi completamente libre de fármacos o factores de crecimiento exógenos, cuando se usa para la vascularización o regeneración de tejidos. Este hidrogel intrínsicamente bioactivo, como resultado de su estructura única, proporciona un andamiaje de adhesión celular que modula la actividad celular posterior, tal como la regeneración de tejidos y la vasculogénesis.

La bioactividad intrínseca del hidrogel reticulado estabilizado es evidente por su capacidad para estimular la vasculogénesis sin el uso de factores de crecimiento adicionales, como el factor básico de crecimiento de fibroblastos (FbCF). El hidrogel reticulado se puede usar in vivo para facilitar la vascularización en tejido dañado cuando se ubica en un término vascular y se le deja actuar como andamiaje vascular hasta que pueda crecer nuevo tejido vascular desde el término. El andamiaje vascular no sólo proporciona un medio de soporte para el nuevo tejido vascular, sino que también realiza la función de estimular el crecimiento de los vasos prolaterales proporcionando a la vez una fuente de estabilización de la zona dañada.

El hidrogel reticulado estabilizado se comporta de forma similar cuando se usa en otros aspectos de la regeneración de tejidos. El hidrogel proporciona una madeja estructural estabilizada que facilita la retención y multiplicación celular en zonas con daño tisular. Esto es debido en parte a la bioactividad intrínseca del hidrogel, que estimula el procedimiento regenerativo.

El hidrogel reticulado estabilizado se puede usar como agente de volumen para proporcionar dimensiones aumentadas a tejidos específicos que requieran volumen adicional, con objetivos tanto estéticos como funcionales. Los ejemplos de estas aplicaciones incluyen el tratamiento de individuos con incontinencia urinaria y enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), problemas normalmente relacionados con un tono reducido del esfínter. Un esfínter es una banda de fibras musculares en forma de anillo que actúan constriñendo un paso o cierran un orificio natural. Las personas con GERD muestran generalmente síntomas múltiples que se extienden desde fluidos gástricos que pueden regresar desde el estómago al esófago debido a que el esfínter en la base del esófago, que normalmente se abre para dejar pasar el material desde el esófago al estómago y después se cierra, tiene un tono reducido y no se consigue cerrar completamente. Las personas con GERD pueden tratarse con medicamentos para reducir la producción de fluidos gástricos o acelerar el movimiento del alimento desde el estómago al intestino; sin embargo, los casos graves requieren a menudo cirugía correctiva, tal como la fundoaplicatura de Nissen, en la que la parte superior del estómago se envuelve alrededor del esófago inferior para estrechar artificialmente el esfínter esofágico. De manera similar, la incontinencia urinaria es a menudo resultado de un tono reducido en el esfínter de la base de la vejiga que lleva a la uretra y puede requerir terapias múltiples, incluyendo la cirugía.

El hidrogel de la presente invención se puede usar para tratar estos problemas, y otros relacionados con un tono reducido en el esfínter. El hidrogel puede inyectarse en el esfínter tanto como un material de relleno del espacio o como vehículo celular para repoblar un tejido local añadiendo por tanto volumen, y permitiendo que el esfínter funcione normalmente de nuevo usando el volumen aumentado para contrarrestar el tono reducido, permitiendo por tanto que el esfínter cierre completamente. Dicho tratamiento se vuelve posible debido a la estabilidad aumentada del hidrogel bioactivo reticulado, que mantiene su estructura a temperaturas corporales y proporciona una solución a largo plazo biológicamente compatible que es mucho menos invasiva que los tratamientos alternativos.

La matriz de hidrogel reticulado puede combinarse con células de tejido viable en algunos usos terapéuticos. Es preferible, pero no necesario, que las células de tejido procedan del mismo tipo de tejido para el cual la matriz de hidrogel se va a usar terapéuticamente. Las células de tejido viable se pueden derivar de fuentes de tejido autólogo, fuentes de tejido alogénico o fuentes de tejido xenogénico. El término "autólogo" se indica para referirse al tejido originado en el propio huésped. El término "alogénico" se indica para referirse al tejido originado en una fuente que es de la misma especie (es decir, ser humano), pero de composición genética no idéntica. El término "xenogénico" se indica para referirse al tejido originado en una fuente de una especie distinta a la del huésped. Ejemplos no limitantes de tipos de células que se pueden usar en combinación con la matriz de hidrogel incluyen células madre, células óseas, tenocitos, adipocitos, cardiomiocitos, hepatocitos, células de la musculatura lisa, células endoteliales, y similares. Las células de tejido se pueden añadir a la matriz de hidrogel antes, durante o después de que se produzca la reticulación.

Una aplicación específica de la matriz de hidrogel combinada con células de tejido viable es el uso de células en la aplicación de agente de volumen anteriormente descrita. Se pueden añadir células de tejido que se originan en el mismo tipo de tejido necesitado de un agente de volumen a la matriz de hidrogel reticulado antes de la administración de la matriz al sitio anatómico necesitado del agente de volumen.

En otro ejemplo, se inyectan a un paciente hepatocitos suspendidos en la matriz de la invención antes del reticulado, y se reticula in situ. La matriz proporciona a) un andamiaje para las células inmovilizadas y b) un hidrogel bioactivo para la rápida vascularización en el punto del implante.

En otro ejemplo más, la matriz de hidrogel de la invención podría usarse como un andamiaje de cultivo ex vivo para el desarrollo de injertos vasculares de pequeño diámetro, válvulas u otros constructos complejos de diseño de tejidos antes de su implantación en un paciente. En este caso, el hidrogel reticulado sirve como plantilla de organización que dirige el crecimiento celular in vitro, y se puede usar para desarrollar complejas estructuras de órgano o tejido en una secuencia de etapas de cultivo.

En otro aspecto adicional de la invención, el hidrogel reticulado se mezcla con otros materiales para formar estructuras moldeables. Por ejemplo, los hidrogeles reticulados se pueden mezclar con materiales osteoconductivos u osteoinductivos, tales como aluminato de calcio, hidroxiapatito, alúmina, zirconia, silicatos de aluminio, fosfato de calcio, vidrio bioactivo, materiales cerámicos, colágeno, hueso autólogo, hueso alogénico, hueso xenogénico, materiales coralinos, o sus derivados o combinaciones, u otros materiales compuestos producidos de forma biológica que contienen elementos estructurales de calcio o hidroxiapatito. El término "osteoconductivo" se entiende que se refiere a materiales que facilitan la incursión de vasos sanguíneos y la formación de hueso nuevo en el interior de una estructura definida pasiva de enrejado. El término "osteoinductivo" se entiende que se refiere a materiales que llevan a una mitogénesis de células indiferenciadas mesenquimales perivasculares que llevan a la formación de células osteoprogenitoras (células con la capacidad de formar hueso nuevo). Por "alúmina" se entiende la definición habitual para los materiales constituidos por óxido de aluminio natural o sintético, que se puede ejemplificar de varias maneras, como corindón. Los vidrios bioactivos contienen por lo general dióxido de silicio (SiO_{2}) como formador de red y se caracterizan por su capacidad para sujetarse firmemente al tejido vivo. Ejemplos de vidrios bioactivos comercialmente disponibles y sus fabricantes incluyen Bioglass® (American Biomaterials Corp., EEUU, 45% de sílice, 24% de óxido de calcio (CaO), 24,5% de óxido de disodio (Na_{2}O), y 6% de pirofosfato (P_{2}O_{5})), Consil® (Xeipon Ltd., Reino Unido), NovaBone® (American Biomaterials Corp.), Biogran® (Orthovita, EEUU), PerioGlass® (Block Drug Co., EEUU), y Ceravital® (E.Pfeil & H. Bromer, Alemania). Corglaes® (Giltech Ltd., Ayr, Reino Unido) representa otra familia de vidrios bioactivos que contienen pirofosfato en lugar de dióxido de silicio como formador de red. Estos vidrios contienen 42-49% en moles de P_{2}O_{5}, siendo el resto 10-40% en moles como CaO y Na_{2}O.

El uso de estos materiales como se ha descrito anteriormente mezclados con la matriz de hidrogel reticulado estabilizada de la presente invención debería formar de manera esperada estructuras reticuladas moldeables adecuadas para la reparación y reconstrucción ósea como se ilustra esquemáticamente en la figura 6. Como se muestra, los ingredientes de una matriz de hidrogel bioactivo reticulado de la invención se mezclan en un recipiente y se dejan reaccionar (es decir, reticular) en presencia de polvo de material cerámico finamente dividido u otro material osteoinductivo, para formar una pasta que se puede verter como se muestra en la Etapa 1. La pasta se moldea en un molde con forma y se deja reaccionar y endurecer (Etapa 2). El producto final se retira del molde, y en este caso, se usa como espiga para la reparación de hueso (Etapa 3). Se espera que este dispositivo o implante induzca la vasculogénesis y por tanto una mejor integración del implante osteoinductivo. Presumiblemente, mejorar el suministro vascular en huesos largos (por ejemplo fémur) puede incrementar la formación de médula ósea y tener un efecto terapéutico más allá de la simple mejora en la densidad y salud del hueso. Se pueden usar geles sólidos y semisólidos de este tipo para heridas de tejido, incluyendo heridas por fragmentación de huesos o fracturas que no se curan.

El hidrogel reticulado estabilizado se puede usar como dispositivo para cicatrización de heridas para proteger heridas abiertas durante la cicatrización y también para estimular la cicatrización por administración del hidrogel reticulado a la herida. Las capacidades individuales de colágeno y gelatina juegan un papel útil en el campo de cubiertas para heridas y cicatrización de heridas y están bien documentadas. Se sabe que el colágeno tiene las siguientes funciones en la cicatrización de heridas: detención del sangrado, ayuda en el desbridamiento de heridas por atracción de monocitos; proporcionar una matriz para el crecimiento tisular y vascular; atracción de fibroblastos y ayuda en la migración dirigida de células; enlace con fibronectina que estimula la unión celular; soporta el crecimiento celular, la diferenciación, y la migración; y ayuda a la deposición de fibras orientadas y organizadas, lo que aumenta la integridad del tejido. De manera similar, la gelatina también realiza cicatrización de heridas y se sabe que estimula la activación de macrófagos y produce un elevado efecto hemostático. (Véanse, por ejemplo, Hovig T. y col., "Platelet Adherence to Fibrin and Collagen" Journal Lab and Clin. Med. 71(1):29-39 (1968); Postlewaithe, A.E. y col., "Chemotactic Attraction of Human Fibroblasts to Type I, II, and III Collagens and Collagen Derived Peptides" Proc. Natl. Acad. Science 177:64-65 (1978); Kleinman, H.K. y col., Role of Collagenous Matrices in the Adhesion and Growth of Cells" The Journal of Cell Biology 88:473-485 (1981); Dunn, G.A. y Ebendal, T., "Contact Guidance on Oriented Collagen Gels" Exp. Cell Res. 111:475-479 (1978); Kleinman, H.K. y col., Interactions of Fibronectin with Collagen Fibrils" Biochemistry 20:2325-2330 (1981); Morykwas, M.J. y col., "In vitro and In vivo Testing of a Collagen Sheet to Support Keratinocyte Growth for Use as a Burn Wound Covering" The Journal of Trauma 29(8):1163-1167 (1976); Emerman, J.T. y Pitelka, D.R., "Maintenance and Induction of Morphological Differentiation in Dissociated Mammary Epithelium on Floating Collagen Membranes" In vitro 13(5):316-337 (1977); Doillon, C.J. y col., "Fibroblast-Collagen Sponge Interactions and Spatial Disposition of Newly Synthesized Collagen Fibers in vitro and in vivo" Scanning Electron Microscopy 3:1313-1320 (1984); y Hong, S.R. y col., "Study on Gelatin-Containing Artificial Skin IV: A Comparative Study on the Effect of Antibiotic and EGF on Cell Proliferation During Epidermal Healing" Biomaterials 22: 2777-2783 (2001)).

Se cree que el hidrogel reticulado estabilizado de la presente invención es útil como dispositivo de cicatrización de heridas debido a la bioactividad intrínseca del material y a la estereoquímica única de las macromoléculas en presencia de aminoácidos polares potenciadores y reforzantes. Varios estudios indican que las propiedades del colágeno de cicatrización de heridas se pueden atribuir a su estructura única (véanse, Brass, L.F. y Bensusan, H., "The Role of Quaternary Structure in the Platelet-Collagen Interaction" The Journal of Clinical Investigation 54:1480-1487 (1974); Jaffe, R. y Dykin, D., "Evidence for a Structural Requirement for the Aggregation of Platelets by Collagen" Journal of Clinical Investigation 53:875-883 (1974); Postlewaithe, A.E. y Kang, A.H., "Collagen and Collagen Peptide Induced Chemotaxis of Human Blood Monocytes" The Journal of Experimental Medicine 143:1299-1307 (1976); y Reddi, A.H., "Collagen and Cell Differentiation" en: Biochemistry of Collagen, Nueva York; Plenum Press, 449-477 (1976)). De forma similar, el hidrogel de la presente invención demuestra una actividad única como dispositivo de cicatrización de heridas debido a la estructura única de la matriz de hidrogel, que proporciona un andamiaje para las células y atrae los componentes y factores que construyen tejido, necesarios para estimular la cicatrización de heridas. La rápida integración mecánica de los hidrogeles reticulados con el lecho de la heridas, las similares propiedades mecánicas del material, y su capacidad para actuar como andamiaje preferido para la adhesión celular en el lecho de la herida contribuyen al potencial uso de la matriz como dispositivo de cicatrización de heridas.

El hidrogel reticulado estabilizado se puede usar como adhesivo (es decir, como sellante de tejido) en la reparación de heridas. El uso de adhesivos en la reparación de heridas es conocido en la técnica, y aunque su uso sólo ha obtenido recientemente la aprobación de la FDA en los Estados unidos, los adhesivos para reparación de heridas se han usado extensamente en Canadá y Europa durante más de 20 años. Los adhesivos para heridas proporcionan una alternativa popular para el cierre de heridas respecto de los procedimientos convencionales tales como suturas, grapas, y tiras adhesivas, ya que ofrecen facilidad de uso, disminución de dolor, tiempo de aplicación reducido, y sin seguimiento para retirada. Históricamente, el primer adhesivo para heridas disponible, y el que se sigue usando más hoy en día, es un tipo de cianoacrilato, o supercola doméstica común. Los primeros adhesivos para heridas estaban compuestos por cianoacrilato de N-butilo, pero la forma preferida actual es el cianoacrilato de 2-octilo. El uso de adhesivos para heridas de cianoacrilato, sin embargo, tiene graves inconvenientes que limitan su uso, esto es, reacciones alérgicas, presencia de disolventes residuales, y migración de productos químicos a otras partes del cuerpo. Además, los adhesivos de cianoacrilato no se deberían usar en mujeres embarazadas o pacientes con historial de enfermedad vascular periférica, diabetes mellitus, o uso prolongado de corticosteroides, o en pacientes con heridas punzantes o mordeduras o heridas por arañazos (de origen animal o humano). Los adhesivos de cianoacrilato para heridas sólo se pueden usar en la superficie de la piel y en heridas de forma regular con superficies lisas que se pueden reunir fácilmente. Es necesario asegurar que nada del cianoacrilato toca la piel sana o se introduce en la herida ya que puede producir irritación grave y puede realmente actuar desequilibrando la formación de epitelio en el interior de la herida.

Existen alternativas novedosas a los adhesivos de cianoacrilato para heridas, pero muchas de las alternativas tienen inconvenientes adicionales que complican su amplio uso. Por ejemplo, se ha demostrado que adhesivos compuestos de gelatina, resorcinol, y formaldehído son útiles, pero los efectos tóxicos y carcinogénicos del formaldehído limitan su uso. Se han realizado investigaciones que apuntan a que secreciones de organismos marinos, como las que usan las lapas para sujetarse a los cascos de los barcos podrían ser adhesivos para heridas útiles, pero la ingeniería genética detallada usada para producir comercialmente el material se ha encontrado hasta la fecha de un coste prohibitivo. Las colas biológicas, como la cola de fibrina, o los agentes hemostáticos se usan con frecuencia en cirugía cardiaca o vascular para controlar el sangrado difuso. Un ejemplo de este tipo de sellante hemostático, FloSeal® (FloSeal Matrix Hemostatic Sealant; Fusion Medical Technologies, Fremont, CA), es una combinación de una matriz de gelatina y trombina reticulada, que convierte el fibrinógeno en monómeros de fibrina que polimerizan para formar un coágulo de fibrina. Ninguna de estas alternativas, sin embargo, ofrece una alternativa viable a los cianoacrilatos como adhesivo para heridas de fácil uso que pueda usarse en la práctica común.

La matriz de hidrogel reticulado estabilizada de la presente invención muestra propiedades que la hacen útil como adhesivo para heridas a la vez que evita muchos de los inconvenientes y contraindicaciones asociados con los cianoacrilatos. La capacidad del hidrogel para polimerizar in situ tiene el efecto de incrementar la adhesión célula-a-célula a la vez que acelera simultáneamente la vascularización y estimula la cicatrización de heridas. La biocompatibilidad del hidrogel permite su uso en un amplio espectro de heridas, incluyendo situaciones en las que no se pueden usar los cianoacrilatos, tal como heridas abiertas, heridas con bordes irregulares, y heridas alrededor de membranas mucosas. De hecho, el hidrogel de la presente invención es más efectivo cuando se introduce en el sitio de la herida en oposición al mero uso tópico. Cuando la mezcla de hidrogel nascente se coloca dentro de la herida, la polimerización in situ del hidrogel actúa para iniciar una cascada de interacciones biológicas que sellan la herida y facilitan el proceso de cicatrización. Los sitios de enlace activo en las macromoléculas de gelatina y dextrano, en presencia de los aminoácidos añadidos estabilizantes y potenciadores, no sólo reticulan entre sí, sino que también forman enlaces con las células nativas del interior de la herida formando de esta manera una matriz de hidrogel reticulada que actúa empujando las superficies de la herida hacia el eje central de la herida y mantiene los bordes de la herida unidos. Además de funcionar sujetando los bordes de la herida, el hidrogel actúa adicionalmente para formar una barrera insoluble al agua entre el sitio de la herida y los elementos exteriores y actúa como un andamiaje celular para estimular la regeneración de tejidos en el sitio.

Existen muchas formas de realización en las que el hidrogel puede empaquetarse y administrarse para uso como adhesivo para heridas. Por ejemplo, los componentes reactivos de poliglicano y polipéptido se pueden envasar en un aparato de doble cámara que mantiene los componentes separados durante el almacenamiento y permite que los componentes se expelan simultáneamente al interior de la herida donde puede tener lugar la reticulación. Otra forma de realización contemplada implica envasar los componentes en un aparato con membranas degradables que separen los componentes. Inmediatamente antes de usar, la agitación del aparato destruiría las membranas, permitiendo la mezcla de los componentes proporcionando una ventana de tiempo limitada para su aplicación a la herida, para que el reticulado se produjera in situ. Serán rápidamente evidentes para el experto en la técnica varias formas de realización adicionales para envasar y dosificar el hidrogel para uso como adhesivo para heridas.

La Tabla 1 siguiente lista los componentes preferidos presentes dentro de la matriz de hidrogel reticulado estabilizada de la presente invención junto con las concentraciones adecuadas así como las concentraciones preferidas de cada componente. Nótese que las concentraciones listadas en la Tabla 1 para gelatina y dextrano serían también adecuadas para componentes alternativos de poliglicano y polipéptido.

TABLA 1

1

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona numerosos beneficios incluyendo desencadenar la vascularización en un punto localizado, modular la respuesta localizada de cicatrización de heridas, y proporcionar medios adecuados de desarrollar un dispositivo recuperable de implantación celular para terapéutica basada en células. Otros beneficios pueden incluir los siguientes: reducir las escaras asociadas con la degradación de materiales de sutura bioerosionables; mejora en el rendimiento y función a largo plazo de sensores extravasculares tales como sensores de glucosa usados rutinariamente en sistemas de dosificación de insulina; mejora en la velocidad de cicatrización, durabilidad y propiedades mecánicas alrededor de implantes estructurales como articulaciones y tendones artificiales; reducción en el dolor y complicaciones asociadas que proceden de adhesiones posquirúrgicas especialmente en lesiones abdominales o espinales: e integración mejorada entre tejidos naturales y estructuras implantadas (es decir dientes, hidroxiapatito poroso o materiales para la reparación del hueso).

La matriz de hidrogel reticulada de la invención se puede reticular fuera del cuerpo y posteriormente implantarse en un paciente, o se puede dejar que la matriz de hidrogel reticule in situ. Aunque el hidrogel es estable a temperaturas corporales, el reticulado real de gelatina y dextrano se puede producir también a temperaturas corporales. Esta característica es particularmente útil a la vista de las capacidades anteriormente reseñadas del hidrogel reticulado a usar para la regeneración de tejidos, vasculogénesis, como agente de volumen, y otras aplicaciones que serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Los defectos de tejidos irregulares, como los habituales en heridas químicas, térmicas o traumáticas, que necesitan una cicatrización rápida, se beneficiarían también de la capacidad de formar in situ un hidrogel bioactivo que proporcione una andamiaje para adhesión celular para regeneración de tejidos. Un procedimiento a modo de ejemplo para administrar los componentes líquidos del hidrogel al emplazamiento deseado para la formación in situ implica usar una jeringa multicámara. La jeringa multicámara puede unirse a un catéter o aguja multilumen de forma que los componentes de alto peso molecular que forman el hidrogel reticulado no interactúan hasta la inyección dentro del emplazamiento en el interior del cuerpo dónde se necesita la matriz. Otro procedimiento contemplado implica el uso de la jeringa multicámara con un único lumen con un catéter o aguja de lumen único que contiene un elemento estático de mezcla en la que los componentes permanecen separados hasta inyección al emplazamiento, pero los componentes poliglicano y polipéptido realmente entran en contacto entre sí en el interior del lumen del catéter o aguja durante la inyección dentro del emplazamiento específico. Procedimientos adicionales de administración de los componentes de hidrogel para la formación in situ serán rápidamente evidentes para el experto en la técnica. Típicamente, en las formas de realización anteriormente descritas, un componente, como dextrano oxidado, se ubicaría en una cámara de la jeringa u el otro componente y agentes de ubicarían en una cámara separada.

Parte experimental

La presente invención se ilustra más completamente mediante los siguientes ejemplos, que se establecen para ilustrar la presente invención y no se consideran limitantes de la misma. A no ser que se indique otra cosa, todos los porcentajes se refieren a porcentajes en peso basados en el peso total de la matriz de hidrogel bioactivo.

Ejemplo 1

20 g de dextrano (PM 500.000 Da) se pesaron dentro de un matraz tarado que contenía 180 g de solución salina tamponada con fosfato. El dextrano se disolvió, con agitación constante y se añadieron 8 g de metaperyodato de sodio (comercializado por Sigma, número de producto S1147) al dextrano disuelto. El matraz se envolvió con una lámina para evitar reacciones secundarias fotocatalizadas, y se colocó en un refrigerador sobre una placa de agitación durante 12 horas a 5ºC \pm 3ºC. El matraz se retiró, se añadieron 50 ml de etilenglicol para consumir el exceso de peryodato, y se dejó continuar la reacción de terminación durante 30 minutos a temperatura ambiente. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 7,5 \pm 0,5 con NaOH 0,1 N. Los productos de reacción se separaron usando filtración en flujo tangencial (Filtron Mini-Ultrasette Pall Filtration Products, número de producto OS100C77). La masa de solución se redujo a la mitad y se sustituyó con 4 veces el volumen de solución salina tamponada con fosfato. El producto purificado se redujo hasta un volumen final de 100 ml. El producto final se esterilizó por filtración como solución en dextrano al 20% y se almacenó congelada hasta uso. La valoración con hidroxilamina mostró que este dextrano estaba oxidado en un 20%.

Un vial de un matriz de hidrogel termoreversible comprendiendo gelatina y dextrano y un vial de dextrano oxidado esterilizado por filtración se mantuvieron a 39ºC durante 30 minutos para fundir el hidrogel y calentar el dextrano oxidado. Una alícuota de 10 ml de hidrogel se añadió a un tubo de centrífuga de 50 ml, y se mezclaron rápidamente con 5 ml de dextrano oxidado. La solución se moldeó en una placa de cultivo de 100 mm, y se hizo girar suavemente para formar una película uniforme en el fondo de la placa.

El gel reactivo se dejó reticular a temperatura ambiente. El gel se lavó con Medium 199, a 37ºC inundando la superficie del gel con rojo de fenol que contenía Medium 199. La parte superior de Medium 199 se sustituyó según necesidad para mantener un pH neutro.

Se usó una punta de biopsia de tejido para producir discos de 8 mm de gel reticulado. Los discos individuales se ubicaron en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía 10 ml de Medium 199 y se incubaron a 37ºC durante 2 semanas. Los geles reticulados fueron insolubles a 37ºC y retuvieron su forma original.

Ejemplo 2

20 g de dextrano (PM 500.000 Da) (comercializado por Sigma, St. Louis, MO) se añadieron a un matraz tarado que contenía 200 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agitó para formar una solución uniforme. Se añadieron otros 8 g de metaperyodato de sodio a la solución de dextrano, que se envolvió con una lámina, y se dejó agitar toda la noche a 5ºC \pm 3ºC. La reacción se detuvo con 50 ml de etilenglicol, y la solución se ajustó con NaOH 0,1 M hasta un pH de 7,5 \pm 0,5. El producto se purificó usando filtración tangencial, y se concentró hasta una solución de dextrano al 20%. Las soluciones esterilizadas por filtración se congelaron hasta uso. La valoración con hidroxilamina mostró que este dextrano estaba oxidado en un 18%. Las muestras congeladas no mostraron pérdidas en los niveles de oxidación tras 8 meses de almacenamiento a 20ºC \pm 5ºC.

Se prepararon una serie de formulaciones de hidrogel termoreversible y dextrano oxidado con una concentración fija total de gelatina (12%) y concentración creciente de dextrano oxidado. Como se ilustra en la figura 7, la gelificación de los geles moldeados aumenta a medida que aumenta la concentración de dextrano oxidado. Mezclas de concentraciones fijas de gelatina y concentraciones variables de dextrano oxidado se ensayaron respecto su resistencia a la compresión a dos temperaturas, 20ºC y 28ºC. La gelificación aumentó con el aumento del contenido de dextrano oxidado y con la disminución de la temperatura.

Ejemplo 3

Se añadieron 20 g de dextrano (PM 68.000 Da) (comercializado por Sigma, St. Louis, MO) a un matraz tarado que contenía 200 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agitó para formar una solución uniforme. Se añadieron otros 8 g de metaperyodato de sodio a la solución de dextrano, que se envolvió con una lámina, y se dejó agitar toda la noche a 5ºC \pm 3ºC. La reacción se detuvo con 50 ml de etilenglicol, y la solución se ajustó con NaOH 0,1 M hasta un pH de 7,5 \pm 0,5. El producto se purificó usando filtración tangencial, y se concentró hasta una solución de dextrano al 20%. Las soluciones esterilizadas por filtración se congelaron hasta uso. La valoración con hidroxilamina mostró que este dextrano estaba oxidado en un 14%.

Un hidrogel termoreversible comprendiendo gelatina y dextrano se fundió y añadió a varios conjuntos de muestras de dextranos nativos y oxidados, se mezclaron y moldearon en un frasco de cultivo T-25. La concentración de dextrano oxidado en cada muestra estaba comprendida entre aproximadamente 3% y aproximadamente 21%.

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Los geles moldeados se dejaron endurecer a 5ºC, \pm 3ºC, toda la noche, y se lavaron extensamente a 37ºC con rojo de fenol que contenía Medium 199 (comercializado por Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) hasta que no hubo más cambios en el pH evidenciados colorimétricamente. El material se lavó extensamente durante cuatro días con medio de cultivo para neutralizar los componentes ácidos residuales.

Los frascos que contenían dextrano oxidado al 12% se usaron para posteriores estudios de cultivo celular. Se proporcionaron fibroblastos normales de neonato humano en 6 ml de medio de cultivo que contenía suero y se dejaron interactuar con el material durante dos semanas más a 37ºC. Tras 24 horas, aparentemente las células mantenían una salud normal, mostraban adhesión al material mediante procesos citoplasmáticos, y también mostraron formación de clústeres multicelulares. Cuando se observaron 5 días después, un frasco mostró agregados celulares grandes que se habían formado en el cultivo, así como células estrelladas en las capas inferiores del cultivo dónde los agregados celulares grandes estaban unidos al material de hidrogel reticulado. Durante la semana siguiente, estos agregados continuaron creciendo en tamaño y contenían células sanas. Se tomaron imágenes de los cultivos en ese momento, y las figuras resultantes mostraron la apariencia de los agregados celulares por encima de la superficie del material con procesos alargados y células individuales conectadas a la estructura del sustrato de hidrogel.

Tras aproximadamente un mes de exposición al material reticulado, las células se disociaron con éxito de los frascos que contenían hidrogel y se resembraron en superficies plásticas convencionales para cultivo de tejido, sobre las que se observó que crecían fácilmente mostrando un morfología similar a la de los fibroblastos normalmente cultivados.

Ejemplo 4

Se preparó un hidrogel reticulado de acuerdo con el Ejemplo 1 anterior, en el que el hidrogel estaba constituido por gelatina al 12% y dextrano oxidado (PM 500.000 Da) al 5%. Tras la fabricación, 5 ml del hidrogel reticulado se dispensaron a un frasco T-25, al cual se añadieron 5 ml de medio de cultivo (IMDM que contenía FBS al 10%). El hidrogel reticulado resultó sólido a la temperatura de la incubadora (37ºC). A las 4 horas de la adición, el medio añadido había experimentado un cambio de color desde rojo a amarillo claro, indicando un cambio en la solución hacia pH ácido. Los 5 ml iniciales de medio de cultivo se retiraron y se añadió una segunda cantidad de 5 ml para probar la capacidad tampón del medio. Tres días después, se observó el mismo cambio de color. El medio de cultivo se volvió a retirar, y se sustituyó con 5 ml más de medio de cultivo. Un día después, hubo un mínimo cambio de color indicando la neutralización de lixiviados ácidos desde el material. El mismo día, una población de fibroblastos de piel humana (número de producto CCD-1112Sk, American Type Culture Collection) se disoció y preparó para siembra en el frasco. Las células se sembraron en medio fresco a una dilución 1:6 en un volumen total de 6 ml, y los frascos se devolvieron a la incubadora. Tras una hora, las células estaban extendiendo pseudópodos para conectar con el hidrogel reticulado, pero aún no estaban bien adheridos. Tras aproximadamente 4 horas más de incubación adicional, no se observó adhesión adicional. Tras un día más, aproximadamente el 20% de las células parecían formar estructuras tipo agregado, los agregados comprendidos en un intervalo de tamaños desde aproximadamente 2 a aproximadamente 10 células y extendiéndose los procesos de adhesión desde las células. El medio de cultivo existente se eliminó por vertido a otro frasco T25 y se añadieron 3 ml de medio de cultivo fresco al cultivo.

El día siguiente, se examinaron las células originales y replaqueadas. Ambas poblaciones celulares aparecieron redondas e insanas, y las células trasplantadas no se habían adherido a la superficie del frasco nuevo.

Cinco días después (nueve días desde el inicio del experimento), se examinó un tercer frasco, que contenía fibroblastos de piel humana, hidrogel reticulado, y medio de cultivo, que se había cultivado sin perturbación. Esta muestra mostró agregados grandes. Cuando se comprobó de nuevo el día siguiente, los clústeres de agregados celulares habían crecido en tamaño y se parecían a estructuras embrionarias. El examen seis días después reveló grandes estructuras multicelulares en la parte superior del hidrogel reticulado con algunas células aparentemente creciendo en algunos puntos del hidrogel.

Ejemplo 5

Se añadieron 1,5 ml de una solución de disulfuro de Bis-[\beta-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro (BASED),
0,5 mg/ml, un agente reticulante, en dimetil sulfóxido (DMSO), a un recipiente envuelto con una lámina que contenía 15 ml de hidrogel líquido termoreversible que contenía gelatina y dextrano. Se produjo reticulación fotoactivada inespecífica del hidrogel termoreversible tras exposición de la mezcla reactiva a luz de longitud de onda larga, como la que proporciona la exposición continua a una bombilla de 550 W (foco usado en fotografía). Exposiciones más largas mostraron mejor reticulación.

A un experto en la técnica a la que pertenece esta invención se le ocurrirán muchas modificaciones y otras formas de realización con el beneficio de las enseñanzas presentadas en las anteriores descripciones y dibujos asociados. Por tanto, se debe entender que la invención no se va a limitar a las formas de realización específicas desveladas en el presente documento y que se pretende que estas modificaciones y otras formas de realización queden incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean términos específicos en el presente documento, se usan de forma genérica y descriptiva únicamente, y no con efectos de limitación.

Claims

1. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado, matriz que comprende un poliglicano, un polipéptido reticulado covalentemente con el poliglicano, y al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos polares, quelantes catiónicos divalentes, y sus combinaciones.

2. La matriz de la reivindicación 1, en la que el poliglicano es un polisacárido o un polisacárido sulfatado.

3. La matriz de la reivindicación 2, en la que el poliglicano es un polisacárido que comprende más de 10 restos de monosacárido unidos entre sí por enlaces glicosídicos.

4. La matriz de la reivindicación 2, en la que el polisacárido se selecciona entre el grupo constituido por glicosaminoglicanos y glucosaminoglicanos.

5. La matriz de la reivindicación 2, en la que el polisacárido se selecciona entre el grupo constituido por dextrano, heparán, heparina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, caragenano, amilopectina, amilosa, glicógeno, almidón, celulosa, quitina y quitosán.

6. La matriz de la reivindicación 2, en la que el polisacárido sulfatado se selecciona entre el grupo constituido por sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, sulfato de dermatán, y sulfato de keratán.

7. La matriz de la reivindicación 1, en la que el poliglicano tiene a peso molecular de 2.000 a 8.000.000 Da.

8. La matriz de la reivindicación 1, en la que el poliglicano tiene a peso molecular de 20.000 a 1.000.000 Da.

9. La matriz de la reivindicación 1, en la que el polipéptido es un polipéptido derivado de tejido o sintético.

10. La matriz de la reivindicación 9, en la que el polipéptido es un polipéptido derivado de tejido derivado de tejido seleccionado entre el grupo constituido por colágenos, gelatinas, queratina, decorina, agrecano, y glicoproteínas.

11. La matriz de la reivindicación 9, en la que el polipéptido es un polipéptido derivado de tejido derivado de extractos de tejido seleccionado del grupo constituido por tejidos submucosales, arterias, cuerdas vocales, pleura, tráquea, bronquios, tabique de alvéolos pulmonares, ligamentos, cartílago auricular, fascia abdominal, hígado, riñón, neurilema, aracnoides, dura mater, y pia mater.

12. La matriz de la reivindicación 9, en la que el polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por laminina, nidógeno, fibulina,

13. La matriz de la reivindicación 1, en la que el polipéptido tiene un peso molecular de 3.000 a 3.000.000 Da.

14. La matriz de la reivindicación 1, en la que el polipéptido tiene un peso molecular de 30.000 a 300.000 Da.

15. La matriz de la reivindicación 1, en la que el poliglicano es dextrano y el polipéptido es gelatina.

16. La matriz de la reivindicación 15, en la que el dextrano está presente a una concentración de 0,01 a 10 mM.

17. La matriz de la reivindicación 15, en la que la gelatina está presente a una concentración de 0,01 a 40 mM.

18. La matriz de la reivindicación 1, en la que el al menos un agente comprende al menos un aminoácido polar seleccionado entre el grupo constituido por tirosina, cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, histidina, y sus mezclas.

19. La matriz de la reivindicación 18, en la que los aminoácidos polares están presentes a una concentración de 3 a 150 mM.

20. La matriz de la reivindicación 18, en la que los aminoácidos polares están presentes a una concentración de 10 a 65 mM.

21. La matriz de la reivindicación 18, en la que los aminoácidos polares se seleccionan entre el grupo constituido por L-cisteína, ácido L-glutámico, L-lisina, L-arginina, y sus mezclas.

22. La matriz de la reivindicación 18, en la que el matriz comprende ácido L-glutámico a una concentración de 2 a 60 mM.

23. La matriz de la reivindicación 18, en la que el matriz comprende L-lisina a una concentración de 0,5 a 30 mM.

24. La matriz de la reivindicación 18, en la que el matriz comprende L-arginina a una concentración de 1 a 40 mM.

25. La matriz de la reivindicación 18, en la que el matriz comprende L-cisteína a una concentración de 5 a 500 \mum.

26. La matriz de la reivindicación 1, en la que el al menos un agente comprende ácido etilendiaminatetraacético o una de sus sales.

27. La matriz de la reivindicación 26, en la que el ácido etilendiaminatetraacético o una de sus sales está presente a una concentración de 0,01 a 10 mM.

28. La matriz de la reivindicación 1, en la que la matriz reticulada es estable a pH fisiológico.

29. La matriz de la reivindicación 1, en la que la matriz es estable a temperatura fisiológica.

30. La matriz de la reivindicación 1, en la que el poliglicano es dextrano, el polipéptido es gelatina, y el al menos un agente comprende uno o más aminoácidos polares.

31. La matriz de la reivindicación 30, en la que los aminoácidos polares se seleccionan entre el grupo constituido por L-cisteína, ácido L-glutámico, L-lisina, L-arginina, y sus mezclas.

32. La matriz de la reivindicación 30, en la que el al menos un agente comprende además ácido etilendiaminatetraacético o una de sus sales.

33. La matriz de la reivindicación 1, en la que la matriz de hidrogel comprende además células de tejido.

34. La matriz de la reivindicación 33, en la que las células de tejido se seleccionan entre el grupo constituido por células madre, células óseas, tenocitos, adipocitos, cardiomiocitos, hepatocitos, células del músculo liso y células endoteliales.

35. Un procedimiento para preparar una matriz de hidrogel bioactivo reticulado, que comprende:

proporcionar una mezcla de un poliglicano, un polipéptido, y al menos un agente seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos polares, quelantes catiónicos divalentes, y sus combinaciones; y

hacer reaccionar el poliglicano con el polipéptido en condiciones suficientes para reticular covalentemente el poliglicano con el polipéptido.

36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano es un polisacárido o un polisacárido sulfatado.

37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que el poliglicano es una polisacárido sulfatado seleccionado entre el grupo constituido por sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, sulfato de dermatán, y sulfato de keratán.

38. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano es un polisacárido que comprende más de 10 restos de monosacárido unidos entre sí por enlaces glicosídicos.

39. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que el polisacárido se selecciona entre el grupo constituido por glicosaminoglicanos y glucosaminoglicanos.

40. El procedimiento de la reivindicación 36. en el que el polisacárido se selecciona entre el grupo constituido por dextrano, heparán, heparina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, caragenano, amilopectina, amilosa, glicógeno, almidón, celulosa, y quitina.

41. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano tiene un peso molecular de 2.000 a 8.000.000 Da.

42. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano tiene a peso molecular de 20.000 a 1.000.000 Da.

43. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el polipéptido es un polipéptido derivado de tejido.

44. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que el polipéptido derivado de tejido polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por colágenos, gelatinas, queratina, decorina, agrecano, y glicoproteínas.

45. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que el polipéptido se deriva de extractos de tejido procedentes de tejido seleccionado entre el grupo constituido por tejidos submucosales, arterias, cuerdas vocales, pleura, tráquea, bronquios, tabique de alvéolos pulmonares, ligamentos, cartílago auricular, abdominal fascia, hígado, riñón, neurilema, aracnoides, dura mater, y pia mater.

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46. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que el polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por laminina, nidógeno, fibulina, y fibrillina.

47. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el polipéptidos tiene un peso molecular de 3.000 a 3.000.000 Da.

48. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el polipéptido tiene un peso molecular de 30.000 a 300.000 Da.

49. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano es dextrano y el polipéptido es gelatina.

50. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el al menos un agente comprende al menos un aminoácido polar seleccionado entre el grupo constituido por tirosina, cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, histidina, y sus mezclas.

51. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el al menos un agente comprende ácido etilendiaminatetraacético o una de sus sales.

52. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el poliglicano es dextrano, el polipéptido es gelatina, y el al menos un agente comprende uno o más aminoácidos polares.

53. El procedimiento de la reivindicación 52, en la que los aminoácidos polares se seleccionan entre el grupo constituido por L-cisteína, ácido L-glutámico, L-lisina, L-arginina, y sus mezclas.

54. El procedimiento de la reivindicación 52, en el que el al menos un agente comprende además ácido etilendiaminatetraacético o una de sus sales.

55. El procedimiento de la reivindicación 35, que comprende además, antes de dicha etapa de reacción, modificar químicamente al menos uno del poliglicano y el polipéptido para formar emplazamientos reactivos en el mismo capaces de participar en el enlace covalente.

56. El procedimiento de la reivindicación 55, en el que dicha etapa modificadora comprende oxidar al menos uno del poliglicano y el polipéptido.

57. El procedimiento de la reivindicación 56, en el que dicha etapa modificadora comprende tratar al menos uno del poliglicano y el polipéptido con una sal de ácido peryódico.

58. El procedimiento de la reivindicación 55, en el que el poliglicano es dextrano y dicha etapa modificadora comprende oxidar el dextrano para formar emplazamientos reactivos en el mismo.

59. El procedimiento de la reivindicación 58, en el que los emplazamientos reactivos son grupos aldehído o cetona.

60. El procedimiento de la reivindicación 35, el que dicha etapa de reacción comprende hacer reaccionar el poliglicano y el polipéptido en presencia de al menos un reticulante bifuncional.

61. El procedimiento de la reivindicación 60, en la que el reticulante se selecciona entre el grupo constituido por glutaraldehído, epóxidos, dextrano oxidado, p-azidobenzoil hidracida, éster de N-[\alpha-maleimidoacetoxi]succinimida, p-azidofenil glioxal monohidrato, disulfuro de bis-[\beta-(4-azidosalicilamido)etil], bis-[sulfosuccinimidil]suberato, ditiobis[succinimidil] propionato, suberato de disuccinimidilo, y clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida.

62. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para uso en terapia.

63. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para uso en la estimulación de la regeneración de tejidos en mamíferos por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la matriz de hidrogel a un emplazamiento especificado identificado como necesitado de regeneración de tejidos.

64. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado para uso de acuerdo con la reivindicación 63 en la que la matriz de hidrogel se administra a un término vascular y se ubica de forma que la matriz se extiende lateralmente desde el término vascular.

65. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para uso en añadir volumen a un tejido por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la matriz de hidrogel a un emplazamiento especificado identificado como necesitado más volumen.

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66. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado para uso de acuerdo con la reivindicación 63 o la reivindicación 65 en la que el matriz de hidrogel se reticula antes de la administración.

67. Una matriz de hidrogel bioactivo reticulado para uso de acuerdo con la reivindicación 63 o la reivindicación 65 en la que el matriz de hidrogel se reticula in situ.

68. Un procedimiento para preparar un implante óseo que comprende las etapas de:

proporcionar una cantidad de un material osteoconductivo u osteoinductivo;

proporcionar una matriz de hidrogel bioactivo reticulado de acuerdo con la reivindicación1;

combinar el material osteoconductivo u osteoinductivo con la matriz de hidrogel reticulada para formar una pasta de material compuesto moldeable; moldear la pasta en un molde conformado; dejar endurecer la pasta en el molde conformado; y

retirar la pasta moldeada del molde conformado.

69. El procedimiento de la reivindicación 68, en la que el material osteoconductivo u osteoinductivo se selecciona entre el grupo constituido por aluminato de calcio, hidroxiapatito, alúmina, zirconia, silicatos de aluminio, fosfato de calcio, vidrio bioactivo, materiales cerámicos, colágeno, hueso autólogo, hueso alogénico, hueso xenogénico, materiales coralinos, y sus derivados o combinaciones.