ES2256500T3 - Procedimiento para fabricar una tagatosa. - Google Patents
Procedimiento para fabricar una tagatosa.Info
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Abstract
Un procedimiento para fabricar tagatosa que comprende: a) hidrolizar lactosa o un material de partida que contenga lactosa para obtener galactosa y glucosa b) isomerizar la galactosa obtenida con una L-arabinosa isomerasa, y c) separar por cromatográfica los productos y compuestos no convertidos y reciclar los compuestos no convertidos al procedimiento.
Description
Procedimiento para fabricar una tagatosa.
La presente invención concierne a la fabricación
enzimática de tagatosa, especialmente la
D-tagatosa.
La D-tagatosa es un edulcorante a
granel bajo en calorías de fines múltiples que tiene propiedades no
cariogénicas y prebióticas. La D-tagatosa puede ser
usada en alimentos y alimentos funcionales así como en productos
farmacéuticos, cf. documentos de EE.UU. 4786722, 5356879 y
5447917.
De acuerdo con los documentos de EE.UU. 5002612 y
5078796, la D-tagatosa ha sido fabricada
hidrolizando a la lactosa o a un material que contiene lactosa en
una mezcla de galactosa y glucosa usando una lactasa, opcionalmente
eliminando la glucosa seguido de la isomerización química de
galactosa a tagatosa.
El documento de EE.UU. 6057135 describe la
fabricación de D-tagatosa de suero de queso o leche,
que se hidroliza para preparar una mezcla de galactosa y glucosa. La
glucosa se separa de la galactosa por fermentación de glucosa y se
somete a la isomerización usando L-arabinosa
isomerasa.
En un primer aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento para fabricar tagatosa que comprende a)
hidrolizar la lactosa o un material de partida que contenga lactosa
para obtener galactosa y glucosa, b) isomerizar la galactosa
obtenida con una L-arabinosa isomerasa, y c) separar
por cromatográfica los productos y compuestos no convertidos y
reciclar los compuestos no convertidos al procedimiento.
En un segundo aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento, en el que las etapas a) y b) son
realizadas en un reactor.
En un aspecto más de la invención se proporciona
un procedimiento para fabricar D-tagatosa.
En todavía un aspecto más de la invención se
proporciona un procedimiento, en el que la
L-arabinosa isomerasa usada en la etapa b) es
termofílica.
En todavía un aspecto más de la invención se
proporciona un procedimiento, en el que la lactasa usada en la etapa
a) es termofílica.
En todavía un aspecto más de la invención se
proporciona un procedimiento, en el que la temperatura usada
en
la(s) etapa(s) a) y/o b) es 40 - 90°C.
la(s) etapa(s) a) y/o b) es 40 - 90°C.
Se dan otros aspectos más de la invención en las
reivindicaciones añadidas.
La figura 1 muestra el procedimiento del ejemplo
1 esquemáticamente,
la figura 2 muestra el procedimiento del ejemplo
2 esquemáticamente y
la figura 3 muestra el procedimiento del ejemplo
3 esquemáticamente.
La figura 4 muestra el resultado del ejemplo
4.
Sorprendentemente se ha encontrado que es posible
usar separación cromatográfica y reciclado en un procedimiento
enzimático para fabricar tagatosa. Como consecuencia se logran
rendimientos más altos y un procedimiento más limpio. El rendimiento
total así como el rendimiento para cada ciclo son más altos.
La utilización de este procedimiento es posible
para reciclar y usar cualquier lactosa y galactosa no convertida. Es
también posible separar los productos, la tagatosa y cualquier
subproducto, especialmente la glucosa de la galactosa y usar la
glucosa para otros objetivos.
El material de partida puede ser cualquier
lactosa o material de partida que contenga lactosa.
\newpage
La lactosa es un subproducto de la fabricación
del queso. Este procedimiento proporciona una oportunidad para
convertir la lactosa, un producto de bajo valor producido en exceso,
en un producto de alto valor con propiedades beneficiosas para las
personas. Este es un modo de usar la lactosa. Durante mucho tiempo
se han buscado ocasiones para utilizar la lactosa.
El procedimiento implica la hidrólisis enzimática
de la lactosa, la conversión enzimática de galactosa en tagatosa y
opcionalmente la separación cromatográfica con el reciclaje de los
productos no convertidos.
El consumo de sustancias químicas etc. es
bajo.
La producción de sub-productos es
baja. Sólo un subproducto es producido, a saber la glucosa como un
jarabe/polvo de glucosa, que puede ser usado para alimentos.
Es posible realizar la reacción entera en un
reactor que contiene enzimas para la hidrólisis de lactosa así como
para la isomerización de galactosa. Así la etapa a) y la etapa b) se
combinan.
Por lo tanto, el procedimiento completo es
mejorado con respecto al rendimiento por unidad de tiempo. La
galactosa es eliminada continuamente del reactor por su
isomerización a tagatosa, reduciendo así la concentración de
galactosa que de otra manera impediría a la lactasa y causaría la
reducción de la transformación de lactosa a galactosa y glucosa. Es
posible llevar a cabo el procedimiento a alta concentración (Brix)
debido a la alta temperatura del procedimiento. La capacidad de
evaporación será salvada lo que de nuevo causará una mejor economía
en cuanto a la inversión y el funcionamiento. La mayor concentración
de azúcar además tiene el efecto de que puede reducirse el uso de
conservantes. También la primera separación cromatográfica se
volverá superflua lo que significa de nuevo una economía mejorada en
cuanto a la inversión y al proceso.
Especialmente se ha demostrado la conversión
enzimática de lactosa a glucosa y galactosa con la isomerización
subsecuente de la galactosa a tagatosa en el mismo reactor
enzimático. Los ensayos iniciales demostraron que la enzima LacS
lactasa y L-arabinosa isomerasa de T.
mathranii podría funcionar bajo condiciones idénticas de ión
metálico, tampón y temperaturas. El principio entonces fue analizado
por la incubación de una solución de lactosa 800 mM (28%) con
lactasa inmovilizada e isomerasa inmovilizada. Las muestras fueron
analizadas para determinar el contenido de lactosa, glucosa,
galactosa y tagatosa por HPLC. Durante 24 horas de incubación la
concentración de glucosa aumentó a aproximadamente 800 mM indicando
que toda la lactosa fue escindida. Las concentraciones de galactosa
y tagatosa ambas aumentaron linealmente a aproximadamente 300 mM.
Por consiguiente, el grado de conversión fue de (300/800) x 100% =
38%.
La enzima adicional puede ser introducida en el
mismo reactor, denominado un combi-reactor.
La tagatosa es especialmente la
D-tagatosa, que tiene una alta demanda en la
industria de los alimentos.
Todas las lactasas pueden ser usadas en la etapa
a). Los ejemplos son enzimas derivadas a partir del grupo que
consiste en Bacillus, Sulfolobus,
Thermoanaerobacter, Thermus y Pyrococcus.
Todas las L-arabinosa isomerasas
pueden ser usadas en la etapa b). Los ejemplos son enzimas derivadas
a partir del grupo que consiste en Bacillus, Sulfolobus,
Thermoanaerobacter y Thermotoga.
Las enzimas pueden ser usadas en cualquier forma.
Por ejemplo, es posible usar enzimas inmovilizadas.
El Instituto Biotecnológico, Dinamarca, puede
suministrar lactasas y
L-arabinosa-isomerasas
utilizables.
El Instituto Biotecnológico, Dinamarca, encontró
y analizó una enzima derivada de Thermoanaerobacter
mathranii, Thermoanaerobacter mathranii DSM 11426. Ellos
han presentado la solicitud de patente de EE.UU. Nº.
09/905.108 que abarca a su invención.
09/905.108 que abarca a su invención.
Los valores de K_{m} para la enzima de
T. mathranii en D-galactosa son inferiores a
los valores de las enzimas de organismos que producen
L-arabinosa isomerasa comunes, tales como
Aerobacter aerogenes, Bacillus amyloliquefaciens, Arthrobacter
sp. y Lactobacillus pentosus. Por lo tanto, T.
mathranii tiene una mejor afinidad.
Esta última enzima es termofílica.
Una ventaja añadida de usar enzimas termofílicas
es la posibilidad de usar altas temperaturas de proceso cuando la
solubilidad de lactosa y glucosa es más alta. Esto significa que
pueden ser usados productos más concentrados para el procedimiento
enzimático de la invención. Esto significa de nuevo menos consumo de
agua y menos agua para la evaporación. Esto dará ventajas técnicas
y menos necesidad de agua y energía, por ejemplo, para calentar y
enfriar corrientes de proceso.
El uso de enzimas termofílicas además ha hecho
posible trabajar a temperaturas más altas. Esto conduce a una mejor
higiene debido al menor riesgo de contaminación con microorganismos
perjudiciales. Además, una mayor conversión de galactosa a tagatosa
es alcanzada a temperaturas más altas comparado con la conversión de
arabinosa a ribulosa. Además de esto, también pueden existir
ventajas técnicas tales como un flujo más fácil y una filtración
más rápida.
Así es preferido usar enzimas que tienen
rendimientos óptimos a altas temperaturas en las etapas a) y/o en la
etapa b). Esto normalmente dará una reacción más rápida. Además, es
posible limpiar el sistema usando altas temperaturas, por ejemplo,
temperaturas de pasterización usadas por lo general en la industria
de la leche o temperaturas mayores de 100°C, si las enzimas son
termofílicas o hasta extremofílicas. Si no hay o hay sólo una
diferencia pequeña de temperaturas entre la temperatura en las
etapas a) y b), se reduce la energía de enfriamiento y
calentamiento. El procedimiento de producción puede ser llevado a
cabo así a temperaturas superiores a los 60°C. Esto tiene amplias
implicaciones para la microbiología y el consumo de vapor y salmuera
para el calentamiento y enfriamiento.
La temperatura usada en la(s)
etapa(s) a) y/o b) es 40 - 90°C. Normalmente es 60 - 90°C.
Preferiblemente la temperatura es 60 - 80°C, más preferiblemente
65-70°C, y la temperatura más preferida es 65°C. Sin
embargo, la temperatura dependerá de las enzimas escogidas, y puede
ser diferente en las etapas a) y b). Como se menciona anteriormente,
son alcanzadas algunas ventajas usando la misma temperatura en ambas
etapas, incluyendo realizar ambas etapas simultáneamente en un
reactor.
Contrariamente a la conversión química de
galactosa en tagatosa el procedimiento puede ser llevado a cabo a un
valor de pH óptimo para azúcares. Esto reduce considerablemente la
producción de los productos de la degradación de azúcar. Por
consiguiente, la recuperación y la economía son mejoradas. Un valor
de pH típico es aproximadamente 7,0. Los valores de pH utilizables y
otros parámetros de reacción son encontrados, por ejemplo, en el
documento de EE.UU. 6057135. Yamanaka, K y Wood, W. A. (1966)
Methods in Enzymology 9: 596-602,
cataloga un número de bacterias de ácido láctico que proporcionan
una enzima de L-arabinosa isomerasa capaz de
producir cetosas a partir de, por ejemplo,
D-galactosa.
El producto de la invención en forma de jarabe es
tan puro que es posible usar jarabes de tagatosa directamente. Hasta
ahora, ha sido necesario purificar el producto, por ejemplo,
cristalizando el jarabe impuro y disolviendo o solubilizando de
nuevo.
Como se menciona anteriormente, la
D-tagatosa puede ser fabricada a partir de una
fuente que contiene lactosa (por ejemplo suero de queso, suero de
caseína o leche). La lactosa es hidrolizada para igualar las
cantidades de galactosa y glucosa por la lactasa, que puede ser
lactasa inmovilizada.
La galactosa preferiblemente se separa de la
glucosa por cromatografía. La lactosa no hidrolizada puede ser
separada y reciclada en la columna de la enzima. La galactosa se
isomeriza a tagatosa mediante L-arabinosa isomerasa
opcionalmente inmovilizada. La galactosa no isomerizada puede ser
separada por cromatografía y reciclada. La fracción que contiene
D-tagatosa se cristaliza. Los cristales se separan
de las aguas madre y se secan. Las aguas madre altas en tagatosa
pueden ser recicladas/recristalizadas. Es posible también usar
directamente la tagatosa producida como un jarabe en productos de
alimentación para personas u otros objetivos.
Así, se ha encontrado un procedimiento enzimático
eficaz combinado con cromatografía para fabricar tagatosa a alto
rendimiento y en una forma muy pura en uno o dos reactores. El
procedimiento tiene ventajas especiales de ser realizados con
enzimas termofílicas/extremofílicas.
El nuevo procedimiento para la producción de
tagatosa es sumamente eficaz y limpio debido a una conversión
enzimática específica combinada con el reciclaje de productos no
convertidos. El procedimiento es extremadamente eficaz y
ecológico.
1. La lactosa es producida a partir de suero por
ultrafiltración seguido de cristalización.
2. Una solución de lactosa en agua
(8-40%DS) es hidrolizada por lactasa inmovilizada a
temperatura alta o baja (por la enzima de Aspergillus oryzae
o un organismo termofílico).
3. La glucosa y la galactosa son separadas por
cromatografía. Dependiendo de la concentración de alimentación
puede ser necesario concentrar, por ejemplo, por evaporación.
4. La lactosa y los galactooligosacáridos
posibles son reciclados en la columna que contiene la enzima
inmovilizada.
5. Si la concentración de oligosacáridos en el
bucle de reciclaje es demasiado alta (la hidrólisis es afectada
indeseablemente), el sistema se purga.
6. La fracción que contiene glucosa y galactosa
se isomeriza por galactosa isomerasa inmovilizada (a partir de un
organismo termofílico).
7. La mezcla se concentra, por ejemplo, por
evaporación.
8. La tagatosa se separa por cromatografía.
9. La fracción de tagatosa se concentra y
posiblemente se cristaliza.
10. La fracción de glucosa podría ser concentrada
para la venta como un jarabe o puede ser procesada después.
11. La fracción de galactosa se recicla en la
columna de isomerasa.
1. La lactosa es producida a partir de suero por
ultrafiltración seguido de cristalización.
2. Una solución de lactosa en agua
(8-40%DS) es hidrolizada por lactasa inmovilizada
(la enzima proviene de Aspergillus oryzae).
3. La mezcla que contiene aproximadamente el 46%
de glucosa, el 46% de galactosa es pasada por una columna que
contiene galactosa isomerasa inmovilizada (de un organismo
termofílico). Aproximadamente el 30% de galactosa es convertido en
tagatosa.
4. El producto es separado en 3 fracciones por
concentración y separación cromatográfica:
- \bullet
- La fracción 1 contiene principalmente galactosa no convertida. Esta fracción es reciclada a la columna de galactosa isomerasa.
- \bullet
- La fracción 2 contiene principalmente tagatosa. Esta fracción es concentrada para la cristalización o se comercializa como jarabe.
- \bullet
- La fracción 3 contiene principalmente glucosa, pero también galactooligosacáridos producidos por la enzima lactasa así como lactosa no convertida. Esta fracción es concentrada para la venta como jarabe o para un procesamiento subsiguiente, tal como la cristalización o el secado.
1. La lactosa es producida a partir de suero por
ultrafiltración seguido de la cristalización.
2. Una solución de lactosa en agua es pasada por
una columna que contiene lactasa y L-arabinosa
isomerasa inmovilizadas (ambas enzimas que provienen de organismos
termofílicos).
3. El producto es separado en 3 fracciones por
concentración y separación cromatográfica:
- \bullet
- La fracción 1 contiene galactosa principalmente no convertida. Esta fracción es reciclada a la columna para la conversión enzimática.
- \bullet
- La fracción 2 contiene principalmente tagatosa. Esta fracción es concentrada para la cristalización o se comercializa como un jarabe.
- \bullet
- La fracción 3 contiene principalmente glucosa, pero también galactooligosacáridos producidos por la enzima lactasa así como lactosa no convertida. Esta fracción es concentrada para la venta como un jarabe o para un procesamiento subsiguiente, tal como la cristalización o el secado.
El gen que codifica para la
\beta-glucosidasa de Sulfolobus
solfataricus (Moracci M, Ciaramella M, y Rossi M. [2001]
Methods in Enzymology vol. 330, p.
201-15) fue clonado y expresado en E. coli.
El gen fue aislado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando ADN cromosómico purificado de la cepa P2 de Sulfolobus
solfataricus. Iniciadores que contenían sitios de restricción
adicionales para Ndel y BamHI fueron diseñados para
proporcionar la secuencia de codificación entera sobre un fragmento
que posteriormente fue clonado en un plásmido de expresión estándar
pET3a (Novagen).
Fueron cultivadas células E. coli que
expresan la enzima, recuperadas por centrifugación, lisadas en una
celda de presión French y reticuladas con glutaraldehído y
polietilenimina como se describe en el documento de EE.UU.
4.354.105. La enzima inmovilizada fue recuperada por centrifugación
y liofilización de los pelets. La actividad de la lactasa
inmovilizada fue 1500 unidades/g en peso seco. Una unidad fue
definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de
glucosa por minuto a 65°C, pH 7, en una solución de lactosa del 30%
(p/v).
El gen de L-arabinosa isomerasa
de Thermoanaerobacter mathranii fue clonado y expresado en
E. coli como se describe en la solicitud de patente de EE.UU.
Nº. 09/905.108 (Instituto Biotecnológico, Dinamarca).
Células de E. coli que expresan la enzima
fueran cultivadas, recuperadas por centrifugación, lisadas en una
celda de presión French y reticuladas con glutaraldehído y
polietilenimina como se describe en el documento de EE.UU.
4.354.105. La enzima inmovilizada fue recuperada por centrifugación
y liofilización de los pelets. La actividad de la
L-arabinosa isomerasa inmovilizada fue 50 unidades/g
en peso seco. Una unidad fue definida como la cantidad de enzima que
produce un micromol de D-tagatosa por minuto a 65°C,
pH 7, en una solución de D-galactosa 30% (p/v).
Fueron incubadas a 65°C mezclas de ensayo de un
mililitro que contenían 20 mg de lactasa inmovilizada, 80 mg de
isomerasa inmovilizada, 0,30 g de lactosa (30%, 875 mM), tampón de
K-maleato 25 mM, pH 6,9, y MnCl_{2} 5 mM. Una
muestra control sin enzimas fue tratada de modo similar. De forma
periódica, eran tomadas muestras para determinar las concentraciones
de glucosa, galactosa y tagatosa por cromatografía líquida de alta
resolución usando una columna HPX-87C de Aminex
(Bio-Rad) y un detector del índice de refracción
(Waters 410). La fase móvil fue desionizada, desgasificada al
vacío, la temperatura de columna fue 85°C, y el caudal fue de 0,6
ml/min.
Como se muestra en la Figura 4, la concentración
de glucosa aumentó a aproximadamente 800 mM en 24 h, indicando que
casi toda la lactosa fue hidrolizada a galactosa y glucosa. La
concentración de tagatosa aumentó directamente a aproximadamente 300
mM en 24 h, indicando una bioconversión de 300 mM/800 mM = 38%.
\vskip1.000000\baselineskip
| tiempo de incubación (h) | lactosa (mM) | glucosa (mM) | galactosa (mM) | tagatosa (mM) |
| 0 | 816 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 176 | 57 | 30 | |
| 4 | 281 | 87 | 48 | |
| 6 | 366 | 116 | 72 | |
| 8 | 430 | 139 | 98 | |
| 24 | 811 | 316 | 295 |
Claims (18)
1. Un procedimiento para fabricar tagatosa
que comprende:
- a)
- hidrolizar lactosa o un material de partida que contenga lactosa para obtener galactosa y glucosa
- b)
- isomerizar la galactosa obtenida con una L-arabinosa isomerasa, y
- c)
- separar por cromatográfica los productos y compuestos no convertidos y reciclar los compuestos no convertidos al procedimiento.
2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la lactosa no convertida es separada por cromatografía y
reciclada a la etapa a) para la hidrólisis.
3. Un procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que la galactosa no convertida es separada por cromatografía
y reciclada a la etapa b) para la isomerización.
4. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa a) y la etapa b)
son realizadas en un reactor.
5. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la galactosa es
D-galactosa y la tagatosa es
D-tagatosa.
6. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la
L-arabinosa isomerasa usada en la etapa b) es
termofílica.
7. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la lactasa usado en la etapa
a) es termofílica.
8. Un procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que la L-arabinosa isomerasa usada en la etapa
b) se deriva a partir del grupo que consiste en, pero no se
restringe a, Bacillus, Sulfolobus, Thermoanaerobacter y
Thermotoga.
9. Un procedimiento de la reivindicación 8, en el
que la L-arabinosa isomerasa se deriva a partir de
Thermoanaerobacter mathranii.
10. Un procedimiento de la reivindicación 9, en
el que la L-arabinosa isomerasa se deriva a partir
de DSM 11426 de Thermoanaerobacter mathranii.
11. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la lactasa usada en la etapa
a) se deriva a partir del grupo que consiste en, pero no se
restringe a, Bacillus, Sulfolobus, Thermoanaerobacter,
Thermus y Pyrococcus.
12. Un procedimiento de la reivindicación 1, en
el que una o varias de las enzimas usadas se inmovilizan.
13. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura usada en
la(s) etapa(s) a) y/o b) es 40 - 90°C.
14. Un procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la temperatura es 60 - 90°C.
15. Un procedimiento de la reivindicación 14, en
el que la temperatura es 60 - 80°C.
16. Un procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la temperatura es 65 - 70°C.
17. Un procedimiento de la reivindicación 16, en
el que la temperatura es 65°C.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la L-arabinosa isomerasa
usado se deriva a partir de Thermoanaerobacter mathranii y la
lactasa usada se deriva a partir de Sulfolobus
solfataricus.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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