ES2256302T3 - Vectores adenovirales para la transduccion de condrocitos. - Google Patents
Vectores adenovirales para la transduccion de condrocitos.Info
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Abstract
Uso de un adenovirus quimérico recombinante del subgrupo C como vehículo para administrar un ácido nucleico de interés a un condrocito humano primario in vitro, donde dicho adenovirus contiene al menos el dominio knob de una proteína de la fibra de un adenovirus seleccionado entre el grupo consistente en adenovirus del serotipo 8, 11, 16, 32, 35, 38, 40-S y 51.
Description
Vectores adenovirales para la transducción de
condrocitos.
La invención se relaciona con el campo de la
genética molecular y de la medicina. En particular, la presente
invención se relaciona con el campo de la terapia génica, más en
particular con la terapia génica que utiliza adenovirus.
Actualmente en terapia génica, se da información
genética a una célula huésped para corregir (suplementar) una
deficiencia genética en dicha célula o para inhibir una función no
deseada en dicha célula, o para eliminar dicha célula huésped. Por
supuesto, la información genética puede tener también la finalidad
de proporcionar a la célula huésped una función deseada, por
ejemplo, suministrar una proteína segregada para tratar otras
células del hospedador, etc. Así, existen al menos tres
aproximaciones diferentes en terapia génica, una dirigida a
compensar una deficiencia presente en un hospedador (mamífero); la
segunda dirigida a la supresión o eliminación de substancias no
deseadas (organismos o células), y la tercera dirigida a
proporcionar a una célula una función deseada.
Con fines de terapia génica, se han propuesto
adenovirus como vehículos adecuados para administrar genes al
hospedador. Los vectores de transferencia de genes derivados de
adenovirus (así llamados vectores adenovíricos) tienen una serie de
características que los hacen particularmente útiles para la
transferencia de genes. 1) La biología de los adenovirus está
caracterizada en detalle; 2) el adenovirus no se asocia a patología
humana grave; 3) el virus es extremadamente eficiente en la
introducción de su ADN en la célula huésped; 4) el virus puede
infectar una amplia variedad de células y tiene un amplio espectro
de hospedadores; 5) el virus puede ser producido a altos títulos
víricos en grandes cantidades, y 6) se puede hacer que el virus sea
defectivo en cuanto a replicación por deleción de la región precoz 1
(E1) del genoma vírico (Brody y Crystal 1994).
Sin embargo, aún existen inconvenientes asociados
al uso de vectores adenovíricos, especialmente los serotipos bien
investigados de los adenovirus del subgrupo C. Estos serotipos
requieren la presencia del receptor del adenovirus Coxsackie (CAR)
sobre las células para el éxito en la infección. Aunque esta
proteína es expresada por muchas células y líneas celulares
establecidas, esta proteína está ausente en muchas otras células
primarias y líneas celulares, haciendo que estas últimas células
sean difíciles de infectar con los serotipos 1, 2, 5 y 6.
El genoma del adenovirus es una molécula de ADN
de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases. El
ADN del adenovirus contiene Repeticiones Terminales Invertidas
("ITR") idénticas de aproximadamente 90-140
pares de bases, dependiendo la longitud exacta del serotipo. Los
orígenes víricos de replicación están dentro de las ITR exactamente
en los extremos del genoma. La mayoría de los vectores adenovíricos
actualmente usados en terapia génica tienen una deleción en la
región E1, donde se puede introducir nueva información genética. La
deleción E1 hace que la replicación del virus recombinante sea
efectiva. Se ha demostrado ampliamente que el adenovirus
recombinante, en particular el serotipo 5, es adecuado para la
transferencia eficiente de genes in vivo al hígado, al
epitelio de las vías aéreas y a tumores sólidos en modelos animales
y xenoinjertos humanos en ratones inmunodeficientes (Bout 1996;
Blaese y col. 1995). Actualmente, se han propuesto seis subgrupos
diferentes de adenovirus humanos que abarcan, en total, 51 serotipos
de adenovirus diferentes. Además de estos adenovirus humanos, se ha
identificado un amplio número de adenovirus animales (Ishibashi y
Yasue 1984).
Un serotipo se define en base a su distintividad
inmunológica determinada por neutralización cuantitativa con
antisueros animales (caballo, conejo). Si la neutralización muestra
un cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se supone la
distintividad de serotipo si A) las hemaglutininas no están
relacionadas, como se ve por la falta de reacción cruzada en
inhibición de la hemaglutinación, o B) existen substanciales
diferencias biofísicas/bioquímicas en el ADN (Francki y col. 1991).
Los nueve serotipos últimamente identificados
(42-51) fueron aislados por vez primera de pacientes
infectados con HIV (Hierholzer y col. 1988; Schnurr y Dondero 1993;
De Jong y col. 1999). Por razones no bien comprendidas, la mayoría
de tales pacientes inmunocomprometidos eliminaban adenovirus que se
aislaban raramente o que no se aislaban nunca de individuos
inmunocompetentes (Hierholzer y col. 1988; Hierholzer 1992; Khoo y
col. 1995; De Jong y col. 1999).
Actualmente, el serotipo 5 del adenovirus es el
más ampliamente utilizado con fines de terapia génica. De forma
similar a los serotipos 2, 4 y 7, el serotipo 5 tiene una afiliación
natural hacia los epitelios pulmonares y otros tejidos
respiratorios. Por el contrario, se sabe que, por ejemplo, los
serotipos 40 y 41 tienen una afiliación natural hacia el tracto
gastrointestinal. Para una revisión detallada de la asociación a la
enfermedad de los diferentes serotipos de adenovirus, véase la Tabla
I. En esta Tabla I, existe una desviación con respecto a la
literatura. El análisis de secuencia y los ensayos de
hemaglutinación que utilizan eritrocitos de diferentes especies
realizados en nuestro instituto indicaron que, contrariamente a la
literatura (De Jong y col. 1999), el adenovirus 50 mostró ser un
vector del grupo D, mientras que el adenovirus 51 mostró ser un
vector del grupo B.
La afiliación natural de un serotipo dado hacia
un órgano específico puede ser debida a una diferencia en la vía de
infección, es decir, que puede hacer uso de diferentes moléculas
receptoras, o en las rutas de internalización. Sin embargo, también
puede deberse al hecho de que un serotipo puede infectar muchos
tejidos/órganos, pero puede replicarse sólo en un órgano debido al
requerimiento de ciertos factores celulares para la replicación y
por ello para la enfermedad clínica. Actualmente no se sabe cuáles
de los mecanismos antes citados es responsable de las diferencias
observadas en la asociación a la enfermedad humana. Sin embargo, es
sabido que diferentes serotipos de adenovirus pueden unirse a
diferentes receptores debido a diferencias de secuencia de las
proteínas de la cápside, v.g., proteínas fibrosas. Por ejemplo, se
ha visto que los adenovirus del subgrupo C, tales como Ad2 y Ad5, se
unen a diferentes receptores en comparación con los adenovirus del
subgrupo B, tales como Ad3 (Defer y col. 1990). Se hace referencia a
un adenovirus del subgrupo B como adenovirus de tipo B. Igualmente,
se demostró que la especificidad de receptores podía alterarse
intercambiando la proteína knob de Ad3 con la de Ad5 y viceversa
(Krasnykh y col. 1996; Stevenson y col. 1995 y 1997). El extremo C
de la proteína de la fibra, o knob, es responsable de la interacción
inicial con el receptor de adenovirus celular. Así, la proteína de
la fibra es principalmente responsable de la especificidad de
receptores. Como diferentes células huésped pueden tener diferentes
receptores, la proteína de la fibra determina en gran medida a qué
células huésped se une preferiblemente el adenovirus. La preferencia
por la unión a un cierto tipo de célula huésped es llamada tropismo.
Si un adenovirus tiene tropismo por una determinada célula huésped,
puede, o no, unirse a otro tipo de células también. El tropismo de
un adenovirus es así al menos parcialmente dependiente del tipo de
proteína de la fibra y/o de proteína knob.
Sólo en los Estados Unidos se realizan 95.000
reemplazos de rodilla y 41.000 procedimientos quirúrgicos diferentes
para reparar defectos cartilaginosos de la rodilla en una base
anual. Esto, junto con otras enfermedades del cartílago (es decir,
irregularidades de la superficie articular, deformación
craneofacial, imperfecciones de la osteogénesis, lesión de los
meniscos, anencefalia, fracturas intraarticulares, osteoporosis,
osteoartritis, fusión de la médula espinal y artritis reumatoide)
garantiza el enorme interés en la comprensión de los defectos
biológicos y bioquímicos subyacentes de las enfermedades, así como
el interés en la terapia génica como posible cura (revisado en
Frenkel y DiCesare 1999). Las estrategias para tratar estas
enfermedades son diversas, yendo desde la administración directa de
genes a los sitios de lesiones hasta las aproximaciones de
administración basadas en células, o ingeniería de tejidos ex
vivo. En caso de que se administren genes directamente a un
sitio de lesión, se contemplan retrovirus, adenovirus, ADN desnudo o
ADN acomplejado con liposomas (Madry y Trippel 2000; Lubberts y col.
1999; Goto y col. 1999). El ADN puede codificar para secuencias de
aminoácidos que inhiben la progresión de la enfermedad y/o para
secuencias de aminoácidos que contrarrestan la pérdida de cartílago.
Son ejemplos no limitativos de genes que inhiben la progresión de la
enfermedad TGFbeta (Nishida y col. 1999), IL-4
(Lubberts y col. 1999), p16INK4a (Taniguchi y col. 1999),
IL-1 (Fernández y col. 1999), IL-10
(Whalen y col. 1999) o sustancias (fármacos antiinflamatorios, TNFa,
agentes inmunosupresores) que pueden producir una regulación a menos
de la actividad de NOS o COX (Amin y col. 1999). Estas otras
estrategias, la bioingeniería basada en células o ex vivo,
utilizan ambas los mismos genes (Gazit y col. 1999): dos mediadores
inflamatorios pleotrópicos superproducidos en articulaciones
infectadas con artritis. Son ejemplos no limitativos de genes que
contrarrestan la degradación del cartílago la familia de las
proteínas de la morfogénesis ósea (Mason y col. 1998; Kramer y col.
2000, Pizette y Niswander 2000). Las células de elección para
realizar la administración basada en células en sitios de lesión o
trasplantadas a un andamiaje son los condrocitos o las células madre
mesenquimales derivadas de médula ósea humana (Richardson y col.
1999; Silverman y col. 2000: Gazit y col. 1999). Para que todas
estas estrategias resulten terapéuticamente interesantes, la
administración de secuencias génicas a condrocitos necesita ser muy
eficiente, de tal modo que a) los niveles de expresión de los genes
terapéuticos sean altos y b) se pueden aplicar bajas dosificaciones
del vehículo de transferencia génica, es decir, de adenovirus, para
soslayar los posibles efectos tóxicos mediados por vectores. El uso
de vectores adenovíricos per se en la transfección in vitro
de condrocitos es conocido por la técnica anterior.
La presente invención resuelve el problema de
cómo se pueden contrarrestar las enfermedades del cartílago
transluciendo eficientemente un ácido nucleico a condrocitos
primarios. Para este fin, se ha construido un vehículo de
administración de genes consistente en un adenovirus recombinante
que tiene un tropismo por los condrocitos humanos primarios. Por
vehículo de administración de genes, se quiere decir un soporte que
puede administrar al menos un ácido nucleico a una célula huésped.
Dicho ácido nucleico que se administra a una célula huésped puede
tener una secuencia de ácido nucleico codificante de una secuencia
de aminoácidos. Dicho ácido nucleico puede incluir además al menos
un promotor y/o potenciador y/o finalizador. Puede incluir también
sitios de iniciación de la transcripción y similares. Administrando
un ácido nucleico a una célula huésped, dicho ácido nucleico se
mueve del exterior al interior de la célula huésped. La expresión
transitoria del transgén es suficiente para activar las células para
formar hueso o disparar la angiogénesis. Por lo tanto, se prefiere
un vector no integrante, es decir, un adenovirus. La presente
invención muestra que los condrocitos humanos primarios no expresan
niveles detectables de CAR o MHC-clase I, como se
describe en el ejemplo 4. Este último indica que es difícil
transducir los condrocitos humanos primarios con un adenovirus que
entra en las células mediante estas moléculas, como, por ejemplo, el
comúnmente usado adenovirus serotipo 5. Se pueden usar títulos muy
altos de dicho adenovirus, pero esto presenta varios inconvenientes,
tales como una fuerte respuesta inmune causada por síntesis de
novo de genes adenovíricos que pueden cargarse a continuación
en complejos de MHC de clase I y presentarse al sistema inmune una
vez se han trasplantado las células a un hospedador. Para evitar
efectos tóxicos colaterales, gustaría poder transferir un ácido
nucleico a condrocitos humanos primarios por un vehículo de
administración de genes con alta eficacia. Una alta eficiencia de
infección permite una reducción en la carga vírica, que da como
resultado una menor unión de virus a células distintas de las
células diana de interés. Si el vehículo de administración de genes
infecta demasiadas otras células, la expresión del ácido nucleico
administrado en esas otras células puede causar muchos efectos
colaterales. Por lo tanto, la presente invención describe un
vehículo de administración de genes al que se ha hecho específico
para un condrocito primario y que tiene las otras propiedades de los
adenovirus, por ejemplo el no integrar su ADN en el genoma de la
célula huésped. Para obtener especificidad para los condrocitos, la
presente invención describe un adenovirus que contiene una deleción
en el gen codificante de la proteína de la fibra, que es reemplazado
por una secuencia de ácido nucleico codificante de una secuencia de
aminoácidos que tiene tropismo por los condrocitos humanos
primarios. Dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una
secuencia de aminoácidos que tiene tropismo por los condrocitos
humanos primarios puede derivar de cualquier gen codificante de la
proteína de la fibra. Puede contener al menos una mutación que lo
haga diferente de cualquier gen de tipo salvaje codificante de la
proteína de la fibra. Por lo demás, dicho ácido nucleico puede ser
un gen no modificado codificante de proteína de la fibra de
cualquier serotipo. Si el adenovirus descrito en esta invención
consiste en secuencias de ácidos nucleicos de al menos dos serotipos
diferentes, se hace referencia a dicho adenovirus como un adenovirus
quimérico.
Aunque los condrocitos humanos primarios no
expresan niveles detectables de proteína CAR, el adenovirus descrito
en la presente invención es muy capaz de infectar dichos
condrocitos. Por lo tanto, es posible usar un adenovirus
recombinante derivado de una secuencia de adenovirus de serotipo 5,
aunque un adenovirus de serotipo 5 normalmente no infecta
condrocitos primarios. Dicho adenovirus recombinante puede tener una
secuencia de ácido nucleico de adenovirus 5. Puede tener un genoma
de adenovirus 5, que contenga al menos una deleción en su región E1,
donde se inserta o se puede insertar un ácido nucleico de
interés.
En la contrarrestación de las enfermedades del
cartílago, el ácido nucleico que se administra a los condrocitos
humanos primarios preferiblemente codifica para una secuencia de
aminoácidos que inhibe la progresión de la enfermedad del cartílago
o una secuencia de aminoácidos que contrarresta la pérdida de
cartílago. El ácido nucleico puede codificar para un miembro de la
familia de las proteínas de la morfogénesis del hueso.
Alternativamente, el ácido nucleico puede codificar para una
secuencia de aminoácidos que proporcione a la célula huésped otra
función deseada.
Otra característica de la presente invención es
el medio para producir un virus quimérico. Típicamente, no se desea
administrar un lote de adenovirus a una célula huésped que contenga
adenovirus competentes en cuanto a replicación, aunque esto no es
siempre cierto. En general, por lo tanto, se desea omitir un número
de genes (pero al menos uno) del genoma adenovírico en el vector
codificante del virus quimérico y suministrar estos genes al genoma
de la célula a la que se lleva el vector para producir adenovirus
quimérico. Dicha célula es frecuentemente llamada célula de
empaquetamiento. Una célula de empaquetamiento para producir un
adenovirus quimérico según la invención contiene en trans todos los
elementos necesarios para la producción de adenovirus no presentes
en el vector adenovírico según la invención. Típicamente, el vector
y la célula de empaquetamiento tienen que adaptarse entre sí en el
sentido de que tengan todos los elementos necesarios, pero no tengan
elementos solapantes que conduzcan a virus competente en replicación
por recombinación.
La etapa inicial para la infección eficaz es la
unión del adenovirus a su célula diana, un proceso mediado por la
proteína de la fibra. La proteína de la fibra tiene una estructura
trimérica (Stouten y col. 1992) con diferentes longitudes,
dependiendo del serotipo vírico (Signas y col. 1985; Kidd y col.
1993). Diferentes serotipos tienen polipéptidos con extremos N y C
estructuralmente similares, pero diferentes regiones truncales
medias. A nivel N-terminal, los primeros 30
aminoácidos están implicados en el anclaje de la fibra a la base
pentón (Chroboczek y col. 1995), especialmente la región FNPVYP
conservada en la cola (Arnberg y col. 1997). La knob es responsable
de la interacción inicial con el receptor adenovírico celular.
Después de esta unión inicial, se propone que la unión secundaria
entre la base pentón de la cápside y las integrinas de la superficie
celular conduce a la internalización de las partículas víricas en
hoyos revestidos y a endocitosis (Morgan y col. 1969; Svensson y
Persson 1984; Varga y col. 1991; Greber y col. 1993; Wickham y col.
1993).
Las integrinas son
\alpha,\beta-heterodímeros de los que se han
identificado al menos 14 subunidades \alpha y 8 subunidades
\beta (Hynes 1992). La disposición de las integrinas expresadas en
células es compleja y variará entre tipos celulares y con el
ambiente celular. Aunque la knob contiene algunas regiones
conservadas, entre serotipos, las proteínas knob muestran un alto
grado de variabilidad, lo que indica que podrían existir diferentes
receptores de adenovirus. Por ejemplo, se ha demostrado que los
adenovirus del subgrupo C (Ad2, Ad5) y los adenovirus del subgrupo B
(Ad3) se unen a diferentes receptores (Defer y col. 1990). Usando
CAR soluble producido por baculovirus, así como proteína knob de
adenovirus del serotipo 5, Roelvink y col. (1998) concluyeron por
estudios de interferencia que todos los serotipos de adenovirus, a
excepción de los serotipos del subgrupo B, entran en las células a
través de CAR. Esto último, caso de ser válido, limita la
complejidad de la utilización de diferentes serotipos con fines de
terapia génica.
Además de la implicación en la unión celular, la
proteína de la fibra también contiene el antígeno \gamma
específico de tipo, que, junto con el antígeno \varepsilon del
hexón, determina la especificidad de serotipo. El antígeno \gamma
se localiza sobre la fibra y se sabe que consiste en 17 aminoácidos.
Los anticuerpos anti-fibra del hospedador se
dirigen, por lo tanto, a la estructura trimérica de la knob.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un método in vitro y medios mediante los cuales
un adenovirus pueda infectar a condrocitos humanos primarios. Por lo
tanto, se describe la generación de adenovirus preferiblemente
quiméricos basados, por ejemplo, en adenovirus del serotipo 5 con
genes de la fibra modificados. Con este fin, se construyeron dos o
tres plásmidos, que juntos contienen el genoma completo del
adenovirus del serotipo 5. A partir de este plásmido, se eliminó el
ADN codificante de la proteína de la fibra del adenovirus del
serotipo 5 y se substituyó por secuencias de ADN de enlace que
facilitan una fácil clonación. El plásmido en el que se eliminó
parcialmente la secuencia de la fibra nativa del adenovirus del
serotipo 5 sirvió a continuación como plantilla para la inserción de
ADN codificante de la proteína de la fibra derivado de serotipos de
adenovirus diferentes (humanos o animales). Los ADN derivados de los
diferentes serotipos fueron obtenidos usando la técnica de la
reacción en cadena de polimerasa en combinación con oligonucleótidos
(degenerados). En la primera localización E1 en el genoma del
adenovirus del serotipo 5, se puede clonar cualquier ácido nucleico
de interés. Un solo procedimiento de transfección de los dos o tres
plásmidos juntos dio lugar a la formación de un adenovirus quimérico
recombinante. Aunque otros han publicado el éxito en la introducción
de cambios en la fibra y la base pentón del adenovirus del serotipo
5, la compleja estructura de knob y el limitado conocimiento de los
aminoácidos precisos que interaccionan con CAR hacen que dichas
aproximaciones de abordaje sean laboriosas y difíciles.
Para vencer las limitaciones antes descritas,
preferimos usar fibras de adenovirus preexistentes para maximizar
la posibilidad de obtener adenovirus recombinantes que puedan
organizarse normalmente en el núcleo de una célula productora y que
puedan ser producidos en células de empaquetamiento preexistentes.
Generando, por ejemplo, una librería de fibra basada en adenovirus
quimérico de serotipo 5 que contiene proteínas de fibra de todos los
demás serotipos de adenovirus humanos, hemos desarrollado una
tecnología que permite un rastreo rápido de un vector adenovírico
recombinante con características de infección preferidas para
condrocitos humanos primarios.
En otro aspecto, la invención describe la
construcción y el uso de plásmidos consistentes en distintas partes
de, por ejemplo, el adenovirus de serotipo 5, en donde el gen
codificante de la proteína de la fibra ha sido substituido con ADN
derivado de serotipos humanos o animales alternativos. Este conjunto
de construcciones, que abarcan en total el genoma completo del
adenovirus, permite la construcción de adenovirus quiméricos únicos
adaptados para la transducción de tipos celulares u órgano(s)
particulares. Además, en esta parte de la invención se describen
medios y métodos para propagar, producir y purificar fibra de
adenovirus quiméricos.
En otro aspecto de la invención, se describen
virus quiméricos que tienen características de infección preferidas
en condrocitos primarios humanos. Los vectores adenovíricos derivan
preferiblemente de adenovirus del subgrupo B o contienen al menos
una parte funcional de la proteína de la fibra de un adenovirus del
subgrupo B que contiene al menos el resto de unión de la proteína de
la fibra. En otra realización preferida, los vectores adenovíricos
son vectores quiméricos basados en el adenovirus del serotipo 5 y
contienen al menos una parte funcional de la proteína de la fibra
del adenovirus tipo 16, 35 ó 51. Aunque el adenovirus del serotipo 5
no se une a condrocitos primarios, el resto de unión de una
proteína de la fibra adenovírica de un adenovirus de tipo B parece
ser suficiente para hacer que el adenovirus quimérico infecte
eficientemente los condrocitos primarios. Hay que entender que, en
todas las realizaciones, los vectores adenovíricos pueden derivar
del serotipo que tiene las propiedades deseadas, o que el vector
adenovírico se basa en un adenovirus de un serotipo y contiene las
secuencias que incluyen las funciones deseadas de otro serotipo,
substituyendo estas secuencias las secuencias nativas en dicho
serotipo.
En otro aspecto de la invención, los adenovirus
recombinantes pueden o no contener deleciones en la región E1,
donde se inserta o se puede insertar un ácido nucleico de interés.
Más aun, los adenovirus quiméricos pueden o no contener deleciones
en la región E3, E2 y/o E4, donde se inserta o se puede insertar un
ácido nucleico de interés. Si el ácido nucleico de interés no
incluye un promotor, debe unirse a un promotor si el ácido nucleico
de interés es insertado en la región E3, E2 y/o E4. Si el adenovirus
recombinante contiene deleciones en la región E2 y/o E4, se
requieren líneas celulares que complementen E2 y/o E4 para generar
adenovirus recombinantes.
Otro objeto de la presente invención es un
vehículo de administración de genes que tiene un tropismo por los
condrocitos humanos primarios y que consiste en un adenovirus
recombinante. Este adenovirus recombinante puede ser un adenovirus
quimérico. El adenovirus recombinante puede contener una deleción en
el gen codificante de la proteína de la fibra que se substituye por
un ácido nucleico codificante de una secuencia de aminoácidos que
tiene un tropismo por los condrocitos humanos primarios. Como se
describe en esta solicitud, dicho tropismo puede ser obtenido por al
menos una parte determinante de tropismo de una proteína de la fibra
adenovírica de un adenovirus de tipo B y dicha proteína de la fibra
puede derivar de un adenovirus tipo 16, 35 y/o 51. El adenovirus
recombinante puede consistir en una secuencia de ácido nucleico de
adenovirus 5 y puede incluir un genoma de adenovirus 5 que tiene al
menos una deleción en su región E1, donde se inserta o se puede
insertar una secuencia de ácido nucleico de interés. Y puede
contener deleciones en su región E3, E2 y/o E4, donde se inserta o
se puede insertar una secuencia de ácido nucleico de interés, como
se describe en esta solicitud. Este adenovirus recombinante puede
incluir una secuencia de ácido nucleico codificante de al menos una
secuencia de aminoácidos que inhibe la progresión de la enfermedad
del cartílago y/o al menos una secuencia de aminoácidos que
contrarresta la pérdida de cartílago. Puede incluir un ácido
nucleico que codifique para al menos un miembro de la familia de las
proteínas de la morfogénesis ósea. Además, dicho ácido nucleico
puede proporcionar a la célula huésped otra función deseada.
Otro objeto de la presente invención es una
composición farmacéutica para uso en el tratamiento de las
enfermedades del cartílago. Esta composición farmacéutica contiene
un vehículo de administración de genes como se ha descrito en el
párrafo anterior. La ventaja de esta composición farmacéutica es que
puede contrarrestar las enfermedades del cartílago de una forma muy
eficiente, ya que contiene un vehículo de administración de genes
que infecta los condrocitos muy eficientemente. Debido a esta
eficiencia, será suficiente una pequeña cantidad. Por lo tanto,
apenas habrá efectos colaterales. La respuesta inmune será baja.
Además, la composición farmacéutica incluye un vector no integrante,
cosa que debe ser preferida, para evitar la transformación del
genoma de la célula huésped y de su descendencia. Como esta
composición farmacéutica contiene un vector no integrante bien
conocido, es posible producir esta composición, con el aprendizaje
de esta invención, a gran escala.
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar la
presente invención. Se describe la generación de clones plasmídicos
genómicos de adenovirus del serotipo 5 y de virus basados en
adenovirus del serotipo 5 con proteínas de la fibra quiméricas. Se
estudian entonces los condrocitos primarios en cuanto a la expresión
de integrinas y proteína CAR. Finalmente, se determina la
transducción de condrocitos primarios humanos con adenovirus
quiméricos de fibra recombinantes.
Se ha clonado el genoma completo del adenovirus
del serotipo 5 en diversos plásmidos o cósmidos para permitir una
fácil modificación de partes del genoma del adenovirus del serotipo
5, conservando aún la capacidad para producir virus recombinantes.
Con este fin, se generaron los siguientes plásmidos:
Para facilitar la clonación de extremos romos de
las secuencias ITF, se trató ADN de adenovirus humano de tipo
salvaje de tipo 5 (Ad5) con enzima Klenow en presencia de dNTP en
exceso. Tras la inactivación de la enzima Klenow y la purificación
por extracción con fenol/cloroformo seguida de precipitación con
etanol, se digirió el ADN con BamHI. Se usó esta preparación de ADN
sin mayor purificación en una reacción de ligación con ADN vector
derivado de pBr322 preparado como sigue: se dirigió ADN pBr322 con
EcoRV y BamHI, se desfosforiló por tratamiento con enzima TSAP (Life
Technologies) y se purificó en gel de LMP agarosa (SeaPlaque GTG).
Tras la transformación en E. coli DH5\alpha competente
(Life Techn.) y el análisis de colonias resistentes a ampicilina, se
seleccionó un clon que mostró un patrón de digestión tal como se
esperaba para un inserto que se extendía desde el sitio BamHI en
Ad5 hasta el ITR derecho. El análisis de secuencia del límite de
clonación en el ITR derecho reveló que el residuo G más 3' del ITR
estaba ausente; se vio que el resto del ITR era correcto. Dicho
residuo G ausente se complementa por el otro ITR durante la
replicación.
Se digirió pBr/Ad.Bam-rITR con
BamHI y SalI. Se aisló el fragmento del vector que incluía la
inserción de adenovirus en LMP agarosa (SeaPlaque GTG) y se ligó en
un fragmento SalI-BamHI de 4,8 kb obtenido de ADN
Ad5 de tipo salvaje y se purificó con el kit Geneclean II (Bio 101,
Inc.). Se escogió un clon y se determinó la integridad de las
secuencias de Ad5 por análisis con enzimas de restricción. El clon
pBr/Ad.Sal-rITR contiene secuencias de adeno de tipo
5 del sitio SalI en pb 16746 hasta, inclusive, el rITR (al que le
falta la mayor parte del residuo G 3').
Se digirió el ADN del adenovirus tipo 5 con ClaI
y BamHI y se aisló el fragmento de 20,6 kb de gel por
electoelución. Se digirió pBr322 con las mismas enzimas y se
purificó de gel de agarosa por Geneclean. Ambos fragmentos fueron
ligados y transformados en DH5\alpha competente. Se analizó el
clon resultante pBr/Ad.Cla-Bam por digestión con
enzimas de restricción y se vio que contenía una inserción con
secuencias de adenovirus desde pb 919 hasta 21566.
Se linealizó el clon
pBr/Ad.Cla-Bam con EcoRI (en pBr322) y se digirió
parcialmente con AflII. Después de la inactivación por calor de
AflII durante 20 minutos a 65ºC, se rellenaron los extremos del
fragmento con enzima Klenow. Se ligó entonces el ADN a un
oligoenlazante de doble hebra romo que contenía un sitio PacI
(5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3').
Se produjo este enlazante hibridando los siguientes dos
oligonucleótidos:
5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' y
5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3',
haciéndolo romo a continuación con enzima Klenow. Tras la
precipitación del ADN ligado para cambiar el tampón, se digirieron
las ligaciones con un exceso de enzima PacI para eliminar los
concatámeros del oligo. Se aisló el fragmento parcial de 22016 pb
que contenía secuencias Ad5 desde el pb 3534 hasta el 21566 y las
secuencias vectoras en LMP agarosa (SeaPlaque GTG), se volvió a
ligar y se transformó en DH5\alpha competente. Se seleccionó un
clon que resultó contener el sitio PacI y que había conservado el
adenofragmento grande y se secuenció en el extremo 5' para verificar
la correcta inserción del enlazante PacI en el sitio AflII
(perdido).
Para permitir la inserción de un sitio PacI cerca
del ITR de Ad5 en el clon pBr/Ad.Bam-rITR, se
eliminaron aproximadamente 190 nucleótidos entre el sitio ClaI en el
esqueleto pBr322 y el inicio de las secuencias ITR. Se hizo esto
como sigue: se digirió pBr/Ad.Bam-rITR con ClaI y se
trató con nucleasa Bal31 durante períodos de tiempo variables (2
minutos, 5 minutos, 10 minutos y 15 minutos). Se siguió el grado de
eliminación de nucleótidos por reacciones separadas sobre el ADN
pBr322 (también digerido en el sitio ClaI) usando tampones y
condiciones idénticos. Se inactivó la enzima Bal31 por incubación a
75ºC durante 10 minutos, se precipitó el ADN y se resuspendió en un
volumen más pequeño del tampón TE. Para asegurar extremos romos, se
trataron aún los ADN con ADN polimerasa T4 en presencia de un exceso
de dNTP. Tras la digestión del ADN pBr322 (control) con SalI, se
observó una degradación satisfactoria (\sim150 pb) en las muestras
tratadas durante 10 minutos ó 15 minutos. Se ligaron entonces las
muestras de pBr/Ad.Bam-rITR tratadas durante 10
minutos ó 15 minutos con los enlazantes PacI romos antes descritos
(véase pBr/Ad.AflII-Bam). Se purificaron las
ligaciones por precipitación, se digirieron con un exceso de PacI y
se separaron de los enlazantes en gel de LMP agarosa. Tras la
religación, se transformaron los ADN en DH5\alpha competente y se
analizaron las colonias. Se seleccionaron diez clones que mostraban
una deleción de aproximadamente la longitud deseada y éstos fueron
además analizados por secuenciación de rastreo de T (kit de
secuenciación T7, Pharmacia Biotech). Se encontraron dos clones con
el enlazante PacI insertado justo secuencia abajo del rITR. Tras la
digestión con PacI, el clon #2 tiene 28 pb y el clon #8 tiene 27 pb
unidos al ITR.
Se usó el vector cosmídico pWE15 (Clontech) para
clonar inserciones de Ad5 mayores. Primeramente, se insertó un
enlazante que contenía un sitio PacI único en los sitios EcoRI de
pWE15 creando pWE.pac. Con este fin, se usó oligo PacI de doble
hebra, según se ha descrito para pBr/Ad.AflII-BamHI,
pero ahora con sus extremos sobresalientes EcoRI. Se aislaron
entonces los siguientes fragmentos por electroelución en gel de
agarosa: pWE.pac digerido con PacI, pBr/AflII-Bam
digerido con PacI y BamHI y pBr/Ad.Bam-rITR#2
digerido con BamHI y PacI. Se ligaron estos fragmentos entre sí y se
empaquetaron usando extractos de empaquetamiento de fago l
(Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en
bacterias huésped, se cultivaron las colonias en placas y se
analizaron en cuanto a la presencia de la inserción completa.
pWE/Ad.AflII-rITR contiene todas las secuencias del
adenovirus de tipo 5 desde pb 3534 (sitio AflII) hasta el ITR
derecho inclusive (que carecía de la mayor parte del residuo G
3').
Se trató ADN de adenovirus 5 de tipo salvaje con
enzima Klenow en presencia de dNTP en exceso y se digirió a
continuación con SalI. Se aislaron dos de los fragmentos
resultantes, designados como ITR
izquierdo-Sal(9.4) y
Sal(16.7)-ITR derecho, respectivamente, en
LMP agarosa (SeaPlaque GTG). Se digirió el ADN de pBr322 con EcoRV y
SalI y se trató con fosfatasa (Life Technologies). Se aisló el
fragmento vector usando el método Geneclean (BIO 101, Inc.) y se
ligó a los fragmentos SalI de Ad5. Sólo la ligación con el fragmento
de 9,4 kb dio colonias con una inserción. Después de analizar y
secuenciar el límite de clonación, se eligió un clon que contenía
toda la secuencia ITR y que se extendía al sitio SalI en el pb
9462.
Se digiere
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) con SalI y se
desfosforila (TSAP, Life Technologies). Para prolongar este clon
hasta el tercer sitio SalI en Ad5, se linealizó
pBr/Ad.Cla-Bam con BamHI y se digirió parcialmente
con SalI. Se aisló un fragmento SalI de 7,3 kb que contenía
secuencias de adenovirus de 9462-16746 en gel de LMP
agarosa y se ligó al fragmento vector
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) digerido con SalI.
Se digirió pWE-pac con ClaI y se
rellenaron los extremos sobresalientes 5' usando enzima Klenow. Se
digirió entonces el ADN con PacI y se aisló de gel de agarosa. Se
digirió pWE/AflII-rITR con EcoRI y, tras el
tratamiento con enzima Klenow, se digirió con PacI. Se aisló el
fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovíricas
de gel de agarosa y se ligó al vector pWE.pac digerido con ClaI y
hecho romo usando el kit Ligation Express™ (Clontech). Después de la
transformación de células XL10-Gold Ultracompetentes
de Stratagene, se identificaron los clones que contenían la
inserción esperada. pWE/AflII-EcoRI contiene
secuencias de Ad5 de los pb 3534-27336.
La ausencia de solapamiento de secuencias entre
el adenovirus recombinante y las secuencias E1 en la línea de
células de empaquetamiento es esencial para una generación libre de
RCA y una propagación seguras de nuevos virus recombinantes. El
plásmido adaptador pMLPI.TK es un ejemplo de un plásmido adaptador
diseñado para uso según la invención en combinación con las líneas
celulares de empaquetamiento mejoradas de la invención. Se usó este
plásmido para producir un nuevo vector en el que se pueden
intercambiar fácilmente moléculas de ácido nucleico consistentes en
secuencias promotoras y génicas específicas. Primeramente, se generó
un fragmento PCR a partir de ADN plantilla
pZip\DeltaMo+PyF101(N^{-}) (descrito en WO 96/35798) con
los siguientes cebadores: LTR-1:
5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA
ATA CAT AAC TG-3' y LTR-2:
5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT
AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Se usó la
ADN polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim) según el protocolo de los
fabricantes con los siguiente ciclos de temperatura: una vez 5
minutos a 95ºC, 3 minutos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC y 30 ciclos de 1
minuto a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, 1 minuto a 72ºC, seguido de una vez
10 minutos a 72ºC. Se digirió entonces el producto de la PCR con
BamHI y se ligó en el vector pMLP10 (Levrero y col. 1991) digerido
con PvuII y BamHI, generando así el vector pLTR10. Este vector
contiene secuencias adenovíricas desde el pb 1 hasta el pb 454,
seguidas de un promotor consistente en una parte del
Mo-MuLV LTR que tiene sus secuencias potenciadoras
de tipo salvaje substituidas por el potenciador de un virus de
polioma mutante (PyF101). Se designó el fragmento promotor como
L420. A continuación, se insertó la región codificante del gen HSA
murino. Se digirió pLTR10 con BstBI, seguido de tratamiento con
Klenow y digestión con NcoI. Se obtuvo el gen HSA por amplificación
por PCR sobre pUC18-HSA (Kay y col. 1990) usando los
siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA
GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT
AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG
AA-3'. El fragmento amplificado de 269 pb fue
subclonado en un vector lanzadera usando los sitios NcoI y BglII. La
secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificante
correcta del gen HSA, pero con una inserción TAG extra directamente
después del codon de parada TAG. Se cortó entonces la región
codificante del gen HSA, incluyendo la duplicación TAG, como un
fragmento NcoI (adherente)-SalI (romo) y se clonó en
el fragmento NcoI (adherente)/BstBI (romo) de 3,5 kb de pLTR10,
dando lugar a pLTR-HSA10.
Finalmente, se digirió pLTR-HSA10
con EcoRI y BamHI, después de lo cual se insertó el fragmento que
contenía el ITR izquierdo, señal de empaquetamiento, promotor L420 y
gen HSA en el vector pMLPI.TK digerido con las mismas enzimas y
substituyendo así las secuencias promotoras y génicas. Esto dio
lugar al nuevo plásmido adaptador pAd/L420-HSA, que
contiene sitios de reconocimiento convenientes para diversas enzimas
de restricción alrededor de las secuencias promotoras y génicas. Se
pueden combinar SnaBI y AvrII con HpaI, NheI, KpnI y HindIII para
intercambiar las secuencias promotoras, mientras que estos últimos
sitios pueden combinarse con los sitios ClaI o BamHI 3' de la región
codificante HSA para substituir los genes en esta construcción.
Otro plásmido adaptador que fue diseñado para
permitir un fácil intercambio de moléculas de ácido nucleico fue
producido substituyendo las secuencias promotoras, génicas y poli A
en pAd/L420-HSA con el promotor de CMV, un sitio de
clonación múltiple, un intrón y una señal poli A. Con este fin, se
digirió pAd/L420-HSA con AvrII y BglII, seguido de
tratamiento con Klenow para obtener extremos romos. Se aisló el
fragmento de 5,1 kb con vector pBr322 y secuencias adenovíricas y se
ligó a un fragmento romo de 1570 pb de pcDNA1/amp (Invitrogen)
obtenido por digestión con HhaI y AvrII, seguida de tratamiento con
ADN polimerasa T4. Este plásmido adaptador fue llamado pCLIP.
Para generar adenovirus recombinantes con
deleción E1 con el nuevo sistema basado en plásmidos, se prepararon
las siguientes construcciones: a) una construcción adaptadora que
contenía el cassette de expresión con el ácido nucleico de interés
linealizado con una enzima de restricción que corta en el lado 3'
del fragmento de genoma adenovírico solapante, preferiblemente que
no contiene ninguna secuencia vectora pBr322, y b) una construcción
genómica adenovírica complementante
pWE/Ad.AflII-rITR digerida con PacI. Estas dos
moléculas de ADN fueron purificadas además por extracción con
fenol/cloroformo y precipitación con EtOH. La cotransfección de
estos plásmidos en una línea celular empaquetadora de adenovirus
generó adenovirus deficientes en replicación recombinantes por una
recombinación homóloga en una etapa entre el adaptador y la
construcción complementante.
Alternativamente, en lugar de
pWE/Ad.AflII-rITR se pueden usar otros fragmentos,
v.g., se pueden combinar pBr/Ad.Cla-Bam digerido
con EcoRI y BamHI o pBr/Ad.AflII-BamHI digerido con
PacI y BamHI con pBr/Ad.Sal-rITR digerido con SalI.
En este caso, se combinan tres plásmidos y se necesitan dos
recombinaciones homólogas para obtener un adenovirus recombinante.
Hay que entender que los expertos en la técnica pueden usar otras
combinaciones de plásmidos adaptadores y complementantes sin
desviarse de la presente invención. Se ha llevado a cabo un
protocolo general según se señala a continuación y que pretende ser
un ejemplo no limitante de la presente invención para producir
diversos adenovirus recombinantes usando diversos plásmidos
adaptadores y el fragmento Ad.AflII-rITR. Se
sembraron células empaquetadoras de adenovirus (PER.C6) en matraces
de \sim25 cm^{2} y se transfectaron al día siguiente, cuando
tenían \sim80% de confluencia, con una mezcla de ADN y agente
lipofectamina (Life Techn.) según describe el fabricante. De forma
rutinaria, se usan 40 \mul de lipofectamina, 4 \mug de plásmido
adaptador y 4 \mug del fragmento del genoma adenovírico
complementante AflII-rITR (ó 2 \mug de los tres
plásmidos para la recombinación homóloga doble). En estas
condiciones, se obtienen eficiencias de transfección transitorias de
\sim50% (48 h post-transfección), según se
determina con transfecciones control usando un adaptador
pAd/CMV-LacZ. A los dos días, se pasan las células a
matraces de \sim80 cm^{2} y se vuelven a cultivar.
Aproximadamente cinco (para la recombinación homóloga simple) a once
días (para la recombinación homóloga doble) después, se observa un
efecto citopático (ECP), lo que indica que se ha formado adenovirus
funcional. Se recogen las células y el medio cuando el ECP es
completo y se libera el virus recombinante por
congelación-descongelación. Se realiza
rutinariamente una etapa extra de amplificación en un matraz de 80
cm^{2} para aumentar el rendimiento, ya que, en la etapa inicial,
se ve que los títulos son variables a pesar de producirse un ECP
completo. Tras la amplificación, se recogen los virus y se purifican
por placa en células PER.C6. Se estudian las placas individuales en
cuanto a virus con transgenes activos.
Además de substituciones en la región E1, es
posible suprimir y reemplazar (parte de) la región E3 en el
adenovirus, ya que las funciones de E3 no son necesarias para la
replicación, el empaquetamiento y la infección del virus
(recombinante). Esto crea la oportunidad de usar una inserción mayor
o de insertar más de un gen sin sobrepasar el tamaño máximo de
empaquetamiento (aproximadamente un 105% de la longitud del genoma
de tipo salvaje). Puede hacerse esto, v.g., por deleción de parte de
la región E3 en el clon pBr/Ad.Bam-rITR por
digestión con XbaI y religación. Esto elimina las secuencias de tipo
salvaje de Ad5 28592-30470, incluyendo todas las
regiones conocidas codificantes de E3. Otro ejemplo es la
substitución precisa de la región codificante de gp19K en la región
E3 con un polienlazante que permite la inserción de nuevas
secuencias. Esto 1) deja las demás regiones codificantes intactas y
2) obvia la necesidad de un promotor heterólogo, ya que el transgén
es dirigido por el promotor E3 y secuencias pA, dejando más espacio
para secuencias codificantes. Con este fin, se clonó el fragmento
EcoRI de 2,7 kb de Ad5 de tipo salvaje que contiene la parte 5' de
la región E3 en el sitio EcoRI de pBlue-script
(KS^{-}) (Stratagene). A continuación, se eliminó el sitio HindIII
en el polienlazante por digestión con EcoRV y HincII y posterior
religación. Se usó el clon resultante,
pBS.Eco-Eco/ad5DHIII, para suprimir la región
codificante de gp19K. Se usaron cebadores 1 (5'-GGG
TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3') y 2
(5'-GAT CCC ATG GAA GCT TGG GTG GCG ACC CCA
GCG-3') para amplificar una secuencia de
pBS.Eco-Eco/Ad5DHIII correspondiente a las
secuencias 28511 a 28734 en el ADN de Ad5 de tipo salvaje. Se usaron
cebadores 3 (5'-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT
ACA AAG CTA-3') y 4 (5'-GTC GCT GTA
GTT GGA CTG G-3') sobre el mismo ADN para amplificar
secuencias de Ad5 de 29217 a 29476. Se ligaron los dos fragmentos de
PCR resultantes entre sí en virtud del nuevo sitio NcoI introducido
y se digirió a continuación con XbaI y MunI. Se ligó entonces este
fragmento en el vector pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII,
que fue digerido con XbaI (parcialmente) y MunI, generando
pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K. Para
permitir la inserción de genes extraños en el sitio HindIII y BamHI,
se hizo una deleción XbaI en
pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K para
eliminar el sitio BamHI en el polienlazante Bluescript. El plásmido
resultante
pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII\Deltagp19K\DeltaXbaI
contiene sitios únicos HindIII y BamHI correspondientes a las
secuencias 28733 (HindIII) y 29218 (BamHI) en Ad5. Después de la
introducción de un gen extraño en estos sitios, se reintroduce el
fragmento XbaI suprimido o se vuelve a clonar la inserción en
pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K usando
HindIII y, por ejemplo, MunI. Usando este procedimiento, hemos
generado plásmidos que expresan HSV-TK,
hIL-1a, IL-3 de rata, luciferasa o
LacZ. Los sitios únicos SrfI y NotI en el plásmido
pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K (con o sin
gen de interés insertado) son usados para transferir la región que
contiene el gen de interés a la región correspondiente de
pBr/Ad.Bam-rITR, obteniéndose la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR\Deltagp19K (con o sin gen de
interés insertado). Esta construcción es usada como se ha descrito
antes para producir adenovirus recombinantes. En el contexto
vírico, la expresión de los genes insertados es dirigida por el
promotor E3 de adenovirus.
Se generan virus recombinantes con deleción tanto
de E1 como de E3 por un procedimiento de doble recombinación
homóloga como se ha descrito antes para vectores de substitución de
E1 usando un sistema basado en plásmido consistente en:
a) un plásmido adaptador para substitución de E1
según la invención, con o sin inserción de un primer gen de
interés,
b) el fragmento
pWE/Ad.AflII-EcoRI y
c) el plásmido
pBr/Ad.Bam-rITR\Deltagp19K con o sin inserción de
un segundo gen de interés.
Además de manipulaciones en la región E3, se
pueden conseguir cambios de (partes de) la región E4 fácilmente en
pBr/Ad.Bam-rITR. La generación y propagación de tal
virus, sin embargo, en algunos casos requiere complementación in
trans.
Se describe a continuación el método para generar
adenovirus recombinantes por cotransfección de dos o más secuencias
de adenovirus clonadas separadas. Una de estas secuencias de
adenovirus clonadas fue modificada de tal forma que se suprimió el
ADN de la fibra del adenovirus del serotipo 5 y se substituyó por
sitios únicos de restricción, generando así "clones plantilla"
que permiten una fácil introducción de secuencias de ADN
codificantes de la proteína de la fibra derivadas de otros serotipos
de adenovirus.
La secuencia codificante de la fibra del
adenovirus serotipo 5 se localiza entre los nucleótidos 31042 y
32787. Para eliminar el ADN del adenovirus serotipo 5 codificante de
la fibra, partimos de la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR. Primeramente, se eliminó un sitio
NdeI de esta construcción. Para este fin, se digirió el ADN del
plásmido pBr322 con NdeI, después de lo cual se rellenaron los
extremos sobresalientes usando enzima Klenow. Se volvió a ligar
entonces este plásmido pBr322, se digirió con NdeI y se transformó
en E. coli DH5\alpha. Se digirió el plásmido obtenido
pBr/\DeltaNdeI con ScaI y SalI y se ligó el fragmento del vector
de 3198 pb resultante al fragmento ScaI-SalI de
15349 pb derivado de pBr/Ad.BamrITR, dando lugar al plásmido
pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI, que por ello contenía
un sitio único NdeI. A continuación, se realizó una PCR con
oligonucleótidos NY-up: 5'- CGA CAT ATG TAG
ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' y
NY-down: 5'-GGA GAC CAC TGC CAT
GTT-3'. Durante la amplificación, se introdujeron
tanto un sitio de restricción NdeI (negrita) como uno NsiI
(subrayado) para facilitar la clonación de los ADN de la fibra
amplificados. La amplificación consistía en 25 ciclos cada uno de 45
seg. a 94ºC, 1 min. a 60ºC y 45 seg. a 72ºC. La reacción PCR
contenía 25 pmol de oligonucleótidos NY-up o
NY-down, dNTP 2 mM, tampón PCR con MgCl_{2} 1,5 mM
y 1 unidad de polimerasa termoestable Elongase (Gibco, Países
Bajos). Se llevó una décima parte del producto de la PCR a un gel de
agarosa que demostró que el fragmento esperado de ADN de \pm 2200
pb estaba amplificado. Este fragmento de PCR fue a continuación
purificado usando el sistema del kit Geneclean (Bio 101 Inc). Se
digirió entonces la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI, así como el producto
de la PCR, con enzimas de restricción NdeI y SbfI. Se clonó a
continuación el fragmento de la PCR usando enzima ligasa T4 en
pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI digerido con SbfI,
generando pBr/Ad.BamR\DeltaFib. Este plásmido permite la inserción
de cualquier secuencia de la fibra amplificada por PCR a través de
los sitios únicos NdeI y NsiI, que se insertan en lugar de la
secuencia de la fibra eliminada. Se pueden generar virus por una
doble recombinación homóloga en células empaquetadoras descritas a
continuación usando un plásmido adaptador, la construcción
pBr/Ad.AflII-EcoRI, digerida con PacI y EcoRI, y una
construcción pBr/Ad.BamR\DeltaFib, en donde se han insertado
secuencias de la fibra heterólogas. Para aumentar la eficacia de la
generación de virus, se modificó la construcción
pBr/Ad.BamR\DeltaFib para generar un sitio PacI que flanquea el
ITR derecho. Hasta aquí, se digirió pBr/Ad.BamR\DeltaFib con AvrII
y se aisló el adenofragmento de 5 kb y se introdujo en el vector
pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8, substituyendo el fragmento
AvrII correspondiente. La construcción resultante fue denominada
pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac. Una vez introducida una secuencia de la
fibra heteróloga en pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac, se puede introducir
el clon de adenovirus derecho modificado de la fibra en un clon
cosmídico grande como se describe para
pWE/Ad.AflII-rITR en el ejemplo 1. Dicho gran clon
cosmídico permite la generación de adenovirus por sólo una
recombinación homóloga, haciendo que el proceso sea extremadamente
eficiente.
Para permitir la amplificación de los ADN
codificantes de la proteína de la fibra derivados de serotipos
alternativos, se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Con este
fin, se alinearon primeramente secuencias de ADN conocidas
codificantes de la proteína de la fibra de serotipos alternativos
para identificar regiones conservadas en la región de la cola, así
como en la región knob de la proteína de la fibra. Para la
alineación, que contenía la secuencia nucleotídica de 19 serotipos
diferentes que representaban a los 6 subgrupos, se sintetizaron
oligonucleótidos (degenerados) (véase la Tabla II). También se
muestra en la Tabla II la combinación de oligonucleótidos usados
para amplificar el ADN codificante de la proteína de la fibra de un
serotipo especifico. La reacción de amplificación (50 \mul)
contenía dNTP 2 mM, 25 pmol de cada oligonucleótido, tampón PCR 1x
estándar, MgCl_{2} 1,5 mM y 1 Unidad de polimerasa termoestable
Pwo (Boehringer) por reacción. El programa ciclador contenía 20
ciclos, cada uno consistente en 30 seg. a 94ºC, 60 seg. a
60-64ºC y 120 seg. a 72ºC. Se llevó un 10% del
producto de la PCR a un gel de agarosa que demostró que se había
amplificado un fragmento de ADN. De cada diferente plantilla, se
realizaron dos reacciones PCR independientes, después de lo cual se
secuenciaron los fragmentos de PCR independientes obtenidos para
determinar la secuencia nucleotídica. De 11 serotipos diferentes, se
pudo comparar la secuencia nucleotídica con secuencias presentes en
Genbank. De todos los demás serotipos, el ADN codificante de la
proteína de la fibra era previamente desconocido y fue, por lo
tanto, alineado con secuencias conocidas de otros miembros del
subgrupo para determinar la homología, es decir, la divergencia de
secuencia. De los 51 serotipos humanos conocidos hasta la fecha,
todas las secuencias de la fibra, a excepción de los serotipos 1, 6,
18 y 26, han sido amplificadas y secuenciadas.
Se digirieron todos los ADN de la fibra
amplificados, así como el vector (pBr/Ad.BamR\DeltaFib) con NdeI
y NsiI. Los ADN digeridos fueron a continuación llevados a un gel de
agarosa, después de lo cual se aislaron los fragmentos del gel y se
purificaron usando el kit Geneclean (Bio 101 Inc). Se clonaron
entonces los fragmentos de PCR en los sitios NdeI y NsiI de
pBr/AdBamR\DeltaFib, generando así pBr/AdBamRFibXX (donde XX
representa el número de serotipo del que se aisló el ADN de la
fibra). Hasta ahora, se ha clonado la secuencia de la fibra de los
serotipos 5/ 7/ 8/ 9/ 10/ 11/ 12/ 13/ 14/ 16/ 17/ 19/ 21/ 24/ 27/
28/ 29/ 30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 36/ 37/ 38/ 40-S/
40-L/ 41-S/ 42/ 45/ 47/ 49/ 51 en
pBr/AdBamRFibXX. A partir de pBr/AdBamRFibXX (donde XX es 5/ 8/ 9/
10/ 11/ 13/ 16/ 17/ 24/ 27/ 30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 38/
40-S/ 40-L/ 45/ 47/ 49/ 51), se
generó un clon cosmídico en pWE/Ad.AflII-rITR (véase
el ejemplo 1) para facilitar una generación eficiente de virus. Esta
clonación cosmídica dio lugar a la formación de la construcción
pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX (donde XX representa el
número de serotipo del que se aisló el ADN de la fibra).
Para generar adenovirus recombinante portador de
la fibra del serotipo 12, 16, 28, 40-L, 51 y 5, se
transfectaron tres construcciones, pCLIP/luciferasa,
pWE/AdAflII-Eco y pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (XX = 12,
16, 28, 40-L, 51 y 5), en células productoras de
adenovirus. Para generar virus Ad5 recombinante portador de la fibra
de 5/ 7/ 8/ 9/ 10/ 11/ 12/ 13/ 14/ 16/ 17/ 19/ 21/ 24/ 27/ 28/ 29/
30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 36/ 37/ 38/ 40-S/
40-L/ 41-S/ 42/ 45/ 47/ 49/ 51, se
transfectaron dos construcciones, pCLIP/luciferasa y
pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX, en células productoras de
adenovirus. Para la transfección, se diluyeron 2 \mug de
pCLIP/luciferasa y 4 \mug tanto de pWE/AdAflII-Eco
como de pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (o, en el caso de los cósmidos: 4
\mug de pCLIP/luciferasa más 4 \mug de
pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX) en DMEM libre de suero a
100 \mul de volumen total. Se añadieron a esta suspensión de ADN
100 \mul de Lipofectamine (Gibco) diluida 1x. Después de 30
minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución del complejo
ADN-lipofectamine a 2,5 ml de DMEM libre de suero,
que fue a continuación añadido a un matraz de cultivo de tejidos T25
cm^{2}. Este matraz contenía 2 x 10^{6} células PER.C6, que
fueron sembradas 24 horas antes de la transfección. A las dos horas,
se diluyó una vez el medio que contenía el complejo
ADN-lipofectamine por adición de 2,5 ml de DMEM
suplementado con un 20% de suero de ternera fetal. De nuevo 24 horas
después, se cambió el medio por DMEM fresco suplementado con un 10%
de suero de ternera fetal. Se cultivaron las células durante
6-8 días, se recogieron a continuación y se
congelaron/descongelaron 3 veces. Se eliminaron los restos celulares
por centrifugación durante 5 minutos a 3.000 rpm y a temperatura
ambiente. Del sobrenadante (12,5 ml), se usaron 3-5
ml para infectar de nuevo células PER.C6 (matraces de cultivo de
tejidos T80 cm^{2}). Esta reinfección da lugar a un efecto
citopatogénico (ECP) completo después de 5-6 días,
después de lo cual se recoge el adenovirus como se ha descrito
antes. Además de la construcción y generación de vectores quiméricos
en cuanto a la fibra portadores sólo de luciferasa como gen marcador
como se ha descrito antes, se generaron muchos virus quiméricos en
cuanto a la fibra portadores de otros genes marcadores usando pCLIP
o pAdapt como plásmidos adaptadores, en donde, por ejemplo, se
clonaron LacZ o proteína fluorescente verde ("GFP") en el
polienlazante presente en estos plásmidos. Aquí, se usaron
pCLIP/LacZ y pAdapt.GFP para generar adenovirus recombinantes que
expresaban los transgenes respectivos (estos diferentes plásmidos
adaptadores han sido descritos anteriormente y en WO 99/55132, WO
00/63403 y WO 01/20014).
Del sobrenadante obtenido de células PER.C6
transfectadas, se usaron 10 ml para inocular un fermentador de 1 l
que contenía 1-1,5 x 10^{6} células/ml de PER.C6,
que estaban específicamente adaptadas para crecer en suspensión.
Tres días después de la inoculación, las células fueron recogidas y
se obtuvo una pella por centrifugación durante 10 minutos a 1.750
rpm y a temperatura ambiente. Se extrajeron a continuación los
adenovirus quiméricos presentes en la pella celular y se purificaron
usando el siguiente protocolo de procesado secuencia abajo. Para
producciones a pequeña escala, se usaron células PER.C6 adherentes
en combinación con matraces de cultivo de tejidos T175 cm^{2}.
Independientemente de la escala de la producción, las células fueron
tratadas de manera idéntica. Se disolvió la pella en 50 ml de
NaPO_{4}^{-} 10 mM y se congeló a -20ºC. Después de descongelar
a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de desoxicolato (5% p/v), después de lo
cual se homogeneizó la solución. Se incubó la solución a
continuación durante 15 minutos a 37ºC para romper por completo las
células. Tras homogeneizar la solución, se añadieron 1.875 \mul de
MgCl_{2}^{-} (1M) y 5 ml de glicerol al 100%. Tras la adición de
375 \mul de ADNasa (10 mg/ml), se incubó la solución durante 30
minutos a 37ºC. Se eliminaron los restos celulares por
centrifugación a 1.880g durante 30 minutos a temperatura ambiente
sin poner el freno. Se purificó a continuación el sobrenadante de
proteínas cargando 10 ml de freón. Tras centrifugar durante 15
minutos a 2.000 rpm sin freno a temperatura ambiente, tres bandas
eran visibles, de las cuales la banda superior representa el
adenovirus. Se aisló esta banda pipeteando, después de lo cual se
cargó en un gradiente de bloque de cloruro de cesio tamponado con
Tris/HCl (1M) (rango: 1,2 a 1,4 g/ml). Tras centrifugar a 21.000 rpm
durante 2,5 h a 10ºC, se purificó el virus del resto de la proteína
y de los restos celulares, ya que el virus, contrariamente a los
otros componentes, no migra a la solución de cloruro de cesio de 1,4
g/ml. Se aísla la banda vírica, después de lo cual se realiza una
segunda purificación usando un gradiente continuo tamponado con
Tris/HCl (1M) de 1,33 g/ml de cloruro de cesio. Después de cargar el
virus encima de este gradiente, se centrifuga el virus durante 17 h
a 55.000 rpm a 10ºC. A continuación, se aísla la banda vírica y,
después de añadir 30 \mul de sacarosa (50 p/v), se elimina el
exceso de cloruro de cesio por tres rondas de diálisis, consistiendo
cada ronda en 1 h. Para la diálisis, se transfiere el virus a
portaobjetos de diálisis
(Slide-a-lizer, corte a 10.000 kDa,
Pierce, EE.UU.). Los tampones usados para la diálisis son PBS,
suplementado con una concentración creciente de sacarosa (rondas 1 a
3: 30 ml, 60 ml y 150 ml de sacarosa (50% p/v)/1,5 litros de PBS,
todas suplementadas con 7,5 ml de CaMgCl_{2} al 2% (p/v). Después
de la diálisis, se retira el virus del
slide-a-lizer, después de lo cual se
alicuota en porciones de 25 y 100 \mul, tras de lo cual se guarda
el virus a -85ºC. Para determinar el número de partículas víricas
por ml, se llevan 100 \mul de cada lote de virus a un cromatógrafo
líquido de alta presión (HPLC). El adenovirus se une a la columna
(intercambio aniónico), después de lo cual se eluye usando un
gradiente de NaCl (rango 300-600 mM). Determinando
el área bajo el pico de virus, se puede calcular el número de
partículas víricas. Para determinar el número de unidades
infecciosas (UI) por ml presentes en un lote de virus, se realizan
titulaciones sobre células 911. Con este fin, se siembran 4 x
10^{4} células 911 por pocillo de placas de 96 pocillos en las
filas B, D y F en un volumen total de 100 \mul por pocillo. Tres
horas después de la siembra, las células se unen al soporte de
plástico, después de lo cual se puede eliminar el medio. Se añade a
las células un volumen de 200 \mul, por duplicado, que contiene
diferentes diluciones de virus (rango: 10^{2} veces diluido hasta
2 x 10^{9}). Rastreando el ECP , se considera que la dilución del
virus que aún da ECP después de 14 días contiene al menos una unidad
infecciosa. Usando esta observación, junto con la cantidad calculada
de volumen de virus presente en estas células, se obtiene el número
de unidades infecciosas por ml de un lote de virus dado. En la Tabla
II se muestran los resultados de producción, es decir, las
partículas de virus por ml de adenovirus quiméricos con el ADNc de
luciferasa como marcador.
Para estudiar la expresión sobre condrocitos
primarios para las moléculas de membrana que se sabe están
implicadas en la infección por Ad5, se estudió la presencia de CAR y
de a_{v}-integrinas en un citómetro de flujo. Como
el dominio alfa-2 del MHC clase I ha sido también
propuesto como receptor para Ad5, se estudió también la expresión de
esta molécula. Con este fin, se lavaron 2 x 10^{4} condrocitos una
vez con PBS/0,5% de BSA, tras de lo cual se centrifugaron las
células durante 5 minutos a 1.750 rpm a temperatura ambiente.
A continuación, se añadieron 10 \mul de un
anticuerpo a_{v}b3 diluido 100 veces (Mab 1961, Brunswick chemie,
Países Bajos), un anticuerpo a_{v}b5 diluido 100 veces (anticuerpo
Mab 1976, Brunswick chemie, Países Bajos) o anticuerpo CAR diluido
1.000 veces (Hsu y col. 1988) (una amable donación del Dr.
Bergelson, Harvard Medical School, EE.UU.) a la pella celular,
después de lo cual se incubaron las células durante 30 minutos a 4ºC
en un ambiente obscuro. Después de esta incubación, se lavaron las
células dos veces con PBS/0,5% de BSA y se volvió a formar una pella
por centrifugación durante 5 minutos a 1.750 rpm a temperatura
ambiente. Para marcar las células, se añadieron 10 ml de IgG1 de
rata anti-ratón marcada con ficoeritrina (PE) a la
pella celular, después de lo cual se incubaron de nuevo las células
durante 30 minutos a 4ºC en un ambiente obscuro. Finalmente, se
lavaron las células dos veces con PBS/0,5% de BSA y se analizaron en
un citómetro de flujo. En la figura 1 se muestran los resultados de
estos experimentos. Por los resultados, se puede concluir que los
condrocitos humanos primarios no expresan niveles detectables de
CAR, que es el receptor primario para Ad5. Las células sí expresan
MHC-clase I, pero, como éste es un receptor de muy
baja afinidad, los resultados confirman que los condrocitos son
difíciles de transducir con un adenovirus de serotipo 5.
Se cultivaron condrocitos primarios humanos en
medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10%
de suero de ternera fetal y suplementado además con aminoácidos
esenciales (prolina 0,4 mM), aminoácidos no esenciales (1x) y ácido
cólico-6-fosfato (0,2 mM) y
tamponado con HEPES (10 mM) (todos los materiales derivados de
Gibco). En un primer experimento, se sembraron 10^{5} condrocitos
en pocillos de placas de 24 pocillos. Al día siguiente, las células
fueron expuestas a 100, 500 ó 1.000 partículas víricas por célula de
virus quiméricos en cuanto a la fibra recombinantes portadores de
la fibra del serotipo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 24, 27, 30, 32,
33, 35, 38, 40-S, 40-L, 45, 47, 49 ó
51. En estos experimentos, se tomó el vector parental (fib5) como
referencia. A las 48 h de la adición del virus, se lavaron dos veces
las células con 1 ml de PBS, después de lo cual se lisaron las
células añadiendo 100 \mul de tampón de lisis celular. Los lisados
fueron transferidos a continuación a placas de 96 pocillos y
guardados a -20 grados Celsius hasta la medición de la actividad
luciferasa. Se determinó la actividad luciferasa usando una máquina
de bioluminiscencia, el kit de ensayo de luciferasa de Promega™ (Nº
de catálogo E-1501) y las instrucciones
proporcionadas por el fabricante. Los resultados de la expresión
del transgén de la luciferasa medida en condrocitos humanos
primarios tras transducción con el panel de virus quiméricos en
cuanto a fibra son mostrados en la figura 2A y B (condrocitos
derivados de dos donantes individuales). Los resultados demuestran
que diversos virus quiméricos en cuanto a la fibra se comportan
mejor en condrocitos en comparación con el virus parental (Ad5).
Estos virus llevan la fibra de virus del B, es decir, 11, 16, 35 y
51. Además, varios, aunque no todos, de los virus portadores de una
fibra originada del subgrupo D, es decir, 8, 13 y 32, están mejor
equipados para transducir condrocitos. Estos resultados, por lo
tanto, muestran claramente que, a partir de una librería que
contiene diferentes vectores quiméricos en cuanto a la fibra, se
pueden identificar adenovirus que están mejorados en cuanto a su
capacidad para transducir tipos celulares humanos de interés, es
decir, condrocitos. Más aún, estos resultados demuestran que los
adenovirus humanos, entre subgrupos, pero incluso dentro de un
subgrupo, pueden reconocer distintas moléculas de unión sobre las
células humanas.
Para determinar el efecto de la infección por
adenovirus en el tiempo sobre los condrocitos en términos de
toxicidad, se sembraron condrocitos primarios humanos 24 h antes de
la infección a una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo en una
placa de 24 pocillos. Las células fueron infectadas con uno de los
virus mejorados identificado, es decir, Ad5Fib16. Se infectaron los
condrocitos con Ad5Fib16LacZ usando m.o.i. de 100, 1.000 y 5.000
pv/célula. Los virus permanecieron en la solución a lo largo de todo
el experimento. Se monitorizó la expresión de LacZ a diferentes
puntos de tiempo: 20, 44, 68, 140, 164 y 188
post-infección. Se determinó la viabilidad de las
células usando el ensayo MTS de Promega con las instrucciones
facilitadas por el fabricante. En general, se añadieron 200 \mul
del así llamado Reactivo de Una Solución Acuosa para Titulación
Celular al pocillo y se incubó durante 4 h a 37ºC. Esto fue seguido
de inactivación del virus y detención de la reacción añadiendo 25
\mul de solución de SDS al 10%. Se transfirieron 100 \mul de la
mezcla a un pocillo de una placa de 96 pocillos y se midió la
absorbancia a 490 nm y se comparó con los controles. Se realizó cada
experimento de punto temporal por triplicado y se halló la media. En
la figura 3A se muestran los resultados y éstos indican que los
condrocitos primarios humanos no sufren significativamente por las
infecciones adenovíricas, incluso cuando se aplicó una elevada
m.o.i. de 5.000 partículas víricas por célula.
Se usaron células infectadas de forma idéntica a
como se ha descrito antes para determinar la expresión del transgén
LacZ a lo largo del tiempo. Para ello, se lavaron las células dos
veces con PBS y se fijaron con 0,5 ml/pocillo de una solución
fijadora (1,08 ml de formaldehído (JT Baker) más 480 \mul de
glutardialdehído (Merck) en 40 ml de PBS) y se incubaron durante 10
minutos a temperatura ambiente. Se lavaron entonces las células dos
veces con PBS y se tiñeron con 0,5 ml/pocillo de solución de tinción
(1 ml de K_{3}Fe(CN)_{6}, 1 ml de
K_{4}Fe(CN)_{6}, 80 \mul de MgCl_{2} 1M,
completada hasta 40 ml con PBS, a lo que se añaden 150 \mul de
X-Gal por 6 ml antes de su uso) durante 4 h a 37ºC.
Se contaron las células positivas y se compararon con las células
negativas. En la figura 3B se muestran los resultados y éstos
indican que, a lo largo de periodos prolongados de tiempo, la
expresión del transgén no está significativamente disminuida en
condrocitos primarios humanos tras la infección con adenovirus.
Estos últimos resultados indican que están presentes suficientes
copias de vector en el núcleo de los condrocitos transducidos como
para permitir al menos 4 duplicaciones celulares sin perder el gen
marcador.
Aunque tanto la luciferasa como LacZ proporcionan
datos concernientes a la eficiencia de transducción de Ad5 y de
vectores quiméricos en cuanto a la fibra en condrocitos, la
determinación a nivel de una sola célula es difícil usando estos
genes marcadores. Por lo tanto, comparamos Ad5 con virus Ad5Fib13,
Ad5Fib16, Ad5Fib35 y Ad5Fib51, todos ellos portadores de proteína
fluorescente verde ("GFP") como gen marcador. La detección de
la expresión de GFP puede ser monitorizada usando un citómetro de
flujo (FACScalibur, Becton Dickinson). Para ello, se sembraron
condrocitos primarios humanos 24 h antes de la infección a una
densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 24
pocillos. Se expusieron las células durante 2 h a los vectores a una
concentración de 100, 500 y 1.000 partículas víricas por célula. A
las 48 h de la exposición a los virus, las células fueron recogidas
y sometidas a análisis citométrico de flujo. Para ajustar el
citómetro de flujo, se usaron condrocitos no transducidos (apertura
de fondo 1% de células positivas). A continuación, se estudiaron las
células expuestas a los diferentes vectores adenovíricos. Como se
muestra en la figura 4A, el porcentaje de células positivas para la
GFP aumentó usando un aumento en la carga vírica de 100 a 1.000
partículas víricas por célula. Más aún, los resultados muestran que,
usando Ad5Fib16, Ad5Fib35 o Ad5Fib51, la cantidad de células
transducidas aumenta drásticamente en comparación con las células
expuestas a Ad5 (3-9 veces más células dependiendo
de la m.o.i.). Además del aumento en el número de células que
resultaron positivas para GFP usando los vectores quiméricos en
cuanto a fibra, se monitorizó también otro parámetro, es decir, la
fluorescencia media. Este parámetro da información concerniente a la
cantidad de GFP producida a nivel de una sola célula. En la figura
4B se muestran los resultados de este análisis, que demuestra que la
cantidad de GFP producida por célula es mucho mayor usando Ad5Fib16,
Ad5Fib35 o Ad5Fib51 en comparación con Ad5. Así, usando estos
vectores quiméricos en cuanto a fibra, tanto la cantidad de células
transducidas como la cantidad de copias de vector por célula
aumentan significativamente.
Figura 1: Expresión de CAR,
MHC-clase I y a_{v}-integrinas en
condrocitos primarios. Como control para los anticuerpos, se usaron
células PER.C6.
Figura 2: Rastreo de los virus quiméricos con
respecto a la fibra en cuanto a la presencia de virus que están
mejor adecuados para la transducción de condrocitos humanos
primarios. Las dosis usadas son 100, 500 ó 1.000 partículas víricas
por célula. La actividad luciferasa se expresa en unidades de luz
relativas ("RLU"). (A) y (B) representan dos experimentos
independientes separados realizados en condrocitos derivados de
diferentes donantes.
Figura 3: (A) Efecto de la infección adenovírica
sobre la viabilidad de los condrocitos. Se usaron tres m.o.i.
diferentes de un virus que expresaba LacZ (Ad5Fib16LacZ, generado
con pCLIP.LacZ como plásmido adaptador) para infectar condrocitos
primarios humanos. Se comprobó la viabilidad en varios puntos
temporales después de la infección. (B) duración de la expresión
LacZ en condrocitos humanos transfectados.
Figura 4: (A) Análisis citométrico de flujo de
condrocitos expuestos a diferentes vectores adenovíricos. Se usaron
condrocitos no transducidos para fijar el fondo citométrico de flujo
a un 1% de células positivas a la proteína fluorescente verde (GFP).
Se muestra el porcentaje de condrocitos en la población celular que
se vuelven positivos para GFP tras la infección con adenovirus
recombinantes que expresan GFP (X en AdFibXAdaptGFP representa
diferentes fibras derivadas de diferentes serotipos en un esqueleto
de Ad5 generados con pAdApt como plásmido adaptador). (B) Se muestra
la fluorescencia media, que indica la cantidad de GFP producida por
célula.
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\vskip1.000000\baselineskip
| Síndrome | Subgénero | Serotipo |
| Enfermedad respiratoria | A | 31 |
| B | 3,7,11,14,21,34,35,51 | |
| C | 1,2,5,6 | |
| D | 39,42-48 | |
| E | 4 | |
| Queratoconjuntivitis (ojo) | B | 11 |
| D | 8,19,37,50 | |
| Cistitis hemorrágica (riñón) e infecciones del | B | 7,11,14,16,21,34,35 |
| tracto urogenital | C | 5 |
| D | 39,42-48 | |
| Transmisión sexual | C | 2 |
| D | 19,37 | |
| Gastroenteritis | A | 31 |
| B | 3 | |
| C | 1,2,5 | |
| D | 28 | |
| F | 40,41 |
| Síndrome | Subgénero | Serotipo |
| Enfermedad del SNC | A | 12,31 |
| B | 3,7 | |
| C | 2,5,6 | |
| D | 32,49 | |
| Hepatitis | A | 31 |
| C | 1,2,5 | |
| Diseminada | A | 31 |
| B | 3,7,11,21 | |
| D | 30,43-47 | |
| Ninguna (???) | A | 18 |
| D | 9,10,13,15,17,20 | |
| 22-29,33,36,38 |
| Adenovirus | Partículas víricas/ml |
| Ad5Fib5 | 2,2 x 10^{12} |
| Ad5Fib9 | 4,9 x 10^{11} |
| Ad5Fib10 | 5,5 x 10^{11} |
| Ad5Fib11 | 1,1 x 10^{12} |
| Ad5Fib12 | 4,4 x 10^{12} |
| Ad5Fib13 | 1,1 x 10^{12} |
| Ad5Fib16 | 1,4 x 10^{12} |
| Ad5Fib17 | 9,3 x 10^{11} |
| Ad5Fib24 | 1,0 x 10^{12} |
| Ad5Fib27 | 3,0 x 10^{11} |
| Ad5Fib30 | 7,1 x 10^{11} |
| Ad5Fib32 | 2,0 x 10^{12} |
| Ad5Fib33 | 1,5 x 10^{12} |
| Ad5Fib35 | 2,0 x 10^{12} |
| Ad5Fib38 | 5,8 x 10^{11} |
| Ad5Fib40-S | 3,2 x 10^{10} |
| Ad5Fib40-L | 2,0 x 10^{12} |
| Ad5Fib45 | 2,8 x 10^{12} |
| Ad5Fib47 | 2,6 x 10^{12} |
| Ad5Fib49 | 1,2 x 10^{12} |
| Ad5Fib51 | 5,1 x 10^{12} |
<110> Crucell Holland B.V.
\hskip1cmHavenga, Menzo J.E.
\hskip1cmVogels, Ronald
\hskip1cmBout, Abraham
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vectores de administración de genes
con especificidad de tipo celular para condrocitos humanos
primarios
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P53305PC00
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<140> PCT/NL01/00595
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<141>
09-08-2001
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<150> EP 00202835.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-08-2000
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligoenlazante que contiene un sitio PacI
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(23)
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtctta attaaccgct taa
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(19)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipaattgtctta attaaccgc
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(19)
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgcggtt aattaagac
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 47
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador LTR-1
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtacgtac cagtgcactg gcctaggcat ggaaaaatac ataactg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador LTR-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(64)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador HSA1
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgccaccat gggcagagcg atggtggc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador HSA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(50)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttagatcta agcttgtcga catcgatcta ctaacagtag agatgtagaa
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(21)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtattagg ccaaaggcgc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcccatgg aagcttgggt ggcgacccca gcg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcccatgg ggatccttta ctaagttaca aagcta
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgctgtag ttggactgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador NY-up
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacatatgt agatgcatta gtttgtgtta tgtttcaacg tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador NY-down
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagaccact gccatgtt
\hfill18
Claims (10)
1. Uso de un adenovirus quimérico recombinante
del subgrupo C como vehículo para administrar un ácido nucleico de
interés a un condrocito humano primario in vitro, donde dicho
adenovirus contiene al menos el dominio knob de una proteína de la
fibra de un adenovirus seleccionado entre el grupo consistente en
adenovirus del serotipo 8, 11, 16, 32, 35, 38, 40-S
y 51.
2. Uso según la reivindicación 1, donde el
adenovirus del subgrupo C es adenovirus del serotipo 5.
3. Uso según la reivindicación 2, donde dicho
adenovirus recombinante contiene una secuencia de ácido nucleico
del adenovirus 5.
4. Uso según la reivindicación 3, donde dicha
secuencia de ácido nucleico del adenovirus 5 contiene una deleción
en el gen codificante de la proteína de la fibra, que está
substituido por una secuencia de ácido nucleico codificante de al
menos el dominio knob de una proteína de la fibra de un adenovirus
seleccionado entre el grupo consistente en adenovirus del serotipo
8, 11, 16, 32, 35, 38, 40-S y 51.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-4, donde dicho adenovirus recombinante tiene un
genoma de adenovirus 5, que tiene al menos una deleción en su región
E1, donde se inserta o puede insertar un ácido nucleico de
interés.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-5, donde dicho adenovirus recombinante tiene al
menos una deleción en la región E3, donde se inserta o puede
insertar un ácido nucleico de interés.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-6, donde dicho adenovirus recombinante tiene al
menos una deleción en la región E2 y/o E4, donde se inserta o puede
insertar un ácido nucleico de interés.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-7, donde dicho ácido nucleico de interés codifica
para al menos una secuencia de aminoácidos que inhibe la progresión
de la enfermedad del cartílago y/o al menos una secuencia de
aminoácidos que contrarresta la pérdida de cartílago.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-8, donde dicho ácido nucleico de interés codifica
para al menos un miembro de la familia de proteínas de la
morfogénesis ósea.
10. Uso de un adenovirus quimérico recombinante
del subgrupo C en la preparación de un medicamento para la
reparación del cartílago o para la inhibición de la progresión de la
enfermedad del cartílago, donde dicho adenovirus contiene al menos
el dominio knob de una proteína de la fibra de un adenovirus
seleccionado entre el grupo consistente en adenovirus del serotipo
8, 11, 16, 32, 35, 38, 40-S y 51.
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