ES2325825A1 - Procedimiento y sistema para dectectar y/o cuantificar bacteriofagos susceptibles de infectar una cepa huesped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo micrelectronico sensor para detectar dichos bacteriofagos y dispositivos microelectronico sensor para llevar a cabo dich. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo micrelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento. El Procedimiento, sistema y dispositivo reivindicados están basados en la medida de los cambios de impedancia producidos en la interfase de un electrodo al que previamente se han adherido bacterias de una cepa huésped para el bacteriófago que se pretende detectar. Los cambios que se producen en la citada interfase electrodo/bacterias tienen su origen en la actividad fágica de los bacteriófagos sobre las bacterias adheridas en la superficie del electrodo de trabajo de un dispositivo micro-electrónico sensor.
Description
Procedimiento y sistema para detectar y/o
cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped
bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectrónico
sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo
microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento.
La presente invención se refiere a un
procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos
susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana
predeterminada, que está basado en la toma de medidas de impedancia
eléctrica del medio o solución analizar, mediante la técnica de
espectroscopia de impedancia eléctrica.
También se refiere a un dispositivo
micro-electrónico sensor para llevar a cabo dicho
procedimiento y al uso de dicho dispositivo
micro-electrónico sensor para detectar y cuantificar
dichos bacteriófagos.
Los bacteriófagos son virus que infectan
bacterias, que están formados por ácidos nucleicos (ADN o ARN)
envueltos por una cápside proteica. Estos virus presentan una
elevada especificad por las bacterias que infectan de manera que se
puede detectar un determinado bacteriófago o grupo de bacteriófagos
en función de la cepa huésped seleccionada.
De manera resumida, el ciclo de los
bacteriófagos consta de 4 fases: en un primer paso se produce el
reconocimiento bacteriófago-bacteria y la inyección
de los ácidos nucleicos fágicos que contienen la información
genética necesaria para la formación de nuevos bacteriófagos. A
continuación, el material genético de los bacteriófagos se integra
en forma de ADN en el cromosoma bacteriano. Una vez integrado, la
infección de la célula huésped puede provocar dos tipos de
respuesta en función del tipo de bacteriófago que la infecta. Así,
se distinguen los bacteriófagos atemperados, que pueden integrarse
en el genoma de la célula huésped indefinidamente o hasta que se
induce la lisis por diversos factores, y los bacteriófagos líticos,
los cuales tras un periodo de incubación y gracias a la maquinaria
biosintética de la célula huésped, replican el material necesario
para la creación de nuevos viriones y salen al exterior mediante la
lisis de la célula huésped.
La detección y/o cuantificación de bacteriófagos
de bacterias entéricas resulta de particular importancia en el
control microbiológico de aguas y en la determinación del origen de
la contaminación fecal. Dichos bacteriófagos han sido propuestos
como microorganismos indicadores de la presencia de virus ya que
tienen un comportamiento similar a éstos. Existen tres grupos de
bacteriófagos de bacterias entéricas que se emplean como indicadores
de contaminación fecal de origen vírico: los colifagos somáticos,
fagos RNA F-específicos, y fagos que infectan
bacterias Bacteroides spp.
Otro grupo de bacteriófagos cuya detección y/o
cuantificación resulta de particular interés, es el formado por los
bacteriófagos que infectan bacterias lácticas del tipo de las que
se emplean para la producción de quesos u otros productos
fermentados de tipo láctico. Dichos bacteriófagos afectan
seriamente a la producción de ácido láctico lo que conlleva
cuantiosas pérdidas económicas en las industrias lácticas.
Los métodos clásicos para la detección de
bacteriófagos se basan en la detección de sus efectos sobre sus
bacterias huéspedes. Tradicionalmente para la enumeración de los
bacteriófagos se utiliza el ensayo de la doble capa de agar, en el
que se deposita una capa de agar semi-sólido que
contiene una cepa huésped determinada (en función del bacteriófago
que se quiera cuantificar) y la muestra a analizar, sobre una capa
de agar. La cuantificación de los bacteriófagos se realiza mediante
la detección de zonas o placas de lisis originadas por la infección
y lisis de la bacteria huésped por un bacteriófago o grupos de
bacteriófagos presentes en la muestra, tras un periodo de
incubación de dicha cepa huésped.
Los métodos basados en la siembra en placas
presentan el inconveniente de que son muy lentos, puesto que
requieren como mínimo 24 de incubación.
Otros métodos más recientemente descritos para
la detección de bacteriófagos se basan en la detección de dichos
bacteriófagos mediante la técnica PCR. Sin embargo, estos métodos
son también lentos y, además, muy laboriosos.
Las patentes europeas EP0149383 y EP0714450
describen otros métodos para detectar bacteriófagos, en concreto
para la detección de bacteriófagos de bacterias lácticas.
La patente EP0714450 se refiere a la detección
de algún componente interno de la bacteria tras su lisis mediante
la emisión de bioluminiscencia, en reacciones enzimáticas
catalizadas por enzimas como la luciferaza, mientras que la patente
EP0149383, se refiere a la detección de la inhibición del
crecimiento mediante el uso de indicadores de pH para detectar la
actividad microbiana.
Los métodos descritos en las citadas patentes
presentan el inconveniente de que no permiten la detección de los
bacteriófagos en estado activo, por lo que resultan en la práctica
muy poco fiables. Por otro lado, se trata de métodos muy complejos
y caros, puesto que conllevan el uso de un gran número de
reactivos.
\newpage
La solicitud de patente española núm. 200800109,
todavía no publicada en el momento de presentar la presente
solicitud, se refiere a un procedimiento y dispositivo para medir
concentración de biomasa, que emplea la técnica de espectroscopia
electroquímica de impedancias (EEI) para determinar el cambio de
señal impedimétrica producido por la adhesión de biomasa sobre la
superficie del electrodo de trabajo de un dispositivo.
En una realización descrita en la mencionada
solicitud de patente, los electrodos con los que se lleva a cabo
las medidas de impedancia de la interfase están dispuestos
integrados en un sustrato de material de un dispositivo
micro-electrónico plano, en concreto un chip sensor,
susceptible de ser inmerso en el medio en el que se lleva a cabo la
medida de concentración de biomasa de la solución.
En el procedimiento y dispositivo descritos en
la citada solicitud de patente, se determina la concentración de
biomasa de la solución a partir del valor del cambio de
capacitancia de la doble capa eléctrica de la interfase
electrodo/solución producido por la adhesión electrostática de
biomasa.
La variación de la capacitancia de la doble capa
eléctrica de la interfase electrodo/solución se ha visto
dependiente de la concentración de biomasa de la solución, por lo
que la monitorización de los cambios de capacitancia de dicha capa
permite la detección de la concentración de biomasa de la solución,
de un modo sencillo y muy fiable, mediante la correspondiente curva
de calibración.
Un primer objetivo de la presente invención es
el de desarrollar un procedimiento y sistema alternativo para
detectar y/o cuantificar bacteriófagos, que está basado en la
medida de los cambios de impedancia eléctrica producidos en la
interfase de un electrodo al que previamente se le han adherido
bacterias.
El procedimiento y sistema descrito presenta la
ventaja respecto de los procedimientos del estado de la técnica de
que es muy sencillo, económico y altamente fiable.
De acuerdo con este objetivo, según un primer
aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para
detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una
cepa huésped bacteriana predeterminada, que se caracteriza por el
hecho de que comprende las etapas de;
a) adherir bacterias procedentes de por lo menos
una de dichas cepas huésped, sobre la superficie de un electrodo de
trabajo de un dispositivo que comprende medios para medir
impedancia eléctrica,
b) exponer el electrodo procedente de la etapa
a) a una solución del material a analizar susceptible de contener
bacteriófagos,
c) incubar junto con el electrodo, la solución
de la etapa b), en condiciones predeterminadas al objeto de que, si
dichas bacterias son infectadas por bacteriófagos, se lleve a cabo
la lisis de dichas bacterias adheridas sobre el electrodo,
d) medir el cambio de impedancia eléctrica de
dicha solución, mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa
c),
e) determinar en el circuito eléctrico
equivalente del espectro de impedancias, el valor del cambio de
capacitancia de la interfase electrodo-bacterias, a
partir de dicho valor de cambio de impedancia,
f) determinar la presencia o la concentración de
bacteriófagos de la solución, a partir de dicho valor de cambio de
capacitancia mediante la correspondiente curva de calibración que
correlaciona dicho valor de cambio de capacitancia con la
concentración de bacteriófagos de la solución.
Atendiendo al mismo objetivo, según un segundo
aspecto, la presente invención proporciona un sistema para detectar
y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa
huésped bacteriana predeterminada, que se caracteriza por el hecho
de que comprende un dispositivo micro-electrónico
sensor que comprende por lo menos dos electrodos para llevar a cabo
medidas de impedancia eléctrica, bacterias de por lo menos una de
dichas cepas huésped, adheridas sobre la superficie de por lo menos
uno de dichos electrodos, y medios de procesamiento y control para
determinar, en el circuito equivalente del espectro de impedancias,
el cambio de capacitancia de la interfase electrodo/bacterias,
siendo producido dicho cambio de capacitancia por efecto de la
tisis de las bacterias adheridas sobre el electrodo, al ser dichas
bacterias infectadas por bacteriófagos.
Un segundo objetivo de la presente invención es
el de proporcionar un dispositivo micro-electrónico
sensor que comprende por lo menos un par de electrodos para medir
cambios de impedancia eléctrica. Dicho dispositivo sensor se
caracteriza por el hecho de que comprende un biofilm bacteriano
adherido sobre la superficie de por lo menos uno de dichos
electrodos, perteneciendo las bacterias de dicho biofilm a por lo
menos una cepa huésped susceptible de ser infectada por
bacteriófagos de especificidad predeterminada a dicha cepa.
Por último, un tercer objetivo de la presente
invención es la utilización de un dispositivo
micro-electrónico sensor que comprende por lo menos
un par de electrodos integrados en un sustrato de material, para
detectar y cuantificar, mediante espectroscopia de impedancia
electroquímica, bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa
huésped bacteriana predeterminada.
En la presente invención por dispositivo
micro-electrónico se entenderá un componente sensor
plano, preferentemente fabricado con tecnologías microelectrónicas
ya sean de capa gruesa o de capa delgada.
Por biofilm, se entenderá una formación
bacteriana heterogénea que crece en la superficie del electrodo de
trabajo de un dispositivo micro- electrónico, preferiblemente, una
comunidad de bacterias que crece embebida en una matriz de
exopolisacáridos, adherida sobre la superficie del electrodo de
trabajo de un dispositivo micro-electrónico.
El procedimiento y sistema reivindicados están
basados en la medida de los cambios de impedancia producidos en la
interfase de un electrodo al que previamente se han adherido
bacterias de una cepa huésped para el bacteriófago o grupo de
bacteriófagos que se pretende detectar. Los cambios que se producen
en la citada interfase electrodo/bacterias tienen su origen en la
actividad fágica de los bacteriófagos sobre las bacterias adheridas
en la superficie del electrodo de trabajo. Dicho electrodo pertenece
a un dispositivo micro-electrónico sensor que mide
impedancias mediante espectroscopia de impedancia
electroquímica.
Los experimentos efectuados han permitido
observar que la lisis mediada por bacteriófagos de bacterias
adheridas sobre el electrodo de trabajo de un dispositivo
micro-electrónico sensor produce una respuesta que
puede ser monitorizada en tiempo real mediante medidas de impedancia
eléctrica.
En concreto, se ha observado que el valor de la
capacitancia de la interfase de un electrodo al que se han adherido
bacterias, puede verse modificado por la actividad fágica de
bacteriófagos que provocan la lisis de dichas bacterias. El valor
del cambio de capacitancia de la interfase, determinado en el
circuito eléctrico equivalente del espectro de impedancias, depende
del grado de actividad fágica (lisis) que tiene lugar sobre la
superficie del electrodo, la cual a su vez es proporcional a la
concentración de bacteriófagos del medio o solución a analizar.
Este hecho ha permitido el desarrollo de un
sistema y procedimiento para detectar y/o cuantificar bacteriófagos
que presenta la ventaja de que es altamente fiable, puesto que
detecta los bacteriófagos en estado activo. Además, se trata de un
método y sistema muy sencillo, fácilmente reproducible y
automatizable, que permite la monitorización en tiempo real de la
concentración de bacteriófagos de una muestra. Por otro lado,
presenta la ventaja de que puede aplicarse para la detección de
bacteriófagos presentes en cualquier tipo de matriz (aguas
residuales, lodos de depuradora, leche, biosólidos, etc...).
Tanto el sistema como el procedimiento
reivindicados requieren de la adhesión, sobre la superficie del
electrodo de trabajo, de la cepa huésped para el bacteriófago o
grupo de bacteriófagos que se pretenden detectar. Dicha adhesión
bacteriana puede llevarse a cabo mediante técnicas distintas.
Según una primera realización, la adhesión puede
realizarse mediante la funcionalización previa de la superficie del
electrodo de trabajo con la adsorción de un compuesto o disolución
destinado a inmovilizar las bacterias.
Según otra realización, la adhesión puede
realizarse aplicando un potencial eléctrico a los electrodos del
dispositivo, al objeto de provocar la adhesión electrostática de las
bacterias sobre el electrodo de trabajo.
No obstante, según una realización preferida, la
adhesión bacteriana comprende la formación de un biofilm bacteriano
sobre la superficie del electrodo de trabajo.
La formación de un biofilm sigue un proceso
característico que empieza con una fase de adhesión reversible de
las bacterias sobre un sustrato, seguido por una adhesión
irreversible y el inicio de la división bacteriana que comportará
el crecimiento y posterior maduración del biofilm. Este proceso
puede ser monitorizado mediante la técnica de espectroscopia de
impedancia electroquímica siguiendo un circuito equivalente en el
que se define la capacitancia del biofilm (Cb) como el parámetro o
componente eléctrico de dicho circuito que modela en la interfase
el biofilm adherido sobre el electrodo. La capacitancia del biofilm
muestra una correlación positiva con el grosor del biofilm, de
manera que ésta aumenta al aumentar el grosor del biofilm durante
su maduración.
Atendiendo a la realización preferida que
incluye la formación del biofilm, la presente invención reivindica
un procedimiento en el que;
- la adhesión bacteriana de la etapa a)
comprende la formación de un biofilm bacteriano sobre la superficie
del electrodo de trabajo, preferiblemente formado tras un periodo
de incubación predeterminado,
- la determinación del cambio de capacitancia de
la interfase comprende la determinación de la capacitancia (Cb) de
dicho biofilm, siendo dicha capacitancia el parámetro del circuito
eléctrico equivalente que modela en la interfase dicho biofilm,
\newpage
y en el que, se determina la presencia o
concentración de bacteriófagos a partir del cambio de capacitancia
(Cb) de dicho biofilm, estando correlacionado dicho cambio de
capacitancia con la degradación de dicho biofilm por efecto de la
lisis.
Atendiendo a la misma realización preferida que
incluye la formación del biofilm, la presente invención reivindica
un sistema en el que las bacterias adheridas sobre el electrodo de
trabajo del dispositivo micro-electrónico forman
parte de dicho biofilm, y en el que los medios de procesamiento y
control determinan el cambio de capacitancia (Cb) de dicho biofilm,
estando correlacionado dicho cambio de capacitancia con la
degradación del mismo biofilm por efecto de la lisis bacteriana.
Los experimentos efectuados han permitido
observar que cuando un biofilm crecido sobre el electrodo de
trabajo de un dispositivo micro-electrónico sensor
se expone a una muestra que contiene bacteriófagos en solución, la
tisis bacteriana que éstos provocan produce una disminución del
grosor de dicho biofilm que se traduce en un cambio de capacitancia
(Cb) de dicho biofilm.
Sorprendentemente, se ha observado que tanto el
cambio de grosor como el cambio de capacitancia (Cb) del biofilm,
pueden asociarse al ciclo lítico de los bacteriófagos responsables
de la eliminación de las bacterias del biofilm adherido sobre la
superficie del dispositivo micro-electrónico.
Gracias a ello, la presente invención
proporciona un sistema y procedimiento muy sencillos y fiables, en
los que, según una realización preferida, se detecta y cuantifica
la presencia de bacteriófagos en una solución mediante la detección
de cambios de impedancia asociados a la degradación de un biofilm
adherido sobre la superficie de un dispositivo
micro-electrónico.
También gracias a ello, la presente invención
proporciona un dispositivo micro-electrónico sensor
que comprende por lo menos un par de electrodos para medir cambios
de impedancia eléctrica que se caracteriza por el hecho de que
comprende un biofilm bacteriano adherido sobre la superficie de por
lo menos uno de dichos electrodos, perteneciendo las bacterias de
dicho biofilm a una cepa huésped susceptible de ser infectada por
bacteriófagos de especificidad predeterminada a dicha cepa.
Ventajosamente, el dispositivo
micro-electrónico que incluye un biofilm, se
utiliza para detectar y cuantificar, mediante espectroscopia de
impedancia electroquímica, bacteriófagos susceptibles de infectar
por lo menos una cepa huésped de las bacterias de dicho
biofilm.
Preferiblemente, dicho dispositivo
micro-electrónico es un chip sensor o dispositivo
micro-electrónico miniaturizado plano,
preferentemente fabricado con tecnologías litográficas de capa
delgada.
El chip constituye un sensor muy sensible, el
cual, gracias a su reducido tamaño, permite realizar medidas en
volúmenes de muestra muy pequeños.
El procedimiento y sistema reivindicados pueden
aplicarse a la detección de cualquier tipo de bacteriófagos siempre
que se disponga de la cepa huésped para la que dicho bacteriófago
presenta una especificidad predeterminada. Dichos bacteriófagos
pueden proceder de muestras de materiales muy diversos; por ejemplo
de aguas, lodos de depuradoras, leche, u otro tipo de materiales
sólidos o líquidos para los que la detección de bacteriófagos
resulte interesante.
En el caso concreto de muestras procedentes de
aguas, la detección de bacteriófagos resulta especialmente
interesante, puesto que éstos han sido propuestos como
microorganismos indicadores de la presencia de contaminación fecal
de tipo vírico.
Según una realización preferida, la presente
invención se refiere a la detección de bacteriófagos de importancia
en el control microbiológico de aguas y/o en la determinación de
contaminación fecal, entre los que se incluyen, por ejemplo, los
colífagos somáticos, los bacteriófagos F-RNA
específicos, bacteriófagos que infectan Bacteroides
fragilis.
Según otras realizaciones, los bacteriófagos de
la presente invención son bacteriófagos que infectan Pseudomonas
putida, o bacteriófagos que infectan bacterias lácticas, como
por ejemplo: Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus lactis,
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, y
Streptococcus thermophilus.
Para mayor comprensión de cuanto se ha expuesto
se acompañan unos dibujos en los que, esquemáticamente y sólo a
título de ejemplo no limitativo, se representa un caso práctico de
realización.
En dichos dibujos,
la figura 1 es una vista esquemática en planta
de la estructura de un dispositivo
micro-electrónico sensor, en concreto, un chip
sensor impedimétrico, empleado para detectar bacteriófagos.
las figuras 2a y 2b muestran sendos detalles del
chip de la figura 1, sobre el que se ha hecho crecer un biofilm de
Pseudomonas putida. La figura 2a muestra la superficie del
electrodo de trabajo del chip con el biofilm antes de ser sometido
a la acción de los bacteriófagos, mientras que la figura 2b muestra
la misma superficie del electrodo después de ser sometido a la
acción de bacteriófagos que infectan Pseudomonas putida.
la figura 3 es una representación gráfica que
muestra la evolución en el tiempo de la capacitancia (Cb) del
biofilm crecido en el chip de la figura 1, en una solución control
y en una solución que comprende bacteriófagos que infectan
Pseudomonas putida.
la figura 4 muestra una representación del
circuito eléctrico equivalente empleado para modelar en la
interfase la capacitancia del biofilm (Cb).
A continuación se describe una realización del
procedimiento y sistema de la presente invención para la detección
de bacteriófagos que infectan Pseudomonas putida.
En la realización que se describe, el
dispositivo micro-electrónico empleado es un chip
sensor 1 como el representado en la figura 1, que lleva integrados
en un mismo sustrato un electrodo de trabajo 2 y dos
contraelectrodos 3, todos ellos en forma de
micro-discos de platino.
Tal y como se ha comentado en la descripción
detallada de la invención, el procedimiento y sistema reivindicados
están basados en la medida de los cambios de impedancia producidos
en la interfase de un electrodo al que previamente se han adherido
bacterias de una cepa huésped para el bacteriófago o grupo de
bacteriófagos que se pretende detectar.
En la realización que se describe, las bacterias
se han adherido sobre la superficie del chip 1 de la figura 1
mediante la formación de un biofilm 4 de Pseudomonas putida.
La figura 2a muestra un detalle del chip sensor 1 de la figura 1
sobre el que se ha hecho crecer el mencionado biofilm 4.
Para la formación del mencionado biofilm 4, el
propio chip sensor 1 se ha introducido en un reactor con un cultivo
de Pseudomonas putida en fase exponencial, en un medio mínimo
controlado (medio mínimo AB) en agitación y con una aireación
constante. En este reactor, el chip 1 se ha dejado incubar durante
un periodo de cinco días. Tras este periodo, el biofilm 4 que se ha
formado sobre el chip 1 tiene el aspecto que se muestra en la figura
2a.
A continuación se detalla la composición y el
modo de preparación del medio mínimo AB.
Se prepara a partir de una mezcla de las
siguientes soluciones:
- \medcirc
- 875 ml d'agua destilada estéril
- \medcirc
- 100 ml de solución A
- \medcirc
- 25 ml de solución B
- \medcirc
- 10 ml de glucosa al 20% (20 g/100 ml de agua destilada)
\vskip1.000000\baselineskip
La solución A incluye, en 1000 ml de agua
destilada:
- \medcirc
- (NH_{4}) SO_{4}: 20 g
- \medcirc
- Na_{2}HPO_{4}: 73,1 g
- \medcirc
- KH_{2}PO_{4}: 78,5 g
- \medcirc
- NaCl: 30,0 g
- \medcirc
- NaSO_{4}: 0,11 g
\vskip1.000000\baselineskip
La solución B incluye los siguientes
componentes, los cuales se mezclan tras ser autoclavados por
separado:
- \medcirc
- 16 g MgCl_{2} . 6 H_{2}O, en 500 ml d'agua destilada.
- \medcirc
- 0,58 g CaCl_{2}, en 250 mg d'agua destilada.
- \medcirc
- 0,032 g FeCl_{3} . 6 H_{2}O, en 250 ml d'agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez formado el biofilm 4 sobre el chip 1, se
introduce dicho chip 1 en una solución que contiene una suspensión
de bacteriófagos de 10^{8} (PFU/ml) (Unidades Formadoras de
Placas). Esta solución se ha obtenido al inocular 0,5 ml de una
muestra de agua residual que contiene bacteriófagos, en 4,5 ml de
dicho medio mínimo AB.
A continuación, se procede a incubar la
mencionada solución que incluye el chip 1, durante un periodo de 24
horas a una temperatura de 37ºC. Durante el proceso de incubación,
se han llevado a cabo medidas de impedancia eléctrica al objeto de
monitorizar la degradación del biofilm 4.
Las medidas de impedancia se han llevado a cabo
mediante espectroscopia de impedancia electroquímica utilizando las
siguientes condiciones de medida:
- \sqbullet
- Temperatura: 37ºC.
- \sqbullet
- Medio de cultivo: Medio mínimo AB, según composición arriba descrita.
- \sqbullet
- Potencial DC de circuito abierto: + 0.26 \pm 0.5 V
- \sqbullet
- Potencial AC: 25 mV
- \sqbullet
- Rango de frecuencias: 10 Hz a 100 KHz.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ambiente eléctrico, el biofilm 4
adherido sobre la superficie del chip 1 se comporta como un
material dieléctrico que se modela, en el circuito eléctrico
equivalente del espectro de impedancias, como la capacitancia del
biofilm (Cb).
La ecuación que define la capacitancia (Cb) del
biofilm 4 viene dada por la siguiente fórmula:
donde \varepsilon_{0} es el
coeficiente de permitividad en el vacío, \varepsilon_{biofilm}
la permitividad del biofilm, A el área de recubrimiento de
biofilm y d, el grosor del
biofilm.
La figura 4 muestra una representación del
mencionado circuito equivalente en el que, además de la
capacitancia del biofilm (Cb), se definen los siguientes
parámetros:
- \sqbullet
- Cr. Capacitancia asociada al electrodo de referencia.
- \sqbullet
- Rs: Resistencia de la solución
- \sqbullet
- Rb: Resistencia del biofilm 4.
- \sqbullet
- Cc: Capacitancia de la doble capa eléctrica de la interfase
- \sqbullet
- Rc: Resistencia de la transferencia de cargas.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se ha comentado en la descripción de
la invención, la exposición del biofilm 4 a la acción de los
bacteriófagos genera una respuesta que es mesurable
impedimétricamente en términos de variación del parámetro del
circuito eléctrico equivalente que modela en la interfase el
biofilm, es decir, en términos de variación de la capacitancia
(Cb) de dicho biofilm 4.
La figura 3 es una representación gráfica que
muestra la evolución en el tiempo de la capacitancia (Cb) del
biofilm 4 de cinco días dispuesto sobre el chip sensor 1, en una
solución control y en una solución que contiene bacteriófagos que
infectan Pseudomonas putida.
Tal y como se aprecia en la representación de la
figura 3, la capacitancia (Cb) del biofilm 4 disminuye a las 6
horas de incubación del chip 1 cuando éste se dispone en una
solución que contiene bacteriófagos. Sin embargo, la misma
capacitancia (Cb) se mantiene constante cuando el mismo chip 1 se
dispone en una solución control sin bacteriófagos.
Tal y como se ha comentado en la descripción de
la invención, los experimentos realizados han puesto de manifiesto
que los cambios en la capacitancia (Cb) del biofilm están
correlacionados con cambios en el grosor del mismo biofilm 4, según
pudo observarse mediante microscopia láser confocal. El cambio en
estos dos parámetros se asocia al ciclo lítico de los bacteriófagos
responsables de la eliminación de las bacterias del biofilm 4.
\newpage
En la realización que se describe, se tomaron
medidas del grueso del biofilm 4 en el chip 1 que había sido
expuesto a la acción de los bacteriófagos, detectándose una
reducción de alrededor del 50% en el grueso del biofilm, si bien la
disminución del total de bacterias (UFC/ml) (Unidades Formadoras de
Colonias), fue de alrededor de un 20%, probablemente debido a que
únicamente las capas externas del biofilm 4, que presentan menos
densidad bacteriana, fueron capaces de ser infectadas por los
fagos.
Estas medidas de disminución del grosor del
biofilm 4 se correlacionaron con una disminución en la capacitancia
del biofilm (Cb) producida por la presencia de bacteriófagos, tal y
como se puede observar en la Figura 3.
La concentración de bacteriófagos de la solución
a analizar se determina a partir del valor de cambio de
capacitancia (Cb) del biofilm, mediante la correspondiente curva de
calibración que correlaciona dicho valor de cambio de capacitancia
(Cb) con la concentración de bacteriófagos de la solución en el
rango de trabajo.
En la realización que se ha descrito las medidas
de impedancia se han llevado a cabo mediante un dispositivo
micro-electrónico sensor de tipo chip 1. No
obstante, cualquier otro dispositivo
micro-electrónico equivalente, como por ejemplo, un
dispositivo microelectrónico fabricado con tecnología
microelectrónica de capa gruesa, puede resultar útil para llevar a
cabo la presente invención.
De igual modo, en la realización que se
describe, la adhesión de bacterias sobre la superficie del
electrodo de trabajo 2 se ha llevado a cabo mediante la formación
de un biofilm 4 de cinco días. No obstante, la adhesión de
bacterias puede realizarse mediante cualquier otro tipo de técnicas,
como por ejemplo, llevando a cabo la funcionalización de la
superficie del electrodo de trabajo 3 mediante la adsorción directa
de un compuesto, por ejemplo, avidina, que facilita la adhesión de
las bacterias, previamente biotiniladas, mediante uniones
avidina-biotina.
La realización descrita se refiere a la
detección de bacteriófagos que infectan Pseudomonas putida.
No obstante, tal y como ya se ha comentado, la presente invención
puede aplicarse a la detección y/cuantificación de cualquier tipo de
bacteriófago siempre que se disponga de una cepa huésped bacteriana
susceptible de ser infectada por dicho bacteriófago. Por ejemplo,
similares resultados se han obtenido en la detección y
cuantificación de bacteriófagos colífagos somáticos susceptibles de
infectar cepas de Escherichia coli.
Claims (17)
1. Procedimiento para detectar y/o cuantificar
bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana
predeterminada, caracterizado por el hecho de que comprende
las etapas de;
a) adherir bacterias procedentes de por lo menos
una de dichas cepas huésped, sobre la superficie de un electrodo
(2) de trabajo de un dispositivo que comprende medios para medir
impedancia eléctrica,
b) exponer el electrodo (2) procedente de la
etapa a) a una solución del material a analizar susceptible de
contener bacteriófagos,
c) incubar junto con el electrodo (2), la
solución de la etapa b), en condiciones predeterminadas al objeto
de que, si dichas bacterias son infectadas por bacteriófagos, se
lleve a cabo la Tisis de dichas bacterias adheridas sobre el
electrodo (2),
d) medir el cambio de impedancia eléctrica de
dicha solución, mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa
c),
e) determinar en el circuito eléctrico
equivalente del espectro de impedancias, el valor del cambio de
capacitancia de la interfase electrodo-bacterias, a
partir de dicho valor de cambio de impedancia,
f) determinar la presencia o la concentración de
bacteriófagos de la solución, a partir de dicho valor de cambio de
capacitancia mediante la correspondiente curva de calibración que
correlaciona dicho valor de cambio de capacitancia con la
concentración de bacteriófagos de la solución.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que;
- la adhesión bacteriana de la etapa a)
comprende la formación de un biofilm (4) bacteriano de por lo menos
una de dichas cepas huéspedes, sobre la superficie de dicho
electrodo (2),
- la etapa e) comprende la determinación del
valor del cambio de capacitancia (Cb) del biofilm adherido sobre el
electrodo (2), siendo dicha capacitancia (Cb) el parámetro del
circuito eléctrico equivalente que modela en la interfase dicho
biofilm (4),
y por el hecho de que en la etapa f) se
determina la presencia o concentración de bacteriófagos a partir
del cambio de capacitancia (Cb) de dicho biofilm (4), estando
correlacionado dicho cambio de capacitancia (Cb) con la degradación
de dicho biofilm (4) por efecto de la lisis.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la adhesión bacteriana de
la etapa a) comprende la funcionalización previa de la superficie
de dicho electrodo (2) mediante la adsorción de un compuesto
destinado a inmovilizar dichas bacterias sobre la superficie del
electrodo (2).
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicho electrodo (2) de trabajo está integrado en el sustrato de
material de un dispositivo micro-electrónico (1)
que comprende por lo menos otro electrodo (3) para llevar a cabo
medidas de impedancia eléctrica.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo
micro-electrónico es un chip sensor (1).
6. Sistema para detectar y/o cuantificar
bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana
predeterminada, caracterizado por el hecho de que comprende
un dispositivo micro-electrónico (1) que incluye por
lo menos dos electrodos (2,3) para llevar a cabo medidas de
impedancia eléctrica, bacterias de por lo menos una de dichas cepas
huésped, adheridas sobre la superficie de por lo menos uno de
dichos electrodos (2), y medios de procesamiento y control para
determinar, en el circuito equivalente del espectro de impedancias,
el cambio de capacitancia de la interfase electrodo/bacterias,
siendo producido dicho cambio de capacitancia por efecto de la lisis
de las bacterias adheridas sobre el electrodo (2), al ser dichas
bacterias infectadas por bacteriófagos.
7. Sistema según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que dichas bacterias forman
parte de un biofilm (4) bacteriano adherido sobre la superficie de
dicho electrodo (2) y por el hecho de que dichos medios de
procesamiento y control determinan el cambio de capacitancia (Cb)
del parámetro del circuito eléctrico equivalente que modela en la
interfase dicho biofilm (4), estando correlacionado dicho cambio de
capacitancia (Cb) con la degradación del mismo biofilm (4) por
efecto de la lisis bacteriana.
8. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, caracterizado por el hecho de que
dicho dispositivo micro-electrónico es un chip
sensor (1).
9. Dispositivo micro-electrónico
sensor que comprende por lo menos un par de electrodos (2,3) para
medir cambios de impedancia eléctrica, caracterizado por el
hecho de que comprende un biofilm (4) bacteriano adherido sobre la
superficie de por lo menos uno de dichos electrodos (2),
perteneciendo las bacterias de dicho biofilm (4) a una cepa huesped
susceptible de ser infectada por bacteriófagos de especificidad
predeterminada a dicha cepa.
10. Dispositivo según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo
micro-electrónico es un chip sensor (1).
11. Uso de un dispositivo
micro-electrónico sensor (1) que comprende por lo
menos un par de electrodos (2,3) integrados en un sustrato de
material, para detectar y/o cuantificar, mediante espectroscopia de
impedancia electroquímica, bacteriófagos susceptibles de infectar
una cepa huésped bacteriana predeterminada.
12. Uso de un dispositivo según la
reivindicación 11, en el que dicho dispositivo es un chip sensor
(1).
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
11 y 12, en el que dicho dispositivo o chip sensor comprende un
biofilm (4) bacteriano adherido sobre su superficie, siendo las
bacterias de dicho biofilm (4) de por lo menos una de dichas cepas
huésped.
14. Procedimiento según la reivindicación 1,
sistema según la reivindicación 6, dispositivo
micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso
de dicho dispositivo micro-electrónico según la
reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son colifagos
somáticos o bacteriofagos susceptibles de infectar cepas de
Escherichia coli.
15. Procedimiento según la reivindicación 1,
sistema según la reivindicación 6, dispositivo
micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso
de dicho dispositivo micro-electrónico según la
reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son bacteriófagos
susceptibles de infectar cepas de bacterias lácticas.
16. Procedimiento según la reivindicación 1,
sistema según la reivindicación 6, dispositivo
micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso
de dicho dispositivo micro-electrónico según la
reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son bacteriófagos
susceptibles de infectar cepas de Pseudomonas putida.
17. Procedimiento según la reivindicación 1,
sistema según la reivindicación 6, dispositivo
micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso
de dicho dispositivo micro-electrónico según la
reivindicación 11, en el que la solución de material a analizar
procede de una muestra de agua.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200800776A ES2325825B1 (es) | 2008-03-17 | 2008-03-17 | Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriofagos susceptibles de infectar una cepa huesped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectronico sensor para detectar dichos bacteriofagos y dispositivo microelectronico sensor para llevar a cabo dicho. |
| PCT/ES2009/070066 WO2009115633A1 (es) | 2008-03-17 | 2009-03-17 | Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento. |
| US12/922,882 US20110053144A1 (en) | 2008-03-17 | 2009-03-17 | Process and system for detecting and/or quantifying bacteriophages capable of infecting a predetermined bacterial host strain, use of a microelectronic sensor device for detecting said bacteriophages and microelectronic sensor for carrying out said process |
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