ES2257739T3 - Antigenos ctla-8 de primate purificados y reactivos relacionados. - Google Patents

Abstract

ANTIGENO CTLA - 8 DE UN PRIMATE, REACTIVOS RELACIONADOS CON EL MISMO INCLUYENDO PROTEINAS PURIFICADAS, ANTICUERPOS ESPECIFICOS Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN EL ANTIGENO. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS DE UTILIZACION DE LOS REACTIVOS Y EQUIPOS DE DIAGNOSTICO.

Description

Antígenos CTLA-8 de primate purificados y reactivos relacionados.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune de los vertebrados consiste en un cierto número de órganos y diversos tipos diferentes de células. Dos de los tipos más importantes de células incluyen los linajes de mieloides y de linfoides. Entre los linajes de las células linfoides están las células B, que estaban originalmente caracterizadas como de diferenciación en el hígado fetal o en la médula ósea de los adultos, y las células T, que estaban originalmente caracterizadas como de diferenciación en el timo. Véase, por ejemplo, Paul (ed) (1993) Fundamental Immunology (3d ed) Raven Press, Nueva York.

En muchos aspectos del desarrollo de una respuesta inmune o de diferenciación celular, las proteínas solubles conocidas como citocinas juegan un papel crítico en la regulación de las interacciones celulares. Estas citocinas evidentemente median las actividades celulares de muchos modos. Ellas han mostrado, en muchos casos, que modulan la proliferación, el crecimiento, y la diferenciación de las células pluripotenciales hematopoyéticas en el vasto número de progenitores que componen los linajes responsables de una repuesta inmune.

Sin embargo, las moléculas celulares que se expresan mediante diferentes etapas de desarrollo de células en estas vías de maduración están todavía incompletamente identificadas. Además, los papeles y los mecanismos de acción de las moléculas señales que inducen, sostienen, o modulan los diversos estados fisiológicos, de desarrollo o proliferativos de estás células están mal comprendidos. Claramente, el sistema inmune y su respuesta a diversas tensiones tenía relevancia en medicina, por ejemplo, en la inflamación, enfermedades infecciosas, respuestas y tratamientos relacionados con el cáncer, y las repuestas a alergias y al rechazo de transplantes. Véase, por ejemplo, Thorn, y colaboradores, Harrison's Principles of Internal Medicine McGraw/Hill, Nueva York.

La ciencia médica depende, en gran medida, para la apropiada selección o supresión del sistema inmune en efectuar curas durante respuestas fisiológicas insuficientes o inadecuadas para los factores ambientales. Sin embargo, la carencia de una comprensión de cómo el sistema inmune se regula o se diferencia ha bloqueado la capacidad para modular ventajosamente los mecanismos defensivos normales para los retos biológicos. Los estados médicos caracterizados por una anormal o inapropiada regulación del desarrollo o fisiología de células apropiadas permanecen así inmanejables. El descubrimiento y caracterización de citocinas específicas contribuirá al desarrollo de terapias para una amplia gama de estados degenerativos o de otro tipo que afectan al sistema inmune, a las células hematopoyéticas, así como también a otros tipos de células. La presente invención proporciona soluciones a algunos de estos y muchos otros problemas.

Sumario de la invención

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de un clon de cDNA que codifica una proteína semejante a la citocina. Esta proteína se ha designado como CTLA-8 humana. La invención comprende los genes aislados que codifican las proteínas de la invención, proteínas de fusión, compuestos químicos miméticos, y anticuerpos. Se proporcionan también diversos usos de estas diferentes composiciones de ácidos nucleicos o de proteínas.

La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína CTLA-8 de primate que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

La presente invención proporciona también una proteína CTLA-8 de primate sustancialmente pura. La proteína o péptido comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9 y puede exhibir un patrón de modificación post-translacional diferente de una proteína CTLA-8 de primate natural; o inducir a una célula para secretar un mediador inflamatorio, por ejemplo, IL-6, IL-8, y/o PGE2. Una realización adicional es una composición que comprende dicha proteína y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención incluye un anticuerpo que se une específicamente a un aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 8 ó 9. De acuerdo con las realizaciones preferidas el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; el anticuerpo bloquea la secreción inducida por CTLA-8 de un mediador inflama-torio, por ejemplo, IL-6, IL-8 y/o PGE2; o el anticuerpo está marcado.

La invención comprende también un estuche (kit) que comprende un ácido nucleico al menos un 95% idéntico a uno que codifica una proteína CTLA-8 de primate, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9; una proteína CTLA-8 de primate sustancialmente pura, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9, por ejemplo, como un control positivo; o un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

La invención incluye también un método in vitro de modular la fisiología o el desarrollo de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

La invención proporciona también un método in vitro de modular la secreción inducida por CTLA-8 de un mediador inflamatorio de una célula en un tejido que comprende la etapa de poner en contacto dicho tejido con:

a)

un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9; o

b)

una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

La disponibilidad de estos reactivos proporciona también métodos de modular la fisiología o el desarrollo de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con un agonista o antagonista de una proteína CTLA-8. El método de modulación comprende regular la secreción inducida por CTLA-8 de un mediador inflamatorio, por ejemplo, IL-6, IL-8, y/o PGE2, mediante la puesta en contacto de la célula o del tejido con un anticuerpo que se une específicamente a una proteína CTLA-8 de mamífero o de CTLA-8 de mamífero sustancialmente pura.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Generalidades

La presente invención proporciona una secuencia de DNA que codifica diversas proteínas de primates que exhiben propiedades características de las moléculas expresadas en células T funcionalmente significativas. La secuencia de cDNA exhibe diversos rasgos que son característicos de los mRNA que codifican citocinas, factores de crecimiento, y oncogenes. El gen humano descrito en la presente invención contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína predicha de 155 aminoácidos. Esta proteína es un 66,4% homologa a una supuesta proteína codificada por un genoma viral, el virus herpes Saimiri ORFIS.

Estas proteínas se designan proteínas CTLA-8. Un cDNA de ratón que codifica una proteína CTLA-8 similar se describió por Rouvier y colaboradores (1993) J. Immunol, 150:5445-5456. Las proteínas naturales deben ser capaces de mediar varias respuestas fisiológicas que darían lugar a respuestas biológicas o fisiológicas en las células diana. Los estudios iniciales habían localizado el mensaje que codifica esta proteína en varias líneas celulares de las células hematopoyéticas. Se ha elaborado el mapa de los genes que codifican el antígeno para el cromosoma humano 2q31 y el cromosoma del ratón 1A. Las descripciones más adelante están dirigidas, para propósitos de ejemplo, a una proteína CTLA-8 humana, pero son asimismo aplicables a las realizaciones relacionadas de otras especies de primates.

Ácidos nucleicos

La SEQ ID NO:5-8 describe las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína CTLA-8 humana, y fragmentos de los mismos. Las secuencias de nucleótidos descritas y los reactivos relacionados son útiles en la construcción de un clon de DNA útil para expresar una proteína CTLA-8 de primate, o, por ejemplo, para el aislamiento de un gen homólogo a partir de otra fuente natural. Típicamente, las secuencias serán útiles en el aislamiento de otros genes, por ejemplo, variantes alélicas, de seres humanos, y se aplicarán procedimientos similares para el aislamiento de genes de otras especies, por ejemplo, de otros primates. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de genes de otras especies de primates. Se dispondrá de un cierto número de métodos diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado a partir de otras fuentes.

La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para la generación de anticuerpos mediante métodos estándares, según se describió anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada se pueden presentar a un sistema inmune para generar una composición de unión específica, por ejemplo anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.

Por ejemplo, la composición de unión específica se puede usar para la evaluación de una librería de expresión preparada a partir de una línea celular de primates que expresa una proteína CTLA-8. La evaluación puede ser mediante tinción estándar de la superficie de la proteína expresada, o mediante encuadramiento ("panning"). La evaluación de la expresión intracelular se puede efectuar también mediante diversos procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Las composiciones de unión se pueden usar para la purificación o la clasificación por afinidad de las células que expresan la proteína.

Esta invención contempla el uso de DNA aislado o de fragmentos para codificar una proteína CTLA-8 ó polipéptido correspondiente biológicamente activos. Alternativamente, se puede usar un ácido nucleico menos de completamente idéntico como una sonda que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una CTLA-8. Además, esta invención cubre el DNA aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activos y que es capaz de su hibridación bajo condiciones apropiadas con las secuencias de DNA descritas en la presente invención. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activos puede ser un antígeno intacto, o un fragmento, y tienen una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO: 6 u 8. Además, esta invención cubre el uso de DNA aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que codifican proteínas que son homólogas a una proteína CTLA-8 de primate o las cuales se aislaron, bajo condiciones apropiadas, usando cDNA que codifica una proteína CTLA-8 de primate como una sonda. El DNA aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, agentes de potenciación, señales de adición de poli(A) (poliadenilato), y otras. En particular, el gen de CTLA-8 humana tiene una significativa identidad, del 66,4%, con la supuesta proteína codificada mediante el marco de lectura abierta ORF13, del virus herpes Saimiri (SEQ ID NO: 4), y con una equivalente CTLA-8 de ratón (SEQ ID NO: 2), de aproximadamente un 60%.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un RNA, DNA, o un polímero mixto, que está separado sustancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente a una secuencia original, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas de flanqueo de las especies que se originan. El término comprende una secuencia de ácido nucleico que ha sido separada de su ambiente naturalmente existente, e incluye aislamientos de DNA recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. Alternativamente, unas especies purificadas se pueden separar de los componentes huésped a partir de un sistema de expresión recombinante. La extensión de la homología de dicho ácido nucleico será típicamente inferior a los grandes vectores, por
ejemplo, inferior a decenas de kB, típicamente inferior a varias kB, y estará preferiblemente en el intervalo de 2-6 kB.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones, contendrá una pequeña heterogeneidad. La heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos o partes del polímero no críticos para una función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" se define bien por su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto preparado mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de las técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente la selección o la producción. Alternativamente, se puede preparar un ácido nucleico mediante generación de una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no están naturalmente contiguos unos con otros, pero significa excluir los productos de la naturaleza, por ejemplo los mutantes que existen naturalmente. Así, por ejemplo, están comprendidos los productos preparados mediante la transformación de células con cualquier vector que no existe naturalmente, como son los ácidos nucleicos que comprenden secuencias obtenidas usando cualquier procedimiento de oligonucleótido sintético. Esto se efectúa a menudo para reemplazar un codón con un codón superfluo que codifica el mismo o un aminoácido conservador, mientras que típicamente introduce o separa un sitio de reconocimiento de la secuencia. Alternativamente, se efectúa el unir juntos segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales disponibles comúnmente. Los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción son a menudo el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación del DNA, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles se pueden incorporar mediante diseño. Un concepto similar se pretende para un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Están incluidos específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que, por un exceso de código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmento de estos antígenos, y fusiones de secuencia de diversas variantes de especies de primates diferentes.

Un "fragmento" significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más generalmente de al menos aproximadamente 23 nucleótidos, ordinariamente de al menos aproximadamente 26 nucleótidos, más ordinariamente de al menos aproximadamente 29 nucleótidos, a menudo de al menos aproximadamente 32 nucleótidos, más a menudo de al menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente de al menos aproximadamente 38 nucleótidos, más típicamente de al menos aproximadamente 41 nucleótidos, usualmente de al menos aproximadamente 44 nucleótidos, más usualmente de al menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 53 nucleótidos, y en las realizaciones particularmente preferidas será de al menos aproximadamente 56 ó más nucleótidos. Estos fragmentos pueden empezar o terminar en virtualmente cualquier posición dentro del gen, y preferiblemente dentro de las secuencias de codificación, por ejemplo, de un mRNA.

Un DNA que codifica una proteína CTLA-8 será particularmente útil para la identificación de genes, mRNA, y especies de cDNA que codifican proteínas relacionadas u homólogas, así como también los DNA que codifican proteínas homólogas procedentes de diferentes especies de primates. Diversas proteínas de CTLA-8 de primates deberían ser homólogas y están comprendidas en la presente invención. Sin embargo, incluso las proteínas que tienen una relación evolutiva más distante al antígeno se pueden aislar fácilmente bajo condiciones apropiadas usando estas secuencias si ellas son suficientemente homólogas.

Esta invención cubre además las moléculas de DNA recombinante y los fragmentos que tienen una secuencia idéntica a son altamente homólogos a los DNA aislados establecidos en la presente invención. En particular, las secuencias estarán a menudo operablemente unidas a los segmentos de DNA que controlan la transcripción, la traducción, y la replicación del DNA. Alternativamente, los clones recombinantes obtenidos a partir de secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para los estudios transgénicos, que incluyen, por ejemplo, las células y organismos transgénicos, y para la terapia de genes. Véase, por ejemplo, Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roit (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, páginas 1502-1504; Travis (1992), Science 256:1392-1394; Kuhn, y colaboradores (1991) Science 254:707-710; Capechi (1989) Science 244:1288; Robertson (1987) (ed) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Rosemberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199; y Cournoyer and Caskey (1993), Ann. Rev. Immunol, 11:297-329.

Las secuencias de ácido nucleico homólogos, cuando se comparan, exhiben una similitud o identidad significativa. Los patrones para la homología en los ácidos nucleicos son bien medidas para la homología generalmente usadas en la técnica mediante la comparación de las secuencias o se basan en las condiciones de la hibridación. Las condiciones de la hibridación se describen con mayor detalle más adelante.

Una homología sustancial en el contexto de la comparación de las secuencias de ácido nucleicos significa bien que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando se alinean óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente un 70% de los nucleótidos, generalmente en al menos aproximadamente un 75%, ordinariamente en al menos aproximadamente un 79%, a menudo en al menos aproximadamente un 83%, típicamente en al menos aproximadamente un 87%, y usualmente en al menos aproximadamente un 90%, preferiblemente en al menos aproximadamente un 92%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 95 a 98% ó más, y en las realizaciones en particular, tan elevadas como aproximadamente un 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectivas, a una hebra, o a su complemento, usando típicamente una secuencia obtenida de SEQ ID NO: 3, 5, ó 7. Típicamente, la hibridación selectiva se producirá cuando exista al menos aproximadamente un 55% de homología sobre un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente un 65%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 75%, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente un 90%. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res, 12:203-213. La longitud de la comparación de la homología, según se describe, puede ser sobre tramos más grandes, y en ciertas realizaciones será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente de al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente de al menos 28 nucleótidos, más típicamente de al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 75 a 100 ó más nucleótidos. La invención proporciona todas las combinaciones de longitudes, medidas de identidad, y puntos finales para los fragmentos, véase anteriormente.

Las condiciones rigurosas, en referencia a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos, y otros parámetros, típicamente las controladas en las reacciones de hibridación. Las condiciones rigurosas de temperatura incluyen usualmente temperaturas en exceso de aproximadamente 30ºC, más usualmente en exceso de aproximadamente 37ºC, típicamente en exceso de aproximadamente 45ºC, más típicamente en exceso de aproximadamente 55ºC, preferiblemente en exceso de aproximadamente 65ºC, y más preferiblemente en exceso de aproximadamente 70ºC. Las condiciones rigurosas de sal serán ordinariamente inferiores a aproximadamente 1000 mM, usualmente inferiores a aproximadamente 500 mM, más usualmente inferiores a aproximadamente 400 mM, típicamente inferiores a aproximadamente 300 mM, preferiblemente inferiores a aproximadamente 200 mM, y más preferiblemente inferiores a aproximadamente 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro único. Véase, por ejemplo, Wetmur and Davison (1968) J. Mol. Biol, 31:349-370.

La proteína CTLA-8 procedente de otras especies de primates se puede clonar y aislar mediante la hibridación cruzada de especies en especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies distantemente relacionadas, y así es aconsejable la hibridación de especies relativamente estrechamente relacionadas. Alternativamente, la producción de una preparación de anticuerpo que exhiba menos especifidad para las especies puede ser útil en los métodos de clonación por expresión.

Proteína CTLA-8 de primate purificada

La secuencia de proteína predicha de CTLA-8 de ratón se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de proteína ORF13 predicha de virus herpes homólogo se muestra en SEQ ID NO: 4. La secuencia predicha de una equivalente humana se describe en SEQ ID NO: 8. Las secuencias de péptidos permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos.

Según se usa en la presente invención, la expresión "proteína CTLA-8 humana" debe comprender, cuando se usa en un contexto de proteína, una proteína que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 8, o un fragmento significativo de dicha proteína, por ejemplo, SEQ ID NO: 6. Se refiere también a un polipéptido obtenido de un ser humano que exhibe una función biológica similar o que interactúa con los componentes de unión específicos de la proteína CTLA-8. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, típicamente se unen a una proteína CTLA-8 con una elevada afinidad, por ejemplo, de al menos aproximadamente 100 nM, usualmente mejor de aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente mejor de aproximadamente 3 nM. Las proteínas homólogas se encontrarán en especies de mamíferos distintos a los seres humanos, por ejemplo, ratas, ratones, primates, y en el genoma del virus herpes, por ejemplo, ORF13. Las especies que no son de mamíferos deben poseer también genes y proteínas estructural o funcionalmente relacionados.

El término "polipéptido" según se usa en la presente invención incluye un fragmento o segmento significativo, y comprende un tramo de restos de aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, más generalmente de al menos aproximadamente 12 aminoácidos, a menudo de al menos aproximadamente 14 aminoácidos, más a menudo de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, típicamente de al menos aproximadamente 18 aminoácidos, más típicamente de al menos aproximadamente 20 aminoácidos, usualmente de al menos aproximadamente 22 aminoácidos, más usualmente de al menos aproximadamente 24 aminoácidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 26 aminoácidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 28 aminoácidos, y, en las realizaciones particularmente preferidas, de al menos aproximadamente 30 ó más aminoácidos.

La expresión "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especifidad a la proteína CTLA-8 de primates, por ejemplo en una forma tipo ligando-receptor, una interacción anticuerpo-antígeno, o compuestos, por ejemplo, proteínas que se asocian específicamente con la proteína CTLA-8, por ejemplo, en una interacción proteína-proteína natural fisiológicamente pertinente, bien covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero, o un reactivo químico. No se presentan implicaciones en cuanto a si la proteína CTLA-8 es bien el ligando o el receptor, distintas a que la interacción exhibe una especifidad similar, por ejemplo, una afinidad específica. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula totalmente no relacionada, por ejemplo, que tiene una forma molecular que interactúa con los determinantes de unión apropiados Las proteínas pueden servir como agonistas o antagonistas de un receptor, véase por ejemplo, Goodman, y colaboradores (eds) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª edición), Pergamon Press.

La solubilidad de un polipéptido o de un fragmento depende del ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, que incluyen la temperatura, el ambiente del electrólito, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la que se usa el polipéptido está en el intervalo desde aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Usualmente la temperatura de uso es superior a aproximadamente 18ºC y más usualmente superior a aproximadamente 22ºC. Para los propósitos de diagnóstico, la temperatura será usualmente aproximadamente la temperatura ambiente o más caliente, pero menos que la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Para propósitos terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura del cuerpo, típicamente aproximadamente 37ºC para los seres humanos, aunque bajo ciertas situaciones la temperatura se puede elevar o bajar in situ ó in vitro.

Los electrólitos se aproximaran usualmente a las condiciones fisiológicas in situ, pero se pueden modificar a concentraciones iónica más elevadas o más bajas cuando sea ventajoso. Los iones reales se pueden modificar, por ejemplo para conformarse a las disoluciones tampones estándar usadas en los contextos fisiológicos o analíticos.

El tamaño y la estructura del polipéptido deben estar generalmente en un estado sustancialmente estable, y usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes en una manera que se aproxima a las interacciones naturales bi-capa del lípido.

El disolvente será usualmente una disolución tampón compatible biológicamente, de un tipo usado para la preservación de las actividades biológicas, y usualmente se aproximará a un disolvente fisiológico. Usualmente el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente entre 5 y 10, y preferiblemente de aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirá un detergente, típicamente uno no desnaturalizado suave, por ejemplo, CHS o CHAPS, o una concentración bastante baja tal como para evitar una disrupción significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas del antígeno.

La solubilidad viene reflejada mediante la sedimentación medida en unidades Svedberg (S), que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se realizaba clásicamente en una ultra-centrifuga analítica, pero ahora se efectúa típicamente en una ultra-centrifuga estándar. Véase, Freifelder (1982), Physical Biochemistry, (2ª edición), W. H. Freeman; y Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes 1-3, W. H. Freeman & Co., San Francisco. Como una determinación sin refinar, una muestra que contiene un polipéptido superfluamente soluble se hace girar en una ultra-centrifuga de tamaño natural estándar a aproximadamente 50000 rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el material sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble será típicamente inferior a aproximadamente 30 S, más típicamente inferior a aproximadamente 15 S, usualmente inferior a aproximadamente 10 S, más usualmente inferior a aproximadamente 6 S, y, en las realizaciones en particular, preferiblemente inferior a aproximadamente 4 S, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 3 S.

Preparación de la proteína CTLA-8 de primates: Miméticos

El DNA que codifica la proteína CTLA-8 de primates o fragmentos de la misma se puede obtener mediante síntesis química, examen de las bibliotecas de cDNA, o mediante examen de las bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejidos.

Este DNA se puede expresar en una amplia variedad de células huésped para la síntesis de una proteína de intervalo completo o de fragmentos que a su vez, se pueden usar, por ejemplo, para generar anticuerpos monoclonales o policlonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada antígeno o sus fragmentos se pueden expresar en células huésped que son transformadas o sometidas a transfección con los vectores de expresión apropiados. Estas moléculas se pueden purificar sustancialmente para estar libres de contaminantes de proteína o celulares, distintos a los obtenidos a partir del huésped recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, o las porciones del mismo, se puede expresar como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión son típicamente estructuras de DNA o de RNA auto-replicativas que contienen el gen del antígeno o sus fragmentos deseados, usualmente unido operablemente a elementos de control genéticos adecuados que están reconocidos en una célula huésped adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un huésped adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión dependerá de la eventual célula huésped usada. Generalmente, los elementos de control genéticos pueden incluir un sistema promotor procariótico o un sistema de control de la expresión de promotor eucariótico, y típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar la aparición de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión del mRNA, una secuencia que codifique un sitio de unión al ribosoma adecuado, y secuencias que terminen la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión contienen también usualmente un origen de la replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula huésped. Los métodos para la amplificación del vector del número de copias son también conocidos, véase, por ejemplo, Kaufman y colaboradores (1985) Molec. And Cell. Biol., 5:1750-1759.

Los vectores de esta invención contienen DNA que codifica una proteína CTLA-8 de primates, o un fragmento de la misma, codificando típicamente un polipéptido biológicamente activo. El DNA puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla además el uso de dichos vectores de expresión que son capaces de expresar un cDNA eucariótico que codifica una proteína CTLA-8 en un huésped procariótico o eucariótico, en el que el vector es compatible con el huésped y en el que el cDNA eucariótico que codifica el antígeno está insertado en el vector de tal manera que el crecimiento del huésped que contiene el vector expresa el cDNA en cuestión. Usualmente, los vectores de expresión se diseñan para una replicación estable en sus células huésped o para su amplificación para incrementar grandemente el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula huésped, por ejemplo, es posible efectuar la expresión transitoria del antígeno o de sus fragmentos en varios huéspedes usando vectores que no contengan un origen de replicación que esté reconocido por la célula huésped. Es también posible usar vectores que den lugar a la integración de un gen de la proteína CTLA-8 ó de sus fragmentos en el DNA huésped mediante recombinación, o para integrar un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, según se usan en la presente invención, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de DNA integrables, y otros vehículos que permiten la integración de los fragmentos de DNA en el genoma del huésped. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genéticos que efectúan la expresión de los genes operablemente unidos. Los plásmidos son la forma más comúnmente usada de vector pero todas las otras formas de vectores que sirven una función equivalente y que son, o que lleguen a ser, conocidos en la técnica son adecuados para su uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Pouwels, y colaboradores (1985 y Suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, y Rodríguez, y colaboradores (1988) (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Las células transformadas incluyen células, preferiblemente de mamíferos, que han sido transformadas o sometidas a transfección con vectores que contienen un gen CTLA-8, construido típicamente usando las técnicas del DNA recombinante. Las células huésped transformadas usualmente expresan el antígeno o sus fragmentos, pero para los propósitos de clonación, amplificación y manipulación de su DNA, no necesitan expresar la proteína. La invención contempla además cultivar las células transformadas en un medio nutriente, permitiendo así que la proteína se acumule en el cultivo. La proteína se puede recuperar, bien a partir del cultivo o a partir del medio de cultivo.

Para los propósitos de esta invención, las secuencias de DNA están operablemente unidas cuando ellas están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el DNA para una secuencia previa o líder secretor está operablemente unido a un polipéptido si este se expresa como una proteína previa o participa en dirigir el polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está operablemente unido a una secuencia de codificación si él controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma está operablemente unido a una secuencia de codificación si él está posicionado para permitir la traducción. Usualmente, operablemente unido significa contiguos y en un marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como los genes represores no están
unidos contiguamente sino que todavía se unen a las secuencias del operador que a su vez controlan la expresión.

Las células huésped adecuadas incluyen las procariotas, las eucariotas inferiores y las eucariotas superiores. Las procariotas incluyen tanto los organismos Gram negativos como los Gram positivos, por ejemplo E. coli y B. subtilis. Las eucariotas inferiores incluyen las levaduras, por ejemplo S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Las eucariotas superiores incluyen las líneas celulares de cultivo tisular establecidas procedentes de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, las células de insectos y de pájaros, como las de origen mamífero, por ejemplo, de seres humanos, primates, y roedores.

Los sistemas de vector-huésped procariótico incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Según se usa en la presente invención, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otras procariotas. Un vector representativo para la amplificación del DNA es pBR322 ó muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar las proteínas CTLA-8 o sus fragmentos incluyen, pero no se limitan a, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o los promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius y colaboradores (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, capítulo 10, páginas 205-236.

Las eucariotas inferiores, por ejemplo las levaduras y Dictyostelium, se pueden transformar con vectores que codifican las proteínas CTLA-8. Para los propósitos de esta invención, el huésped eucariótico inferior lo más común es la levadura de la panificación, Saccharomyces cerevisiae. Ella se usará para representar genéricamente a las eucariotas inferiores aunque están también disponibles un cierto número de otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un origen de replicación (a menos del tipo de integración), un gen de selección, un promotor, DNA que codifica la proteína deseada o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, la poli-adenilación, y la terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para las levaduras incluyen dichos promotores constitutivos tales como la 3-fosfoglicerato quinasa y varios otros promotores de genes de enzima glicolítica o dichos promotores inducibles tales como el promotor de alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen los derivados de los tipos siguientes: auto-replicativos de bajo número de copias (tales como la serie YRp), auto-replicativos de elevado número de copias (tales como la serie YEp); los tipos de integración (tales como la serie YIp), o los mini-cromosomas (tales como la serie YCp).

Las células de cultivo tisular eucarióticas superiores son las células huésped preferidas para la expresión de la proteína CTLA-8 funcionalmente activa. En principio, muchas de las líneas celulares de cultivo tisular eucarióticas superiores son capaces de ser trabajadas, por ejemplo, los sistemas de expresión de báculovirus de los insectos, ya procedan de una fuente invertebrada o vertebrada. Sin embargo, se prefieren las células de los mamíferos, en el tratamiento, tanto cotranslacionalmente como post-translacionalmente. La transformación o la transfección y propagación de dichas células ha llegado a ser un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen las células HeLa, las líneas celulares del ovario de hámster Chino (CHO), las líneas celulares del riñón de la ratita (BRK), las líneas celulares de insectos, las líneas celulares de pájaros, y las líneas celulares de monos (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares incluyen usualmente un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la traducción, sitios de corte y empalme del RNA (si se usa un DNA genómico), un sitio de poli-adenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores usualmente contienen también un gen de selección o un gen amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retro-virus que transportan promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como los adenovirus, SV40, parvovirus, virus de la viruela de las vacas, o los citomegalovirus. Ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama y colaboradores (1985) Mol. Cell Biol., 5:1136-1142; pMC1neo PolY-A, véase Thomas y colaboradores (1987) Cell 51:503:512; y un vector de báculovirus tal como pAC 373 ó pAC 610, véase O'Reilly y colaboradores (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Freeman and Co, CRC Press, Boca Raton, Florida.

A menudo será deseable expresar un polipéptido de proteína CTLA-8 de primate en un sistema que proporcione un método de glicosilación específico o definido. En este caso, el método usual será aquel proporcionado naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el método será modificable mediante exposición del polipéptido, por ejemplo, una forma sin glicosilar, a las proteínas de glicosilación apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen de la proteína CTLA-8 se puede co-transformar con uno o más genes que codifican enzimas de glicosilación de mamíferos u otros. Usando este método, ciertos patrones de glicosilación de mamíferos serán conseguibles o aproximados en las células procariotas o de otro tipo.

La proteína CTLA-8 de primate, o un fragmento de la misma, se puede transformar para estar vía fosfatidil inositol (PI) unida a una membrana celular, pero se puede separar de las membranas mediante tratamiento con una enzima que disocie el fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite su purificación mediante procedimientos estándar de la química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophys. Acta, 988:427-454; Tse y colaboradores (1985), Science 230:1003-1008; y Brunner y colaboradores (1991) J. Cell Biol., 114:1275-1283.

Ahora que la proteína CTLA-8 ha sido zada, se pueden preparar fragmentos o derivados de la misma mediante procedimientos convencionales para la síntesis de péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como son los descritos en Stewart and Young (1964) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York. Por ejemplo, se pueden usar un procedimiento de azida, un procedimiento de cloruro de ácido, un procedimiento de anhídrido de ácido, un procedimiento de anhídrido mixto, un procedimiento de éster activo (por ejemplo, éster de p-nitro-fenilo, éster de N-hidroxi-succinimida, o éster de ciano-metilo), un procedimiento de carbodiimidazol, un procedimiento de oxidación-reducción, o un procedimiento de diciclohexil-carbodiimida (DCDC)/aditivo. Las síntesis en fase sólida y en fase en disolución son ambas aplicables para los procedimientos precedentes.

La proteína CTLA-8 de primate, fragmentos, o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los procedimientos anteriores como se emplean típicamente en la síntesis de péptidos, generalmente mediante un procedimiento denominado de etapa a etapa que comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, en secuencia de uno a uno, o mediante la copulación de fragmentos de péptido al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se van a usar en la reacción de copulación se protegen típicamente para prevenir su copulación en una posición incorrecta.

Si se adopta una síntesis en fase sólida, el aminoácido terminal en C está unido a un vehículo o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no está particularmente limitado siempre y cuando él tenga una capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de dichos vehículos insolubles incluyen las resinas de halo-metilo, tales como la resina de cloro-metilo o la resina de bromo-metilo, las resinas de hidroxi-metilo, la resinas de fenol, las resinas de terc-alquiloxicarbonilo hidrazidadado (tratado con hidrazida), y las semejantes.

Un aminoácido protegido con un grupo amino está unido en secuencia a través de la condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena previamente formado, para sintetizar el péptido etapa a etapa. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido se separa del vehículo insoluble para producir el péptido. Este método en fase sólida se describe de manera general por Merrifield y colaboradores (1963) en J. Am. Chem. Soc., 85:2149:2156.

La proteína preparada y los fragmentos de la misma se pueden aislar y purificar a partir de la mezcla de reacción mediante medios de la separación de péptidos, por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis, y diversas formas de cromatografía, y los semejantes. Las proteínas CTLA-8 de primate de esta invención se pueden obtener en grados variables de pureza dependiendo de su uso deseado. La purificación se puede efectuar mediante el uso de las técnicas de purificación de proteínas descritas en la presente invención o mediante el uso de los anticuerpos de la presente invención descritos en la cromatografía de afinidad inmunoabsorbante. Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbante se realiza mediante en primer lugar unir los anticuerpos a un soporte sólido y a continuación poner en contacto los anticuerpos unidos con los lisados solubilizados de células de fuentes apropiadas, los lisados de otras células que expresan la proteína, o los lisados o los materiales sobrenadantes de células que producen la proteína CTLA-8 como consecuencia de las técnicas de DNA, véase más adelante.

V. Variantes físicas

Esta invención comprende también proteínas o péptidos que tienen una homología sustancial de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la proteína CTLA-8. Las variantes incluyen especies o variantes alélicas.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina mediante la optimización de los apareamientos de restos, si fuera necesario, mediante la introducción de espacios según se requiera. Esto cambia cuando se considera las sustituciones conservativas como apareamientos. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen las sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homólogos pretenden típicamente incluir las variaciones alélicas naturales y las interespecies en cada secuencia de proteínas respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán desde 50-100% de homología (si se pueden introducir espacios), a 80-100% de homología (si se incluyen las sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de una proteína CTLA-8 de primate. Las medidas de identidad serán al menos de aproximadamente 60%, generalmente de al menos aproximadamente 65%, a menudo de al menos aproximadamente 70%, típicamente de al menos aproximadamente 75%, usualmente de al menos aproximadamente 80%, más usualmente de al menos aproximadamente 84%, preferiblemente de al menos aproximadamente 87%, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 90% y en las realizaciones particularmente preferidas, de al menos aproximadamente 95% ó más. Véase también Needleham y colaboradores (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453; Sankoff y colaboradores (1983), Capítulo Uno en Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de programas informáticos de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Los fragmentos incluyen todas las combinaciones de longitudes, medidas, y términos, como se proporcionan dentro de las secuencias
descritas.

El DNA aislado que codifica una proteína CTLA-8 se puede modificar fácilmente mediante las sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan lugar a nuevas secuencias de DNA que codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica, o antigénica similares. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir antígenos mutantes o para potenciar la expresión. La expresión potenciada puede implicar la amplificación del gen, una transcripción incrementada, una traducción incrementada, y otros mecanismos. Dichos derivados de la proteína CTLA-8 mutante incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la respectiva proteína o de sus fragmentos. "La proteína CTLA-8 mutante" comprende un polipéptido que de otro modo cae dentro de la definición de homología de la proteína CTLA-8 humana según se estableció anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteína CTLA-8 que se encuentra en la naturaleza, ya sea por vía de deleción, sustitución, o inserción. En particular, la expresión "proteína CTLA-8 de primate mutante de sitio específico" incluye generalmente proteínas que tienen una homología significativa con una proteína que tiene las secuencias SEQ ID NO: 4, 6, u 8, y que comparte diversas actividades biológicas, por ejemplo, antigénica o inmunológica, con aquellas secuencias, y en las realizaciones preferidas contienen la mayor parte de las secuencias descritas. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas CTLA-8, particularmente a aquellas encontradas en diversos primates, por ejemplo, monos y gibones. Como se estableció antes, se resalta que las descripciones generalmente quieren significar que comprenden todas las proteínas CTLA-8, y no se limitan a la realización humana específicamente tratada.

Aunque los sitios de mutación de sitio específico están predeterminados, los mutantes no necesitan un sitio específico. La mutagénesis de la proteína CTLA-8 se puede efectuar mediante hacer inserciones o deleciones de aminoácidos. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones, o cualesquiera combinaciones para llegar a una construcción final Las inserciones incluyen las fusiones amino- o carboxi-terminales. La mutagénesis al azar se puede efectuar en un codón diana y los mutantes expresados se pueden evaluar para determinar la actividad deseada. Los métodos para efectuar las mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el DNA que tiene una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante las técnicas de mutagénesis de cebador M13 ó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase también Sambrook y colaboradores (1989) y Ausubel y colaboradores (1987 y Suplementos).

Las mutaciones en el DNA normalmente no deben colocar secuencias de codificación fuera de los marcos de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que se podrían hibridar para producir una estructura de mRNA secundaria tal como bucles u horquillas.

La presente invención proporciona también proteínas recombinantes, por ejemplo proteínas de fusión heterólogas usando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o de segmentos que están naturalmente no fusionadas normalmente de la misma manera. Así, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de CTLA-8 es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace de péptido típico, preparada típicamente como un producto de traducción simple y que exhibe propiedades obtenidas de cada péptido fuente. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, las nuevas construcciones se pueden preparar a partir de combinar dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, la unión de antígeno o de otros segmentos se puede "intercambiar" entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión diferentes. Véase, por ejemplo, Cunningham y colaboradores (1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd y colaboradores (1988) J. Biol. Chem., 263:15985-15992. Así, se producirán nuevos polipéptidos quiméricos que exhiben nuevas combinaciones de especificidades a partir del enlace funcional de dominios biológicamente pertinentes y de otros dominios funcionales.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts., 22:1859-1862, producirá fragmentos de DNA sintéticos adecuados. Un fragmento de doble hebra se obtendrá a menudo mediante síntesis de la hebra complementaria y la reasociación de la hebras conjuntamente bajo condiciones apropiadas o mediante la adición de la hebra complementaria usando la DNA polimerasa con una secuencia de cebador apropiada, por ejemplo, las técnicas PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las proteínas CTLA-8 puede dar lugar a la inhibición de la unión del antígeno a su socio de unión natural, por ejemplo, a través de la inhibición competitiva. Así, en los ensayos in vitro de la presente invención se usarán a menudo proteína aislada, membranas de células que expresan una membrana recombinante asociada a la proteína CTLA-8, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión, o fragmentos fijados a los substratos de fase sólida. Estos ensayos permitirán también la determinación diagnóstica de los efectos de bien las mutaciones y modificaciones del segmento de unión, o las mutaciones y modificaciones de la proteína, por ejemplo, sus análogos.

Esta invención contempla también el uso de ensayos de evaluación de fármacos competitivos, por ejemplo, en los que los anticuerpos neutralizantes a antígeno o fragmentos de socios de unión compiten con un compuesto de ensayo para unirse a la proteína. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier poli-péptido que comparte uno o más sitios de unión antigénicos de la proteína y se pueden usar también para ocupar los sitios de unión sobre la proteína que de otro modo podrían interactuar con un socio de unión.

Adicionalmente, los anticuerpos neutralizantes frente a la proteína CTLA-8 y los fragmentos solubles del antígeno que contienen un sitio de unión al receptor de elevada afinidad, se pueden usar para inhibir la función del antígeno en los tejidos, por ejemplo, en los tejidos que experimentan una fisiología anormal.

El término "derivados" de unos antígenos de CTLA-8 de primate incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glicosilación, y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes se pueden preparar mediante enlace de las funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos de CTLA-8 ó en los N- ó C- terminales, por medios que se conocen bien en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticas del carboxilo terminal, o de restos que contienen cadenas laterales de carboxilo, los derivados de O-acilo de los restos que contienen grupos hidroxilo, y los derivados de N-acilo del amino del aminoácido terminal o los restos que contienen grupos amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo que incluyen alquilo normal C_{3} a C_{18}, por medio de lo cual forman especies de alcanoil aroilo. La unión covalente a las proteínas vehículo puede ser importante cuando los restos inmunológicos son haptenos.

En particular, están incluidas las alteraciones de la glicosilación, por ejemplo, las preparadas mediante modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y tratamiento, o en las etapas de tratamiento posteriores. Los medios particularmente preferidos para efectuar esto son mediante exposición del polipéptido a las enzimas de glicosilación obtenidas a partir de células que normalmente proporcionan dicho tratamiento, por ejemplo las enzimas de glicosilación de mamíferos. Se contemplan también las enzimas de desglicosilación. También se abarcan las versiones de la misma secuencia de aminoácido primario que tengan otras pequeñas modificaciones, incluyendo los restos de aminoácido fosforilado, por ejemplo, fosfo-tirosina, fosfo-serina, o fosfo-treonina.

Un grupo más importante de derivados son los conjugados covalentes de la proteína CTLA-8 o de fragmentos de la misma con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivos recombinantes tales como las fusiones N- o C-terminales o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en la reticulación de proteínas a través de sus grupos laterales reactivos. Los sitios de formación de antígenos preferidos con los agentes de reticulación están en los grupos amino libres, los restos de carbohidrato, y los restos de cisteína.

Se proporcionan también polipéptidos de fusión entre las proteínas CTLA-8 de primates y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores superficiales, lo que da lugar a, por ejemplo, una proteína híbrida que exhibe especificidad de unión con el receptor. Asimismo, se pueden efectuar fusiones heterólogas que exhiben una combinación de las propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son las fusiones de un polipéptido "reportero", por ejemplo, la luciferasa, con un segmento o dominio de un antígeno, por ejemplo, un segmento de unión al receptor, de tal manera que la presencia o localización del antígeno fusionado se puede determinar fácilmente. Véase, por ejemplo, Dull y colaboradores; Patente de EE.UU. Nº 4.859.609. Otros socios de la fusión de genes incluyen la \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol-deshidrogenasa, y el factor de acoplamiento alfa de la levadura. Véase, por ejemplo, Godowski y colaboradores (1988) Science 241:812-816.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts, 22:1859:1862, producirá fragmentos de DNA sintético adecuados. Se obtiene a menudo un fragmento de doble hebra mediante bien sintetizar la hebra complementaria y reasociar las hebras juntas bajo condiciones apropiadas o mediante la adición de la hebra complementaria usando DNA polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Dichos polipéptidos pueden tener también restos de aminoácidos que han sido modificados químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación (tratamiento con biotina), o la adición o separación de otros restos, particularmente aquellos que tienen formas moleculares similares a los grupos de fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje útiles, o sirven como dianas de purificación, por ejemplo ligandos de afinidad.

Las proteínas de fusión se preparan típicamente bien mediante los métodos de ácido nucleico recombinante o mediante los métodos de polipéptido sintéticos. Las técnicas para la manipulación de los ácidos nucleicos se describen de manera general, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición), Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science, 232:341-347; y Atherson y colaboradores (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.

Esta invención contempla también el uso de derivados de las proteína CTLA-8 distintos a las variaciones en la secuencia de aminoácidos o en la glicosilación. Dichos derivados pueden implicar la asociación covalente o de agregación con restos químicos. Estos derivados generalmente se clasifican en tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de cadena lateral y resto terminal, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con las membranas celulares. Dichos derivados covalentes o de agregación son útiles como agentes inmunógenos, como reactivos en los ensayos inmunológicos, o en los métodos de purificación tales como la purificación por afinidad de antígenos u otras proteínas de unión. Por ejemplo, un antígeno de CTLA-8 de primate se puede inmovilizar mediante enlace covalente a un soporte sólido tal como Sefarose activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que se conocen bien en la técnica, o adsorbidos sobre las superficies de poliolefinas, con o sin reticulación con aldehído glutárico, para su uso en el ensayo o purificación de los anticuerpos de antiproteína CTLA-8 o de su receptor u otro socio de unión. Los antígenos de CTLA-8 de primate se pueden marcar también con un grupo detectable, por ejemplo marcados con yodo radiactivo mediante el procedimiento de la cloramina T, unidos covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugados con otro resto fluorescente para su uso en ensayos de diagnóstico. La purificación de la proteína CTLA-8 se puede efectuar mediante anticuerpos inmovilizados o socios de unión.

Un antígeno o fragmento de CTLA-8 solubilizado de esta invención se puede usar como un inmunógeno para la producción de anti-sueros o anticuerpos específicos para la proteína o fragmentos de la misma. El antígeno purificado se puede usar para evaluar los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de unión preparados mediante inmunización con diversas formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos" comprende también los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos naturales. Las proteínas CTLA-8 se pueden usar también como un reactivo para detectar cualesquiera anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados de la proteína o fragmentos de células que contienen el antígeno, ambos de los cuales pueden ser el diagnóstico de un estado de enfermedad anormal o fisiológico específico. Adicionalmente, los fragmentos de antígenos pueden servir también como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, según se describe inmediatamente más adelante. Por ejemplo, esta invención contempla los anticuerpos generados frente a las secuencias de aminoácidos codificados por las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 3, 5, ó 7, o fragmentos de proteínas que contienen las mismas. En particular, esta invención contempla los anticuerpos que tienen afinidad de unión con o que se generan frente a fragmentos específicos que se prevé caen fuera de la bi-capa
lípídica.

La presente invención contempla el aislamiento de variantes de especies estrechamente relacionadas adicionales. El análisis mediante transferencia Southern estableció que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos, por ejemplo, en ratas y ratones. Es probable que las proteínas CTLA-8 estén extendidas ampliamente en variantes de las especies, por ejemplo, en los gibones, gorilas, y cercopothecidae.

La invención proporciona también medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que presentan tanto diferencias como similaridades en su estructura, expresión, y funciones. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de los antígenos se acelerará grandemente mediante el aislamiento y caracterización de variantes de especies diferenciadas. En particular la presente invención proporciona sondas útiles para la identificación de entidades genéticas homólogas adicionales en especies de primates diferentes.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una proteína CTLA-8 correspondiente, por ejemplo, bien tipos de especies o células que carecen de los antígenos correspondientes y deben exhibir actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares antigénicamente puras, con variantes de especies definidas o únicas. Este método permitirá una detección y discriminación más sensibles de los efectos fisiológicos de las proteínas CTLA-8. Se pueden aislar y usar fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o los fragmentos de membranas.

La disección de los elementos estructurales que efectúan las diversas funciones fisiológicas o de diferenciación es posible usando las técnicas de la biología molecular moderna, particularmente en la comparación de elementos de la clase relacionados. Véase, por ejemplo, la técnica de la mutagénesis de barrido de homólogos descrita en Cunningham y colaboradores (1989), Science 243:1336-1339; y los métodos usados por O'Dowd y colaboradores (1988) J. Biol. Chem., 263:15985-15992; y Lechleiter y colaboradores (1990) EMBO J., 9:4381-4390.

En particular, los dominios o segmentos funcionales pueden estar sustituidos entre variantes de especies para determinar qué características naturales son importantes tanto en la afinidad como en la especificidad del socio de unión, así como también la transducción señal. Se usará un conjunto de diferentes variantes para evaluar las moléculas que exhiben propiedades combinadas de interacción con diferentes variantes de especies de los socios de unión.

La internalización del antígeno se puede producir bajo ciertas circunstancias, y se puede producir la interacción entre los componentes intracelulares y los segmentos de proteínas "extracelulares" implicados en las interacciones. Los segmentos específicos de interacción de la proteína CTLA-8 con otros componentes intracelulares se pueden identificar mediante mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo, métodos de reticulación o de afinidad. El análisis estructural mediante métodos cristalográficos u otros métodos físicos serán también aplicables. Una investigación adicional del mecanismo de la función biológica incluirá el estudio de los componentes asociados que se pueden aislar mediante métodos de afinidad o mediante métodos genéticos, por ejemplo el análisis de complementación de mutantes.

Se puede efectuar un estudio adicional de la expresión y control de la proteína CTLA-8. Los elementos de control asociados con los antígenos pueden exhibir patrones de diferenciales de desarrollo, específico de tejido, u otros de expresión. Las regiones genéticas aguas arriba y aguas abajo, por ejemplo, los elementos de control, son de interés.

Los estudios estructurales del antígeno conducen al diseño de nuevas variantes, particularmente de análogos que exhiben propiedades de agonista o antagonista sobre los socios de unión. Esto se puede combinar con los métodos de evaluación descritos previamente para aislar las variantes que exhiben los espectros deseados de actividades.

La expresión en otros tipos de células darán lugar a menudo a diferencias de glicosilación en un antígeno en particular. Diversa variantes de especies pueden exhibir funciones diferentes basadas en las diferencias estructurales distintas a la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones diferenciales puede ser responsable de la función diferencial, y la elucidación de los efectos se han hecho ahora posible.

Así, la presente invención proporciona importantes reactivos relacionados con la interacción antígeno-socio de unión. Aunque la descripción precedente se ha centrado principalmente sobre la proteína CTLA-8 humana, las personas especializadas en la técnica reconocerán inmediatamente que la invención comprende otros antígenos, por ejemplo de especies del mono y de otros primates o variantes alélicas, así como también variantes de los mismos.

Anticuerpos

Se pueden generar anticuerpos de las diversas proteínas CTLA-8, incluyendo especies o variantes alélicas, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas que existen en la naturaleza como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden generar anticuerpos de las proteínas CTLA-8 bien en sus formas activas como en sus formas inactivas. Se contemplan también los anticuerpos anti-idiotípicos.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones de cadena única, frente a fragmentos predeterminados de los antígenos se pueden generar mediante la inmunización de los animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan los anticuerpos deseados. Estos anticuerpos monoclonales se pueden evaluar para determinar su unión a proteínas CTLA-8 normales o defectuosas, o evaluados para determinar su actividad agonística o antagonística, por ejemplo mediada a través de un socio de unión. Estos anticuerpos monoclonales se unirán usualmente con al menos un K_{D} de aproximadamente 1 mM, más usualmente de al menos aproximadamente 300 \muM, típicamente de al menos aproximadamente 10 \muM, más típicamente de al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 \mum, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 3 \mum o mejor.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, de esta invención pueden tener un valor de diagnóstico o terapéutico significativo. Ellos pueden ser potentes antagonistas que se unen a un socio de unión e inhiben la unión del antígeno o inhiben la capacidad de un antígeno para obtener una respuesta biológica. Ellos pueden ser también útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden copular a toxinas o radionucleidos de tal manera que cuando el anticuerpo se una al antígeno, una célula que exprese el mismo, por ejemplo, sobre su superficie, es eliminada. Además, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, bien directamente o indirectamente por medio de un engarce, y pueden efectuar el objetivo del fármaco.

Los anticuerpos de esta invención pueden ser también útiles en las aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, ellos se pueden evaluar para determinar su capacidad de unión a los antígenos sin inhibir su unión mediante un socio. Como anticuerpos de neutralización, ellos pueden ser útiles en los ensayos de unión competitivos. Ellos serán también útiles en la detección o cuantificación de la proteína CTLA-8 o de sus socios de unión. Véase, por ejemplo, Chan (ed) (1987) Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, Florida; Ngo (ed) (1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Pres, NY; y Price and Newman (eds) (1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, NY.

Los fragmentos de antígeno pueden estar unidos a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o covalentemente unidos para ser usados como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos pueden estar fusionados o covalentemente unidos a una variedad de inmunógenos, tales como la hemocianina de la lapa ojo de cerradura, la albúmina del suero bovino, el toxoide tetánico, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, Nueva York, y Williams y colaboradores (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Volumen 1, Academic Press, Nueva York, para las descripciones de los métodos de preparación de anti-sueros policlonales. Un método típico implica la hiper-inmunización de un animal con un antígeno. La sangre del animal se recoge a continuación poco después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la gamma globulina.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos huéspedes de mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, y seres humanos. La descripción de las técnicas para la preparación de dichos anticuerpos monoclonales se puede encontrar en, por ejemplo, Stites y colaboradores (eds) Basic and Clinical Immunology (4ª edición), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª edición) Academic Press, Nueva York; y particularmente en Kohler and Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que trata sobre un método de generar anticuerpos monoclonales. Resumiendo brevemente, este método implica inyectar un animal con un inmunógeno. A continuación se sacrifica el animal y se extraen células de su bazo, las cuales a continuación se fusionan con células del mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. A continuación la población de hibridomas se evalúa para aislar clones individuales, cada uno de los cuales segregan unas especies de anticuerpo únicas al inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpo individuales obtenidas son los productos de células B simples inmortalizadas y clonadas del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunológica.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, Huse y colaboradores (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281; y Ward y colaboradores (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo los anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán mediante unión, bien covalentemente o no covalentemente, a una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcadores y de técnicas de conjugación y se informan de ellas ampliamente tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionucleidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y los semejantes. Las patentes que muestran el uso de dichos marcadores incluyen las Patentes de EE.UU. Nº^{s} 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También, se puede producir inmunoglobulina recombinante, véase Cabilly, Patente de EE.UU. Nº 4.816.567.

Los anticuerpos de esta invención se pueden usar también para la cromatografía por afinidad en el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como de agarosa, Sephadex, o las semejantes, en las que un lisado de células se puede hacer pasar a través de la columna, se lava la columna, seguido de incrementar las concentraciones de un desnaturalizante suave, por medio de lo cual se liberará la proteína CTLA-8 purificada.

Los anticuerpos se pueden usar también para evaluar las bibliotecas de expresión para productos de expresión en particular. Usualmente los anticuerpos usados en un procedimiento tal se marcarán con un resto que permita la detección fácil de la presencia del antígeno mediante la unión del anticuerpo.

Los anticuerpos generados frente a cada proteína CTLA-8 serán también útiles para generar anticuerpos antiidiotípicos. Estos serán útiles en la detección o diagnosis de diversos estados inmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos respectivos.

Usos

La presente invención proporciona reactivos que encuentran uso en aplicaciones de diagnóstico como las descritas en otra parte en la presente invención, por ejemplo, en la descripción general de las anormalidades fisiológicas o de desarrollo, o más adelante en la descripción de los estuches (kit) para diagnóstico.

Esta invención proporciona también reactivos con significativo valor terapéutico. La proteína CTLA-8 (existente en la naturaleza o recombinante), fragmentos de la misma, y los anticuerpos, junto con los compuestos identificados como que tienen afinidad de unión con la proteína CTLA-8, deben ser útiles en el tratamiento de los estados asociados con una fisiología o desarrollo anormales, que incluyen la proliferación anormal, por ejemplo, estados cancerosos, o estados degenerativos. La proliferación anormal, regeneración, degeneración, y atrofia se pueden modular mediante un tratamiento terapéutico apropiado usando las composiciones que se proporcionan en la presente invención. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociados con la expresión anormal o la señal anormal mediante un antígeno de la CTLA-8 debería ser un objetivo probable para un agonista o antagonista de la proteína.

Otros estados de desarrollo anormales se conocen en los tipos de células que muestran poseer mRNA antígeno de la CTLA-8 mediante análisis por transferencia Northern. Véase Berkow (ed) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; y Thorn y colaboradores Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Nueva York. Estos problemas pueden ser susceptibles de su prevención o tratamiento usando las composiciones proporcionadas en la presente invención.

Los anticuerpos recombinantes que se unen a la CTLA-8 se pueden purificar y a continuación se pueden administrar a un paciente. Estos reactivos se pueden combinar para su uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, coadyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones se pueden filtrar en condiciones estériles y colocadas en formas de dosis tal como mediante liofilización en viales de dosis o almacenadas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso dee anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, incluyendo las formas que no son de unión del complemento.

Se puede efectuar una evaluación usando CTLA-8 para determinar los socios de unión o los compuestos que tienen afinidad de unión con el antígeno de CTLA-8, incluyendo el aislamiento de los componentes asociados. Los ensayos biológicos subsiguientes se pueden utilizar a continuación para determinar si el compuesto tiene actividad biológica intrínseca y es por lo tanto un agonista o antagonista porque el mismo bloquea una actividad del antígeno. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos de la proteína CTLA-8 como antagonistas. Este método debe ser particularmente útil con otras variantes de especies de la proteína CTLA-8.

Las cantidades de reactivos necesarios para una terapia eficaz depende de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, y de otros medicamentos administrados. Así, se deben valorar las dosis de tratamiento para optimizar su seguridad y eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en la determinación de las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo en animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosis humana. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman y colaboradores (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edición (1990), Mack Publishing Co, Easton, Penn. Los métodos para su administración se tratan también en la presente invención y más adelante, por ejemplo, para su administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, difusión transdérmica, y otras. Véase también Langer (1990) Science 249:1527-1533. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, disolución salina, disoluciones tampón, y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Los intervalos de dosis cabría esperar que fueran de ordinario en cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamente a concentraciones inferiores a aproximadamente 10 \muM, usualmente inferiores a aproximadamente 100 nM, preferiblemente inferiores a aproximadamente 10 pM (picomolares) y lo más preferiblemente inferiores a aproximadamente 1 fM (femtomolares), con un vehículo apropiado. Las formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta se utilizarán a menudo para su administración continua.

La proteína CTLA-8, los fragmentos de la misma, y los anticuerpos para ella o sus fragmentos, antagonistas, y agonistas, se pueden administrar directamente al huésped a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugar los mismos con proteínas vehículos tales como la ovalbúmina o la albúmina del suero con anterioridad a su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en cualquier formulación de dosis convencional. Mientras que es posible que el ingrediente activo se administre solo, es preferible presentar el mismo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones típicamente comprenden al menos un ingrediente activo, según se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables de los mismos. Cada vehículo debe ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para su administración por vía oral, rectal, nasal, o parenteral (incluyendo la subcutánea, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unidad y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman y colaboradores (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press, Parrytown, NY; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edición (1990), Mack Publishing Co, Easton, Penns; Avis y colaboradores (eds) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 2ª edición, Dekker, NY; y Lieberman y colaboradores (eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. La terapia de esta invención se puede combinar con o usarse en asociación con otros agentes quimio-terapéuticos o quimio-preventivos.

Tanto las formas existentes en la naturaleza como las recombinantes de las proteínas CTLA-8 de esta invención son particularmente útiles en estuches (kits) y métodos de ensayo que son capaces de evaluar compuestos para determinar su actividad de unión a las proteínas. Se han desarrollado en años recientes varios métodos de ensayos automáticos tales que permiten la evaluación de decenas de miles de compuestos en un corto período de tiempo. Véase, por ejemplo, Fodor y colaboradores (1991) Science 251:767-773, que describe medios para el ensayo de la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un substrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados se puede facilitar grandemente por la disponibilidad de grandes cantidades de proteína CTLA-8 soluble y purificada como se proporciona por esta invención.

Esta invención es particularmente útil para la evaluación de compuestos mediante el uso del antígeno recombinante en cualquiera de una variedad de técnicas de evaluación de fármacos. Las ventajas de usar una proteína recombinante en la evaluación de ligandos específicos incluyen: (a) fuente renovable mejorada del antígeno de una fuente específica; (b) potencialmente mayor número de moléculas de antígeno por célula que proporcionan una mejor relación de señal a ruido en los ensayos; y (c) especifidad de las variantes de especies (lo que proporciona teóricamente una mayor especificidad biológica y frente a la enfermedad). La proteína purificada se puede ensayar en numerosos ensayos, típicamente en ensayos in vitro, que evalúan las respuestas biológicamente pertinentes. Véase, por ejemplo, Coligan Current Protocols in Immunology; Hood y colaboradores Immunology, Benjamin/Cummings; Paul (ed) Fundamental Immunology; y Methods in Enzymology, Academic Press.

Un método de evaluación de fármacos utiliza células huéspedes eucarióticos o procarióticos que son transformados establemente con moléculas de DNA recombinante que expresan los antígenos de la CTLA-8. Se pueden aislar células que expresan un antígeno mediante aislamiento a partir de otros antígenos funcionalmente equivalentes. Dichas células, bien en forma viable o fija, se pueden usar para ensayos estándar de unión proteína a proteína. Véase también, Parce y colaboradores (1989) Science 246:243-247; y Owicki y colaboradores (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar las respuestas celulares. Los ensayos competitivos son particularmente útiles, en los que las células (fuente de la proteína CTLA-8) se ponen en contacto y se incuban con un socio de unión o anticuerpo marcado que tienen afinidad de unión conocida para el ligando, tal como el anticuerpo I^{125}, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión se va a medir. Las composiciones de unión marcadas combinadas y libres se separan a continuación para evaluar el grado de unión del antígeno. La cantidad de compuesto de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de receptor marcado que se une a la fuente conocida. Se puede usar una cualquiera de las numerosas técnicas para separar el antígeno combinado del libre para evaluar el grado de unión. Esta etapa de separación puede implicar típicamente un procedimiento tal como la adhesión a los filtros seguido de lavado, adhesión a plástico seguido de lavado, o centrifugación de las membranas celulares. Las células viables se pueden usar también para evaluar los efectos de los fármacos sobre las funciones mediadas por la proteína CTLA-8, por ejemplo, los niveles de segundo mensajero, es decir, Ca^{++}; la proliferación de células; los cambios en la agrupación de inositol fosfato; y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo, un sistema de detección sensible a la proximidad. Los colorantes sensibles al calcio serán útiles para la detección de los niveles de Ca^{++}, con un fluorímetro o un aparato de clasificación de células por fluorescencia.

Otro método utiliza membranas de células huéspedes eucarióticas o procarióticas transformadas como la fuente de la proteína CTLA-8. Estas células están establemente transformadas con los vectores DNA que dirigen la expresión de una membrana asociada a la proteína CTLA-8, por ejemplo, una forma combinada de membrana transformada. Esencialmente, las membranas se preparan a partir de las células y se usan en cualquier ensayo de unión del tipo receptor/ligando tal como el ensayo competitivo establecido anteriormente.

Todavía otro método es usar proteína CTLA-8 purificada, impurificada o solubilizada, solubilizada procedente de células huéspedes eucarióticas o procarióticas transformadas. Esto permite un ensayo de unión "molecular" con las ventajas de una especificidad incrementada, la capacidad de ser automático, y un rendimiento elevado del ensayo de fármacos.

Otra técnica para la evaluación de fármacos implica un método que proporciona un elevado rendimiento de la evaluación de los compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a la CTLA-8 y se describe en detalle en Geysen, Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. En primer lugar, se sintetizan grandes cantidades de compuestos de ensayo de diferentes péptidos pequeños sobre un substrato sólido, por ejemplo, alfileres de plástico o alguna otra superficie adecuada, véase Fodor y colaboradores (1991). A continuación todos los alfileres se hacen reaccionar con una composición de unión CTLA-8 purificada, impurificada o solubilizada, solubilizada, y se lava. La etapa siguiente implica la detección de la composición de unión combinada.

El diseño racional de fármacos se puede basar también en los estudios estructurales de las formas moleculares de la proteína CTLA-8 y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que median otras funciones en respuesta a la unión del antígeno, u otras proteínas que normalmente interactúan con el antígeno. Un medio de determinar qué sitios interactúan con proteína específicas diferentes es una determinación de la estructura física, por ejemplo, la cristalografía de rayos X o técnicas de RMN de dos dimensiones. Estas proporcionarán una guía en lo que se refiere a qué restos de aminoácidos forman regiones de contacto moleculares. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, Nueva York.

La proteína CTLA-8 purificada puede estar revestida directamente sobre placas para su uso en las técnicas de evaluación de fármacos antes mencionadas. Sin embargo, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para estos ligandos como los anticuerpos de captura para inmovilizar el ligando respectivo sobre la fase sólida.

Estuches (Kits)

Esta invención contempla también el uso de las proteínas CTLA-8, fragmentos de la misma, péptidos, y sus productos de fusión en una variedad de estuches y métodos de diagnóstico para la detección de la presencia de una composición de unión. Típicamente el estuche tendrá un compartimiento que contiene bien un péptido de la CLTA-8 definido o un segmento de gen o un reactivo que reconoce uno o el otro, por ejemplo, fragmentos de antígeno o anticuerpos. Véase, por ejemplo, Chen (ed) (1987) Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman (eds) (1991), Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, Nueva York; y Ngo (ed) (1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY.

Un estuche para la determinación de la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a una proteína CTLA-8 comprende típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida para el antígeno; una fuente de proteína CTLA-8 (existente en la naturaleza o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado combinado del libre, tal como una fase sólida para la inmovilización del antígeno. Una vez se han evaluado los compuestos, los que tienen afinidad de unión al antígeno adecuada se pueden evaluar en ensayos biológicos adecuados, según se conoce bien en la técnica, para determinar si ellos exhiben actividades biológicas similares para el antígeno natural. La disponibilidad de polipéptidos de proteína CTLA-8 recombinante proporciona también patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos.

Un estuche preferido para la determinación de la concentración de, por ejemplo, una proteína CTLA-8 en una muestra comprende típicamente un compuesto marcado, por ejemplo, un anticuerpo, que tiene afinidad de unión conocida para el antígeno, una fuente de antígeno (existente en la naturaleza o recombinante) y un medio para separar el compuesto marcado combinado del libre, por ejemplo, una fase sólida para la inmovilización de la proteína CTLA-8. Se proporcionan normalmente compartimientos que contienen los reactivos, y las instrucciones.

Un método para la determinación de la concentración de la proteína CTLA-8 en una muestra comprende típicamente las etapas de: (1) preparar membranas a partir de una muestra que comprende una fuente de proteína CTLA-8 unida a la membrana; (2) lavar las membranas y suspender las mismas en una disolución tampón; (3) solubilizar el antígeno mediante incubación de las membranas en un medio de cultivo al que se le ha añadido un detergente adecuado; (4) ajustar la concentración de detergente del antígeno solubilizado; (5) poner en contacto e incubar dicha dilución con un anticuerpo marcado con un marcador radiactivo para formar complejos; (6) recuperar los complejos tal como mediante filtración a través de filtros tratados con polietilenimina; y (7) medir la radiactividad de los complejos recuperados.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión del antígeno, específicos para la proteína CTLA-8 ó sus fragmentos son útiles en las aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de proteína CTLA-8 y/o de sus fragmentos. Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células activas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos corporales, y además pueden implicar la detección de antígenos relacionados con la proteína en suero, o los semejantes. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo proteína-proteína) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como los de radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunosorbente ligado a enzima o ensayo inmunoenzimático (ELISA), el inmunoensayo de enzimas (EIA), la técnica de inmunoensayo multiplicado de enzimas (EMIT), inmunoensayo fluorescente de substrato marcado (SLFIA), y los semejantes. Por ejemplo, los anticuerpos sin marcar se pueden emplear mediante el uso de un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo para una proteína CTLA-8 ó un fragmento particular de la misma. Ensayos similares se han tratado ampliamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos frente a una proteína CTLA-8, tal como puede ser el diagnóstico de diversos estados anormales. Por ejemplo, la superproducción de proteína CTLA-8 puede dar lugar a la producción de diversas reacciones inmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anormales, particularmente en estados celulares proliferativos tales como el cáncer o la diferenciación anormal.

Frecuentemente, los reactivos para los ensayos diagnósticos se suministran en estuches, de tal manera que se optimice la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo, y el marcador, se proporciona bien anticuerpo marcado o sin marcar, o proteína CTLA-8 marcada. Esto se hace usualmente en conjunción con otros aditivos, tales como disoluciones tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción señal tales como substratos para enzimas, y los semejantes. Preferiblemente, el estuche contendrá también instrucciones para su uso apropiado y para la eliminación de los contenidos después de su uso. Típicamente el estuche tiene compartimientos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan como un polvo liofilizado seco, en el que los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso que proporciona las concentraciones apropiadas de los reactivos para la realización del ensayo.

Cualquiera de los constituyentes antes mencionados de la evaluación de fármacos y de los ensayos diagnósticos se puede usar sin modificación o se puede modificar en una variedad de modos. Por ejemplo, el marcaje se puede conseguir mediante la unión covalentemente o no covalentemente de un resto que directa o indirectamente proporciona una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el antígeno, el compuesto de ensayo, la proteína CTLA-8, o los anticuerpos de la misma se pueden marcar bien directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos de marcaje: radiomarcadores tales como ^{125}I, enzimas (Patente de EE.UU. Nº 3.645.090) tales como la peroxidasa y la fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (Patente de EE.UU. 3.940.475) capaces de controlar el cambio en la intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente seguido de su unión a avidina copulada a uno de los grupos de marcaje anteriores.

Existen también numerosos métodos de separar el antígeno combinado del libre, o alternativamente el compuesto de ensayo combinado del libre. La proteína CTLA-8 se puede inmovilizar sobre diversas matrices seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plástico tal como una placa para los ensayos ELISA, filtros, y perlas. Los métodos de inmovilización de la proteína CTLA-8 a una matriz incluyen, sin limitación, la adhesión directa al plástico, el uso de un anticuerpo de captura, la copulación química, y tratamiento con biotina-avidina. La última etapa en este método implica la precipitación del complejo proteína-proteína mediante cualquiera de diversos métodos que incluyen los que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico tal como polietilen glicol o una sal tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de la partícula magnetizable de anticuerpo marcado con fluoresceína descrito en Rattle y colaboradores (1984) Clin. Chem., 30:1457-1461, y la separación por partícula magnética de doble anticuerpo según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.659.678.

Los métodos para unir proteína o sus fragmentos a los diversos marcadores se han informado ampliamente en la bibliografía y no requieren de un tratamiento detallado en la presente invención. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilos activados bien a través del uso de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloro-acetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para ligamiento, o los semejantes. Las proteínas de fusión encontrarán también uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos extraídos de la secuencia de una proteína CTLA-8. Estas secuencias se pueden usar como sondas para la detección de los niveles de mensaje del antígeno en muestras de pacientes sospechosos de tener un estado anormal, por ejemplo, cáncer o un problema de desarrollo. La preparación de secuencias de nucleótidos tanto de RNA como de DNA, el marcaje de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y tratamiento en la bibliografía. Normalmente una sonda de oligonucleótido debería tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas de polinucleótidos pueden ser de hasta varias kilo-bases. Se pueden emplear varios marcadores, lo más comúnmente radionucleidos, en particular ^{32}P. Sin embargo, se pueden emplear también otras técnicas, tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. A continuación la biotina sirve como el sitio para su unión a la avidina o los anticuerpos, los cuales se pueden marcar con una amplia variedad de marcadores, tales como radionucleidos, agentes de fluorescencia, enzimas, o los semejantes. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo los dúplex de DNA, dúplex de RNA, dúplex de híbridos de DNA-RNA, o dúplex de proteína-DNA. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se realiza cuando el dúplex está unido a una superficie, de tal manera que por la formación de dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo combinado al dúplex. El uso de sondas para el nuevo RNA antisentido se puede realizar mediante cualesquiera técnicas convencionales tales como la hibridación de ácido nucleico, rastreo más y menos, sondeo recombinante, facilitación de la traducción por hibridación (HRT), y bloqueo de la traducción por hibridación (HART). Estas incluyen también las técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se contemplan también estuches de diagnóstico que ensayan también la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o prognosis puede depender de la combinación de las múltiples indicaciones usadas como marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet y colaboradores (1989) Progress in Growth Factor Res., 1:89-97.

El alcance amplio de esta invención se entenderá mejor por referencia a los ejemplos siguientes, que no se pretende limiten la invención a realizaciones específicas.

Ejemplos I. Métodos generales

Algunos de los métodos estándar se describen o se referencian, por ejemplo, en Maniatis y colaboradores (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª edición), volúmenes 1-3, CSH Press, NY; Ausubel y colaboradores, Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel y colaboradores (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York; Innis y colaboradores (eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de columna, electroforesis, centrifugación, cristalización, y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, volumen 182, y otros volúmenes en esta serie; y la bibliografía de los fabricantes sobre el uso de productos para la purificación de las proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N. J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con las técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o a una equivalente que se puede fusionar vía una secuencia de proteasa separable. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods, 12:87-98, Plenum Press, N. Y.; y Crowe y colaboradores (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Los análisis FACS se describen en Melamed y colaboradores (1990) Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry, liss, Nueva York, NY; y Robinson y colaboradores (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, Nueva York, NY.

Fuente del mensaje de CTLA-8

Se evaluaron diversas líneas celulares usando una sonda apropiada para la expresión de mensaje de elevado nivel. Las líneas celulares apropiadas se seleccionan basadas en los niveles de expresión del mensaje de CTLA-8. Los Solicitantes usaron métodos de hibridación substractivos sobre células T citotóxicas activadas.

Aislamiento de un clon que codifica la CTLA-8

Se usan técnicas de PCR estándar para amplificar una secuencia de genes de CTLA-8 procedente de una biblioteca genómica o de cDNA, o de mRNA. Los cebadores apropiados se seleccionan de las secuencias proporcionadas, y se aisla un clon de longitud total. El clon de longitud total, o los fragmentos apropiados del mismo se pueden usar como sondas de hibridación, por ejemplo, para evaluar otros genes homólogos usando condiciones de hibridación rigurosas o menos rigurosas.

En otro método, se usan oligonucleótidos para evaluar una biblioteca. En combinación con las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se usan oligonucleótidos sintéticos en orientaciones apropiadas como cebadores para seleccionar los clones correctos de una biblioteca.

II. Aislamiento de una CTLA-8 humana

Se obtuvo una biblioteca genómica humana de Clontech (Cat. HL1006d) y se evaluó con una sonda cDNA compuesta de unos 453 pares de base que codifica la secuencia completa de una CTLA-8 de ratón. Véase SEQ ID NO: 1. Se encontraron un cierto número de clones lambda independiente que se hibridaban fuertemente con la sonda de mCTLA-8. Un clon contenía un fragmento Xbal de hibridación de aproximadamente 2000 pares de bases que correspondía a un fragmento previamente detectado usando una sonda similar sobre una transferencia Southern de DNA genómico humano. Este fragmento de 2000 pares de bases era subclonado en Bluescript (Stratagene) y se secuenció. Esto reveló una región de 240 pares de bases (véase SEQ ID NO: 5) un 83,8% homóloga a la CTLA-8 de ratón de SEQ ID NO: 1. La traducción de esta región produjo una secuencia de aminoácidos un 70,8% homóloga a los 79 aminoácidos terminales en carboxilo de la proteína supuesta CTLA-8 del ratón. El exón se usó como una sonda para evaluar una biblioteca de cDNA preparada con un cebador que corresponde a los últimos 21 nucleótidos de la región de codificación. Se obtuvieron tres clones de cDNA independientes que contienen la región de codificación completa de la CTLA-8 humana. El marco de lectura abierta de 468 pares de bases codifica un polipéptido de 155 aminoácidos con un peso molecular teórico de 17.100 daltons. Véase SEQ ID NO: 7-8. Esta CTLA-8 es un 66,4% homóloga con el ORF-13 del virus, y un 58,3% homóloga con la proteína codificada CTLA-8 del ratón. Además, las 6 cisteínas se conservan entre los tres genes, así como también los sitios supuestos de glicosilación y de fosforilación.

El análisis de la secuencia de aminoácidos de la CTLA-8 humana revela un tramo hidrofóbico de 19 restos, desde el 7 a aproximadamente el 25, en el amino terminal, similar a un péptido señal. Es altamente probable que la CTLA-8 humana sea una proteína segregada de un peso molecular que se asemeja al de la citocina.

III. Caracterización bioquímica de las proteínas CTLA-8

Dos formas de la CTLA-8 humana se expresaron en células heterólogas; la forma original, y una forma recombinante que visualiza el péptido FLAG en el carboxilo final. Véase, por ejemplo, Crowe y colaboradores (1992) OIAexpress: The High Level Expressiom and Protein Purification System, QUIGEN, Inc. Chatsworth, CA; y Hopp y colaboradores (1988) Bio/Technology, 6:1204-1210. Estas dos formas de la proteína CTLA-8 humana se introdujeron en los vectores de expresión pME18S por pEE12, y posteriormente se sometieron a transfección en células COS-7 ó NSO, respectivamente, mediante electroporación. Las células sometidas a electroporación se cultivaron a continuación durante 48 horas en un medio RPMI suplementado con 10% de suero de ternero fetal. Las células se incubaron a continuación con ^{35}S-Met y ^{35}S-Cys con el fin de marcar las proteínas celulares. La comparación de las proteínas bajo condiciones de reducción sobre SDS-PAGE mostró que las células sometidas a transfección con CTLA-8 humana segregaban un polipéptido de 15.000 daltons. La SDS-PAGE no reductora reveló 2 bandas específicas de alrededor 28.000 daltons y 33.000 daltons.

Con el fin de determinar si la forma natural de la CTLA-8 humana producida mediante células T CD4+ activadas era también segregada como un dímero similar a las células COS-7 y NSO sometidas a transfección, se purificaron células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) a partir de 500 ml de sangre humana sobre un gradiente de Ficoli. Las células B, las células T CD8+, los monocitos, y las células NK se destruyeron usando 100 \mul de fluido ascítico que contiene anti-CD19, anti-CD8, anti-CD14, y 25 \mug de anticuerpo monoclonal NKH1 (Coulter, Hialeah, FL). Después de 30 minutos de incubación a 4ºC, las PBMC se lavaron dos veces en RPMI que contiene 10% de suero de ternero fetal (FCS). Perlas paramagnéticas revestidas con anticuerpos de cabra se añadieron a IgG de ratón (Dynabeads M450, Dynal, Oslo, Noruega) a una concentración final de 5 perlas/célula a ser destruida. Las células no queridas se separaron posteriormente al hacerlas pasar 3 veces sobre un imán. Las células restantes eran células CD4+ de 87% de pureza las cuales se diluyeron a 10^{7} células/ml en DMEM F12 (Gibco, Gaithersburg, MD) que contiene 10% de FCS, 10 ng/ml de PMA (Sigma, St Louis, MO) y 500 ng/ml de ionomicina (Sigma, St Louis, MO). Después de la incubación durante 4 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}, el medio se cambió a DMEM libre de metionina y cisteína (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), suplementado con 1% de FCS dializado, 10 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina, y se incubó durante 1 hora a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se añadió 100 \muCi/ml de ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína (Amersham), y el marcaje metabólico se realizó durante 18 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después del preaclarado de los materiales sobrenadantes con anti-IFN-g Mab B27 y 0,5 ml de Proteína G-Sepharose (Sigma St. Louis, MO), los materiales sobrenadantes se inmunoprecipitaron usando anticuerpos monoclonales para la CTLA-8 humana. Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron sobre SDS-PAGE. Las células T CD4+ y las células NSO sometidas a transfección revelan dos bandas a 28.000 y 33.000 daltons lo que corresponde a dímeros de CTLA-8 humana. Por lo tanto, la CTLA-8 humana obtenida a partir de las células NSO sometidas a transfección y la CTLA-8 aislada a partir de células T presentan las mismas características biológicas.

IV. Producción en gran escala de CTLA-8 humana

Para los ensayos biológicos, se produjeron CTLA-8 humana y CTLA-8-FLAG humana en grandes cantidades con células COS-7 sometidas a transfección crecidas en un medio RPMI suplementado con 1% de Nutridoma HU (Boeringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y posteriormente se purificaron.

Con el fin de producir cantidades más elevadas de la CTLA-8 humana original o de la CTLA-8-FLAG humana, se prepararon transformantes estables de las células NSO de acuerdo con la metodología desarrollada por Celltech (Slough, Berkshire, UK; Las Solicitudes de Patente Internacional WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89/01036, y WO 89/10404. Tanto la CTLA-8 como la CTLA-8-FLAG se sub-clonaron en pEE12 y posteriormente se sometieron a transfección en células NSO mediante electroporación. Las células NSO sometidas a transfección se sembraron en DMEM libre de glutamina selectivo suplementado con 10% de suero de ternero fetal según se describe en el protocolo de Celltech. Los materiales sobrenadantes de las mejores líneas de producción se usaron en ensayos biológicos y en la purificación de la CTLA-8 humana y la CTLA-8-FLAG humana.

Purificación de la proteína CTLA-8 humana

Típicamente, 1 litro de material sobrenadante que contiene CTLA-8 ó CTLA-8-FLAG humanas se hizo pasar sobre una columna de 60 ml de iones Zn^{++} injertados a una matriz de quelación de flujo rápido de Sepharose (Pharmacia, Upsalla, Suecia). Después de lavar con 10 volúmenes de disolución tampón de unión (HisBind Buffer kit; Novagen, Madison, WI), las proteínas retenidas por los iones metálicos se eluyeron con un gradiente de 20-100 mM de imidazol. El contenido en CTLA-8-FLAG humana en las fracciones eluidas se determinó mediante el análisis de mancha puntual usando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT), mientras que el contenido en CTLA-8 humana se evaluó mediante la tinción con plata de SDS-PAGE no reductor. Las fracciones que contienen la CTLA-8 se mezclaron a continuación y se dializaron frente a PBS, y se usaron bien en ensayos biológicos o se purificaron posteriormente mediante HPLC de cambio de anión sobre una columna de DEAE (dietil aminoetilo).

Preparación de anticuerpos específicos para la CTLA-8

Ratones balb/c consanguíneos se inmunizaron por vía intraperitoneal con 1 ml de CTLA-8-FLAG humana purificada emulsificada en coadyuvante completo de Freund en el día 0, y en el coadyuvante incompleto de Freund en los días 15 y 22. Los ratones se potenciaron con 0,5 ml de CTLA-8 humana purificada administrada por vía intravenosa.

Se crearon hibridomas usando las líneas celulares de mieloma no segregante SP2/0-Ag8 y polietilen glicol 1000 (Sigma, St Louis, MO) como el agente de fusión. Las células de hibridoma se colocaron en una placa de cultivo celular Falcon de 96 pocillos (Becton Dickinson, NJ) y se alimentaron con DMEM F12 (Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado con 80 \mug/ml de gentamicina, 2 mM de glutamina, 10% de suero de caballo (Gibco, Gaithersburg, MD), 1% de ADCM (CRTS, Lyon, Francia), azaserina 10^{-5} M (Sigma, St. Louis, MO) e hipoxantina 5 x 10^{-5} M. Los materiales sobrenadantes de hibridoma se evaluaron para la producción de anticuerpos frente a la CTLA-8 humana mediante inmunocitoquímica (ICC) usando células COS-7 sometidas a transfección con CTLA-8 humana fijadas con acetona y mediante ELISA usando CTLA-8-FLAG purificada a partir de materiales sobrenadantes de COS-7 como un antígeno de revestimiento. Partes alícuotas de clones de células positivos se expandieron durante 6 días y se preservaron criogénicamente así como también propagados en ascitis a partir de pristano (2,6,10,14-tetra-metil-pentadecano, Sigma, St. Louis, MO) y se trataron en ratones Balb/c que habían recibido una inyección intraperitoneal de pristano 15 días antes. Aproximadamente 10^{5} células de hibridoma en 1 ml de PBS se proporcionaron por vía intraperitoneal, y 10 días más tarde, se colectaron ascitis de cada ratón.

Después de la centrifugación de los ascitis, la fracción de anticuerpo se aisló mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de cambio de anión sobre una columna de Zephir-D silicio (IBF Sepracor) equilibrada con 20 mM de tampón Tris de pH 8,0. Se eluyeron las proteínas con un gradiente de NaCl (en el intervalo desde NaCl 0 a 1 M). Se recogieron fracciones de 2 ml y se ensayaron mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpos de anti-CTLA-8. Las fracciones que contienen actividad anti-CTLA-8 específica se mezclaron, se dializaron, y se congelaron. Partes alícuotas de los anticuerpos monoclonales purificados se marcaron con peroxidasa.

Cuantificación de la CTLA-8 humana

Entre los anticuerpos específicos para la CTLA-8, se seleccionaron Ab25 y Ab16 marcados con peroxidasa para cuantificar los niveles de CTLA-8 humana usando un ensayo tipo emparedado. El Ab25 purificado se diluyó a 2 \mug/ml en disolución tampón de revestimiento (disolución tampón de carbonato, pH 9,6, 15 mM de Na_{2}CO_{3}, y 35 mM de NaHCO_{3}). Esta disolución diluida se revistió sobre las paredes de una placa ELISA de 96 pocillos (Immunoplate Maxisorp F96 certificado, NUNC, Dinamarca) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron manualmente una con una disolución tampón de lavado que consiste en Disolución Salina Tamponada con Fosfato y 0,05% de Tween 20 (Technicon Diagnositics, USA). Se añadió a cada pocillo 110 \mul de CTLA-8 humana purificada diluida en disolución tampón TBS-B-T [20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 1% de BSA (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de Tween 20]. Después de 3 horas de incubación a 37ºC, las placas se lavaron una vez. Se añadió a cada pocillo 100 \mul de Ab16 marcado con peroxidasa diluida a 5 \mug/ml en disolución tampón de TBS-B-T, y se incubó durante 2 horas a 37ºC. A continuación los pocillos se lavaron tres veces en disolución tampón de lavado. Se añadió a cada pocillo 100 \mul de substrato de peroxidasa, 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazoin-6 sulfónico) (ABTS), se diluyó a 1 mg/ml en disolución tampón de citrato/fosfato, y la reacción colorimétrica se leyó a 405 nm. La concentración más baja de CTLA-8 humana detectada era de 0,015 ng/ml.

V. Aislamiento de homólogos de CTLA-8

La composición de unión se usa para evaluar una biblioteca de expresión preparada a partir de una línea celular que expresa una proteína CTLA-8. Se usan técnicas estándar para detectar o clasificar el antígeno expresado intracelular o en superficie, o las células transformadas que se expresan en superficie se evalúan mediante encuadramiento. La evaluación de la expresión intracelular se efectúa mediante diversos procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Véase también McMahan y colaboradores (1991) EMBO J., 10:2821-2832.

Por ejemplo, en el día 0, revestir previamente portaobjetos de permanox en 2 cámaras con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar una vez con PBS. A continuación colocar en placa células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de cultivo. Incubar durante la noche a 37ºC.

En el día 1 para cada muestra, preparar 0,5 ml de una disolución de 66 mg/ml de DEAE-dextrano, 66 mM de cloroquina, y 4 mg de DNA en DME libre de suero. Para cada conjunto, se prepara un control positivo, por ejemplo de huIl-10-FLAG cDNA a dilución 1 y 1/200, y un falso negativo. Enjuagar las células con DME libre de suero. Añadir la disolución de DNA e incubar 5 horas a 37ºC. Separar el medio y añadir 0,5 ml de 10% de DMSO en DME durante 2,5 minutos. Separar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento e incubar durante la
noche.

En el día 2, cambiar el medio. En los días 3 ó 4, las células se fijan y se tiñen. Enjuagar las células dos veces con Disolución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y se fijan en 4% de paraformaldehído (PFA)/glucosa durante 5 minutos. Lavar tres veces con HBSS. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80ºC después de que se ha separado todo el líquido. Para cada cámara, se efectúan incubaciones de 0,5 ml como sigue. Añadir HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de NaN_{3} 1 M durante 20 minutos. A continuación las células se lavan con HBSS/saponina 1 vez. Se añade anticuerpo soluble a las células y se incuban durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir el segundo anticuerpo, por ejemplo, el anticuerpo vector anti-ratón, a dilución de 1/200, y se incuban durante 30 minutos. Preparar la disolución de ELISA, por ejemplo disolución de peroxidasa de raíz de rábano rusticano Vector Elite ABC, y preincubar durante 30 minutos. Usar, por ejemplo, 1 gota de disolución A (avidina) y 1 gota de disolución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir disolución ABC HRP e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS, el segundo lavado durante 2 minutos, lo que cierra las células. A continuación añadir el vector de ácido diamino-benzoico (DAB) durante 5 a 10 minutos. Usar 2 gotas de disolución tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada en alambique de vidrio. Separar cuidadosamente la cámara y enjuagar el portaobjetos en agua. Secar al aire durante unos pocos minutos, y a continuación añadir 1 gota de Crystal Mount y una tapa de deslizamiento. Calentar en horno durante 5 minutos a 85-90ºC.

Alternativamente, las composiciones de unión se usan para purificar o clasificar por afinidad las células que expresan el antígeno. Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores o Ausebel y colaboradores.

Métodos similares son aplicables para aislar bien especies o variantes alélicas. Las variantes de especies se aislan usando técnicas de hibridación cruzada de especies basadas en el uso de un aislamiento o fragmento de longitud total de unas especies como una sonda.

Actividad biológica de la CTLA-8 humana

Se aislaron sinoviocitos de pacientes de artritis reumatoide que experimentaron una sinovectomía. Las líneas celulares principales se establecieron de acuerdo con el procedimiento descrito por Dechanet y colaboradores (1993) J. Immunol, 151:4908-4917. Los sinoviocitos, al paso de 3 a 8, se sembraron en 10^{4} células/pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se añadió CTLA-8 a los pocillos y se incubó durante 48 horas. A continuación se recogieron los materiales sobrenadantes y bien se ensayaron inmediatamente, o se congelaron. Todas las muestras se ensayaron por triplicado mediante ELISA. Los estuches de ELISA para IL-6, IL-8, y GM-CSF procedían de Medgenix (Fleurus, Belgica). Los estuches de ELISA para MIP-1a y TGFb procedían de R & D Systems (Minneapolis, MN). Se midieron los niveles de prostaglandina E2 (PGE2) mediante un estuche RIA (New England Nuclear, Boston, MA).

La CTLA-8 humana original y la CTLA-8-FLAG purificadas producidas mediante bien células COS-7 o NSO sometidas a transfección indujeron significativamente la secreción de IL-6 de los sinoviocitos reumatoides de diferentes pacientes. Similarmente, la CTLA-8 humana original purificada procedente de células NSO estimuló la secreción de IL-8 y PGE2 de los sinoviocitos reumatoides.

Los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-8 se ensayaron para determinar su capacidad para bloquear la actividad biológica de la CTLA-8 humana. Se incubó 1 ng/ml de CTLA-8 humana con 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-8 antes de la adición de los sinoviocitos. La mayor parte de los anticuerpos monoclonales eran capaces de bloquear parcial o totalmente la secreción de IL-6 de los sinoviocitos. Similarmente, la CTLA-8 humana indujo la secreción de IL-8 y la PEG2 era también inhibida por los anticuerpos monoclonales anti-CTLA. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la CTLA-8 actúa como una citocina proinflamatoria que induce a las células de fibroblastos a secretar un mediador inflamatorio, por ejemplo, IL-6, IL-8, o PGE2.

En el listado de secuencias mostrado más adelante, SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ácidos nucleicos cDNA de la CTLA-8 del ratón. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de un péptido de CTLA-8 del ratón. SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ácidos nucleicos de un virus herpes ORF13. SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos predicha de un herpes virus ORF13. SEQ ID NO: 5 es una secuencia de ácido nucleico cDNA de exón de CTLA humana. SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos predicha de exón de CTLA-8 humana. SEQ ID NO: 7 es una secuencia de cDNA de longitud total de CTLA-8 humana. SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos predicha de CTLA-8 humana que contiene una secuencia señal en el N terminal. SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos biológicamente activos y maduros predichos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Schering Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

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(C)

CIUDAD: Kenilworth

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: New Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: U.S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 07033-0530

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELEFÁX: 908-298-5388

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEX: 219165

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: INSERM

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 101 rue de Tolbiac

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: París

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 75654

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFÁX:

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TELEX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTÍGENOS DE CTLA-8 DE PRIMATE PURIFICADA Y REACTIVOS RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

FORMA LEIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Apple Macintosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.0

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: Microdoft Word 5.1ª

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/250.846

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 DE MAYO DE 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/177.747

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 DE ENERO DE 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/077.203

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 DE JUNIO DE 1993

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(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1080 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 12..464

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

\newpage

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(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 aminoácidos

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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3

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(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 456 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..453

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 151 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..240

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 79 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 510 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 43..507

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 132 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

Claims (16)

1. Un ácido nucleico que codifica una proteína CTLA-8 de primate, que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de SEQ ID NO: 7.

3. Una proteína CTLA-8 de primate sustancialmente pura que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

4. Una composición que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8
ó 9.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo está marcado.

8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo bloquea una secreción inducida por CTLA-8 de un mediador inflamatorio.

9. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho mediador inflamatorio es IL6; IL-8; o
PGE2.

10. Un método in vitro de modular la fisiología o el desarrollo de una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

11. Un método in vitro de modular la secreción inducida por CTLA-8 de un mediador inflamatorio de una célula en un tejido, que comprende la etapa de poner en contacto dicho tejido con:

a) un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9; o

b) una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho mediador inflamatorio es IL-6; IL-8; o
PGE2.

13. Un estuche (kit) que comprende:

a) un ácido nucleico al menos un 95% idéntico a uno que codifica una proteína CTLA-8 de primate, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9; o

b) una proteína CTLA-8 de primate sustancialmente pura, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 ó 9; o

c) un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8
ó 9.

14. El estuche de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho ácido nucleico codificante comprende una secuencia de SEQ ID NO: 7.

15. El estuche de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en:

a) una proteína obtenida a partir de un ser humano;

b) una proteína que comprende al menos un segmento de polipéptido de SEQ ID NO: 8 ó 9; y

c) una proteína que exhibe un patrón de modificación post-translacional diferente de una proteína CTLA-8 de primate natural.

\newpage

16. El estuche de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende un anticuerpo, en el que:

a) dicha proteína CTLA-8 se obtiene a partir de un ser humano;

b) dicho anticuerpo se genera frente a una secuencia de péptidos de SEQ ID NO: 8 ó 9;

c) dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o

d) dicho anticuerpo está marcado.