ES2256165T3 - Metodos y equipos de reactivos empleados para la determinacion de proteina cinasa. - Google Patents

Abstract

Método para medir la actividad de la proteína cinasa, dicho método comprendiendo: a) Proveer una primera solución que contenga ATP, una proteína cinasa que será objeto del ensayo y un substrato susceptible de ser foforilado por dicha proteína cinasa y una segunda solución que contenga ATP en ausencia de la citada proteína cinasa que será objeto del ensayo y un substrato susceptible de ser fosforilado por dicha proteína. b) Medir, mediante una reacción de bioluminiscencia, la concentración de ATP y/o ADP o de la tasa de cambio de la misma con respecto al tiempo, en cada una de las mezclas de reacción constituidas en la etapa a). c) Usar de la información sobre la concentración de ATP y/o ADP para determinar la actividad de la proteína cinasa objeto del ensayo.

Description

Métodos y equipos de reactivos empleados para la determinación de proteína cinasa.

La presente invención describe los métodos empleados en la detección de la actividad de la proteína cinasa así como los equipos de reactivos utilizados para llevar a cabo dichos métodos.

Las proteínas cinasa desempeñan un papel determinante en la modulación de una amplia variedad de procesos celulares. Estas enzimas actúan transfiriendo residuos fosfatados a ciertos aminoácidos en polipéptidos intracelulares para provocar la activación de estos sustratos proteínicos y desencadenar una sucesión de procesos de activación determinantes que incluyen el crecimiento, diferenciación y división de las células. Las proteínas cinasa han sido objeto de amplios estudios en el campo de la biología tumoral. Se cree que la actividad descontrolada de estas proteínas en las células es la responsable de la formación de tumores. La industria farmacéutica dedica constantes esfuerzos a la búsqueda de drogas destinadas a frenar esta actividad descontrolada con el objetivo de encontrar tratamientos para una amplia variedad de tumores. Existen, al menos, 1.200 tipos de proteínas cinasa que intervienen en la regulación de las funciones celulares, actuando como enzimas citosólicas implicadas en los mecanismos de transferencia a través de la membrana celular y como fosforiladores de residuos de aminoácidos de serina, treonina y tirosina. Basándose en esta especificidad del substrato, las proteínas cinasa se clasifican en dos grupos: cinasa serina/treonina y cinasa tirosina. Esto ha dado lugar al desarrollo de un gran número de técnicas basadas en la capacidad de estas proteínas para captar un grupo fosfato y adherirlo a una proteína/péptido.

Una de las técnicas más empleadas es la de los radio-isótopos, basada en la utilización de fosfatos gamma ^{32}P o ^{33}P. En presencia de una cinasa activa, el fosfato marcado es trasferido desde el ATP a la proteína o sustrato péptido. Estos ensayos deben realizarse en presencia de ATP, marcado para un tipo de actividad muy específica. Esto resulta de mantener la concentración de ATP sin marcar dentro de los rangos de concentración micro molar. Con el fin de alcanzar el grado de sensibilidad requerido, el sustrato péptido debe emplearse en altas concentraciones (5-20 \muM). La creciente radioactividad de las fosfoproteínas resultantes puede detectarse mediante contadores de centelleo tras ser depositadas en papel de fosfocelulosa.

Otros métodos emplean procedimientos de inmunoprecipitación. Durante esto ensayos, tiene lugar la reacción entre la proteína cinasa, el ATP y el substrato, reacción que es detenida posteriormente empleando una solución tampón, tal como la descrita por Laemmli. La proteína se separa mediante electroforesis SDS/PAGE, el gel se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y se sonda el substrato fosforilado, empleando para ello un anticuerpo adecuado para el tipo de aminoácido elegido. La banda fosforilada se puede visualizar empleando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano, empleando posteriormente un sistema de detección quimioluminiscente y exposición sobre un film fotográfico. Sin embargo, al igual que ocurre en muchos de los métodos propuestos como alternativa a los ensayos mediante radioisótopos, la técnica de transferencia Western anterior carece de sensibilidad y resulta bastante laboriosa.

La utilización de detección luminiscente, ya sea por bioluminiscencia como por quimioluminiscencia, permite conseguir un sistema de detección de alta sensibilidad. En Lehel et al. (1997) Anal. Biochem. 244, 340-346 ya se publicó un ensayo realizado en una placa de microtitulación quimioluminescente para la detección de actividad de la proteína cinasa. Este ensayo está basado en la utilización de péptidos del substrato biotinilados capturados en una microplaca revestida de estreptavidim, junto con anticuerpos monoclónicos. Los autores escogieron la proteína cinasa A (PKA) para realizar el ensayo pero también encontraron resultados fiables en el caso de la proteína cinasa C (PKC) escogida, proteína cinasa II calcio/calmodulin dependiente, proteína receptora y genes inductores de sarcoma. Estos ensayos se llevaron a cabo en presencia de ATP 20 \muM y la cinasa de interés +/- el inhibidor y se procedió a la realización completa de la reacción de la cinasa. Las placas se lavaron antes de la unión del anticuerpo y de la detección por quimioluminiscencia con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano con quimiluminescencia determinada utilizando un equipo de reactivos del substrato quimioluminiscente Tropix (RTM) (EE. UU). Este ensayo continúa basándose en la disponibilidad de sustratos específicos y también de anticuerpos para las fosfoproteínas generadas.

Otra aproximación que se ha realizado consiste en emplear la tecnología de los microchips. En Choen et al (1999) Anal. Biochem. 273, 89-97 se publicó un ensayo, basado en técnicas fotolitográficas, para la determinación de la PKA. Realizando en un chip una separación electroforética del sustrato péptido marcado mediante fluorescencia y del producto empleado para la determinación del movimiento del grupo fosfato desde el ATP al residuo de serina del heptapéptido (kemptide). Esta tecnología se desarrolló para la detección de la actividad de la PKA.

En Eu et Al (1999) Anal. Biochem. 271, 168-176 se describe un método en el que se emplea la técnica de bioluminiscencia para medir la cantidad de ATP, demostrándose que dicha cantidad está relacionada con la cantidad de substrato (galactosa) presente en una muestra de orina.

En Lundin et al (US 4, 246, 340) se hace referencia a una mejora del proceso para la determinación de la concentración de ATP en donde la concentración se mide mediante la técnica de bioluminiscencia.

En Jubin et al (US 5, 759, 795) se hace referencia a los materiales y métodos empleados para identificar los inhibidores de la proteína ATPase del virus de la hepatitis C (NS3) mediante bioluminiscencia.

Sala-Newby & Campbell (1992) FEBS Lett 307, 241-244 describen la utilización de la luciferasa de luciérnaga manipulada para contener proteínas recombinantes capaces de reconocer la proteína cinasa A y para la falta de señal de peroxisomal terminal-C de la luciferasa nativa. La luciferasa mutante se expresó en células COS y se utilizó para detectar y cuantificar la activación de la PKA mediante AMP cíclico en dichas células.

Se observará que el método anterior es sumamente específico y solo resulta útil en los casos de activación de PKA mediante AMP cíclico. Por ello, plantea los mismos problemas que los sistemas de detección de proteína cinasa descritos anteriormente y basados en las enzimas y substratos específicos con los que reaccionan.

No existen ensayos que permitan determinar la actividad de la proteína cinasa sin tener en cuenta la familia de proteínas cinasa de la que proceden o los residuos de aminoácidos que son fosforilados. Ello se debe al hecho de que todos los métodos de que se dispone actualmente se centran en las enzimas específicas y en los substratos implicados.

El objetivo de la presente invención es proporcionar métodos de medida de la actividad de la proteína cinasa que no son específicos de un único tipo de proteína cinasa sino que se pueden utilizar en general para medir la actividad de una amplia gama de proteína cinasa.

La presente invención proporciona un método para medir la actividad de la proteína cinasa.

Dicho método comprende:

a) una primera solución compuesta por ATP, la proteína cinasa que va a ensayarse y una segunda solución que incluya el ATP en ausencia de la citada proteína cinasa que también va a ensayarse.

b) adicción de un substrato susceptible de ser fosforilado por la proteína cinasa que va a ensayarse en caso de la primera y segunda soluciones del paso a)

c) medida de la concentración de ATP y/o de ADP, o bien de la variación de éstos con respecto al tiempo, en cada una de las mezclas de reacciones formadas en el paso b), empleando una reacción de bioluminiscencia.

d) utilización de la información disponible acerca de la concentración de ATP y/o ADP para determinar la actividad de la proteína cinasa objeto de ensayo.

Es recomendable que la proteína cinasa sea activada mediante fosforilación con anterioridad a la etapa a). Las proteínas cinasa participan en cascadas de señales intracelulares muy complejas. Mediante la unión de un agonista a un receptor de membrana celular se desencadenan muy rápidamente una serie de procesos de fosforilación. En el caso de células inactivas, existe un cierto número de proteínas cinasa que se encuentran en su forma inactiva y deben ser sometidas a tratamiento de fosforilación para permitir que estas enzimas fosforilen sus substratos. Por efecto dominó, la activación de un componente en una etapa del proceso puede llegar a proporcionar una gran amplificación de la señal. Por ejemplo, la Raf es una cinasa de serina/treonina que fosforila y activa la MEK (cinasa MAPK). Ésta, a su vez, es una cinasa dual de tirosina/treonina que, a su vez, activará la MAPK (ERK-1 y ERK-2) mediante fosforilación de los residuos de tirosina y treonina. Las MAPK son sucesivamente activadas de modo que pueden fosforilzar sus substratos (p. ej. la proteína básica de la mielina).

Las proteínas cinasa se encuentran disponibles comercialmente en su forma activa (ya fosforiladas) o en su forma inactiva. Esta última requiere fosforilación mediante otra proteína cinasa que se encontraría situada en una etapa previa del proceso de transducción de la señal.

Dado que los métodos utilizados en esta invención no son selectivos para determinados tipos de proteína cinasa (p. ej. serina/treonina frente a tirosina) pueden emplearse para controlar la activación etapa por etapa de todas las proteínas cinasa en una etapa en particular, por ejemplo midiendo la disminución de la cantidad de ATP observado cuando la MEK fosforila ERK-1, que sucesivamente fosforila la proteína básica de la mielina.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína cinasa, dicho método comprende:

a) una primera solución compuesta por ATP, una proteína cinasa y el compuesto que va a ensayarse, y una segunda solución que contenga el ATP y la proteína cinasa en ausencia del citado compuesto.

b) adicción de un substrato susceptible de ser fosforalizado por la citada proteína cinasa para la primera y segunda soluciones del apartado a)

c) medida de la concentración de ATP y/o ADP, o de la variación de estos con respecto al tiempo, en cada mezcla formada en la etapa b) utilizando una reacción de bioluminiscencia.

d) utilización de la información sobre la concentración de ATP y/o ADP para determinar la actividad de la proteína cinasa en las soluciones primera y segunda.

e) comparación de la actividad de la proteína cinasa en la solución primera con la actividad de la citada proteína en la solución segunda con el objetivo de identificar los compuestos que modulan la actividad de una proteína cinasa a través de los cuales el compuesto objeto del ensayo se identifica como modulador de proteína cinasa en caso que la actividad de la proteína cinasa de la solución primera sea diferente a la de la proteína cinasa de la segunda solución.

Entre las posibles combinaciones de cinasa/substrato que se utilizan en los métodos de esta invención caben citarse las siguientes JNK-1/c-jun, JNK-2/c-jun, cinasa-1 MAP (ERK-1)/ proteína básica de la mielina, cinasa-2 MAP (ERK-2)/ proteína básica de la mielina, PKA/kemptide, MEK-1/ cinasa-2 MAP inactiva (ERK-2), JNK2\alpha2/ATF-2, JNK2\alpha2/c-jun, SAPK-3/ proteína básica de la mielina, SAPK-4/ proteína básica de la mielina y raf-1/ MEK-1 inactivo.

Por "modulación" se entiende que la actividad de la proteína cinasa se incrementa, disminuye o se impide/inhibe en presencia del compuesto de ensayo. De este modo, los métodos de la invención pueden utilizarse para determinar si un compuesto es un inhibidor o un activador de una proteína cinasa determinada.

El compuesto que va a ser sometido al ensayo se identifica como un inhibidor de la proteína cinasa en caso que la actividad de la cinasa en la primera solución sea menor que la actividad de la cinasa en la solución segunda. En aquellos casos en los que la actividad de la proteína cinasa de la primera solución se encuentre por debajo del 90% de la actividad de la cinasa de la solución segunda, el compuesto que va a ser sometido al ensayo se identifica como un inhibidor de la proteína cinasa. Con mayor precisión se identifica dicho compuesto como un inhibidor de la proteína cinasa en aquellos casos en los que la actividad de la cinasa de la primera solución sea inferior al 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% de la actividad de la cinasa de la segunda solución. Pero el menor error se comete cuando se identifica el compuesto como un inhibidor de la proteína cinasa en los casos en los que la actividad de la cinasa en la primera solución sea inferior al 50% de la actividad de la cinasa en la segunda solución.

Asimismo, el compuesto a ensayar se identifica como un activador de proteína cinasa si la actividad de la cinasa de la primera solución es mayor que la actividad de la cinasa de la segunda. En aquellos casos en los que la actividad de la proteína cinasa de la primera solución sea más de un 10% superior a la de actividad de la cinasa de la solución segunda, se identifica el compuesto que va a ser sometido al ensayo como un activador de la proteína cinasa. En cambio, se identifica dicho compuesto como un inhibidor de la proteína cinasa en aquellos casos en los que la actividad de la cinasa de la primera solución sea más de un 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% ó 200% superior a la de la actividad de la cinasa de la segunda solución. Pero el menor error se comete al identificar el compuesto como un activador de la proteína cinasa en los casos en los que la actividad de la cinasa en la primera solución sea, al menos, un 50% superior a la actividad de la cinasa en la segunda solución.

Es recomendable que las soluciones primera y segunda de la etapa a) de los métodos propuestos por la invención se encuentren libres de células.

Las etapas de a) a b) del método según el segundo aspecto de la invención pueden repetirse una o más veces utilizando cada vez un tipo de cinasa diferente y su correspondiente substrato.

Los compuestos que incrementan la actividad de una proteína cinasa pueden ser útiles en medicina, especialmente en el estudio de diversos tipos de cáncer, y como agentes terapéuticos. Aquellos compuestos que disminuyen o impiden/inhiben la actividad de una proteína cinasa pueden también ser de utilidad en tales aplicaciones.

Es recomendable emplear una solución tampón en el caso de las soluciones primera y segunda, preferiblemente la solución tampón Hepes.

Se recomienda que las etapas de a) a c) se lleven a cabo de manera consecutiva.

Las personas que estén familiarizadas con este campo apreciarán que, después de la adicción del substrato en la etapa b), la reacción puede proseguir durante un cierto tiempo y a diferentes temperaturas antes de llegar a la etapa c). Se recomienda que, tras la adicción del substrato en la etapa b), se deje que reaccione la mezcla durante 10 minutos a 30ºC previamente a la etapa c). También es conveniente que, tras la adicción del substrato en la etapa b), la mezcla se deje reaccionar durante 10 minutos a 30ºC o durante 1 hora, a temperatura ambiente, previamente a la etapa
c).

La etapa c) de los métodos de la presente invención constan principalmente de:

i)

adicción de un reactivo bioluminiscente que consta de luciferín o de un derivado del mismo y una luciferasa para formar la mezcla. El luciferín o su derivado y la luciferasa emiten una señal luminosa en el transcurso de una reacción de bioluminiscencia en presencia de ATP.

ii)

medida de la intensidad luminosa emitida como resultado de la reacción bioluminiscente, o su variación con respecto al tiempo, como medida de la concentración de ATP.

El reactivo bioluminiscente empleado en la etapa c) puede ser cualquiera del tipo general luciferín/luciferase. El substrato activo es D-luciferín o un derivado del mismo. La patente estadounidense nº 5.374.534 indica los derivados del D-luciferín que pueden utilizarse junto con la luciferasa en los métodos de la presente invención. También se puede utilizar cualquier otro derivado.

La enzima luciferasa se obtiene principalmente de modo natural, especialmente de luciérnagas y más concretamente de Photinus pyralis. Sin embargo, la fuente de luciferasa no es crítica, siempre que reaccione con luciferín (o un derivado del mismo) y ATP en una reacción de bioluminiscencia. Como ejemplos cabe citar las luciferasas procedentes de Luciola cruciata, Diptera spp. y Coleoptera spp.

La sintética, por ejemplo, que recombina luciferasa, se puede utilizar en la invención. Se describe en Devine et al. (1993) Biochemica et Biphysica Acta 1173, 121-132, en la patente europea nº 0.301.541 y en la patente estadounidense nº 5.583.024.

Las luciferasas mutantes también pueden utilizarse en los métodos de la presente invención. (Véase más adelante).

Lo más recomendable es que el método incluya una etapa más b') (posterior a la etapa b) y anterior a la c)) y que consiste en la adicción de un reactivo a la mezcla formada en e la etapa b) y que detiene la reacción de la cinasa con el substrato.

Existe un cierto número de ácidos que son adecuados para su utilización como reactivo de parada por ejemplo los ácidos empleados habitualmente en los laboratorios, tales como el ácido fosfórico. También se puede utilizar alternativamente altas concentraciones de EDTA/EGTA. La luciferasa es más resistente que otras enzimas a los efectos de los EDTA/EGTA y su efectividad, empleada junto con altas concentraciones de estas sales, aumenta si se utilizan enzimas de luciferasa mutantes. Además, es posible utilizar cualquier otra solución tampón conocida capaz de detener las reacciones enzimáticas.

El reactivo de parada empleado es preferiblemente ácido fosfórico, EDTA o EGTA.

La utilización de un reactivo de parada resulta particularmente ventajosa ya que permite preparar y guardar una gran cantidad de muestras que se ensayarán posteriormente, lo cual constituye una gran ayuda para las aplicaciones de la invención a gran escala (véase más abajo).

El método empleado contempla, ventajosamente, la adición de una nueva etapa b''), posterior a la b') y anterior a la c) y que consiste en realizar el ajuste del pH de la mezcla formada en la etapa b') a un pH al cual la enzima luciferasa es activa, normalmente a pH 7,0. Ventajosamente, la etapa b'') contempla la adición de la solución tampón Hepes.

La etapa consistente en el ajuste del pH se puede evitar utilizando una luciferasa mutante que conserve la actividad requerida al pH de la solución tras la adición del reactivo de parada. También resulta muy útil utilizar una luciferasa activa a 30ºC, mejor que una luciferasa del denominado tipo salvaje que no resulte muy activa por encima de los 25ºC. Uno de los beneficios que se obtienen al utilizar mutantes de luciferasa termoestable, además de su resistencia a elevadas temperaturas, es que los aminoácidos clave con la enzima pueden sufrir mutaciones de modo que adquieran otras propiedades favorables que potencien la actuación de la enzima, incluyendo la resistencia a pH bajos y altas concen-
traciones de sal. Estas propiedades constituyen, por ello, una gran ayuda en caso de utilizar una solución de parada.

Se pueden obtener luciferasas mutantes válidas en la compañía japonesa Kikkoman Biochemicals.

Otros tipos de luciferasa mutantes óptimas para su utilización en los distintos métodos propuestos en esta invención aparecen en el White et al (1996) Biochem J. 319, 343-350, Squirrel et al. (1997) J. Defence Science 2, 292-297, Karp & Oler-Blom (1999) Biomolecular Engineering 16, 101-104, Branchini et al. (1999) Biochemistry 38, 13223-13230, Branchini et al. (2000) Biochemistry 39, 5433-5440, Tatsumi et al. (1996) Anal. Biochem. 243, 176-180, WO 98/46729, WO 96/22376, WO 99/02697, EP 0 449 621 B, US 5,330,906, US 6,074,859 y WO 95/18853.

Ventajosamente, la etapa c) además comprende los siguientes pasos a realizar después de que la medida de la intensidad luminosa obtenida en el paso ii) haya alcanzado un nivel significativamente constante:

iii)

adición de un reactivo que convierta el ADP en ATP.

iv)

adición de un reactivo bioluminiscente consistente en luciferin o un derivado del mismo y luciferasa a la citada mezcla de reacciones del paso iii).

v)

medida de la intensidad luminosa emitida por la reacción de bioluminiscencia resultante de donde la diferencia de la intensidad luminosa obtenida en el paso v) y la intensidad luminosa constante del paso ii) constituye una medida de la concentración de ADP que se encuentra presente en la reacción de la mezcla del paso ii).

Por "significativamente constante" se entiende que la intensidad luminosa no varía de manera importante a lo largo del tiempo en lo que respecta a la cuantía de las diferentes medidas tomadas de la intensidad luminosa. Como ejemplo, el término pretende incluir el significado de que la tasa de cambio de la intensidad luminosa emitida es inferior al 5% por minuto y preferiblemente inferior al 3% por minuto. En cualquier caso, si se tiene suficiente experiencia, es posible apreciar si el nivel es suficientemente constante para poder obtener una lectura valida del ATP producido añadiendo el reactivo convertidor de ADP que no haya sido afectado de manera significativa por cualquier cambio, aunque sea pequeño, de la línea de base del ATP.

Lo más recomendable es que las etapas b) y c) se lleven a cabo a la vez.

Cuando se tiene la suficiente experiencia es posible darse cuenta de que los métodos de la invención resultan válidos en los casos en los que se vaya a realizar un proceso de cribado a gran escala. Por ejemplo, el cribado de grandes cantidades de productos generados químicamente y derivados naturalmente para investigación de productos farmacéuticos. En estos ensayos de cribado los componentes pueden agruparse para el mismo utilizando la tecnología de placas de microvaloración.

De este modo, los métodos de la invención pueden realizarse en las placas de pequeño volumen de 384 y 1536 pocillos, además de en la placa de 96 pocillos. En estas circunstancias, cuando se emplean robots de laboratorio, los ensayos se preparan en una gran número de placas y se pueden llevar a cabo utilizando robots que se encargan de introdir las placas en un luminómetro provisto de inyectores. El resto del ensayo se realiza tal y como se ha descrito anteriormente.

Otra opción se presenta por a la larga semivida del "brillo" del haz luminoso emitido durante la reacción de bioluminiscencia. Una vez que la reacción ha llegado a un punto muerto, la intensidad luminosa emitida permanece significativamente constante, lo cual permite añadir, en lotes, el reactivo bioluminiscente a las placas. De este modo, las placas pueden leerse incluso 3 ó 4 horas después de la adición de los reactivos.

La invención, además, proporciona una herramienta que puede utilizarse en el método del segundo aspecto de la invención y que comprende:

a)

un reactivo bioluminiscente que contiene luciferin o un derivado del mismo y una luciferasa, el citado luciferin o su derivado emite un haz luminoso en el transcurso de una reacción de bioluminiscencia con la luciferasa en presencia de ATP.

b)

una cinasa.

c)

Un substrato susceptible de ser fosforilado por la citada cinasa.

d)

ATP.

Este equipo de reactivos comprende, además, uno o mas tampones para reconstituir, diluir o disolver el reactivo bioluminiscente, la cinasa, el substrato y/o el ATP.

El citado equipo de reactivos puede también incluir un reactivo capaz de detener la reacción entre la citada cinasa y el substrato, por ejemplo, el ácido fosfórico.

Un equipo de reactivos válido para utilizar en la invención puede además incluir uno o más reactivos capaces de convertir el ADP en ATP, tales como la que comprende piruvato cinasa y fosfoenol piruvato.

Es preferible emplear un equipo de reactivos que se componga de 2 o más tipos diferentes de cinasas así como de sus substratos, lo que constituye una herramienta adecuada para el cribado de los componentes que se probarán con una gran variedad de cinasas diferentes, con el fin de determinar si el componente modula la actividad de la cinasa así como la especificidad de dicha inhibición.

Un equipo de reactivos válido para ser utilizado en la presente invención puede, además, incluir una placa de microvaloración de pocillos múltiples. Este término se refiere a los aparatos que comprenden una gran variedad de recipientes de reacción o pocillos unidos formando una placa. Cada pocillo es de escaso volumen, normalmente entre 250 y 300 \mul en el caso de una placa de 96 pocillos, entre 60 y 70 \mul en una de 384 y entre 6 y 8 \mul en una de 1536. En la actualidad, las placas más utilizadas son las de 96 pocillos pero se conocen placas de 384 y 1536 pocillos que resultan de gran utilidad según la invención. Preferiblemente, el equipo de reactivos debe incluir una placa de microvaloración de pocillos múltiples que contenga 96 pocillos o más.

Lo más recomendable es que en el equipo de reactivos a utilizar en la presente invención el reactivo o reactivos se presente en forma liofilizada.

Algunos ejemplos que incluyen algunos aspectos de la invención se describirán ahora con la ayuda de ilustraciones referidas a las figuras siguientes:

Figura 1: Muestra la disminución de la eficiencia luminosa (unidades de luz relativas: RLUs) frente a la cantidad de proteína cinasa JNK-1. También se muestra la media obtenida por separado en tres experimentos \pm el error estándar de la media (SEM). Estos son los resultados obtenidos de los datos generados en presencia de solución tampón Hepes 200 mM .

Figura 2: Muestra el efecto producido por la solución tampón Hepes y la solución de parada en la eficiencia luminosa (RLUs) obtenida en presencia y ausencia de JNK activado. Los resultados se expresan como la media obtenida de dos experimentos por separado, realizados por triplicado \pm SD. Se añaden 20 \mul de agua destilada como control en lugar de la solución de parada.

Figura 3: Muestra el efecto del MAPK-1/ERK-1 cuando se produce un incremento de la cantidad de ADP. Los datos se muestran como variaciones de RLUs, previas y posteriores a la adición del reactivo de conversión. Los resultados representan la media de 6 reproducciones exactas de cada condición \pm SD.

Figura 4: Muestra el efecto de concentraciones crecientes de MAPK-1 frente a disminuciones de la eficiencia luminosa. Los resultados se expresan como la media obtenida por separado en tres experimentos llevados a cabo por triplicado \pm SEM.

Figura 5: Muestra la eficiencia luminosa inicial y la posterior disminución de la señal observada en presencia de un reactivo de control de ATP y de ATP 12 \muM utilizando soluciones tampón diferentes. Los resultados mostrados pertenecen a un experimento representativo.

Figura 6: Muestra el efecto de la actividad del JNK-2 frente a la disminución de la señal medida durante los primeros dos minutos, en presencia de un reactivo de control de ATP. Los resultados mostrados pertenecen a un experimento, representativo de tres. Los ensayos se realizaron en triplicados de pocillos de una placa blanca de microvaloración de 96 pocillos.

Figura 7: Muestra el efecto de concentraciones crecientes de MAPK-1 frente a una disminución de la señal luminosa. Este experimento también comparaba el efecto de una forma activada de la enzima frente a la forma inactivada. Los resultados se expresan como la media de tres experimentos \pm SD.

Figura 8: Muestra el efecto producido por diferentes tipos de soluciones tampón de cinasa en la eficiencia luminosa (RUL) en presencia de ATP 1 \muM. Los resultados se expresan como la media de 6 pocillos duplicados \pm SD. Para mayor información sobre la solución tampón véase la tabla 1.

Figura 9: Muestra el tiempo transcurrido frente a la reducción de la eficiencia luminosa sin adición de cinasa y el transcurrido en el caso de emplear una cinasa tipo JNK2\alpha2 utilizando ATF-2 como substrato. La detección de ADP se realizó para actuar como control confirmando la división del grupo fosfato a partir del ATP. Se emplearon para ello 50 mU de JNK2\alpha2 y 5,38 \mug de ATF-2.

Figura 10: Muestra curvas obtenidas con distintas concentraciones de JNK2\alpha2 que muestran, a su vez, las distintas variaciones que experimenta la concentración de ATP con respecto al tiempo, a una temperatura de 30ºC, como indicativo de la actividad de la cinasa. El reactivo de conversión de ADP se añadió para confirmar la presencia de ADP en la mezcla de reacción.

Figura 11: Muestra una comparación de la disminución de la señal luminosa obtenida utilizando JNK2\alpha2 con c-Jun y ATF-2 como substratos.

Figura 12: Muestra la variación respecto al tiempo de diferentes curvas obtenidas con distintas concentraciones de SAPK3 frente a la eficiencia luminosa (RUL). Las concentraciones de SAPK3 vienen dadas en nanomoles/l (nM).

Figura 13: Muestra la variación respecto al tiempo de diferentes curvas obtenidas con distintas concentraciones de SAPK4 frente a una disminución de la eficiencia luminosa (RUL), empleando MBP como substrato. Las concentraciones de SAPK4 vienen dadas en nanomoles/l (nM).

Figura 14: Muestra el efecto de concentraciones crecientes de ATP de actividad tipo JNK2\alpha2 empleando ATF-2 como substrato. Los resultados obtenidos se expresan como la media de triplicados de pocillos \pm SD.

Figura 15: Muestra el efecto de concentraciones crecientes de ATP en la actividad de SAPK3 utilizando MBP como substrato. Los resultados obtenidos se expresan como la media de triplicados de pocillos \pm SD.

Figura 16: Muestra la reducción de RUL en presencia de concentraciones crecientes de ATP para SAPK3 y MBP. Se utilizó SAPK3 728 nM con MBP a una concentración final de 100 \mug/ml.

Figura 17: Muestra una comparación del rendimiento del ensayo de la cinasa cuando se utilizan 20 \mul procedentes de un volumen de reacción mayor y cuando el ensayo se realiza directamente en los pocillos de una placa de microvaloración de 384 pocillos.

Figura 18: Muestra la activación de MAPK2 por MEK-1, seguida de la fosforilación de MBP por MAPK-2 activado previamente.

Figura 19: Muestra la correlación entre una disminución de la señal luminosa y los inmunoprecipitados del MBP fosforilado, mediante la técnica de transferencia Western. La barra sombreada de la izquierda corresponde al proceso realizado sin que exista control con MBP mientras que la zona de la derecha muestra el efecto de la actividad de SAPK3 utilizando MBP suministrado por la compañía Upstate Biotechnology (UBI).

Figura 20: Compara los resultados obtenidos durante el ensayo de bioluminiscencia de la actividad de la cinasa y los obtenidos en la transferencia Western.

Figura 21: Muestra el efecto de la estaurosporina en el sistema de detección por bioluminiscencia. Los resultados se presentan como la media de triplicados de pocillos \pmSD.

Figura 22: Muestra el efecto de dos concentraciones diferentes de estaurosporina en la actividad del JNK2\alpha2 (empleando ATF-2 como substrato).

Figura 23: Muestra el efecto de concentraciones crecientes de genistein en la actividad de MAPK-1 (empleando MBP como substrato).

Figura 24: Muestra el efecto de dos concentraciones diferentes de PD098059 en la actividad del raf-1 (empleando MEK-1 inactivo como substrato). Los resultados se expresan como la media de triplicados de pocillos \pmSD.

Ejemplos

Se han realizado une serie de experimentos que muestran el efecto de la actividad de la proteína cinasa en un sistema libre de células. Todas las proteínas cinasa y los substratos fueron suministrados por Upstate Biotechnology Inc. (UBI) Lake Placid, EE. UU. En el apéndice 1 se muestran otros posibles tipos de reactivos utilizados con composiciones diferentes.

Ejemplo 1

Determinación de la actividad de la JNK-1

Los primeros experimentos se realizaron para determinar la actividad de la JNK-1 tras la activación de esta enzima mediante otras dos cinasas: MEKK1 y MEKK4. La solución tampón de ensayo que se utilizó para la activación de estas enzimas tenía una composición equivalente a 10 veces la de una disolución stock (la composición se muestra en el apéndice 1). El ensayo tuvo lugar como sigue, con una preparación inicial de un pre-mezcla para la activación de JNK.

Se utilizó una concentración stock de enzima JNK de 1,234 mg/ml, 1 mg/ml de MEKK1 y 0,28 mg/ml de MKK4. La mezcla de activación se añadió en un tubo de polipropileno (Sarstedt) junto con 8,7 \mul de JNK, 2,5 \mul de MEKK1, 8,4 \mul de MKK4, 1 \mul de ATP 10 mM (Calbiochem, Reino Unido), 1 \mul de dithiothreitol (Sigma, Reino Unido), 5 \mul de solución tampón de ensayo 10 X y 23,4 \mul de agua destilada y se mantuvo en una incubadora durante toda la noche a temperatura ambiente. Para realizar el ensayo en condiciones reales, los 50 \mul del concentrado activado se diluyeron en 9 ml de solución tampón de ensayo JNK a la concentración de trabajo (p. ej. razón de dilución 1:10). El substrato empleado era GST-c-jun a una concentración de 8,61 mg/ml. A continuación, se diluyeron 12 \mul de GST-c-jun en 1545 \mul de solución tampón de dilución del ensayo, de alta capacidad amortiguadora. Cada etapa del ensayo se llevó a cabo en triplicados de pocillos de una placa blanca y opaca de microvaloración de 96 pocillos (Dynex). A cada pocillo se añadieron 15 \mul de la mezcla del substrato, seguida de 30 \mul de la enzima JNK activada. Se desencadenó la reacción a temperatura ambiente durante una hora y se detuvo mediante la adición de 20 \mul de ácido fosfórico al 2% (Sigma, Reino Unido). A uno de los conjuntos de triplicado de pocillos se le añadieron 135 \mul de solución tampón Tris-acetato pH 7,75 (véase composición en apéndice 1), a otro conjunto de triplicados de pocillos se le añadieron 135 \mul de solución tampón Hepes 200 mM pH 7,75 (véase composición en apéndice 1). Posteriormente, se añadieron en cada pocillo 20 \mul de reactivo de control de ATP (véase composición en apéndice 1). Tras ello, se introdujo la placa inmediatamente en un luminómetro Microbeta (RTM) Jet (Perkin-Elmer Life Sciences) y la eficiencia luminosa se determinó transcurrido 1 segundo. La figura 1 muestra la caída de la eficiencia luminosa registrada en presencia de cinasa.

Solución de parada

Estos experimentos se llevaron a cabo con un 2% de ácido fosfórico para detener la acción de la cinasa una vez transcurrido un tiempo prefijado. Una ventaja que presenta en particular la utilización de una solución de parada (es decir, cualquier reactivo capaz de detener la acción de la cinasa y el substrato que fosforiliza) es que es posible crear y almacenar una gran cantidad de muestras antes de que sean probadas en los métodos de la invención. Esta característica constituye un beneficio adicional en el caso de aplicaciones de cribado a gran escala. Uno de los problemas que presenta la utilización de la solución de parada es que una reducción del pH produce un efecto adverso sobre la enzima luciferasa, con lo que debe existir una capacidad tampón suficiente cuando se realice la medida del ATP. En las primeras series de experimentos, los resultados obtenidos con la solución tampón Hepes al contrarrestar los efectos del ácido fosfórico, resultaron ser mucho mejores que con cualquier otro tipo de solución tampón. Los experimentos se realizaron empleando concentraciones crecientes de Hepes y mostraron que la solución tampón 200 mM hizo que el pH en el pocillo recuperase el valor de 7,0 permitiendo, de este modo, que la reacción entre luciferasa y luciferín avanzara sin necesidad de reactivar la cinasa. La solución tampón Tris-acetato resultó ser menos eficaz y continuaba existiendo diferencias en los RUL registrados en presencia de la enzima cinasa, sin embargo, no eran tan acusadas como en caso de utilizar solución tampón Hepes. Los resultados obtenidos con Hepes daban valores menores para el RUL que en caso de no utilizar esta solución tampón pero esta aproximación sí que permitió controlar la actividad de la cinasa antes de que se pudiese detectar mediante la reacción entre luciferasa y luciferín. Como resultado, la mayor parte de los experimentos que figuran a continuación se realizaron con solución tampón Hepes 200 mM, como solución tampón de dilución, a menos que se indicase lo contrario. La figura 2 muestra los datos obtenidos en dos experimentos diferentes así como los resultados obtenidos utilizando una solución de parada compuesta por ácido fosfórico y la solución tampón Hepes.

Cuando se tiene la suficiente experiencia, se puede evitar el uso de una solución tampón, tras la adición de una solución de parada, utilizando luciferasas mutantes de pH y contenido salino constante. Es, asimismo, preferible utilizar luciferasas mutantes termoestables a una temperatura de 30ºC frente a luciferasas de tipo salvaje, que no son muy activas por encima de 25ºC. Es posible obtener mutantes adecuados de una gran variedad de fuentes. Por ejemplo, los mutantes de pH y contenido salino constante y termoestables se pueden adquirir en Kikkoman Biochemicals (Japón) (véanse párrafos anteriores).

Ejemplo 2

Determinación de la actividad de MAPK-1/ERK-1

Para confirmar el control/seguimiento de la actividad de la cinasa mediante el método anterior de la invención, se podrían utilizar otras enzimas que separasen el fosfato del ATP y otros tipos de cinasas que son importantes en transducción de señales y empleadas como objetivos en descubrimiento de nuevas drogas.

La actividad de la cinasa-1 MAP/ERK-1 se investigó en presencia de proteína básica de la mielina tal como un fosfoaceptor. Esta enzima la suministró UBI en su forma activa a una concentración stock de 25 \mug en 250 \mul. A continuación, se añadieron 10 \mul de solución tampón de dilución utilizado en el ensayo (UBI, véase composición en apéndice 1) a los triplicados de pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos de paredes blancas (Dynex). A ésta se añadieron 10 \mul de MAPK1 y 10 \mul de proteína básica de la mielina (UBI, 2 mg/ml), más 10 \mul de mezcla de ATP (UBI, véase composición en apéndice 1). La placa se selló y se inició la reacción durante 10 minutos a 30ºC. Tras este tiempo, se añadieron a los pocillos 110 \mul o bien de la solución tampón de dilución empleada en el ensayo, o bien de la solución tampón Hepes, seguidos de 20 \mul de reactivo de control de ATP reconstituido en solución tampón Hepes 200 mM. Los resultados muestran una disminución de la eficiencia luminosa con esta enzima, en presencia de su substrato. Al utilizar la solución tampón UBI se produjo una caída en los RLU desde 77367 hasta 35578 mientras que con la solución tampón Hepes la caída fue desde 91256 hasta 73424.

Detección basada en un aumento del ADP

Con este experimento también es posible determinar si sería posible detectar cualquier aumento de ADP con la conversión de ADP en ATP, mediante la adición de 20 \mul de un reactivo de conversión de ADP que contenga piruvato cinasa (véase composición en apéndice 1). Para determinar la cantidad de ADP, se tomó una lectura después de que la señal inicial de ATP se dejase caer durante 10 minutos. En ese momento se añadió el reactivo conversor y se tomó una nueva medida 5 minutos después. Todas estas medidas se tomaron 1 segundo después de haber utilizado Microbeta (RTM) Jet (Perkin-Elmer Life Sciences). La cantidad de ADP presente estaba relacionada con la diferencia en la eficiencia luminosa registrada entre la lectura final y la realizada antes de la adición del reactivo conversor. Los datos reflejan que es posible determinar un incremento de ADP, tal y como se muestra en la figura 3.

Ejemplo 3

Determinación de la actividad de MAPK-2/ERK-2

El protocolo anterior se utilizó también para determinar el efecto de MAPK-2/ERK-2 en presencia del mismo substrato, proteína básica de la mielina. El MAPK-2 fue suministrado por UBI en una concentración de 2,5 \mug de enzima en 25 \mul de solución tampón (véase composición en apéndice 1) con una actividad específica de 662,5 U/mg, donde IU = 1 nanomol de fosfato incorporado a proteína básica de la mielina. Esta enzima se comparó con la forma inactiva, también suministrada por UBI, en una concentración de 12,5 \mug en 50 \mul. Ambas enzimas se diluyeron en la solución tampón de dilución de UBI utilizado en el ensayo para permitir la adición en cada pocillo de 25 ng de proteína en 10 \mul. La proteína básica de la mielina se añadió tal y como muestra el ejemplo anterior y se añadió también la solución tampón Hepes 200 mM a los pocillos antes de la adición del reactivo de control de ATP. El ensayo se realizó en triplicado de pocillos y dio unos valores del RLU de 10075 \pm339 para la enzima inactiva que resultaron ser muy parecidos a los de la eficiencia luminosa obtenida en los controles realizados sin presencia de enzimas (11440\pm1372). Los RLU correspondientes a la enzima activa mostraban una caída del ATP, tras un proceso de incubación de 10 minutos, de 7008\pm430. También fue posible detectar un aumento de los RLU después de la adición de reactivo conversor de ADP en la muestra activa de 5272, comparado con el valor 441 obtenido con la enzima inactiva.

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Ejemplo 4

Efecto de la concentración de cinasa en la reducción de ATP

Con el fin de determinar si ha habido un efecto dependiente de la concentración de la actividad de la cinasa en la reducción de ATP, se utilizó MAPK-1 en concentraciones que oscilan entre 1,56 ng/10 \mul y 100 ng/10 \mul, con diluciones dobles en serie de las concentraciones más altas. La concentración de proteína básica de la mielina utilizada era la misma que en los experimentos anteriores. Los ensayos se realizaron de igual modo que los dos experimentos anteriores, p.ej. utilizando reactivos UBI pero con la adición de 110 \mul de solución tampón Hepes 200 mM antes de las lecturas de ATP. Los resultados mostraron una disminución de los niveles de ATP detectados en función de la concentración con concentraciones crecientes de MAPK-1. No se produjo ningún efecto de la enzima cuando se añadieron 1,56 ng a cada pocillo, no obstante, sí que hubo un efecto considerable a concentraciones de 3,13 ng y superiores (véase figura 4).

Ejemplo 5

Efecto de la concentración de ATP en la disminución de la señal: influencia del tipo de solución tampón

La enzima luciferasa en sí misma es un ATPase que convierte ATP en AMP y fosfato inorgánico. Después del incremento inicial de la eficiencia luminosa como resultado de la reacción entre luciferín y luciferasa, la señal luminosa comienza a caer con el transcurso del tiempo. Examinamos esta caída con concentraciones crecientes de ATP hasta una concentración 200 \muM de los experimentos mencionados anteriormente. Los ATP estándares (Sigma, Reino Unido) se diluyeron en diluciones dobles en serie desde concentraciones 200 \muM hasta 3,125 \muM por 10 \mul añadidos a cada pocillo. Los estándares se diluyeron en tres soluciones tampón diferentes, una solución tampón de dilución de UBI, una solución tampón Tris-acetate (pH 7,75) y 200 mM de Hepes de pH 7,7. Se añadieron 10 \mul de los estándares, además de una solución tampón de control sin ATP a los triplicados de pocillos de una placa blanca y opaca de microvaloración de 96 pocillos. Los experimentos se realizaron con placas en duplicado, una en la que se añadieron a los pocillos 140 \mul de solución tampón Tris-acetato y otra en la que se añadió el mismo volumen de solución tampón Hepes 200 mM. Inmediatamente después de añadir estos reactivo, se añadieron a los pocillos 20 \mul de reactivo de control de ATP. Entonces, se situó la placa en un luminómetro MPL2 de un sistema de detección Berthold (RTM) y el programa estaba ya listo para tomar una segunda lectura integral de cada pocillo en intervalos de 2 minutos. El gráfico de la figura 5 muestra la eficiencia luminosa inicial (en tiempo 0) y la disminución observada de la señal luminosa empleando diferentes soluciones tampón y el ATP 200 \muM (concentración final en el pocillo de 12 \muM).

Ejemplo 6

Efecto del reactivo luciferín-luciferasa (AMR) en el ensayo de cinasa: detección de la actividad de la cinasa como caída en la señal luminosa

Los experimentos se llevaron a cabo también con el fin de investigar el efecto del ensayo de cinasa en presencia de reactivo luciferín-luciferasa (AMR) y su efecto en la tasa de reducción de la señal. La enzima utilizada fue JNK-2 (Upstate Biotechnology Inc, EE. UU) en concentración de 1 \mug por cada 10 \mul añadidos a cada pocillo, se añadió también, en idéntica concentración, el substrato c-jun (1-169)-GST (Upstate Biotechnology Inc, EE. UU). En cada pocillo se añadieron 10 \mul de ATP estándar 200 \muM y 10 \mul de solución tampón Hepes 200 mM. En los pocillos de control se remplazaron los 10\mul de enzima por 10 \mul de solución tampón Hepes, una vez que todos los reactivos activos estaban en los pocillos y se hubieron añadido 120 \mul de solución tampón Hepes de dilución, se procedió a añadir 20 \mul de AMR con lo que se observó que la disminución de la señal se producía cada 20 segundos en períodos de 2 minutos, utilizando un luminómetro MPL2 de un sistema de detección Berthold (RTM). Se tomó una lectura integral de 1 segundo cada período de tiempo establecido. Los datos ponían en evidencia un incremento de la tasa de disminución de la señal en presencia de la enzima JNK-2, tal y como aparece en la figura 6. Todo ello muestra que la actividad de la cinasa también puede detectarse como una caída brusca de la señal luminosa, en ausencia de una solución de parada.

Ejemplo 7

Comparación entre las formas activa e inactiva de la cinasa

También se compararon las formas activa e inactiva de MAPK-1 y MAPK-2 y se obtuvo una actividad reducida de la cinasa con las formas inactivas de las enzimas. Aunque en algunos casos sí que parecía existir una cierta cantidad de autofosforilación, ésta no era significantemente diferente de la obtenida en los controles realizados sin enzimas. Una curva de concentración correspondiente a MAPK-1 inactivo frente a la forma activada mostraba claramente cómo la actividad de la cinasa de la enzima reducía la cantidad de ATP y, por ello, acentuaba la caída de la señal. El experimento se realizó tal y como se detalla en el ejemplo 3, sin embargo, en este caso la cinética de la reacción se investigó durante los 6 primeros minutos de la reacción. De la figura 7, se observa que concentraciones de 100 ng de MAPK por cada 10 \mul (588 ng/ml de concentración final) dieron un aumento significativo en el porcentaje de disminución de la señal durante 6 minutos. El ensayo se realizó por triplicado en 3 experimentos diferentes. Nada más añadir el AMR se realizó una nueva lectura de la placa en intervalos de 1 segundo cada 6 minutos, mediante un luminómetro de Labsystems Luminoskan (RTM).

Un efecto parecido se observó con la fosforilación del MAPK-2 por MEK-1. En esta serie de experimentos se utilizó MEK-1 a concentraciones finales en el pocillo comprendidas entre 75 \mug/ml y 375 \mug/ml por adición de 1-5 \mul de enzima de stock a razón de 5U/50 \mul. La actividad indicada por el Upstate Biotechnology Inc era de 7850 U/mg donde 1 unidad activará, como máximo, 1 unidad de MAPK-2 inactivo. El MAPK-2 inactivo se añadió a cada pocillo en volúmenes de 10 \mul para dar una concentración final de 5,88 \mug/ml. De nuevo, en presencia de ATP 200 \muM y solución tampón Hepes se produjo un aumento de la caída de la señal dependiente de la concentración del 14% en el control hasta el 36% para el máximo valor de concentración utilizado.

Ejemplo 8

Efecto de diferentes buffers cinasa

Es posible encontrar multitud de soluciones tampón diferentes que se emplean para realizar ensayos de cinasa, por ello, se decidió probar el reactivo de detección de ATP con estas soluciones tampón para asegurar que el ensayo se llevaba a cabo independientemente de los constituyentes de la misma. El motivo de emplear estas soluciones tampón es proporcionar unas condiciones óptimas para la reacción de la cinasa en presencia de ATP y proteína/substratos péptidos. La figura 8 muestra el efecto de 13 soluciones tampón diferentes, empleadas comúnmente en ensayos de proteína cinasa. Los constituyentes de la solución tampón se muestran en la tabla 1.

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TABLA 1

Soluciones	Constituyentes de la solución tampón	Tipos de cinasas en las que se emplean
tampón Nº
0	Tris HCl 100 mM pH 7,4 con DDT 20 mM, MnCl2	Mezcla SBE (Astrazeneca)
	20 mM, 10% de Glycerol y 0,004% de Brij 35
1	MOPS 8 mM pH 7,0 con EDTA 0,2 mM y	GSK3\beta, S6K1, MAPKAP-K1b/RSK2,
	MOPS 8 mM pH 7,0 con EDTA 0,2 mM	PKA, CHK1, CHK2, MSK1 y SGK
2	Tris-HCl 50 mM pH 7,75 con 0,05% de	PKB\alpha
	2-Mercaptoetanol
3	Tris-HCl 25 mM pH 7,5 con EGTA 0,1 mM	ERK-2 SAPK2\alpha/p38 SAPK2b/p38/p32,
		SAPK3 y SAPK4
4	Sodio \beta glicerofosfato 50 mM pH 7,5	MAPKAP-K2 y PRAK
	con EGTA 0,1 mM
5	Tris-HCl 50 mM pH 7,5 con EGTA 0,1 mM y	JNK-1, ROCKII y PRK-2
	0,1% de 2-Mercaptoetanol
6	Hepes 50 mM pH 7,4 con DDT 1 mM, 0,02% de	AMPK
	Brij-35 y AMP0,2 mM . Respiratorio
7	Hepes 20 mM pH 7,4 con 0,03% de Triton X-100,	PKC\alpha
	CaCl20,1 mM , 0,1 mg/ml de fosfatidilserina y
	10 \mug/ml de 1,2-dioleoil-sn-glicerol
8	Hepes 20 mM pH 7,4 con 0,03% de Triton X-100,	PKC\delta
	EGTA0,1 mM , 0,1 mg/ml de fosfatidilserina y
	10 \mug.ml de 1,2-dioleoil-sn-glicerol
9	Hepes 20 mM pH 7,6 con NaCl150 mM, EDTA0,1	CK2
	mM , DTT 5 mM y 0,1% de Triton X-100
10	Tris-HCl 50 mM pH 7,5 con sodio \beta	PHK
	glicerofosfato y CaCl2 0,04 mM
11	Tris-HCl 25 mM pH 7,5 con EGTA0,1 mM , 0,1%	ERK2
	de 2-Mercaptoetanol y 0,01% de Brij-35

TABLA 1 (continuación)

Soluciones	Constituyentes de la solución tampón	Tipos de cinasas en las que se emplean
tampón Nº
12	Tris-HCl 50 mM pH 7,5 con 0,1% de	PDK-1
	2-Mercaptoetanol
13	Tris-HCl 50 mM pH 7,5 con CaCl2 0,1 mM, 10	MLCK
	unidades/ml de calmodulina y 0,1% de
	2-Mercaptoetanol
14	Tris-HCl 50 mM pH 7,5 con EGTA 0,1 mM y	LCK 14
	Na4Vo3 0,1 mM

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Se diluyó el ATP en cada una de las soluciones tampón y se añadieron 100 \mul en cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos, también se añadió a los pocillos 20 \mul de reactivo de detección de ATP y se detectó la eficiencia luminosa después de 1 segundo completo mediante un luminómetro Orion de un sistema de detección Berthold (RTM).

Los resultados que aparecen en la figura 8 muestran que las soluciones tampón de 0 a 9 comprometen la eficiencia luminosa, sin embargo no se alteró la sensibilidad del ensayo. Estos ensayos se llevan a cabo normalmente con concentraciones de ATP que van desde decenas hasta cientos de micromoles, p.ej. en este ejemplo se utilizó una concentración superior a 1 \muM, donde todavía fue posible detectar una eficiencia luminosa significativa con soluciones tampón que reducían la señal.

Ejemplo 9

Utilización de la solución tampón Tris-acetato en un ensayo de bioluminiscencia

Se ha comparado el resultado obtenido en el ensayo de bioluminiscencia con solución tampón Tris y Hepes. Se ha demostrado que es posible transformar el reactivo de detección de ATP en soluciones tampón de Tris-acetato a un pH de 7,75. Sin embargo, cuando se utiliza una solución ácida de parada, por ejemplo ácido fosfórico, es preferible usar la solución tampón Hepes descrita anteriormente.

Los ensayos se realizaron utilizando una gran cantidad de cinasas y substratos de diferentes tipos. Los experimentos se llevaron a cabo empleando métodos similares a los descritos para las soluciones tampón Hepes. Los ensayos se realizaron en volúmenes de 100 \mul en los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos, se añadieron a los pocillos las concentraciones adecuadas de cada enzima y substrato en la solución tampón que resulte más apropiada para ese tipo de enzima. Entonces se inició la reacción mediante la adición de ATP en concentración adecuada y continuó a 30ºC durante 10 minutos antes de la adición de 20 \mul de reactivo de detección de ATP (convertido ahora en solución tampón Tris-acetato), la eficiencia luminosa se detectó durante 1 segundo. En los ejemplos que aparecen a continuación, el porcentaje de casos en los que el reactivo de detección de ATP se convirtió en una solución tampón Tris-acetato a pH 7,75 fue superior a aquellos en los que pasó a convertirse en solución tampón Hepes.

JNK2\alpha2 con ATF 2 y c-Jun como substratos

Esta enzima se probó con los substratos péptidos ATF-2 y c-Jun suministrados por Upstate Discovery.

Solución tampón de ensayo	Tris-HCl 100 mM pH 7,4
	Dithiothreitol 20 mM
	MgCl2 20 Mm
	10% de Glycerol
	0,004% de Brij 35

Estos experimentos llevados a cabo a lo largo del tiempo se realizaron en volúmenes de 100 \mul (o 200 \mul) en probetas de plástico transparentes. La reacción se llevó a cabo bien en un baño a 30ºC bien en una incubadora.

Upstate Discovery recomienda utilizar el substrato ATF-2 en cantidades de 5 \mug por ensayo y de 20 mU en el caso del JNK2\alpha2.

ATF-2 de stock (LB018LFp107) en concentraciones de 4,3 mg/ml por cada 10 \mul alícuotas (43 \mug en 10 \mul). Se procedió a la dilución del substrato en proporción 1:8 y se añadieron 10 \mul al tubo hasta obtener una concentración final de 5,38 \mug en la mezcla de la reacción.

JNK2\alpha2 de stock (LB021SDp81) a 77 U/mg (100 U/ml) y 1,3 mg/ml divididas en volúmenes de 10 \mul alícuotas (1 U). Las curvas de concentración se realizaron añadiendo 5 \mul de enzima de stock (50 mU), 5 \mul en proporción 1:2 (25 mU), 1:4 (12,5 mU) y 1:8 (6,25 mU) por cada 100 \mul de volumen final de reacción.

ATP de stock 1 M en 10 \mul alícuotas. El ATP se diluyó en proporción 1:4 con solución tampón Tris-HCl (adicción de 390 \mul) procediéndose, posteriormente, a realizar una nueva dilución de razón 1:100 para obtener una dilución de trabajo 250 \muM. Concluido esta etapa, se añadieron 10 \mul por cada 100 \mul de volumen final de reacción, obteniéndose una concentración final 25 \muM en las probetas.

Con ello, las probetas contenían	10 \mul de substrato
	5 \mul de enzima
	10 \mul de ATP
	75 \mul de solución tampón de ensayo

Con el fin de determinar la actividad de la cinasa, se extrajeron muestras de 20 \mul de las probetas durante intervalos de 5 minutos y se añadieron a los pocillos de una placa blanca y opaca de microvaloración de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron a los pocillos 20 \mul de AMR convertido en solución tampón Tris-Acetato y se procedió a la lectura de la placa en el luminómetro durante 1 segundo.

Para determinar la capacidad de reproducirse, se preparó un gran volumen y se tomaron muestras por triplicado durante intervalos de tiempo reducidos.

La figura 9 también muestra la caída de la eficiencia luminosa con respecto al tiempo en presencia de una enzima y un substrato, comparado con el caso en que sólo exista control del substrato.

La figura 9 también muestra el efecto de la adicción de 20 \mul de reactivo de conversión de ADP que transformó en ATP el ADP formado como resultado de la actividad de la cinasa, para la detección con el reactivo de detección de ATP. La caída de la señal luminosa registrada tras extraer mediante pipeta el reactivo de conversión de ADP se debió a una disminución del pH en el pocillo tras la adicción. La figura 9 muestra claramente una caída acusada de la eficiencia luminosa en presencia de enzima y substrato comparado con el caso en que no exista control enzimático.

Tal y como aparece descrito en los métodos anteriores, el ensayo se repitió con concentraciones decrecientes de JNK2\alpha2 frente a concentraciones iguales de ATP y péptido. La figura 10 muestra los datos obtenidos desde 2,55 \muM (50 mU) hasta JNK2\alpha2 320 nM.

Además de ATF-2 también se estudió otro substrato JNK, el péptido c-Jun. Para determinar la actividad del JNK2\alpha2 con el péptido c-Jun los experimentos se realizaron utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente pero preferiblemente añadiendo 10 \mul de c-Jun frente a ATF-2.

C-Jun stock (LB023JTp72) en concentraciones de 4,83 mg/ml, por cada 805 \mul, en 10 \mul = 48,3 \mug, para utilizar aproximadamente la misma cantidad de péptido en forma de ATF-2 de nuevo en una razón de dilución de 1:9 y, posteriormente, añadir 10 \mul por probeta.

En la figura 11 se compara la caída de ATP como resultado de la actividad de la cinasa cuando se comparaban 2 substratos diferentes. Los datos confirmaban la información recibida del Upstate Discovery que el ATF-2 resultó ser un substrato más eficaz que el c-Jun para la actividad del JNK2\alpha2.

SAPK-3 y proteína básica de la mielina

El SAPK3 pertenece a la familia de proteínas cinasa activadas por mitógenos (MAPK) que pueden activarse mediante una gran variedad de agonistas extracelulares. Estas proteínas cinasas de alto grado de activación pueden utilizar la proteína básica de la mielina (MBP) como fosfoaceptores en reacciones de cinasa. Se ha mostrado que esta actividad de la cinasa se puede determinar con un reactivo de detección de ADP convertido en solución tampón Tris-acetato (pH 7,75) además de solución tampón Hepes. Los ensayos se realizaron como sigue.

Este ensayo se llevó a cabo utilizando la misma solución tampón que para MAPK-2/ERK-2, con un proceso de incubación a 30ºC. El ATP se utilizó en la misma concentración que para JNK2\alpha2.

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Solución tampón de ensayo	Tris-HCl 25 mM pH 7,5
	Acetato de Mg 10 mM
	EGTA 0,1 mM

Al igual que con las enzimas anteriores, el ensayo se realizó en probetas. Después de que concluyese la reacción de la cinasa, se añadieron 20 \mul de mezcla de reacción a los pocillos de una placa blanca y opaca de microvaloración de 96 pocillos, seguido de la adicción de 20 \mul de reactivo de detección de ATP. La eficiencia luminosa se determinó de nuevo 1 segundo después.

Las probetas contenían: 10 \mul de enzima, 10 \mul de substrato, 10 \mul de ATP y 70 \mul de solución tampón de ensayo.

Se utilizó una solución stock de SAPK3 (LB012SDp174, 220 \mul) con una concentración de 1,55 mg/ml y 87,3 U/mg. La enzima se dividió en volúmenes alícuotas de 10 \mul (15,5 mg) y se diluyó en una razón de dilución 1:3 (=5,17 \mug/10 \mul). Para las curvas de concentración de la enzima, ésta se diluyó aún más, en razón de 1:5 (1,03 \mug) y 1:10 (0,25 \mug). El ensayo se realizó mediante la adicción de 10 \mul por cada 100 \mul de volumen de reacción final. Las concentraciones finales de enzima que se obtuvieron fueron de 0; 0,517; 1,03 y 5,17 \mug/ml (correspondientes a concentraciones nanomolares de 0; 72,8; 145,6 y 728,0 nM respectivamente. Véase la leyenda de la figura 12).

Con MBP de Calbiochem (0,5 mg/ml) se utilizaron 10 \mul de la solución de stock por cada 100 \mul de volumen de reacción final (concentración final 2,72 \muM).

En la figura 12 se muestran los resultados del experimento realizado con SAPK3/MBP, apreciándose claramente una caída del ATP (en función de la eficiencia luminosa) dependiente de la concentración.

SAPK4 y proteína básica de la mielina

El experimento anterior se repitió también con SAPK4 y MBP. Estos ensayos se realizaron utilizando la misma solución tampón de ensayo que en el caso de MAPK2/ERK-2 y SAPK3.

SAPK4 de stock (LB021SDp176) a 1,64 mg/ml y 144,1 U/mg en 127 \mul. Esto se dividió en muestras alícuotas de 5 \mul (8,2 \mug/alícuota). Para crear un stock de trabajo, la enzima se diluyó en razón 1:4 (2,05 \mug/5 \mul), posteriormente 1:5 (410 ng/5 \mul) y 1:10 (205 ng/ 5 \mul). Entonces se añadieron 5 \mul en cada probeta, lo que dio concentraciones finales en las probetas, para un volumen de reacción de 100 \mul, de 0; 0,103; 0,205 y 1,25 \mug/ml (las correspondientes concentraciones nanomolares se muestran en la figura 13).

MBP de stock (Life Technologies) de concentración 2,5 \mug/ml, se añadieron 10 \mul por cada 100 \mul de volumen final de reacción (250 \mug/ml o 13,6 \muM).

La concentración más alta de MBP mostraba un rápido descenso de la señal luminosa en tiempo 0, esto se produjo, de hecho, aproximadamente 2 minutos después de la adicción de los reactivos, dado que se tardó tiempo en sacar las muestras de las probetas, aplanarlas y añadir el reactivo de detección de ATP (véase figura 13).

El trabajo realizado con cinasas SAP también mostró que era posible utilizar MBP de un gran número de proveedores diferentes (aunque los resultados del ensayo dependían de la calidad de la proteína suministrada).

Estos datos confirman que la solución tampón Tris-acetato podría utilizarse para la reconstitución del reactivo de detección de ATP tal y como la solución tampón Hepes descrita anteriormente.

Ejemplo 10

Efecto de la concentración de ATP

Todos los ensayos anteriores se realizaron con ATP con una concentración final de 25 \muM. Continuamos nuestra investigación para comprobar si el sistema bioluminescente pudie detectar actividad de cinasa con concentraciones más altas y mas bajas de ATP. Los ensayos se realizaron con los mismos tipos de soluciones tampón que los descritos anteriormente y con los mismos volúmenes. Sin embargo, en lugar de utilizarse probetas, en la mayoría de los ejemplos siguientes los experimentos se realizaron en pocillos de placas de paredes blancas de microvaloración de 96 pocillos. Después de 30 minutos a 30ºC las placas se sacaron de la incubadora y se añadieron 20 \mul de reactivo de detección de ATP en cada pocillo y se midió la eficiencia luminosa transcurrido 1 segundo.

JNK2\alpha2

La figura 14 muestra los datos obtenidos con 3 concentraciones diferentes de ATP 1, 10 y 100 \muM (los resultados se muestran como la media de triplicados de pocillos \pm SD). El substrato empleado era ATF-2 en una concentración final de 2,11 \muM con una enzima presente en concentración 1,25 \muM. La solución tampón de ensayo era la misma que la descrita anteriormente para JNK2\alpha2.

SAPK3

Se repitieron los experimentos y se obtuvieron distintas curvas de concentración de ATP utilizando SAPK3 y MBP como substrato. La figura 15 muestra el efecto producido por diferentes concentraciones de ATP en el cambio de la eficiencia luminosa (los resultados se muestran como la media de triplicados de pocillos \pm SD). El SAPK3 se utilizó con una concentración 728 nM con proteína básica de la mielina (MBP) a una concentración final de 2,72 \muM en los pocillos. A 100 \muM se produjo un efecto de la enzima en presencia del substrato donde la señal luminosa caía unos 693.234 RLU desde 5.267.900 \pm 133.688 hasta 4.574.666 \pm283.204. Esto suponía un descenso notable del RLU e indicaba que la cantidad de enzima y substrato era limitante a esta elevada concentración de ATP.

Las diferencias en los valores RLU se relacionan directamente con las concentraciones de ATP. Esta caída de la eficiencia luminosa se refiere a la cantidad de ATP defosforilado por el SAPK3. Todo esto se muestra en la figura 16 en la que se indican las diferencias en los valores de URL, lo que indica que se consumió la misma cantidad de ATP con ATP 100 \muM que con ATP 10 \muM.

Aunque no se aprecia claramente en la figura 16, existe también una diferencia significativa en los valores de RLU obtenidos con las concentraciones mas bajas de ATP empleado donde los RLU experimentaron una caída desde 818 \pm 18 hasta 300 \pm 17 (medias \pm SD).

Ejemplo 11

Realización del ensayo en placas de microvaloración de 384 pocillos

Los experimentos llevados a cabo a lo largo del tiempo descritos anteriormente confirmaron que era posible realizar ensayos en probetas empleando volúmenes grandes y, posteriormente, a cada intervalo predeterminado, tomar una muestra de 20 \mul y añadirla a una placa blanca y opaca de microvaloración de 96 pocillos, con una eficiencia luminosa medida después de la adición de 20 \mul de reactivo de detección de ATP. También se ha demostrado que es posible realizar el ensayo en volúmenes de 100 \mul en los pocillos de dicha placa.

En la figura 17 se comparan los resultados del ensayo en dos casos, uno utilizando 20 \mul procedentes de un volumen de reacción mayor y otro en el que el ensayo se lleva a cabo directamente en los pocillos de una placa de microvaloración de 384 pocillos. En los 384 pocillos, la reacción de la cinasa tiene lugar en volúmenes de 20 \mul con la adición de 20 \mul de reactivo de detección de ATP. Los datos muestran que el resultado del ensayo era el mismo con independencia de si este se realizaba en probetas de 100 \mul o en placas de 384 pocillos de 20 \mul.

Ejemplo 12

Estudio de cascadas de cinasa

La activación de cinasas suele producirse por fosforilación mediante otras cinasas situadas en etapas anteriores del proceso a lo largo del camino recorrido por la señal de transducción. Un ejemplo de ello lo constituye la activación de MAPK-2 por MEK-1, seguido de la capacidad del MAPK-2 para fosforilar el MBP. Este sistema de utiliza para confirmar que se había producido la fosforilación y activación del MAPK-2 por el MEK-1. En el caso en que la proteína hubiera sido activada, se produciría una reducción de ATP cuando el MAPK-2 fuese expuesto al MBP en presencia de ATP. El ensayo se realizó en probetas de volumen 100 \mul, la activación inicial de MAPK2 inactivo tuvo lugar a 30ºC con ATP 10 \muM. La solución tampón de ensayo se componía de Tris-acetato 25 mM de pH 7,75 con 0,1 mM de EGTA y acetato de magnesio 10 mM. El MEK-1 se utilizó en una concentración final de 114 nM con MAPK-2 inactivo a una concentración final 516 nM.

Para determinar la actividad de la cinasa, se añadieron 20 \mul a los pocillos dobles de una placa de 96 pocillos, así como otros 20 \mul de reactivo de detección de ATP y se midió la señal luminosa 1 segundo después.

Se preparó una segunda placa que contenía triplicados de pocillos con 10 \mul de MBP (Calbiochem) en una concentración de 0,25 mg/ml, 10 \mul de ATP y 60 \mul de solución tampón de ensayo, a esta mezcla se le añadieron 20 \mul de una mezcla de reacción procedente de las probetas y compuesta por NMK-1/MAPK2 y se dejó transcurrir la reacción en una incubadora a 30ºC durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, se añadieron 20 \mul a los pocillos de reactivo de detección de ATP y se determinó la eficiencia luminosa.

Los resultados se muestran en la figura 18 donde se observa un aumento del RLU cuando el substrato controla la reacción, lo que se relaciona con la adición de ATP procedente de la mezcla original de MEK-1/MAPK-2. Los datos muestran claramente que el MAPK-2 había sido fosforilado y era, por ello, capaz de tener actividad cinasa propia en presencia de MBP. Se llevó a cabo un control adicional con el MAPK-2 inactivo y el MBP que no mostraron disminución alguna de la señal luminosa.

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Ejemplo 13

Estudios de fosforilación de substratos mediante la técnica de transferencia Western

Además de demostrar que es posible inducir una actividad funcional de cinasas y detectar este hecho mediante un ensayo de luminiscencia, se confirmó que la disminución de la eficiencia luminosa estaba ligada a la fosforilación de aminoácidos en substratos de péptidos/proteínas mediante la técnica de transferencia Western.

Métodos

Preparación de muestras: Tras la finalización de la reacción de cinasa en volúmenes de 100 \mul, se añadieron 20 \mul de mezcla de reacción a 20 \mul de solución tampón formada por muestras de solución tampón Laemmli 2x (Amersham, Bucks, UK) y se calentó a 100ºC durante 4 minutos, antes de colocarlo inmediatamente en hielo el tiempo que fuese preciso.

Se preparó un marcador de peso molecular de la proteína HRP (New England Biolabs) añadiendo 10 \mul de marcador a 10 \mul de solución tampón formada por muestras obtenidas por transferencia Western.

Electroforesis en gel (SDS PAGE) y transferencia de proteínas: se añadieron a los pocillos 20 \mul procedentes de cada una de las muestras preparadas (equivalente a 10 \mul de mezcla de reacción de cinasa) de un gel SDS preparado al 12% (BioRad, Herts, UK) y se utilizó una solución tampón estándar de corrida compuesta por Tris-Glicina, actuando durante 45 minutos a 180 V.

El gel se equilibró con la solución tampón estándar de transferencia Tris-Glicina-Metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente, antes de ser transferido a una membrana de nitrocelulosa mediante una mini cámara de transferencia (BioRad) a 100 V durante 60 minutos.

Sondeo de membrana: Se bloqueó la membrana empleando la solución tampón de bloqueo Pierce Superblock ® (IL, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios empleados para el MAPK, p38 y JNK y el UBI para MBP anti-fosforilado fueron suministrados por Promega (Wisconsin, EE.UU.) Las diluciones de anticuerpos se realizaron en Superblock ® diluido 10 veces en agua destilada. El anticuerpo primario se utilizó en una proporción 1:10000 mientras que la proporción de los anticuerpos secundarios apropiados fue de 1:20000. El reactivo de detección conjugado de HRP se utilizó en proporción de 1:10000 para la detección del marcador HRP de proteína.

Detección quimioluminiscente: Las membranas sondeadas se metieron en la incubadora junto con 10 ml de Super
Signal® West Pico (Pierce, IL EE.UU.) durante 2 minutos con una ligera agitación. Los elementos sondados transferidos fueron expuestos entonces a Hyperfilm (Amersham, Bucks, UK) durante 20 segundos. Los objetivos ya fosforilados se compararon con los marcadores de peso molecular para proceder a su identificación.

Resultados

La figura 19 muestra el efecto de la actividad del SAPK3 en el MBP tras 30 minutos a 30ºC. En este experimento, los ensayos se realizaron en probetas tal y como se ha descrito previamente. Para la determinación de los niveles de ATP, se extrajeron muestras alícuotas de 20 \mul de los pocillos dobles de una placa compatible luminiscente de 96 pocillos y el resto se utilizó en los análisis por transferencia Western. El elemento transferido se sondeó utilizando un anticuerpo para el MBP desfosforilado (Upstate Biotechnology).

El experimento anterior se repitió utilizando SAPK4 y un número de suministros diferentes de MBP. Los resultados se muestran en la figura 20 e indican que algunas proteínas, incluso cuando se utilizan en las mismas concentraciones, dan resultados diferentes si se emplea un ensayo por bioluminiscencia o transferencia Western. Los elementos trasferidos se sondearon de nuevo utilizando el mismo MBP anti-fosforilado. Tal y como muestra el resultado, uno de los lotes de MBP utilizado (CB) no produjo ningún efecto en ninguno de los ensayos de detección. Se utilizaron dos muestras diferentes de MBP procedentes de Upstate Technology, una correspondía a la forma defosforilada (DePhos) y la otra a la estándar MBP (UBI). Los datos obtenidos por bioluminiscencia indicaban que, para la misma cantidad de proteína utilizada (2,72 \muM) la forma defosforilada resultaba más eficaz en el ensayo con SAPK4. Este hecho no se pudo determinar mediante inmunotransferencia, confirmándose que la bioluminiscencia resulta ser un ensayo más sensible y cuantitativo en el caso de la actividad de la cinasa.

Resumen

Los estudios descritos en los ejemplos de 1 a 13 demuestran la versatilidad de los métodos y equipos de reactivos que aparecen en la presente invención.

En particular, los métodos de la invención pueden utilizarse para estudiar un número variado  de combinaciones cinasa/substrato de proteínas diferentes. Las enzimas de proteína cinasa utilizadas en los ejemplos anteriores incluían:

i) JNK-1 y JNK-2 en presencia de péptido c-jun como substrato.

ii) MAPK-1/ERK-1 y MAPK-2/ERK-2 con proteína básica de la mielina como substrato.

iii) MEK-1 con MAPK-2 inactivo como substrato.

iv) JNK2\alpha2 con ATF-2 y c-jun como substratos.

v) SAPK-3 con proteína básica de la mielina como substrato.

vi) SAPK-4 con proteína básica de la mielina como substrato.

Además, se realizaron comparaciones entre las formas activadas e inactivas tanto de MAPK-1/ERK-1 como de MAPK-2/ERK-2 en presencia de proteína básica de la mielina.

Los resultados de estos experimentos muestran que era posible detectar actividad de cinasa en presencia de ATP y del substrato enzimático adecuado, mediante una disminución del ATP detectable, un incremento del ADP medido y también una caída brusca de la señal en presencia de luciferasa.

A continuación se resumen algunas de las ventajas de los ensayos de la invención:

- El ensayo se aplica a cualquier proteína cinasa que divide un fosfato a partir de ATP.

- Se podría prolongar la actividad de la proteína cinasa hasta el final, antes de la detección de ATP y/o ADP.

- El ensayo se podría realizar en presencia de un reactivo de control de ATP, determinando la actividad de la proteína cinasa como la disminución de la eficiencia luminosa, junto con un incremento en la caída de la señal.

- Los cambios producidos en los nucleótidos adenilato mostraban los cambios producidos de la concentración al modificarse la enzima, el substrato y las concentraciones de ATP.

- La disminución de la señal luminosa se encuentra ligada a la defosforilación de las proteínas.

- Los métodos se pueden utilizar para detectar y estudiar los inhibidores de proteína cinasa.

- Los métodos se pueden utilizar para estudiar sistemas de cascada de proteínas cinasa.

- Los ensayos se podrían haber realizado a temperatura ambiente o a 30ºC.

- Los cambios en los nucleótidos adenilato se podrían haber detectado en presencia o ausencia de una solución de parada, permitiendo el cribado de muestras a gran escala. Utilizando una solución tampón adecuada (p.ej. Hepes) también era posible detener la reacción de la proteína cinasa con un 2% de ácido fosfórico y detectar la cantidad reducida de ATP obtenida como resultado de la actividad de la proteína cinasa.

- Los métodos se pueden utilizar con un número variado de soluciones tampón de proteína cinasa.

- El reactivo de detección de ATP se puede utilizar para Tris-acetato o solución tampón Hepes.

- El ensayo se puede suministrar como un equipo de reactivos. Podrían suministrase diferentes equipos de reactivos para realizar medidas de la disminución de ATP, con o sin la utilización de un reactivo de parada. Estos equipos de reactivos podrían contener también el reactivo de conversión de ADP (tal y como se indicó en el apéndice 1) para detectar un incremento del ADP debido a la actividad de la proteína cinasa.

Aplicaciones de los métodos de la invención

Los métodos y ensayos de la presente invención, tal y como se describieron en los ejemplos anteriores, se pueden utilizar para medir la actividad de la cinasa en sistemas libres de células. Esto constituye un hecho de gran importancia para la industria farmacéutica ya que permite utilizar los métodos y ensayos en laboratorios que llevan a cabo procesos de cribado a gran escala, p.ej. para la identificación de drogas que pueden actuar como moduladores de cinasa, especialmente inhibidores. Para esta aplicación, los ensayos se pueden realizar tal y como se describe en los ejemplos anteriores.

Los métodos y ensayos de la invención también pueden utilizarse para determinar la actividad de la cinasa en extractos celulares así como para determinar el efecto de los moduladores de actividad celular de la cinasa. Para llevar a cabo estos experimentos, es posible remplazar, en los ejemplos anteriores, la cinasa conocida por el extracto celular/líquido sobrante. El substrato se añade tal y como se ha descrito anteriormente y, de este modo, es posible detectar cualquier cambio que se produzca en la actividad de la cinasa en aquellas células tratadas con inhibidores/activadores.

Existe un número creciente de proteínas cinasa que están siendo estudiadas para el desarrollo de terapias para el tratamiento de nuevos tumores. A medida que esta lista aumenta, se hará poco práctica y extremadamente cara ya que supondría la realización de ensayos específicos para cada tipo de cinasa. Tanto los ensayos como los equipos de reactivos que aparecen en la presente invención permiten la detección de de un amplio espectro de cinasas y proporcionan un sistema de detección común para todas ellas. Esto permite una gran facilidad de utilización, especialmente en laboratorios que llevan a cabo procesos de cribado a gran escala, en los que los robots pueden trabajar con todo tipo de reactivos de detección y diferentes tipos de cinasas e inhibidores de interés y con placas blancas y opacas (o negras) de microvaloración.

Además, la utilización de una solución de parada permite tratar grandes cantidades de lotes de placas (p.ej. almacenadas) antes del análisis de niveles de ATP y/o ADP.

Ejemplo 14

Estudio de los inhibidores de cinasa Estaurosporina

Inicialmente se escogió un amplio espectro de estaurosporina inhibidora de la cinasa (Calbiochem). En primer lugar, se comprobó el inhibidor (en DMSO) en el reactivo de detección de ATP para asegurar que el inhibidor no afectara la reacción entre la luciferasa y el luciferín.

La figura 21 muestra el efecto de la estaurosporina en el sistema de detección por bioluminiscencia. Los resultados se presentan como la media de triplicados de pocillos \pm SD.

Los datos muestran que, incluso a altas concentraciones del inhibidor, no se produjo un efecto significativo en la eficiencia luminosa. El experimento se re realizó utilizando ATP 10 \muM en volúmenes de 100 \mul en una placa de 96 pocillos con la adicción de 20 \mul de reactivo de detección de ATP.

Se comprobó el efecto de la estaurosporina en la enzima JNK2\alpha2 con ATF-2 como substrato y, tal y como muestra la siguiente figura, la actividad inhibidora esperada podría detectarse utilizando el sistema de ensayo de proteína cinasa por bioluminiscencia.

La figura 22 muestra el efecto de dos concentraciones de estaurosporinas diferentes en la actividad del JNK2\alpha2. La concentración más baja apenas tuvo efecto, sin embargo, una concentración 5 \muM provocó una inhibición de aproximadamente el 50% tras 30 minutos a 30ºC.

El ensayo descrito anteriormente se realizó en volúmenes de 200 \mul, en probetas de plástico y en baños con agua a 30ºC. A cada intervalo de tiempo preestablecido se extraían de las probetas muestras de 20 \mul que se añadían a los pocillos de una placa de 96 pocillos, seguidas de la adicción de 20 \mul de reactivo de detección de ATP. La concentración final de ATP utilizada fue de 12,5 \muM con JNK2\alpha2 y ATF-2 en concentración 1,25 \muM y 2,55 \muM respectivamente.

Genistein

Se investigó también el efecto del genistein (Calbiochem) en la actividad del MAPK-1 utilizando MBP como substrato.

La solución tampón de ensayo empleada era la misma que la utilizada para las cinasas SAP (véase más arriba). El ensayo se realizó en volúmenes de 100 \mul en una placa de microvaloración de 96 pocillos a 30ºC durante 30 minutos. Se utilizó MBP (Calbiochem) en la misma concentración anterior (2,72 \muM) junto con el complejo activado MAPK1/ERK1 (UBI) a una concentración de 2,5 U por cada 100 \mul de volumen de reacción. Se añadió el inhibidor en concentraciones de 0; 0,1; 0,25; 0,5 y 1,0 \muM, junto con 10 \mul que se añadieron por cada pocillo en 0,1% (v/v)
DMSO.

Para terminar, se analizaron las muestras de control con y sin DMSO (0+DMSO y 0-DMSO, respectivamente) para confirmar que el DMSO no afectaba al desarrollo del ensayo.

La figura 23 muestra el efecto de concentraciones crecientes de Genistein (\muM) en la actividad del MAPK-1 empleando MBP como substrato (los resultados se muestran como la media de pocillos dobles \pm SD). Concretamente, los datos mostraban un efecto del Genistein a 500 nM, con una actividad inhibidora creciente a una concentración 1 \muM.

PD098059

También se investigó el efecto del inhibidor selectivo PD098059 en la activación de raf-1 y de MEK-1 inactivo.

Con PD098059 existía un aumento de la eficiencia luminosa dependiente de la concentración, en presencia del inhibidor que indicaba una actividad reducida de cinasa.

\newpage

La figura 24 muestra el efecto de dos concentraciones de PD098059 diferentes en la actividad del raf-1 (los resultados se expresan como la media de triplicados de pocillos \pm SD). Estos datos confirmaron que el ensayo era adecuado para la determinación de la actividad inhibidora de la cinasa.

Este experimento también constituye una valoración de la versatilidad de los métodos y ensayos expuestos ya que es posible detectar la actividad de otro sistema cinasa/substrato, p.ej. raf-1/MEK-1 inactivo.

Apéndice 1

Composición del reactivo de control de ATP (AMR) AMR reconstituido

Acetato de magnesio	20 mM	Sigma
Pirofosfato de tetrasodio	8 \muM	Sigma
Albúmina sérica bovina	0,32% w/v	Sigma
D-Luciferín	712 \muM	ConCell
L-Luciferín	17,8 \muM	ConCell
Luciferasa	17 nM	Europa Bioproducts
Dextran	3 mg/ml	Sigma
Tris	40 mM	Sigma
EDTA	800 \muM	Sigma

\vskip1.000000\baselineskip

Concentraciones finales de reacción

Acetato de magnesio	2,36 mM
Pirofosfato de tetrasodio	236 nM
Albúmina sérica bovina	0,009% w/v
D-Luciferín	21 \muM
L-Luciferín	525 nM
Luciferasa	500 pM
Dextran	88,5 g/ml
Tris	1,18 mM
EDTA	23,6 \muM

\vskip1.000000\baselineskip

Solución tampón Tris-acetato (TA) (en cantidad suficiente para 1 L)

Tris	12,1 g	Sigma
EDTA	0,744 g	Sigma

Tris 0,1 M, EDTA 2 mM ajustado a un pH de 7,75 con ácido acético glacial.

\vskip1.000000\baselineskip

Solución tampón 200 mM (en cantidad suficiente para 1 L)

EDTA	0,744 g	Sigma
Hepes	47,6 g	Sigma

Ajuste a pH 7,75 con ácido acético glacial.

\newpage

Solución tampón UBI (véase hoja de especificaciones)

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 MOPS 20 Mm, pH 7,2\cr   \beta -glicerol fosfato 25
mM\cr  EGTA 5 mM\cr  Ortovanadato de sodio 1 mM\cr  Ditiotreitol 1
mM\cr}

Solución tampón de ensayo JNK (formulación para concentrados x 10)

Hepes 250 Mm, Ph 7,5	Sigma
Cloruro sódico 1,5 M,	Sigma
Cloruro de magnesio 200 mM	Sigma
0,01% Tween 20	Sigma

En el momento de su utilización, se añade ditiotreitol 20 mM (Sigma) y ATP 150 \muM (Sigma).

Reactivo de conversión de ADP (en cantidad suficiente para 600 ml)

Cinasa piruvato (50.000 unidades)	20 ml	Calbiochem
Fosfoenol piruvato 1 M (sal monosódica)	10 ml	Sigma
Acetato potásico 2 M	100 ml	Sigma
Solución tampón Tris-acetato Ph 7,75	470 ml

Concentraciones finales

	Stock	Mezcla de reacción
PK	7,6 U/ml	0,8 U/ml
PEP	1,67 mM	175 nM
Acetato potásico	33 mM	3,5 mM

Apéndice 2

Proveedores

Berthold Detection Systems GmbH	Dynex Labsystems
Bleichstrasse 56-58	Action Court
D-75173 Pforzheim	Ashford Road
Alemania	Ashford
	Middlesex TW15 1XB
	Reino Unido
Biotrace Ltd
The Science Park	Labsystems Oy
Bridgend	Sorvaajankatu 15
CF31 3NA	Helsinki 00810
Reino Unido	Finlandia
Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd	Perkin Elmer Life Sciences
Boulevard Industrial Park	Perkin Elmer House
Padge Road	204 Cambridge Science Park
Beeston	Cambridge CB4 0GZ
Nottingham NG9 2JR	Reino Unido
Reino Unido

(Continuación)

	Sarstedt
ConCell BV	68 Boston Road
Wevelinghoven 26	Beaumont Leys
Nettetal	Leicester LE4 1AW
D-41334	Reino Unido
Alemania
	Sigma-Aldrich Co Ltd
Europa Bioproducts Ltd	Fancy Road
Europa House	Poole
15-17 North Street, Wicken	Dorset BH12 4QH
Ely, Cambridge	Reino Unido
CB7 5XW
Fahrenheit Lab Supplies	Upstate Biotechnology Inc. (UBI)
Northfield Road	199 Saranac Avenue
Rotherham	Lake Placid
Reino Unido	NY 12946
	EE. UU.
South Yorkshire S60 1RR
Labtech International Ltd	Wallac Oy
1 Acorn House	PO Box 10
The Broyle	Turku
Ringmer	FI-20101
East Sussex BN8 5 NW	Finlandia

Claims (41)

1. Método para medir la actividad de la proteína cinasa, dicho método comprendiendo:

a)

Proveer una primera solución que contenga ATP, una proteína cinasa que será objeto del ensayo y un substrato susceptible de ser foforilado por dicha proteína cinasa y una segunda solución que contenga ATP en ausencia de la citada proteína cinasa que será objeto del ensayo y un substrato susceptible de ser fosforilado por dicha proteína.

b)

Medir, mediante una reacción de bioluminiscencia, la concentración de ATP y/o ADP o de la tasa de cambio de la misma con respecto al tiempo, en cada una de las mezclas de reacción constituidas en la etapa a).

c)

Usar de la información sobre la concentración de ATP y/o ADP para determinar la actividad de la proteína cinasa objeto del ensayo.

2. Método para identificar un compuesto que module la actividad de una proteína cinasa, dicho método comprendiendo:

a)

Proveer una primera solución que contenga ATP, una proteína cinasa, un compuesto que será probado y un substrato susceptible de ser desfoforilado por la proteína cinasa que también será objeto de ensayo y una segunda solución que contenga ATP, una proteína cinasa y un substrato susceptible de ser fosforilado por dicha proteína cinasa en ausencia del componente que va a ensayarse.

b)

Medir, mediante una reacción de bioluminiscencia, de la concentración de ATP y/o ADP o de la tasa de cambio de la misma con respecto al tiempo, en cada una de las mezclas de reacción constituidas en la etapa a).

c)

Utilizar la información sobre la concentración de ATP y/o ADP para determinar la actividad de la proteína cinasa en las soluciones primera y segunda.

d)

Comparar la actividad de la proteína cinasa en la primera solución con la actividad de la citada proteína en la segunda solución con el fin de identificar los compuestos que modulan una proteína cinasa, a través de la cual el compuesto que va a ser probado es identificado como un modulador de la proteína cinasa si la actividad de la proteína cinasa de la primera solución es diferente a la de la proteína cinasa de la segunda solución.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2 en el que proveer las soluciones primera y segunda de a) comprende añadir el citado substrato a una solución que contenga los reactivos sobrantes.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las soluciones primera y segunda de la etapa a) están sustancialmente libres de células.

5. Un método según las reivindicaciones 2, 3 ó 4 en el que el compuesto que va a ser objeto de ensayo se identifica como un inhibidor de la proteína cinasa en caso de que la actividad de la cinasa de la solución primera sea más baja que la actividad de la cinasa de la segunda solución.

6. Un método según la reivindicación 5 en el que el compuesto objeto de ensayo se identifica como un inhibidor de la proteína cinasa si la actividad de la cinasa de la primera solución es menor del 50% de la actividad de la cinasa de la segunda solución.

7. Un método según las reivindicaciones 2, 3 ó 4 en el que el compuesto objeto de ensayo se identifica como un activador de la proteína cinasa en caso de que la actividad de la cinasa de la primera solución sea mayor que la actividad de la cinasa de la segunda solución.

8. Un método según la reivindicación 7 en el que el compuesto objeto de ensayo se identifica como un activador de la proteína cinasa si la actividad de la cinasa de la primera solución es, como mínimo, un 50% mayor que la actividad de la cinasa de la segunda solución.

9. Un método según las reivindicaciones 2 ó 3 en el que se repiten las etapas a) a c) una o más veces utilizando un tipo de cinasa diferente y su correspondiente substrato cada vez.

10. Un método según las reivindicaciones 1, 2 ó 3 donde la cinasa se activa previamente a la etapa a).

11. Un método según las reivindicaciones 1,2 ó 3 donde las soluciones primera y segunda de la etapa a) incluyen una solución tampón.

12. Un método según la reivindicación 11 en el que la solución tampón es solución tampón Hepes.

13. Un método según las reivindicaciones 1, 2 ó 3 donde las etapas a) y b) se llevan a cabo de manera consecutiva.

14. Un método según la reivindicación 13 en el que las mezclas de reacción formadas en la etapa a) se dejan reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente previamente a la etapa c).

15. Un método según la reivindicación 13 que comprende una etapa más b'), posterior a la etapa a) y previa a la b) de añadir un reactivo a la mezcla de reacción constituida en la etapa a) y que detiene la reacción de la cinasa con el substrato.

16. Un método según la reivindicación 15 en el que se selecciona el reactivo de parada de entre un grupo compuesto por ácido fosfórico, EGTA y EDTA.

17. Un método según las reivindicaciones 15 a 16 que comprende una etapa adicional b''), posterior a la etapa b') y anterior a la b) de ajustar el pH de la mezcla constituida en la etapa b') a pH 7,0.

18. Un método según la reivindicación 17 en el la etapa b'') comprende añadir solución tampón Hepes.

19. Un método según las reivindicaciones 1,2 ó 3 donde las etapas a) y b) se llevan a cabo simultáneamente.

20. Un método según las reivindicaciones 1,2 ó 3 donde la etapa b) comprende:

i)

Adición de un reactivo bioluminiscente que contenga luciferin o un derivado del mismo y una luciferasa para las citadas mezclas de reacción, dicho luciferin o un derivado del mismo emitiendo luz durante una reacción de bioluminiscencia con luciferasa en presencia de ATP; y

ii)

medir la intensidad de la luz emitida por la reacción de biolumininsencia resultante, o su variación con respecto al tiempo, como una medida de la concentración de ATP.

21. Un método según la reivindicación 20 en el que la etapa b) además comprende las siguientes etapas después de que la medida de la intensidad luminosa realizada en el paso ii) haya alcanzado un nivel sustancialmente constante:

iii)

Adición de un reactivo que convierta el ADP en ATP;

iv)

Adición de un reactivo bioluminiscente que contenga luciferin o un derivado del mismo y luciferasa para la mezcla de reacción del paso iii); y

v)

Medición de la intensidad luminosa emitida por la reacción de bioluminiscencia resultante

en el que la diferencia entre la intensidad luminosa obtenida en el paso v) y el valor estacionario de la intensidad luminosa del paso ii) constituye una medida de la concentración de ADP en la mezcla de reacción obtenida en el paso ii).

22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones que van desde la 2 a la 21 y en el que la cinasa es JNK-1 y el substrato es GST-c-jun.

23. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es MAPK cinasa-1 (ERK-1) y el substrato es la proteína básica de la mielina.

24. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es MAP cinasa-2 (ERK-2) y el substrato es la proteína básica de la mielina.

25. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es PKA y el substrato es kemptide.

26. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es JNK-2 y el substrato es GST-c-jun.

27. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es MEK-1 y el substrato es MAP cinasa-2 inactiva (ERK-2).

28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es JNK2\alpha2 y el substrato es ATF-2.

29. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es JNK2\alpha2 y el substrato es c-jun.

30. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es SAPK-3 y el substrato es la proteína básica de la mielina.

31. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es SAPK-4 y el substrato es la proteína básica de la mielina.

32. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21 y en el que la cinasa es raf-1 y el substrato es MEK-1 inactivo.

33. Un equipo de reactivos para uso en el método expuesto en la reivindicación 2 ó 3 que comprende:

a)

Un reactivo bioluminiscente que contenga luciferin o un derivado del mismo y una luciferasa, dicho luciferín o un derivado del mismo emitiendo luz en una reacción de bioluminiscencia con la luciferasa en presencia de ATP;

b)

Una proteína cinasa;

c)

Un substrato susceptible de ser fosforilado por la citada proteína cinasa; y

d)

ATP.

34. Un equipo de reactivos según la reivindicación 33 que comprende además una o más soluciones tampón para reconstituir, diluir o disolver el reactivo bioluminiscente, la cinasa, el substrato y/o el ATP.

35. Un equipo de reactivos según la reivindicación 33 que comprende además un reactivo capaz de detener la reacción entre dicha cinasa y dicho substrato.

36. Un equipo de reactivos según la reivindicación 33 que comprende además uno o más reactivos capaces de convertir el ADP en ATP.

37. Un equipo de reactivos según la reivindicación 36 en el que el reactivo que convierte el ADP en ATP comprende piruvato cinasa y de fosfoenol piruvato.

38. Un equipo de reactivos según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 que comprende, además, dos o más cinasas diferentes y sus substratos.

39. Un equipo de reactivos según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38 en el que el reactivo o los reactivos se encuentran en forma liofilizada.

40. Un equipo de reactivos según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39 comprende, además, una placa multipocillos de multivaloración.

41. Un equipo de reactivos según la reivindicación 40 en el que la placa multipocillos de multivaloración contiene 96 pocillos o más.