ES2333694T3 - Citoquinas de mamiferos relacionados con la interleuquina-17.polinucleotido que las codifican y sus instalaciones. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el polipéptido IL-174 maduro comprendido en el SEQ ID NO: 14.
Description
Citoquinas de mamíferos relacionadas con la
interleuquina-17. Polinucleótido que las codifican y
sus utilizaciones.
La presente invención se refiere a composiciones
relacionadas con proteínas que funcionan en el control de la
fisiología, el desarrollo, y la diferenciación de células de
mamíferos, p. ej., células de un sistema inmunitario de mamífero.
En particular, proporciona ácidos nucleicos y proteínas que regulan
la fisiología, el desarrollo, la diferenciación, o la función
celular de diferentes tipos de células, incluyendo las células
hematopoyéticas.
El sistema inmunitario de los vertebrados
consiste en numerosos órganos y varios tipos de células diferentes.
Dos tipos de células principales incluyen los linajes mieloide y
linfoide. En el linaje de células linfoides se encuentran las
células B, que se caracterizaron originalmente por diferenciarse en
hígado fetal o médula ósea adulta, y las células T, que se
caracterizaron originalmente por diferenciarse en el timo. Véase, p.
ej., Paul (ed. 1998) Fundamental Immunology (4ª ed.) Raven Press,
Nueva York.
En muchos aspectos del desarrollo de una
respuesta inmunitaria o una diferenciación celular, las proteínas
solubles conocidas como citoquinas juegan un papel crítico en la
regulación de las interacciones celulares. Estas citoquinas median
aparentemente las actividades celulares de muchas maneras. Se ha
demostrado, en muchos casos, que modulan la proliferación, el
crecimiento, y la diferenciación de células pluripotenciales
hematopoyéticas en un enorme número de progenitores que componen
los linajes responsables de una respuesta inmunitaria.
No obstante, las moléculas celulares que son
expresadas por las diferentes fases evolutivas de las células en
estas rutas de maduración todavía no se han identificado
completamente. Por otra parte, los papeles y los mecanismos de
acción de las moléculas de señalización que inducen, sostienen, o
modulan los diferentes estados fisiológicos, evolutivos, o
proliferativos de estas células son escasamente conocidos.
Claramente, el sistema inmunitario y su respuesta a diferentes
estreses tienen relevancia en medicina, p. ej., enfermedades
infecciosas, respuestas y tratamientos relacionados con el cáncer,
respuestas alérgicas y de rechazo a transplantes. Véase, p. ej.,
Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine
McGraw/Hill, Nueva York.
La ciencia médica cuenta, en gran medida, con el
reclutamiento o la supresión apropiados del sistema inmunitario al
efectuar curas para respuestas fisiológicas insuficientes o
impropias a factores medioambientales. Sin embargo, la falta de
conocimiento sobre cómo se regula o se diferencia el sistema
inmunitario ha bloqueado la capacidad de modular ventajosamente los
mecanismos defensivos normales a sensibilizaciones biológicas. Las
condiciones médicas caracterizadas por una regulación anómala o
inapropiada del desarrollo o la fisiología de células relevantes
siguen siendo de este modo incontrolables. El descubrimiento y la
caracterización de citoquinas específicas contribuirán al
desarrollo de terapias para una amplia gama de condiciones
degenerativas u otras condiciones que afectan al sistema
inmunitario, a las células hematopoyéticas, así como a otros tipos
de células. La presente invención proporciona soluciones para
algunos de estos y muchos otros problemas.
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de clones de ADNc que codifican diferentes proteínas
de tipo citoquina que muestran una similitud de secuencia
significativa con la citoquina denominada
CTLA-8.
La invención abarca genes aislados que codifican
la proteína IL-174 de la invención, variantes de la
proteína codificada, p. ej., mutaciones (muteínas) de las
secuencias naturales, variante de especies y alélicas, proteínas de
fusión, mímeticos químicos, y otros análogos estructurales y
funcionales. También se describe diversos usos de estos diferentes
ácidos nucleicos o composiciones de proteínas.
En ciertas realizaciones de ácidos nucleicos, la
invención proporciona un polinucleótido aislado o recombinante que
comprende la secuencia de una IL-174 de mamífero,
que: codifica al menos 16 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 14;
o comprende uno o más segmentos de al menos 33 nucleótidos contiguos
del SEQ ID NO: 13. Otras realizaciones incluyen semejante
polinucleótido en un vector de expresión, que comprende una
secuencia que: codifica al menos 16 aminoácidos contiguos del SEQ
ID NO: 14 o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos del SEQ ID
NO: 13. Ciertas realizaciones incluirán aquellos polinucleótidos que
codifican al menos 16 restos aminoácido contiguos del SEQ ID NO:
14; comprenden al menos 33 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 13;
o comprende la porción codificante madura completa del SEQ ID NO:
13.
Se proporcionan diferentes métodos, p. ej.,
elaboración de: a) un polipéptido que comprende expresar el vector
de expresión descrito, produciendo de ese modo el polipéptido; b) un
ácido nucleico dúplex que comprende poner en contacto un
polinucleótido descrito con un ácido nucleico complementario, dando
como resultado de ese modo la producción del ácido nucleico dúplex;
o c) un polinucleótido descrito que comprende amplificar utilizando
un método de PCR.
También se describe en la presente memoria un
polinucleótido aislado o recombinante que hibrida en condiciones de
lavado restrictivas de al menos 55ºC y una concentración de sal de
menos de 400 mM con el polinucleótido (IL-174)
descrito que consiste en la porción codificante del SEQ ID NO: 13.
Tales polinucleótidos descritos incluyen los polinucleótidos en los
que las condiciones de lavado son de al menos 65ºC y una
concentración de sal de menos de 300 mM. En otras realizaciones, se
proporcionan polinucleótidos que comprenden al menos 50 nucleótidos
contiguos del SEQ ID NO: 13 (IL-174).
Se describen ciertos kits, p. ej., que
comprenden un polinucleótido descrito, y: a) instrucciones para el
uso del polinucleótido para la detección; b) instrucciones para
deshacerse del polinucleótido u otros reactivos del kit; o c) tanto
a como b.
También se proporcionan diferentes células, p.
ej., una célula que contiene el vector de expresión descrito, donde
la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una
célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto;
una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate;
o una célula humana.
Las realizaciones de polipéptidos incluyen, p.
ej., un polipéptido IL-174 antigénico aislado o
recombinante que comprende al menos un segmento de 16 aminoácidos
contiguos idénticos del SEQ ID NO: 14. Otras realizaciones incluyen
un polipéptido descrito, donde el polipéptido
IL-174: a) comprende el SEQ ID NO: 14 maduro; b) se
une selectivamente a un anticuerpo policlonal generado contra un
inmunógeno del SEQ ID NO: 14 maduro; c) comprende una pluralidad de
segmentos polipeptídicos distintos de 16 aminoácidos contiguos del
SEQ ID NO: 14; d) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o
e) muestra al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos
para el SEQ ID NO: 14 maduro. Otras realizaciones diferentes
incluyen semejante polipéptido descrito, que: a) es una composición
estéril; b) no está glicosilado; c) está desnaturalizado; d) es un
polipéptido sintético; e) está anclado a un sustrato sólido; o f)
es una proteína de fusión con una etiqueta de detección o
purificación.
También se proporcionan los métodos de
utilización de los polipéptidos descritos, p. ej.,: a) para marcar
el polipéptido, que comprenden marcar el polipéptido con una marca
radiactiva; b) para separar el polipéptido de otro polipéptido en
una mezcla, que comprende hacer circular la mezcla en una matriz de
cromatografía, separando de ese modo los polipéptidos; c) para
identificar un compuesto que se une selectivamente al polipéptido,
que comprende incubar el compuesto con el polipéptido en condiciones
apropiadas; haciendo de ese modo que el compuesto se una al
polipéptido; o d) para conjugar el polipéptido a una matriz, que
comprende transformar el polipéptido con un agente reactivo, y
conjugar el polipéptido con la matriz.
También se describen anticuerpos, incluyendo un
compuesto de unión que comprende una porción de unión al antígeno
de un anticuerpo que se une selectivamente con semejante polipéptido
descrito, donde el polipéptido IL-174 comprende el
SEQ ID NO: 14. El compuesto de unión puede ser un anticuerpo
policlonal que se origina contra el polipéptido
IL-174 del SEQ ID NO: 14. Otros aspectos incluyen
semejante compuesto de unión descrito, donde: a) el anticuerpo: i)
es inmunoseleccionado; ii) se une a una proteína desnaturalizada; o
iii) muestra una Kd para el polipéptido de al menos 30 mM; o b) el
compuesto de unión: i) está anclado a un sustrato sólido,
incluyendo una cuenta o una membrana de plástico; ii) está en una
composición estéril; o iii) está marcado detectablemente,
incluyendo una marca radiactiva o fluorescente.
Se describen métodos, p. ej., que producen un
complejo antígeno:anticuerpo, que comprenden poner en contacto un
polipéptido que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 14 con un
compuesto de unión descrito en condiciones que permiten que se
forme el complejo. Preferiblemente, el compuesto de unión es un
anticuerpo, y el polipéptido es una muestra biológica.
Se describen kits, p. ej., que comprenden un
compuesto de unión descrito y: a) un polipéptido de SEQ ID NO: 14;
b) instrucciones para el uso del compuesto de unión para la
detección; o c) instrucciones para deshacerse del compuesto de
unión u otros reactivos del kit.
Y se describe un método de evaluación de la
selectividad de unión de un anticuerpo a una proteína del SEQ ID
NO: 14, que comprende poner en contacto un anticuerpo descrito para
la proteína y para otra citoquina; y comparar la unión del
anticuerpo a la proteína y a la citoquina.
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En la presente memoria se proporcionan
secuencias de ADN que codifican diferentes proteínas de mamífero que
muestran rasgos estructurales característicos de citoquinas,
concretamente relacionadas con la citoquina denominada
CTLA-8 (también referida como
IL-17). Se han descrito las formas de rata, ratón,
ser humano y un homólogo viral de la CTLA-8 y sus
secuencias están disponibles en GenBank. Véanse Rouvier, et
al. (1993) J. Immunol. 150:5445-5456; Yao,
et al. (1995) Immunity 3:811-821; Yao, et
al. (1995) J. Immunol. 155:5483-5486; y Kennedy,
et al. (1996) J. Interferon and Cytokine Res.
16:611-617. La CTLA-8 tiene
actividades implicadas en la artritis, el rechazo de injerto de
riñón, la tumorigenicidad, las interacciones
virus-anfitrión, y la inmunidad innata; y parece
mostrar ciertas funciones reguladoras similares a
IL-6. Véanse PubMed (búsqueda para
IL-17); Chabaud, et al. (1998) J. Immunol.
63:139-148; Amin, et al. (1998) Curr. Opin.
Rheumatol. 10:263-268; Van Kooten, et al.
(1998) J. Am. Soc. Nephrol. 9:1526-1534; Fossiez,
et al. (1998) Int. Rev. Immunol. 16:541-551;
Knappe, et al. (1998) J. Virol.
72:5797-5801; Seow (1998) Vet. Immuno. Immunopathol.
63:139-48; y Teunissen, et al. (1998) J.
Invest. Dermatol. 111:645-649. Un informe sobre la
señalización a través de la transcripción del factor de
transcripción NF\kappaB insinúa una ruta de señalización que se
utiliza en la inmunidad innata. Shalom-Barak, et
al. (1998) J. Biol. Chem.
273:27467-27473.
273:27467-27473.
Las secuencias de ADNc presentadas recientemente
muestran diferentes rasgos que son característicos de los ARNm que
codifican citoquinas, factores de crecimiento, y oncogenes. Debido a
que la IL-17 es el primer miembro de esta familia
de citoquinas reconocida recientemente relacionadas con
TGF-\beta, los autores de la presente solicitud
han denominado a la familia IL-170, con los nuevos
miembros IL-172, IL-173,
IL-174, IL-176,
IL-177; e IL-171 e
IL-175. En el documento WO 99/61617 se describen
polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen homología con
IL-174 e IL-173. En el documento WO
99/60127 se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido
que tiene homología con IL-172. Se pronostica que el
plegamiento para esta familia es el de la familia de citoquinas del
TGF-\beta. La familia de citoquinas
TGF-\beta, y la familia IL-170
comparten el rasgo común de un motivo nudo de cistina,
caracterizado por un espaciamiento concreto de restos cisteína.
Véanse, p. ej., Sun y Davies (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomolec.
Struct. 24:269-291; McDonald, et al. (1993)
Cell 73:421-424; e Isaacs (1995) Curr. Op. Struct.
Biol. 5:391-395. En particular, las estructuras
sugieren numerosas cisteínas conservadas, que corresponden a, y se
numeran, en la IL-172 humana (SEQ ID NO: 2), como
cisteínas en 101, 103, 143, 156, y 158. La primera cisteína
corresponde a la posición de la Tabla 7 de la
IL-172 humana (SEQ ID NO: 2) val19. La cuarta
cisteína corresponde a la de la IL-172 de ratón (SEQ
ID NO: 4) cys141; a la IL-173 humana (SEQ ID NO: 6)
cys119; a la IL-174 de ratón (SEQ ID NO: 16) cys104;
y a la IL-171 humana (SEQ ID NO: 21) cys50. Los
enlaces disulfuro deben estar en las cisteínas 2 con 5; y 3 con 6; y
1 con 4. La trascendencia funcional de la similitud de plegamiento
sugiere la formación de dímeros para la familia
IL-170. Como consecuencia, los dímeros de
IL-170 reunirían dos receptores de la superficie
celular, a través de los cuales se produciría una transducción de
la señal.
Estas nuevas proteínas se denominan proteínas
relacionadas con CTLA-8, o generalmente
IL-70. Las proteínas naturales deben ser capaces de
mediar diferentes respuestas fisiológicas que conducirían a
respuestas biológicas o fisiológicas en células diana, p. ej.,
aquellas respuestas características de la señalización de
citoquinas. Los estudios iniciales habían localizado el mensaje que
codificaba esta proteína para diferentes líneas celulares de
células hematopoyéticas. Los genes que codifican el antígeno
CTLA-8 original (IL-17) han sido
mapeados para el cromosoma 1A de ratón y el cromosoma 2q31 humano.
El CTLA-8 murino fue clonado originalmente por
Rouvier, et al. (1993) J. Immunol.
150:5445-5456. La IL-173 humana ha
sido mapeada para el cromosoma 13q11. También deberían estar
disponibles secuencias similares para proteínas de otras especies de
mamíferos.
El CTLA-8 purificado, cuando es
cultivado con sinoviocitos, es capaz de inducir la secreción de
IL-6 a partir de estas células. Esta inducción es
revertida tras la adición de un anticuerpo neutralizador originado
contra CTLA-8 humano. Las células endoteliales,
epiteliales, fibroblásticas y de carcinoma también muestran
respuesta al tratamiento con CTLA-8. Estos datos
sugieren que CTLA-8 puede estar implicado en la
fibrosis inflamatoria, p. ej., psoriasis, esclerodermia, fibrosis
pulmonar, o cirrosis. El CTLA-8 también puede
ocasionar la proliferación de carcinomas u otras células cancerosas
dado que IL-6 a menudo actúa como un factor de
crecimiento para tales células. Como tales, es probable que los
otros miembros de la familia relacionados recientemente descubiertos
tengan actividades biológicas similares o relacionadas.
Las siguientes descripciones están dirigidas,
con fines ilustrativos, a proteínas IL-174 murinas o
humanas, pero también son aplicables a realizaciones relacionadas
de otras especies.
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Las Tablas 1-6 describen las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de diferentes secuencias de
los nuevos miembros de la familia de IL-170. Las
secuencias de nucleótido descritas y los reactivos relacionados son
útiles en la construcción de clones de ADN útiles para ampliar los
clones en ambas direcciones para la determinación de la secuencia
completa o limítrofe, que expresan los polipéptidos
IL-170, o, p. ej., aislar un gen homólogo de otra
fuente natural. Típicamente, las secuencias serán útiles en el
aislamiento de otros genes, p. ej., variantes alélicas, de ratón, y
se aplicarán procedimientos similares para aislar genes de otras
especies, p. ej., animales de sangre caliente, tales como aves y
mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de genes
de otras especies. Estarán disponibles numerosos enfoques diferentes
para aislar satisfactoriamente un ácido nucleico adecuado de otras
fuentes.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los segmentos particularmente interesantes
incluyen, p. ej., aquellos que comienzan o terminan con gln1; val19;
pro20; pro22; lys34; pro35; leu78; ser79; glu98; ala99; phe110;
thr111; cys143; o arg144.
\newpage
Secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido IL-172 de roedor, p. ej., ratón y
secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden utilizar
secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Se
indica el sitio de escisión señal pronosticado, pero puede haber
unos pocos restos a cada lado; sitio de glicosilación supuesto en
los restos 53-55. SEQ ID NO: 3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los segmentos particularmente interesantes
incluyen, p. ej., aquellos que empiezan o terminan por arg1; ala17;
pro18; pro20; his21; lys32; pro33; leu76; ser77; glu96; ala97;
phe108; thr109; cys141; o arg142.
\newpage
Secuencia de nucleótidos complementaria que
codifica un polipéptido IL-173 de primate, p. ej.,
humano y secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden
utilizar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos
fines. SEQ ID NO: 7 y 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los motivos pronosticados importantes incluyen,
p. ej., AMPc PK en 50-53, 66-69,
72-75, y 113-116; Ca Phos en
82-84 y 166-168; sitios miristoílo
en 57-61 y 164-166; sitios de
fosforilación en 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113, y 116.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido IL-173 de roedor, p. ej., rata, y
secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden utilizar
secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEQ
ID NO: 9 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Secuencia de nucleótidos suplementaria que
codifica un polipéptido IL-173 de roedor, p. ej.,
ratón, y secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden
utilizar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos
fines. SEQ ID NO: 11 y 12.
Los motivos pronosticados importantes incluyen,
p. ej., sitios AMPc PK en 50-53,
66-69, 72-75, y
113-116; sitios de fosforilación Ca en
82-84, 159-161, y
166-168; sitios miristoilo en 57-61
y 101-105; sitios N-glicosilo en
51-53 y 164-166; sitios de
fosforilación en 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113, y 116; y sitios de
fosforilación PKC en 4-6.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Los motivos pronosticados importantes incluyen,
p. ej., sitios AMPc PK en 21-24,
53-56, y 95-98; sitios de
fosforilación Ca en 15-17, 16-18, y
45-47; sitios miristoilo en 12-16,
115-119, y 118-122; sitios
N-glicosilo en 104-107; sitios de
fosforilación en 21, 23, 43, 53, 56, 95, 98, y 131; sitios de
fosforilación PKC en 41-43 y
119-121; y sitios tirosina quinasa en
95-102.
\newpage
Secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido IL-174 de roedor, p. ej., ratón, y
secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden utilizar
secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEQ
ID NO: 15 y 16.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Secuencia de nucleótidos suplementaria que
codifica un polipéptido IL-174 de roedor, p. ej.,
ratón, y secuencia de aminoácidos pronosticada. También se pueden
utilizar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos
fines. SEQ ID NO: 17 y 18.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los motivos pronosticados importantes incluyen,
p. ej., sitios AMPc PK en 29-32 y
61-64; sitios de fosforilación Ca en
18-20, 53-55, y
67-69; sitios miristoilo en 123-127;
sitios de N-glicosilación en
112-114; y sitios de fosforilación en 29, 31, 51,
53, 61, 64, 139, y 141; y sitios de fosforilación PKC en
2-4, 49-51, y
127-129.
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SEQ ID NO: 20 y 21 son secuencias de ADNc y
polipéptidos traducibles por PATENTIN
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Secuencia de nucleótidos suplementaria que
codifica IL-171 de primate, p. ej., humano. También
se pueden utilizar secuencias de ácido nucleico para muchos fines.
SEQ ID NO: 22 y 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 25 y 26 son secuencias de ADNc y
polipéptidos traducibles por PATENTIN. Se indica el sitio de
escisión de la señal pronosticado, pero puede tener unos pocos
restos a cada lado; sitio de glicosilación supuesto en los restos
53-55:
Los segmentos particularmente interesantes
incluyen, p. ej., aquellos que empiezan o terminan por arg1; cys17;
pro18, pro19; va120; thr49; ser50; arg69; pro70; y el final de la
secuencia disponible.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de nucleótidos que codifica
IL-177 de primate, p. ej., humano. También se pueden
utilizar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos
fines. SEQ ID NO: 29 y 30
\vskip1.000000\baselineskip
Los segmentos particularmente interesantes
incluyen, p. ej., aquellos correspondientes a los segmentos de
IL-172 o IL-175, indicados antes,
con los otros miembros de la familia.
Las proteínas o polipéptidos purificados son
útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales,
como se ha descrito antes. Los péptidos sintéticos o proteínas
purificadas pueden ser presentados a un sistema inmunitario para
generar una composición de unión específica, p. ej., anticuerpos
monoclonales o policlonales. Véanse, p. ej., Coligan (1991) Current
Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989)
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press.
Por ejemplo, se podría utilizar la composición
de unión específica para el escrutinio de un genoteca de expresión
elaborada a partir de una línea celular que expresa una proteína
IL-174. El escrutinio puede ser mediante tinción
convencional de la proteína expresada en la superficie, o mediante
selección repetitiva. El escrutinio de la expresión intracelular
también se puede realizar mediante diferentes procedimientos de
tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían
ser utilizadas para purificar o clasificar por afinidad células que
expresan la proteína.
Esta invención contempla el uso de ADN o
fragmentos para codificar una proteína o polipéptido
IL-174 correspondiente biológicamente activos.
Además, esta invención abarca ADN aislado o recombinante que
codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo y que es
capaz de hibridar en condiciones apropiadas con las secuencias de
ADN de IL-174 descritas en la presente memoria.
Dicha proteína o polipéptido biológicamente activos pueden ser un
antígeno intacto, o un fragmento, y tener una secuencia de
aminoácidos descrita en la Tabla 3. El ADN aislado puede tener las
respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', p. ej.,
promotores, intensificadores, señales de adición
poli-A, y otras.
Un ácido nucleico "aislado" es un ácido
nucleico, p. ej., un ARN, ADN, o una mezcla polimérica, que se
separa esencialmente de otros componentes que acompañan
naturalmente a la secuencia nativa, p. ej., ribosomas, polimerasas,
y secuencias genómicas adyacentes de la especie original. El término
abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido separado de su
entorno natural, e incluye productos aislados de ADN recombinante o
clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos
sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula
esencialmente pura incluye formas aisladas de la molécula.
Alternativamente, una especie purificada puede ser separada de los
componentes del anfitrión de un sistema de expresión recombinante.
El tamaño de homología de semejante ácido nucleico será típicamente
menor que los vectores grandes, p. ej., menor de decenas de kB,
típicamente menor que varios kB, y preferiblemente en el intervalo
de 2-6 kB.
Un ácido nucleico aislado será generalmente una
composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones,
tendrá menor heterogeneidad. Esta heterogeneidad se encuentra
típicamente en los extremos del polímero o en porciones no críticas
para una función o actividad biológica deseada.
Un ácido nucleico "recombinante" está
definido por su método de producción o por su estructura. En
referencia a su método de producción, p. ej., un producto elaborado
mediante un procedimiento, el procedimiento consiste en la
utilización de técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, que
implican p. ej., la intervención humana en la secuencia de
nucleótidos, típicamente selección o producción. Alternativamente,
puede ser un ácido nucleico elaborado generando una secuencia que
comprende la fusión de dos fragmentos que no son contiguos entre sí
naturalmente, pero se pretende excluir productos de la naturaleza,
p. ej., mutantes de origen natural. De este modo, por ejemplo, se
incluyen los productos elaborados transformando células con
cualquier vector de origen no natural, como los ácidos nucleicos
que comprenden secuencias obtenidas utilizando cualquier
procedimiento oligonucleotídico sintético. Esto se realiza a menudo
para remplazar un codón por un codón redundante que codifica el
mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, mientras se introduce
o se elimina típicamente un sitio de reconocimiento de una
secuencia. Alternativamente, eso se realiza para reunir segmentos de
ácido nucleico de funciones deseadas para generar una única entidad
genética que comprende una combinación deseada de funciones que no
se encuentran en las formas naturales asequibles comúnmente. Los
sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción son a menudo
la diana de tales manipulaciones artificiales, pero también se
pueden incorporar por medio del diseño otras dianas específicas del
sitio, p. ej., promotores, sitios de replicación del ADN,
secuencias de regulación, secuencias de control, u otros rasgos
útiles. Se pretende un concepto similar para un polipéptido
recombinante, p. ej., de fusión. Se incluyen específicamente los
ácidos nucleicos sintéticos que, por la redundancia del código
genético, codifican polipéptidos similares a fragmentos de estos
antígenos, y fusiones de secuencias de diversas variantes de
especies diferentes.
Un fragmento "significativo" en un contexto
de ácidos nucleicos es un segmento contiguo de al menos
aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente al menos 20
nucleótidos, más generalmente al menos 23 nucleótidos, normalmente
al menos 26 nucleótidos, más normalmente al menos 29 nucleótidos, a
menudo al menos 32 nucleótidos, más a menudo al menos 35
nucleótidos, típicamente al menos 38 nucleótidos, más típicamente al
menos 41 nucleótidos, normalmente al menos 44 nucleótidos, más
normalmente al menos 47 nucleótidos, preferiblemente al menos 50
nucleótidos, más preferiblemente al menos 53 nucleótidos, y en
realizaciones particularmente preferidas serán al menos 56 o más
nucleótidos. Dichos fragmentos pueden tener extremos en cualquier
localización, pero especialmente en los límites entre los dominios
estructurales.
En otras realizaciones, la invención proporciona
polinucleótidos (o polipéptidos) que comprenden una pluralidad de
segmentos distintos, p. ej., no solapantes, de la longitud
especificada. Típicamente, la pluralidad será de al menos dos, más
normalmente al menos tres, y preferiblemente 5, 7, o incluso más. Si
bien se proporcionan las longitudes mínimas, pueden ser apropiadas
longitudes más largas, de diferentes tamaños, p. ej., uno de
longitud 7, y dos de longitud 12.
Un ADN que codifica una proteína
IL-174 resultará particularmente útil para
identificar especies de genes, ARNm, y ADNc que codifican proteínas
relacionadas u homólogas, así como ADN que codifican proteínas
homólogas de diferentes especies. Probablemente hay homólogos en
otras especies, incluyendo primates. Las diferentes proteínas
CTLA-8 deben ser homólogas y están incluidas en la
presente memoria. Sin embargo, incluso las proteínas que tienen una
relación evolutiva más distante con el antígeno pueden ser
fácilmente aisladas en condiciones apropiadas utilizando estas
secuencias si son suficientemente homólogas. Las proteínas
CTLA-8 de primate son particularmente
interesantes.
En la presente memoria también se describen
moléculas de ADN recombinante y fragmentos que tienen una secuencia
de ADN idéntica o altamente homóloga a los ADN de
IL-174 aislados mostrados en la presente memoria. En
particular, las secuencias a menudo estarán conectadas
operablemente a segmentos de ADN que controlan la transcripción, la
traducción, y la replicación de ADN. Alternativamente, los clones
recombinantes derivados de las secuencias genómicas, p. ej., que
contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos,
incluyendo, p. ej., células y organismo transgénicos, y para la
terapia génica. Véanse, p. ej., Goodnow (1992) "Transgenic
Animals" en Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic
Press, San Diego, págs. 1502-1504; Travis (1992)
Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991)
Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science
244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem
Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; Rosenberg (1992) J.
Clinical Oncology 10:180-199; y Cournoyer y Caskey
(1993) Ann. Rev. Immunol. 11:297-329.
Las secuencias de ácido nucleico homólogas,
cuando se comparan, muestran una similitud significativa. Los
patrones para la homología de los ácidos nucleicos son medidas para
la homología utilizadas generalmente en la técnica mediante
comparación de secuencias o se basan en las condiciones de
hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con mayor
detalle más abajo.
La homología sustancial en el contexto de la
comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que, o bien
sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando
se alinean óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos
apropiadas, en al menos aproximadamente 50% de los nucleótidos,
generalmente al menos 56%, más generalmente al menos 59%,
normalmente al menos 62%, más normalmente al menos 65%, a menudo al
menos 68%, más a menudo al menos 71%, típicamente al menos 74%, más
típicamente al menos 77%, normalmente al menos 80%, más normalmente
al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos
aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente
95 a 98% o más, y en realizaciones concretas, tan elevada como
aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente,
existe homología sustancial cuando los segmentos hibridan en
condiciones de hibridación selectivas, con una hebra, o su
complemento, típicamente utilizando una secuencia derivada de la
Tabla 2, 3, o 6. Típicamente, la hibridación selectiva se producirá
cuando haya una homología de al menos aproximadamente 55% a lo
largo de un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente al menos aproximadamente 65%, más preferiblemente al
menos aproximadamente 75%, y muy preferiblemente al menos
aproximadamente 90%. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res.
12:203-213. La longitud de la comparación de
homología, como se ha descrito, puede realizarse sobre tramos más
largos, y en ciertas realizaciones se realizará sobre un tramo de
al menos aproximadamente 17 nucleótidos, normalmente al menos
aproximadamente 20 nucleótidos, más normalmente al menos
aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente
28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 40
nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50
nucleótidos, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75 a 100
nucleótidos o más.
Las condiciones restrictivas, en referencia a la
homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones
combinadas restrictivas de sal, temperatura, disolventes orgánicos,
y otros parámetros, típicamente aquéllos controlados en las
reacciones de hibridación. Las condiciones de temperatura
restrictivas incluirán normalmente temperaturas de más de
aproximadamente 30ºC, más normalmente de más de aproximadamente
37ºC, típicamente de más de aproximadamente 45ºC, más típicamente
de más de aproximadamente 55ºC, preferiblemente de más de
aproximadamente 65ºC, y más preferiblemente de más de
aproximadamente 70ºC. Las condiciones restrictivas de sal serán
normalmente de menos de aproximadamente 1000 mM, normalmente menos
de aproximadamente 500 mM, más normalmente menos de aproximadamente
400 mM, típicamente menos de aproximadamente 300 mM, preferiblemente
menos de aproximadamente 200 mM, y más preferiblemente menos de
aproximadamente 150 mM. No obstante, la combinación de parámetros
es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro
individual. Véase, p. ej., Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol.
31:349-370. La hibridación en condiciones
restrictivas debe producir un fondo de al menos
2-veces por encima del fondo, preferiblemente al
menos 3-5 o más.
Alternativamente, para la comparación de
secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de
referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando
se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen
las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se
designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y
se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias.
El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el
porcentaje de identidad de la secuencia para la secuencia o las
secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia,
basándose en los parámetros del programa designado.
El alineamiento óptico de secuencias para la
comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante algoritmo de
homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482,
mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y
Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por el
método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos
algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA del Paquete de Soporte
Lógico Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente
Ausubel, et al., supra).
Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP
crea un alineamiento de secuencias múltiple a partir de un grupo de
secuencias relacionadas utilizando alineamientos por pares,
progresivos para mostrar la relación y el porcentaje de identidad
de secuencia. También traza un árbol o dendrograma que muestra las
relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento.
PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento
progresivo de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol.
35:351-360. El método utilizado es similar al método
descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS
5:151-153. El programa puede alinear hasta 300
secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o
aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con
el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares,
produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este
agrupamiento se alinea después a la siguiente secuencia más afín o
agrupamiento de secuencias alineadas. Dos agrupamientos de
secuencias se alinean por medio de una simple prolongación del
alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El
alineamiento final se logra mediante una serie de alineamientos por
pares, progresivos. El programa se hace funcionar diseñando
secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o
nucleótidos para las regiones de comparación de la secuencia y
designando los parámetros del programa. Por ejemplo, se puede
comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo
para determinar la relación del porcentaje de identidad de la
secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso del espacio
por defecto (3,00), peso de la longitud del espacio por defecto
(0,10), y espacios de los extremos pesados.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y la
similitud de la secuencia es el algoritmo BLAST, que es descrito por
Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-410. El soporte lógico para realizar
análisis BLAST se encuentra disponible al público por medio del
Centro nacional para Información Biotecnológica
(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar
primero los pares de secuencia de elevada puntuación (HSP)
identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia
problema, que se emparejan o satisfacen alguna puntuación del umbral
de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma
longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el
umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul, et al.,
supra). Estos aciertos de la palabra vecina inicial actúan
como siembras para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más
largos que los contienen. Los aciertos de palabras se prolongan
después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia siempre y
cuando se pueda incrementar la puntuación de alineamiento
cumulativa. La prolongación de los aciertos de la palabra en cada
dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento
cumulativa cae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado;
la puntuación cumulativa llega a cero o menos, debido a la
acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación
negativa; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias.
Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la
sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST
utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de
alineamiento BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, una esperanza (E)
de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.
Además de calcular el porcentaje de identidad de
la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej.,
Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
90:5873-5787). Una medida de la similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma
más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad por la cual un emparejamiento entre dos secuencias de
nucleótidos o aminoácidos podría aparecer por casualidad. Por
ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una
secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña es
una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico
de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente
menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de
aproximadamente 0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias
de ácido nucleico de polipéptidos son sustancialmente idénticas es
que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta
reacción inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el
segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. De este modo, un
polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo
polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren
solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que
dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es
que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas,
como se describe más abajo.
Se pueden clonar las proteínas de tipo
CTLA-8 de otras especies de mamíferos y aislarlas
mediante hibridación de especies cruzadas de especies íntimamente
relacionadas, p. ej., ser humano, como se describe en las Tablas
1-7. La homología puede ser relativamente baja entre
especies lejanamente relacionadas, y de este modo es aconsejable la
hibridación de especies relativamente íntimamente relacionadas.
Alternativamente, puede ser útil la elaboración de una preparación
de anticuerpo que muestre menor especificidad de especie en enfoques
de clonación de la expresión.
La secuencia pronosticada del polipéptido
IL-173 de primate, p. ej., ser humano, y roedor, p.
ej., ratón, se muestran en la Tabla 2. De un modo similar, en la
Tabla 3, se proporciona la secuencia de IL-174 de
primate, p. ej., ser humano, y se le asigna el SEQ ID NO: 14.
También se describe en la Tabla 3 una IL-174 de
roedor, p. ej., murino. Las secuencias peptídicas permiten la
preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer
tales segmentos.
Según se utilizan en la presente memoria, los
términos "proteína IL-174 de primate" y
"proteína IL-174 de roedor" abarcarán, cuando
se utilicen en un contexto de proteínas, una proteína que tiene
secuencias de aminoácidos designadas mostradas en la Tabla 3, o un
fragmento significativo de semejante proteína. También hace
referencia a un polipéptido obtenido de primate o roedor que
muestra una función biológica similar o interacciona con los
componentes de unión específica de la proteína
IL-174. Estos componentes de unión, p. ej.,
anticuerpos, se unen típicamente a una proteína
IL-174 con elevada afinidad, p. ej., al menos
aproximadamente 100 nM, normalmente más de aproximadamente 30 nM,
preferiblemente más de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente
más de aproximadamente 3 nM. Las proteínas homólogas se
encontrarían en especies de mamífero distintas de ratas o seres
humanos, p. ej., ratón, primate, y en el genoma del virus del
herpes, p. ej., ORF13. Las especies diferentes de mamíferos también
tendrían genes y proteínas estructuralmente y funcionalmente
relacionados.
El término "polipéptido" según se utiliza
en la presente memoria incluye un fragmento significativo o
segmento, y abarca un tramo de restos aminoácido de al menos
aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos 10
aminoácidos, más generalmente al menos 12 aminoácidos, a menudo al
menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos 16 aminoácidos,
típicamente al menos 18 aminoácidos, más típicamente al menos 20
aminoácidos, normalmente al menos 22 aminoácidos, más normalmente
al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26 aminoácidos,
más preferiblemente al menos 28 aminoácidos, y, en realizaciones
particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más
aminoácidos. Los extremos específicos de semejante segmento estarán
en cualquier combinación dentro de la proteína, abarcando
preferiblemente dominios estructurales.
El término "composición de unión" hace
referencia a moléculas que se unen con especificidad a la proteína
IL-174, p. ej., de una manera de tipo
ligando-receptor, una interacción
anticuerpo-antígeno, o compuestos, p. ej.,
proteínas que se asocian específicamente con la proteína
IL-174, p. ej., en una interacción
proteína-proteína fisiológicamente relevante
natural, ya sea covalente o no covalente. La molécula puede ser un
polímero, o un reactivo químico. No existe implicación en cuanto a
si la proteína IL-174 es el ligando o el receptor de
una interacción ligando receptor aparte de que la interacción
muestre una especificidad similar, p. ej., una afinidad específica.
Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones
estructurales, o puede ser una molécula no relacionada en absoluto,
p. ej., que tenga una conformación molecular que interaccione con
los determinantes de unión apropiados. Las proteínas pueden servir
como agonistas o antagonistas de un receptor, véase, p. ej.,
Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's: The
Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.), Pergamon
Press.
La solubilidad de un polipéptido o un fragmento
depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a
la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, el
entorno electrolítico, el tamaño y las características moleculares
del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la
temperatura a la cual se utiliza el polipéptido oscila de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Normalmente la
temperatura de uso es mayor de aproximadamente 18ºC y más
normalmente mayor de aproximadamente 22ºC. Con fines diagnósticos,
la temperatura será normalmente aproximadamente la temperatura
ambiente o más caliente, pero menor de la temperatura de
desnaturalización de los componentes del análisis. Con fines
terapéuticos, la temperatura será normalmente la temperatura
corporal, típicamente aproximadamente 37ºC para seres humanos,
aunque en ciertas situaciones la temperatura se puede elevar o
disminuir in situ o in vitro.
Los electrolitos se aproximarán normalmente a
las condiciones fisiológicas in situ, pero pueden ser
modificados hacia una fuerza iónica superior o inferior cuando
resulte ventajoso. Los mismos iones pueden ser modificados, p. ej.,
para ajustarse a tampones convencionales utilizados en contextos
fisiológicos o analíticos.
El tamaño y la estructura del polipéptido deben
estar generalmente en un estado esencialmente estable, y normalmente
no en estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado
con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, p. ej., para
conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes de manera
que se aproxime a las interacciones de la bicapa lipídica
natural.
El disolvente será normalmente un tampón
biológicamente compatible, de un tipo utilizado para la conservación
de las actividades biológicas, y normalmente se aproximará a un
disolvente fisiológico. Normalmente el disolvente tendrá un pH
neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente
aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirá un
detergente, típicamente uno no desnaturalizante suave, p. ej., CHS o
CHAPS, o una concentración suficiente baja como para evitar la
desorganización significativa de las propiedades estructurales o
fisiológicas del antígeno.
La solubilidad se refleja por la sedimentación
medida en unidades Svedberg, que son una medida de la velocidad de
sedimentación de una molécula en condiciones concretas. La
determinación de la velocidad de sedimentación se realizaba
clásicamente en una ultracentrífuga analítica, pero ahora se realiza
típicamente en una ultracentrífuga convencional. Véanse, Freifelder
(1982) Physical Biochemistry (2ª ed.), W.H. Freeman; y Cantor y
Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes 1-3,
W.H. Freeman & Co., San Francisco. Como determinación grosera,
se centrifuga una muestra que contiene un polipéptido supuestamente
soluble en una ultracentrífuga grande convencional a
aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las
moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o
polipéptido soluble tendrá típicamente menos de aproximadamente 30S,
más típicamente menos de aproximadamente 15S, normalmente menos de
aproximadamente 10S, más normalmente menos de aproximadamente 6S,
y, en realizaciones concretas, preferiblemente menos de
aproximadamente 4S, y más preferiblemente menos de aproximadamente
3S.
Se puede obtener ADN que codifica la proteína
IL-174 o sus fragmentos mediante síntesis química,
escrutinio de genotecas de ADNc, o escrutinio de genotecas
genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas
celulares o muestras de tejido.
Este ADN puede ser expresado en una amplia
variedad de células anfitrionas para la síntesis de una proteína
completa o fragmentos que, a su vez, puedan ser utilizados por
ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para
estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas
modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada antígeno o
sus fragmentos pueden ser expresados en células anfitrionas que son
transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados.
Estas moléculas pueden ser purificadas esencialmente para que estén
libres de proteína o contaminantes celulares, aparte de los
derivados del anfitrión recombinante, y por lo tanto son
particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se
combinan con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El antígeno, o sus porciones, pueden ser expresados en forma de
fusiones con otras proteínas.
Los vectores de expresión son típicamente
constructos de ADN o ARN auto-replicantes que
contienen el gen del antígeno deseado o sus fragmentos, normalmente
conectado operablemente a elementos de control genético adecuados
que son reconocidos en una célula anfitriona adecuada. Estos
elementos de control son capaces de llevar a cabo la expresión en
un anfitrión adecuado. El tipo específico de elementos de control
necesarios para llevar a cabo la expresión dependerá de la célula
anfitriona eventual utilizada. Generalmente, los elementos de
control genético pueden incluir un sistema promotor eucariótico o
un sistema de control de la expresión de un promotor eucariótico, y
típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador
opcional para controlar el comienzo de la transcripción,
intensificadores de la transcripción para elevar el nivel de
expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión al
ribosoma adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y
traducción. Los vectores de expresión también contienen normalmente
un origen de replicación, que permite que el vector replique
independientemente de la célula anfitriona. Los métodos para
amplificar el número de copias del vector también son conocidos,
véase, p. ej., Kaufman, et al. (1985) Molec. and Cell. Biol.
5:1750-1759.
Los vectores de esta invención contienen ADN que
codifica una proteína IL-174, o uno de sus
fragmentos, que codifica típicamente un polipéptido biológicamente
activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y
puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla
adicionalmente el uso de tales vectores de expresión que son
capaces de expresar ADNc eucariótico que codifica una proteína
IL-174 en un anfitrión procariótico o eucariótico,
donde el vector es compatible con el anfitrión y donde el ADNc
eucariótico que codifica el antígeno es insertado en el vector de
manera que el crecimiento del anfitrión que contiene el vector
expresa el ADNc en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión
se diseñan para una replicación estable en sus células anfitrionas
o para la amplificación para aumentar enormemente el número total de
copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario
requerir que un vector de expresión replique en una célula
anfitriona, p. ej., es posible llevar a cabo la expresión
transitoria del antígeno o sus fragmentos en diferentes anfitriones
utilizando vectores que no contienen un origen de replicación que es
reconocido por la célula anfitriona. También es posible utilizar
vectores que ocasionan la integración de un gen de la proteína
IL-174 o sus fragmentos en el ADN del anfitrión
mediante recombinación, o integrar un promotor que controla la
expresión de un gen endógeno.
Vectores, según se utiliza en la presente
memoria, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de
ADN integrables, y otros vehículos que permiten la integración de
fragmentos de ADN en el genoma del anfitrión. Los vectores de
expresión son vectores especializados que contienen elementos de
control genético que llevan a cabo la expresión de genes conectados
operablemente. Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente
utilizada pero todas las demás formas de vectores que sirven para
una función equivalente y que son, o se vuelven, conocidos en la
técnica son adecuados para su uso en la presente memoria. Véanse, p.
ej., Pouwels, et al. (1985 y Supplements) Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., y Rodriquez, et al. (eds.
1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,
Buttersworth, Boston, MA.
Las células transformadas incluyen células,
preferiblemente de mamífero, que han sido transformadas o
transfectadas con vectores que contienen un gen
IL-174, construidos típicamente utilizando técnicas
de ADN recombinante. Las células anfitrionas transformadas expresan
normalmente el antígeno o sus fragmentos, pero para clonar,
amplificar, y manipular su ADN, no es necesario que expresen la
proteína. Esta invención contempla adicionalmente cultivar las
células transformadas en un medio nutriente, permitiendo de este
modo que la proteína se acumule en el cultivo. La proteína puede
ser recuperada, o bien del cultivo o bien del medio de cultivo.
Para los fines de esta invención, las secuencias
de ADN se conectan operablemente cuando están funcionalmente
relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para una
pre-secuencia o un líder secretor está conectado
operablemente a un polipéptido si éste es expresado como
pre-proteína o participa dirigiendo el polipéptido a
la membrana celular o secretando el polipéptido. Un promotor está
conectado operablemente a una secuencia codificante si controla la
transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma está
conectado operablemente a una secuencia codificante si está situado
para permitir la traducción. Normalmente, conectado operablemente
significa contiguo y en el marco de lectura, no obstante, ciertos
elementos genéticos tales como los genes represores no están
conectados de forma contigua, pero sin embargo se unen a secuencias
operadoras que a su vez controlan la expresión.
Las células anfitrionas adecuadas incluyen
procariotas, eucariotas inferiores, y eucariotas superiores. Los
procariotas incluyen organismos tanto gram negativos como gram
positivos, p. ej., E. coli y B. subtilis. Los
eucariotas inferiores incluyen levaduras, p. ej., S.
cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los
eucariotas superiores incluyen líneas celulares de cultivos de
tejidos establecidas de células animales, tanto de origen distinto
de mamífero, p. ej., células de insecto, y aves, como de origen
mamífero, p. ej., ser humano, primates, y roedores.
Los sistemas anfitrión
procariótico-vector incluyen una amplia variedad de
vectores para muchas especies diferentes. Según se utilizan en la
presente memoria, E. coli y sus vectores se emplearán
genéricamente para incluir vectores equivalentes utilizados en
otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es
pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden
utilizar para expresar la proteína IL-174 o sus
fragmentos incluyen, pero no están limitados a, vectores tales como
los que contienen el promotor lac (series pUC); el promotor trp
(pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los
promotores pP o pR de lambda (pOTS); o promotores híbridos tales
como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988)
"Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and
Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt
(eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their
Uses, Buttersworth, Boston, Capítulo 10, págs.
205-236.
Los eucariotas inferiores, p. ej., levaduras y
Dictyostelium, pueden ser transformados con vectores que codifican
las proteínas IL-174. Para los fines de esta
invención, el anfitrión eucariótico inferior más común es la
levadura panadera, Saccharomyces cerevisiae. Esta se
utilizará genéricamente para representar eucariotas inferiores
aunque también se encuentran disponibles otras numerosas cepas y
especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un
origen de replicación (salvo en el tipo integrante), un gen de
selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus
fragmentos, y secuencias para la terminación de la transcripción,
poliadenilación, y terminación de la transcripción. Los vectores de
expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos
tales como el de la 3-fosfoglicerato quinasa y otros
promotores diferentes de genes de enzimas glicolíticas o promotores
inducibles tales como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o
el promotor de la metalotioneína. Los vectores adecuados incluyen
derivados de los siguientes tipos: auto-integrantes
de bajo número de copias (tales como la serie YRp),
auto-replicantes de elevado número de copias (tales
como la serie YEp); los tipos integrantes (tales como la serie
YIp), o mini-cromosomas (tales como la serie
YCp).
Las células de cultivos de tejidos eucarióticos
superiores son las células anfitrionas preferidas para la expresión
de la proteína IL-174 funcionalmente activa. En
principio, son factibles muchas líneas celulares de cultivos de
tejidos eucarióticos superiores, p. ej., sistemas de expresión de
baculovirus en insectos, ya sean de origen invertebrado o
vertebrado. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero,
debido al procesamiento co-traduccional y
post-traduccional. La transformación o la
transfección y la propagación de tales células se ha convertido en
un procedimiento rutinario. Los ejemplos de las líneas celulares
útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster
Chino (CHO), líneas celulares de riñón de cría de rata (BRK),
líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas
celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para tales
líneas celulares incluyen normalmente un origen de replicación, un
promotor, un sitio de inicio de la traducción, sitios de empalme de
ARN (si se utiliza ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un
sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también
contienen normalmente un gen de selección o un gen de
amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser
plásmidos, virus, o retrovirus que portan promotores derivados, p.
ej., de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus
vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de los
vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase
Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol.
5:1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase
Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; y un
vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610, véase O'Reilly,
et al. (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory
Manual Freeman and Co., CRC Press, Boca Raton, Fla.
A menudo se deseará expresar un polipéptido de
la proteína IL-174 en un sistema que proporcione un
patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el
patrón usual será aquél proporcionado naturalmente por el sistema
de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el
polipéptido, p. ej., una forma no glicosilada, a proteínas
glicosiladoras apropiadas introducidas en un sistema de expresión
heterólogo. Por ejemplo, el gen de la proteína
IL-174 puede ser co-transformado con
uno o más genes que codifican enzimas glicosiladoras de mamífero u
otras. Utilizando este enfoque, serán alcanzables ciertos patrones
de glicosilación de mamíferos o aproximados en células procariotas
u otras.
La proteína IL-174, o uno de sus
fragmentos, puede ser diseñada para que tenga fosfatidilinositol
(PI) unido a una membrana celular, pero pueda ser separado de las
membranas mediante tratamiento con una enzima de escisión de
fosfatidilinositol, p. ej., fosfatidilinositol
fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en una forma
biológicamente activa, y permite la purificación mediante
procedimientos convencionales de la química de las proteínas. Véase,
p. ej., Low (1989) Biochim. Biophys. Acta
988:427-454; Tse, et al. (1985) Science
230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991) J.
Cell Biol. 114:1275-1283.
Ahora que la proteína IL-174 ha
sido caracterizada, se pueden preparar fragmentos o sus derivados
mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos.
Estos incluyen procedimientos tales como los descritos por Stewart
y Young (1984) en Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical
Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of
Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y
Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag, Nueva York. Por ejemplo, se puede
utilizar un procedimiento con azida, un procedimiento con cloruro
de ácido, un procedimiento con un anhídrido ácido, un procedimiento
con un anhídrido mixto, un procedimiento con un éster activo (por
ejemplo, éster p-nitrofenílico, éster de
N-hidroxisuccinimida, o éster de cianometilo), un
procedimiento con carbodiimidazol, un procedimiento
oxidativo-reductivo, o un procedimiento con
diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida
y en fase de disolución son aplicables a los procedimientos
anteriores.
La proteína IL-174, los
fragmentos, o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los
procedimientos anteriores empleados típicamente en la síntesis de
péptidos, generalmente mediante lo que se denomina un procedimiento
por etapas que comprende condensar un aminoácido al aminoácido
terminal, uno por uno en la secuencia, o acoplando fragmentos
peptídicos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no están
siendo utilizados en la reacción de acoplamiento son protegidos
típicamente para evitar el acoplamiento en una localización
incorrecta.
Si se adopta la síntesis en fase sólida, el
aminoácido C terminal se une a un portador insoluble o soporte a
través de su grupo carboxilo. El portador insoluble no está
particularmente limitado con tal que tenga capacidad de unión a un
grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de tales portadores
insolubles incluyen resinas halometiladas, tales como resina
clorometilada o resina bromometilada, resinas hidroximetiladas,
resinas fenólicas, resinas con
t-alquiloxicarbonil-hidrazida, y
similares.
El aminoácido protegido en el grupo amino se une
a la secuencia por medio de condensación de su grupo carboxilo
activado y el grupo amino reactivo del péptido formado previamente o
la cadena, para sintetizar el péptido etapa por etapa. Después de
sintetizar la secuencia completa, el péptido es separado del
portador insoluble para producir el péptido. Este enfoque en fase
sólida es descrito generalmente por Merrifield, et al. (1963)
en J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156.
La proteína preparada y sus fragmentos se pueden
aislar y purificar de la mezcla de reacción por medio de la
separación peptídica, por ejemplo, mediante extracción,
precipitación, electroforesis y diferentes formas de cromatografía,
y similares. Las proteínas IL-174 de esta invención
se pueden obtener con diferentes grados de pureza dependiendo de su
uso deseado. La purificación se puede completar mediante el uso de
técnicas de purificación de proteínas descritas en la presente
memoria o mediante el uso de los anticuerpos de la presente memoria
descritos en la cromatografía de afinidad por inmunoabsorción. Esta
cromatografía de afinidad por inmunoabsorción se lleva a cabo
uniendo primero los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo en
contacto después los anticuerpos unidos con productos lisados
solubilizados de células de una fuente apropiada, productos lisados
de otras células que expresan la proteína, o productos lisados o
sobrenadantes de células que producen la proteína
IL-174 como resultado de las técnicas del ADN, véase
más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria también se describen
proteínas o péptidos que tienen una homología de la secuencia de
aminoácidos esencial con la secuencia de aminoácidos de la proteína
IL-174. Las variantes incluyen especies o variantes
alélicas.
La homología de la secuencia de aminoácidos, o
la identidad de la secuencia, se determinan optimizando los
emparejamientos de restos, si fuera necesario, introduciendo
espacios según se requiera. Esto cambia cuando se consideran las
sustituciones conservativas como emparejamientos. Las sustituciones
conservativas incluyen típicamente sustituciones en los siguientes
grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido
aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina,
treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Se pretende
típicamente que las secuencias de aminoácidos homólogas incluyan
variaciones alélicas naturales e interespecie en cada secuencia de
proteínas respectiva. Las proteínas homólogas típicas o péptidos
tendrán una homología de 25-100% (si se pueden
introducir espacios), a una homología de 50-100% (si
se incluyen sustituciones conservativas) con la secuencia de
aminoácidos de la proteína IL-170. Las medidas de la
homología serán de al menos aproximadamente 35%, generalmente al
menos 40%, más generalmente al menos 45%, a menudo al menos 50%, más
a menudo al menos 55%, típicamente al menos 60%, más típicamente al
menos 65%, normalmente al menos 70%, más normalmente al menos 75%,
preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 80%, y
en realizaciones particularmente preferidas, al menos 85% o más.
Véanse también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol.
48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Capítulo
Uno en Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and
Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley,
Reading, MA; y paquetes de soporte lógico de IntelliGenetics,
Mountain View, CA; y el University of Wisconsin Genetics Computer
Group, Madison, WI. El ADN aislado que codifica una proteína
IL-174 puede ser fácilmente modificado mediante
sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones
de nucleótidos, e inversión de tramos de nucleótidos. Estas
modificaciones dan como resultado secuencias de ADN novedosas que
codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen una
actividad fisiológica, inmunogénica, o antigénica similar. Estas
secuencias modificadas se pueden utilizar para producir antígenos
mutantes o para aumentar la expresión. El aumento de la expresión
puede implicar amplificación génica, aumento de la transcripción,
aumento de la traducción, y otros mecanismos. Tales derivados de la
proteína IL-174 mutante incluyen mutaciones
predeterminadas o específicas del sitio de la respectiva proteína o
sus fragmentos. "Proteína IL-174 mutante"
abarca un polipéptido que por lo demás entre dentro de la definición
por homología de la proteína IL-174 murina o
IL-174 humana como se ha mostrado antes, pero que
tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteína
IL-174 encontrada en la naturaleza, ya sea por
deleción, sustitución, o inserción. En particular, "proteína
IL-174 mutante de sitio específico" incluye
generalmente proteínas que tienen una homología significativa con
la secuencia de la Tabla 3, y que comparten diferentes actividades
biológicas, p. ej., antigénicas o inmunogénicas, con esas
secuencias, y en realizaciones preferidas contienen la mayoría de
las secuencias descritas. Se aplican conceptos similares a
diferentes proteínas IL-174, concretamente aquellas
encontradas en diferentes animales de sangre caliente, p. ej.,
mamíferos y aves. Como se ha expuesto antes, se hace hincapié en
que se pretende que las descripciones generalmente abarquen todas
las proteínas IL-174, sin limitarse a la
realización de ratón comentada específicamente.
Aunque los sitios de las mutaciones específicas
del sitio están predeterminados, no es necesario que los mutantes
sean de sitio específico. La mutagénesis de la proteína
IL-174 se puede llevar a cabo realizando inserciones
o deleciones de aminoácidos. Se pueden generar sustituciones,
deleciones, inserciones, o cualquiera de sus combinaciones para
llegar a un constructo final. Las inserciones incluyen fusiones
amino o carboxi terminales. Se puede llevar a cabo una mutagénesis
al azar en el codón diana y después se pueden escrutar los mutantes
expresados en busca de la actividad deseada. Los métodos par
realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del
ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidos en la
técnica, p. ej., mediante técnicas de mutagénesis con cebadores de
M13 o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véanse también
Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y
Suplementos).
Las mutaciones en el ADN no deben situar
normalmente secuencias codificantes fuera de los marcos de lectura
y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan
hibridar para producir una estructura secundaria de ARNm tal como
bucles u horquillas.
La presente invención también proporciona
proteínas recombinantes, p. ej., proteínas de fusión heterólogas
que utilizan segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión
heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente
no están fusionadas normalmente de la misma manera. De este modo, el
producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido
IL-174 es una molécula de proteína continua que
tiene secuencias fusionadas con un enlace peptídico típico,
elaborada típicamente como un único producto de traducción y que
muestra propiedades derivadas de cada uno de los péptidos de origen.
Se aplica un concepto similar a las secuencias de ácido nucleico
heterólogas.
Además, se pueden elaborar nuevos constructos
combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por
ejemplo, se pueden "intercambiar" segmentos de unión al
antígeno u otros segmentos entre diferentes polipéptidos de fusión
nuevos o fragmentos. Véanse, p. ej., Cunningham, et al.
(1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd, et
al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. De
este modo, nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas
combinaciones de especificidades resultarán del enlace funcional de
dominios biológicamente relevantes y de otros dominios
funcionales.
El método de la fosforamidita descrito por
Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts.
22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN
sintéticos adecuados. A menudo se obtendrá un fragmento de doble
hebra sintetizando la hebra complementaria y recociendo las hebras
juntas en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria
utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada, p.
ej., mediante técnicas de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El bloqueo de la respuesta fisiológica a las
proteínas IL-174 puede resultar de la inhibición de
la unión del antígeno a su compañero de unión natural, p. ej., a
través de la inhibición competitiva. De este modo, los análisis
in vitro de la presente invención a menudo utilizarán
proteínas aisladas, membranas de células que expresan una proteína
IL-174 asociada a la membrana recombinante,
fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión, o fragmentos
anclados a sustratos en fase sólida. Estos análisis también
permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de
mutaciones y modificaciones del segmento de unión, o de mutaciones y
modificaciones de la proteína, p. ej., análogos.
Esta invención también contempla el uso de
análisis competitivos de escrutinio de fármacos, p. ej., en los que
anticuerpos neutralizadores de antígenos o fragmentos de compañeros
de unión compiten con un compuesto de ensayo por la unión a la
proteína. De esta manera, se pueden utilizar los anticuerpos para
detectar la presencia de cualquier polipéptido que comparta uno o
más sitios de unión antigénicos de la proteína y también se pueden
utilizar para ocupar sitios de unión de la proteína que podrían
interaccionar de otro modo con un compañero de unión.
Adicionalmente, los anticuerpos neutralizadores
contra la proteína IL-174 y los fragmentos solubles
del antígeno que contienen un sitio de unión al receptor de elevada
afinidad, se pueden utilizar para inhibir la función del antígeno
en los tejidos, p. ej., tejidos que sufren una fisiología
anómala.
Los "derivados" de los antígenos
IL-174 incluyen mutantes de la secuencia de
aminoácidos, variantes de glicosilación, y productos conjugados o
agregados covalentes con otros radicales químicos. Se pueden
preparar derivados covalentes mediante unión de funcionalidades a
grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos de
IL-174 o en los extremos N o C, mediante métodos
que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden
incluir, sin limitación, ésteres alifáticos o amidas del extremo
carboxilo, o de restos que contienen cadenas laterales
carboxiladas, derivados O-acilados de restos que
contienen grupos hidroxilo, y derivados N-acilados
del aminoácido amino terminal o de restos que contienen un grupo
amino, p. ej., lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan
del grupo de radicales alquilo que incluyen alquilos C3 a C18
normales, formando de ese modo especies alcanoil aroílicas. El
anclaje covalente a proteínas portadoras puede ser importante cuando
los radicales inmunogénicos son haptenos.
En particular, se incluyen las alteraciones de
la glicosilación, p. ej., realizadas modificando los patrones de
glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento,
o en etapas de procesamiento adicionales. Los métodos
particularmente preferidos para realizar esto son la exposición del
polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que
normalmente proporcionan semejante procesamiento, p. ej., enzimas de
glicosilación de mamífero. También se contemplan enzimas de
desglicosilación. Asimismo están incluidas las versiones de la
misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras
modificaciones menores, incluyendo restos aminoácido fosforilados,
p. ej., fosfotirosina, fosfoserine, o fosfotreonina.
Un grupo principal de derivados son los
productos conjugados covalentes de la proteína
IL-174 o sus fragmentos con otras proteínas o
polipéptidos. Estos derivados pueden ser sintetizados en cultivos
recombinantes tales como fusiones N o C terminales o mediante el
uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en el
entrecruzamiento de proteínas por medio de grupos laterales
reactivos. Los sitios preferidos de derivatización de antígenos con
agentes de entrecruzamiento están en los grupos amino libres, los
radicales carbohidratados, y los restos cisteína.
También se proporcionan polipéptidos de fusión
entre las proteínas IL-174 y otras proteínas
homólogas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser
fusiones entre diferentes marcadores de superficie, dando como
resultado, p. ej., una proteína híbrida que muestra especificidad
de unión con el receptor. Del mismo modo, se pueden construir
fusiones heterólogas que mostrarían una combinación de propiedades o
actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son
las fusiones de un polipéptido informador, p. ej., luciferasa, con
un segmento o dominio de un antígeno, p. ej., un segmento de unión
al receptor, de manera que se pueda determinar fácilmente la
presencia o localización del antígeno fusionado. Véanse, p. ej.,
Dull, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.859.609.
Otros compañeros de fusión de genes incluyen
\beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A,
\beta-lactamasa, alfa amilasa, alcohol
deshidrogenasa, y feromona alfa de levadura. Véase, p. ej.,
Godowski, et al. (1988) Science
241:812-816.
El método de la fosforamidita descrito por
Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts.
22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético
adecuados. A menudo se obtendrá un fragmento de doble hebra
sintetizando la hebra complementaria y recociendo las hebras juntas
en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria
utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.
Tales polipéptidos también pueden tener restos
aminoácido que han sido modificados químicamente mediante
fosforilación, sulfonación, biotinilación, o adición o eliminación
de otros radicales, concretamente aquellos que tienen
conformaciones moleculares similares a grupos fosfato. En algunas
realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje
útiles, o servirán como dianas de purificación, p. ej., ligandos de
afinidad.
Las proteínas de fusión se elaborarán
típicamente mediante métodos de ácidos nucleicos recombinantes o
mediante métodos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la
manipulación y expresión de ácidos nucleicos son descritas
generalmente, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Vols.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Las técnicas
para la síntesis de polipéptidos son descritas, por ejemplo, por
Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156;
Merrifield (1986) Science 232: 341-347; y Atherton,
et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, IRL Press, Oxford.
Esta invención también contempla el uso de
derivados de las proteínas IL-174 diferentes de las
variaciones en las secuencias de aminoácidos o la glicosilación.
Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o
agregativa con radicales químicos. Estos derivados entran
generalmente en las tres clases: (1) sales, (2) modificaciones
covalentes de restos de la cadena lateral y terminales, y (3)
complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Tales
derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como
reactivos en inmunoanálisis, o en métodos de purificación tales
como purificación por afinidad de antígenos u otras proteínas de
unión. Por ejemplo, se puede inmovilizar un antígeno
IL-174 mediante enlace covalente con un soporte
sólido tal como bromuro de cianógeno-Sefarosa
activada, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, o
adsorbidos sobre superficies de poliolefina, con o sin
entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en el análisis o
purificación de anticuerpos anti-proteína
IL-174 o su receptor u otro compañero de unión. Los
antígenos IL-174 también pueden ser marcados con un
grupo detectable, por ejemplo radioyodado mediante el procedimiento
de la cloramina T, unidos covalentemente a quelatos de tierras
raras, o conjugados a otro radical fluorescente para su uso en
análisis de diagnóstico. La purificación de la proteína
IL-170 se puede efectuar mediante anticuerpos
inmovilizados o mediante compañeros de unión. Se puede utilizar un
antígeno IL-174 solubilizado o un fragmento de esta
invención como inmunógeno para la producción de antisueros o
anticuerpos específicos para la proteína o sus fragmentos. Se puede
utilizar el antígeno purificado para escrutar los anticuerpos
monoclonales o los fragmentos de unión preparados mediante
inmunización con diferentes formas de preparaciones impuras que
contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos"
también abarca fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos
naturales. Las proteínas IL-170 purificadas también
se pueden utilizar como reactivo para detectar cualquiera de los
anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles
elevados de la proteína o fragmentos de células que contienen el
antígeno, ambos los cuales puede servir como diagnóstico de un
estado anómalo o fisiológico específico o enfermedad.
Adicionalmente, los fragmentos de antígeno también pueden servir
como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente
invención, como se describe inmediatamente más abajo. Por ejemplo,
esta invención contempla anticuerpos originados contra secuencias
de aminoácidos codificadas por la secuencia de nucleótidos mostrada
en la Tabla 3, o fragmentos de proteínas que contienen esta
secuencia. En particular, esta invención contempla anticuerpos que
tienen afinidad de unión por o que están siendo originados contra
fragmentos específicos que se pronostica que están fuera de la
bicapa lipídica.
La presente invención contempla el aislamiento
de variantes de especies íntimamente relacionadas adicionales. El
análisis de transferencia Southern estableció que existían entidades
genéticas similares en otros mamíferos, p. ej., rata y ser humano.
Es probable que las proteínas IL-174 están
extendidas en variantes de especies, p. ej., roedores, lagomorfos,
carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos, y primates.
La invención también proporciona medios para
aislar un grupo de antígenos relacionados que presentan distinción
y similitudes en estructura, expresión, y función. La elucidación de
muchos de los efectos fisiológicos de los antígenos se acelerará
enormemente mediante aislamiento y caracterización de distintas
variantes de especies. En particular, la presente invención
proporciona sondas útiles para identificar entidades genéticas
homólogas adicionales en diferentes especies.
Los genes aislados permitirán la transformación
de células que carecen de la expresión de una proteína
IL-174 correspondiente, p. ej., cualquier tipo de
especie o célula que carezca de los correspondientes antígenos y
deba mostrar una actividad de fondo negativa. La expresión de genes
transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares
antigénicamente puras, con variantes de especie definidas o
individuales. Este enfoque permitirá una detección y una
discriminación más sensibles de los efectos fisiológicos de las
proteínas IL-174. Los fragmentos subcelulares, p.
ej., citoplastos o fragmentos de membrana, pueden ser aislados y
utilizados.
Es posible la disección de los elementos
estructurales críticos que tienen efecto sobre las diferentes
funciones fisiológicas o de diferenciación proporcionadas por las
proteínas utilizando técnicas convencionales de la biología
molecular moderna, concretamente al comparar miembros de una clase
relacionada. Véanse, p. ej., la técnica de mutagénesis mediante
barrido de homólogos descrita por Cunningham, et al. (1989)
Science 243:1339-1336; y los enfoques utilizados en
O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem.
263:15985-15992; y Lechleiter, et al. (1990)
EMBO J. 9:4381-4390.
En particular, se pueden sustituir dominios
funcionales o segmentos entre variantes de especies para determinar
qué rasgos estructurales son importantes tanto en la afinidad y
especificidad de los compañeros de unión, como en la transducción
de la señal. Se utilizará una matriz de variantes diferentes para
escrutar moléculas que muestren propiedades combinadas de
interacción con diferentes variantes de especie de compañeros de
unión.
Se puede producir la internalización del
antígeno en ciertas circunstancias, y se puede producir la
interacción entre componentes intracelulares y segmentos
"extracelulares" de las proteínas implicadas en las
interacciones. Los segmentos de interacción específicos de la
proteína IL-174 con otros componentes intracelulares
pueden ser identificados mediante mutagénesis o métodos bioquímicos
directos, p. ej., métodos de afinidad o entrecruzamiento. También
puede ser aplicable el análisis estructural mediante métodos
cristalográficos u otros medios físicos. La investigación adicional
del mecanismo de la función biológica incluirá el estudio de los
componentes asociados que pueden ser aislables mediante métodos de
afinidad o mediante medios genéticos, p. ej., análisis de
complementación de
mutantes.
mutantes.
Se perseguirá el estudio adicional de la
expresión y el control de la proteína IL-174. Los
elementos controladores asociados con los antígenos pueden mostrar
patrones de expresión evolutivos diferenciales, específicos de
tejidos, u otros. Tienen interés las regiones genéticas aguas arriba
o aguas abajo, p. ej., los elementos de control.
Los estudios estructurales del antígeno
conducirán al diseño de nuevas variantes, concretamente análogos que
muestran propiedades agonísticas o antagónicas sobre los compañeros
de unión. Esto se puede combinar con los métodos de escrutinio
descritos previamente para aislar variantes que muestran espectros
de actividades deseados.
La expresión en otros tipos de células a menudo
dará como resultado diferencias en la glicosilación en un antígeno
concreto. Las diferentes variantes de especies pueden mostrar
funciones distintas basándose en diferencias estructurales
distintas de la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones
diferenciales pueden ser responsables de funciones diferenciales, y
ahora se hace posible la elucidación de los efectos.
De este modo, la presente invención proporciona
importantes reactivos relacionados con la interacción
antígeno-compañero de unión. Aunque la descripción
anterior se ha centrado principalmente en la proteína
IL-174 murina e IL-174 humana, los
expertos en la técnica reconocerán inmediatamente que la invención
incluye otros antígenos, p. ej., de ratón y otras especies de
mamíferos o variantes alélicas, así como sus variantes.
Esta invención también contempla el uso de
proteínas IL-174, sus fragmentos, péptidos, y sus
productos de fusión en una variedad de kits de diagnóstico y
métodos para detectar la presencia de una composición de unión.
Típicamente el kit tendrá un compartimento que contenga un péptido
IL-174 definido o un segmento génico o un reactivo
que reconozcan uno u otro, p. ej., fragmentos del antígeno o
anticuerpos.
Un kit para determinar la afinidad de unión de
un compuesto de ensayo por una proteína IL-174
comprendería típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto
marcado, por ejemplo un anticuerpo que tenga una afinidad de unión
conocida por el antígeno; una fuente de proteína
IL-174 (de origen natural o recombinante); y un
medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como
una fase sólida para inmovilizar el antígeno. Una vez que los
compuestos son escrutados, se pueden evaluar aquellos que tienen
afinidad de unión adecuada por el antígeno en análisis biológicos
adecuados, como los que son bien conocidos en la técnica, para
determinar si muestran actividades biológicas similares al antígeno
natural. La disponibilidad de los polipéptidos de la proteína
IL-174 recombinante también proporciona patrones
bien definidos para calibrar tales análisis.
Un kit preferido para determinar la
concentración, por ejemplo, de una proteína IL-174
en una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, p.
ej., anticuerpo, con afinidad de unión conocida por el antígeno, una
fuente de antígeno (de origen natural o recombinante) y un medio
para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una
fase sólida para inmovilizar la proteínas IL-174.
Normalmente se proporcionarán compartimentos que contengan los
reactivos, y las instrucciones.
Un método para determinar la concentración de
proteína IL-174 en una muestra comprendería
típicamente las etapas de: (1) preparar membranas a partir de una
muestra compuesta de una fuente de proteína IL-174
unida a membrana; (2) lavar las membranas y suspenderlas en un
tampón; (3) solubilizar el antígeno incubando las membranas en un
medio de cultivo al cual se ha añadido un detergente adecuado; (4)
ajustar la concentración de detergente del antígeno solubilizado;
(5) poner en contacto e incubar dicha dilución con el anticuerpo
radiomarcado para formar complejos; (6) recuperar los complejos por
ejemplo mediante filtración a través de filtros tratados con
polietilenimina; y (7) medir la radiactividad de los complejos
recuperados.
Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de
unión al antígeno, específicos para la proteína
IL-174 o sus fragmentos son útiles en aplicaciones
de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de
proteína IL-174 y/o sus fragmentos. Tales análisis
de diagnóstico pueden emplear productos lisados, células vivas,
células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos
corporales, y adicionalmente pueden implicar la detección de
antígenos relacionados con la proteína del suero, o similar. Los
análisis de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de
separación entre el reactivo libre y el complejo
proteína-proteína) o heterogéneo (con una etapa de
separación). Existen diferentes análisis comerciales, tales como el
radioinmunoanálisis (RIA), el análisis de inmunoabsorción con
enzima ligada (ELISA), el inmunoanálisis enzimático (EIA), la
técnica de inmunoanálisis de multiplicación enzimática (EMIT),
inmunoanálisis fluorescente con sustrato marcado (SLFIA), y
similares. Por ejemplo, los anticuerpos no marcados se pueden
emplear utilizando un segundo anticuerpo que está marcado y que
reconoce el anticuerpo para una proteína IL-174 o
para un fragmento concreto de la misma. También se han debatido
ampliamente análisis similares en la literatura. Véase, p. ej.,
Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.
Los anticuerpos anti-idiotípicos
pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de
anticuerpos contra una proteína IL-174, ya que la
misma puede servir como diagnóstico de diferentes estados anómalos.
Por ejemplo, la producción en exceso de proteína
IL-174 puede dar como resultado la producción de
diferentes reacciones inmunológicas que pueden servir como
diagnóstico de estados fisiológicos anómalos, concretamente en
afecciones con células proliferativas tales como el cáncer o con una
diferenciación anómala.
Frecuentemente, los reactivos para análisis
diagnósticos se suministran en kits, con el fin de optimizar la
sensibilidad del análisis. Para la invención sujeto, dependiendo de
la naturaleza del análisis, se proporcionan el protocolo, y la
marca, anticuerpo marcado o no marcado, o proteína
IL-174 marcada. Esto junto con otros aditivos,
tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la
producción de la señal tales como sustratos para enzimas, y
similares. Preferiblemente, el kit también contendrá instrucciones
para el uso y la eliminación apropiados de los contenidos después
de su uso. Típicamente el kit tiene compartimentos para cada
reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan en forma
de un polvo liofilizado seco, donde los reactivos pueden ser
reconstituidos en un medio acuoso proporcionando concentraciones
apropiadas de reactivos para realizar el análisis.
Se puede utilizar cualquiera de los
constituyentes del escrutinio de fármacos y los análisi diagnósticos
anteriormente mencionados sin modificación o se pueden modificar de
diferentes maneras. Por ejemplo, se puede lograr el marcaje uniendo
covalentemente o no covalentemente un radical que proporciona
directamente o indirectamente una señal detectable. En cualquiera
de estos análisis, el antígeno, el compuesto de ensayo, la proteína
IL-174, o los anticuerpos para esta pueden ser
marcados directamente o indirectamente. Las posibilidades para el
marcaje directo incluyen grupos marcadores: radiomarcas tales como
I^{125}, enzimas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.645.090)
tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcas fluorescentes
(Patente de los Estados Unidos Núm. 3.940.475) capaces de controlar
el cambio en la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de
la longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Las
posibilidades para el marcaje indirecto incluyen la biotinilación
de un constituyente seguida de unión a avidina acoplada a uno de los
grupos marcadores anteriores.
También existen numerosos métodos de separación
del antígeno unido del libre, o alternativamente el compuesto de
ensayo unido del libre. La proteína IL-174 puede ser
inmovilizada sobre diferentes matrices seguido de lavado. Las
matrices adecuadas incluyen materiales plásticos tales como una
placa de ELISA, filtros y cuentas. Los métodos de inmovilización de
la proteína IL-174 a una matriz incluyen, sin
limitación, la adherencia directa al material plástico, el uso de
un anticuerpo de captura, el acoplamiento químico, y
biotina-avidina. La última etapa de este enfoque
implica la precipitación del complejo
proteína-proteína por medio de uno cualquiera de
los numerosos métodos que incluyen utilizar, p. ej., un disolvente
orgánico tal como polietilenglicol o una sal tal como sulfato de
amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin
limitación, el método de la partícula imantable con anticuerpo con
fluoresceína descrito por Rattle, et al. (1984) Clin. Chem.
30:1457-1461, y la separación de partículas
magnéticas con doble anticuerpo como se describe en la Patente de
los Estados Unidos Núm. 4.659.678.
Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos
a los diferentes marcadores han sido referidos ampliamente en la
literatura y no requieren un comentario detallado aquí. Muchas de
las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados o bien
por medio de la utilización de carbodiimida o ésteres activos para
formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante
reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como
cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para la
unión, o similar. Las proteínas de fusión también encontrarán uso
en estas aplicaciones.
Otro aspecto diagnóstico descrito en la presente
memoria implica el uso de oligonucleótidos o secuencias de
polinucleótidos tomadas de la secuencia de una proteína
IL-174. Estas secuencias se pueden utilizar como
sondas para detectar niveles de mensaje antigénico en muestras de
pacientes que se sospecha que tienen una condición anómala, p. ej.,
cáncer o un problema de desarrollo. La preparación de secuencias de
nucleótidos de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias, y el tamaño
preferido de las secuencias han recibido una amplia descripción y
discusión en la literatura. Normalmente una sonda oligonucleotídica
debe tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, normalmente al
menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas
pueden tener hasta varias kilobases. Se pueden emplear diferentes
marcadores, muy comúnmente radionúclidos, concretamente P^{32}.
Sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, tales como
las que utilizan nucleótidos modificados con biotina para la
introducción en un polinucleótido. La biotina sirve después como
sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden ser
marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como
radionúclidos, sustancias fluorescentes, enzimas, o similares.
Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden
reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de
ARN, dúplex híbridos ADN-ARN, o dúplex de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden ser
marcados y el análisis se puede llevar a cabo cuando el dúplex está
unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex
sobre la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo
unido al dúplex. El uso de sondas para el ARN
anti-sentido novedoso se puede llevar a cabo
mediante cualquiera de las técnicas convencionales tales como la
hibridación de ácido nucleico, el escrutinio más y menos, el sondeo
recombinatorio, traducción de híbrido liberado (HRT), y traducción
de híbrido detenido (HART). Esto también incluye técnicas de
amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Otro enfoque utiliza, p. ej., ácido nucleico antisentido,
incluyendo la introducción de ARN de doble hebra (ARNdh) para
interferir genéticamente en la función del gen como describen, p.
ej., Misquitta, et al. (1999) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
96:1451-1456, y/o ribozimas para bloquear la
traducción de un ARNm de IL-70 específico. El uso
de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de
genes es bien conocido en la técnica. Marcus-Sakura
(1988) Anal. Biochem. 172:289; Akhtar (ed. 1995) Delivery Strategies
for Antisense Oligonucleotide Therapeutics CRC Press, Inc.
También se contemplan los kits de diagnóstico
que también someten a ensayo la presencia cualitativa o cuantitativa
de otros marcadores. La diagnosis o la prognosis pueden depender de
la combinación de indicaciones múltiples utilizadas como
marcadores. De este modo, los kits pueden someter a ensayo
combinaciones de marcadores. Véase, p. ej., Viallet, et al.
(1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.
El amplio alcance de esta invención se comprende
mejor mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que no se
pretende que limiten la invención a realizaciones específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos de los métodos convencionales se
describen o son referidos, p. ej., en Maniatis, et al. (1982)
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols.
1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology,
Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et
al. (1987 y Supplements) Current Protocols in Molecular
Biology, Greene/Wiley, Nueva York; Innis, et al. (eds. 1990)
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press,
N.Y.; y Kohler, et al. (1995) Ouantitation of mRNA by
Polymerase Chain Reaction Springer-Verlag, Berlin.
Los métodos para la purificación de proteína incluyen métodos tales
como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en
columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización, y
otros. Véase, p. ej., Ausubel, et al. (1987 y suplementos
periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification"
en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes de esta serie;
y las publicaciones de los fabricantes sobre el uso de productos
para la purificación de proteínas, p. ej., Pharmacia, Piscataway,
N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con
técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, p.
ej., a una secuencia FLAG o un equivalente que puede ser fusionado
por medio de una secuencia separable por una proteasa. Véanse, p.
ej., Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70;
Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal
Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle
and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe,
et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression &
Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Las técnicas inmunológicas convencionales son
descritas, p. ej., por Hertzenberg, et al. (eds. 1996)
Weir's Handbook of Experimental Immunology vols.
1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current
Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology
vols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163.
Los análisis con citoquinas son descritos, p. ej., por Thomson (ed.
1998) The Cytokine Handbook (3ª ed.) Academic Press, San Diego;
Mire-Sluis y Thorpe (1998) Cytokines Academic Press,
San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colony
Stimulating Factors Cambridge University Press; y Aggarwal y
Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
Los análisis de las actividades biológicas
vasculares son bien conocidos en la técnica. Abarcarán las
actividades angiogénicas y angiostáticas en tumores, u otros
tejidos, p. ej., proliferación de la musculatura lisa arterial
(véase, p. ej., Koyoma, et al. (1996) Cell
87:1069-1078), la adherencia de monocitos al
epitelio vascular (véase, McEvoy, et al. (1997) J. Exp. Med.
185:2069-2077), etc. Véanse también Ross (1993)
Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995) Am. J.
Pathol. 147:668-677; Thyberg, et al. (1990)
Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cell
84:345-357.
Los análisis de las actividades biológicas de
las células neurales son descritos, p. ej., por Wouterlood (ed.
1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in
Neurosciences Academic Press; y Neuromethods Humana Press, Totowa,
NJ. La metodología de los sistemas evolutivos es descrita, p. ej.,
por Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental
Biology CRC. Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and
Approaches in Developmental Biology Interscience.
El análisis de secuencias computarizado se
realiza, p. ej., utilizando programas de soporte lógico disponibles,
incluyendo los de GCG (U. Wisconsin) y GenBank. También se
utilizaron las bases de datos de secuencias públicas, p. ej., de
GenBank y otros.
Se pueden aplicar muchas técnicas pertinentes a
la IL-170 a estas nuevas entidades, p. ej., en
USSN.
Los análisis FACS son descritos por Melamed,
et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988)
Practical Flow Cytometry Liss, Nueva York, NY; y Robinson, et
al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods
Wiley-Liss, Nueva York, NY.
El aislamiento de CTLA-8 murino
es descrito por Rouvier, et al. (1993) J. Immunol.
150:5445-5456. Se encuentran disponibles métodos
similares para aislar contrapartes de especies de
IL-173, IL-174,
IL-176, y IL-177, junto con
IL-171, IL-172, y
IL-175.
Las diversas líneas celulares se escrutan
utilizando una sonda apropiada para una expresión del mensaje de
alto nivel. Las líneas celulares apropiadas se seleccionan basándose
en los niveles de expresión del mensaje de IL-170
apropiado.
Se utilizan técnicas de PCR convencionales para
amplificar una secuencia génica de IL-170 de una
genoteca genómica o de ADNc, o a partir de ARNm. Se obtiene una
genoteca genómica o de ADNc humano y se escruta con una sonda de
ADNc o sintética apropiada. Se pueden preparar cebadores de PCR. Se
seleccionan los cebadores apropiados, p. ej., a partir de
secuencias proporcionadas, y se aísla un clon completo. Se pueden
preparar diferentes combinaciones de cebadores, de diferentes
longitudes y posiblemente con diferencias en la secuencia. Se puede
utilizar el clon completo como sonda de hibridación para escrutar en
busca de otros genes homólogos utilizando condiciones de
hibridación restrictivas o menos restrictivas.
En otro método, se utilizan oligonucleótidos
para escrutar una genoteca. Se utilizan como cebadores
olignucleótidos sintéticos en orientaciones apropiadas, combinados
con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
seleccionar clones correctos de una genoteca.
Se expresa una proteína IL-170
en células heterólogas, p. ej., la forma nativa o una forma
recombinante que presenta el péptido FLAG en el extremo carboxi.
Véanse, p. ej., Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High
Level Expression and Protein Purification System QIAGEN, Inc.
Chatsworth, CA; y Hopp, et al. (1988) Bio/Technology
6:1204-1210. Estas dos formas se introducen en
vectores de expresión, p. ej., pME18S o pEE12, y con posterioridad
se transfectan a células apropiadas, p. ej., células
COS-7 o NSO, respectivamente. Las células
electroporadas se cultivan, p. ej., durante 48 horas en medio RPMI
con un suplemento de Suero de Ternera Fetal al 10%. Después las
células se incuban con Met-S^{35} y
Cys-S^{35} con el fin de marcar las proteínas
celulares. La comparación de las proteínas en condiciones
reductoras sobre SDS-PAGE debe mostrar que las
células transfectadas con clones completos deben secretar un
polipéptido del tamaño apropiado, p. ej., aproximadamente 15.000
daltons. El tratamiento con endoglicosidasas demostrará si hay
formas N-glicosiladas.
Para los análisis biológicos, se produce
IL-170 de mamífero en gran cantidad, p. ej., con
células COS-7 transfectadas desarrolladas en medio
RPMI con un suplemento de Nutridoma HU al 1% (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania) y después se purifican. Para la purificación se
pueden utilizar cromatografía de afinidad empleando anticuerpos, o
técnicas de purificación de proteínas, p. ej., empleando anticuerpos
para determinar las propiedades de separación.
Con el fin de producir una gran cantidad de
proteínas nativas, se pueden preparar transformantes estables de
células NSO de acuerdo con la metodología desarrollada por Celltech
(Slough, Berkshire, UK; Solicitudes de Patente Internacionales
WO86/05807, WO87/04462, WO89/01036, y WO89/10404).
Típicamente, se hace pasar 1 litro de
sobrenadante que contiene IL-173 o
IL-173-FLAG humanas, p. ej., por
una columna de 60 ml de iones Zn^{++} injertados en una matriz de
Flujo Rápido de Sefarosa Quelante (Pharmacia, Upsalla, Suecia).
Después de lavar con 10 volúmenes de tampón de unión (Kit de Tampón
de Unión a His, Novagen, Madison, WI), las proteínas retenidas por
los iones metálicos se hacen eluir con un gradiente de Imidazol
20-100 mM. Se determina el contenido de
IL-173-FLAG humana de las fracciones
eluidas mediante transferencia puntual utilizando el anticuerpo
monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, New Haven,
CT), mientras el contenido de IL-173 humana se
evalúa, p. ej., mediante tinción con plata de
SDS-PAGE no reductora. Las fracciones que contienen
IL-170 se reúnen después y se someten a diálisis
frente a PBS, y se utilizan en análisis biológicos o se purifican
adicionalmente, p. ej., mediante HPLC de intercambio aniónico sobre
una columna de DEAE. Se puede realizar una tercera etapa de
cromatografía de filtración en gel sobre una columna SUPERDEX
G-75 HRD30 (Pharmacia Uppsala, Suecia). La
purificación se puede evaluar, p. ej., mediante
SDS-PAGE teñida con plata.
Se inmunizan ratones Balb/c endogámicos
intraperitonealmente, p. ej., con 1 ml de
IL-173-FLAG humana purificada
emulsionada en coadyuvante completo de Freund el día 0, y en
coadyuvante incompleto de Freund los días 15 y 22. Los ratones se
refuerzan con 0,5 ml de IL-173 humana purificada
administrada intravenosamente.
Se recoge el antisuero policlonal. El suero se
puede purificar de los anticuerpos. Los anticuerpos se pueden
procesar adicionalmente, p. ej., hasta fragmentos Fab, Fab2, Fv, o
similares.
Se crean hibridomas utilizando, p. ej., la línea
de células de mieloma no secretora SP2/0-Ag8 y
polietilenglicol 1000 (Sigma, St. Louis, MO) como agente de fusión.
Las células de hibridoma se colocan en una placa para el cultivo de
tejidos Falcon de 96 pocillos (Becton Dickinson, NJ) y se alimentan
con DMEM F12 (Gibco, Gaithersburg, MD) con un suplemento de 80
\mug/ml de gentamicina, glutamina 2 mM, suero de caballo al 10%
(Gibco, Gaithersburg, MD), ADCM al 1% (CRTS, Lyon, France)
azaserina 10^{-5} M (Sigma, St. Louis, MO) e hipoxantina 5 x
10^{-5} M. Los sobrenadantes de hibridoma se escrutan en busca de
la producción de anticuerpo contra IL-173 humana
mediante inmunocitoquímica (ICC) utilizando células
COS-7 transfectadas para IL-173
humana fijadas con acetona y mediante ELISA utilizando
IL-173-FLAG humana purificada a
partir de los sobrenadantes de COS-7 como antígeno
de recubrimiento. Las alícuotas de los clones celulares positivos se
expanden durante 6 días y se crioconservan y se propagan en ascitis
de ratones Balb/c tratados con pristano
(2,6,10,14-terametilpentadecano, Sigma, St. Louis,
MO) que habían recibido en inyección intraperitoneal de pristano 15
días antes. Típicamente, aproximadamente se administran
intraperitonealmente 10^{5} células de hibridoma en 1 ml de PBS, y
10 días más tarde, se recogen las ascitis de cada ratón.
Después de la centrifugación de las ascitis, se
aísla la fracción de anticuerpo mediante precipitación con sulfato
de amonio y cromatografía de intercambio aniónico en una columna de
silicio Zephyr-D (IBF Sepracor) equilibrada con
Tris 20 mM pH 8,0. Las proteínas se hacen eluir con un gradiente de
NaCl (que oscila de Na 0M a Na 1M). Se recogen fracciones de 2 ml y
se someten a ensayo mediante ELISA en busca de la presencia de
anticuerpo anti-IL-173. Las
fracciones que contienen actividad
anti-IL-173 específica se reúnen, se
someten a diálisis, y se congelan. Las alícuotas de los anticuerpos
monoclonales purificados pueden ser marcadas con peroxidasa.
Las preparaciones de anticuerpos, policlonales o
monoclonales, pueden ser absorbidas de manera cruzada, agotadas, o
combinadas para crear reactivos que muestren las combinaciones
deseadas de selectividades y especificidades. Los antígenos
específicos definidos pueden ser inmovilizados a una matriz en fase
sólida y utilizados para agotar o seleccionar selectivamente las
capacidades de unión deseadas.
Entre los anticuerpos específicos para
IL-173, se seleccionan los productos aislados
clónicos apropiados para cuantificar los niveles de
IL-173 humana utilizando un análisis sándwich. Los
anticuerpos purificados se diluyen, p. ej., a 2 \mug/ml en tampón
de recubrimiento (tampón carbonato, pH 9,6, Na_{2}CO_{3} 15 mM,
NaHCO_{3} 35 mM). Con esta solución diluida se recubren los
pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos (Immunoplate Maxisorp
F96 certificado, NUNC, Dinamarca) durante la noche a la temperatura
ambiente. Después las placas se lavan manualmente, p. ej., con un
tampón de lavado que consiste en Solución salina Tamponada con
Fosfato y Tween 20 al 0,05% (Technicon Diagnostics, EEUU). Se
añaden a cada pocillo 110 \mul de CTLA-8 humana
purificada diluida en tampón
TBS-B-T [Tris 20 mM, NaCl 150 mM,
BSA al 1% (Sigma, St. Louis, MO), y Tween 20 al 0,05%]. Después de
3 horas de incubación a 37ºC, las placas se lavan una vez. Se añaden
100 \mul de Ac marcado con peroxidasa diluido a 5 \mug/ml en
tampón TBS-B-T a cada pocillo, y se
incuban durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavan después tres
veces en tampón de lavado. Se añaden a cada pocillo 100 \mul de
sustrato de peroxidasa, ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico)
(ABTS), diluido a 1 mg/ml en tampón citrato/fosfato, y se lee la
reacción colorimétrica a 405 nm.
La IL-173 humana se identificó a
partir de la secuencia obtenida de una genoteca de ADNc de un córtex
frontal de cerebro epiléptico. La IL-173 de rata se
obtuvo de una genoteca de ADNc de cóclea, cerebro, cerebelo, ojo,
pulmón, y riñón. De nuevo, los genes parecían ser bastante raros, lo
que sugiere que las distribuciones de la expresión estarían
altamente restringidas.
Se identificó la IL-174 de ratón
a partir de la secuencia obtenida de una genoteca de ADNc obtenida
de embrión de ratón. El gen parece ser bastante raro, lo que
sugiere que la distribución de la expresión estaría altamente
restringida.
La IL-171 humana fue
identificada a partir de una secuencia obtenida de una célula T
apoptótica. El gen parece ser bastante raro, lo que sugiere que la
distribución de la expresión estaría altamente restringida.
La IL-172 humana fue
identificada a partir de secuencias de corazón, hígado y bazo, timo,
tumor del timo fetales humanos, y feto total. La de ratón se obtuvo
de secuencias obtenidas de embrión, embrión, glándula mamaria de
ratón, y órganos reunidos. Ambos genes parecen ser bastante raros,
lo que sugiere que su distribución de la expresión estaría
altamente restringida.
La IL-175 humana fue
identificada a partir de una secuencia obtenida de una célula T
activada con tiouridina durante 12 h. El gen parece ser bastante
raro, lo que sugiere que la distribución de la expresión estaría
altamente restringida.
Se utiliza un ADNc aislado que codifica el gen
de IL-170 apropiado. El mapeo cromosómico es una
técnica normalizada. Véanse, p. ej., BIOS Laboratories (New Haven,
CT) y los métodos para utilizar un panel de híbridos de células
somáticas de ratón con PCR.
El gen de IL-173 humana se
cartografía en el cromosoma 13q11 humano.
Se utiliza una composición de unión, p. ej.,
anticuerpo, para escrutar una genoteca de expresión elaborada a
partir de una línea celular que expresa una proteína
IL-170. Se utilizan técnicas de tinción
convencionales para detectar o clasificar un antígeno intracelular
o expresado en superficie, o se escrutan células transformadas de
expresión en superficie mediante selección repetitiva. Se realiza el
escrutinio de la expresión intracelular mediante diferentes
procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase también
McMahan, et al. (1991) EMBO J.
10:2821-2832.
Son aplicables métodos similares para aislar
variantes de especie o alélicas. Las variantes de especie se aíslan
utilizando técnicas de hibridación de especies cruzadas basadas en
un producto aislado completo o un fragmento de una especie como
sonda, o una especie apropiada.
Se encuentran disponibles métodos para escrutar
una genoteca de expresión elaborada a partir de una línea celular
que expresa receptores de IL-170 potenciales. Se
produce un ligando de IL-170 marcado, como se ha
descrito antes. Se utilizan técnicas de tinción convencionales para
detectar o clasificar el receptor expresado en superficie, o se
escrutan células transformadas de expresión en superficie mediante
selección repetitiva. Véase también McMahan, et al. (1991)
EMBO J. 10:2821-2832.
Por ejemplo, el día 0, recubrir previamente
portas de permanox de 2 cámaras con 1 ml de fibronectina, 10 ng/ml
en PBS, por cámara durante 30 min a la temperatura ambiente.
Enjuagar una vez con PBS. Después cultivar en placa células COS a
2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio
de crecimiento. Incubar durante la noche a 37ºC.
El día 1 de cada muestra, preparar 0,5 ml de una
solución de 66 \mug/ml de DEAE-dextrano,
cloroquina 66 \muM, y 4 \mug de ADN en DME sin suero. Para cada
grupo, se prepara un control positivo, p. ej., de ADN de
huIL-170-FLAG a una dilución de 1 y
1/200, y un negativo simulado. Enjuagar las células con DME sin
suero. Añadir la solución de ADN e incubar 5 horas a 37ºC. Separar
el medio y añadir 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 min.
Separar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de
crecimiento e incubar durante la noche.
El día 2, cambiar el medio. Los días 3 o 4, las
células se fijan y se tiñen. Enjuagar las células dos veces con
Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y fijar en paraformaldehído
al 4% (PFA)/glucosa durante 5 min. Lavar 3X con HBSS. Los portas se
pueden almacenar a -80ºC una vez que se la eliminado todo el
líquido. Para cada cámara, se balizan incubaciones de 0,5 como
sigue. Añadir HBSS/saponina (0,1%) con 32 \mul/ml de NaN_{3} 1
M durante 20 min. Después las células se lavan con HBSS/saponina 1X.
Se añade anticuerpo soluble a las células y se incuban durante 30
min. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir un
segundo anticuerpo, p. ej., anticuerpo anti-ratón
Vector, a una dilución 1/200, e incubar durante 30 minutos. Preparar
una solución ELISA, p. ej., solución de peroxidasa de rábano
picante Vector Elite ABC, y preincubar durante 30 min. Utilizar, p.
ej., 1 gota de solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina)
por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con
HBSS/saponina. Añadir la solución ABC HRP e incubar durante 30 min.
Lavar las células dos veces con HBSS, lavar por segunda vez durante
2 min, lo que cierra las células. Después añadir ácido
diaminobenzoico (DAB) Vector durante 5 a 10 min. Utilizar 2 gotas
de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml
de agua destilada en vidrio. Separar cuidadosamente la cámara y
enjuagar el porta en agua. Secar al aire unos minutos, después
añadir 1 gota de Crystal Mount y cubrir con un cubre. Cocer durante
5 min a 85-90ºC.
Alternativamente, se utiliza el ligando marcado
para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan
el receptor. Véanse, p. ej., Sambrook, et al. o Ausubel,
et al.
Se pueden realizar muchas modificaciones y
variaciones de esta invención. Las realizaciones específicas
descritas en la presente memoria se ofrecen solamente a modo de
ejemplo, y la invención se debe limitar solamente a los términos de
las reivindicaciones adjuntas.
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-172 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de polipéptido de
IL-172 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-172 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de polipéptido de
IL-172 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-173 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de polipéptido de
IL-173 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-173 de primate suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de polipéptido de
IL-173 de primate suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-173 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 10 la secuencia de polipéptido de
IL-173 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 11 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-173 murina suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 12 la secuencia de polipéptido de
IL-173 murina suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 13 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-174 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 14 es la secuencia de polipéptido de
IL-174 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 15 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-174 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 16 es la secuencia de polipéptido de
IL-174 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 17 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-174 murina suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 18 es la secuencia de polipéptido de
IL-174 murina suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 19 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-171 de primate de la IUPAC.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 20 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-171 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 21 es la secuencia de polipéptido de
IL-171 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 22 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-171 de primate suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 23 es la secuencia de polipéptido de
IL-171 de primate suplementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 24 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-175 de primate de la IUPAC.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 25 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-175 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 26 es la secuencia de polipéptido de
IL-175 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 27 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-176 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 28 es la secuencia de polipéptido de
IL-176 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 29 es la secuencia de ácido nucleico
de IL-177 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 30 es la secuencia de polipéptido de
IL-177 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 31 es la secuencia de polipéptido de
CTLA-8 de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 32 es la secuencia de polipéptido de
CTLA-8 de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 33 es la secuencia de polipéptido de
CTLA-8 de primate.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 34 es la secuencia de polipéptido de
CTLA-8 viral.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Schering Corporation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Citoquinas de mamífero Purificadas;
Reactivos y Métodos Relacionados
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DX0917K
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 09/228,822
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-01-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(540)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(540)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(540)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(540)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(453)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1385
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59)..(664)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (110)..(664)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(132)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(615)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(615)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 504
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(501)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(501)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(432)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 985
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(507)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(507)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(521)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nota= "n puede ser a, c, g, o
t"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(369)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (281)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> note= "los nucleótidos 281, 367,
437, 462, y 468 se indican como c; cada uno puede ser
alternativamente a, g, o t; el aminoácido traducido depende del
código genético"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(705)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (166)..(705)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(403)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nota= "n puede ser a, c, g, o
t"
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<400> 24
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<211> 403
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<212> ADN
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<213> primate
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<220>
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<221> CDS
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<222> (71)..(403)
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<221> péptido_mat
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<220>
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<221> rasgo_misc
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<222> (1)..(403)
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<223> nota= "n puede ser a, c, g, o t;
el aminoácido traducido depende del código genético"
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<400> 25
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<210> 26
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<212> PRT
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<213> primate
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<212> ADN
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<221> CDS
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<222> (3)..(281)
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<400> 27
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<212> ADN
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<213> primate
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<221> CDS
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<222> (1)..(189)
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<213> primate
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<213> roedor
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<213> viral
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<400> 34
Claims (13)
1. Un polinucleótido que comprende una secuencia
que codifica el polipéptido IL-174 maduro
comprendido en el SEQ ID NO: 14.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
comprende la porción codificante madura completa del SEQ ID NO:
13.
3. Un polinucleótido que codifica al menos 16
aminoácidos contiguos del polipéptido IL-174 maduro
comprendido en el SEQ ID NO: 14.
4. Un polinucleótido que comprende al menos 33
nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 13.
5. Un vector de expresión, que comprende un
polinucleótido de la reivindicación 1.
6. Una célula anfitriona que contiene un vector
de expresión de la reivindicación 5, donde la célula es:
- (a)
- una célula procariótica;
- (b)
- una célula eucariótica;
- (c)
- una célula bacteriana;
- (d)
- una célula de levadura;
- (e)
- una célula de insecto;
- (f)
- una célula de mamífero;
- (g)
- una célula de ratón;
- (h)
- una célula de primate; o
- (i)
- una célula humana.
7. Un método para elaborar un polipéptido de
IL-174 que comprende cultivar la célula anfitriona
de la reivindicación 6 en condiciones adecuadas para expresar el
polipéptido.
8. Un polipéptido que comprende el polipéptido
de IL-174 maduro comprendido en el SEQ ID NO:
14.
9. Un polipéptido que comprende al menos 16
aminoácidos contiguos del polipéptido de IL-174
maduro comprendido en el SEQ ID NO: 14.
10. El polipéptido de la reivindicación 9 que es
o está:
- (a)
- en una composición estéril;
- (b)
- no glicosilado;
- (c)
- desnaturalizado;
- (d)
- un polipéptido sintético;
- (e)
- anclado a un sustrato sólido; o
- (f)
- una proteína de fusión con una etiqueta de detección o purificación.
11. El polipéptido de la reivindicación 8, que
está marcado radiactivamente.
12. Un método de utilización del polipéptido
IL-174 de la reivindicación 8 para identificar un
compuesto que se une selectivamente al polipéptido, que comprende
incubar el compuesto con el polipéptido en condiciones apropiadas;
haciendo de ese modo que el compuesto se una al polipéptido.
13. Un kit que comprende el polipéptido
IL-174 de la reivindicación 8 o el polinucleótido de
la reivindicación 1 o 2.
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