ES2257741T3 - Proteina lkp tip adhesin y acido nucleico de haemophilus influenzae no clasificables. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL AISLAMIENTO Y DUPLICACION DEL GEN ESTRUCTURAL, HIPP, PARA EL SEROTIPO 5 DE PILI NTHI Y EL OPERON LKP. LA INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE ADN CAPACES DE CONVERTIR EN HIBRIDO LAS SECUENCIAS DE ADN DEL GENOMA HAEMOPHILUS INFLUENZAE RELACIONADAS CON PILI. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UNA MOLECULA DE ADN QUE CODIFICA UNA PROTEINA PILI, EN PARTICULAR UNA PROTEINA DE ADHESION DE PUNTA. LAS MOLECULAS DE ADN DE LA INVENCION PUEDEN UTILIZARSE EN UN METODO PARA ENSAYAR EN UNA MUESTRA, COMO UNA MUESTRA DE SANGRE, LA PRESENCIA DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE EN LA MUESTRA. POR CONSIGUIENTE, LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS AL USO DE LAS MOLECULAS DE ADN COMO DIAGNOSTICO. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UNA PROTEINA PILI HAEMOPHILUS INFLUENZAE RECOMBINANTE, COMO UNA PROTEINA DE ADHESION DE PUNTA. LA PROTEINA PUEDE EMPLEARSE EN UN METODO PARA INMUNIZAR A UN ANIMAL, COMO UN HUMANO, COMO UN AGENTE TERAPEUTICO O DIAGNOSTICO.

Description

Proteína LKP tip adhesin y ácido nucleico de Haemophilus influenzae no clasificables.

Los Haemophilus influenzae no tipificables (NTHi) son patógenos del tracto respiratorio humano principalmente no invasivos. Los NTHi pueden residir en el tracto respiratorio como un comensal o aumentando infecciones locales, incluida la otitis media, bronquitis, sinusitis, y raramente, neumonía (Bluestone, C.D., and J.O. Klein, In Pediatric Otolaryngology., 356 (1983); Bluestone and Stool ed. W.B. Saunders Co. Philadelphia.; Musher, D.M. et al., Ann. Intern. med. 99:344-350 (1983)). Se han descrito varios factores de adherencia potencial para Haemophilus influenzae (tanto tipificables como no tipificables) que se adhieren a las células humanas, incluidas cuatro clases de fimbrias/pili y dos proteínas de alto peso molecular con similitud con la hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis (St. Geme, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2875-2879 (1993)). Los pili son antígenos de superficie bacterianos. Son apéndices de proteína que consisten en un conjunto simétrico helicoidalmente de subunidades de proteína principal (pilina). Algunos pili pueden también llevar de dos a tres proteínas menores unidas en sus extremos. Una de estas proteínas, la adhesina, lleva el emplazamiento activo para la adhesión de pilus a receptores de membrana específicos sobre células humanas y animales.

Una clase de pili/fimbrias ha sido ampliamente estudiada, la familia de pili largos gruesos (LKP). Los pili LKP están expresados por H. influenzae (Hib) tanto tipificables como no tipificables. Los pili de esta familia tienen una morfología característica, una especificidad de adhesión parcialmente compartida y sus proteínas estructurales comparten secuencias de aminoácidos. Estos pili son de hemoaglutinación positiva y enlace medio a las células mucosas humanas (Brinton, C.C. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 Suppl.:54-61 (1989)). La hemoaglutinación de los eritrocitos humanos se lleva a cabo mediante unión al antígeno del grupo sanguíneo AnWj, mientras que la unión con las células epiteliales implica a un ácido siálico que contiene receptor de lactosilceramida (van Alphen, L. et al., Infect. Immun. 69:4473-4477 (1991)).

La familia LKP ha sido dividida en serotipos específicos de cepas diferentes basándose en la reactividad a los antisueros policlonales contra los pili purificados. Se ha observado poca reacción cruzada entre serotipos de pili (Brinton, C.C., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 Suppl.:54-61 (1989)).

Inhibir, o bloquear, la adhesión por medio de pilus LKP por H. influenzae a las células puede prevenir las enfermedades de H. influenzae. Los pili LKP purificados e intactos han demostrado ser candidatos a la vacuna para la otitis media de NTHi en el modelo chinchilla, confiriendo protección contra el reto con cepas de NTHi que llevan serotipo de pili homólogos (Karasic, R. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (Suppl.): S62-65 (1988)). Sin embargo, puesto que la protección es piloespecífica, para una protección amplia se requeriría una vacuna que fuera multivalente, que incluyera los serotipos más frecuentes de pili en la población natural de patógenos. Los genes estructurales de la pilina LKP han sido clonados y secuenciados por varios grupos (Coleman, T. et al., Infect. Immun. 59:1716-1722 (1991); Forney, L.J. et al., Infect. Immun. 59:1991-1996 (1991); Kar, S., et al.Infect. Immun. 58:903-908 (1990); van Ham, S.M., et al., EMBO Jour. 8:3535-3540 (1989)), pero solo han sido identificados los genes responsables de los serotipos 1 y 4 de pili.

Describimos el aislamiento, clonación y secuenciación del gen de pilina para el serotipo 5 de pili de Haemophilus influenzae (Figura 1), la secuenciación del operón de LKP1 completo, que consta en la Tabla 5 y la clonación de los pili LKP10, LKP1l y LKP12. Describimos moléculas de ADN (también aludidas en el presente como secuencias de ADN o secuencias de ácido nucleico) que codifican proteínas que comprenden el LKP de H. influenzae, especialmente una proteína adhesina tip. También describimos moléculas de ADN capaces de hibridizar a las secuencias de ADN del genoma de Haemophilus influenzae relacionado con los pili. Las moléculas de ADN descritas aquí pueden ser usadas en un método para probar una muestra, como una muestra de sangre, en busca de presencia de Haemophilus influenzae. Las moléculas de ADN descritas aquí pueden en consecuencia usarse como diagnóstico.

También se describen proteínas de pili de Haemophilus influenzae recombinante, y péptidos, específicamente una proteína adhesina tip. Las proteínas o péptidos pueden usarse para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, que reaccionan con (por ejemplo, enlazándose) las proteínas de pili de H. influenzae, y pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos de Haemophilus influenzae en, por ejemplo, una muestra de sangre. Estos anticuerpos pueden también ser usados como vacunas en métodos de inmunización pasiva.

Las proteínas y péptidos descritos pueden también ser empleados en métodos para inmunizar a un mamífero, como un ser humano, contra la infección de Haemophilus influenzae y, por tanto, como vacuna para la prevención de las enfermedades relacionadas con Haemophilus influenzae, por ejemplo la otitis media. En particular, basándose en las secuencias de ADN y aminoácidos presentadas aquí, puede construirse una vacuna de proteína adhesina, o péptido, que puede inducir anticuerpos protectores para H. influenzae en mamíferos.

La Figura 1 es una ilustración gráfica de las regiones conservadas de las proteínas codificadas por genes de pilina de serotipos de H. influenzae 1, 4 y 5 (SEC ID nº: 1-3, respectivamente). Las Figuras 2A, 2B, y 2C son esquemáticas de los mapas físicos obtenidos por digestión de enzima de restricción de vectores que contienen inserciones de LKP.

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de proteína de fusión LKP1. El subrayado indica la secuencia de aminoácido parcial de la proteína adhesina tip de LKP que fue fusionada a maltosa-proteína de unión.

La Figura 4 es una fotografía de un gel que muestra la identificación de proteína adhesina tip LKP1 por reactivo de anticuerpos con la proteína de fusión de adhesina-MBP tip LKP1 en membranas de Western Blot. Carriles 1 y 2: diferentes preparaciones de pili de LKP1 purificados con proteína tip (47Kd). (Se mostró una reacción positiva entre la proteína tip y el anticuerpo); carril 3: pili LKP10 purificados con adhesina tip (47Kd). (La proteína tip no reacciona con el anticuerpo); carril 4: pili LKP11 purificados con proteína tip (47Kd). (La proteína tip no reacciona con el anticuerpo); carril 5: marcadores de peso molecular de la proteína.

La Figura 5 es una fotografía de un gel mostrando la actividad de unión de adhesina tip LKP1 a fantasmas de glóbulos rojos humanos (HRC). Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: pili LKP1 purificados con proteína tip; carril 3: los pili con fantasmas HRC tras la centrifugación. La banda de proteína tip (47Kd) desapareció debido a la unión de pili de adhesina tip a sedimento fantasma; carril 4: Fantasmas HRC tras la centrifugación, usados como control; carril 5: pili purificados sin proteína tip (tratados con 1% SDS) fueron incubados con fantasmas frescos, mostrando el mismo patrón de banda de proteína que el patrón del carril 3; Carril 6: pili purificados sin proteína tip. Antes de la carga de gel, los pili fueron tratados con 1% SDS, exhaustivamente dializados en tampón Tris 25 m, a pH 8,0, cristalizados por PEG más NaCl y resolubilizados en tampón Tris 25 mM, a pH 8,0.

La Figura 6 es una fotografía de un gel mostrando la actividad de unión de proteína adhesina tip LKP1 purificada a fantasmas de glóbulos rojos humanos. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: proteína adhesina tip con un peso molecular de 47Kd y la proteína fue extraída por 0,1% SDS en 100 mM de tampón Glicina, a pH 2,0; carril 3: se incubó adhesina purificada con fantasmas de glóbulos rojos humanos frescos y sedimentada por centrifugación antes de cargar el sobrenadante en el gel. La banda de adhesina tip desapareció debido a la unión con los fantasmas HRC; carril 4: se incubó adhesina purificada con fantasmas HRC hervidos y sedimentada por centrifugación antes de cargar el sobrenadante en el gel. Mostró banda de adhesina con 47Kd, lo que indica que la proteína adhesina tip no se une al sedimento de fantasmas; carril 5: sobrenadante de fantasmas frescos tras la centrifugación. Se usó como control; carril 6: sobrenadante de fantasmas HRC hervidos tras centrifugación, mostrando un patrón de proteína soluble diferente del de los fantasmas HRC frescos, usados como otro control; carril 7: preparación diferente de proteína tip purificada incubada con fantasmas HRC frescos, que mostró la unión entre la proteína tip y el sedimento de fantasmas HRC frescos; carril 8: preparación diferente de proteína tip purificada incubada con fantasmas HRC hervidos, indicando que la proteína tip no se une a los fantasmas desnaturalizados. El gel estaba teñido con plata.

La Figura 7 es una fotografía de un gel que muestra proteínas adhesina de pili de tipo LKP diferentes con el mismo peso molecular. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: pili LKP10; carril 3: pili LKP11 y carril 4 a 6: preparación purificada diferente de pili LKP1. Las proteínas fueron teñidas con plata.

Aquí se describe, por primera vez, la clonación del gen pilina del serotipo 5 de Haemophilus influenzae y la secuencia de todo el operón LKP1 (Tabla 5/SEC ID Nº: 4) y las secuencias de aminoácido deducidas para seis marcos de lectura abiertos (SEC ID Nº: 5-10). El operón LKP1, como se muestra en la Tabla 5, está compuesto por cinco genes separados, llamados hipP (el gen pilina), hipC (el gen chaperona periplásmica, hipR (el gen de anclaje), hipM (el gen de proteína asociada tip menor) y hipA (el gen adhesina tip). Estos cinco genes también son llamados aquí hifA (para hipP), hifB (para hipC), hifC (para hipR), hifD (para hipM) y hifE (para hipA). También presentes en el operón LXP1 hay un gen integrasa y un gen peptidasa. Las proteínas codificadas por estos genes del operón LKP1 y la proteína pilina LKP5 son nombrados colectivamente en el presente proteínas de pili de H. influenzae.

En el presente se describen secuencias de ácido nucleico aislado y/o recombinante, o fragmentos activos biológicamente del mismo. Tal como están usados en el presente, los ácidos nucleicos también son llamados ADN y ARN, o secuencias de ADN y secuencias de ARN, o moléculas de ADN o moléculas de ARN. Los ácidos nucleicos llamados aquí "aislados" son ácidos nucleicos separados de los ácidos nucleicos del ADN genómico o ARN celular de su fuente de origen (es decir, tal como existe en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos como una biblioteca), y pueden haber experimentado más procesado. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen ácidos nucleicos obtenidos por métodos conocidos por los familiarizados con la técnica y métodos para obtener ácidos nucleicos aislados y métodos descritos aquí. Estos ácidos nucleicos aislados incluyen ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de métodos biológicos y químicos, y ácidos nucleicos recombinantes que están aislados.

Los ácidos nucleicos llamados aquí "recombinantes" son ácidos nucleicos que han sido producidos por metodología de ADN recombinante, incluidos aquellos ácidos nucleicos que son generados por procedimientos que confían en un método de recombinación artificial, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o clonación dentro de un vector usando enzimas de restricción. Los ácidos nucleicos "recombinantes" son también aquellos que resultan de los acontecimientos de recombinación que se producen a través de los mecanismos naturales de las células, pero son seleccionados tras la introducción en las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir y hacer probable un acontecimiento de recombinación deseado.

También se describen aquí secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN o ARN) que son sustancialmente complementarias a las secuencias de ADN de H. influenzae descritas aquí, y secuencias de ácido nucleico que hibridizan con estas secuencias de ADN bajo condiciones rigurosas conocidas por aquellos suficientemente familiarizados con la técnica para identificar secuencias de ADN con identidad de secuencia de ácido nucleico sustancial. Es razonable pronosticar que las secuencias de ADN identificadas bajo estas condiciones difíciles probablemente codificarán una proteína (también llamada aquí polipéptido, o fragmento de péptido) con la actividad biológica de proteínas de pili de H. influenzae. Una descripción general de condiciones de hibridación rigurosa se encuentra en Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience 1989. Factores como la longitud de la sonda, composición de base, desequilibrio porcentual entre las secuencias de hibridación, temperatura y fuerza iónica influyen en la estabilidad de los híbridos de ácido nucleico. Así, suficientes condiciones rigurosas para identificar proteínas de pili de H. influenzae adicionales, (esto es, condiciones difíciles altas o moderadas) pueden ser determinadas empíricamente, según, en parte, las características del ADN conocido con el cual otros ácidos nucleicos desconocidos están siendo comparados para similitud de secuencia.

Tal como está definido aquí, complementario substancialmente significa que la secuencia no refleja necesariamente la secuencia exacta de, por ejemplo, la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4), pero debe ser suficientemente similar en identidad de secuencia para hibridizar con la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4) bajo condiciones rigurosas. Por ejemplo, bases no complementarias, o secuencias más largas o más cortas pueden ser entremezcladas en secuencias a condición de que la secuencia tenga suficientes bases complementarias con, por ejemplo, la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4) para hibridizar con la misma.

Las moléculas de ADN pueden, preferiblemente, codificar una proteína de pili activa funcional o biológicamente, como el gen de pilina, hipP; la chaperona periplásmica, hipC; la proteína de anclaje de la membrana, hipR; la proteína asociada tip, hipM y tal como se describe aquí, la proteína adhesina tip, hipP. Una "proteína activa funcional o biológicamente" está definida aquí como una proteína que comparte identidad significativa (esto es, al menos alrededor de un 65%, preferiblemente al menos alrededor de un 80%, y más preferiblemente al menos alrededor del 95%) con las secuencias correspondientes de la proteína endógena y posee una o más de las funciones de la misma. Las funciones biológicas de las proteínas de pili de H. influenzae incluyen propiedades estructurales antigénicas y de adhesión. Por ejemplo, tal como se describe en Karasic, R. et al. (Karasic, R. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (Suppl.): S62-65 (1988)), las proteínas de pili pueden mostrar adhesión a células mucosas y eritrocitos. Así, dichas propiedades de adhesión, como la unión a los glóbulos rojos, pueden ser una medida de actividad biológica. También descrita aquí, la actividad biológica puede incluir la antigenicidad de la proteína, o péptido, resultando en la producción de anticuerpos que pueden unirse a las proteínas de pili.

Las proteínas de pili de H. influenzae incluyen las proteínas del operón LKP1 y la proteína pilina hipP de serotipo 5, y teniendo las proteínas secuencias de aminoácidos análogas a estas secuencias. Dichas proteínas están definidas aquí como análogas, o derivadas, de proteínas de pili de H. influenzae. Las secuencias de aminoácidos análogas según están definidas aquí significan secuencias de aminoácidos con identidad suficiente de secuencias de aminoácidos con, por ejemplo, proteína adhesina tip LKP1, para poseer la actividad biológica de adhesina tip. La actividad biológica de adhesina tip puede incluir, por ejemplo, la capacidad de la adhesina tip de unirse a receptores de membrana específicos en células humanas y animales, incluyendo la unión a preparaciones de fantasma de glóbulo rojo
nativo.

Por ejemplo, un polipéptido análogo puede ser producido con cambios "silenciosos" en la secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos difieren de los residuos de aminoácidos de la adhesina LKP1, aunque aún posean actividad de adhesión. Ejemplos de dichas diferencias incluyen adiciones, supresiones o sustituciones de residuos.

También abarcadas en la presente invención hay proteínas análogas que muestran actividad biológica superior o inferior a las proteínas de pili de la presente invención.

También describimos proteína biológicamente activa, o fragmentos biológicamente activos de las proteínas de pili de H. influenzae. Dichos fragmentos pueden incluir solo una parte de la secuencia de aminoácido en toda su longitud de una proteína de pili aunque posea actividad biológica. Dichos fragmentos pueden ser producidos por supresiones amino y carboxil terminales, así como supresiones internas. Estos fragmentos de péptido pueden ser probados en busca de actividad biológica como se describe aquí. Así, una proteína funcional o biológicamente activa incluye mutaciones o derivados de la proteína endógena, en donde uno o más aminoácidos han sido sustituidos, suprimidos o añadidos. También se describen fragmentos activos de la proteína. Las proteínas de pili de H. influenzae incluyen proteínas pili funcional o biológicamente activas, como la proteína estructural pilina, hipP; la chaperona periplásmica, hipC; la proteína de anclaje de la membrana, hipR; la proteína asociada tip, hipM; y más preferiblemente, como se describe aquí, la proteína adhesina tip, hipA. Las proteínas de fusión que incluyen las proteínas de pili descritas aquí (llamadas aquí primera región) están enlazadas a una segunda región, lo que no ocurre en la proteína de pili tal como se encuentra en la naturaleza. Así, la segunda región puede ser un aminoácido, péptido o polipéptido simple. La primera región puede ser una ubicación N-terminal, una ubicación C-terminal o interna a la proteína de fusión.

Las secuencias de ADN descritas aquí pueden también ser usadas en una construcción recombinante para la infección, transfección o transformación de una célula in vitro o in vivo bajo control de un promotor apropiado para la expresión de proteínas de pili de H. influenzae funcionales, como se describen aquí, en una célula huésped apropiada. Estas construcciones recombinantes son también llamadas aquí vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de ADN puede estar funcionalmente asociada a un promotor adecuado (por ejemplo, un promotor constitutivo o inducible o el promotor endógeno) introducido en un vector de expresión adecuado, como pUC19, que es después introducido en una célula huésped adecuada. La construcción puede también incluir ADN codificando uno o más marcadores seleccionables (como neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg y hisd) o ADN codificando uno o más antígenos diferentes o proteínas terapéuticas.

La construcción puede ser introducida por cualquier medio adecuado, como consta más arriba, como por precipitación de fosfato cálcico, microinyección, electroporación o infección (como con un retrovirus infeccioso, herpes vaccinia o vector de adenovirus). La célula huésped puede ser una célula eucariótica o procariótica. Las células adecuadas incluyen células bacterianas (por ejemplo E. coli) o células de mamífero. Las células de mamífero incluyen células somáticas primarias, como células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, macrófagos o células T, o líneas de células inmortalizadas, como HeLa o HT1080. La célula huésped recombinante puede después ser cultivada y, opcionalmente, seleccionada, in vitro bajo condiciones apropiadas, resultando en la expresión de la proteína. Alternativamente, la célula puede ser transplantada o inyectada a un animal, como un ser humano, para expresión in vivo.

Una incorporación se refiere a recombinantes de E. coli pili-productores tipo LKP. Dichos recombinantes han sido construidos a partir de Haemophilus influenzae, tal como se describe aquí. Estos recombinantes de serotipo simple produjeron pili fácilmente purificables en grandes cantidades. Éstos no variaron de fase ni se volvieron persistentes en subcultivo, y podrían cultivarse como E. coli en medio líquido con buena producción de pilus. Las preparaciones de pilus de serotipo simple cultivadas y purificadas a partir de los mismos contenían pili idénticos a los de las cepas madre de H. influenzae (Hflu), y no contenían otros antígenos Hflu. Estas preparaciones son fácilmente estandarizadas por su pureza, identidad, concentración y potencia para mezcla posterior dentro de una vacuna multivalente, y proporcionan un medio eficiente de producción de pilus para la fabricación de vacunas. Tal como aquí se describe, se han construido cepas de vacuna recombinante de E. coli productoras de tipo simple para serotipos LKP10, LKP11 y
LKP12.

También se han construido recombinantes de serotipo múltiple que contienen dos operones sobre plásmidos separados. Colonias simples de estas cepas simultáneamente expresaron, en buenas cantidades, dos serotipos de pili. Sin embargo, estas cepas eran inestables en que, durante el subcultivo in vitro, tendieron a perder rápidamente expresión de pilus, tal vez porque los plásmidos usados eran incompatibles. Si los dos operones están colocados en dos plásmidos compatibles, se espera que estas cepas sean más estables. El uso de cepas recombinantes de doble expresión y alta producción podría simplificar la producción de proteínas adecuadas para uso en vacunas por reducción a la mitad del número de cepas de vacuna requeridas.

Se han desarrollado y se describen aquí métodos de buena producción, concentración y purificación para pili LKP de Hflu de diferentes serotipos. Los pili pueden ser purificados a partir de cultivos de recombinantes de E. coli produciendo pili de Hflu tal como se describe para la purificación de pili a partir de cultivo de Hflu. Se han usado métodos de fermentación tanto de fase sólida como de fase líquida. El procedimiento preferido implica la extracción mecánica de pili de las bacterias recolectadas y su separación de las células bacterianas por centrifugación. Los pili están concentrados y además purificados mediante ciclos alternos de agregación longitudinal (cristalización) de bastoncillos de pilus intactos con impurezas solubles extraídas mediante centrifugación de los cristales seguida de solubilización de los cristales de pilus en bastoncillos de pilus libres con impurezas particuladas extraídas por centrifugación. Cada etapa del proceso de producción/purificación fue optimizada para cada serotipo de pilus. Hasta la fecha, han sido purificados diecinueve serotipos diferentes de LKP.

También han sido desarrollados métodos de purificación de pilus alternativos con utilidad analítica e industrial. Usando disolvente y condiciones de columna apropiados, los pili intactos pueden ser purificados de proteínas contaminantes por HPLC o FPLC sobre columnas de exclusión molecular, hidrofóbicas o de intercambio iónico. Estos métodos también pueden ampliarse proporcionalmente para producción industrial.

También se han desarrollado métodos de purificación para proteínas de pilus individuales desarrolladas a partir de pili de LKP intactos. Proteínas estructurales de pilus de LKP de Hflu, tal como se deduce de la alineación de secuencia múltiple de secuencias del gen de pilus con otros genes de pilus, incluyen la pilina, proteínas menores de tip pequeño y proteínas menores de tip grande. La proteína menor de tip grande es llamada "adhesina" porque comporta la conocida especificidad de adhesión de pilus LKP para glóbulos rojos humanos. Sin embargo, por analogía con otras familias de pilus, las otras dos proteínas estructurales de pilus LKP pueden también ser adhesinas con especificidades para por el momento receptores humanos desconocidos. Tanto las pilinas como las adhesinas de pili LKP han sido purificadas en forma activa biológicamente.

Las pilinas son purificadas en forma de bastoncillo ensamblado por extracción de proteínas tip menores y separación de bastoncillos desde menores en columnas de exclusión molecular. En su forma ensamblada, las unidades de pilina retienen la especificidad antigénica de los pili intactos, que es conferida por los determinantes de superficie expuestos de las subunidades de pilina sobre la superficie lateral del bastoncillo de pilus. Los bastoncillos de pilina se espera que sean iguales como componentes de vacuna multivalente efectiva, ya que los pili intactos pueden tener la ventaja de superior pureza y posiblemente efectos secundarios reducidos.

La adhesina de LKP11 ha sido aislada y purificada en forma activa y soluble. Su extracción desde pili LKP11 elimina la capacidad de estos pili de unirse a los glóbulos rojos humanos. En forma pura puede unirse a las membranas de glóbulos rojos humanos. La banda de adhesina sobre geles SDS está etiquetada por reactivo de anticuerpos con proteína de fusión que comprende un fragmento de proteína de unión de adhesina y maltosa. Las adhesinas de pilus LKP purificadas pueden tener utilidad como componentes de vacuna capaces de inducir anticuerpos de adhesión-bloqueo o compensación. La adhesina LKP11 no mostró reactividad cruzada antigénicamente con la adhesina LKP1 en Western Blot. Así, la similitud del gel SDS/PAGE de pesos moleculares aparentes encontrada para 3 adhesinas LKP diferentes no fue predictiva de similitud antigénica en esta prueba limitada a dos serotipos. Puede probarse la eficacia de adhesinas libres como vacunas para otitis media y para su capacidad de inducir anticuerpos de adhesión-bloqueo. El antisuero para la proteína de fusión, que etiquetó la banda de adhesina en Western Blot, no bloqueó la adhesión a glóbulos rojos.

Las proteínas recombinantes aisladas de la presente invención pueden ser administradas a un mamífero para protegerlo o tratarlo contra la infección de H. influenzae. La proteína de pili recombinante aislada puede ser formulada en una composición de vacuna, por ejemplo tal como se describe en la patente norteamericana 5.336.490. La proteína también puede ser administrada vía construcción infecciosa, preferiblemente una construcción viral incompetente o atenuada de replicación. Alternativamente, la proteína puede ser administrada vía una célula huésped recombinante (como, por ejemplo, una célula de mamífero) que expresará la proteína in vivo o en un portador aceptable farmacéuticamente. En particular, la proteína adhesina tip LKP1 recombinante, un fragmento activo biológicamente de la misma, o una proteína de fusión, pueden usarse en una composición de vacuna para inducir la producción de anticuerpos en un mamífero. Es razonable predecir que dichos anticuerpos pueden proteger al mamífero de enfermedades de H. influenzae.

La composición de vacuna puede ser administrada en una única dosis o en más de una dosis durante un periodo de tiempo para conseguir un nivel de anticuerpos en la sangre que sea suficiente para conferir protección contra la infección de H. influenzae.

Portadores farmacéuticos adecuados incluyen, sin limitarse, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos como la lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y, si se desea, mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes y/o sustancias aromáticas y otros parecidos que no reaccionan perjudicialmente con los componentes activos. También pueden combinarse si se desea con otros agentes activos, por ejemplo inhibidores de enzimas, para reducir la degradación metabólica.

Para aplicación parenteral, son particularmente adecuadas soluciones inyectables estériles, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implantes, incluidos supositorios. En caso de ampollas, son convenientes dosis unitarias.

Los modos de administración son aquellos conocidos por la técnica, como la administración parenteral, oral o intranasal, o por implantación celular.

Hay que comprender que las cantidades efectivas reales de la proteína en un caso específico variarán según el compuesto específico a utilizar, la composición particular formulada, el modo de administración y la edad, peso y condiciones del paciente, por ejemplo. Tal como se usa aquí, una cantidad efectiva de proteína es una cantidad de proteína que es capaz de aumentar el nivel de anticuerpos en un mamífero hasta un nivel suficiente para proporcionar protección contra la infección de H. influenzae. Las dosis para un paciente particular pueden ser determinadas por una persona con conocimientos corrientes de la técnica que aplique consideraciones convencionales (por ejemplo, mediante un protocolo farmacológico apropiado y convencional).

Las moléculas y proteínas de ADN descritas aquí pueden ser usadas en ensayos diagnósticos in vitro para detectar la presencia de H. influenzae en muestras biológicas. Estas moléculas de ADN, o fragmentos de las mismas, pueden ser usadas como sondas en un ensayo para detectar Haemophilus influenzae en una muestra, como una muestra de sangre de un mamífero, por ejemplo de un ser humano. Dichas sondas pueden ser diseñadas de forma que se unan específicamente a la secuencia objetivo (por ejemplo una proteína de pili de H. influenzae).

En una incorporación la sonda de ADN puede comprender los nucleótidos de una región conservada de serotipo del genoma de H. influenzae, como los nucleótidos que codifican una proteína adhesina tip. Para unirse específicamente a la secuencia objetivo, la sonda debe ser de longitud suficiente para proporcionar la especificidad deseada, esto es, para evitar ser hibridizada a secuencias aleatorias en la muestra. La molécula de ADN capaz de hibridación preferiblemente contiene al menos alrededor de 400 nucleótidos, más preferiblemente al menos alrededor de 1000 nucleótidos, y más preferiblemente al menos alrededor de 1200 nucleótidos. Por ejemplo, la molécula de ADN puede comprender al menos alrededor de 400 nucleótidos entre alrededor del nucleótido 7000 al 7400 de la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4). La sonda de hibridación de ADN preferiblemente comparte una homología de al menos alrededor de un 70% o las secuencias correspondientes del genoma de Haemophilus influenzae, más preferiblemente al menos alrededor del 80%, y más preferiblemente al menos alrededor del 90%.

En particular, las moléculas de ADN descritas aquí son capaces de hibridizar a regiones conservadas de serotipo del genoma de H. influenzae. Una incorporación particularmente preferida son moléculas de ADN que hibridizan con la región de H. influenzae que codifica la proteína adhesina tip. Por ejemplo, una molécula de ADN puede ser capaz de hibridizar al gen que codifica la proteína adhesina tip de serotipo 1, preferiblemente la secuencia que consta aproximadamente entre el nucleótido 6955 y el 8265 de la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4). En una incorporación, la molécula de ADN es capaz de hibridizar al genoma bajo condiciones difíciles, tal como aquí se describe. El ensayo de hibridación puede ejecutarse empleando procedimientos de hibridación conocidos, como los aquí descritos. La sonda puede ser, por ejemplo, etiquetada detectablemente empleando etiquetas conocidas en la técnica, que incluyen enzimas, tintes, anticuerpos y etiquetas radioactivas. La sonda está preferiblemente inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, una membrana).

Alternativamente, la molécula de ADN puede ser seleccionada de forma que hibridice a una región no conservada del genoma de Haemophilus influenzae. Por ejemplo, puede emplearse una molécula de ADN que hibridiza al gene que codifica la proteína pilina. Un ensayo como este puede detectar la presencia de un serotipo particular de Haemophilus influenzae en la muestra.

Una muestra factible de ser sometida al presente ensayo puede ser cualquier muestra que se sospeche contiene, o ha sido contaminada con, Haemophilus influenzae. Ejemplos de una muestra así incluyen una muestra de sangre, una muestra nasofaríngea o una aspiración de oído.

El ensayo puede ser usado, por tanto, como diagnóstico para la detección de infección de un sujeto, como un mamífero (por ejemplo, un ser humano), con Haemophilus influenzae. El ensayo puede ser también usado para detectar la presencia de contaminación de un material con Haemophilus influenzae, como un alimento, medicamento, o material biológico.

La proteína puede usarse en un ensayo para detectar infección de Haemophilus influenzae en una muestra, como en una muestra de sangre. Por ejemplo, los pili de un patógeno pueden ser aislados de la muestra o producidos recombinantemente, empleando las técnicas descritas aquí. Pueden entonces secuenciarse una o más de las proteínas, o fragmentos de la misma, de los pili. Las secuencias pueden ser alineadas a, y comparadas con la o las secuencias de proteína correspondientes de SEC ID Nº: 4. La homología en exceso del 90%, por ejemplo, es indicativa de presencia del patógeno (esto es, infección) en la muestra.

La proteína de pili, o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento de péptido) puede también ser usada en un inmunoensayo, específicamente un ELISA, para detectar la presencia de anticuerpos en muestras biológicas (por ejemplo sangre, suero o tejido). Dicho inmunoensayo puede ser ejecutado fácilmente por aquellos que estén familiarizados con la técnica usando técnicas bien establecidas para detectar anticuerpos vinculados a la proteína de pili LKP o fragmentos de péptidos.

Las proteínas de pili, o fragmentos de las mismas (también llamadas aquí péptidos, o fragmentos de péptidos), pueden también ser usadas para producir anticuerpos que son reactivos con las proteínas de pili descritas aquí. El término anticuerpo pretende abarcar anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser preparados por inmunización de un animal con una preparación de proteína de pili cruda o purificada usando técnicas bien conocidas por aquellos familiarizados con la técnica. Las proteínas de fusión de pili pueden también ser usadas para inmunización. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando técnicas conocidas por aquellos familiarizados con la técnica. Estos anticuerpos pueden ser usados en ensayos diagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos de H. influenzae en muestras biológicas tal como se describe más arriba.

La invención es además específicamente ilustrada por los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Clonación y Secuenciación del LKP 5, gen hipP y Operón LKP1 Materiales y Métodos Cepas bacterianas y plásmidos

Se emplearon cepas de H. influenzae P860295, P861249, y P860688 que expresan serotipos LKP 1, 4, y 5 respectivamente, descritos anteriormente (Brinton, C.C. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 Suppl.: 54-61 (1989)). Cepas de E. coli MB392 (Kar, S. et al., Infect. Immun. 58:903-908 (1990)) y HB101 se usaron como huéspedes para plásmidos de recombinante y la cepa DH5-\alpha se usó para pasos de clonación que implican complementación de (\beta-galactosidasa \alpha-péptido. Hflu fueron cultivados en caldo cerebro corazón (Dco Laboratories, Detroit, MI) conteniendo 10 \mug/ml de hemina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 2 \mug/ml NAD (Sigma) a 37ºC. Cepas de E. coli fueron cultivadas en caldo Luria (Miller, J.H., In Experiments in molecular genetics., 203 (1972). Cold Muelle Harbor Laboratory. Cold Muelle Harbor, NY) a 37ºC. En el caso apropiado, se usaron antibióticos a las concentraciones siguientes: ampicilina (Sigma) 100 \mug/ml, kanamicina (Sigma) 25 \mug/ml, y cloramfenicol (Sigma) 20 \mug/ml.

Se emplearon la construcción y propiedades de plásmido pHF1 que expresa pili LKP1 en E. coli tal como se ha descrito anteriormente (Kar, S. et al., Infect. Immun. 58:903-908 (1990)). El plásmido pPX551 es un derivado de pUC18 que contiene el fragmento 1,9 kb XhoI de pHF1 insertado en el emplazamiento BamHI. Se construyeron clones de supresión de pHF1 sin el locus pepN tal como se describe en el texto. El gen estructural de pilina LKP4 fue aislado por amplificación PCR de ADN cromosómico P860295 usando iniciadores con las secuencias siguientes: para el extremo 5' del gen-5'GTGCTGGATCCGTTTCTCTTGCATTACATTAGG 3' (SEC ID Nº: 12) y para el extremo
3'-5'TTAGGAATTCGGAAGCGTTTTTTACTTTTTTTGG3' (SEC ID Nº: 13). El iniciador 5' incluía un emplazamiento de restricción HindIII, subrayada en la secuencia, y el iniciador 3' incluía un emplazamiento EcoRI también subrayada. El producto de PCR fue clonado dentro de PCR1000 (Invitrogen, Inc., CA) según las directrices del fabricante. El gen estructural LKP4 fue subclonado mediante enromado del emplazamiento EcoRI con Klenow en presencia de los cuatro dNTP, y cortando con Asp718 I (un emplazamiento Asp718 I está ubicado en el vector) liberando el fragmento. El gen LKP4 estaba ligado en HindII-Asp718 I corte pPX191 (un derivado de pUC19 con el gen bla substituido por el gen cat desde pACYC184 (Chang, A.C.Y., and S.N. Cohen, J. Bacteriol. 134:1141-1156 (1978)) a la forma pPX602.

El gen estructural de pilina LKP5 fue aislado por PCR usando los iniciadores siguientes: para el extremo
5'-5'-AACGAATTCTGCTGTTTATTAAGGCTTTAG (SEC ID Nº: 14) y para el 3'-AGCTGGATCCTTGTAGGGTG
GGCGTAAGCC (SEC ID Nº: 15). El producto PCR de aproximadamente 1 kb fue clonado dentro de pCRII (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y subclonado como un fragmento de acabado romo por tratamiento Klenow de extremos EcoRI generado usando los emplazamientos EcoRI adyacentes del vector. El gen de pilina LKP5 fue subclonado dentro de plásmido pPX191 y su orientación determinada por análisis de restricción. El subclon LKP5 fue salvado como pPX605.

La clonación de genes hipP que codifican otros serotipos LKP

Se han descrito loci hipP que codifican genes de LKP de serotipo 4 y serotipo 1 (Kar, S. et al., Infect. Immun. 58:903-908 (1990); van Ham, S.M. et al., EMBO Jour. 8:3535-3540 (1989)). Para determinar la especificidad del serotipo de pili de LKP situado dentro del gen de hipP, se usó PCR para clonar los genes de pilina de serotipos 4 y 5 desde una cepa NTHi que expresa estos pili. El producto de PCR para el gen de pilina de LKP4 fue clonado dentro de pPX191 tal como se describe más arriba y es expresado bajo control del promotor lac. El gen hipP desde un LKP5 que expresa cepa de Hflu fue aislado por PCR tal como se ha descrito y clonado dentro de pPX191 para expresión bajo control lac.

Síntesis de oligonucleótido

Los oligonucleótidos sintéticos usados como iniciadores para la amplificación de PCR y secuenciación de ADN fueron sintetizados en un sintetizador Applied Biosystems (ABI) 380B DNA usando química b-cianoetil fosforamidita (Sinha, N.D. et al., Nucleic Acids Research 12:4539-4557 (1984)).

Amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Los genes de pilina LKP4 hipP y LKP5 hipP fueron amplificados por PCR desde cepas NTHi P861249 y P860688 respectivamente, usando protocolos de amplificación PCR estándar (Saiki, R.K. et al., Science 239:487-491 (1988)).

Secuenciación de ADN

El gen hipP contenido en plásmido pPX551 y el operón completo LKP1 contenido en plásmido pHF1 fueron secuenciados con iniciadores M13 estándar y con iniciadores sentido y antisentido superpuestos. Toda la secuenciación de ADN fue hecha en un secuenciador de ADN de Applied Biosystems (ABI) 373A usando el kit de secuenciación Taq thermal cycling DyeDeoxy^{TM} Terminator de ABI, parte nº 901497. Los serotipos LKP4 y LKP5 fueron secuenciados directamente desde los productos PCR usando los iniciadores de amplificación de PCR e iniciadores sintéticos internos basándose en el estudio de secuenciación de LKP1.

Análisis SDS-PAGE

La electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) fue realizada en un sistema de mini gel 70 por 100 mm (Bio-Rad, Richmond, CA) usando el método de Laemmli (Laemmli, U.K., Nature (London) 227:680-685 (1970)). Las muestras fueron reducidas con R-mercaptoetanol o DTT en tampón de preparación de muestra y hervidas durante 5 min. Los geles estuvieron a una tensión constante de 150 V. Las proteínas separadas fueron detectadas por tinción con azul brillante Coomassie G-250 (Sigma).

Purificación parcial de pili

Los pili de LKP fueron purificados según los métodos previamente descritos usando solubilidad de pH diferencial (Brinton, C.C., Jr. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 Suppl.:54-61 (1989)). Brevemente, las bacterias piliadas fueron recolectadas desde cultivo líquido por centrifugación y lavadas dos veces en solución salina tamponada con fosfato, a un pH de 7,2. El sedimento bacterial fue resuspendido en tris 100 mM, a pH 10,3, conteniendo 150 mM de NaCl a una proporción de 4 ml tampón/g de peso húmedo de células. Los pili fueron cortados de las células por mezcla en un minimezclador Oster durante tres minutos a 4ºC. Los residuos bacterianos fueron separados por centrifugación y descartados. El sobrenadante fue dializado contra 50 mM de NaAcetato, a pH 5,0, durante toda una noche para precipitar los pili y desnaturalizar otras proteínas. El sedimento fue recogido por centrifugación a 15.000 x g a 4ºC y disuelto durante una noche en 50 ml de tampón CAPS 0,01 M, a pH 10,4, con balanceo suave. Este ciclo de precipitación y solubilización de ácido en tampón básico fue repetido dos veces más. El sedimento ácido final fue después resolubilizado en NaFosfato 0,01 M, a pH 10,4, y el material no soluble, descartado. Esta fracción soluble fue descrita como pili parcialmente purificados.

Secuencia del operón de LKP1

El operón de LKP1 fue secuenciado tal como se describe más arriba y la secuencia completa consta en la Tabla 5 (SEC ID Nº: 4). El análisis de secuencia identificó seis marcos de lectura abierta potenciales (ORF) en el operón de LKP, incluyendo el gen hipP (aproximadamente entre los nucleótidos 1882-2532 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4) y el gen hipC (aproximadamente entre los nucleótidos 2854-3630 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4). Los seis ORF en el operón de LKP fueron identificados como homólogos a los genes de operón de pilus equivalentes en la superfamilia pilus, tal como define la alineación de secuencia múltiple de proteínas. El análisis de la alineación de la secuencia fue también ejecutado usando la Entrez Sequences Database Release 10.0 del National Center for Bio-
technology Information (National Library of Medicine, Bethesda, MD). Secuencias de aminoácidos derivados de los ORF se muestran en la Tabla 5 (SEC ID Nº: 5 a 10). Una función para cada marco de lectura fue asignada basándose en el análisis de alineación de secuencia. Hay cinco ORF que parecen estar agrupados en un operón controlado por la región promotora de hipC. Después del gen hipC (chaperona periplásmica), el segundo marco de lectura
hipR (aproximadamente entre los nucleótidos 4016-6238 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4) fue designado, una proteína de anclaje de membrana, el tercer ORF de hipM (aproximadamente entre los nucleótidos 6259-6873 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4) fue designado, una proteína asociada tip, (también mencionada aquí como una proteína tip menor) y el quinto ORF de hipA (aproximadamente entre los nucleótidos 6955-8265 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4) fue designado, una proteína adhesina tip. El gen de pilina (hipe) y el gen de chaperona periplásmica (hipC) están transcritos en orientaciones opuestas como en el operón de LKP 4 teniendo la región promotora las repeticiones TA previamente identificadas (van Ham, S.M. et al., Cell 73:1187-1196 (1993)). Puesto que pHF1 expresa de LKP1 en E. coli, hay 10 repeticiones de TA en la región intrapromotora, tal como describen van Ham et al. Estas repeticiones de TA son responsables de la variación de fase del fenotipo de pili LKP, con pérdida de algunas repeticiones, lo que resulta en pérdida de piliación y un número de repetición de TA entre 10 u 11, que permite la expresión del operón de LKP. Como se identificó en el operón de LKP1 había un ORF codificando una integrasa (aproximadamente entre los nucleótidos 1495-1868 de la Tabla 5/SEC ID Nº: 4). También ubicada en el operón LKP1 había una secuencia que codifica un encima, peptidasa (aproximadamente entre los nucleótidos 8395-9342 de la Tabla 5/SEC
ID Nº: 4).

El tamaño predicho del producto gen de hipP de LKP1 es aproximadamente de 21,2 kilodaltons, suponiendo una longitud de secuencia de señal de 20 aminoácidos, mientras que el peso molecular observado en geles SDS-PAGE es de aproximadamente 27 kilodaltons. Parte de esto puede explicarse por la migración de secuencia anómala de pilinas de LKP en general en geles SDS-PAGE (el LKP4 maduro migra a un tamaño molecular de 24 kilodaltons, mientras que su tamaño predicho es de 22,1 kilodaltons) pero la explicación exacta sigue sin saberse.

Comparación de secuencia de serotipos 1, 4, y 5 de LKP y genes hipP

Este informe representa el primer análisis de secuencia de los genes hipP que codifican serotipos 1 y 5 de LKP (Figura 1). El gen hipP desde un LKP4 que expresa cepa de Hib ha sido también secuenciado (van Ham, S.M. et al., EMBO Jour. 8:3535-3540 (1989)) y la secuencia de aminoácidos derivada muestra un 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos derivada de hipP de LKP4 contenida en la misma. Las secuencias de gen hipP desde cepas de Hib Eagan y M43 han sido publicadas (Forney, L.J. et al., Infect. Immun. 59:1991-1996 (1991)). El gen hipP de LKP1 debería codificar una proteína de aproximadamente 21,5 kD, mientras que el peso molecular predicho de la proteína hipP de LKP 4 es de 23,8 kD. Los productos de gen hipP reales observados en E. coli recombinante son de aproximadamente los tamaños correctos en Western Blot para LKP4 y LKP5, pero la pilina LKP1 corre anormalmente a un peso molecular superior al predicho, a 26 kD. Se usó el programa informático MacVector para valorar la homología de estos genes, con las proteínas de hipP de LKP4 y hipP de LKP5, siendo un 70 y 67% idénticas al hipe de LKP1, respectivamente. La alineación entre las secuencias es muy buena en el termini amino de las proteínas, con tres áreas principales de divergencia de secuencia en los genes de serotipo 4 y 5 de LKP1, más allá de las proteínas, como muestra la Figura 1. Puesto que se ha observado poca reactividad cruzada entre los sueros anti-LKP1, anti-LKP4, o anti-LKP5 con pili intactos de serotipo heterólogo, las secuencias responsables de la especificidad del serotipo de los antisueros debe localizarse en dichas regiones. Por comparación de las secuencias en GenBank con la secuencia LKP4, la pilina tipo b M43 de H. influenzae (Gilsdorf, J.R. et al., Infect. Immun. 58:1065-1072 (1990)) secuenciada por Gilsdorf et al. también parece ser un gen de serotipo LKP4 (no se muestran datos).

Ejemplo 2 Construcción de recombinantes de E. coli productores de pili tipo LKP Cepas bacterianas

Las cepas de Hflu piliado usadas para la construcción de recombinante de E. coli son LKP11/CB59, LKP10/88-0807 y LKP12/88-0677. La hemoaglutinación y aglutinación de suero fueron examinadas antes de hacer la biblioteca genómica. Se usaron como célula huésped de clonación cepas de E. coli XL1-Blue^{MR} y HB101.

Construcción de biblioteca de ADN y ADN de vector cósmido

Los ADN cromosómicos de LKPI1, LKP10 y LKP12 fueron extraídos y purificados respectivamente mediante técnicas estándar. El tamaño del ADN genómico de Hflu es de alrededor de 1,8 x 10^{6} bp. El ADN cromosómico fue parcialmente digerido con el enzima de restricción Sau3A I. Aproximadamente 30 kb de fragmento de ADN fue eluído desde gel LMTA (Sigma) y purificado por método fenol-cloroformo. La concentración de ADN final es de alrededor de 1 \mug/\mul.

El ADN de vector SuperCos I (Stratagene, La Jolla, CA) fue digerido con Xba I y desfosforilado con fosfatasa alcalina del intestino de ternera (CIAP). El ADN de vector tratado Xba I y CIAP fue después digerido con enzima de restricción Bam HI. Se obtuvo un fragmento de ADN de vector de alrededor de 6,5 kb.

Los fragmentos de ADN LKP11/CB59, LKP10/88-0807 y LKP12/88-0677 fueron ligados a la localización Bam HI del ADN vector SuperCos I, respectivamente. El ADN ligado fue empaquetado en partículas \lambdafagas usando el kit Ciga-pack Gold (Stratagene, La Jolla, CA). La célula huésped para el empaquetado fue XL1-Blue^{MR}

Cribado de biblioteca

Los pili de tipo LKP expresado de recombinante fueron cribados mediante el método de "colony blot". La concentración de sueros antipilus desde LKP11, LKP10 y LKP12 fue de dilución 1:1000. El porcentaje de colonia positiva fue de 40/4200 para LKP11, 9/700 para LKP10 y 1/600 para LKP12. La piliación de célula fue examinada por EM. Los recombinantes fueron verificados por un ensayo más de HA y SA y después fueron nombrados CLJll para LKP11, CLJ10 para LKP10 y CLJ12 para LKP12 (Figuras 2A, 2B y 2C). El ADN de recombinantes fue extractado y transformado en cepa HB101 de E. coli porque la célula XL1-Blue expresa pili tipo I. El tamaño de ADN de recombinantes es de alrededor de 18,5 kb para CLJ11. Esto se obtuvo por digestión y posterior ligamiento usando localización de restricción en inserto y ADN de vector. El ADN de CLJ10 es de alrededor de 25 kb, y el CLJ12 de 35 kb. La secuencia de ADN parcial está disponible para estos insertos de recombinante.

Ejemplo 3 Protocolos para la purificación de un pilus de LKP a partir de una cepa recombinante de E. coli usando el método de fase líquida Protocolo general

1. Inocular células de E. coli recombinante en 3 ml de medio LB que contenga ampicilina y cultivar a 37ºC hasta que la lectura 540 nm OD alcance 0,6-0,8 (3-4 horas).

2. Transferir la suspensión celular a 50 ml de medio y cultivar a 37ºC hasta que la lectura en 540 nm alcance 0,8-1,0 (4-5 horas).

3. Transferir los 50 ml de suspensión celular a 1L de medio en frasco de 2,8L y cultivar a 37ºC toda la noche (16-18 horas) hasta que se obtenga una lectura en 540 nm de 4,0-5,0.

4. Cultivar las células por centrifugación a 5000 rpm durante 15 minutos.

5. Resuspender las células en tampón de acetato 50 nM a pH 5,0 y mantener la suspensión a temperatura ambiente durante una hora.

6. Mezclar a 11000 rpm en copa grande, o a 14000 rpm en copa pequeña, con omnimixer, hielo durante 3 minutos.

7. Titrar a pH 8,0 con 1 M de HCl y dejar reposar durante 3 horas a temperatura ambiente.

8. Centrifugar a 12000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. Pesar todos los sedimentos y descartar.

9. Añadir 10 \mul de desoxirribonucleasa y ribonucleasa por cada 100 ml de prep. Mezclar bien y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

10. Dializar contra varios cambios de 50 mM de tampón de acetato, a pH 5,0 durante una noche. Si la preparación no alcanza pH 5,0 en una noche, entonces dializar más tiempo contra más cambios de tampón.

11. Centrifugar a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC para obtener el sedimento del precipitante de proteína y los cristales de pilus.

12. Resuspender el sedimento en alrededor del 25% del volumen original con 25 mM de tampón Tris-HCl a pH 8,0.

13. Removiendo suavemente, añadir Triton X-100 y EDTA a la preparación para producir una concentración final de 0,2% y 5 mM. Remover suavemente durante una noche a 4ºC.

14. Clarificar la preparación por centrifugado a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC.

15. Añadir NaCl y PEG 8000 hasta una concentración final de 0,5 M y 3,0% respectivamente, y después incubar y preparar sobre hielo durante 2 horas.

16. Centrifugar la preparación a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC para sedimentar los cristales de pilus.

17. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl a pH 8,0 en 1/3 de volumen previo. Usando menos solución se obtiene una producción menor de cristales de pilus.

18. Repetir los pasos (13) a (17).

19. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl a pH 8,0. Según la pureza y cantidad de material, puede seguirse con pasos de solubilización y cristalización alternativa de material según se requiera.

Durante la purificación, sacar una muestra tras cada paso y usar SDS-PAGE para examinar la pureza de las muestras. Se requiere ensayo de microscopia de campo oscuro para ayudar en la comprobación de la pureza. Es necesario usar escaneo de UV para determinar cualquier contaminación por ADN o ARN.

Puesto que Triton X-100 tiene una fuerte absorbancia a 280 nm, es importante extraer el Triton X-100 residual por cristalización, una vez, o más, de pili por PEG y NaCl tras la purificación. Esto evita lecturas falsas a 280 nm cuando se determina la concentración de preparaciones de pilus por método UV.

Purificación de los pili LKP 5

1. Recolección en 80 mM de PBS a pH 5,0 usando 5-10 ml/bandeja.

2. Titrar la preparación a pH 5,0 con 6N de HCl si es necesario.

3. Mezclar con omnimixer sobre hielo durante 3 minutos (velocidad media = 9800 rpm) (hasta 11000 rpm si es posible en copas grandes y hasta 14000 rpm en copas pequeñas).

4. Titrar a pH 9,0 con 5 M de NaOH y dejar reposar durante 3 horas a temperatura ambiente. Puede ser necesario remover suavemente para evitar cambios en el pH. Controlar concienzudamente el pH y ajustarlo si es necesario. (Si los cultivos han sido cultivados en caldo, después titrar con un 1 M de solución de tampón (Tris) en lugar de NaOH).

5. Centrifugar a 15300 g durante 20 minutos a 4ºC. Transferir el sobrenadante a botellas limpias y clarificar una segunda vez como antes. Pesar todos los sedimentos y descartar.

6. Ajustar el pH del sobrenadante a 8,0 y añadir 10 \mul de desoxirribonucleasa y ribonucleasa por cada 100 ml de prep. Mezclar bien y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

7. Dializar contra varios cambios de 40 mM de tampón de acetato, a pH 5,0 durante una noche. Si la preparación no alcanza un pH de 5,0 en una noche, dializar después más tiempo contra más cambios de tampón.

8. Centrifugar a 18600 g durante 60 minutos a 4ºC para sedimentar los cristales de pilus (cristales no típicos para limpios).

9. Resuspender el sedimento en alrededor del 25% de volumen original con 25 mM de Tris-HCl a pH 9,0 usando un cepillo "rubber policeman". Remover suavemente a 4ºC (evitar formación) varias horas. Romper los fragmentos grandes con pipeteado suave si es necesario.

10. Removiendo suavemente, añadir Triton X-100 (2% de stock) a la preparación para obtener una concentración final de 0,4% y añadir EDTA (25 mM de stock) para una concentración final de 5 mM. Incubar una noche a 4ºC.

11. Clarificar la preparación por centrifugado a 186000 g durante 60 minutos a 4ºC. Transferir el sobrenadante a un frasco limpio.

12. Ajustar el pH del sobrenadante a menos de 8,0 usando 1 N de HCl.

13. Añadir NaCl (5 M de stock) para una concentración final de 0,5 M y PEG (30% de stock) para una concentración final del 3% y después incubar la preparación sobre hielo durante 0,5 horas. Inspeccionar en campo oscuro en busca de cristales. Aumentar el tiempo si es necesario, pero es de crítica importancia no sobreexponer los pili al PEG porque la resolubilización se hace cada vez más difícil al aumentar los tiempos.

14. Centrifugar la preparación a 18600 g durante 60 minutos a 4ºC para sedimentar los cristales de pilus.

15. Lavar el sedimento con 40 mM de tampón citrato a pH 5,0 para extraer el exceso de PEG/NaCl. Después centrifugar a 186000 g durante 60 minutos (2 veces).

16. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl a pH 9,0 en de 1/3 a 1/2 de volumen previo. Solubilizar por turbulencia seguida de un suave pipeteado. Poner la muestra sobre un gel para comprobar la pureza. Si es necesario, seguir con el paso 17.

17. Añadir Triton x-100 a la preparación para obtener una concentración final de 0,4%, añadir EDTA para una concentración final de 5 mM y después incubar una noche a 4ºC (ver paso 10 para más detalles).

18. Ajustar el pH de la preparación a menos de 8,0 usando HCl (entre 7 y 8).

19. Añadir NaCl para una concentración final de 0,5 M y PEG para una concentración final del 3% y después incubar la preparación sobre hielo durante 0,5 horas (ver paso 13 para más detalles).

20. Centrifugar la preparación a 186000 g durante 60 minutos a 5ºC para sedimentar los cristales de pilus.

21. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl a pH 9,0 para solubilizar los pili (ver paso 16 para más detalles). Comprobar la pureza por SDS-PAGE. Si es necesario, seguir con el paso 22.

22. Añadir Triton x-100 a la preparación para obtener una concentración final de 0,4%, añadir EDTA para una concentración final de 5 mM y después incubar una noche a 4ºC (ver paso 10 para más detalles).

23. Clarificar por centrifugado a 18600 g durante 60 minutos a 4ºC.

24. Añadir NaCl para una concentración final de 0,5 M, PEG para una concentración final de 3M y después incubar la preparación sobre hielo durante 0,5 horas (ver paso 13 para más detalles).

25. Centrifugar a 18600 g durante 1 hora a 4ºC. Descartar el sobrenadante.

26. Resuspender el sedimento en Tris-HCl a pH 9,0. Según la cantidad y pureza del material, puede seguirse con pasos que alternen la solubilización/cristalización según se requiera.

Durante el proceso de purificación, controlar el material de sedimento y el sobrenadante por campo oscuro y/o gel y/o escaneado. Puede requerir un reprocesado.

Comprobar pureza mediante SDS-PAGE: Repetir el paso Triton si es necesario, pero evitar pasos de reacción de SDS en protocolos anteriores a causa de altas pérdidas de pili.

Ejemplo 4 Purificación de los pili LKP por HPLC y otros Métodos de Columna

Además de extracción de detergente y precipitación de PEG, los pili LKP pueden también ser purificados por HPLC, FPLC y otros métodos de columna. Estos métodos son buenos particularmente para pili de LKP desconocido. Normalmente, los pili son parcialmente purificados por extracción y precipitación primero, hasta que la solución de pilus sea transparente, concentrada y muy pequeña de tamaño. Si la preparación aún no es pura según determine SDS-PAGE, puede elegirse aplicar métodos de columna. Las columnas de exclusión molecular son el método preferido para este propósito. Antes de cargar a una columna, es importante hacer un tratamiento para purificar más la muestra de pilus. El detergente usado para la purificación parcial de pili debería ser extraído de las muestras de pilus por diálisis u otras técnicas conocidas. El detergente reduce significativamente la resolución de separación de columna. La columna de exclusión requiere un volumen de muestra pequeño.

Para HPLC o FPLC, se recomienda el volumen de carga de 50 \mul a 200 \mul, y para otras columnas de filtración de gel de LC de rutina, el volumen de carga de la muestra depende de la longitud y tamaño de la columna. Una muestra de pilus de 1 ml se prefiere para una columna con un volumen total de 50 ml. Puesto que los pili tienen una baja absorbancia a 280 nm, se recomienda una sensibilidad más alta para controlar. La proteína disponible eluída desde columna puede ser controlada a 230 nm. Pueden purificarse más las proteínas por HPLC. Los métodos de columna de purificación son también útiles para aislar la pilina de los pili.

Ejemplo 5 Protocolo para la purificación de un pilus LKP de una cepa de Hflu o cepa recombinante de E. coli usando método de fase sólida

Hablando en general, la cepa recombinante expresa proteína estructural de pilus mejor de lo que lo hace la cepa madre, Hflu, por tanto es más fácil purificar pili los desde las células recombinantes. Sin embargo, debido al hecho de que la cepa recombinante de E. coli expresa la proteína de pili de la misma forma que hace el Hflu madre, los procedimientos de purificación de bastoncillos de pilus desde Hflu o desde cepa recombinante son básicamente los mismos. El cultivo de la cepa Hflu requiere medio agar chocolate y cierto CO_{2} y humedad. El cultivo de cepa recombinante E. coli requiere medio agar LB que contenga ampicilina.

1. Recolección en 80 mM de PBS a pH 5,0 usando 5 ml/bandeja. Usar un borde de cristal liso para escariar células húmedas y después transferir la suspensión celular a copa omnimixer. Si las células están hechas en superficie, usar solo humedad de superficie de medios para recolectar células húmedas.

2. Titrar la preparación a pH 5,0 con 2 M de tampón acetato si es necesario.

3. Mezclar a 14000 rpm con omnimixer sobre hielo durante 3-5 minutos.

4. Titrar a pH 8,0 con 1 M de tampón Tris-HCl y controlar el cambio de pH mediante pHmetría. Se puede titrar a pH con 2,5 o 5 M de NaOH en lugar de tampón Tris, si la preparación contiene muchas células húmedas. Hay que tener cuidado de evitar la lisis de células al usar NaOH. Incubar la preparación a temperatura ambiente durante 3 horas.

5. Centrifugar a 12000 rpm durante 20-30 minutos a 4ºC. Pesar todos los sedimentos y descartar.

6. Añadir 10 \mul de desoxirribonucleasa y ribonucleasa por cada 100 ml de prep. Mezclar bien y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

7. Dializar contra varios cambios de 50 mM de tampón de acetato, a pH 5,0, durante una noche. Si la preparación no alcanza pH 5,0 en una noche, entonces dializar más tiempo contra más cambios de tampón.

8. Centrifugar a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC para sedimentar el precipitado de proteína y cristales de pilus.

9. Resuspender el sedimento en alrededor del 25% del volumen original con 25 mM de tampón Tris-HCl, a pH 8,0.

10. Removiendo suavemente, añadir Triton X-100 y EDTA a la preparación para producir una concentración final de 0,2% y 5 mM. Remover suavemente durante una noche a 4ºC.

11. Clarificar la preparación por centrifugación a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC.

12. Añadir NaCl y PEG 8000 hasta una concentración final de 0,5 M y 3,0%, respectivamente, y después incubar la preparación sobre hielo durante 2 horas. Los pili de LKP con longitudes y dímero diferentes pueden cristalizar en concentraciones diferentes de NaCl y PEG 8000. Por tanto es importante una prueba de concentración para NaCl y PEG para cristalizar pili diferentes.

13. Centrifugar a 16000 rpm durante 60 minutos a 4ºC para sedimentar cristales de pilus.

14. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl, a pH 8,0 en 1/3 anterior. Usar incluso menos solución si se encuentra una producción menor de cristal de pilus.

15. Repetir desde el paso 10 hasta el paso 14.

16. Resuspender el sedimento en 25 mM de Tris-HCl a pH 8,0. Según la pureza y cantidad de material, puede seguirse con pasos de solubilización y cristalización alterna de material según se requiera.

Durante la purificación, sacar una muestra tras cada paso y usar SDS-PAGE para examinar la pureza de las muestras. Se requiere ensayo de microscopia de campo oscuro para ayudar en la comprobación de la pureza. Es necesario emplear el escaneo de UV para encontrar cualquier contaminación por ADN o ARN.

Puesto que el Triton X-100 tiene una fuerte absorbancia a 280 nm, es prudente extraer el residuo de detergente por una cristalización más de pili por PEG y NaCl tras la purificación. Esto evita lecturas falsas a 280 nm cuando se determina la concentración de preparación de pilus por método UV.

Ejemplo 6 Construcción de proteína de fusión MBP-Ä3'Tip

La fusión genética fue construida usando iniciadores PCR para obtener una porción del gen de tip de LKP1 desde pHFl que estaría en marco con el gen de proteína MBP en el vector pMAL-p2. Los iniciadores fueron diseñados de forma que el terminal carboxil de aproximadamente 100 aminoácidos de la proteína tip serían suprimidos y reemplazados por un codón de terminación. La porción terminal amino de la proteína fue PCR en marco con un emplazamiento de restricción apropiado en el punto aproximado del emplazamiento de exfoliación de secuencia de la señal que fue determinado por analogía con otras secuencias de señal bacterianas y el perfil de hidrofobicidad de la secuencia de aminoácido deducida de la proteína tip. La secuencia de aminoácido de la proteína de fusión se muestra en la Figura 2. La secuencia parcial de la proteína tip LKP de la proteína de fusión está subrayada.

Expresión de la fusión, purificación y producción de antisueros

La proteína se expresó en BL21 de E. coli (una cepa K-12 onnipT.lon) siendo cultivados en caldo SOB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml a 28ºC tras inducción con 0,2 mM de IPTG. Las células fueron sedimentadas por centrifugación y lavadas una vez en PBS. Las células fueron resuspendidas en Tris 20 mM, a pH 7,5, conteniendo 2 mM de EDTA y 400 mM de NaCl a una proporción de 20 ml/litro de cultivo original. Las células fueron lisadas pasándolas a través de una célula de presión francesa tres veces, y el residuo celular extraído por centrifugación de baja velocidad a 8 veces x g durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue diluido 5 veces en el mismo tampón usado para la rotura y pasado a través de columna de resina amilosa de volumen de lecho de 1 ml/min a temperatura ambiente. Una vez efectuado el lisato por columna, la columna fue lavada con 15 volúmenes de lecho del tampón de lisado a 5 ml/min. El material fijado fue eluido usando tampón lavador que contiene 10 mM de maltosa. La elución se hizo con 50 ml de tampón a 1 ml/min y el eluyente combinado. La mezcla de proteína resultante fue analizada por SDS-PAGE y Western Blot y sueros anti-MBP, y se descubrió que contenía la fusión, productos de análisis y MBP de longitud completa. Se detectaron otros materiales pequeños.

Las proteínas de fusión, MBP y productos de análisis se eludieron como un complejo. Los ratones fueron inmunizados con dosis de 10 \mug del complejo usando 100 \mug de MPL como adyuvante. Las inmunizaciones se hicieron subcutáneamente en las semanas 0, 4, y 6 y los ratones fueron exsanguinados en la semana 8. Los sueros de control negativo fueron sueros anti-MBP de ratón hechos contra MBP purificado usando los mismos protocolos de purificación e inmunización.

Sueros Ant i -GST

La fusión GST fue construida usando el gen tip LKP completo, incluida la secuencia de señal. El gen fue pasado por PCR desde PHF1 con la restricción apropiada localizaciones enzyma para inserción en pGEX-3X en marco, y expresado en DH5\alpha de E. coli. Las células fueron cultivadas en SOB conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina e inducida con IPTG a 0,2 mM a 37ºC durante 2 horas. Las células fueron recolectadas y lavadas en PBS, después resuspendidas en PBS y lisadas por paso a través de célula de presión francesa. Los residuos celulares fueron recolectados por centrifugación y lavados tres veces con tampón que contenía 1% de Triton X-Zwittergent 3-14 y los cuerpos de inclusión recubiertos por centrifugación. Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados en 5 M de guanidina HCl y analizados por SDS-PAGE. La concentración de guanidina fue bajada a 2,5 M por diálisis y los cuerpos de inclusión solubles almacenados a 4ºC. Los antisueros fueron hechos por geles SDS-PAGE 10% preparativos y cortando la banda de fusión del gel. La banda de acrilamida-proteína fue picada usando un escalpelo y mezclada con MPL (100 \mug) e inyectada a ratones tres veces en las semanas 0, 4, y 6. Los ratones fueron sangrados en la semana 8.

Ejemplo 7 Extracción, purificación e identificación de proteína adhesina tip de pilus LKP de H. influenzae

Esta es la primera demostración de que la proteína adhesina tip de pili LKP1 de H. influenzae puede ser extraída sin despolimerización de bastoncillos de pilus. La proteína adhesina tip libre puede ser aislada y purificada mediante diálisis y prep-electroforesis. La adhesina tip purificada puede ser identificada por el antisuero desde una proteína de fusión genética construida, que procede de una porción de gen tip de LKP1 y gen de MBP (proteína de unión a maltosa) usando análisis de Western Blot. La unión específica fue detectada entre la proteína tip purificada y el antisuero de proteína de fusión, que claramente muestra que la proteína purificada a partir de preparación de pilus de LKP1 es proteína de adhesina tip de LKP1.

Los ensayos de actividad con fantasmas de glóbulo rojo humano (RBC) demostraron que la proteína tip purificada se une a una preparación de fantasmas nativos pero no se une a fantasmas RBC desnaturalizados, indicando que la proteína tip purificada es biológicamente funcional, o al menos parcialmente funcional.

Extracción de proteína tin de bastoncillos de pilus

1. Dializar pili de LKP1 purificados en 200 mM de tampón Gly-HCl, a pH 2,0, que contenga 5 M de NaCl, a temperatura ambiente durante de 4 a 6 horas.

2. Transferir la bolsa de diálisis a 25 mM de tampón Tris-HCl, a pH 8,0 y dializar durante varias horas hasta que el pH de la preparación de pilus alcance el pH 8,0.

3. Añadir SDS a la preparación de pilus hasta una concentración final del 0,1% e incubar a 4ºC durante 10 horas.

4. Dializar la preparación de pilus en 50 mM de tampón citrato, a pH 5,0 durante una noche.

5. Los agregados de pilus pueden ser extraídos por centrifugación y la mayor parte de proteína tip libre es retenida en el sobrenadante.

La proteína tip puede ser completamente extraída por SDS al 2% en 25 mM de tampón Tris sin despolimerización de bastoncillos de pilus, pero el SDS puede dañar la actividad de la proteína. El SDS al 0,1% solo extrae alrededor del 20-30% de proteína tip total, sin embargo, la proteína mantiene la actividad biológica. Los resultados también demostraron que 4 M de urea y 2 M de GuHCl en tampón a pH 2,0 puede extraer parcialmente proteína tip de bastoncillos de pilus sin despolimerización.

Purificación de proteína tin

1. Mezclar proteína tip concentrada con tampón de tratamiento de muestra de SDS-PAGE sin SDS y \beta-mercaptoletanol. La proporción es de 2,5 ml de preparación de pilus para 0,3 ml de tampón de tratamiento de muestra.

2. Cargar la muestra para 12% de SDS-PAGE (0,1% SDS) en Prep-Cell (Bio-Rad) con la longitud de gel de apilado de 0,8-1,0 cm y gel de 5 cm.

3. Poner el gel a 300 voltios con sistema de enfriamiento durante 6-8 horas, y controlar la elución a 280 nm.

4. Combinar las fracciones que contengan proteína tip y concentrar.

5. Determinar la pureza de las fracciones combinadas por mini-SDS-PAGE. La identificación de la proteína tip purificada por proteína de fusión anti-KLPl-MBP se muestra en la Figura 4. La actividad de unión de la proteína tip purificada con fantasmas de glóbulos rojos humanos se muestra en las Figuras 5 y 6. La Figura 7 compara las proteínas de adhesina de pili tipo LKP diferente por SDS/PAGE.

Ejemplo 8 Análisis de serotipo

El bacterioplex de Haemophilus influenzae (Hflu) es un complejo diferenciado de fases bacterianas, o tipos celulares, socialmente organizados para facilitar los apéndices de proteína expresados sobre la superficie de Hflu, y también secretados de Hflu en forma libre, que portan determinantes de adhesión específica para unirse a los receptores de membrana celular humana. Los pili adaptan las bacterias patógenas para vivir en huéspedes vertebrados mimetizando las funciones de las proteínas propias del huésped. Las funciones del pilus incluyen unir bacterias a una variedad de células y tejidos huésped y estimular el sistema inmunitario del huésped de formas que beneficien las bacterias y dañen al huésped. Los pili son factores de transmisión, virulencia, diseminación, patogenicidad e inmunidad en la mayor parte de enfermedades bacterianas.

La expresión de pili es controlada por un mecanismo de conmutación genética, variación de fase, en la cual la expresión de pilus y tipo de pilus son conmutados on y off en probabilidades que varían con, y están determinadas por, condiciones y señales en el entorno inmediato de las bacterias. Bajo algunas condiciones las probabilidades de conmutación pueden ser muy altas, tan altas como 10^{-2} por división celular bacteriana. Bajo otras condiciones ambientales la probabilidad de la conmutación de la misma fase puede ser de 10^{-6} o inferior. La conmutación de fase está acompañada por reajustes tanto reversibles como irreversibles en el ADN de operones de pilus. La conmutación de fase durante el cultivo in vitro va frecuentemente acompañada de supresiones para genes de operón de pilus tales que las fases no piliadas permanecen irreversibles en esta fase.

Por purificación de pili de Hflu desde distintos aislados y produciendo antisueros para preparaciones purificadas, se han identificado hasta ahora serotipos de pilus de LKP distintos. La expresión de los serotipos diferentes se usa como marcador para identificar las fases de piliación diferentes del bacterioplex de Hflu.

TABLA 1

		L = 1	L = 2	L = 3	D = 3	D = 4
LKP1	N = 4	0	0	4	0	4
LKP2	N - 2	0	1	1	0	2
LKP3	N = 0	0	0	0	0	0
LKP4	N = 1	0	1	0	0	1
LKP5	N = 5	0	1	4	0	5
LKP6	N = 12	0	2	8	1	9
LKP7	N = 3	0	0	2	0	2
LKP8	N = 0	0	0	0	0	0

TABLA 1 (continuación)

		L = 1	L = 2	L = 3	D = 3	D = 4
LKP9	N = 0	0	0	0	0	0
LKP10	N = 26	1	8	17	2	24
LKP11	N = 22	0	6	16	0	22
LKP12	N = 12	0	3	7	2	8
LKP13	N = 0	0	0	0	0	0
LKP14	N = 9	1	2	6	1	8
LKP15	N = 6	0	5	1	0	6
LKP16	N = 9	0	4	5	3	6
LKP17	N = 17	0	6	11	2	15
LKP18	N = 12	1	4	7	1	11
LKP19	N = 3	0	1	3	0	3
LKP20	N = 15	1	6	8	3	12
Total de cepas = 77	4	50	99	15	136
L = 1 es longitud < 0,2 \mu
L = 2 es longitud < 0,2 \mu < 0,5 \mu
L = 3 es longitud < 0,5 \mu
D = 3 tiene un diámetro de 3 nm ("fino")
D = 4 tiene un diámetro de 4 nm ("grueso")

La frecuencia de cada serotipo LKP fue determinada por todos los cultivos serotipables y para todos los cultivos expresando por tipos de conteo tanto expresores simples como múltiples. Dieciséis de los 20 serotipos fueron encontrados en cultivos piliados típicamente de LKP, y el 90% de estos cultivos fueron serotipables en el sistema de 20 tipos. La frecuencia de distribución de serotipos para estos cultivos se muestra en la Tabla 1.

Tres genes de operón de pilus de LKP diferente fueron seleccionados, el gen de pilina, el gen de anclaje y el gen adhesina, que tenían todos similitud de secuencia exhibida entre diferentes serotipos en alineaciones de secuencia múltiples, pero también fueron característicos de los pili LKP de Hflu. Se seleccionaron secuencias de estos genes que servirían como secuencias iniciadoras adecuadas flanqueando cada gen para su uso en una reacción de PCR.

1

Los tres pares de iniciadores fueron todos sintetizados y usados en una reacción PCR para amplificar segmentos de ADN extraído de aislados de Hflu.

Los datos muestran la presencia de operones de pilus LKP en cepas de Haemophilus influenzae probadas como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2

Correlación entre la presencia de material genético de operón de pilus de LKP en H. aislados de influenzae y
los parámetros de LKP expresados de piliación y hemoaglutinación
Parámetro LKP	Total	PCR	PCR	PCR	Fracción	Porcentaje
		Hecho			PCR +	PCR +
Pilus longitud 0	74	68	59	9	59/68	87%
Pilus longitud 3	101	93	82	11	82/93	88%
HA+	148	139	115	24	115/139	83%
HA-	166	149	119	30	119/149	80%
Pilus diám. 3	40	38	28	10	28/38	74%
Pilus diám. 4	172	159	136	23	136/159	86%
Serotipable	189	173	149	24	149/173	86%
No serotipable	54	63	53	10	53/63	84%
1. Longitud de pilus 0 significa no piliado.
2. longitud 3 significa >0,5 micras (más largo, típico de pili LKP).
3. \begin{minipage}[t]{155mm}HA+ significa positivo para hemoaglutinación de glóbulos rojos humanos; típico de pili LKP. (Estos aislados no son persistentes por definición.)\end{minipage}
4. \begin{minipage}[t]{155mm}HA- significa negativo para hemoaglutinacion de glóbulos rojos humano; típico de pili SNN. (Estos aislados son persistentes puesto que todos los aislados fueron hemoadsorbidos al menos una vez.)\end{minipage}
5. El diámetro de pilus 3 significa que los aislados expresan pili con diámetros típicos de pili SNN.
6. El diámetro de pilus 4 significa que los pili expresan aislados con diámetros típicos de pilus LKP.
7. \begin{minipage}[t]{155mm}Serotipable significa el aglutinado de aislados bajo condiciones estándar con al menos uno de los antisueros tipo pilus LKP en el sistema 1-20.\end{minipage}
8. No serotipable significa el aislado no aglutinado con cualquier antisuero tipo pilus LKP en el sistema 1-20.

Ejemplo 9 Ensayo de hibridación para construcción de sonda de ensayo de Haemophilus influenzae

Un fragmento de aproximadamente 1100 bp desde plásmido pHF1 (Karasic, R. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (Suppl.): S62-65 (1988)) que contiene el operón de serotipo LKP1 fue amplificado por PCR usando iniciadores que hibridizan en los extremos 5' y 3' del gen hipA. Este gen codifica la proteína adhesina tip de los pilus LKP1. La reacción PCR incluyó digoxigenina etiquetada de dUTP junto con los cuatro dNTP para etiquetar el producto de la reacción PCR con digoxigenina. Esta sonda fue sometida a electroforesis sobre un gel agarosa y purificada por corte de la banda \sim1,2 kb band y extracción del ADN por métodos estándar. La sonda fue redisuelta en 30 \mul de tampón apropiado.

Ensayo de hibridación

Once aislados clínicos de Haemophilus influenzae elegidos aleatoriamente fueron cultivados en placas BHI-XV a 37ºC con 5% de CO_{2} y también puestos sobre agar BHI. Todos los aislados crecieron solo sobre la placa BHI-XV, indicando que eran H. influenzae. Los aislados incluyeron 2 cepas Hib y 9 NTHi. Las cepas fueron inoculadas en una membrana de nilón colocada sobre agar BHI-XV. Cinco aislados clínicos de otro patógeno respiratorio, Moraxella catarrhalis, fueron también rociados sobre el filtro. Las bacterias fueron cultivadas toda una noche a 37ºC en 5% de CO_{2}. Tras el cultivo, 2 cepas de Bordetella pertussis fueron rociadas sobre el filtro. Los filtros fueron procesados para hibridación de colonia según el método de Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1991, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). Los filtros fueron bloqueados en solución de prehibridación tal como describe Boehringer-Mannheim para el sistema Genius^{TM} a 65ºC durante 3 horas. Los residuos de colonia fueron extraídos mediante frotado suave con pañuelos de papel húmedos. La sonda, 30 \mul, fue añadida a 5 ml de solución de prehibridación y hervida durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN. La sonda fue inmediatamente añadida al filtro y se dejó hibridizar toda una noche a 65ºC. Los filtros fueron lavados en 2X SSC, 0,1% SDS, 2 veces durante 5 min/lavado a temperatura ambiente, seguido de 2 lavados de 15 minutos con 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65ºC. La sonda de unión se detectó usando fosfatasa alcalina etiquetada con anticuerpos antidigoxigenina tal como describe el fabricante. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Hibridación de sonda tip LKP1 dig-etiquetada para aislados clínicos aleatorios

\hskip1cm Número de Resultados Positivos
Cepa bacteriana	Señal fuerte	Señal débil	Ninguna	Total
				señal
	\hskip1cm H. influenzae	4	4	3	11
	\hskip1cm M. catarrhalis	0	0	5	5
	\hskip1cm B. perfussis	0	0	0	2

La sonda era específica para H. influenzae sin que se viera hibridación ni con M. catarrhalis ni con B. pertussis.

Ensayo de hibridación de cepas no tipificables de pili de Haemophilus influenza

Diez pili LKP que expresan cepas NTHi que expresan diferentes serotipos de pili LKP, junto con Eagan Hib, fueron cultivados sobre un filtro de nilón superpuesto sobre agar chocolate a 37ºC en 5% de CO_{2}. También se incluyó un aislado de NTHi adicional. Tras el cultivo, dos cepas aparecieron amarillas sobre el filtro, lo cual sugiere bacterias no Haemophilus, así que se probaron por crecimiento sobre BHI y BHI-XV. Este experimento demostró que son contaminantes y no NTHi. El filtro fue extraído desde el agar y procesado tal como se describe más arriba. La sonda desde el primer experimento fue hervida de nuevo y añadida al filtro como antes, excepto que la temperatura de hibridación fue bajada a 62ºC. El filtro fue lavado como antes excepto que la temperatura de lavado también fue de 62ºC. La sonda de unión fue detectada como se indica más arriba. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Hibridación de sonda TIP TKP dig-etiquetada a cepas tipo LKP

Serotipo LKP	Señal con sonda	Ninguna señal	ID de cepa
		con sonda
5	Fuerte		NTHi
2	Moderado		NTHi
9	Fuerte		NTHi
1	Fuerte		NTHi
6	Moderado		NTHi
13	Fuerte		NTHi
4	Fuerte		NTHi
7	Moderado		NTHi
		X	Contaminante
		X	Contaminante
10	Débil		NTHi
4	Fuerte		Hib

Los resultados mostrados más arriba establecen que las sondas de ADN hibridizaron selectivamente a Haemophilus influenzae.

Aquellos familiarizados con la técnica reconocerán, o serán capaces de distinguir, usando solo la experimentación rutinaria, muchos equivalentes para las incorporaciones específicas descritas aquí.

TABLA 5

2

TABLA 5 (continuación)

3

TABLA 5 (continuación)

4

TABLA 5 (continuación)

5

TABLA 5 (continuación)

6

TABLA 5 (continuación)

7

8

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Wyeth Holdings Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Wyeth Holdings Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: Five Giralda Farms

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(C)

CIUDAD: Madison

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(D)

ESTADO/PROVINCIA: New Jersey

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL/ZIP: 07940

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Bactex Inc.

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(B)

DIRECCIÓN: 4516 Henry Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Pittsburgh

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO/PROVINCIA: Pennsylvania

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL/ZIP: 15213

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(i)

INVENTOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Bruce A. Green

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(B)

DIRECCIÓN: 40 Northfield Gate

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(C)

CIUDAD: Pittsford

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(D)

ESTADO/PROVINCIA: New York

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL/ZIP: 14534

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

INVENTOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Charles C. Brinton, Jr.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 4913 Simmons Drive

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(C)

CIUDAD: Export

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO/PROVINCIA: Pennsylvania

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL/ZIP: 15632

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína adhesina tip de LKP de Haemophilus influenzae no tipificable y ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 530 Virginia Road, P.O. Box 9133

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Concord

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachusetts

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 01742-9133

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Ordenador compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/08789

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 de julio de 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/277,321

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-JUL-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/473,750

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Carroll, Alice O.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33,542

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: ACC94-02BA PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-861-6240

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 617-861-9540

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 217 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 216 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 214 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 9432

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN complemento (1882..2532)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN 2854..3630

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN 4016..6238

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN 6259..6873

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN 6955..8265

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN 8395..9342

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 217 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 259 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 741 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 205 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 437 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 316 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 670 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCTGGATC CGTTTCTCTT GCATTACATT AGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGGAATTC GGAAGCGTTT TTTACTTTTT TTGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACGAATTCT GCTGTTTATT AAGGCTTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGGATCC TTGTAGGGTG GGCGTAAGCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGGATCC TTGTAGGGTG GGCGTAAGCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACGGATTCG TTTGCTGTTT ATTAAGCCTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACGGATTCG TTTGCTGTTT ATTAAGCCTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAAATACG CAACCGCTAAA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGACGAAGA TGGTACAACG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares básicos 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAGCTTGG CCCGACATTA TTATTGATAT GACA

\hfill

34

Claims (6)

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo consistente en:

(i) una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo consistente en:

a)

nucleótidos entre el 6955 y el 8265 de la Tabla 5;

b)

secuencias de ácido nucleico que hibridizan con los nucleótidos de a) bajo condiciones de alta rigurosidad; y

c)

secuencias de ARN transcritas desde los nucleótidos de a), o b) ; y

(ii) una secuencia de ADN aislada que hibridiza con una secuencia de ADN que codifica proteína adhesina tip de LKP de serotipo 1 de Haemophilus influenzae no tipificable bajo condiciones de alto rigurosidad, donde la secuencia de ADN que codifica la proteína adhesina tip LKP de serotipo 1 consiste en los nucleótidos del 6955 al 8265 de la Tabla 5.

2. Una proteína de Haemophilus influenzae no tipificable aislada, que comprende: Una proteína adhesina tip LKP de serotipo 1 que tiene la secuencia de aminoácido codificada por el ORF de nucleótidos entre el 6955 hasta el 8265 de la Tabla 5, y fragmentos biológicamente activos de la misma que se unen a la preparaciones fantasma de glóbulos rojos nativos pero no se unen a fantasmas de glóbulos rojos desnaturalizados.

3. Un vector de expresión recombinante que comprende un inserto de ADN, donde dicho inserto de ADN hibridiza con el complemento de una secuencia de nucleótido que codifica proteína adhesina tip LKP de Haemophilus influenzae bajo condiciones de alta rigurosidad, consistiendo dicha secuencia de nucleótido en nucleótidos entre el 6955 hasta el 8265 de la Tabla 5, donde dicho vector de expresión expresa una proteína adhesina tip de Haemophilus influenzae no tipificable en una célula procariótica o ecuariótica.

4. El vector de expresión recombinante de la Reivindicación 3 donde el inserto de ADN codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácido codificada por el ORF de los nucleótidos entre el 6955 hasta el 8265 de la Tabla 5.

5. Una célula huésped procariótica o eucariótica transformada con un vector de expresión de la Reivindicación 3.

6. Un método in vitro para producir proteína de Haemophilus influenzae no tipificable de la Reivindicación 2 usando el vector de expresión recombinante de la Reivindicación 3 en una célula huésped procariótica o eucariótica que comprende transinfectar la célula huésped con el vector de expresión recombinante y mantener la célula huésped transinfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas de pilus LKP de Haemophilus influenzae no tipificable en la célula huésped.