ES2256028T3 - Deteccion e identificacion de cepas bacterianas. - Google Patents

Deteccion e identificacion de cepas bacterianas.

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ES2256028T3 ES00954386T ES00954386T ES2256028T3 ES 2256028 T3 ES2256028 T3 ES 2256028T3 ES 00954386 T ES00954386 T ES 00954386T ES 00954386 T ES00954386 T ES 00954386T ES 2256028 T3 ES2256028 T3 ES 2256028T3
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Abstract

Procedimiento para la detección de bacterias, que comprende las siguientes etapas: a) acoplamiento de bacteriófagos y/o de proteínas de bacteriófagos mediante unión directa a un portador o mediante unión directa de los bacteriófagos y/o de las proteínas de bacteriófagos a un polipéptido inmovilizado en un portador, b) incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o con las proteínas de bacteriófagos con una muestra, c) dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, d) dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias, y e) detección de las bacterias de la muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.

Description

Detección e identificación de cepas bacterianas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de bacterias, que comprende las siguientes etapas: acoplamiento de bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos a un portador, incubación del portador acoplado con bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos con una muestra, dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias, y detección de las bacterias de la muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, no sometiendo las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
La detección rápida y exacta de bacterias es la primera etapa necesaria para el diagnóstico y el tratamiento de una infección bacteriana en el ser humano y en animales, así como para tomar medidas preventivas. Además, la detección sirve para el control de la higiene y de la calidad de materias primas y alimentos elaborados, así como para el control de la higiene y de la calidad de agua potable y agua de uso industrial y de la calidad del agua de balnearios públicos. Además, la detección sirve para la monitorización y la optimización de procesos, así como para el control de calidad en el análisis del medio ambiente. En contraste con la mayoría de los procedimientos usados hasta ahora, el procedimiento aquí descrito también posibilita una detección sencilla del objeto que se ha de examinar en el lugar donde se encuentra.
La detección de bacterias en muestras biológicas, la mayoría de las veces, se efectúa con la ayuda de una combinación de procedimientos de cultivo, con el seguimiento de actividades metabólicas. En una tipificación de cepas bacterianas de una especie de bacterias mediante fagos, se acoplan procedimientos de cultivo con la sensibilidad de bacterias con bacteriófagos de tipificación. En una placa de agar de la muestra que se ha de examinar, se superpone una suspensión de bacteriófagos en agar blando a una densa población de bacterias, que se ha obtenido por aislamiento de una colonia individual y por multiplicación subsiguiente de la misma. El resultado se obtiene por el recuento de las placas y el control de la morfología de las placas, después de una incubación durante la noche, a la temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias, que usualmente asciende en la mayoría de las veces a 37ºC. Una variante de la tipificación prevé la medición de la adenilatoquinasa, después de la lisis celular mediada por los fagos. Para esto, se diluye con un tampón un cultivo de una noche de las bacterias que se han de analizar, se mezcla con fagos y se mide la lisis por fagos específicos, mediante la actividad de la adenilatoquinasa.
En todos los procedimientos descritos hasta ahora, se espera la lisis antes de efectuar la detección, o se efectúa la detección mediante la lisis. De esta manera, pueden seguirse fuentes de agentes infecciosos y pueden descubrirse fuentes de infección. Esta tipificación está establecida desde hace años para una serie de bacterias, como Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, así como un gran número de otras bacterias. Sin embargo, estos procedimientos de detección establecidos sólo proveen los resultados por lo general después de varios días. Por cierto, justamente la determinación rápida y exacta de la especie de bacterias (tipificación) muchas veces es de gran importancia para una reacción rápida.
El documento WO93/17129 describe un procedimiento para la detección de determinadas bacterias en una muestra, en el que se detectan las bacterias mediante un bacteriófago que es capaz de unirse a la bacteria, y al que está fijado un asociado de unión de un par de unión de dos partes. El segundo asociado de unión del par de unión de dos partes está unido a un portador sólido, insoluble en agua, que puede suspenderse en agua. Las bacterias, si están presentes en la muestra, son unidas por los bacteriófagos, que entonces, a través de los asociados de unión, se unen al portador sólido.
Últimamente, también se usan procedimientos de detección más rápidos de biología molecular, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa, que, sin embargo, tienen la desventaja de ser más susceptibles a la contaminación. También con estos procedimientos, el resultado usualmente sólo está a disposición después de un día.
Además, para una identificación del género de bacterias, en algunos casos es necesario enviar muestras a laboratorios de referencia altamente especializados, lo que igualmente representa un factor que consume tiempo y costes.
Por ello, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento rápido y económico para detectar bacterias que, por un lado, pueda llevarse a cabo en el laboratorio por personas con conocimientos microbiológicos especiales, y, por el otro lado, pueda llevarse a cabo en una forma simplificada en el mismo lugar en que se encuentra la muestra, y sin conocimientos previos correspondientes.
Se alcanza el objetivo mediante el objeto definido en las reivindicaciones.
Por ello, un aspecto de la presente invención es un sistema de detección rápido y exacto para bacterias, que provee información acerca de la especie de bacterias, acerca de la cepa de bacterias y, dado el caso, permite una cuantificación de las bacterias, y consiste en el reconocimiento de estas bacterias mediante bacteriófagos o proteínas de bacteriófagos.
Los procedimientos usuales de detección de bacterias basados en bacteriófagos contienen etapas de cultivo que consumen mucho tiempo, y la lisis celular mediada por bacteriófagos. Aunque el procedimiento conforme a la invención aprovecha igualmente el reconocimiento específico de células mediante bacteriófagos, en contraste con los procedimientos descritos hasta ahora, a continuación de la etapa de reconocimiento celular específico, después de la separación de bacterias unidas de forma inespecífica, se efectúa directamente un ensayo correspondiente de unión, por ejemplo, una medición de una modificación de señal espectroscópica (por ejemplo, por absorción, fluorescencia, bioluminiscencia o quimioluminiscencia, o dicroísmo circular) o eléctrica (por ejemplo, por medición de capacidad o modificación de la conductividad eléctrica). De esta manera, ya se posibilita una detección de las bacterias después de pocos minutos, en lugar de después de horas o incluso, de días. Por un acoplamiento selectivo, especialmente, una fijación covalente de bacteriófagos a estructuras portadoras apropiadas, por ejemplo, a placas de microtitulación, tiras de ensayo, portaobjetos, obleas, materiales filtrantes o cámaras celulares de flujo, se favorece la etapa de procedimiento del ensayo de unión mediante la reducción del fondo no específico y se posibilita una amplia aplicación para todas las bacterias. Las estructuras portadoras pueden estar constituidas, por ejemplo, por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio. Además, el uso del procedimiento conforme a la invención también posibilita el uso de bacteriófagos lisogénicos para la detección de bacterias.
Por ello, un aspecto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para la detección de bacterias que comprende las siguientes etapas: acoplamiento de bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos a un portador, incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos con una muestra, dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana bacteriana, y detección de las bacterias de la muestra, unidas a los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
Se prefiere un procedimiento en el que la detección se efectúa mediante una detección colorimétrica de componentes celulares y/o de productos de la reproducción de fagos, mediante una detección de ADN y/o de ARN, o mediante una detección inmunológica. Además, se prefiere un procedimiento en el que los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos están acoplados a los portadores mediante adsorción o mediante un enlace químico. Además, se prefiere un procedimiento en el que los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos presentan modificaciones. Además, se prefiere un procedimiento en el que se usan al menos dos bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos distintos, que reconocen al menos dos especies y/o géneros distintos de bacterias. Además, se prefiere un procedimiento en el que el portador es, por ejemplo, una placa de microtitulación, tiras de ensayo, portaobjetos, obleas, material filtrante o una cámara celular de flujo y, por ejemplo, está constituido por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio u oblea de silicio.
Para la detección, se usan bacteriófagos que son específicos para las bacterias deseadas que se han de detectar. Los fagos no necesitan ser específicos para una especie de bacterias, sino que también pueden ser específicos para varias especies de bacterias o para un género de bacterias. Qué fagos se usan para la detección depende de cuáles sean las bacterias que se han de detectar. Además, también pueden usarse dos o más fagos en un procedimiento de detección, para detectar simultáneamente varias especies de bacterias o para tipificar exactamente un género de bacterias. Los bacteriófagos usados pueden ser bacteriófagos que pueden obtenerse comercialmente, de colecciones de cepas como, por ejemplo, DSM o ATCC, o ser bacteriófagos aislados expresamente para este fin. Pueden usarse tanto bacteriófagos líticos como lisogénicos, prefiriéndose fagos líticos. Las propiedades morfológicas no limitan la selección de fagos, sin embargo, se prefieren Myoviridae (fagos similares a T4), Siphoviridae (fagos similares a \lambda) o Podoviridae (fagos similares a T7, P22).
Los fagos se unen a los receptores correspondientes de las bacterias. Aquí se produce una interacción proteína-proteína o proteína-hidrato de carbono o proteína-lípido. Después de reconocer con alta especificidad a su hospedador, el fago inyecta su información genética (ADN o ARN mono- o bicatenario) en la célula, y se encuentra en forma lisógena o, en el caso de la lisis, produce nuevas partículas de fago. Con la inyección del ácido nucleico del fago, se fija la unión de las bacterias a los fagos, en la mayoría de los casos, de forma irreversible. Después de finalizada la etapa de reconocimiento, en el procedimiento conforme a la invención se efectúa la detección de las bacterias. Este procedimiento, en principio, puede usarse para todas las bacterias para las que están descritos fagos o puedan aislarse estos. Las bacterias preferidas son aquéllas que son relevantes para la industria de los alimentos, en la medicina o en el análisis del medio ambiente como, por ejemplo, bacterias lácticas, por ejemplo, Leuconostoc, Pseudomonas y enterobacterias, por ejemplo, E. coli, Salmonella. La etapa de reconocimiento puede llevarse a cabo a cualquier temperatura en el intervalo de 0º a 90ºC, preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 4º a 45ºC, muy preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 15 a 37ºC, de forma especialmente preferente, a una temperatura en el intervalo de 20 a 37ºC, especialmente, a temperatura ambiente.
Además, es posible aislar y usar para la detección, en lugar de fagos completos, proteínas individuales de fagos, por ejemplo, receptores o adhesinas de fagos, o partes de estas adhesinas, por ejemplo, p12 de T4 o espoina de cola p9 de P22, o variantes de estas proteínas. Se prefieren a este respecto adhesinas que se unan de forma irreversible con bacterias, o cuya bolsa de unión a las bacterias fuera modificada correspondientemente por ingeniería genética o en químicamente para lograr una unión irreversible. Un ejemplo de proteínas de fago modificadas por ingeniería genética son las "mutantes de sitio activo" de la espina de cola de P22 (véase Baxa y col., Biophys. J. Vol. 71, 2040-2048: 1996). Las proteínas de fagos pueden usarse igual que los bacteriófagos para el procedimiento conforme a la invención.
Los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos usados para el procedimiento conforme a la invención pueden adaptarse a las estructuras del portador mediante una mutagénesis selectiva o aleatoria (al azar) de su especificidad de hospedador o de sus propiedades de unión. Mediante mutagénesis, se introducen mutaciones que pueden ser adiciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. Estas mutaciones generan una modificación de la secuencia de aminoácidos en la región de unión de los fagos o de las proteínas de fagos, con la meta de adecuar la especificidad y la afinidad de unión a las necesidades del ensayo, por ejemplo, hacer irreversible la unión de las bacterias a las proteínas de fagos aisladas, para mejorar las posibilidades de lavado. Además, puede realizarse una modificación de las proteínas de fagos mediante ingeniería genética o bioquímica con la meta de suprimir la actividad enzimática, presente dado el caso, para mejorar de este modo la unión o volverla irreversible.
Para la detección conforme a la invención, se inmovilizan los fagos o las proteínas de fagos sobre estructuras portadoras apropiadas, por ejemplo, placas de microtitulación, tiras de ensayo, portaobjetos, obleas, materiales filtrantes o cámaras celulares de flujo. Las estructuras portadoras, por ejemplo, pueden estar constituidas por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio. La inmovilización puede lograrse mediante adsorción o unión covalente, prefiriéndose la unión covalente. Aquí es importante una inmovilización funcional, es decir, que los fagos o las proteínas de fagos, a pesar de la unión al material portador, dispongan de estructuras accesibles para las bacterias.
Para reprimir una reacción inespecífica de las bacterias que se han de examinar con el material portador, puede efectuarse un bloqueo con seroalbúmina bovina o Tween 20, o sustancias similares, usadas en el ámbito de ELISA, por ejemplo, leche en polvo. Además, para aumentar la eficiencia de la adsorción, los sistemas portadores pueden recubrirse previamente con proteínas apropiadas (por ejemplo, anticuerpos específicos contra proteínas de fagos o proteínas inespecíficas como, por ejemplo, seroalbúmina bovina), péptidos, sacáridos (por ejemplo, monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos), o detergentes (por ejemplo, Tween 20 u octilglucósido). Estos recubrimientos pueden efectuarse, o bien, durante una noche, a una temperatura en el intervalo de 4-20ºC, o bien durante 2 a 4 h a 30-65ºC. A continuación, se retira el exceso de líquido y se seca la estructura portadora a aproximadamente 60-70ºC. El recubrimiento básico, por un lado, debe garantizar una adsorción de fagos o proteínas de fagos funcionales y, por el otro lado, deben impedir una adsorción inespecífica de las bacterias de ensayo a la estructura portadora, para aumentar la eficiencia del ensayo.
A continuación del recubrimiento básico, se aplican los fagos o las proteínas de fagos. Para ello, se aplica una disolución acuosa tamponada de los fagos o de las proteínas de fagos sobre la estructura portadora previamente tratada. Después de una adsorción a 4-20ºC durante una noche, o a 30-65ºC durante 2 a 4 h, se retira la disolución de recubrimiento y se seca la estructura portadora como está descrito anteriormente. Para un aumento de la eficiencia de recubrimiento, posteriormente puede llevarse a cabo una fijación covalente de los fagos o de las proteínas de fagos con reticulantes químicos como, por ejemplo, glutaraldehído.
Para mejorar la inmovilización funcional en los fagos usados, por ejemplo, Myoviridae, Siphoviridae y Podoviridae, puede usarse una preparación de presentación en fagos (véase Gene, 1998, 215, 439-444), en la que se expresan péptidos en las proteínas de la cabeza de fagos o de cápsidas que disponen de propiedades de unión definidas para determinados sistemas portadores.
La inmovilización de los fagos y de las proteínas de fagos sobre el material portador mediante adsorción puede llevarse a cabo mediante la incubación de una disolución de fagos en tampón acuoso, por ejemplo, Tris 100 mM, pH 7,3 o fosfato de sodio 100 mM, pH 7,5, durante varias horas o durante a noche, a 5ºC hasta 45ºC, preferentemente, a 15ºC hasta 37ºC, muy preferentemente, a 20ºC hasta 37ºC, de especial preferencia, a temperatura ambiente.
Además, los fagos o las proteínas de fagos no necesitan inmovilizarse directamente sobre el portador, sino pueden unirse a polipéptidos, que a su vez fueron inmovilizados sobre el portador. Estos polipéptidos pueden ser anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinas, específicos de los fagos o de las proteínas de fagos.
En la inmovilización de los fagos y de las proteínas de fagos mediante acoplamiento covalente, debido a las condiciones más restrictivas de lavado, pueden eliminarse mejor las bacterias unidas de forma inespecífica. En el acoplamiento covalente, pueden acoplarse los fagos y las proteínas de fagos, por ejemplo, a través de grupos amino primarios o grupos carboxilo a materiales portadores ya activados por el fabricante, por ejemplo, placas de microtitulación de Nunc, Xenobind o Costar, en condiciones estándar, por ejemplo, -NH_{2} mediante cloruro de cianurilo (Russian Chemical Rev., 1964, 33:92-103), o
-COO- mediante EDC (1-etil-3'-[3'-dimetilaminopropil]carbodiimida) (Anal. Biochem. 1990, 185:131-135). Además, los materiales portadores pueden activarse directamente mediante procedimientos apropiados. Una posibilidad que se prefiere por su aplicabilidad para un amplio espectro de materiales portadores es la silanización del material portador. Por ejemplo, la silanización del poliestireno puede efectuarse mediante pirólisis por llama. A continuación, se aplican mediadores de adherencia apropiados que posibiliten un acoplamiento, por ejemplo, a través de grupos amino primarios o grupos carboxilo.
Para lograr una inmovilización selectiva al portador, por ejemplo, en los fagos T4 un acoplamiento a través de la "cabeza", pueden usarse polímeros hinchables, también mezclas de alquiltioles de distinta longitud con poros de tamaño definido, o sobre superficies metálicas.
Para la unión de las bacterias que se han de examinar a los bacteriófagos o las proteínas de fagos, se pone en contacto la muestra de ensayo en forma acuosa con los fagos o las proteínas de fagos y se incuban. La incubación se efectúa a una temperatura en el intervalo de 4º a 90ºC, preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 4º a 45ºC, muy preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 15º a 37ºC, de especial preferencia, a una temperatura en el intervalo de 20º a 37ºC, especialmente, a temperatura ambiente, durante hasta 6 horas, preferentemente, durante hasta 4 horas, muy preferentemente, durante 2 horas, especialmente, durante 1 hora, de especial preferencia, de 1 a 20 minutos. Por ejemplo, la incubación puede efectuarse durante 2 a 120 min a 4º hasta 37ºC, preferentemente, durante 20 a 30 min a 25ºC o 37ºC, muy preferentemente, durante 35 min a 37ºC. Mediante la adición de inhibidores de traducción, como rifampicina, puede prolongarse la duración de la incubación, para aumentar la eficiencia de unión. Después del reconocimiento específico y de la unión fuerte de las bacterias, puede separarse el material unido de forma inespecífica mediante el lavado con tampón acuoso, por ejemplo, con PBS o PBS-Tween, preferentemente, a valor de pH neutro, por ejemplo, con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. Para aumentar la eficiencia del lavado, dado el caso, pueden añadirse detergentes a los tampones usados, por ejemplo, Tween 20, Triton X 100 ó agentes caotrópicos, por ejemplo, clorhidrato de guanidinio o urea. Esta etapa de lavado puede repetirse varias veces, dependiendo del material de la muestra.
Después de separar el material unido de forma inespecífica, puede permeabilizarse la membrana de las bacterias unidas o, si es necesario, destruirse (dependiendo del ensayo de detección usado), mediante la adición de detergentes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, octilglucósido), sustancias químicas (por ejemplo, polimixina B), polipéptidos formadores de poros (por ejemplo, nisina, holina, melitina) o proteínas (por ejemplo, lisozima). Esta permeabilización de membrana puede efectuarse durante 5 a 10 min a una temperatura en el intervalo de 10º a 50ºC. A continuación, se detectan las bacterias unidas.
Si se pone en contacto la muestra con los fagos o las proteínas de fagos inmovilizados, por ejemplo, en una cámara de flujo o en un filtro, después de la unión de las bacterias a los fagos o a las proteínas de fagos, no debe separarse necesariamente antes de realizarse la detección.
La detección de las bacterias unidas con los fagos o con las proteínas de fagos también puede efectuarse mediante el uso de un ensayo colorimétrico. Aquí se detecta, por ejemplo, NADH (Bergmeyer & Berna; Methoden der enzymatischen Analyse, Bergmeyer, U. VCH, Weinheim 1974), actividad \beta-galactosidasa (Apte y col., 1995, Wat. Res. 29, 1803-1806), o fosfato inorgánico (Lanzetta y col., 1979, Anal. Biochem., 100, 95-97). Estos ensayos posibilitan la detección de al menos 10^{4} células por ml; por el uso de colorantes fluorescentes puede mejorarse la sensibilidad a 10^{2} hasta 10^{3} células por ml. Los ensayos colorimétricos pueden usarse en general para la detección de la actividad de enzimas intracelulares, enzimas de la membrana, o enzimas periplasmáticas, o de componentes celulares o de productos de la reproducción de fagos, por ejemplo, proteínas de fagos o ácidos nucleicos de fagos. Además, los ácidos nucleicos de fagos pueden estar modificados mediante la clonación de un ácido nucleico exógeno, por ejemplo, un gen para la peroxidasa del rábano picante, en el genoma del fago. Después de la inyección del ácido nucleico del fago en la bacteria unida, se expresa el gen exógeno y la actividad del producto génico puede ser detectada mediante procedimientos usuales. Además, el ácido nucleico exógeno puede codificar cualquier polipéptido extraño a la bacteria, que entonces puede detectarse.
Los ensayos colorimétricos pueden ser iguales para todas las bacterias que se han de examinar, pero también pueden ser específicos para determinadas combinaciones de bacteria/fago. La medición de la actividad enzimática de enzimas citoplasmáticas o periplasmáticas se lleva a cabo después de una permeabilización de la membrana de las bacterias unidas. Preferentemente, se detecta la actividad de enzimas ubicuas como, por ejemplo, lactato deshidrogenasa o proteína disulfuroisomerasa. La selección de enzimas puede adecuarse al respectivo género de bacterias analizadas o al respectivo planteamiento específico de género. Para los sistemas de ensayo colorimétricos, según la sensibilidad que se necesite, se usan procedimientos de detección químicos o de bioluminiscencia, de absorción, de fluorescencia o de dicroísmo circular.
Además, la detección de las bacterias unidas a los fagos o a proteínas de los fagos puede efectuarse a través de la detección de ADN y/o ARN. Para ello, pueden usarse sustancias que se unen a ADN y/o ARN. La unión a ADN y/o a ARN puede efectuarse directamente, basado en una difusión a través de una membrana o, como alternativa, mediante una permeabilización de membrana. Aquí puede recurrirse a marcadores de fluorescencia adquiridos como, por ejemplo, bromuro de etidio, naranja de acridina, 4',6'-diamidino-2-fenilindoles (DAPI) o verde I de SYBR, y pueden usarse los protocolos correspondientes de detección descritos en la bibliografía especializada.
Además, la detección de las bacterias unidas a los fagos o a las proteínas de fagos puede llevarse a cabo mediante la detección de nuevos ADN y/o ARN producidos. Para ello, en los nuevos ADN y/o ARN producidos a partir de fagos, pueden introducirse nucleótidos marcados por fluorescencia, permeables a través de la membrana.
Otro procedimiento de detección, es la hibridación con oligonucleótidos altamente conservados del ARNr 16S (secuencia de Shine-Dalgarno), marcados con fluorescencia, y la detección de la señal de hibridación por fluorescencia. Se prefiere el procedimiento de detección con el uso de proteínas de fagos o de "fantasmas" de fagos ("envolturas vacías de fagos", exentas de nucleótidos), porque de esta manera se reduce la señal de fondo de ADN o ARN de fagos.
La detección de las bacterias unidas a los fagos o a las proteínas de fagos, además, puede llevarse a cabo usando polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos, a los que se acopla un marcaje, por ejemplo, FITC o fosfatasa alcalina, contra estructuras de superficie celular de las bacterias, o lectinas contra estructuras de superficie celular, siguiéndose el desarrollo de señales de, por ejemplo, un anticuerpo acoplado con peroxidasa, de forma fotométrica. Las superficies celulares de las bacterias reconocidas por los anticuerpos o las lectinas, por ejemplo, pueden ser lipopolisacáridos o proteínas de membrana. Además, los polipéptidos pueden ser proteínas de fagos que sean idénticas a las proteínas inmovilizadas de fagos, o distintas de éstas. Además, la detección puede llevarse a cabo usando fagos completos, que pueden ser idénticos a los fagos inmovilizados o ser distintos de estos.
El procedimiento de detección conforme a la invención, de esta manera, puede prescindir del uso de un segundo anticuerpo. En contraste con los procedimientos de ELISA tradicionales, en los que las bacterias que se han de examinar se acoplan a un portador y, a continuación, se efectúa la detección mediante anticuerpos primarios o secundarios, mediante el uso de partículas de fagos acoplados a sistemas portadores se lleva a cabo un enriquecimiento previo y una selección. De esta manera, puede mejorarse la sensibilidad del procedimiento ELISA, pudiéndose reducir notablemente la cantidad necesaria actual de gérmenes, de 10^{4}-10^{6} por ml (Blasco y col., 1998; J. Appl. Microbiol. 84, 661-666).
Según sea necesario, se detectan, por ejemplo, fluorescencia, luminiscencia, absorción o dicroísmo circular, conductividad o modificaciones de capacidad de las respectivas muestras en los aparatos de medición estándar correspondientes. Para una determinación exacta de la concentración de las bacterias, puede confeccionarse una recta de calibración con moléculas patrón correspondientes. Para alcanzar una determinación exacta del género de bacterias, puede recurrirse a una serie de esquemas de tipificación ya descritos en la bibliografía especializada. Si es necesario, se construyen y se usan nuevos esquemas de tipificación, es decir, combinaciones apropiadas de diferentes fagos, para la determinación exacta de la cepa.
El uso del procedimiento conforme a la invención posibilita una detección rápida y sensible de bacterias. Mediante el acoplamiento a estructuras portadoras apropiadas, descritas anteriormente, se posibilita una determinación rápida y económica de un gran número de cepas bacterianas, una determinación muy exacta del género bacteriano y/o una cuantificación de las bacterias, en un único ensayo. Entre otras cosas, en el diagnóstico médico, la determinación exacta del género bacteriano también es importante para la caracterización epidemiológica de los agentes patógenos.
El procedimiento conforme a la invención puede usarse para la detección rápida, altamente sensible y económica de bacterias en todas las muestras deseadas, especialmente, en la medicina, en la industria y el análisis alimentarios, en la cría de animales, en el análisis de agua potable y del medio ambiente. La fácil aplicabilidad del procedimiento posibilita tanto disoluciones envasadas para las combinaciones bacterianas más importantes, como disoluciones sistemáticas adecuadas a las necesidades del cliente, y de esta manera, un uso universal del procedimiento conforme a la invención. Además, la presente invención permite una automatización completa del procedimiento conforme a la invención. Además, el procedimiento puede usarse para todas las bacterias para las cuales haya fagos apropiados, o que se aíslen en el futuro, o para bacterias para las que puedan producirse por selección fagos o proteínas de fagos correspondientes para su tipificación. Además, el procedimiento conforme a la invención brinda la posibilidad de su uso en kits de detección de bacterias para "cualquiera", para uso doméstico.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de bacterias, que comprende un portador con fagos o proteínas de fagos inmovilizados y las disoluciones necesarias para la detección de las bacterias unidas con reactivos de ensayo. Los portadores pueden ser todos los portadores descritos anteriormente, sobre los que están inmovilizados los fagos o las proteínas de fagos, como fue descrito anteriormente. Las disoluciones con los reactivos de ensayo corresponden igualmente a las sustancias que están descritas para la detección de las bacterias en el procedimiento conforme a la invención. Además, dado el caso, el kit puede contener disoluciones lavadoras, así como enzimas o detergentes necesarios para la apertura de la membrana bacteriana.
Los siguientes ejemplos explican la invención y no deben entenderse como limitantes. Si no se indica de otra manera, se usaron procedimientos estándar de biología molecular, como los que están descritos, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
1. Aislamiento y purificación de los fagos
Se efectuó la purificación de los fagos de E. coli T4, T7, Q\beta y PhiX174, después del cultivo de los fagos sobre las bacterias hospedadoras de E. coli correspondientes, indicadas por DSM, mediante procedimientos conocidos. Para lograr una separación completa de las bacterias y restos de bacterias, se centrifugó la suspensión de fagos a baja velocidad (5000 x g, durante 30 min). Para la concentración y el aislamiento de los fagos, se efectuó una ultracentrifugación preparativa usual y una precipitación con polietilenglicol. Se controló el éxito de la separación de las bacterias mediante un experimento en placa y, a continuación, se almacenaron los fagos enfriados (4º-8ºC), o congelados (-20º o -80ºC).
2. Aislamiento y purificación de las estructuras de receptores de fagos
Se separaron las estructuras de receptores de fagos a partir de fagos intactos mediante procedimientos de separación estándar usuales de química de proteínas, o se produjeron de forma recombinante, y fueron igualmente purificadas mediante procedimientos de separación estándar de la química de proteínas, y se almacenaron como las partículas completas de fagos.
3. Fijación de los fagos mediante adsorción
Se inmovilizaron directamente 10^{8}-10^{12} fagos/ml en tampón acuoso (Tris 100 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, gelatina al 0,03% (p/v) o fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0), o bien durante varias horas a 37ºC, o bien durante una noche a 20ºC, sobre placas Nunc Maxisorb, mediante adsorción. A continuación, se eliminaron los fagos no unidos, mediante cuatro lavados o bien, con Tris 100 mM, pH 7,3, o bien con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5.
A continuación, para reprimir reacciones secundarias inespecíficas de las bacterias en el material del sistema portador, se llevó a cabo una etapa de bloqueo. Para ello, se incubó el sistema portador tratado con fagos con disolución bloqueante de PBS (KH_{2}PO_{4} 4 mM, Na_{2}PO_{4} 16 mM, NaCl 115 mM) y adición de 0,05-1,0% de Tween 20, 1% de seroalbúmina bovina durante una noche, en un intervalo de temperaturas de 4ºC, o durante 2 h a 37ºC, se retiró el líquido sobrenadante y, a continuación, se secó el sistema portador, como se describió anteriormente.
4. Fijación de los fagos mediante unión covalente
Se activaron placas de poliestireno Nunc (CovaLink^{TM}) y Costar (con grupos NH_{2}), de forma correspondiente al protocolo del fabricante, con cloruro de cianurilo (48 mg en 3 ml de acetona, 45 ml de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0). Para ello, en el transcurso de dos minutos, se pipetearon 100-200 \mul de cloruro de cianurilo en los pocillos de la placa y se incubó durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavó tres veces con fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0 y se secó durante más de 30 minutos a 50ºC. Para el acoplamiento, se incubaron los fagos durante una noche a temperatura ambiente en carbonato de sodio 100 mM, pH 10,0 en los pocillos. Mediante lavado triple con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, se eliminaron fagos no unidos. Se secaron las placas listas o, hasta su uso, se recubrieron con una capa de tampón acuoso y se almacenaron a 4º-20ºC.
5. Detección de las bacterias unidas mediante la actividad \beta-galactosidasa
Se incubaron las muestras de bacterias (200 \mul de muestra/pocillo) durante 35 min a 37ºC. A continuación, se separaron bacterias unidas de forma inespecífica mediante triple lavado o bien, respectivamente con 200 \mul de Tris 100 mM, pH 7,0, o bien con tampón fosfato, pH 7,0. Para el ensayo colorimétrico, se añadieron 200 \mul de tampón de lavado con MgCl_{2} y mercaptoetanol, así como 66 \mul de ONPG (o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido, 4 mg/ml). Se incubó la preparación de ensayo a 37ºC, y se siguió espectrofotométricamente el transcurso de la reacción a 405 nm durante varias horas (2-5).

Claims (10)

1. Procedimiento para la detección de bacterias, que comprende las siguientes etapas:
a)
acoplamiento de bacteriófagos y/o de proteínas de bacteriófagos mediante unión directa a un portador o mediante unión directa de los bacteriófagos y/o de las proteínas de bacteriófagos a un polipéptido inmovilizado en un portador,
b)
incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o con las proteínas de bacteriófagos con una muestra,
c)
dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos,
d)
dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias, y
e)
detección de las bacterias de la muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa mediante una detección colorimétrica de componentes celulares y/o productos de la reproducción de fagos, mediante una detección de ADN y/o ARN, o mediante una detección inmunológica.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos unidos directamente a un portador están acoplados al portador mediante adsorción o mediante unión química.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que los polipéptidos inmovilizados sobre el portador son anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinas específicos.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos presentan modificaciones.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se usan al menos dos bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos distintos, que reconocen al menos dos especies y/o géneros de bacterias distintos.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el portador es una placa de microtitulación, una tira de ensayo, un portaobjetos, una oblea, material filtrante o una cámara celular de flujo y está constituido por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio u oblea de silicio.
8. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, para detectar bacterias en la medicina, en la industria y el análisis alimentarios, en la cría de animales, en el análisis de agua potable y del medio ambiente.
9. Kit para llevar a cabo el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un portador con fagos o proteínas de fagos inmovilizados y reactivos analíticos para detectar las bacterias unidas.
10. Kit según la reivindicación 9, que además comprende disoluciones lavadoras y/o sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias.
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