ES2257780T3

ES2257780T3 - Mutaciones en los genes de susceptibilidad a la diabetes factor nuclear de hepatocito (hnf) hnf-1alfa, hnf-1beta y hnf-4alfa.

Info

Publication number: ES2257780T3
Application number: ES97941508T
Authority: ES
Inventors: Graeme I. Bell; Kazuya Second Dept. Of Internal Medicine Yamagata; Naohisa Oda; Pamela J. Kaisaki; Hiroto The First Department Of Medicine Furuta; Stephan Menzel; Yukio Horikawa
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1996-09-10
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2017-09-10
Also published as: US20030224355A1; US6187533B1; EP0920534A1; CA2265480A1; DE69734986T2; CA2698393A1; DE69734986D1; WO1998011254A1; EP0920534B1; CA2265480C; AU4340297A; ATE314487T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL AL CAMPO DE LA DIABETES. MAS CONCRETAMENTE, TRATA DE LA IDENTIFICACION DE LOS GENES RESPONSABLES DE LA DIABETES MELLITUS NO INSULINO-DEPENDIENTE (DMNID) PARA USO EN DIAGNOSTICO Y TERAPIA. LA PRESENTE INVENCION DEMUESTRA QUE EL LUGAR MODY3 ES, DE HECHO, EL GEN FNH-1 AL , EL LUGAR MODY4 ES FNH-1 BE Y EL LUGAR MODY1 ES EL GEN FNH-4 AL . LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS AL DESCUBRIMIENTO DE QUE EL ANALISIS DE MUTACIONES EN LOS GENES FNH-1 AL , FNH-1 BE Y FNH-4 AL PUEDE SER UN DIAGNOSTICO DE LA DIABETES. LA INVENCION CONTEMPLA IGUALMENTE PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR LA DIABETES, EN VISTA DEL HECHO DE QUE LAS MUTACIONES DE LOS GENES FNH-1 AL , FNH-1 BE Y FNH-4 AL PUEDEN PROVOCAR LA DIABETES.

Description

Mutaciones en los genes de susceptibilidad a la diabetes factor nuclear de hepatocito (HNF) HNF-1\alpha, HNF-1\beta y HNF-4\alpha.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la diabetes. Más concretamente, tiene que ver con la identificación de los genes responsables de la diabetes para el uso en el diagnóstico y la terapéutica.

2. Descripción de la técnica relacionada

La diabetes es una causa principal de los problemas sanitarios en los Estados Unidos. La diabetes mellitus no dependiente de insulina ("NIDDM en sus siglas en Inglés" también referida como diabetes de tipo 2) es un trastorno sanitario público principal de la homeostasis de glucosa que afecta aproximadamente al 5% de la población general en los Estados Unidos. Las causas de la hiperglucemia por ayuno y/o la intolerancia a la glucosa asociada con esta forma de diabetes no son bien comprendidas.

Clínicamente, la NIDDM es un trastorno heterogéneo caracterizado por hiperglucemia crónica que conduce a lesiones micro- y macrovaculares progresivas en los sistemas cardiovascular, renal, y visual así como a neuropatía diabética. Por estas razones, la enfermedad puede estar asociada con morbidez y mortalidad tempranas.

Los subtipos de NIDDM pueden ser identificados basándose al menos hasta cierto punto en el momento del comienzo de los síntomas. El tipo principal de NIDDM tiene su comienzo hacia la mitad de la vida o más tarde. La NIDDM de comienzo temprano o la diabetes que comienza en la madurez de los jóvenes ("MODY en sus siglas en Inglés") comparten muchas características con la forma o las formas más comunes de NIDDM cuyo comienzo ocurre hacia la mitad de la vida. La diabetes que comienza en la madurez de los jóvenes (MODY) es una forma de diabetes mellitus (NIDDM) de (Tipo 2) no dependiente de insulina que está caracterizado por una edad temprana de comienzo, usualmente antes de los 25 años de edad, y un modo dominante autosómico de herencia (Fajans 1989). Excepto por estas características, las características clínicas de los pacientes con MODY son similares a las de aquellos con la forma o las formas de NIDDM de comienzo tardío más comunes.

Si bien las formas de NIDDM no manifiestan herencia Mendeliana sencilla, la contribución de la herencia al desarrollo de la NIDDM ha sido reconocida durante muchos años (Cammidge 1928) y el alto grado de concordancia de NIDDM en parejas de gemelos monocigóticos (Barnett y col. 1981) indica que los factores genéticos juegan un papel importante en su desarrollo.

La MODY está caracterizada por la edad temprana de comienzo que es durante la infancia, la adolescencia o la juventud y usualmente antes de la edad de 25 años. Tiene un modo claro de herencia siendo dominante autosómica. Entre las características adicionales se incluyen una elevada penetrancia (de la sintomatología), y la disponibilidad de las genealogías multigeneracionales para los estudios genéticos de la NIDDM. La MODY se produce en todo el mundo y se ha encontrado que es un trastorno fenotípicamente y genéticamente heterogéneo.

Se han identificado varias formas de MODY genéticamente distintas. Los estudios genéticos han mostrado una estrecha conexión entre MODY y los marcadores de ADN del cromosoma 20, siendo esta la localización del gen MODY1 (Bell y col.; 1991; Cox y col., 1992). MODY2 está asociada con mutaciones en el gen de la glucoquinasa (GCK) localizadas en el cromosoma 7 (Froguel y col. 1992 y 1993). Estudios recientes de los ligamientos han mostrado la existencia de una forma adicional de MODY que ha sido denominada MODY3 (Vaxillaire y col., 1995). Se ha demostrado que MODY3 está ligada al cromosoma 12 y está localizada en una región 5 cM entre los marcadores D12S86 y D12S807/D12S820 del cromosoma (Menzel y col., 1995).

Si bien está bien establecido que MODY2 está asociada con mutaciones en GCK aún no existe información como para identificar los otros genes MODY. Existe una clara necesidad de identificar estos genes y las mutaciones que producen los estados de enfermedad. La identificación de estos genes y de sus productos facilitará una mejor comprensión de los estados de enfermedad asociados con las mutaciones en estos genes y tiene importantes implicaciones en la diagnosis y la terapia de la MODY.

Puesto que una comprensión de la base molecular de la diabetes en general y de la MODY específicamente pueden facilitar el desarrollo de nuevas estrategias de terapia para el tratamiento de estos trastornos, se necesitan estudios para identificar los genes con susceptibilidad a la diabetes asociados con MODY. Por otra parte, se necesitan los métodos para detectar los individuos con propensión a desarrollar semejantes enfermedades. Cuando sea posible, se deben determinar los mecanismos moleculares que sustentan la lesión genética con el fin de permitir la diagnosis y la terapia específicamente dirigida.

N. Miura y K. Tanaka, 1993, en Nucleic acids research 21, 3731-3736 describen el aislamiento y la caracterización de la región promotora del gen HNF-1 de rata en células HepG2.

En la Patente de los Estados Unidos Número 5.403.712 se describe un método para aislar el cofactor DCoH que es capaz de estabilizar dímeros del factor de transcripción HNF1\alpha.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de los autores de la presente invención de que el locus MODY3 es el gen HNF1\alpha, el locus MODY1 es el gen HNF4\alpha y el locus MODY4 es el gen HNF1\beta. La invención se refiere adicionalmente al descubrimiento de que el análisis de las mutaciones en los genes HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha puede ser diagnostico para la diabetes. En la invención también se contemplan los usos para preparar un medicamento para tratar la diabetes en vista del hecho de que las mutaciones en HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha pueden ocasionar diabetes.

En una realización, la invención contempla los métodos para rastrear la diabetes mellitus. Estos métodos comprenden: obtener una muestra de ácido nucleico de un animal; y analizar los ácidos nucleicos para detectar una mutación en un segmento nucleico que codifica HNF (es decir, HNF1\alpha; HNF1\beta y HNF4\alpha); donde una mutación en el ácido nucleico que codifica HNF es indicativa de propensión a la diabetes no dependiente de insulina.

En ciertas realizaciones el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha. En vista del descubrimiento de los autores de la presente invención de que el locus MODY3 es HNF1\alpha, una mutación en el ácido nucleico que codifica HNF1\alpha es indicativa de propensión a la diabetes. En algunas realizaciones preferidas actualmente, el ácido nucleico que codifica HNF1\alpha está localizado en el cromosoma humano 12q, que es el sitio de localización del locus MODY3. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF4\alpha. En vista del descubrimiento de los autores de la presente invención de que el locus MODY1 es HNF4\alpha, una mutación en el ácido nucleico que codifica HNF4\alpha es indicativa de propensión a la diabetes. En algunas realizaciones preferidas actualmente, el ácido nucleico que codifica HNF4\alpha está localizado en el cromosoma humano 20, que es la localización del locus MODY1.

Es importante observar que los términos NIDDM, MODY, MODY1, MODY3, y MODY4 se utilizan para designar los estados de enfermedad de la diabetes, y el uso de semejante nombre concreto puede no siempre representar la misma causa de este estado de enfermedad. Los autores de la presente invención han descubierto que mutaciones en HNF4\alpha pueden conducir al estado de enfermedad MODY1; no obstante, no todas las mutaciones en HNF4\alpha que conducen a la diabetes podrían ocasionar un estado de enfermedad "MODY1". Por el contrario, no todos los estados de enfermedad de diabetes ocasionados por una mutación en HNF4\alpha podrían ser considerados un estado de enfermedad MODY1. Por consiguiente, los Solicitantes prefieren utilizar, en algunos casos, "diabetes HNF4\alpha" para marcar cualquier estado de enfermedad diabético ocasionado por una mutación o funcionamiento defectuoso de HNF4\alpha, incluso aquellos que no manifiestan todos, o ninguno, de los estados de enfermedad MODY1. Asimismo, los Solicitantes pueden utilizar "diabetes HNF1\alpha" y "diabetes HNF1\beta" en lugar de "MODY3" y "MODY4", respectivamente.

El ácido nucleico que se va a analizar puede ser ARN o ADN. El ácido nucleico puede ser analizado en un soporte de tejido completo, un producto homogeneizado, o, preferiblemente, aislado del tejido que vaya a ser analizado. En algunas realizaciones preferidas, la etapa de análisis del ácido nucleico que codifica HNF comprende la secuenciación del ácido nucleico que codifica el HNF para obtener una secuencia, la secuencia puede ser comparada después con la secuencia de un ácido nucleico natural de HNF para determinar una mutación. Semejante secuencia de ácido nucleico natural de HNF1\alpha puede tener la secuencia mostrada en la SEC ID NUM.1. Semejante secuencia de ácido nucleico natural de HNF4\alpha tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NUM: 78.

El método permite la diagnosis casi de cualquier mutación, incluyendo, por ejemplo, mutaciones puntuales, mutaciones por traslocación, mutaciones por deleción, y mutaciones por inserción. El método de análisis puede comprender PCR, un análisis de protección de ARNasa, un procedimiento RFLP, etc. Utilizando este método, los autores de la presente invención han diagnosticado una variedad de mutaciones HNF1\alpha, incluyendo las mostradas en la Tabla 8. En las realizaciones preferidas las mutaciones se producen en los codones 17, 7, 27, 55/56, 98, 131, 122, 142, 129, 131, 159, 171, 229, 241, 272, 288, 289, 291, 292, 273, 379, 401, 443, 447, 459, 487, 515, 519, 547, 548 o 620 de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, por ejemplo, que tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 1. En otras realizaciones preferidas se produce una mutación en la región aceptora de empalme del intrón 5 y el exón 6 de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha. En otras realizaciones, la mutación se produce en la región aceptora de empalme del intrón 9 de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha. En otras realizaciones, la mutación se produce independientemente, en el intrón 1, el intrón 2, el intrón 5, el intrón 7 o el intrón 9 del gen HNF1\alpha. Los autores de la presente invención han encontrado también una variedad de mutaciones HNF4\alpha, incluyendo aquellas encontradas en la Tabla 10. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF4\alpha y se produce una mutación en el exón 7 del ácido nucleico que codifica HNF4\alpha. En otras realizaciones preferidas, se produce una mutación en el codón 268, 127, 130 o 154 de un ácido nucleico que codifica HNF4\alpha que tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 78.

En la invención también se contempla el uso para preparar un medicamento para tratar la diabetes en un animal que comprende: diagnosticar un animal que tenga diabetes y modular la función de HNF en el animal.

La etapa de diagnóstico de un animal con diabetes comprende frecuentemente el análisis de una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF1\alpha o de una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF4\alpha para una mutación.

La etapa de modulación de la función de HNF puede comprender proporcionar un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha al animal. En los casos en los que se busca restablecer la función normal de HNF1\alpha o HNF4\alpha, el polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha puede ser un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha natural. Por ejemplo, un polipéptido HNF1\alpha natural puede tener la secuencia de la SEC ID NUM: 2. Un polipéptido HNF4\alpha natural puede tener la secuencia de la SEC ID NUM: 79. La provisión de un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha se completa mediante una cualquiera de diversas rutas. Por ejemplo, se puede inducir la expresión de un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha, siendo la expresión de un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha codificada en el genoma del animal o de un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha codificada por un ácido nucleico proporcionado al animal. La provisión de un polipéptido HNF1\alpha o HNF4\alpha se puede completar mediante un método que comprende la introducción de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha o HNF4\alpha en el animal, por ejemplo, inyectando el ácido nucleico que codifica HNF1\alpha o HNF4\alpha al animal.

La modulación de la función de HNF en el animal puede comprender proporcionar un modulador de la función de HNF1\alpha o de HNF4\alpha al animal. Semejantes moduladores se encuentran en la naturaleza de los fármacos y pueden ser, por ejemplo, HNF4, HNF6, HNF3 o cualquier otro péptido o molécula que regule HNF1\alpha. Estos moduladores pueden ser formulados en un compuesto farmacéutico para la liberación en el animal. El modulador de la función de HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha puede ser un agonista o antagonista de HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha. El modulador puede modular la transcripción de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha, la traducción de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha, o el funcionamiento del polipéptido HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha.

En la invención también se contemplan los métodos para rastrear los moduladores de la función de HNF que comprenden: obtener un polipéptido HNF, es decir un polipéptido HNF1\alpha, HNF\beta o HNF4\alpha; determinar una actividad normalizada del HNF; poner en contacto el polipéptido con un supuesto modulador; y someter a ensayo el cambio en la actividad normalizada del polipéptido; identificar los candidatos que ocasionan el cambio de perfil de la actividad normalizada. En algunos métodos preferidos, el perfil de la actividad normalizada de un polipéptido HNF1\alpha se determina midiendo la unión del polipéptido HNF1\alpha a un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 9. Para facilitar la medición de la actividad de HNF1\alpha, el segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 9 o el polipéptido HNF1\alpha puede comprender una marca detectable. En algunos métodos preferidos, el perfil de la actividad normalizada del polipéptido HNF1\alpha se determina midiendo la unión del polipéptido HNF4\alpha a un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 85. Para facilitar la medición de la actividad HNF4\alpha, el segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 85 o el polipéptido HNF4\alpha puede comprender una marca detectable. En otras realizaciones, el perfil la de actividad normalizada de un polipéptido HNF se determina determinando la capacidad de un polipéptido HNF1\alpha para estimular la transcripción de un gen indicador, colocado el gen indicador operativamente bajo el control de un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 1. En otras realizaciones, el perfil de la actividad normalizada de un polipéptido HNF se determina determinando la capacidad de un polipéptido HNF4\alpha para estimular la transcripción de un gen indicador, colocado el gen indicador operativamente bajo el control de un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 78. Se contemplan análisis similares para el polipéptido HNF1\beta.

La invención es ilustrada mediante los métodos de rastreo de los moduladores de la función del polipéptido HNF que comprenden: obtener un segmento de ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha; determinar una actividad de transcripción y traducción de la secuencia de ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha; poner en contacto el segmento de ácido nucleico que codifica HNF1\alpha o HNF4\alpha con un supuesto modulador; mantener el segmento de ácido nucleico y el supuesto modulador bajo las condiciones que permitan normalmente la transcripción y la traducción de HNF1\alpha o HNF4\alpha; y analizar un cambio en la actividad de la transcripción y la traducción.

Se proporciona la ilustración de la preparación de los moduladores de HNF tales como los moduladores de MODY3/HNF1\alpha, los moduladores de MODY4/HNF1\beta y los moduladores de MODY1/HNF4\alpha. Semejante modulador de HNF puede ser preparado o preparable mediante un procedimiento que comprende rastrear los moduladores de la función de HNF que comprende: obtener un polipéptido HNF; determinar un perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF; poner en contacto el polipéptido HNF con un supuesto modulador; y someter a ensayo el cambio en el perfil de actividad normalizada. Un modulador de HNF preparado mediante un procedimiento que comprende rastrear los moduladores de la función de HNF comprende: obtener un segmento de ácido nucleico que codifica HNF; determinar una actividad de transcripción y traducción normalizada de la secuencia de ácido nucleico que codifica HNF; poner en contacto el segmento de ácido nucleico que codifica HNF con un supuesto modulador; mantener el segmento de ácido nucleico y el supuesto modulador bajo las condiciones que permitan normalmente la transcripción y la traducción de HNF; y analizar un cambio en la actividad de la transcripción y la traducción.

Para la ilustración de la invención se proporcionan polinucleótidos aislados y purificados que codifican un polipéptido HNF. Semejantes polinucleótidos pueden ser: un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha, una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF1\beta, o un ácido nucleico que codifica HNF4\alpha. Alternativamente, el polinucleótido codifica un HNF1\alpha que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID NUM: 127. Alternativamente, el polinucleótido puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF1\alpha que tiene una secuencia de la SEC ID NUM: 126. Alternativamente, el polinucleótido codifica un HNF1\beta que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID NUM: 139. Alternativamente, el polinucleótido puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF1\beta que tiene una secuencia de la SEC ID NUM: 128. El polinucleótido puede codificar un HNF4\alpha que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID NUM: 140. Alternativamente, el polinucleótido puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica HNF4\alpha que tiene una secuencia de la SEC ID NUM: 130.

Otras realizaciones comprenden segmentos de ácidos nucleicos aislados y purificados que comprenden 10, 14, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 ácidos nucleicos contiguos idénticos a la secuencia de la SEC ID NUM: 128 o de la SEC ID NUM: 126 o al complemento de estas secuencias. Estos segmentos de ácidos nucleicos pueden ser utilizados por los expertos en la técnica como sondas de hibridación, cebadores para la PCR, para la expresión de polipéptidos HNF, para la expresión de otros polipéptidos, etc. En algunas realizaciones, el segmento codifica un polipéptido HNF completo. Son de particular interés los promotores para HNF1\alpha y HNF1\beta, que se describen en las SEC ID NUMS: 126 y 128 respectivamente y en las Fig. 26 y 27, respectivamente y se tratan en otra parte en esta solicitud. Estos promotores pueden ser utilizados por los expertos en la técnica en muchas aplicaciones diversas.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser entendida mejor mediante la referencia a uno o más de estos dibujos combinados con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas aquí.

Fig. 1. Genealogías de las familias MODY3. Los individuos estudiados en el Clinical Research Center en la Universidad de Chicago son indicados mediante MD-1-5 y 8-13 y las de NIDDM, IGT y NGT se muestran mediante símbolos negros, símbolos sombreados y símbolos claros, respectivamente. Los asteriscos indican que estos individuos han heredado el haplotipo de riesgo asociado con MODY3 en esa familia. Se han descrito los genotipos y los haplotipos para la familia P (Menzel y col., 1995) y la puntuación LOD por pares entre MODY y el haplotipo D12S76/D12S321 en esta familia es de 2,06 a una fracción de recombinación de 0,00. La puntuación LOD por pares entre MODY y D12S76 en genealogías F549 es de 0,65 a una fracción de recombinación de 0,00 (Vaxillaire y col., 1995). Las genealogías BDA1 y BDA12 no han sido descritas previamente. La MODY segrega simultáneamente con marcadores estrechamente conectados a MODY3 en estas familias con puntuaciones LOD por pares entre MODY y D12S86 de 1,94 y 0,60, respectivamente, a una fracción de recombinación de 0,00.

Fig. 2. Perfiles medios de glucosa (A), insulina (B) y tasa de secreción de insulina (ISR) (C) en 7 sujetos MODY3 diabéticos (\boxempty), 6 sujetos MODY3 no diabéticos (\ding{115}) y 6 sujetos de control (o) durante los estudios de infusión de glucosa por etapas. Al cabo de un período de 30 minutos para la toma de muestras en la línea base, la glucosa fue infundida a velocidades de 1, 2, 3, 4, 6, y 8 mg\cdotkg^{-1}\cdotmin^{-1}. Cada velocidad de infusión fue administrada durante un período de 40 minutos y se midieron la glucosa, la insulina y el péptido C a los 10, 20, 30 y 40 minutos de cada período.

Fig. 3. Relación entre las concentraciones medias de glucosa en plasma y la ISR durante los estudios de infusión de glucosa por etapas en 7 sujetos MODY3 diabéticos (\boxempty ), 6 sujetos MODY3 no diabéticos (\ding{115}) y 6 sujetos de control (o). Los niveles más bajos de glucosa y la ISR se midieron en condiciones basales, y los niveles subsiguientes se obtuvieron durante las velocidades de infusión de glucosa de 1, 2, 3, 4, 6 y 8 mg\cdotkg^{-1}\cdotmin^{-1}, respectivamente.

Fig. 4. Se administraron infusiones de glucosa intravenosas graduadas a 6 controles (A), 6 sujetos MODY3 no diabéticos (B) y 7 sujetos MODY3 diabéticos (C) tras un ayuno nocturno (línea base (\ding{115})) y tras una infusión de glucosa intravenosa de 42 horas (postglucosa (\boxempty )) a una velocidad de 4-6 mg\cdotkg^{-1}\cdotmin^{-1}.

Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 5C, Fig. 5D, Fig. 5E, Fig. 5F y Fig. 5G. Genealogías MODY3 que muestran la segregación simultánea del alelo HNF1\alpha mutante con diabetes mellitus. Los varones se indican mediante símbolos cuadrados y las hembras mediante círculos. Los individuos con NIDDM se indican mediante símbolos negros y aquellos con diabetes de comienzo gestacional o con tolerancia a la glucosa debilitada mediante símbolos sombreados. Una línea diagonal a través del símbolo indica que el individuo ha fallecido.

La ID individual se indica en el ángulo superior derecho de cada símbolo y el genotipo de HNF1\alpha, si se determinara, se indica abajo: N, alelo normal; M, alelo mutante. La flecha indica el individuo de cada genealogía en el que fueron rastreadas las mutaciones. Obsérvese que algunos individuos han heredado el alelo mutante pero todavía no tienen NIDDM, usualmente debido a su corta edad (v.g. genealogía P, individuo IV-6; y genealogía Ber, individuo V-2. Asimismo, algunos individuos tienen NIDDM aunque no hereden la segregación del alelo HNF1\alpha mutante en esa familia (v.g. genealogía Ber, individuo II-2). Semejante heterogeneidad ha sido observada previamente (Bell y col, 1991) y es un reflejo de la elevada prevalencia de la NIDDM.

Fig. 6. Implicación de los factores nucleares de los hepatocitos en la diabetes.

Fig. 7. Alineamiento de la secuencia de proteínas de HNF4\alpha de humanos (h) con secuencias de especies de humano, ratón (m), Xenopus (x) y Drosófila. Los supuestos sitios de unión al ADN están subrayados y los supuestos sitios de unión al ligando están en negrita.

Fig. 8A, Fig. 8B, Fig. 8C, Fig. 8D, Fig. 8E, Fig. 8F, Fig. 8G, Fig. 8I, Fig. 8H, Fig. 8I. Secuencias de ADN para el exón 1, el exón 2, el exón 3, el exón 4, el exón 5, el exón 6, el exón 7, el exón 8, el exón 9, el exón 10 de HNF4\alpha.

Fig. 9. Mapa físico de la región MODY3 del cromosoma 12. Los clones YAC, BAC (b) y PAC (p) se representan en forma de líneas, cuya longitud refleja el número de STS y no el tamaño real. La distancia física entre STS adyacentes no ha sido determinada directamente y los STS para los cuales no se ha determinado el orden inequívocamente están indicados entre corchetes. Un círculo indica que el clon era positivo para el STS indicado y un cuadrado indica un STS derivado del extremo de un clon específico. Algunos YAC contienen grandes deleciones internas que son indicadas entre corchetes. Los STS son de GDB® y las bases de datos para los STS de GenBank.

Fig. 10. Secuencia parcial del exón 4 del gen HNF-1\alpha del individuo EA1 (genealogía Edimburgo). Se muestran las secuencias de los alelos normal y mutante. Existe una inserción de una C en el codón 291 (indicado por la punta de flecha) en el alelo mutante produciendo un desplazamiento del marco y la terminación prematura.

Fig. 11. Secuencia de ADNc de HNF1\alpha que indica la posición de los exones.

Fig. 12. Modelo de HNF-4\alpha humano que muestra los diferentes patrones de empalme alternativo y las estructuras de las diferentes formas de HNF-4\alpha que pueden ser generadas mediante empalme alternativo. Se muestran los aminoácidos que definen los límites de algunas de las regiones de la proteína. DBD y LBD corresponden a los dominios de unión al ADN y al ligando de HNF-4\alpha, respectivamente.

Fig. 13. Comparación de las secuencias de las regiones promotoras de los genes HNF-4\alpha humano y de ratón (SEC ID NUM: 135 y SEC ID NUM: 137, respectivamente). Los restos idénticos se muestran en recuadros. Se subrayan los sitios de unión para los factores de transcripción que pueden regular la expresión de HNF-4\alpha. Los asteriscos indican el sitio de inicio de la transcripción pronosticado basado en el estudio del gen HNF-4\alpha de ratón (Zhong y col., 1994). La región promotora mínima requerida para la expresión de alto nivel del gen de ratón en células de hepatoma se muestra mediante sombreado. Se indica el codón ATG que define el comienzo de la traducción. La punta de flecha muestra el polimorfismo de ADN encontrado en la región promotora del probando de la familia J2-96. Los números de acceso GenBank para la secuencia promotora de ratón son S74519 y S77762.

Fig. 14A y Fig. 14B. Secuencia parcial del exón 4 de HNF4\alpha del paciente J2-21. Se muestran las secuencias de los alelos normal (Fig. 14A SEC ID NUM: 141 y aminoácidos correspondientes SEC ID NUM: 142) y mutante (Fig. 14B; SEC ID NUM: 143) y la flecha indica la sustitución C\rightarrowT en el codón 127.

Fig. 15. Genealogías de las familias Japonesas con mutaciones/polimorfismos en el gen HNF-4\alpha. Los individuos con diabetes se indican mediante símbolos rellenos y los individuos no diabéticos (o no sometidos a ensayo) se indican mediante símbolos claros. La flecha indica el probando. Se muestran las características clínicas de cada sujeto incluyendo la edad en el momento de la diagnosis, la edad actual y el tratamiento actual. Se marca el genotipo HNF4\alpha de los individuos sometidos a ensayo: N-normal y M-mutación/polimorfismo.

Fig. 16. Identificación de una mutación sin sentido en el gen HNF4\alpha en una familia alemana, la genealogía Dresden-11. Los miembros de esta familia con MODY y tolerancia a la glucosa debilitada se indican con símbolos de color negro y sombreados, respectivamente. Se indican la edad en el momento del diagnóstico de la diabetes mellitus, la edad actual y la terapia (OHA, agentes hipoglucémicos orales), y la naturaleza de las complicaciones (M, enfermedad macrovascular; R, retinopatía; y N, polineuropatía periférica). Se muestra el haplotipo asociado con MODY en esta familia.

Fig. 17. Secuencia parcial del exón 4 del gen HNF4\alpha del sujeto II-4 de la genealogía Dresden-11. Se indica la mutación R154X (SEC ID NUM: 144 y SEC ID NUM: 145). El intrón 4 sigue al codón para Gln, CAG.

Fig. 18A, Fig. 18B, Fig. 18C y Fig. 18D. Tolerancia oral a la glucosa sometida a ensayo en la familia Dresden-11. Se muestran los niveles de glucosa en sangre (Fig. 18A), insulina (Fig. 18B), péptido C (Fig. 18C) y proinsulina (Fig. 18D) durante el curso del ensayo de tolerancia a la glucosa. Los símbolos claros son las medias \pm EEM para los sujetos con la mutación R154X, incluyendo aquellos con diabetes y tolerancia a la glucosa debilitada, y los símbolos rellenos son las medias para los dos sujetos normales.

Fig. 19A, Fig. 19B, Fig. 19C y Fig. 19D. Efecto del bolo y la infusión de arginina, de glucosa, y de arginina durante la pinza "clamp" hiperglucémica sobre la concentración en plasma de glucosa (Fig. 19A), insulina (Fig. 19B), péptido C (Fig. 19C), y glucagón (Fig. 19D) en tres grupos de sujetos de la genealogía RW.

Fig. 20A y Fig. 20B. Respuesta insulínica aguda (Fig. 20A) y del péptido C (Fig. 20B) a la administración de bolo de arginina en 3 grupos de sujetos con la genealogía RW en la línea base durante el procedimiento de la pinza hiperglucémica. La pendiente de la línea que conecta estas respuestas insulínicas (pendiente de potenciación) fue inferior en ND[+] vs ND[-], p<0,001. La pendiente para D[+] fue la más baja.

Fig. 21. Genealogía MODY, Italy-1. Se indican los sujetos con MODY y tolerancia a la glucosa debilitada mediante símbolos rellenos y rayas cruzadas, respectivamente. Los sujetos no diabéticos (por análisis o historial) son indicados mediante símbolos claros. Las características clínicas de los sujetos se marcan debajo de los símbolos incluyendo el tratamiento actual: insulina o agente hipoglucémico oral (OHA). Se muestra el haplotipo en los marcadores D12S321-D12S76-UC-39 y el haplotipo de riesgo se marca mediante sombreado. Se muestra el genotipo HNF-1\alpha: N, normal; M, mutante (sustitución A\rightarrowC en el nucleótido 58). Aunque tratado con insulina, el valor en ayunas de péptido C del sujeto III-9 de 1,2 ng/ml indica que ella tiene MODY en lugar de diabetes mellitus dependiente de insulina.

Fig. 22. Comparación de la secuencia de la región promotora de los genes HNF-1\alpha de humano, rata, ratón, pollo y rana (SEC ID NUM: 134; SEC ID NUM: 138; SEC ID NUM: 136; SEC ID NUM: 132; SEC ID NUM: 133 respectivamente). Se muestran la sustitución A\rightarrowC en el nucleótido 58 y el sitio de unión de HNF-4\alpha. Los restos idénticos a la secuencia humana están recuadrados. Los nucleótidos se numeran con relación al sitio de comienzo de la transcripción del gen humano (indicado mediante un asterisco). El triplete ATG recuadrado es la metionina de iniciación. Los guiones indican espacios introducidos en las secuencias para generar este alineamiento.

Fig. 23. Compendio de mutaciones en el gen HNF-1\alpha humano. Este boceto muestra los exones y la región promotora como recuadros. Las mutaciones y los polimorfismos de los aminoácidos son de Yamagata y col., 1996; Lehto M. y col., 1997; Kaisaki P.J., y col., 1997; Vaxillaire y col., 1997; Frayling y col., 1997; Hansen T. y col., 1997; Urhammer y col., 1997; Glucksmann y col., 1997. Los polimorfismos de los aminoácidos son I/L27, A/V98 y S/N487. Se utilizan las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos.

Fig. 24. Secuencia parcial del exón 2 del gen HNF-1\beta del sujeto J2-20 (SEC ID NUM: 146 y SEC ID NUM: 147). Se indica la mutación C\rightarrowT en el codón 177.

Fig. 25. Genealogía J2-20. Los individuos con diabetes mellitus se indican mediante símbolos rellenos. La flecha indica el probando. Se muestran la edad presente, la edad en el momento del diagnóstico, el tratamiento actual y las complicaciones. Se marca el genotipo HNF-1\beta: N, normal; M, mutante. OHA, agente hipoglucémico oral; PDR, retinopatía diabética proliferativa; CRF, insuficiencia renal crónica; y DKA cetoacidosis diabética.

Fig. 26A-Fig. 26M. Secuencia parcial del gen HNF1\alpha humano. SEC ID NUM:126 y SEC ID NUM:127. Estas figuras describen una secuencia contigua y han sido divididas en paneles debido al tamaño de la secuencia. Se muestran el nucleótido y las secuencias de aminoácidos pronosticadas. Las secuencias exónicas e intrónicas están en mayúsculas y en minúsculas respectivamente. Se marcan el tamaño aproximado de los espacios en los intrones, cuya secuencia completa no fue determinada. En la región promotora, se indican los sitios de unión potenciales para los factores de transcripción que pueden regular la expresión de este gen, con los sitios identificados mediante la huella dactilar de la ADNasa en cursiva, aquellos identificados mediante la homología de la secuencia en tipo normal. La región mínima de los promotores se muestra en negrita. Los polimorfismos y las mutaciones en el gen HNF1\alpha identificados hasta la fecha se muestran en negrita con la denominación de la mutación marcada. Los asteriscos marcan el sitio de comienzo de la transcripción basándose en estudios del gen HNF1\alpha de rata. La letra n indica que la secuencia era ambigua en este sitio.

Fig. 27A-Fig. 27I. Secuencia parcial del gen HNF-1\beta humano. SEC ID NUM: 128, SEC ID NUM: 129, y SEC ID NUM: 139. Estas figuras representan una secuencia contigua y han sido divididas en paneles debido al tamaño de la secuencia. Se muestran el nucleótido y las secuencias de aminoácidos pronosticadas. Las secuencias exónicas e intrónicas están en mayúsculas y en minúsculas respectivamente. Se marcan el tamaño aproximado de los espacios en los intrones, cuya secuencia completa no fue determinada. En la región promotora, se indican los sitios de unión potenciales para los factores de transcripción que pueden regular la expresión de este gen, con los sitios identificados mediante la huella dactilar de la ADNasa en cursiva, aquellos identificados mediante la homología de la secuencia en tipo normal.

Fig. 28A-Fig. 28V. Secuencia parcial del gen HNF4\alpha humano. SEC ID NUM: 130, SEC ID NUM: 131, y SEC ID NUM: 140. Estas representan una secuencia contigua y han sido divididas en paneles debido al tamaño de la secuencia. Se muestran el nucleótido y las secuencias de aminoácidos pronosticadas. Las secuencias exónicas e intrónicas están en mayúsculas y en minúsculas respectivamente.

Descripción de las realizaciones ilustrativas

La presente invención tiene que ver con la detección temprana, la diagnosis, la prognosis y el tratamiento de la diabetes. La presente invención describe por primera vez las mutaciones responsables de la diabetes relacionadas con HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha. Se describen la mutación específica y la identidad de los genes de tipo salvaje correspondientes de sujetos diabéticos. Estas mutaciones son indicadores de la diabetes relacionada con HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha y son diagnósticos del potencial para el desarrollo de la diabetes. Se prevé que las técnicas descritas aquí se utilizarán también para identificar otras mutaciones en genes responsables de otras formas de diabetes.

Los expertos en la técnica comprenderán que las secuencias de ácido nucleido descritas encontrarán utilidad en una diversidad de aplicaciones en la detección, la diagnosis, la prognosis y el tratamiento de la diabetes. Entre los ejemplos de semejantes aplicaciones dentro del alcance de la presente invención se incluyen la amplificación de los marcadores de MODY utilizando cebadores específicos; la detección de marcadores de HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha mediante hibridación con sondas oligonucleotídicas; la incorporación de ácidos nucleicos aislados a vectores y la expresión de los ácidos nucleicos incorporados a los vectores en forma de ARN y proteína; el desarrollo de reactivos inmunológicos correspondientes a productos codificados por el gen; y el tratamiento terapéutico para la MODY identificada utilizando estos reactivos así como ácidos nucleicos antisentido, u otros inhibidores específicos para la MODY identificada. La presente invención describe adicionalmente los análisis de rastreo de los compuestos para aumentar la expresión génica o para combatir los efectos de los genes HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha mutantes.

A. Diabetes y MODY

La diabetes mellitus afecta aproximadamente al 5% de la población de los Estados Unidos y a más de 100 millones de personas en el mundo (King y col., 1988, Harris y col., 1992). Se necesita una mejor manera para identificar la población que tiene el riesgo de desarrollar diabetes puesto que un sujeto puede tener composiciones de glucosa en plasma normales pero puede tener el riesgo de desarrollar diabetes evidente. Estos problemas podrían ser resueltos si fuera posible diagnosticar la población susceptible antes del comienzo de la diabetes evidente. Esto no es posible en la actualidad con sujetos que tengan diabetes clásica debido a su naturaleza multifactorial.

La MODY es una forma monogénica de diabetes y en ese caso los genes responsables pueden ser estudiados más fácilmente que aquellos cuya mutación contribuye al desarrollo de una o varias formas poligénicas de este trastorno tales como la diabetes mellitus de tipo 1 y de tipo 2. Estudios recientes de sujetos con diabetes que comienza en la madurez de los jóvenes (MODY), un subgrupo de diabetes caracterizado por diabetes en la primera o segunda década de vida y herencia dominante autosómica han demostrado que MODY puede resultar de mutaciones en genes sobre el cromosoma 20 (HNF4\alpha/MODY1), el cromosoma 7 (glucoquinasa/MODY2), el cromosoma 12 (HNF1\alpha/MODY3) y el cromosoma 17 (HNF1\beta/MODY4).

Las características clínicas que se manifiestan en la diabetes de tipo HNF4\alpha, HNF1\alpha y HNF1\beta se asemejan a las observadas en pacientes con diabetes de tipo 2. Entre estas características se incluyen hiperglucemia por ayuno severo frecuente, necesidad de agentes hipoglucémicos orales, requerimientos eventuales de insulina, y complicaciones vasculares y neuropáticas (Fajans y col., 1994; Menzel y col., 1995).

Los autores de la presente invención han demostrado que los sujetos prediabéticos con mutaciones en los genes HNF1\alpha y HNF4\alpha tienen alteraciones sutiles pero importantes en el patrón de secreción de insulina estimulada por glucosa. En comparación con los sujetos de control sin historial familiar de diabetes, tenían velocidades de secreción de insulina normales a concentraciones de glucosa inferiores. No obstante, el incremento de la velocidad de secreción de insulina a partir de un incremento en la concentración de glucosa en plasma por encima de 8 mM fue inferior en sujetos con la mutación HNF1\alpha prediabéticos que en los controles (ver Fig. 2-Fig. 4).

La exposición de las células \beta normales a concentraciones crecientes de glucosa en plasma durante 42 horas ocasionaba un incremento de la sensibilidad de las células \beta a un posterior estímulo con glucosa. Tras una infusión de glucosa durante 42 horas que aumentó la concentración de glucosa en plasma a un valor medio de 7,1 \pm 1,4 mM, la velocidad de secreción de insulina de sujetos con la mutación HNF1\alpha prediabéticos aumentó en un 35% entre glucosa 5-9 mM con el consiguiente desplazamiento de la curva dosis-respuesta hacia la derecha. Cinco de los seis sujetos con la mutación HNF1\alpha prediabéticos mostraron este incremento en la velocidad de secreción de insulina, y solamente un sujeto MD13 fracasó al demostrar este efecto. La magnitud de este efecto cebador de la glucosa fue similar al encontrado en los controles.

Los sujetos con la mutación HNF1\alpha diabéticos demostraron una disminución de la secreción de insulina a lo largo del intervalo completo de las concentraciones de glucosa estudiadas. De este modo, a lo largo del intervalo de concentración entre glucosa 5 y 9 mM, los sujetos diabéticos secretaron un 50% menos de insulina que los controles y un 51% menos que los sujetos con la mutación HNF1\alpha prediabéticos. Además, el efecto cebador de la glucosa fue menor en los sujetos con diabetes evidente.

La evaluación de la resistencia a la insulina indicó que los sujetos con la mutación HNF1\alpha no eran más resistentes que los controles. De hecho, existe una tendencia hacia un menor grado de resistencia a la insulina en los sujetos con la mutación HNF1\alpha, haciendo muy improbable que la resistencia a la insulina juegue un papel principal en la patofisiología de la diabetes en estos sujetos.

Los autores de la presente invención han caracterizado recientemente las respuestas secretoras de la insulina en sujetos con la mutación HNF4\alpha y HNF1\alpha prediabéticos. Los sujetos con la mutación HNF4\alpha y HNF1\alpha prediabéticos tienen ambos una reducción de las respuestas secretoras de insulina a la glucosa que son evidentes únicamente a medida que la glucosa en plasma aumenta por encima de un umbral de 7 u 8 mM, respectivamente. Si bien en los sujetos con la mutación HNF1\alpha se conserva el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina, una infusión de glucosa a baja dosis no tiene ningún efecto significativo sobre la secreción de insulina en sujetos con la mutación HNF4\alpha prediabéticos (Byrne y col., 1995b). En sujetos con mutaciones en el gen de la glucoquinasa, la curva dosis-respuesta está desplazada a la derecha y la ISR desciende notablemente a concentraciones de glucosa por debajo de 7 mM, pero la secreción de insulina continua aumentando con concentraciones de glucosa en plasma crecientes incluso por encima de niveles de 8 mM. También resulta preservado el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina (Byrne y col., 1994). Los autores de la presente invención han realizado recientemente estudios similares en sujetos con tolerancia a la glucosa clásica de Tipo 2 y debilitada. En sujetos con IGT, si bien la curva dosis respuesta que relaciona la glucosa y la secreción de insulina estaba desplazada a la derecha, se conservaba el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina. En sujetos con diabetes de Tipo 2 evidente, el incremento de la secreción de insulina en respuesta a un incremento de glucosa estaba notablemente reducido y se perdió el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina.

Parece así que la disfunción de las células \beta juega un papel patofisiológico importante en el desarrollo de las tres formas de MODY que han sido caracterizadas hasta la fecha. No se ha identificado una fase prediabética evidente en sujetos con mutaciones en la glucoquinasa. No obstante, están presentes profundos defectos en la capacidad de las células \beta para responder al estímulo de la glucosa incluso de cara a las suaves subidas de glucosa que caracterizan a la mayoría de estos sujetos. En contraste, una fase prediabética es una característica de las formas de diabetes HNF4\alpha y HNF1\alpha. Estos sujetos prediabéticos tienen una reducción de las respuestas secretoras de insulina a las elevadas concentraciones de glucosa inducidas por la infusión de glucosa por etapas antes del comienzo de la diabetes. Los sujetos HNF4\alpha y HNF1\alpha prediabéticos pueden ser distinguidos basándose en los efectos de una infusión de glucosa de dosis baja o en la secreción de insulina. El efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina se conserva en sujetos HNF1\alpha en la fase prediabética pero se pierde tras el comienzo de la hiperglucemia evidente mientras que este efecto cebador está ausente en la diabetes HNF4\alpha incluso en la fase prediabética de la enfermedad. Las reducciones severas de las respuestas secretoras de insulina a la glucosa observadas en sujetos HNF1\alpha evidentemente diabéticos son debidas probablemente en parte a los efectos de la alta concentración de glucosa, en vista de los efectos adversos bien documentados de la hiperglucemia sobre la secreción de insulina. Una completa comprensión de las razones para estos cambios en las relaciones dosis-respuesta entre la glucosa y la secreción de insulina requiere una mejor comprensión de los papeles de HNF4\alpha y HNF1\alpha en la regulación de la función de la célula b pancreática
normal.

Estudios adicionales de los autores de la presente invención han mostrado que subidas de los niveles de glucosa en sangre en las 2 horas siguientes a la sensibilización pronostican alteraciones de las respuestas secretoras a la glucosa. No obstante, en ese caso, los sujetos con tolerancia a la glucosa debilitada demostraron una reducción de las respuestas secretoras de insulina a lo largo de un intervalo de concentraciones de glucosa y no sólo en respuesta al incremento de glucosa por encima de 8 mM como se observó en los sujetos con la mutación HNF1\alpha prediabéticos. Así, los autores de la presente invención no creen que las alteraciones en la secreción de insulina observadas en los sujetos HNF1\alpha prediabéticos resulten de las modestas subidas de glucosa. En vez de eso, los autores de la presente invención sugieren que el porcentaje de cebado y las velocidades de secreción de insulina se deterioran a medida que se deteriora la tolerancia a la glucosa, y la pérdida de capacidad para aumentar la secreción de insulina a niveles de glucosa elevados es una característica de la mutación en el gen HNF1\alpha.

De los estudios descritos antes y en los Ejemplos que siguen resulta evidente que es importante la identificación y la caracterización del gen o de los genes asociados con la diabetes MODY. Las mutaciones en tales genes conducen a la diabetes y podría ser ventajoso desde el punto de vista de la diagnosis y la terapéutica identificar las mutaciones en los sujetos predispuestos a tales mutaciones.

Estudios que intentaban encontrar la localización del gen MODY3 mostraron que el supuesto gen vinculado a la diabetes de tipo MODY3 estaba localizado en un intervalo de 5 cM entre los marcadores D12S86 y D12S807/D12S820 (Menzel y col., 1995). No obstante, la identidad del gen no ha sido aclarada. La presente invención muestra por primera vez que el gen vinculado a MODY3 expresa un factor identificado previamente a partir de hepatocitos conocido como factor nuclear de hepatocitos 1 \alpha, referido aquí como HNF1\alpha.

Estudios similares que intentaban encontrar la localización del gen MODY1 mostraron que el supuesto gen vinculado a la diabetes de tipo MODY1 estaba localizado en un intervalo de 13 cM entre los marcadores D20S169 y D20S176 (Stofflel y col., 1996). Asimismo, como con MODY3, la identidad del gen en MODY1 no ha sido aclarada. La presente invención muestra por primera vez que el gen vinculado a MODY1 expresa un factor identificado previamente a partir de hepatocitos conocido como factor nuclear de hepatocitos 4 \alpha, referido aquí como HNF4\alpha.

Con posterioridad, los autores de la presente invención realizaron estudios para aclarar los defectos genéticos responsables de las otras formas de MODY. La presente invención muestra por primera vez que la MODY es probablemente consecuencia de mutaciones en el factor nuclear de hepatocitos 1\beta, referido aquí como HNF1\beta.

La asociación de la mutación en HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha con la diabetes indica la importancia de la red HNF en el control de la función de las células \beta pancreáticas y en la homeostasis de la glucosa. Por tanto, los estudios presentados aquí han categorizado las mutaciones ejemplares en los genes HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha identificadas mediante técnicas de PCR. Estos destacados resultados forman la base de muchas técnicas terapéuticas y de diagnóstico como medidas para aliviar la diabetes, concretamente la diabetes HNF1\alpha, la diabetes HNF1\beta y la diabetes HNF4\alpha.

B. Los factores nucleares de hepatocitos son los genes vinculados a la diabetes de tipo MODY Factor Nuclear de Hepatocitos 1\alpha

El factor nuclear de hepatocitos 1\alpha (también conocido como APF, LFB1 o HP1) ha sido descrito como una proteína de unión al ADN de secuencia específica de hígado de rata. Se piensa que interacciona con los elementos promotores presentes en muchos genes incluyendo albúmina, fibrinógeno \alpha y \beta, antitripsina \alpha-1, \alpha-fetoproteín piruvato quinasa, transtiretina y aldosa B entre otros. El HNF1\alpha ha sido purificado a partir de extractos de hígado de rata mediante cromatografía de afinidad de ADN utilizando el elemento promotor del fibrinógeno (Courtoise, 1987) y fue caracterizado como una proteína sencilla de 88 kDa. Se sabe ahora que el HNF1\alpha es un factor de transcripción.

Mendel y Crabtree (1993) sugirieron que la HNF1\alpha interaccionaba con genes "específicos de hepatocitos" en los que juega un papel destacado en la regulación de la transcripción tanto in vitro como in vivo. No obstante, más tarde se demostró que el ARNm de HNF1\alpha también podía ser encontrado en algunos tejidos no hepatocíticos incluyendo el riñón, el estómago, los intestinos, el timo y el bazo y el páncreas (Baumhueter y col., 1990; Kuo et al., 1990). Esto sugiere que la expresión de HNF1\alpha puede participar en la diferenciación de órganos no hepáticos así como en la hepatogénesis.

Los factores de transcripción son proteínas que controlan la transcripción mediante la unión a secuencias de ADN reguladoras que actúan en cis en un gen. Por sí mismos, estos factores juegan un papel crucial en el desarrollo y la diferenciación dictando el patrón de expresión de los genes en células y tejidos específicos.

Las proteínas del homeodominio son una clase de factores de transcripción. Todas estas proteínas poseen la inusual característica de tener dominios de unión al ADN muy similares incluso aunque medien en diversos efectos. El HNF1\alpha es un ejemplo de proteína con homeodominio. Se ha demostrado que HNF1\alpha forma dímeros con sí mismo en solución. Parece que la activación transcripcional máxima mediante HNF1\alpha requiere un cofactor de dimerización novedoso. Este cofactor, conocido como cofactor de dimerización de HNF1\alpha (DCoH), no se une por sí mismo al ADN, en vez de eso, se une a HNF1\alpha.

El HNF1\alpha se une al ADN en forma de dímero; esto se confirmó a partir de estudios sobre la purificación y la clonación del HNF1\alpha. Otros estudios demostraron que existía una proteína que se une al ADN que se unía al sitio de unión a HNF1\alpha en células que carecían del ARNm de HNF1\alpha. Esta segunda proteína HNF1\beta es un homólogo de HNF1\alpha pero es el producto de un gen separado.

Estudios de regulación del promotor de HNF1\alpha demostraron que los sitios de unión para los factores de transcripción HNF3, AP1 y HNF4\alpha son esenciales para la expresión de HNF1\alpha (Hansen y Crabtree, 1993). Se ha demostrado que HNF4\alpha está localizado en el cromosoma 20 del genoma humano. Los autores de la presente invención sugieren que MODY1, que es conocido por estar unido al cromosoma 20, puede actuar como regulador de la expresión del gen MODY3 puesto que tales mutaciones en HNF4\alpha pueden ser responsables de la forma MODY1 de diabetes.

Las proteínas HNF1\alpha poseen tres regiones funcionales, a saber, los dominios de dimerización, activación y unión al ADN. El dominio de dimerización está localizado en los 32 primeros aminoácidos de las proteínas HNF1\alpha. El dominio de unión al ADN es un homeodominio de tipo POU que se une a una secuencia de ADN palindrómica de 13 pb en los promotores de las proteínas de unión de HNF1\alpha (Courtois y col., 1988; Frain y col, 1989). La secuencia consenso para este sitio de unión de HNF1\alpha en estos genes es:

: GTTAATNATTACC \hskip0,5cm (SEC ID NUM: 9)

La diabetes mellitus altera la transcripción de numerosos genes en muchos tejidos diferentes. Los mecanismos que subyacen a estas alteraciones de la transcripción son desconocidos en gran parte. Un ejemplo de transcripción alterada se observa en la reducción de la transcripción del gen de la albúmina en la diabetes (Wanke y col., 1991). Recientemente, se ha demostrado que se reducen los niveles de proteína HNF1\alpha en la diabetes, conduciendo a la teoría de que la disminución de la transcripción génica en la diabetes es debida a la disminución de los niveles de HNF1\alpha, un factor crítico para la regulación de la expresión del gen de la albúmina hepático. Se piensa que éste es el caso en otros genes que poseen un sitio de unión a HNF1\alpha y son afectados por la diabetes. Por consiguiente, los cambios en la abundancia de HNF1\alpha en la diabetes parecen afectar a la expresión de genes cuya expresión está regulada predominantemente por este factor.

La expresión del gen de la insulina en mamíferos adultos está localizada en las células \beta en los islotes pancreáticos. Estudios de este gen han definido una pequeña región en el promotor, el miniamplificador FF, capaz de conferir actividad transcripcional específica del tejido y sensible a la glucosa en un promotor heterólogo (German y col, 1990). Esta región miniamplificadora está compuesta de dos elementos reguladores primarios, la caja Far y el elemento FLAT que interaccionan para aumentar la transcripción.

Un análisis adicional del elemento FLAT demostró que era una agrupación de diversos loci en cis que mediaban efectos positivos y negativos discretos. El locus positivo está caracterizado como FLAT-F y su actividad se revela únicamente cuando existe una mutación en el locus negativo FLAT-E. Esta región FLAT-F es capaz de unirse específicamente a varias proteínas de unión al ADN. La secuencia de FLAT-F tiene un parecido significativo a la secuencia consenso de HNF1\alpha. Esto condujo a estudios para determinar si HNF1\alpha por sí mismo podría jugar un papel en la regulación transcripcional del gen de la insulina en rata. Con posterioridad, se demostró que la expresión de HNF1\alpha está presente en la línea celular HIT de insulinoma derivada de células \beta pancreáticas. Se ha demostrado que HNF1\alpha se une y transactiva los intensificadores del gen de la insulina de rata que contienen el sitio HNF1\alpha.

Factor Nuclear de Hepatocitos 4\alpha

El factor nuclear de hepatocitos 4\alpha (HNF4\alpha) es otro factor de transcripción asociado en primer lugar con el hígado y que tiene una distribución limitada en el tejido (Xanthopoulos y col., 1991; Zhong y col., 1994). El HNF4\alpha puede activar la transcripción en varias líneas celulares no hepáticas, indicando que no se requiere una modificación específica del hígado para su función (Sladek y col., 1990).

Se ha observado que existe una contradicción evidente entre la masa molecular de HNF4\alpha pronosticada a partir de la secuencia primaria (50,6 kDa) (Sladek y col., 1990) y la determinada mediante electroforesis en gel (54 kDa) sugiriendo que esta diferencia puede estar debida a modificaciones post-traduccionales. De los muchos tipos de modificaciones post-traduccionales que podrían regular la expresión génica, se ha prestado mucha atención a la fosforilación, que puede influir en la actividad del factor de transcripción de muchas maneras (Hunter y Karin, 1992).

Se han descrito tres niveles principales de regulación: la fosforilación puede afectar a la actividad de unión al ADN (Boyle y col., 1991; Segil y col., 1991; Shuai y col., 1994), la potencial activación transcripcional (Yamamoto y col., 1988; Trautwein y col., 1993), o la traslocación de un factor de la transcripción del citoplasma al núcleo (Metz y Ziff, 1991; Kerr y col., 1991; Schindler y col., 1992; Shuai y col., 1992). Estas posibilidades no son mutuamente excluyentes, y en principio la fosforilación puede ser responsable de la regulación simultánea a niveles claramente diferentes. Con la excepción de ciertas proteínas de transducción de la señal (Darnell y col., 1994), todos los ejemplos de este tipo de regulación han implicado la fosforilación de restos serina o treonina.

Se ha demostrado que la actividad de HNF4\alpha es regulada post-traduccionalmente por la fosforilación de la tirosina, proporcionando un ejemplo de un factor de transducción sin señal mediante esta modificación. El polipéptido HNF4\alpha (SEC ID NUM: 79) contiene 12 restos tirosina dispersos a lo largo de los dominios de unión al ADN, de dimerización, y de unión al ligando supuestos (Sladek y col., 1990) que podrían ser sitios de fosforilación potenciales. Parece que se requiere la fosforilación de HNF4\alpha para su actividad de unión al ADN. Se ha demostrado que la forma transcripcionalmente activa de HNF4\alpha está localizada en dominios subnucleares específicos. Esta distribución intranuclear depende directamente o indirectamente de la fosforilación de la tirosina, sugiriendo la existencia de un mecanismo de control adicional a nivel de redireccionamiento subnuclear que juega un papel en la regulación de la transcrip-
ción.

El factor nuclear de hepatocitos 4\alpha (HNF4\alpha) es un factor de transcripción que es expresado muy pronto en el desarrollo embrionario y es esencialmente para el desarrollo y la función del hígado (revisado por Sladek, 1993 y Sladek, 1994). El ARNm de HNF4\alpha de ratón aparece en el endodermo primario de los blastocistos implantados el día embriónico 4,5 y en el hígado y en los primordios del intestino el día 8,5 (Duncan y col., 1994), mientras que los ratones con carencia de HNF4\alpha no sobrevivían pasado el día 9 postcoito (Chen y col., 1994).

También se ha propuesto que HNF4\alpha es responsable del cometido final de las células para diferenciarse en hepatocitos (Nagy y col., 1994). En roedores adultos, el HNF4\alpha se localiza primordialmente en el hígado, el riñón, y el intestino, y en los insectos se ha encontrado HNF4\alpha en tejidos equivalentes (Sladek y col., 1990; Zhong y col., 1993). Se sabe que HNF4\alpha activa una amplia variedad de genes esenciales, incluyendo aquellos implicados en el metabolismo del colesterol, de los ácidos grasos, y de la glucosa; la coagulación sanguínea; los mecanismos de destoxificación; las infecciones por virus de la hepatitis B; y la diferenciación del hígado (revisado por Sladek, 1993 y Sladek,
1994).

El HNF4\alpha es un miembro de la superfamilia de los factores de transcripción dependientes del ligando, entre los que se incluyen los receptores de hormonas esteroides, el receptor de hormonas tiroideas (TR), el receptor de vitamina A, y el receptor de vitamina D (VDR), así como un gran número de receptores para los cuales no han sido identificados los ligandos, los denominados receptores huérfanos (revisado por Landers y Spelsberg, 1992; O'Malley y Conneely, 1992; Parker, 1993; y Tsai y O'Malley, 1994). Todos los receptores están caracterizados por dos dominios conservados: la región del dedo de cinc, que media en la unión al ADN, y un gran dominio hidrófobo que media en la dimerización de la proteína, la transactivación, y la unión al ligando.

No se sabe si HNF4\alpha responde a un ligando, pero se ha demostrado que activa la transcripción en ausencia de un ligando añadido exógenamente (Hall y col., 1994; Kuo y col., 1992; Metzger y col., 1993; Mietus y col., 1992; Reijnen y col., 1992; Sladek y col., 1990). El HNF4\alpha también está altamente conservado con el HNF-4 de Drosophila, que contiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de 91% con el HNF4\alpha de rata en el dominio de unión al ADN y una identidad de 68% en el gran dominio hidrófobo (Zhong y col., 1993).

Los miembros de la superfamilia de los receptores han sido clasificados de varias maneras, una de las cuales es su capacidad para formar dímeros consigo mismos y con otros miembros de la superfamilia. Por ejemplo, los receptores de hormonas esteroides, los receptores de glucocorticoides, mineralocorticoides, y de progesterona (GR, MR, y PR, respectivamente) se unen todos al ADN y activan la transcripción en forma de homodímeros. Están presentes en el citoplasma formando complejos con proteínas de choque térmico (HSP) hasta que la presencia del ligando apropiado rompe el complejo, permitiendo a los receptores translocarse al núcleo (revisado por Freedman y Luisi, 1993; O'Malley y Tsai, 1993; y Tsai y O'Malley, 1994). Por otra parte, el receptor de ácido retinóico (RAR) y el receptor X de retinoides (RXR) así como el VDR, el receptor activado por el inductor de la proliferación de los peroxisomas (PPAR), y TR, que no se unen a HSP y residen primordialmente en el núcleo, se unen todos al ADN y activan la transcripción no sólo en forma de homodímeros sino también en forma de heterodímeros (revisado por Giguére, 1994; Parker, 1993; y Stunnenberg, 1993). Varios de los receptores nucleares se unen al ADN muy ineficazmente, si lo hicieran, en forma de homodímeros (RXR\alpha, RAR, VDR, TR, y PPAR) pero se unen bien al ADN en forma de heterodímeros (revisado por Giguère, 1994 y Stunnenberg, 1993). Al menos dos de los receptores (RAR y TR) forman heterodímeros en solución con RXR\alpha (Hermann y col., 1992; Kurokawa y col., 1993; Zhang y col.,
1992).

La pareja de dimerización más común para todos estos receptores es RXR\alpha. La tercera clase de receptores identificados hasta la fecha residen tanto en el núcleo como en el citoplasma y se unen al ADN preferentemente en forma de monómeros (NGFI-B, FTZ-F1, factor esteroidogénico 1 [SF-1], y ROR\alpha1) (Giguère y col., 1995; Kurachi y col., 1994; Ohno y col., 1994).

El HNF4\alpha es muy similar a los receptores de retinoides, en concreto a RXR\alpha, tanto en la secuencia de aminoácidos como en la especificidad de unión al ADN. El RXR\alpha de ratón en idéntico en un 60% al HNF4\alpha de rata en el dominio de unión al ADN y un 44% idéntico en el gran dominio hidrófobo. En comparación, RAR\alpha, que forma fácilmente heterodímeros con RXR\alpha, es idéntico en un 61% a RXR\alpha en el dominio de unión al ADN y sólo idéntico en un 27% en el gran dominio hidrófobo (Mangelsdorf y col., 1992). También se ha demostrado que HNF4\alpha y RXR\alpha comparten elementos de respuesta de al menos seis genes diferentes así como un sitio consenso de una repetición directa de AGGTCA separado por un nucleótido (referido como DR+1) (Carter y col., 1994; Carter y col, 1993; García y col., 1993; Ge y col., 1994; Hall y col., 1994; Hall y col., 1992; Kekule y col., 1993; Ladias, 1994; Lucas y col., 1991; Nakshatri y Chambon, 1994; Widom y col, 1992). Las similitudes estructurales y funcionales de HNF4\alpha y RXR\alpha sugiere que HNF4\alpha podría formar heterodímeros con RXR\alpha y/o con otros receptores.

Los análisis de desplazamiento de la mobilidad electroforética (EMSA) de las proteínas HNF4\alpha y RXR\alpha expresadas in vivo e in vitro demostraron que HNF4\alpha de hecho no forma heterodímeros con RXR\alpha sobre uno cualquiera de algunos de los elementos de respuesta y que mientras que HNF4\alpha forma homodímeros en solución en ausencia de ADN, no forma heterodímeros con RXR\alpha. También se ha demostrado que HNF4\alpha no forma heterodímeros con algunos de los otros receptores de ADN, sugiriendo que la carencia de heterodimerización es una propiedad general de HNF4\alpha.

Estos estudios condujeron a la propuesta de que HNF4\alpha define una nueva subfamilia de receptores nucleares que están presentes exclusivamente en el núcleo, existen en solución, se unen al ADN en forma de homodímeros, y no forman heterodímeros con RXR\alpha o con otros receptores.

El HNF4\alpha es un miembro de la familia de receptores de hormonas esteroides. Los miembros de esta familia han sido clasificados según la secuencia de aminoácidos en el nudillo del dedo de cinc (referido como caja P) una región importante para reconocer la secuencia del sitio de la mitad del palíndromo en los elementos de repuesta hormonal (Forman y Samuels, 1990). Por ejemplo, los miembros de la subfamilia de las hormonas tiroideas que contienen la secuencia de aminoácidos EGCKG (SEC ID NUM: 83) y se unen a los elementos de respuesta tiroidea (TRE). Los miembros de la subfamilia de los receptores de estrógenos contienen los aminoácidos EGCKA (SEC ID NUM: 84) y se unen a los elementos de respuesta estrogénica (ERE). La secuencia de HNF4\alpha es DGCKG (SEC ID NUM: 85) y es muy similar a la del elemento de respuesta tiroidea. A pesar de su similitud parece que HNF4\alpha no se une a TRE ni se une a ERE, y el ligando real para HNF4\alpha no ha sido determinado hasta ahora. Los métodos de rastreo de la presente invención conducirán a un experto en la técnica a aclarar semejante ligando o ligandos.

La presente invención describe la organización exón-intrón y la secuencia parcial del gen HNF4\alpha humano. Además, los autores de la presente invención han rastreado los exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima en cuanto a las mutaciones en un grupo de 57 sujetos Japoneses no relacionados con la diabetes de comienzo temprano/MODY de origen desconocido. Los resultados de estos rastreos sugieren que las mutaciones en el gen HNF4\alpha pueden ocasionar diabetes de comienzo temprano/MODY en Japoneses pero son menos comunes que las mutaciones en el gen HNF1\alpha/MODY3. La información presentada aquí sobre la secuencia del gen HNF4\alpha y su región promotora facilitará la búsqueda de mutaciones en otras poblaciones y estudios del papel de este gen en la determinación de la función normal de las células \beta pancreáticas.

Además, la comprensión actual de la forma MODY1 de diabetes esta basada únicamente en estudios de una sola familia, la genealogía R-W. Los autores de la presente invención informan aquí sobre la identificación de una segunda familia con MODY1 y la primera en la que ha habido una caracterización detallada de la función hepática. Los autores de la presente invención demuestran que MODY1 es primordialmente un trastorno de la función de las células \beta, no obstante, los autores de la presente invención han determinado que las mutaciones en HNF4\alpha pueden conducir a defectos secretores en las células \alpha así como en las células \beta o a una reducción de la masa de los islotes
pancreáticos.

Factor Nuclear Hepático 1\beta y DCoH

El HNF1\beta humano es un factor de transcripción que contiene el homeodominio de 557 aminoácidos (tipo A) generando el empalme alternativo otras dos formas de 531 (tipo B) y 399 aminoácidos (tipo C) (Mendel y col., 1991a; De Simone y col., 1991; Rey-Campos y col., 1991; Bach y Yaniv., 1993). Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del HNF1\beta humano se dan en la SEC ID NUM: 28 y la SEC ID NUM: 129, respectivamente. El HNF1\beta está relacionado estructuralmente con HNF1\alpha y funciona en forma de un homodímero o de un heterodímero con HNF1\alpha. estos dímeros son estabilizados por la proteína bifuncional, DCoH/PCBD (Mendel y col., 1991b, Citron y col., 1992), que se une al dominio de dimerización de HNF1 formando un complejo heterotetramérico y aumentando la actividad transcripcional. Como homotetrámero, PCBD está implicado en la regeneración de la tetrahidrobiopterina, un cofactor esencial de la fenilalanina hidroxilasa y otras monooxigenasas, que catalizan la conversión de 4-hidroxitetrahidrobiopterina en quinonoide-dihidrobiopterina (Citron y col., 1993; Johnen y col., 1995). La pérdida de las mutaciones de función en PCBD está asociada con una rara forma recesiva autosómica de hiperfenilalaninemia suave. Los ARNm de HNF1\beta y DCoH son expresados en los islotes pancreáticos de ratón implicando que pueden funcionar junto con HNF1\alpha para regular la expresión génica en este tejido. El DCoH humano es una proteína de 104 aminoácidos (incluyendo la metionina de iniciación) (Thöny y col., 1995) y funciona como se describe aquí más
abajo.

La Diabetes de Tipo MODY es una Manifestación de los Defectos en los Factores Nucleares de Hepatocitos

Está establecido que todas las formas de diabetes de Tipo 2 están asociadas con defectos profundos en la secreción de insulina entre los que se incluyen la pérdida de respuesta en la primera fase a la glucosa intravenosa, respuestas retardadas y directas a la ingestión de comidas combinadas, pérdida de los patrones oscilatorios normales de la secreción de insulina, y aumento de la secreción de proinsulina y de productos de tipo proinsulina. La base molecular de estos defectos de la secreción en humanos es desconocida, aunque en ratas se ha demostrado que existen cambios globales de la expresión génica en los islotes de animales diabéticos y prediabéticos. Una de tales alteraciones globales es la reducción de los niveles de los ARNm que codifican muchas proteínas específicas de los islotes pancreáticos. Este defecto en la expresión génica podría ser compatible con el descenso en los niveles de un factor de transcripción maestro cuyos niveles afectan a la expresión de un alineamiento completo de genes aguas abajo.

La presente invención pronostica que la disfunción de las células \beta y los defectos en la secreción de insulina asociados con MODY3 son un resultado de las mutaciones en HNF1\alpha, además se demuestra que la disfunción de las células \beta asociada con MODY1 es un resultado de las mutaciones en HNF4\alpha.

Las características de la diabetes de tipo MODY son muy similares a las de la diabetes de Tipo 2 de comienzo tardío. Por tanto, los defectos adquiridos en la expresión de HNF1\alpha, HNF4\alpha, y HNF1\beta, respectivamente, pueden bien ocurrir en la diabetes de comienzo tardío y conducir a la disfunción de las células \beta y a los defectos en la secreción de insulina en esta forma de diabetes. La identificación de los agentes que activan la transcripción de HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha será terapéutica para el tratamiento de MODY, así como de la diabetes de Tipo 2 de comienzo tardío. La presente invención detalla los métodos para la identificación de tales agentes que serán utilizados después para incrementar la expresión de HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha lo que conducirá sucesivamente al incremento de la transcripción/expresión o la activación de genes de las células \beta tales como el de la insulina.

Resulta evidente a partir de la presente invención que los factores nucleares de hepatocitos, su expresión, la regulación y la modificación tienen implicaciones trascendentales en la diabetes. Hasta la fecha se pronostica que tres de los cuatro tipos de diabetes MODY identificados afectan a la expresión génica. Otras formas de MODY no pueden ser descartadas, por ejemplo estudios de acoplamiento genético pronostican la presencia de genes MODY adicionales, cuya localización cromosómica es desconocida en la actualidad.

La dependencia absoluta de HNF4\alpha del promotor de HNF1\alpha acoplado con la evidencia de la capacidad de HNF4\alpha de liberar la expresión de HNF1\alpha endógena es indicativa de que HNF4\alpha es un regulador esencial de HNF1\alpha (Fig. 6). De este modo, la activación o la represión de HNF4\alpha ocasionará una activación indirecta o la represión de HNF1\alpha. La presente invención aclara los métodos para identificar los factores responsables de la modulación de la expresión y/o la actividad de HNF4\alpha.

El HNF1\beta, también conocido como vHNF1, está íntimamente relacionado con HNF1\alpha y es capaz de formar heterodímeros con HNF1\alpha. La dimerización entre los miembros de las clases de factores transcripcionales parece resolver el problema del control de la expresión de un gran número de genes. Una ventaja obvia de la capacidad de dimerización de un factor de transcripción es que proporciona una oportunidad para diversificar el número de mecanismos reguladores que pueden estar asociados con un solo sitio de unión al ADN regulador. Otra ventaja estriba en la posibilidad de trasladar alteraciones sutiles en los niveles de expresión relativos de los miembros de un par de dimerización a un efecto cuantitativo sustancial en la trascripción.

La Fig. 6 resume los diferentes factores implicados en la regulación de la expresión y de la actividad de los factores de transcripción HNF descritos antes. A partir de las investigaciones de los autores de la presente invención es concebible que aberraciones en puntos cualesquiera a lo largo de esta ruta o en factores cualesquiera que afecten a esta ruta directamente o indirectamente producirán disfunción de las células \beta y diabetes mellitus, ya sea en forma de MODY o como diabetes de comienzo tardío.

La presente invención ha demostrado que las mutaciones en HNF1\alpha son claramente responsables de la diabetes de tipo MODY3. Como se ha comentado antes el HNF1\alpha se une al ADN en forma de dímero. Este puede ser o un homodímero o un heterodímero con HNF1\beta (SEC ID NUM: 80). Las dos formas de HNF1 son expresadas en cantidades comparables en el hígado pero hay una expresión tres veces superior de HNF1\beta en el riñón en comparación con HNF1\alpha.

El HNF1\beta carece de actividad transcripcional atribuible a HNF1\alpha. Una consecuencia potencial de esta observación combinada con su capacidad para formar dímeros con HNF1\alpha es que HNF1\beta es probablemente un regulador negativo de la actividad transcripcional de HNF1\alpha. Esta observación es sugerida por la presencia de vHNF1 en sistemas que no expresan la mayoría de los productos génicos específicos de hepatocitos (Baumhueter y col., 1988). No obstante, estudios de Mendel y col., (1991) fueron incapaces de confirmar esta observación.

Los estudios de Mendel y col., (1991) indicaban que un cofactor de dimerización de HNF1 (DCoH) puede incrementar la estabilidad de los dímeros de HNF1\alpha. En ese caso, se sugiere que DCoH tiene el potencial de restringir la actividad de HNF1\alpha y/o HNF1\beta. Existen numerosas hipótesis sobre cómo DCoH afecta a la activación de la transcripción de HNF1. El HNF1\alpha es un monómero en solución y sólo se puede unir al ADN como dímero, la presencia de DCoH favorece la formación de HNF1\alpha dimérico. Alternativamente es plausible que DCoH induzca un cambio conformacional en HNF1\alpha para crear un activador transcripcional más potente ya sea directamente o permitiendo la interacción con otras proteínas, por ejemplo HNF1\beta. Otra alternativa más es que DCoH disminuya la velocidad de degradación de HNF1\alpha estabilizando así HNF1\alpha y potenciando el efecto de HNF1\alpha.

La presente invención demuestra que MODY4, que no había sido caracterizada previamente, es una manifestación de los defectos de HNF1\beta. La presente invención describe mutaciones específicas en HNF1\beta que han llevado a MODY4 en ciertos individuos. A la luz de estas observaciones, se describen aquí los métodos para la identificación y el aislamiento de los factores implicados en la actividad de HNF1\beta y DCoH con el propósito de obtener de una nueva percepción en la intervención terapéutica en la diabetes.

C. Análisis de Rastreo In vitro de Sustancias Candidato

Ciertos aspectos de esta invención tienen que ver con los métodos para evaluar convenientemente las sustancias candidato para identificar los compuestos capaces de estimular la transcripción mediada por HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha. Semejantes compuestos serán capaces de promover la expresión génica, y de este modo pueden ser mencionados por tener actividad sobre-reguladora. En tanto se incremente la expresión génica de, por ejemplo, el gen de la insulina en las funciones corporales para aliviar los síntomas de la diabetes, las sustancias positivas cualesquiera identificadas mediante los análisis de la presente invención serán fármacos antidiabéticos. Antes de la administración a humanos, semejantes compuestos serán sometidos a ensayo rigurosamente utilizando modelos animales convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Las sustancias candidato exitosas pueden funcionar en ausencia de mutaciones en HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha en cuyo caso el compuesto candidato puede ser denominado "estimulador positivo" de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, respectivamente. Alternativamente, semejantes compuestos pueden estimular la transcripción en presencia de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado superando los efectos de las mutaciones, es decir, funcionan oponiéndose a la diabetes mediada por HNF1\alpha mutante, y/o HNF1\beta, y/o HNF4\alpha, y en ese caso se pueden denominar "agonista mutante de HNF1\alpha", "agonista mutante de HNF1\beta" o "agonista mutante de HNF4\alpha" respectivamente. Incluso se puede descubrir que en los compuestos se combinan estas tres acciones. Si bien se puede observar por último que la clase agonista de compuestos es la más deseable, los compuestos de cualquier clase serán probablemente agentes terapéuticos útiles para su uso en la estimulación de la expresión génica y para combatir MODY1, MODY3, MODY4, y la diabetes de Tipo 2 de comienzo tardío en sujetos humanos.

Candidatos para HNF1\alpha

Como se ha demostrado aquí que HNF1\alpha está vinculado al tipo MODY3, un método mediante el cual identificar una sustancia candidato capaz de estimular la transcripción mediada por HNF1\alpha en la diabetes está basado en la unión específica proteína:ADN. Por consiguiente, para llevar a cabo semejante análisis, se puede preparar una composición de una proteína de unión a HNF1\alpha, tal como HNF1\alpha recombinante, y determinar la capacidad de la sustancia candidato para incrementar la unión de la proteína HNF1\alpha a un segmento de ADN incluyendo una secuencia de unión a HNF1\alpha complementaria, es decir, para incrementar la cantidad o la afinidad de unión de un complejo proteína:ADN.

Esto se podría lograr generalmente utilizando dos análisis paralelos, uno de los cuales contiene HNF1\alpha y el ADN específico solo y el otro contiene HNF1\alpha, ADN y la composición de la sustancia candidato. Se podría realizar cada análisis en condiciones, y durante un período de tiempo, eficaces para permitir la formación de los complejos de proteína:ADN, y se podrían separar después los complejos de proteína:ADN unidos de cualquier proteína o ADN no unido y medir la cantidad de complejos de proteína:ADN. Un incremento de la cantidad de complejos de proteína:ADN unidos formados en presencia de la sustancia candidato podría ser indicativo de una sustancia candidato capaz de promover la unión de HNF1\alpha, y de este modo, capaz de estimular la transcripción mediada por HNF1\alpha.

En semejantes análisis de unión, se puede medir la cantidad del complejo de proteína:ADN, tras la eliminación de las especies no unidas, detectando una marca, tal como una marca radiactiva o enzimática, que ha sido incorporada a la composición de proteína HNF1\alpha original o a la proteína recombinante o al segmento de ADN que contiene HNF1\alpha. Alternativamente, se podría detectar la porción proteica del complejo por medio de anticuerpos dirigidos a la proteína, tales como los descritos aquí.

Los análisis de unión preferidos son aquellos en los que o la proteína HNF1\alpha, o la proteína recombinante o la composición purificada del segmento de ADN que contiene HNF1\alpha está unida a un soporte sólido y contacta con el otro componente para permitir la formación del complejo. Los componentes proteicos o de ADN no unidos se separan después de los complejos de proteína:ADN mediante lavado y la cantidad de complejo unido restante se cuantifica detectando la marca o con anticuerpos. Semejantes análisis de unión al ADN forman la base de los análisis de unión al filtro y de tipo placa de microtitulación y pueden ser realizados de una manera semiautomática para posibilitar el análisis de un gran número de sustancias candidato en un corto período de tiempo. También se podrían emplear métodos electroforéticos, tales como el análisis de desplazamiento en gel descrito aquí, para separar la proteína o el ADN no unido de los complejos de proteína:ADN unidos, pero no se prefieren semejantes métodos de trabajo intensivo.

Análisis tales como los descritos antes están dirigidos inicialmente a identificar las sustancias candidato a estimuladores positivos y, por sí mismos, no dirigen la actividad de la sustancia en presencia de los mutantes de HNF1\alpha. No obstante, se puede probar que semejantes reguladores positivos actúan como agonistas de los mutantes de HNF1\alpha, y en cualquier caso, podrían tener probablemente utilidad en la promoción transcripcional, ya sea in vitro o in vivo. Los reguladores positivos podrían probablemente ser evaluados adicionalmente para valorar los efectos de la acción de los mutantes de HNF1\alpha, empleando análisis para el gen indicador celular tales como los descritos aquí más
abajo.

Virtualmente, cualquier sustancia candidato puede ser analizada mediante estos métodos, incluyendo los compuestos que pueden interaccionar con las proteínas que se unen a HNF1\alpha, el HNF1\alpha o los complejos de proteína:ADN, y también sustancias tales como las enzimas que pueden actuar alterando físicamente una de las estructuras presentes. Por supuesto, se puede analizar cualquier compuestos aislado de fuentes naturales tales como plantas, animales o incluso muestras marinas, forestales o de suelo, como lo puede ser cualquier proteína química o recombinante o sintética.

Otro método potencial para estimular la transcripción mediada por HNF1\alpha es preparar una composición de proteína HNF1\alpha y modificar la composición de proteína de una manera eficaz para incrementar la unión de la proteína HNF1\alpha a un segmento de ADN incluyendo la secuencia de unión a la proteína HNF1\alpha. Los análisis de unión se podrían realizar en paralelo, de una manera similar a los descritos antes, permitiendo la comparación de la proteína que se une a HNF1\alpha natural y modificada. Además de las fosfatasas y las quinasas, se podrían emplear otros agentes, incluyendo proteasas y agentes químicos, para modificar la proteína que se une a HNF1\alpha. La presente invención, con la clonación del ADNc de HNF1\alpha mutante, también abre la vía para diseñar genéticamente la proteína HNF1\alpha para promover la transcripción génica en la diabetes. Con respecto a esto, se contempla la mutación de los sitios de fosforilación potenciales y/o la modificación o deleción de otros dominios.

Candidatos para la unión a HNF4\alpha

Los criterios mostrados antes para rastrear los moduladores de HNF1\alpha también se verifican para HNF4\alpha. HNF4\alpha es un miembro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides, no obstante, el ligando para HNF4\alpha es desconocido. La identificación del ligando endógeno para la unión a HNF4\alpha podría ser una etapa importante para la aclaración de los mecanismos de control de los genes eucarioticos, y podría proporcionar asimismo a la ciencia biomédica una poderosa herramienta por medio de la cual regular la expresión génica específica. Semejante desarrollo podría conducir a numerosas aplicaciones útiles en las industrias farmacéutica y biotecnológica. Si bien se contemplan muchas aplicaciones, una aplicación particularmente útil podría ser como componente central en los ensayos de rastreo para identificar nuevas clases de sustancias farmacológicamente activas que pueden ser empleadas para manipular, y concretamente, para promover la transcripción de genes cuya expresión resulta afectada en la
diabetes.

Por tanto, HNF4\alpha podría ser de gran utilidad para identificar agentes para combatir la MODY y la diabetes de Tipo 2. Un agente antidiabético aislado mediante los métodos de rastreo de la presente invención podría actuar promoviendo la transcripción celular o la función de HNF4\alpha, lo que a su vez podría servir para incrementar la transcripción de los genes cuya actividad es regulada por HNF4\alpha (por ejemplo HNF1\alpha) incrementando de ese modo la transcripción de los genes implicados en la diabetes y aliviando los síntomas de la diabetes.

Candidatos para la unión a HNF1\beta

Los criterios mostrados antes para rastrear los moduladores de HNF1\alpha y HNF4\alpha también se verifican para HNF1\beta. HNF1\beta es una secuencia de 557 aminoácidos que está relacionada estructuralmente con HNF1\alpha y funciona como homodímero y heterodímero con HNF1\alpha. Estos dímeros están estabilizados por DCoH. La identificación de los factores que afectan a esta dimerización, o de cualquiera de los factores implicados en el complejo heterotetramérico, proporcionará compuestos útiles para la modulación de la actividad transcripcional. Semejante desarrollo podría conducir a numerosas aplicaciones útiles en las industrias farmacéutica y biotecnológica. Si bien se contemplan muchas aplicaciones, una aplicación particularmente útil podría ser como componente central en análisis de rastreo para identificar nuevas clases de sustancias farmacológicamente activas que pueden ser empleadas para manipular, y concretamente, para promover, la transcripción de genes cuya expresión está alterada en la diabetes.

Por tanto, HNF1\beta podría ser de gran utilidad en la identificación de agentes para combatir MODY y la diabetes de Tipo 2. Un agente antidiabético aislado mediante los métodos de rastreo de la presente invención podría actuar promoviendo la transcripción celular o la función de HNF1\beta, lo que a su vez podría servir para incrementar la transcripción de los genes cuya actividad es regulada por HNF1\beta (por ejemplo HNF1\alpha) incrementando de ese modo la transcripción de los genes implicados en la diabetes y aliviando los síntomas de la diabetes.

D. Genes Indicadores y Análisis de Rastreo Basados en Células

También están disponibles análisis celulares para rastrear sustancias candidato para identificar aquellas capaces de estimular la transcripción mediada por HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha y la expresión génica. En estos análisis, se puede emplear el incremento de expresión de cualquier gen natural o heterólogo bajo el control de una proteína HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha funcional como medida de la actividad estimuladora, aunque se prefiere el uso de genes indicadores. Un gen indicador es un gen que confiere a su célula huésped recombinante un fenotipo detectable fácilmente que emerge únicamente en condiciones específicas. En el presente caso, el gen indicador, estando bajo el control de una proteína HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha funcional, será reprimido generalmente bajo las condiciones de la diabetes MODY3, MODY4 o MODY1 respectivamente, y será expresado generalmente en las condiciones no diabéticas de MODY3, MODY4 o MODY1 respectivamente.

Los genes indicadores son genes que codifican un polipéptido no producido por otra parte por la célula huésped que es detectable mediante el análisis del cultivo celular, v.g., mediante análisis fluorométrico, radioisotópico o espectrofotométrico del cultivo celular. Entre las enzimas ejemplares se incluyen luciferasas, transferasas, esterasas, fosfatasas, proteasas (activador del plasminógeno tisular o uroquinasa), y otras enzimas susceptibles de ser detectadas por su presencia física o actividad funcional. Un gen indicador utilizado a menudo es la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que puede ser empleado con un sustrato radiomarcado, o la luciferasa, que es medida fluorométricamente.

Otras clases de genes indicadores que confieren características detectables a una célula huésped son aquellas que codifican polipéptidos, generalmente enzimas, que vuelven a sus transformantes resistentes a las toxinas, v.g., el gen neo que protege las células huésped de niveles tóxicos del antibiótico G418, y los genes que codifican la dihidrofolato reductasa, que confieren resistencia al metotrexato. Los genes de esta clase no son preferidos generalmente puesto que el fenotipo (resistencia) no proporciona un rendimiento cuantitativo conveniente o rápido. La resistencia a antibióticos o toxinas requiere días de cultivo para su confirmación, o procedimientos de análisis complejos si se va a realizar otra cosa que no sea una determinación biológica.

Otros genes de uso potencial en análisis de rastreo son aquellos capaces de transformar huéspedes para expresar antígenos de la superficie celular únicos, v.g., proteínas env virales tales como gp120 de HIV o gD de herpes, que son fácilmente detectables mediante inmunoanálisis. No obstante, no se prefieren los indicadores antigénicos puesto que, a diferencia de las enzimas, no son catalíticos y de este modo no amplifican sus señales.

Los productos polipeptídicos del gen indicador son secretados, intracelulares, o como se ha observado antes, son péptidos unidos a membranas. Si el polipéptido no es secretado comúnmente, se fusiona a una secuencia señal heteróloga para su maduración y secreción. En otras circunstancias la señal es modificada con el fin de eliminar las secuencias que prohíben la secreción. Por ejemplo, la proteína gD de la cubierta del herpes ha sido modificada mediante deleción dirigida al sitio de su dominio de unión transmembrana, facilitando de este modo su secreción (EP 139.417A). Esta forma truncada de la proteína gD de herpes es detectable en el medio de cultivo mediante inmunoanálisis convencionales. Preferiblemente, no obstante, los productos del gen indicador son alojados en compartimentos intracelulares o de la membrana. Después se pueden fijar al recipiente de cultivo, v.g., pocillos de microtitulación, en los que se desarrollan, seguido de la adición de una sustancia que genera una señal detectable tal como un sustrato cromogénico para enzimas indicadoras.

El procedimiento de promoción transcripcional que, en su totalidad, conduce al aumento de la transcripción es denominado "activación". El mecanismo mediante el cual actúa una sustancia candidato exitosa no es material puesto que el objetivo es promover la expresión génica mediada por HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, o incluso, para promover la expresión génica en presencia de productos génicos HNF1\alpha, HNF1\beta, o HNF4\alpha mutantes, mediante medios cualesquiera.

Para crear un vector o plásmido apropiado para su uso en semejantes análisis se podría ligar el promotor que contiene HNF1\alpha, ya sea el promotor HNF1\alpha híbrido o natural, a un segmento de ADN que codifica el gen indicador mediante métodos convencionales. También se contemplan análisis similares utilizando los promotores HNF1\beta y HNF4\alpha. Las secuencias promotoras HNF1\alpha, HNF1\beta, o HNF4\alpha pueden ser obtenidas mediante síntesis in vitro o recuperadas a partir de ADN genómico y deben ser ligadas aguas arriba del codón de iniciación del gen indicador. La presente invención proporciona la región promotora para HNF1\alpha humano, una comparación de la secuencia de la región promotora de los genes HNF1\alpha humano, de rata, ratón, pollo y rana se da en la Fig. 22. También se proporciona aquí una comparación de la secuencia de las regiones promotoras de los genes HNF4\alpha humano y de ratón (Fig. 13). La secuencia parcial del gen HNF1\beta humano incluyendo el promotor también ha sido identificada por los autores de la presente invención y consignada en la base de datos GenBank con los números de acceso U90279-90287 y U96079. Cualquiera de estos promotores puede ser particularmente preferido en la presente invención. También se debe emplear una región de la caja TATA rica en AT y se debe localizar entre la secuencia HNF y el codón de iniciación del gen indicador. La región 3' con respecto a la secuencia codificadora para el gen indicador contendrá idealmente un sitio de terminación de la transcripción y de poliadenilación. El promotor y el gen indicador pueden ser insertados en un vector replicable y transfectados a un huésped de clonación tal como E. coli, el huésped cultivado y el vector de replicación recuperado con el fin de preparar cantidades suficientes de la construcción para la posterior transfección a un huésped eucariótico adecuado.

Las células huésped para su utilización en los análisis de rastreo de la presente invención serán generalmente células de mamífero, y generalmente líneas celulares que pueden ser utilizadas en relación con estudios de transfección transitoria. Las líneas celulares se deben desarrollar de manera relativamente fácil en el cultivo a gran escala. Asimismo, deben contener tan poco fondo natural como sea posible considerando la naturaleza del polipéptido indicador. Entre los ejemplos se incluyen las líneas celulares Hep G2, VERO, HeLa, de riñón embriónico humano (HEK)-293, CHO, WI38, BHK, COS-7, y MDCK, siendo particularmente preferidas las células CV-1 de mono.

En análisis de rastreo se lleva a cabo típicamente haciendo crecer las células huésped recombinantes en presencia y ausencia de las sustancias candidato y determinando la cantidad o la actividad del gen indicador. Para analizar las sustancias candidato capaces de ejercer sus efectos en presencia de los productos génicos de HNF1\alpha, HNF1\beta y/o HNF4\alpha mutados, se podrían elaborar proporciones molares seriadas de semejantes productos génicos que alteren la expresión mediada por HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha. Se podría medir idealmente el nivel de la señal indicadora tras un período de incubación que sea suficiente para demostrar la represión mediada por el mutante de la expresión de la señal en controles incubados únicamente con mutantes. Las células que contienen proporciones variables de las sustancias candidato podrían ser después evaluadas en cuanto a la activación de la señal en comparación con los niveles suprimidos.

Los candidatos que demuestran un aumento relacionado con la dosis de la transcripción o la expresión del gen indicador son seleccionados después para la evaluación adicional como agentes terapéuticos clínicos. La estimulación de la transcripción puede ser observada en ausencia de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutante, en cuyo caso el compuesto candidato podría ser un estimulador positivo de la transcripción de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, respectivamente. Alternativamente, el compuesto candidato podría producir únicamente una estimulación en presencia de la proteína HNF1\alpha mutada, HNF1\beta mutada o HNF4\alpha mutada, lo que indicaría que funciona oponiéndose a la supresión mediada por mutación de la expresión del gen. Los compuestos candidato de cualquier clase podrían ser agentes terapéuticos útiles que estimularían la expresión génica y de ese modo combatirían MODY y la diabetes de Tipo 2.

E. Ácidos Nucleicos

Como se describe en los Ejemplos, los autores de la presente invención describen el gen en el locus MODY3 del cromosoma 12, estando el locus MODY4 asociado con HNF1\beta y el gen en el locus MODY1 del cromosoma 20. Las mutaciones en estos genes son responsables de la diabetes. Los autores de la presente invención describen mutaciones en los genes HNF1\alpha, HNF1\beta, y HNF4\alpha identificadas mediante técnicas de PCR. El gen para el locus MODY3 ha sido identificado por primera vez como factor nuclear de hepatocitos 1\alpha, referido aquí como HNF1\alpha. El gen para el locus MODY1 ha sido identificado como factor nuclear de hepatocitos 4\alpha (HNF4\alpha). El gen para el locus MODY4 ha sido identificado como factor nuclear de hepatocitos 1\beta (HNF1\beta).

En una realización de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos descritas aquí encuentran utilidad como sondas de hibridación o cebadores para la amplificación. En ciertas realizaciones, estas sondas y cebadores constan de fragmentos oligonucleotídicos. Tales fragmentos deben tener una longitud suficiente para proporcionar la hibridación específica a una muestra de ARN o ADN extraída de tejido. Las secuencias tendrán típicamente de 10 a 20 nucleótidos, pero pueden ser más largas. Secuencias más largas, v.g., 40, 50, 100, 500 e incluso completas, son preferidas para ciertas realizaciones.

Se contemplan las moléculas de ácidos nucleicos que tienen extensiones contiguas de aproximadamente 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75 o 100 o 500 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEC ID NUM: 1, la SEC ID NUM: 3, la SEC ID NUM: 5, la SEC ID NUM: 7, HNF1\alpha y sus mutantes. En otras realizaciones se contemplan los nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEC ID NUM: 78, la SEC ID NUM: 34, la SEC ID NUM: 36, la SEC ID NUM: 38, la SEC ID NUM: 40, la SEC ID NUM: 42, la SEC ID NUM: 44, la SEC ID NUM: 46, la SEC ID NUM: 48, la SEC ID NUM: 50, la SEC ID NUM: 52, la SEC ID NUM: 54, HNF4\alpha y sus mutantes. En otras realizaciones más se contemplan los nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEC ID NUM: 128, HNF1\beta y sus mutantes. También se contemplan las moléculas que son complementarias a las secuencias anteriormente mencionadas y que se unen a estas secuencias en condiciones muy restrictivas. Estas sondas serán útiles en una variedad de realizaciones de hibridación, tales como la transferencia Southern y northern. En algunos casos, se contempla que se puedan utilizar sondas que hibriden con secuencias diana múltiples sin comprometer su capacidad para diagnosticar eficazmente la diabetes (MODY1, MODY3, y MODY4). En ciertas realizaciones, se contempla que se puedan utilizar sondas múltiples para la hibridación a una sola
muestra.

Se pueden diseñar varias sondas y cebadores en torno a las secuencias de nucleótidos descritas. Los cebadores pueden tener cualquier longitud, pero típicamente tienen una longitud de 10 a 20 bases. Asignando valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer resto es el 1, el secundo resto es el 2, etc., se puede proponer un algoritmo que defina todos los cebadores:

n

\;

a

\;

n + y

donde n es un entero de 1 al ultimo número de la secuencia e y es la longitud del cebador menos uno, donde n + y no excede del último número de la secuencia. Así, para un 10-mero, las sondas corresponden a las bases 1 a 10, 2 a 11, 3 a 12, etcétera. Para un 15-mero, las sondas corresponden a las bases 1 a 15, 2 a 16, 3 a 17, etcétera. Para un 20-mero, las sondas corresponden a las bases 1 a 20, 2 a 21, 3 a 22, etcétera.

Los valores de n en el algoritmo anterior para las secuencias de ácido nucleico son: SEC ID NUM: 1, n = 3238 para HNF1\alpha, SEC ID NUM: 78, n = 1441 para HNF4\alpha, SEC ID NUM: 128 para HNF1\beta.

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El uso de una sonda de hibridación de entre 17 y 100 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Se prefieren generalmente moléculas que tengan secuencias complementarias sobre extensiones superiores a 20 bases de longitud, con el fin de incrementar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y de ese modo mejoren la calidad y el grado de las moléculas híbridas concretas obtenidas. Se preferirá generalmente diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan extensiones de 20 a 30 nucleótidos, o incluso mayores cuando se desee. Semejantes fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente los fragmentos mediante métodos químicos o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante.

Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser utilizadas por su capacidad para formar moléculas dúplex selectivamente con extensiones complementarias de genes o ARN o para proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o ARN de tejidos. Dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para lograr grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia diana.

Para las aplicaciones que requieren una alta selectividad, se deseará emplear condiciones relativamente restrictivas para formar los híbridos, v.g., se seleccionarán condiciones con una concentración de sal relativamente baja y/o con elevada temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Semejantes condiciones altamente restrictivas toleran pocos, si los hubiera, emparejamientos erróneos entre la sonda y el molde o la hebra diana, y podrían ser particularmente adecuadas para aislar genes específicos o detectar transcritos de ARNm específicos. Generalmente es apreciado que las condiciones se puedan volver más restrictivas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, la sustitución de nucleótidos mediante mutagénesis dirigida al sitio, es apreciado que se requieran condiciones menos restrictivas. En estas condiciones, la hibridación puede ocurrir incluso aunque las secuencias de la sonda y la hebra diana no sean perfectamente complementarias, sino que estén emparejadas erróneamente en una o más posiciones. Las condiciones se pueden volver menos restrictivas incrementando la concentración de sal y disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, una condición restrictiva intermedia podría ser proporcionada mediante NaCl aproximadamente de 0,1 a 0,25 M a temperaturas de aproximadamente 37 C a aproximadamente 55ºC, si bien se podrían proporcionar condiciones menos restrictivas mediante sal de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, a temperaturas que oscilan de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. De este modo, las condiciones de hibridación pueden ser manipuladas fácilmente dependiendo de los resultados
deseados.

En otras realizaciones, la hibridación puede ser lograda en condiciones, por ejemplo, de Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, ditiotreitol 1,0 M, a temperaturas entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 37ºC. En otras condiciones de hibridación utilizadas se podrían incluir Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, a temperaturas entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 72ºC.

En algunas realizaciones, será ventajoso emplear las secuencias de ácido nucleico de la presente invención combinadas con medios apropiados, por ejemplo una marca, para determinar la hibridación. En la técnica se conocen una gran variedad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros, tales como avidina/biotina, susceptibles de ser detectados. En realizaciones preferidas, se puede desear emplear una marca fluorescente o una etiqueta enzimática como la ureasa, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos o medioambientalmente no deseables. En el caso de las etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden ser empleados para proporcionar un medio de detección visible para el ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen ácido nucleico complementario.

En general, se prevé que las sondas de hibridación descritas aquí serán útiles como reactivos en la hibridación en solución, como en la PCR, para la detección de la expresión de los genes correspondientes, así como en las realizaciones en las que se emplea una fase sólida. En las realizaciones que implican una fase sólida, el ADN (o ARN) de ensayo es adsorbido o fijado de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico de hebra sencilla, fijado es sometido después a hibridación con sondas seleccionadas en las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias concretas basadas en los criterios concretos requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, el tipo de ácido nucleico diana, la fuente de ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc.). Siguiente al lavado de la superficie hibridada para eliminar las moléculas sonda unidas no específicamente, se detecta la hibridación, o incluso se cuantifica, por medio de la marca.

Se deberá entender que esta invención no está limitada a las sondas concretar descritas aquí y concretamente se pretende que abarque al menos las secuencias de ácido nucleico que sean hibridables con las secuencias descritas o sean análogos funcionales de estas secuencias.

Para las aplicaciones en las que los segmentos de ácido nucleico de la presente invención son incorporadas a vectores, tales como plásmidos, cósmidos, o virus, estos segmentos pueden ser combinados con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios para enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificadores, y similares, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferiblemente por la facilidad de preparación y el uso del protocolo de ADN recombinante
deseado.

Los segmentos de ADN que codifican un gen específico pueden ser introducidos en células huésped recombinantes y empleados para expresar una proteína estructural o reguladora específica. Alternativamente, a través de la aplicación de técnicas de ingeniería genética, se pueden emplear subporciones o derivados de genes seleccionados. Se pueden aislar regiones aguas arriba que contienen regiones reguladoras tales como regiones promotoras y con posterioridad emplear para la expresión del gen seleccionado.

En una realización alternativa, los ácidos nucleicos HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha empleados pueden codificar realmente constructos antisentido que hibridan, en condiciones intracelulares, con un ácido nucleico HNF1\alpha o HNF\alpha, respectivamente. Se pretende que el término "constructo antisentido" haga referencia a ácidos nucleicos, preferiblemente oligonucleótidos, que son complementarios a las secuencias de bases de un ADN o ARN diana. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula diana, se unen específicamente a su ácido nucleico diana e interfieren en la transcripción, la maduración del ARN, el transporte, la traducción y/o la estabilidad.

Los constructos antisentido pueden ser diseñados para que se unan al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso a los límites intrón-exón de un gen. Se pueden emplear constructos de ARN antisentido, o el ADN que codifica tales ARN antisentido para inhibir la transcripción o la traducción génica o ambas en una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo, por ejemplo en una célula huésped animal, incluyendo un sujeto humano. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden "nucleótidos complementarios" son aquellas que son susceptibles de emparejamiento de bases conforme a las reglas de complementariedad de Watson y Crick normalizadas. Esto es, las purinas más grandes formarán pares de bases con las pirimidinas más pequeñas para formar combinaciones de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con timina (A:T), en el caso del ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U), en el caso del ARN. La inclusión de bases menos comunes tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras en las secuencias de hibridación no interfiere en el emparejamiento.

Según se utilizan aquí, los términos "complementarias" significan secuencias de ácidos nucleicos que son sustancialmente complementarias en toda su longitud y tienen muy pocos emparejamientos erróneos de bases. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleico de quince bases de longitud se pueden calificar de complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en trece o catorce posiciones únicamente con un solo emparejamiento erróneo. Naturalmente, las secuencias de ácido nucleico que son "completamente complementarias" serán secuencias de ácido nucleico que son completamente complementarias a lo largo de toda su longitud y no tienen emparejamientos erróneos de bases.

También se contemplan otras secuencias con un menor grado de homología. Por ejemplo, se podría diseñar un constructo antisentido que tuviera regiones limitadas de elevada homología, pero también contuviera una región no homóloga (v.g., una ribozima). Estas moléculas, aunque tienen una homología de menos del 50%, podrían unirse a secuencias diana en condiciones apropiadas.

Si bien se puede emplear toda o parte de la secuencia de los genes HNF1\alpha, HNF1\beta, HNF4\alpha en el contexto de un constructo antisentido, los oligonucleótidos cortos son más fáciles de elaborar e incrementan la accesibilidad in vivo. No obstante, tanto la afinidad de unión como la especificidad de la secuencia de un oligonucleótido antisentido a su diana complementaria aumentan al aumentar la longitud. Se contempla que se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más pares de bases. Se puede determinar fácilmente si un ácido nucleico antisentido dado es eficaz para dirigirse al gen de la célula huésped correspondiente simplemente sometiendo a ensayo los constructos in vitro para determinar si la función de los genes endógenos resulta afectada o si la expresión de los genes relacionados que tienen secuencias complementarias resulta afectada.

En algunas realizaciones, se puede desear emplear constructos antisentido que incluyan otros elementos, por ejemplo, aquellos que incluyan propino C-5 pirimidinas. Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen análogos propino C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con una elevada afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica (Wagner y col., 1993).

En toda la solicitud, se pretende que el término "constructo de expresión" incluya cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico que codifique un producto génico en el que parte o toda la secuencia codificadora del ácido nucleico sea susceptible de ser transcrita. El transcrito puede ser traducido a una proteína, pero no necesita serlo. Así, en ciertas realizaciones, en la expresión se incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de un ARN a un producto génico. En otras realizaciones, la expresión incluye únicamente la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar constructos antisentido.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico está bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" hace referencia a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o introducida en la maquinaria sintética, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen. La frase "bajo el control transcripcional" significa que el promotor está en la localización y orientación correctas con relación al ácido nucleico para controlar la iniciación mediante la ARN polimerasa y la expresión del gen.

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El término promotor se utilizará aquí para referirse a un grupo de moléculas para el control transcripcional que se agrupan en torno al sitio de iniciación para la ARN polimerasa II. Muchos de los conceptos acerca de cómo se organizan los promotores derivan de los análisis de diversos promotores virales, incluyendo los de la timidina quinasa (tk) de HSV y las unidades de transcripción temprana de SV40. Estos estudios, aumentados por trabajos más recientes, han demostrado que los promotores están compuestos de módulos funcionales discretos, constando cada uno de aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para proteínas activadoras o represoras de la transcripción.

Al menos un módulo de cada promotor funciona para situar el sitio de inicio de la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de la caja TATA, tal como el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que cubre el propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de iniciación.

Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación de la transcripción. Típicamente, estos están localizados en la región 30-110 pb aguas arriba del sitio de iniciación, aunque se ha demostrado recientemente que varios promotores también contienen elementos funcionales aguas abajo del sitio de iniciación. El espaciamiento entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de manera que se preserva la función promotora cuando los elementos son invertidos o movidos con respecto a los otros. En el promotor tk, el espaciamiento entre los elementos promotores puede ser aumentado a 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales puede funcionar cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.

No se cree que el promotor concreto que se emplea para controlar la expresión de un ácido nucleico sea crítico, con tal que sea capaz de expresar el ácido nucleico en la célula buscada como diana. De este modo, cuando se busca como diana una célula humana, es preferible situar la región codificadora del ácido nucleico adyacente a, y bajo el control de, un promotor que sea susceptible de ser expresado en una célula humana. En términos generales, en semejante promotor se podría incluir un promotor humano o viral. Entre los promotores preferidos se incluyen los derivados de HSV, y el promotor de HNF1\alpha (ver por ejemplo, la Fig. 22), HNF1\beta o HNF4\alpha (ver por ejemplo la Fig. 13). La secuencia parcial del gen HNF1\beta humano incluyendo el promotor también ha sido identificada por los autores de la presente invención y consignada en la base de datos GenBank bajo el número de acceso U90279-90287 y U96179 (SEC ID NUM: 128). Otra realización preferida es el promotor controlado de la tetraciclina.

En algunas otras realizaciones, se pueden utilizar el promotor génico temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40 y las largas repeticiones terminales del virus del sarcoma de Rous para obtener un elevado nivel de expresión de transgenes. También se contempla el uso de otros promotores virales o de fagos de células de mamíferos o bacterianos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de un transgen, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. En las Tablas 1 y 2 se enumeran varios elementos/promotores que pueden ser empleados, en el contexto de la presente invención, para regular la expresión de un transgen. No se pretende que ésta sea una lista completa de todos los posibles elementos implicados en la promoción de la expresión de un transgen sino que, simplemente, sea un ejemplo de los mismos.

Los intensificadores fueron detectados originalmente como elementos genéticos que incrementaban la transcripción de un promotor localizado en una posición distante sobre la misma molécula de ADN. Esta capacidad para actuar a lo largo de una gran distancia tiene pocos precedentes en los estudios clásicos de la regulación de la transcripción en procariotas. Trabajos posteriores han demostrado que las regiones de ADN con actividad intensificadora están organizados casi como los promotores. Esto es, están compuestas de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales.

La diferencia básica entre intensificadores y promotores es operacional. Una región identificadora como un todo es capaz de estimular la transcripción a distancia; esta necesidad no se verifica para una región promotora o para sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor puede tener uno o más elementos que dirigen la iniciación de la síntesis de ARN a un sitio concreto y en una orientación concreta, mientras que los intensificadores carecen de estas especificidades. Los promotores y los intensificadores son a menudo solapantes y contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular similar.

Adicionalmente, se podría utilizar también cualquier combinación de promotor/intensificador (como para la Base de Datos de Promotores Eucarióticos EPDB) para conducir la expresión de un transgen. Otra posible realización es la utilización de un sistema de expresión citoplásmico T3, T7 o SP6. Las células eucarióticas pueden tolerar la transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de liberación o como un constructo de expresión genético adicional.

TABLA 1

Promotor
Cadena Pesada de la Inmunoglobulina	c-HA-ras
Cadena Ligera de la Inmunoglobulina	Insulina
Receptor de Células T	Molécula de Adherencia Celular Neural (NCAM)
HLA DQ\alpha y DQ\beta	Antitripsina \alpha-1
Interferón \beta	Histona H2B(TH2B)
Interleuquina 2	Colágeno de Ratón o de Tipo I
Receptor de Interleuquina 2	Proteínas Reguladas por Glucosa (GRP94 y GRP78)
MHC Clase II 5	Hormona del Crecimiento de Rata
MHC Clase II HLA-DR\alpha	Amiloide A de Suero Humano (SAA)
\beta-Actina	Troponina I (TNI)
Creatina Quinasa Muscular	Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas
Prealbúmuna (Transtiretina)	Distrofia Muscular de Duchenne
Elastasa/	SV40
Metalotioneína	Polioma
Colagenasa	Retrovirus
Gen de la Albúmina	Papilomavirus
\alpha-Fetoproteína	Virus de la Hepatitis B
\alpha-Globina	Virus de la Inmunodeficiencia Humana
\beta-Globina	Citomegalovirus
c-fos	Virus de la Leucemia de los Monos Gibones

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TABLA 2

Elemento	Inductor
MTII	Ester de Forbol (TPA) Metales pesados
MMTV (virus del tumor mamario de ratón)	Glucocorticoides
Interferón \beta	poli(rl)X poly(rc)
Adenovirus 5 E2	Ela
c-jun	Ester de Forbol (TPA), H_{2}O_{2}
Colagenasa	Ester de Forbol (TPA)
Estromelisina	Ester de Forbol (TPA), IL-1

TABLA 2 (continuación)

Elemento	Inductor
SV40	Ester de Forbol (TPA)
Gen MX Murino	Interferón, Virus de la Enfermedad de Newcastle
Gen GRP78	A23187
Macroglobulina \alpha-2	IL-6
Vimentina	Suero
Gen H-2kB del MHC de Clase I	Interferón
HSP70	Ela, Antígeno T Grande de SV40
Proliferina	Ester de Forbol (TPA)
Factor de Necrosis Tumoral	FMA
Gen \alpha de la Hormona Estimuladora del Tiroides	Hormona Tiroidea

El uso del sistema de baculovirus implicará un elevado nivel de expresión del potente promotor del virus poliedro.

Típicamente se incluirá una señal de adenilación para efectuar la poliadenilación apropiada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica acertada de la invención, y se puede emplear cualquiera de tales secuencias. Entre las realizaciones preferidas se incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, convenientes y conocido su buen funcionamiento en diferentes células diana. También se contempla como elemento de la casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para aumentar los niveles del mensaje y para minimizar la lectura por medio de la casete en otras secuencias.

También se puede requerir una señal de iniciación específica para la traducción eficaz de las secuencias codificadoras. Entre estas señales se incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales para el control exógeno de la traducción, incluyendo el codón de iniciación ATG. Un experto normal en la técnica podría fácilmente ser capaz de determinar esto y de proporcionar las señales necesarias. Es bien conocido que el codón de iniciación debe estar "en marco" con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las señales para el control exógeno de la traducción y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede ser intensificada mediante la inclusión de elementos intensificadores de la transcripción apropiados (Bittner y col., 1987).

En diversas realizaciones de la invención, el constructo de expresión puede comprender un virus o constructo diseñado derivado de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus para introducirse en las células vía endocitosis mediada por receptores y para integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar los genes virales establemente y eficazmente los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes foráneos a células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus utilizados como vectores fueron los virus con ADN incluyendo los papovavirus (virus 40 de simios, virus del papiloma bovino, y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y virus adenoasociados. Los retrovirus también son vehículos de transferencia génica atractivos (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin 1986) como lo son el virus vaccinia (Ridgeway, 1988) y el virus adenoasociado (Ridgeway, 1988). Semejantes vectores
pueden ser utilizados para (i) transformar líneas celulares in vitro con el fin de expresar proteínas de interés o (ii) para transformar células in vitro o in vivo para proporcionar polipéptidos terapéuticos en un escenario de terapia génica.

En algunas realizaciones, el vector es HSV. Debido a que HSV es neurotrópico, ha generado un interés considerable para tratar los trastornos del sistema nervioso. Puesto que las células \beta pancreáticas secretoras de insulina comparten muchas características con las neuronas, el HSV puede ser útil para distribuir genes en las células \beta y para la terapia génica de la diabetes. Además, la capacidad de HSV para establecer infecciones latentes en células neuronales que no están en división sin integrarse en el cromosoma de la célula huésped o alterar de otro modo el metabolismo de las células huésped, junto con la existencia de un promotor que es activo durante la latencia. Y aunque se ha prestado mucha atención a las aplicaciones neurotrópicas de HSV, este vector también puede ser explotado para otros tejidos.

Otro factor que hace al HSV un vector atractivo es el tamaño y la organización del genoma. Puesto que HSV es grande, la incorporación de genes o casetes de expresión múltiples es menos problemática que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de diferentes secuencias de expresión viral con funcionamiento variable (temporal, resistencia, etc.) hace posible controlar la expresión hasta un grado mayor que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes empalmados, facilitando adicionalmente las manipulaciones genéticas.

El HSV también es relativamente fácil de manipular y se puede desarrollar a títulos elevados. En ese caso, la distribución es un problema menor, tanto en términos de los volúmenes necesarios para alcanzar un MOI suficiente como en la disminución de la necesidad de repetir las dosificaciones.

F. Proteínas Codificadas

Una vez que ha sido determinada la secuencia codificadora completa de un gen asociado con un marcador, el gen puede ser insertado en un sistema de expresión apropiado. El gen puede ser expresado en cualquier número de sistemas de expresión de ADN recombinante diferentes para generar grandes cantidades del producto polipeptídico, que puede después ser purificado y utilizado para vacunar animales para generar antisueros con los cuales llevar a cabo estudios adicionales.

Entre los ejemplos de los sistemas vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica se incluyen bacterias tales como E. coli, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, baculovirus, y sistemas de expresión en mamíferos tales como células COS o CHO. En una realización, los polipéptidos son expresados en E. coli y en sistemas de expresión de baculovirus. Se puede expresar un gen completo o, alternativamente, se pueden producir los fragmentos del gen que codifican las porciones del polipéptido.

En una realización, la secuencia génica que codifica el polipéptido es analizada para detectar las supuestas secuencias transmembrana. Tales secuencias son típicamente muy hidrófobas y son detectadas fácilmente mediante el uso de soporte lógico para el análisis de la secuencia normalizado, tal como MacVector (IBI, New Haven, CT). La presencia de secuencias transmembrana a menudo es perjudicial cuando se sintetiza una proteína recombinante en muchos sistemas de expresión, especialmente en E. coli, puesto que esto conduce a la producción de agregados insolubles que son difíciles de renaturalizar a la conformación nativa de la proteína. La supresión de secuencias transmembrana típicamente no altera significativamente la conformación de la estructura de la proteína restante.

Por otra parte, las secuencias transmembrana, estando por definición encajadas en una membrana, son inaccesibles. Por consiguiente, los anticuerpos para estas secuencias no demostrarán ser útiles para los estudios in vivo o in situ. La supresión de las secuencias que codifican transmembrana de los genes utilizados para la expresión se puede lograr mediante técnicas normalizadas. Por ejemplo, se pueden utilizar sitios para enzimas de restricción colocados casualmente para separar mediante corte el fragmento génico deseado, o se puede utilizar la amplificación de tipo PCR para amplificar únicamente la parte deseada del gen. El practicante experto comprenderá que semejantes cambios pueden ser diseñados de manera que no cambie el marco de lectura para la traducción de las porciones aguas abajo de la secuencia que codifica la proteína.

En una realización, el análisis de la secuencia mediante ordenador se utiliza para determinar la localización de los epítopos determinantes antigénicos principales pronosticados del polipéptido. El soporte lógico capaz de llevar a cabo este análisis es fácilmente asequible comercialmente, por ejemplo MacVector (IBI, New Haven, CT). En el soporte lógico se utilizan típicamente algoritmos normalizados tales como los métodos de Kyte/Doolittle o Hopp/Woods para localizar las secuencias hidrófilas que se encuentran característicamente sobre la superficie de las proteínas y que, por consiguiente, es probable que actúen como determinantes antigénicos.

Una vez que se ha realizado este análisis, se pueden preparar polipéptidos que contienen al menos las características esenciales del determinante antigénico y que pueden ser empleados para la generación de antisueros contra el polipéptido. Se pueden construir minigenes o fusiones génicas que codifiquen estos determinantes e insertarlos en vectores de expresión mediante métodos normalizados, por ejemplo, utilizando metodología para la PCR.

El gen o fragmento génico que codifica un polipéptido puede ser insertado en un vector de expresión mediante técnicas de subclonación normalizadas. En una realización, se utiliza un vector de expresión E. coli que produce el polipéptido recombinante en forma de una proteína de fusión, permitiendo una rápida purificación por afinidad de la proteína. Los ejemplos de tales sistemas de expresión de proteínas de fusión son el sistema de la glutatión S-transferasa (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de proteínas de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA).

Algunos de estos sistemas producen polipéptidos recombinantes que portan únicamente un pequeño número de aminoácidos adicionales, que es improbable que afecten a la capacidad antigénica del polipéptido recombinante. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG como el sistema 6xHis añaden sólo secuencias cortas, se sabe que estos dos son escasamente antigénicos y que no afectan adversamente al plegamiento del polipéptido a su conformación natural. Otros sistemas de fusión producen polipéptidos en los que es deseable separar mediante corte la pareja de fusión del polipéptido deseado. En una realización, la pareja de fusión está conectada al polipéptido recombinante mediante una secuencia peptídica que contiene un sitio de reconocimiento específico para una proteasa. Los ejemplos de las secuencias adecuadas son aquellas reconocidas por la proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (Life Technologies, Gaithersburgh, MD) o el Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).

Las células bacterianas recombinantes, por ejemplo E. coli, se hacen crecer en cualquiera de varios medios adecuados, por ejemplo LB, y se induce la expresión del polipéptido recombinante añadiendo IPTG al medio o cambiando la incubación a una temperatura más alta. Tras cultivar las bacterias durante un período adicional de entre 2 a 24 horas, las células se recogen mediante centrifugación y se lavan para eliminar el medio residual. Las células bacterianas se lisan después, por ejemplo, mediante rotura en un homogeneizador celular y se centrifugan para separar los cuerpos de inclusión densos y las membranas celulares de los componentes celulares solubles. Esta centrifugación se puede realizar en condiciones en las que los cuerpos de inclusión densos son enriquecidos selectivamente mediante la incorporación de azúcares tales como sacarosa al tampón y centrifugación a una velocidad selectiva.

En otra realización, el sistema de expresión utilizado es uno dirigido por el promotor del poliedro de baculovirus. El gen que codifica el polipéptido puede ser manipulado mediante técnicas normalizadas con el fin de facilitar la clonación en el vector baculovirus. Un vector baculovirus es el vector pBlueBac (Invitrogen, Sorrento, CA). El vector que porta el gen para el polipéptido es transfectado en células de Spodoptera frugiperda (Sf9) mediante protocolos normalizados, y las células se cultivan y se tratan para producir el antígeno recombinante. Ver Summers y col., A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station.

Como alternativa a los polipéptidos recombinantes, se pueden preparar péptidos sintéticos correspondientes a los determinantes antigénicos. Semejantes péptidos tienen al menos seis restos aminoácido de longitud, y pueden contener hasta aproximadamente 35 restos, que es aproximadamente el límite de longitud superior de las máquinas de síntesis de péptidos automáticas, tales como las asequibles de Applied Biosystems (Foster City, CA). La utilización de tales péptidos pequeños para la vacunación requiere típicamente la conjugación del péptido a una proteína portadora inmunogénica tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B, hemocianina de lapa ojo de cerradura o seralbúmina bovina. Los métodos para realizar esta conjugación son bien conocidos en la técnica.

En otra realización, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Estas pueden ser, por ejemplo, mínimas variantes de la secuencia del polipéptido que surgen debido a la variación natural en la población o pueden ser homólogas encontradas en otras especies. También pueden ser secuencias que no se produzcan naturalmente pero que sean suficientemente similares como para funcionar de una manera similar y/o provocar una respuesta inmune que presente reacción cruzada con las formas naturales del polipéptido. Las variantes de la secuencia pueden ser preparadas mediante métodos normalizados de mutagénesis dirigida al sitio tales como los descritos más abajo en la siguiente sección.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido pueden ser por sustitución, inserción o deleción. Las variantes por deleción carecen de uno o más restos de la proteína natural que no son esenciales para la función de la actividad inmunogénica, y son ejemplificada por las variantes que carecen de secuencias señal secretoras o de las secuencias señal que dirigen una proteína a unirse a una parte concreta de la célula. Un ejemplo de la última secuencia es el dominio SH2, que induce la unión de la proteína a restos fosfotirosina.

Las variantes por sustitución contienen típicamente el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios en la proteína, y pueden ser diseñadas para modular una o más propiedades del polipéptido tales como la estabilidad frente a la escisión proteolítica. Las sustituciones son preferiblemente conservativas, esto es, un aminoácido es reemplazado por otro de forma y carga similares. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina por serina; arginina por lisina; asparragina por glutamina o histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparragina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparragina o glutamina; isoleucina por leucina o valina; leucina por valina o isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina o isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina o metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptófano por tirosina; tirosina por triptófano o fenilalanina; y valina o isoleucina o leucina.

Entre las variantes por inserción se incluyen proteínas de fusión tales como las utilizada para permitir la rápida purificación del polipéptido y también se pueden incluir proteínas híbridas que contienen secuencias de otras proteínas y polipéptidos que son homólogos del polipéptido. Por ejemplo, en una variante por inserción se pueden incluir porciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de una especia, junto con porciones del polipéptido homólogo de otras especies. En otras variantes por inserción se pueden incluir aquellas en las que se introducen aminoácidos adicionales en la secuencia codificadora del polipéptido. Estas son típicamente inserciones más pequeñas que las proteínas de fusión descritas antes y son introducidas, por ejemplo, en un sitio de escisión con proteasa.

En una realización, se identifican los determinantes antigénicos principales del polipéptido mediante un enfoque empírico en el que las porciones del gen que codifica el polipéptido son expresadas en un huésped recombinante, y se someten a ensayo las proteínas resultantes en cuanto a su capacidad para lograr una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede utilizar PCR para preparar un intervalo de ADNc que codifica péptidos que carecen sucesivamente de fragmentos más grandes del extremo C de la proteína. La actividad inmunoprotectora de cada uno de estos péptidos identifica después aquellos fragmentos o dominios del polipéptido que son esenciales para esta actividad. Experimentos adicionales en los que sólo se elimina un pequeño número de aminoácidos en cada interacción permiten después la localización de los determinantes antigénicos del polipéptido.

Otra realización para la preparación de los polipéptidos según la invención es el uso de miméticos de péptidos. Los miméticos son péptidos que contienen moléculas que imitan los elementos de la estructura secundaria de la proteína. Ver, por ejemplo, Johnson y col., "Peptide Turn Mimetics" en BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY. Pezzuto y col., Eds., Chapman y Hall, New York (1993). La explicación fundamental en pos del uso de los miméticos de péptidos es que el esqueleto peptídico de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de manera que se faciliten las interacciones moleculares, tales como las de anticuerpos y antígenos. Se espera que un mimético de péptido permita interacciones moleculares similares a la molécula natural.

Las aplicaciones acertadas del concepto de mimético de péptido han sido enfocadas hasta ahora a los miméticos de los giros \beta en las proteínas, que se sabe que son altamente antigénicos. Probablemente la estructura del giro \beta en un polipéptido puede ser pronosticada mediante algoritmos basados en ordenadores como se ha tratado antes. Una vez que se determinan los aminoácidos componentes del giro, se pueden construir los miméticos de péptidos para lograr una orientación espacial similar de los elementos esenciales de las cadenas laterales de los aminoácidos.

Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de un gen y aún se obtiene una molécula funcional que codifica una proteína o polipéptido con características deseables. Lo siguiente es un estudio basado en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear un equivalente, o incluso una molécula de segunda generación, mejorada. Los cambios de aminoácidos se pueden lograr cambiando los codones de la secuencia de ADN, según los siguientes datos.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, las regiones de unión al antígeno de los anticuerpos o los sitios de unión en moléculas sustrato. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza de la proteína la que define la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína, y en su secuencia codificadora de ADN fundamental, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. De este modo los autores de la presente invención contemplan que se pueden realizar diferentes cambios en las secuencias de ADN de los genes sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

Al realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína es comprendida generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982).

TABLA 3

Aminoácidos	Codones
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	UGC	UGU
Acido aspártico	Asp	D	GAC	GAU
Acido glutámico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidina	His	H	CAC	CAU
Isoleucina	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Metionina	Met	M	AUG
Asparragina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamina	Gln	O	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serina	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valina	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Triptófano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC	UAU

Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su carácter hidrófobo y sus características de carga (Kyte y Doolittle, 1982), estos son: Isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparragina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Es conocido en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituido por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático o puntuación similar y todavía produzca una proteína con una actividad biológica similar, es decir, todavía se obtenga una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar semejantes cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén entre \pm2, son particularmente preferidas aquellas que están entre \pm1, y son incluso más particularmente preferidas aquellas que están entre \pm0,5.

También se entiende en la técnica que se puede realizar eficazmente la sustitución de aminoácidos similares basándose en el carácter hidrófilo. La Patente de los Estados Unidos Núm. 4.554.101, incorporada aquí como referencia, establece que el mayor carácter hidrófilo medio local de una proteína, puesto que está gobernado por el carácter hidrófilo de sus aminoácidos adyacentes, se corresponde con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores para el carácter hidrófilo a los restos aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina
(-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor para el carácter hidrófilo similar y todavía se obtiene una proteína biológicamente equivalente y una proteína inmunológicamente equivalente. En semejantes cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores para el carácter hidrófilo se encuentren entre \pm2, son particularmente preferidas aquellas que están entre \pm1, y son incluso más particularmente preferidas aquellas que están entre \pm0,5.

Como se ha tratado antes, las sustituciones de aminoácidos están basadas generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración algunas de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica y se incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparragina; y valina, leucina e isoleucina.

G. Mutagénesis de Sitio Específico

La mutagénesis de sitio específico es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o de proteínas o péptidos equivalentes funcionales biológicamente, a través de la mutagénesis específica del ADN esencial. La técnica proporciona adicionalmente una pronta capacidad para preparar y someter a ensayo variantes de secuencia, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos del ADN. La mutagénesis de sitio específico permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de nucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora con un tamaño y complejidad de la secuencia suficiente para formar un dúplex estable a ambos lados de la zona de supresión que esté siendo atravesada. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con alrededor de 5 a 10 restos en ambos lados de la zona de la secuencia que esté siendo alterada.

En general, el mecanismo de mutagénesis dirigida al sitio es bien conocido en la técnica. Según se apreciará, en la técnica se emplea típicamente un vector bacteriófago que existe tanto en forma de hebra sencilla como en forma de doble hebra. Entre los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio se incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos vectores son asequibles comercialmente y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la técnica. También se emplean rutinariamente plásmidos de doble hebra en la mutagénesis dirigida al sitio, lo que elimina la etapa de transferencia del gen de interés de un fago a un plásmido.

En general, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza obteniendo primero un vector de hebra sencilla, o fundiendo las dos hebras de un vector de doble hebra que incluya en su secuencia una secuencia de ADN que codifique la proteína deseada. Se prepara sintéticamente un cebador oligonucleotídico que porte la secuencia mutada deseada. El cebador es recocido después con la preparación de ADN de hebra sencilla, y sometido a enzimas de polimerización de ADN tales como el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli, con el fin de completar la síntesis de la hebra que porta la mutación. De este modo, se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia no mutada original y la segunda hebra porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se utiliza después para transformar las células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan el ordenamiento de la secuencia mutada.

La preparación de variantes de secuencia del gen seleccionado utilizando mutagénesis dirigida al sitio se proporciona como un medio para producir especies potencialmente útiles y no se pretende que sea limitante, como lo son otras maneras en las que pueden ser obtenidas variantes de secuencia de los genes. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican el gen deseado pueden ser tratados con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia.

H. Expresión y Purificación de las Proteínas Codificadas 1. Expresión de Proteínas de ADNc Clonados

Las especies de ADNc especificadas en la SEC ID NUM: 1, la SEC ID NUM: 3, la SEC ID NUM: 5, la SEC ID NUM: 7, y HNF1\alpha pueden ser expresadas en forma de péptidos o proteínas codificados. En otras realizaciones las especies de ADNc especificadas en la SEC ID NUM: 78, la SEC ID NUM: 34, la SEC ID NUM: 36, la SEC ID NUM: 38, SEC ID NUM: 40, la SEC ID NUM: 42, la SEC ID NUM: 44, la SEC ID NUM: 46, SEC ID NUM: 48, la SEC ID NUM: 50, la SEC ID NUM: 52, la SEC ID NUM: 54, y HNF4\alpha pueden ser expresadas en forma de péptidos o proteínas codificados. Las especies de ADNc especificadas en la SEC ID NUM: 128, y HNF1\beta pueden ser expresadas en forma de péptidos o proteínas codificados. El diseño de segmentos de ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico se puede realizar mediante técnicas generalmente bien conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Se cree que virtualmente cualquier sistema de expresión puede ser empleado en la expresión de las secuencias de ácido nucleico reivindicadas.

Las secuencias tanto de ADNc como genómicas son adecuadas para la expresión eucariótica, puesto que la célula huésped generalmente madurará los transcritos genómicos para rendir ARNm funcional para la traducción a proteína. En términos generales, puede ser más conveniente emplear como gen recombinante una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas como que el tamaño del gen será generalmente mucho menor y más fácil de emplear para transfectar la célula diana que un gen genómico, lo que típicamente será de hasta un orden de magnitud mayor que el gen de ADNc. No obstante, el autor de la presente invención no excluye la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen concreto cuando se desee.

Según se utiliza aquí, se pretende que los términos células "diseñadas" y "recombinantes" hagan referencia a una célula en la que ha sido introducido un segmento de ADN endógeno o gen, tal como un ADNc o gen. Por consiguiente, las células diseñadas son distinguibles de las células de origen natural que no contienen un segmento de ADN o gen exógeno introducido recombinantemente. Las células diseñadas son en ese caso células que tienen un gen o varios genes introducidos por medio de la mano del hombre. Entre las células recombinantes se incluyen aquellas que tienen un ADNc o un ADN genómico introducido, y también se incluyen los genes situados adyacentes a un promotor no asociado naturalmente con el gen introducido concreto.

Para expresar una proteína o péptido recombinantes, ya sea mutante o de tipo salvaje, según la presente invención se podría preparar un vector de expresión que comprendiera uno de los ácidos nucleicos aislados reivindicados bajo el control de uno o más promotores. Para poner una secuencia codificadora "bajo el control de" un promotor, se sitúa el extremo 5' del sitio de iniciación de la traducción del marco de lectura generalmente entre aproximadamente 1 y 50 nucleótidos "aguas abajo" del (esto es, 3' del) promotor elegido. El promotor "aguas arriba" estimula la transcripción del ADN insertado y promueve la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de "expresión recombinante" en el contexto utilizado aquí.

Se encuentran disponibles muchas técnicas normalizadas para construir los vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos apropiados y las secuencias para el control de la transcripción/traducción con el fin de lograr la expresión de la proteína o el péptido en una diversidad de sistemas de expresión en huéspedes. Entre los tipos celulares asequibles para la expresión se incluyen, pero no están limitados a, bacterias, tales como E. coli y B. subtilis transformadas con vectores de expresión con ADN de fago, ADN plasmídico o ADN cosmídico recombinantes.

Ciertos ejemplos de huéspedes procarióticos son E. coli cepa RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli \chi 1776 (ATCC Núm. 31537) así como E. coli W3110 (F-, lambda-, prototróficas, ATCC Núm. 273325); bacilos tales como Bacillus subtilis; y otras enterobacteriaceas tales como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, y diferentes especies de Pseudomonas.

En general, se utilizan vectores plasmídicos que contienen secuencias replicón y de control que están derivadas de especies compatibles con la célula huésped en relación con estos huéspedes. El vector porta normalmente un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli a menudo es transformada utilizando pBR322, un plásmido derivado de especies de E. coli. El plásmido pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y de este modo proporciona medios fáciles para identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano o fago debe contener también, o ser modificado para contener, promotores que puedan ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de sus propias proteínas.

Además, los fagos vectores que contienen secuencias replicón y de control que son compatibles con el microorganismo huésped pueden ser utilizados como vectores transformantes en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, el fago lambda GEM®-11 puede ser utilizado para elaborar un fago vector recombinante que puede ser utilizado para transformar células huésped, tales como E. coli LE392.

Entre los vectores útiles adicionales se incluyen vectores pIN (Inouye y col., 1985); y vectores pGEX, para el uso para generar proteínas de fusión solubles con glutation-S-tranferasa (GST) para la posterior purificación y separación o escisión. Otras proteínas de fusión adecuadas son aquellas con \beta-galactosidasa, ubicuitina, o similares.

Entre los promotores que se utilizan más comúnmente para la construcción de ADN recombinante se incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa (penicilinasa), lactosa y triptófano (trp). Se bien estos son los más comúnmente utilizados, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos, y se han publicado los detalles concernientes a sus secuencias de nucleótidos, posibilitando a los expertos en la técnica ligarlos funcionalmente con vectores plasmídicos.

Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, es utilizado comúnmente (Stinchcomb y col., 1979; Kingsman y col., 1979; Tschemper y col., 1980). Este plásmido contiene el gen trpI, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Núm. 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión trpI como característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Entre las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura se incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., 1968; Holland y col., 1978), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la glucoquinasa. Al construir plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también son ligadas al vector de expresión 3' de la secuencia deseada para ser expresadas para proporcionar la poliadenilación de ARNm y la terminación.

Entre otros promotores adecuados, que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, se incluyen la región promotora de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa anteriormente mencionada, y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de los microorganismos, también se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células derivados de organismos multicelulares. En principio, se puede manejar cualquiera de tales cultivos celulares, ya sea cultivo de vertebrados o de invertebrados. Además de las células de mamíferos, entre estos se incluyen sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (v.g., baculovirus); y sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (v.g., virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (v.g., plásmido Ti) que contienen una o más secuencias codificadoras.

En un sistema de insecto útil, se utiliza el virus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus se desarrolla en células de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificadoras de los ácidos nucleicos aislados son clonadas en regiones no esenciales (por ejemplo el gen poliedro) del virus y se colocan bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor poliedro). La inserción acertada de las secuencias codificadoras produce la inactivación del gen poliedro y la producción de virus recombinantes no ocluidos (esto es, un virus que carece de la cubierta proteinacea codificada por el gen polihedro). Estos virus recombinantes se utilizan después para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que es expresado el gen insertado (v.g., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.215.051).

Los ejemplos de las líneas celulares huésped de mamífero son las células VERO y HeLa, las líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO), las líneas celulares WI38, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN y MCDK. Además, se puede elegir una célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y madure el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (v.g., glucosilación) y maduración (v.g., escisión) de los productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína codificada.

Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para la maduración posterior a la traducción y la modificación de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la modificación y la maduración correctas de la proteína foránea expresada. Entre los vectores de expresión para su uso en células de mamífero se incluyen normalmente un origen de replicación (según sea necesario), un promotor localizado delante del gen que se vaya a expresar, junto con cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitios de empalme de ARN, un sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras de la transcripción. El origen de replicación puede ser proporcionado o bien construyendo el vector para que incluya un origen exógeno, por ejemplo puede estar derivado de SV40 u otra fuente viral (v.g., Polioma, Adeno, VSV, BPV), o bien puede ser proporcionado por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula huésped. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula huésped, a menudo es suficiente el último.

Los promotores pueden estar derivados del genoma de células de mamífero (v.g., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (v.g., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). Adicionalmente, también es posible, y puede ser deseable, utilizar secuencias promotoras o de control asociadas normalmente con la secuencia génica deseada, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus, por ejemplo, los promotores utilizados comúnmente están derivado de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío de SV40 son útiles puesto que ambos son obtenidos fácilmente del virus en forma de un fragmento que también contiene el origen viral de replicación de SV40. También se pueden utilizar fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HinDIII al sitio BglI localizado en el origen de replicación viral.

En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, las secuencias codificadoras pueden ser ligadas a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, v.g., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede ser insertado después en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (v.g., región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es viable y susceptible de expresar proteínas en huéspedes infectados.

También pueden ser requeridas señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de las secuencias codificadoras de ácido nucleico aisladas reivindicadas. Entre estas señales se incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar adicionalmente señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. Un experto normal en la técnica podría ser capaz fácilmente de determinar esta necesidad y de proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de iniciación debe estar en marco (o en fase) con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden tener una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede ser intensificada mediante la inclusión de elementos intensificadores de la transcripción o terminadores de la transcripción apropiados (Bittner y col., 1987).

En la expresión eucariótica, se deseará típicamente incorporar a la unidad de transcripción un sitio de poliadenilación apropiado (v.g., 5'-AATAAA-3') si no hubiera uno contenido en el segmento clonado original. Típicamente, el sitio de adición poli A está situado de aproximadamente 30 a 2.000 nucleótidos "aguas abajo" del sitio de terminación de la proteína en una posición anterior a la terminación de la transcripción.

Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen establemente los constructos que codifiquen las proteínas. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células huésped pueden ser transformadas con vectores controlados mediante los elementos de control de la expresión apropiados (v.g., promotor, intensificador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Siguiente a la introducción del ADN foráneo, se puede permitir que las células diseñadas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar foci, que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares.

Se pueden utilizar varios sistemas de selección, incluyendo, pero no limitados, a los genes de la timidina quinasa del virus de hepes simplex (Wigler y col., 1977), de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y col., 1962), y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., 1980), en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Asimismo, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., O'Hare y col., 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y col., 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y col., 1981); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.

Se contempla que los ácidos nucleicos aislados de la invención puedan ser "sobreexpresados", es decir, expresados a niveles crecientes con relación a su expresión natural en células humanas, o incluso con relación a la expresión de otras proteínas en la célula huésped recombinante. Semejante sobreexpresión puede ser evaluada mediante una variedad de métodos, incluyendo el radiomarcaje y/o la purificación de proteínas. No obstante, se prefieren los métodos simples y directos, por ejemplo, los que implican SDS/PAGE y tinción de proteínas o transferencia western, seguido de análisis cuantitativos, tales como rastreo densitométrico del gel o la transferencia resultante. Un incremento específico del nivel de proteína o péptido recombinantes en comparación con el nivel en células humanas naturales es indicativo de sobreexpresión, puesto que es una abundancia relativa de la proteína específica con relación a las otras proteínas producidas por la célula huésped y, v.g., es visible en un gel.

2. Purificación de las Proteínas Expresadas

Aspectos adicionales de la presente invención tienen que ver con la purificación, y en realizaciones concretas, la purificación sustancias, de una proteína o péptido codificados. El término "proteína o péptido purificados" según se utiliza aquí, se pretende que haga referencia a una composición, aislable de otros componentes, en la que la proteína o el péptido sea purificado hasta cualquier grado con relación a su estado naturalmente obtenible, v.g., en este caso, con relación a su pureza en un extracto de hepatocitos o células \beta. Una proteína o péptido purificados también se refiere por consiguiente a una proteína o a un péptido, libre del entorno en el que se puede producir naturalmente.

Generalmente, "purificado" hará referencia a una composición de proteína o péptido que ha sido sometida a fraccionamiento para eliminar otros varios componentes, y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se utiliza el término "purificado sustancialmente", la denominación hará referencia a una composición en la que la proteína o el péptido forma el componente mayoritario de la composición, constituyendo por ejemplo aproximadamente el 50% o más de las proteínas de la composición.

Diferentes métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o del péptido serán conocidos para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Entre estos se incluyen, por ejemplo, la determinación de la actividad específica de una fracción activa, o la evaluación del número de polipéptidos en una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, para compararla con la actividad específica del extracto inicial, y para de este modo calcular el grado de pureza, evaluado aquí mediante un "número de veces purificado". Las unidades reales utilizadas para representar la cantidad de actividad serán, por supuesto, dependientes de la técnica de análisis concreta elegida para seguir la purificación y de si la proteína o péptido manifiesta o no una actividad detectable.

Diferentes técnicas adecuadas para el uso en la purificación de proteínas serán conocidas por los expertos en la técnica. Entre estas se incluyen, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, polietilenglicol, anticuerpos y similares o mediante desnaturalización, seguido de centrifugación, etapas cromatográficas tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase reversa, hidroxiapatito y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnica. Como es generalmente conocido en la técnica, se cree que se puede cambiar el orden de realización de las diferentes etapas de purificación, o que se pueden omitir ciertas etapas, y todavía se produce un método adecuado para la preparación de la proteína o el péptido sustancialmente purificado.

No existe el requerimiento general de que la proteína o el péptido sea suministrado siempre en su estado más purificado. Por supuesto, se contempla que productos menos purificados sustancialmente tendrán utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial se puede completar utilizando menos etapas de purificación combinadas, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC producirá generalmente una purificación varias veces superior que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los métodos que manifiestan un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteico, o en el mantenimiento de la actividad de la proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977). Por consiguiente, se apreciará que en condiciones de electroforesis diferentes, los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados pueden variar.

I. Preparación de Anticuerpos Específicos para Proteínas Codificadas Generación de Anticuerpos

Para algunas realizaciones, se deseará producir anticuerpos que se unan con una alta selectividad a los productos proteicos de un ácido nucleico aislado seleccionado del grupo que comprende la SEC ID NUM: 1, la SEC ID NUM: 3, la SEC ID NUM: 5, la SEC ID NUM: 7, o cualquier otro mutante de HNF1\alpha; la SEC ID NUM: 78, la SEC ID NUM: 34, la SEC ID NUM: 36, la SEC ID NUM: 38, SEC ID NUM: 40, la SEC ID NUM: 42, la SEC ID NUM: 44, la SEC ID NUM: 46, SEC ID NUM: 48, la SEC ID NUM: 50, la SEC ID NUM: 52, la SEC ID NUM: 54, o cualquier otro mutante de HNF4\alpha, la SEC ID NUM: 128 (HNF1\beta) o cualquier mutante de HNF1\beta. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica (Ver, v.g., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporada aquí como referencia).

Los métodos para generar anticuerpos policlonales son bien conocidos en la técnica. Brevemente, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando un animal con una composición antigénica y recogiendo los antisueros del animal inmunizado. Se puede utilizar una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente, el animal utilizado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un cobaya o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, el conejo es una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales.

Como es bien conocido en la técnica, la inmunogenicidad de una composición dada puede variar. Por consiguiente, a menudo es necesario reforzar el sistema inmune del huésped, como se puede lograr acoplando un inmunógeno peptídico o polipeptídico a un portador. Los portadores ejemplares y preferidos son la hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) y la seralbúmina bovina (BSA). También se pueden utilizar como portadores otras albúminas tales como la ovalbúmina, la seralbúmina de ratón o la seralbúmina de conejo. Los medios para conjugar un polipéptido a una proteína portadora son bien conocidos en la técnica e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-diazotada.

Como es asimismo bien conocido en la técnica, la inmunogenicidad de una composición inmunogénica concreta puede ser intensificada mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como coadyuvantes. Entre los coadyuvantes ejemplares y preferidos se incluyen el coadyuvante de Freund completo (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Micobacterium tuberculosis neutralizado), coadyuvantes de Freund incompletos y coadyuvante de hidróxido de aluminio.

La cantidad de composición de inmunógeno utilizada en la producción de anticuerpos policlonales varía dependiendo de la naturaleza del inmunógeno así como del animal utilizado para la inmunización. Se pueden utilizar una variedad de rutas para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede ser verificada tomando muestras de sangre del animal inmunizado en diferentes momentos de la inmunización. También se puede administrar una segunda inyección de refuerzo. Se repite el procedimiento de refuerzo y de titulación hasta que se alcanza un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado puede ser desangrado y el suero aislado y almacenado, y/o en algunos casos el animal puede ser utilizado para generar MAb. Para la producción de anticuerpos policlonales de conejo, el animal puede ser desangrado a través de una vena de la oreja o alternativamente mediante punción cardiaca. La sangre retirada se deja coagular y después se centrifuga para separar los componentes de suero de las células completas y de los coágulos sanguíneos. El suero puede ser utilizado tal cual para diferentes aplicaciones o la fracción de anticuerpo deseada puede ser purificada mediante métodos bien conocidos, tales como cromatografía de afinidad utilizando otro anticuerpo o péptido unido a una matriz sólida.

Los anticuerpos monoclonales (MAb) pueden ser preparados fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas, tales como aquellas ejemplificadas en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.196.265, incorporadas aquí como referencia. Típicamente, esta técnica implica inmunizar un animal adecuado con una composición de inmunógeno seleccionada, v.g., una proteína, polipéptido o péptido expresados purificados o parcialmente purificados. La composición inmunizadora es administrada de una manera que estimule eficazmente las células productoras de anticuerpos.

Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAb) comienzan junto a las mismas líneas que aquellos para preparar anticuerpos policlonales. Los animales preferidos son roedores tales como ratones y ratas, no obstante, también es posible el uso de células de conejo, oveja o rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, págs. 60-61), pero ser prefieren los ratones, siendo el más preferido el ratón BALB/c puesto que es el que se utiliza más rutinariamente y generalmente proporciona un mayor porcentaje de fusiones estables.

Los animales son inyectados con un antígeno como se ha descrito antes. El antígeno puede estar acoplado a moléculas portadoras tales como hemocianina de lapa ojo de cerradura si fuera necesario. El antígeno podría ser mezclado típicamente con coadyuvante, tal como coadyuvante de Freund completo o incompleto. Se podrían producir inyecciones de refuerzo con el mismo antígeno a intervalos de aproximadamente dos semanas.

Siguiente a la inmunización, se seleccionan células somáticas con el potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos (células B), para el uso en el protocolo de generación de MAb. Estas células pueden ser obtenidas de biopsias de bazos, amígdalas o nódulos linfáticos, o de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células del bazo y las células de sangre periférica, las primeras ya que son una fuente rica en células productoras de anticuerpos que están en la fase de hemocitoblasto en división, y la última ya que la sangre periférica es accesible fácilmente. A menudo, habrá sido inmunizado un panel de animales y se eliminará el bazo del animal con el título de anticuerpo más alto y los linfocitos del bazo obtenidos homogeneizando el bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene de aproximadamente 5 x 10^{7} a 2 x 10^{8} linfocitos.

Los linfocitos B que producen anticuerpos del animal inmunizado son fusionados después con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal inmunizado. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para el uso en los procedimientos de fusión para producir hibridomas son preferiblemente no productoras de anticuerpos, tienen alta eficacia de fusión, y tienen carencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que mantienen el crecimiento únicamente de las células fusionadas deseadas (hibridomas).

Se puede utilizar una cualquiera de varias células de mieloma, como es conocido por los expertos en la técnica (Goding, págs. 75-83, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, se pueden utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 BuI, para ratas, se pueden utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son todas útiles a propósito de las fusiones de células humanas.

Una célula de mieloma murino preferida es la línea celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), que es fácilmente asequible del NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository solicitando el número de depósito de la línea celular GM3573. Otra línea celular de mieloma de ratón que puede ser utilizada es la línea celular no productora de mieloma murino de ratón SP2/0 resistente a la 8-azaguarina.

Los métodos para generar híbridos de células de bazo o nódulo linfático productoras de anticuerpos y células de mieloma comprenden usualmente mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción 2:1, aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o de agentes (químicos o eléctricos) que promuevan la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión utilizando virus Sendai han sido descritos por Kohler y Milstein (1975; 1976), y aquellos en los que se utiliza polietilenglicol (PEG), por ejemplo PEG al 37% (v/v), por Gefter y col., (1977). El uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente también es apropiado (Goding, págs. 71-74, 1986).

Los procedimientos de fusión producen usualmente híbridos viables con bajas frecuencias, aproximadamente de 1 x 10^{-6} a 1 x 10^{-8}. No obstante, esta baja frecuencia no plantea ningún problema, puesto que los híbridos fusionados, viables, se diferencian de las células parentales, no fusionadas (concretamente en las células de mieloma no fusionadas que normalmente podrían continuar dividiéndose indefinidamente) mediante cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contenga un agente que bloquee la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo de tejidos. Los agentes ejemplares y preferidos son la aminopterina, el metotrexato, y la azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea únicamente la síntesis de purina. Cuando se utiliza aminopterina o metotrexato, el medio es suplementado con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se utiliza azaserina, el medio es suplementado con hipoxantina.

El medio de selección preferido en HAT. Sólo las células susceptibles de dirigir las rutas salvajes de los nucleótidos son capaces de sobrevivir en medio HAT. Las células de mieloma carecen de enzimas clave de la ruta salvaje, v.g., hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y en ese caso no pueden sobrevivir. Las células B pueden dirigir esta ruta, pero tienen un lapso de vida limitado en cultivo y generalmente mueren en aproximadamente dos semanas. Por consiguiente, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de mieloma y células B.

Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células mediante la dilución de un solo clon en placas de microtitulación, sometiendo a ensayo después los sobrenadantes de los clones individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para la reactividad deseada. El análisis debe ser sensible, sencillo y rápido, tal como los radioinmunoanálisis, los inmunoanálisis enzimáticos, los análisis de citotoxicidad, los análisis en placa, los análisis de inmunovaloración en mancha, y similares.

Los hibridomas seleccionados podrían después ser diluidos seriadamente y clonados en líneas celulares productoras de anticuerpo individuales, que podrían ser después propagadas indefinidamente para proporcionar MAb. Las líneas celulares pueden ser explotadas para la producción de MAb de dos maneras básicas. Una muestra del hibridoma puede ser inyectada (a menudo en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo utilizado para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de células fusionadas. Los fluidos corporales del animal, por ejemplo el fluido de suero o ascitis, pueden ser sangrados para proporcionar MAb con una elevada concentración. Las líneas celulares individuales podrían también ser cultivadas in vitro, donde los MAb son secretados naturalmente al medio de cultivo desde el cual pueden ser fácilmente obtenidos con elevadas concentraciones. Los MAb producidos mediante cualquier medio pueden ser purificados adicionalmente, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y diferentes métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad.

También se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos monoclonales de la presente invención multiplicando células de hibridoma in vivo. Los clones celulares son inyectados a mamíferos que son histocompatibles con las células parentales, v.g., ratones singeneicos, para ocasionar el crecimiento de los tumores productores de anticuerpos. Opcionalmente, los animales son cebados con un hidrocarburo, especialmente aceites tales como pristano (tetrametilpentadecano) antes de la inyección.

Según la presente invención, los fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser obtenidos a partir de los anticuerpos monoclonales producidos como se ha descrito antes, mediante métodos entre los que se incluyen la digestión con enzimas tales como pepsina o papaína y/o escisión de los enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos monoclonales abarcados por la presente invención pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador de péptidos automático, o mediante la expresión de genes completos o de fragmentos génicos en E. coli.

Los productos conjugados monoclonales de la presente invención son preparados mediante métodos conocidos en la técnica, v.g., haciendo reaccionar un anticuerpo monoclonal preparado como se ha descrito antes, por ejemplo, con una enzima en presencia de un agente acoplador tal como glutaraldehído o peryodato. Los productos conjugados con marcadores de fluoresceína son preparados en presencia de estos agentes acopladores o mediante reacción con un isotiocianato. Los productos conjugados con quelatos metálicos son producidos de un modo similar. Entre otros radicales con los que pueden conjugar los anticuerpos se incluyen radionúclidos tales como H^{3}, I^{125}, I^{131}, P^{32}, S^{35}, C^{14}, Cr^{51}, Cl^{36}, Co^{57}, Co^{58}, Fe^{59}, Se^{75}, Eu^{152}, y Tc^{99m}, son otras marcas útiles que pueden ser conjugados con los anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales marcados radiactivamente de la presente invención son producidos según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser yodados mediante contacto con yoduro de sodio o potasio y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos monoclonales según la invención pueden ser marcados con tecnecio^{99} mediante un procedimiento de intercambio de ligandos, por ejemplo, reduciendo pertecnato con una solución estannosa, quelando el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna o mediante técnicas de marcaje directo, v.g., incubando pretecnato, un agente reductor tal como SNCl_{2}, una solución tampón tal como una solución de ftalato de sodio-potasio, y el anticuerpo.

Será apreciado por los expertos en la técnica que los anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha (para las proteínas que estén mutadas en MODY3, MODY4, y MODY1) tendrán utilidades en varios tipos de aplicaciones. Entre estas se pueden incluir la producción de estuches de diagnóstico para su uso para detectar o diagnosticar diabetes de tipo MODY3, MODY4, y MODY1. Los practicantes expertos comprenderán que tales usos están dentro del alcance de la presente invención.

J. Análisis de Inmunodetección

Los métodos de inmunodetección de la presente invención tendrán una utilidad evidente en la diagnosis de las condiciones tales como la NIDDM relacionada con MODY3, MODY4 y MODY1. Aquí, se utiliza una muestra biológica o clínica que se supone que contiene o la proteína o el péptido codificado o el anticuerpo correspondiente. No obstante, estas realizaciones también tienen aplicaciones en muestras no clínicas, por ejemplo en la titulación de muestras de antígeno o anticuerpo, en la selección de hibridomas, y similares.

En la diagnosis cínica o al controlar pacientes con MODY3, MODY4 o MODY1, la detección de un antígeno codificado por un ácido nucleico HNF1\alpha, un ácido nucleico HNF4\alpha, un ácido nucleico HNF1\beta, o un descenso de los niveles de semejante antígeno, en comparación con los niveles de una muestra biológica correspondiente de un sujeto normal es indicativa de un paciente con MODY3, MODY4, o MODY1. La base de tales métodos de diagnóstico estriba, en parte, en el descubrimiento de que los mutantes del ácido nucleico HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha identificados en la presente invención son responsables de la diabetes relacionada con MODY3, MODY4 y MODY1, respectivamente. Por tanto, se puede inferir que al menos algunas de estas mutaciones producen niveles elevados de proteínas codificadas, que también pueden ser utilizadas como marcadores para MODY3, MODY4 o MODY1.

Los expertos en la técnica están muy familiarizados con la diferenciación entre la expresión significativa de un biomarcador, lo que representa una identificación positiva, y un bajo nivel o la expresión del fondo de un biomarcador. Por supuesto, los niveles de expresión del fondo se utilizan a menudo para formar un "corte" por encima del cual el aumento de coloración será puntuado como significativo o positivo. La expresión significativa puede estar representada por elevados niveles de antígenos en tejidos o en los fluidos corporales, o alternativamente, mediante una elevada proporción de células de dentro de un tejido cada uno de los cuales producirá una señal positiva.

1. Métodos de Inmunodetección

En otras reivindicaciones adicionales, la presente invención tiene que ver con métodos de inmunodetección para unir, purificar, separar, cuantificar o de otro modo detectar generalmente componentes biológicos. Las proteínas o péptidos codificados de la presente invención pueden ser empleados para detectar anticuerpos que tienen reactividad con ellos, o, alternativamente, los anticuerpos preparados según la presente invención pueden ser empleados para detectar las proteínas o péptidos codificados. Las etapas de diferentes métodos de inmunodetección útiles han sido descritas en la literatura científica, tal como, v.g., Nakamura y col. (1987).

En general, entre los métodos de inmunovaloración se incluyen los métodos para detectar o cuantificar la cantidad de un componente reactivo en una muestra, cuyos métodos requieren la detección o la cuantificación de cualquier complejo inmune formado durante el procedimiento de unión. Aquí, se podría obtener una muestra que se supone que contiene una proteína, péptido o anticuerpo correspondiente codificado por un mutante de HNF1\alpha o HNF4\alpha, y poner en contacto la muestra con un anticuerpo o proteína o péptido codificado, según sea el caso, y después detectar o cuantificar la cantidad de complejos inmunes formados bajo las condiciones específicas.

En términos de detección de antígenos, la muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra sencilla que se suponga contiene un antígeno HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, tal como una célula \beta pancreática, un extracto de tejido homogeneizado, una célula aislada, una preparación de membrana celular, formas separadas o purificadas de una cualquiera de las composiciones que contienen proteínas anteriores, o incluso cualquier fluido biológico que se ponga en contacto con tejido diabético, incluyendo la sangre.

El contacto de la muestra biológica elegida con la proteína, péptido o anticuerpo en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios) es generalmente cuestión de añadir simplemente la composición a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo suficientemente largo para que los anticuerpos formen complejos inmunes con, es decir, unirse a, cualquier antígeno presente. Tras este tiempo, la composición de muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, una placa de ELISA, hibridación puntual o hibridación western, será lavada generalmente para eliminar cualquier especie de anticuerpo no unida específicamente, permitiendo la detección únicamente de aquellos anticuerpos unidos específicamente en los complejos inmunes primarios.

En general, la detección de la formación de complejos inmunes es bien conocida en la técnica y se puede lograr a través de la aplicación de numerosos enfoques. Estos métodos están basados generalmente en la detección de una marca o marcador, tal como etiquetas o marcas radiactivas, fluorescentes, biológicas o enzimáticas cualesquiera de uso normalizado en la técnica. Entre las patentes de los Estados Unidos concernientes al uso de tales marcas se incluyen 3.817.837; 3.850.752; 3.937.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241, incorporadas cada una como referencia. Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales a través del uso de un ligando de unión secundario tal como un anticuerpo secundario o disposición de unión de ligando de biotina/avidina, como es conocido en la técnica.

La misma proteína, péptido o anticuerpo correspondiente codificado empleado en la detección puede ser conectado a su vez a una marca detectable, donde se podría detectar después sencillamente esta marca, permitiendo de ese modo la determinación de la cantidad de complejos inmunes primarios en la composición.

Alternativamente, el primer componente añadido que se une en los complejos inmunes primarios puede ser detectado por medio de un segundo ligando de unión que tenga afinidad de unión por la proteína, el péptido o el anticuerpo correspondiente codificado. En estos casos, el segundo ligando de unión puede ser conectado a una marca detectable. El mismo segundo ligado de unión es a menudo un anticuerpo, que en ese caso puede ser denominado anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se ponen en contacto con el ligando de unión secundario marcado, o anticuerpo, en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de los complejos inmunes secundarios. Los complejos inmunes secundarios son lavados después generalmente para eliminar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado no unido específicamente, y después se detecta la marca restante en los complejos inmunes secundarios.

Entre los métodos adicionales se incluye la detección de los complejos inmunes primarios mediante un segundo enfoque. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que tiene afinidad por la proteína, el péptido o el anticuerpo correspondiente codificado se utiliza para formar complejos inmunes secundarios, como se ha descrito antes. Tras el lavado, los complejos inmunes secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando de unión que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, de nuevo en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de los complejos inmunes (complejos inmunes terciarios). El tercer ligando o anticuerpo es conectado a una marca detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunes terciarios formados de este modo. Este sistema puede proporcionar la amplificación de la señal si se desea.

2. Inmunohistoquímica

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados asimismo junto con bloques de tejidos embebidos en parafina tanto congelados frescos como fijados con formalina preparados para el estudio mediante inmunohistoquímica (IHC). Por ejemplo, cada bloque de tejido consta de 50 mg de tejido diabético "pulverizado" residual. El método para preparar bloques de tejido de estos especimenes particulados ha sido utilizado con éxito en estudios de IHC previos de diferentes factores prognósticos, y es conocido por los expertos en la técnica (Brown y col., 1990; Abbondanzo y col., 1990; Allred y col., 1990).

Brevemente, las secciones congeladas pueden ser preparadas rehidratando 50 ng de tejido diabético "pulverizado" congelado a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cápsulas de plástico pequeñas; sedimentando las partículas mediante centrifugación; resuspendiéndolas en un medio de imbibición viscoso (OCT); invirtiendo la cápsula y sedimentando después mediante centrifugación; congelando rápidamente en isopentano a -70ºC; cortando la cápsula de plástico y retirando el cilindro de tejido congelado; asegurando el cilindro de tejido en un mandril de microtomo con criostato; y cortando 25-50 secciones en serie.

Se pueden preparar secciones permanentes mediante un método similar que implica la rehidratación de 50 mg de la muestra en un tubo de microcentrífuga de plástico; sedimentación; resuspensión en formalina al 10% para la fijación en 4 horas; lavado/sedimentación; resuspensión en agar al 2,5% templado; sedimentación; refrigeración en agua helada para endurecer el agar; separación del bloque de tejido/agar del tubo; infiltración e imbibición del bloque en parafina; y corte en serie de hasta 50 secciones permanentes.

3. ELISA

Como se ha observado, se contempla que las proteínas o péptidos codificados de la invención encontrarán uso como inmunógenos, v.g., a propósito del desarrollo de vacunas, en análisis de inmunohistoquímica y ELISA. Una utilidad evidente de los antígenos codificados y de los anticuerpos correspondientes es en inmunoanálisis para la detección de HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha, proteínas mutantes, según se necesite en la diagnosis y en el control prognóstico de la MODY.

Los inmunoanálisis, en su significado más sencillo y directo, son análisis de unión. Algunos inmunoanálisis preferidos son los diferentes tipos de análisis inmunoabsorbentes con enzima ligada (ELISA) y los radioinmunoanálisis (RIA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica utilizando secciones de tejido también es particularmente útil. No obstante, será rápidamente apreciado en la técnica que la detección no está limitada a tales técnicas, y que también se pueden utilizar transferencia western, transferencia puntual, análisis FACS, y similares.

En un ELISA ejemplar, los anticuerpos que se unen a las proteínas codificadas de la invención son inmovilizadas sobre una superficie seleccionada que manifieste afinidad hacia la proteína, tal como un pocillo de una placa de microtitulación de poliestireno. Después, se añade a los pocillos una composición de ensayo que se supone contiene el mutante HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, tal como una muestra clínica. Tras la unión y el lavado para eliminar los complejos inmunes no unidos específicamente, se puede detectar el anticuerpo unido. La detección se logra generalmente mediante la adición de un segundo anticuerpo específico para la proteína diana, que se une a una marca detectable. Este tipo de ELISA es un "ELISA sándwich" sencillo. La detección también se puede lograr mediante la adición de un segundo anticuerpo, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tenga afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando unido el tercer anticuerpo a una marca detectable.

En otro ELISA ejemplar, las muestras que se supone contienen el antígeno HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutante se inmovilizan sobre la superficie del pocillo y después se ponen en contacto con los anticuerpos de la invención. Tras la unión y el lavado para eliminar los complejos inmunes no unidos específicamente, se detecta el anticuerpo unido. Cuando los anticuerpos iniciales están conectados a una marca detectable, los complejos inmunes pueden ser detectados directamente. De nuevo, los complejos inmunes pueden ser detectados utilizando un segundo anticuerpo que tenga afinidad de unión por el primer anticuerpo, estando conectado el segundo anticuerpo a una marca detectable.

Otro ELISA en el que son inmovilizados las proteínas o los péptidos, implica el uso de competición con el anticuerpo en la detección. En este ELISA, se añaden anticuerpos marcados a los pocillos, permitiendo unirse a la proteína HNF1\alpha mutante, a la proteína HNF1\beta mutante o a la proteína HNF4\alpha mutante, y se detectan por medio de su marca. La cantidad de antígeno marcador en una muestra desconocida es determinada después mezclando la muestra con los anticuerpos marcados antes o durante la incubación con los pocillos recubiertos. La presencia de antígeno marcador en la muestra actúa reduciendo la cantidad de anticuerpo disponible para unirse al pocillo y de este modo se reduce la señal final. Esto es apropiado para detectar anticuerpos en una muestra desconocida, donde los anticuerpos no marcados se unen a los pocillos recubiertos de antígeno y también se reduce la cantidad de antígeno disponible para unirse a los anticuerpos marcados.

Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen ciertas características en común, tales como el recubrimiento, la incubación o la unión, el lavado para eliminar las especies no unidas específicamente, y la detección de los complejos inmunes unidos. Estos se describen a continuación:

Al recubrir una placa con cualquier antígeno o anticuerpo, generalmente se incubarán los pocillos de la placa con una solución del antígeno o del anticuerpo, o bien durante la noche o bien durante un período de horas especificado. Los pocillos de la placa se lavarán después para eliminar incompletamente la sustancia adsorbida. Cualquier superficie disponible restante de los pocillos se "recubre" después con una proteína no específica que sea antigénicamente neutra con relación a los antisueros de ensayo. Entre estas se incluyen la seralbúmina bovina (BSA), la caseína y las soluciones de leche en polvo. El recubrimiento de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizada reduce el fondo ocasionado por la unión no específica del antisuero a la superficie.

En los ELISA, es probablemente más habitual utilizar medios de detección secundarios o terciarios en lugar de un procedimiento directo. En ese caso, tras la unión de una proteína o anticuerpo al pocillo, el recubrimiento con una sustancia no reactiva para reducir el fondo, y el lavado para eliminar la sustancia no unida, la superficie inmovilizadora se pone en contacto con MODY3, MODY4 o MODY1 de control y/o la muestra clínica o biológica para someterla a ensayo en condiciones eficaces para permitir la formación de un complejo inmune (antígeno/anticuerpo). La detección del complejo inmune requiere después un ligando de unión secundario o anticuerpo marcado, o un ligando de unión secundario o anticuerpo marcado junto con un anticuerpo terciario o tercer ligando de unión marcado.

"En condiciones eficaces para permitir la formación de un complejo inmune (antígeno/anticuerpo)" significa que entre las condiciones preferibles se incluye diluir los antígenos y anticuerpos con soluciones tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG) y solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween®. Estos agentes añadidos también tienden a coadyuvar a la reducción del fondo no específico.

Las condiciones "adecuadas" también significan que la incubación es a una temperatura y durante un período de tiempo suficiente para permitir la unión eficaz. Las etapas de incubación son típicamente de aproximadamente 1 a 2 a 4 horas, a temperaturas preferiblemente del orden de 25º a 27ºC, o pueden ser durante la noche a aproximadamente 4ºC más o menos.

Siguiente a todas las etapas de incubación en un ELISA, la superficie de contacto se lava de manera que se elimine la sustancia que no forma complejo. Un procedimiento de lavado preferido incluye el lavado con una solución tal como PBS/Tween®, o tampón borato. Tras la formación de los complejos inmunes específicos entre la muestra de ensayo y la sustancia unida originalmente, y los posteriores lavados, puede ser determinada la aparición incluso de cantidades mínimas de complejos inmunes.

Para proporcionar un medio de detección, el segundo o tercer anticuerpo tendrá una marca asociada para permitir la detección. Preferiblemente, esta marca será una enzima que generará desarrollo de color tras incubarla con un sustrato cromogénico apropiado. En ese caso, por ejemplo, se deseará poner en contacto e incubar el primer o segundo complejo inmune con un anticuerpo conjugado con una ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o hidrogeno peroxidasa durante un período de tiempo y en condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación de complejos inmunes adicionales (v.g., incubación durante dos horas a la temperatura ambiente en una solución que contenga PBS tal como PBS-Tween®).

Tras la incubación del anticuerpo marcado, y tras el lavado para eliminar la sustancia no unida, la cantidad de marca es cuantificada, v.g., mediante incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azido-di-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico (ABTS) y H_{2}O_{2}, en el caso de la peroxidasa como enzima marcada. La cuantificación se logra después midiendo el grado de generación de color, v.g., utilizando un espectrómetro para el espectro visible.

4. Utilización de Anticuerpos para Radioimaginología

Los anticuerpos de esta invención serán utilizados para cuantificar y localizar la expresión de las proteínas marcadoras codificadas. El anticuerpo, por ejemplo, será marcado mediante uno cualquiera de una variedad de métodos y se utilizará para visualizar la concentración localizada de las células que producen la proteína codificada. Semejante análisis también revelará la localización subcelular de la proteína, que puede tener aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

Según esta invención, el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo puede ser marcado mediante una cualquiera de varios mecanismos conocidos en la técnica. En los métodos de la presente invención también se pueden utilizar isótopos paramagnéticos con el propósito de la detección in vivo. Entre los elementos particularmente útiles en la Imaginología Mediante Resonancia Magnética ("MRI") se incluyen Gd^{157}, Mn^{55}, Dy^{162}, Cr^{52}, y Fe^{56}.

La administración del anticuerpo marcado puede ser local o generalizada y se completa intravenosamente, antraarterialmente, a través del fluido espinal o similares. La administración puede ser también intradérmica o intracavital, dependiendo del lugar del organismo a examen. Después de transcurrir un tiempo suficiente para que el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo se una al tejido deseado, por ejemplo, de 30 minutos a 48 horas, el área del sujeto investigado es examinada mediante técnicas de imaginología rutinarias tales como MRI, SPECT, imaginología mediante centelleo planar o técnicas de imaginología recién aparecidas. El protocolo exacto variará necesariamente dependiendo de factores específicos del paciente, como se ha observado antes, y dependiendo del sitio del organismo a examen, el método de administración y el tipo de marca utilizado; la determinación de los procedimientos específicos será rutinaria para los artesanos expertos. La distribución del isótopo radiactivo unido y su aumento o disminución con el tiempo es después verificada y registrada. Comparando los resultados con los datos obtenidos a partir de estudios de individuos clínicamente normales, se puede determinar la presencia y la extensión del tejido enfermo.

Resultará evidente para los expertos en la técnica que se puede utilizar un enfoque similar para la formación de radioimágenes de la producción de las proteínas mutantes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha codificadas en pacientes humanos. La presente invención proporciona métodos para la diagnosis in vivo de MODY3, MODY4 o MODY1 en un paciente. Semejantes métodos comprenden generalmente administrar a un paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo específico mutante HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, a cuyo anticuerpo se conjuga un marcador, tal como un isótopo radiactivo o una molécula marcada con spin, que sea detectable mediante métodos no invasivos. El producto conjugado de anticuerpo-marcador se deja el tiempo suficiente para que entre en contacto con los antígenos reactivos que están presentes en los tejidos del paciente, y el paciente es expuesto después a un dispositivo de detección para identificar el marcador detectable.

5. Estuches

En otras realizaciones adicionales, la presente invención tiene que ver con estuches de inmunodetección para el uso en los métodos de inmunodetección descritos antes. En tanto que las proteínas o péptidos codificados pueden ser empleados para detectar anticuerpos y los anticuerpos correspondientes pueden ser empleador para detectar proteínas o péptidos codificados, cualquiera o ambos componentes pueden ser proporcionados en el estuche. Los estuches de inmunodetección comprenderán en ese caso, un recipiente adecuado, una proteína o péptido codificado, o un primer anticuerpo que se une a una proteína o péptido codificado, y un reactivo de inmunodetección.

En ciertas realizaciones, la proteína o péptido codificado, o el primer anticuerpo que se une a la proteína o péptido codificado, puede estar unida a un soporte sólido, tal como a una matriz de columna o pocillo de una placa de microtitulación.

Los reactivos de inmunodetección del estuche pueden tomar una cualquiera de una variedad de formas, incluyendo aquellas marcas detectables que están asociadas con o conectadas al anticuerpo o antígeno dado, y las marcas detectables que están asociadas con o ancladas a un ligando de unión secundario. Los ligandos secundarios ejemplares son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo o antígeno, y los anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por un anticuerpo humano.

Entre los reactivos de inmunodetección adecuados adicionales para el uso en los presentes estuches se incluyen el reactivo de dos componentes que comprende un anticuerpo secundario que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo o antígeno, junto con un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando unido el tercer anticuerpo a una marca detectable.

Los estuches pueden comprender adicionalmente una composición dividida adecuadamente en alícuotas de la proteína o antígeno peptídico codificado, ya sea marcada o no marcada, que puede ser utilizada para preparar una curva patrón para un análisis de detección.

Los estuches pueden contener productos conjugados de anticuerpo-marca en forma completamente conjugada, en forma de intermedios, o en forma de radicales separados para ser conjugados por el usuario del estuche. Los componentes de los estuches pueden ser envasados en medios acuosos o en forma liofilizada.

Entre los recipientes de los estuches se incluirán generalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringa u otros recipientes, en los que se va a colocar el anticuerpo o antígeno, y preferiblemente dividido adecuadamente en alícuotas. Cuando se proporciona un segundo o un tercer ligando o componente adicional, el estuche contendrá también generalmente un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que se puede colocar este ligando o componente. En los estuches de la presente invención también se incluirá típicamente un medio para contener el anticuerpo, antígeno, y otros recipientes de reactivos cualesquiera en estricto confinamiento para la venta comercial. Entre tales recipientes se pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se guardan los viales deseados.

K. Detección y Cuantificación de la Especie de Ácido Nucleico

Una realización de la presente invención comprende un método de identificación de mutantes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha en una muestra biológica amplificando y detectando los ácidos nucleicos correspondientes a los mutantes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha. La muestra biológica puede ser cualquier tejido o fluido en el que puedan estar presentes estos mutantes. Entre las diferentes realizaciones se incluyen células \beta y \alpha de los islotes pancreáticos, aspirado de médula ósea, biopsia de médula ósea, aspirado de nódulo linfático, biopsia de nódulo linfático, tejido de bazo, aspirado con aguja fina, biopsia de piel o biopsia de tejido de órganos. Entre otras realizaciones se incluyen muestras en las que el fluido corporal es sangre periférica, fluido linfoide, ascitis, fluido seroso, efusión pleural, esputo, fluido cerebroespinal, fluido lacrimal, deposición u orina.

El ácido nucleico utilizado como molde para la amplificación es aislado de las células contenidas en la muestra biológica, según metodologías normalizadas (Sambrook y col., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN celular fraccionado o completo. Cuando se utiliza ARN, se puede desear convertir el ARN en un ADN complementario. En una realización, el ARN es ARN celular completo y se utiliza directamente como molde para la amplificación.

Los pares de cebadores que hibridan selectivamente con los ácidos nucleicos correspondientes a los mutantes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha se ponen en contacto con el ácido nucleico aislado en condiciones que permitan la hibridación selectiva. Una vez hibridados, el complejo de ácido nucleico:cebador se pone en contacto con una o más enzimas que faciliten la síntesis de ácido nucleico dependiente del molde. Se llevan a cabo múltiples rondas de amplificación, también referidas como "ciclos", hasta que se produce suficiente cantidad de producto de amplificación

A continuación, se detecta el producto de amplificación. En ciertas aplicaciones, la detección se puede realizar mediante medios visuales. Alternativamente, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto vía quimioluminiscencia, escintigrafía radiactiva de radiomarcaje incorporado o marcaje fluorescente o incluso vía un sistema en el que se utilizan señales de impulsos eléctricos o térmicos (Affymax technology; Bellus, 1994).

Tras la detección, se pueden comparar los resultados observados en un paciente dado con un grupo de referencia estadísticamente significativo de pacientes normales y MODY o por supuesto diabéticos dependientes de MODY y diabéticos no dependientes de MODY. De este modo, es posible correlacionar la cantidad de mutantes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha detectados con diferentes estados clínicos.

1. Cebadores

Se pretende que el término cebador, según se define aquí, abarque cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un procedimiento dependiente del molde. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte pares de bases de longitud, pero se pueden emplear secuencias más largas. Se pueden proporcionar cebadores en forma de doble hebra o de hebra sencilla, si bien se prefiere la forma de hebra sencilla.

2. Métodos de Amplificación Dependientes del Molde

Varios procedimientos dependientes del molde están disponibles para amplificar las secuencias marcadoras presente en una muestra de molde dada. Uno de los mejores métodos de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (referida como PCR) que es descrita con detalle en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y por Innis y col., 1990, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

Brevemente, en la PCR, se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias a las regiones en las hebras complementarias opuestas de la secuencia marcadora. Se añade un exceso de desoxinucleósidos trifosfato a una mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, v.g., polimerasa Taq. Si la secuencia marcadora está presente en una muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa hará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia marcadora añadiendo nucleótidos. Aumentando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán al marcador y a los productos de reacción y el procedimiento se repite.

Se puede realizar un procedimiento de amplificación PCR con transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Los métodos para la transcripción inversa de ARN en ADNc son bien conocidos y descritos por Sambrook y col., 1989. En métodos alternativos para la transcripción inversa se utilizan ADN polimerasas dependientes de ARN. Estos métodos son descritos en WO 90/07641 presentada el 21 de Diciembre de 1990. Las metodologías para la reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en la técnica.

Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR") descrita en EP-A-320308. En la LCR se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a las hebras complementarias opuestas de la diana de manera que se adosen. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se conectarán para formar una sola unidad. Mediante un ciclo de temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas unidas se disociarán de la diana y después servirán como "secuencias diana" para la ligadura de pares de sondas en exceso. En la patente de los Estados Unidos Núm. 4.883.750 se describe un método similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.

La replicasa Qbeta, descrita en WO 87/06270 puede ser utilizada también como otro método de amplificación más en la presente invención. En este método, una secuencia de ARN replicativa que tiene una región complementaria a la de una diana se añade a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede ser detectada después.

También puede ser útil un método de amplificación isotérmica, en el que las endonucleasas de restricción y las ligasas se utilizan para lograr la amplificación de moléculas diana que contienen nucleótidos 5'-[alfa-tio]-trifosfato en una hebra de un sitio de restricción en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención, Walker y col., (1992).

La Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA) es otro método para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que implica múltiples rondas de desplazamiento de la hebra y síntesis, esto es, traslado de cortes. Un método similar, denominado Reacción de Reparación de la Cadena (RCR), implica recocer diversas sondas a lo largo de una reacción diana para la amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que están presentes sólo dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden ser añadidas en forma de derivados biotinilados para una fácil detección. Un enfoque similar se utiliza en la SDA. Las secuencias diana específicas también pueden ser detectadas utilizando una reacción con la sonda cíclica (CPR). En la CPR, una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una secuencia media de ARN específico se hibrida con el ADN que está presente en una muestra. Tras la hibridación, la reacción es tratada con ARNasa H, y los productos de la sonda identificados como productos distintivos que son liberados tras la digestión. El molde original es recocido con otra sonda cíclica y se repite la reacción.

Otros métodos más de amplificación descritos en GB-A-2.202.328, y en WO89/09284 pueden ser utilizados según la presente invención. En la primera solicitud, se utilizan cebadores "modificados" en una síntesis de tipo PCR dependiente del molde y de la enzima. Los cebadores pueden ser modificados mediante marcaje con un radical de captura (v.g., biotina) y/o un radical detector (v.g., enzima). En la última aplicación, se añade a una muestra un exceso de sondas marcadas. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y es escindida catalíticamente. Tras la escisión, la secuencia diana es liberada intacta para ser unida por la sonda en exceso. La escisión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia diana.

Entre otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos se incluyen los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS) incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh y col., 1989); Gingeras y col., WO 88/10315. En NASBA, los ácidos nucleicos pueden ser preparados para la amplificación mediante extracción con fenol/cloroformo normalizada, desnaturalización térmica de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y columnas Minispin para el aislamiento de ADN y ARN o extracción con cloruro de guanidinio de ARN. Estas técnicas de amplificación implican recocer un cebador que tiene secuencias específicas de la diana. Tras la polimerización, los híbridos de ADN/ARN son digeridos con ARNasa H mientras que las moléculas de ADN de doble hebra son desnaturalizadas con calor de nuevo. En cualquier caso el ADN de hebra sencilla es convertido completamente en doble hebra mediante la adición de un segundo cebador específico de la diana, seguido de polimerización. Las moléculas de ADN de doble hebra son después transcritas de manera múltiple mediante una polimerasa de ARN tal como T7 o SP6. En una reacción de ciclo isotérmico, los ARN son sometidos a transcripción inversa a un ADN de hebra sencilla, que es convertido después en ADN de doble hebra, y después transcrito de nuevo una vez con una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya sea truncados o completos, indican secuencias específicas de la diana.

Devey y col., EP-A-329.822 describen un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos que implica sintetizar cíclicamente ARN de hebra sencilla ("ARNhs"), ADNhs, y ADN de doble hebra (ADNdh), que pueden ser utilizados según la presente invención. El ARNhs es un molde para un primer oligonucleótido cebador, que es elongado mediante la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). El ARN es separado después del dúplex de ADN:ARN resultante mediante la acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica del ARN en dúplex con ADN o con ARN). El ADNhs resultante es un molde para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' con respecto a su homología con el molde. Este cebador es prolongado después mediante la ADN polimerasa (ejemplificada por el fragmento de "Klenow" grande de las ADN polimerasa I de E. coli), produciendo una moléculas de ADN de doble hebra (ADNdh''), que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia promotora. Esta secuencia promotora puede ser utilizada mediante la ARN polimerasa apropiada para realizar muchas copias con ARN del ADN. Estas copias pueden después reingresar en el ciclo conduciendo a una amplificación muy rápida. Con la elección apropiada de las enzimas, esta amplificación puede ser realizada isotérmicamente sin adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este procedimiento, la secuencia de partida puede ser seleccionada para que esté en forma de ADN o de ARN.

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Miller y col., describen un esquema de amplificación de una secuencia de ácido nucleico basada en la hibridación de una secuencia promotora/cebadora a un ADN de hebra sencilla ("ADNhs") diana seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos moldes a partir de los transcritos de ARN resultantes. Entre otros métodos de amplificación se incluyen "RACE" y "PCR a una cara" (``Frohmanm M.A., En: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, N.Y., 1990; Ohara y col., 1989).

Los métodos basados en la ligadura de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificándose de ese modo el di-oligonucleótido, también pueden ser utilizados en la etapa de amplificación de la presente invención. Wu y col., 1989).

3. Análisis de Protección de la ARNasa

Los métodos para el rastreo genético mediante la identificación de las mutaciones asociadas con la mayoría de las enfermedades genéticas tales como la diabetes deben ser capaces de evaluar grandes regiones de genoma. Una vez que han sido identificadas las mutaciones relevantes en un paciente dado, se pueden rastrear otros miembros de la familia e individuos afectados utilizando métodos que están dirigidos al sitio. La capacidad para detectar mutaciones puntuales dispersas es crítica para el asesoramiento genético, la diagnosis, y la intervención clínica temprana así como para investigar en la etiología del cáncer y otros trastornos genéticos. El método ideal para el rastreo genético podría detectar rápidamente, económicamente y exactamente todos los tipos de mutaciones ampliamente dispersas en las muestras de ADN genómico, ADNc, y ARN, dependiendo de la situación específica.

Históricamente, se han utilizado varios métodos diferentes para detectar mutaciones puntuales, incluyendo la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante ("DGGE"), el análisis de polimorfismo con enzimas de restricción, los métodos de escisión química y enzimática, y otros (Cotton, 1989). Entre los procedimientos de uso más comunes en la actualidad se incluyen la secuenciación directa de regiones diana amplificadas mediante PCR® y el análisis del polimorfismo conformacional de hebra sencilla ("SSCP").

Otro método de rastreo de mutaciones puntuales está basado en la escisión mediante la ARNasa de emparejamientos erróneos de bases en heterodúplex de ARN/ADN y ARN/ARN. Según se utiliza aquí, el término "emparejamiento erróneo" es definido como una región de uno o más nucleótidos no emparejados o emparejados erróneamente en una molécula de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN de doble hebra. En esta definición se incluyen de este modo los ejamientos erróneos debidos a mutaciones por inserción/deleción, así como mutaciones puntuales con base única o múltiple. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.773 se describe un análisis de escisión de emparejamientos erróneos con ARNasa A que implica el recocido de muestras de ensayo de ADN o ARN de hebra sencilla a una sonda de ARN, y el posterior tratamiento de los dúplex de ácido nucleico con ARNasa A. Tras la reacción de escisión con la ARNasa, la ARNasa es inactivada mediante digestión proteolítica y extracción orgánica, y los productos de la escisión son desnaturalizados calentando y analizados mediante electroforesis sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Para la detección de los emparejamientos erróneos, los productos de hebra sencilla del tratamiento con la ARNasa, separados electroforéticamente según el tamaño, son comparados con dúplex de control tratados de un modo similar. La muestras que contienen los tamaño más pequeños (productos de escisión) no observados en el dúplex de control son puntuados como +.

Los análisis de escisión de los emparejamientos erróneos mediante ARNasa asequibles en la actualidad, incluyendo aquellos realizados según la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.773, requieren el uso de sondas de ARN radiomarcadas. Myers y Maniatis en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.773 describen la detección de emparejamientos erróneos de pares de bases utilizando ARNasa A. Otros investigadores han descrito el uso de una enzima de E. coli, la ARNasa I, en análisis de emparejamientos erróneos. Puesto que tiene una especificidad de escisión más amplia que la ARNasa A, la ARNasa I podría ser una enzima deseable para emplear en la detección de emparejamientos erróneos de pares de bases si se pudieran encontrar los componentes que disminuyen el grado de escisión no específica e incrementan la frecuencia de escisión de los emparejamientos erróneos. El uso de ARNasa I para la detección de emparejamientos erróneos es descrita en la literatura de Promega Biotech. Promega comercializa un estuche que contiene ARNasa I que se muestra en sus publicaciones que escinde tres de los cuatro emparejamientos erróneos conocidos, siempre que el nivel de enzima sea suficientemente alto.

El análisis de protección con ARNasa descrito en primer lugar por Melton y col., (1984) fue utilizado para detectar y cartografiar extremos de dianas de ARNm específicas en solución. El análisis cuenta con ser capaz de generar fácilmente sondas de ARN radiomarcadas con actividad altamente específica complementarias al ARNm de interés mediante transcripción in vitro. Originalmente, los moldes para la transcripción in vitro fueron plásmidos recombinantes que contenían promotores de bacteriófagos. Las sondas se mezclan con las muestras de ARN celular totales para permitir la hibridación a sus dianas complementarias, después la mezcla se trata con ARNasa para degradar la sonda no hibridada en exceso. Asimismo, como se pretendía originalmente, la ARNasa utilizada es específica para el ARN de hebra sencilla, de manera que la sonda de doble hebra hibridada es protegida de la degradación. Tras la inactivación y la eliminación de la ARNasa, la sonda protegida (es proporcional en cantidad a la cantidad de ARNm diana que estaba presente) es recuperada y analizada sobre un gel de poliacrilamida.

El análisis de protección de la ARNasa fue adaptado para la detección de mutaciones de base única por Myers y Maniatis (1985) y por Winter y Perucho (1985). En este tipo de análisis de escisión de emparejamientos erróneos, las sondas de ARN radiomarcadas transcritas in vitro a partir de las secuencias de tipo salvaje, son hibridadas a regiones diana complementarias derivadas de las muestras de ensayo. La diana de ensayo comprende generalmente ADN (o ADN genómico o ADN amplificado mediante clonación en plásmidos o mediante PCR®), si bien han sido utilizadas ocasionalmente (Gibbs y Caskey, 1987; Winter y col., 1985) dianas de ARN (ARNm endógeno). Si se producen diferencias de un solo nucleótido (o más) en la secuencia entre la sonda hibridada y la diana, se puede advertir la rotura resultante de los enlaces de hidrógeno de Watson-Crick en esta posición (emparejamiento erróneo) y escindir en algunos casos con ribonucleasa específica para la hebra sencilla. Hasta la fecha, la ARNasa A ha sido utilizada casi exclusivamente para la escisión de emparejamientos erróneos de una única base, si bien se ha demostrado recientemente que la ARNasa I es también útil para la escisión del emparejamiento erróneo. Existen descripciones recientes del uso de la proteína MutS y de otras enzimas reparadoras de ADN para la detección de emparejamientos erróneos (Ellis y col., 1994; Lishanski y col., 1994).

Hibridando cada hebra de la sonda de tipo salvaje en los análisis de emparejamientos erróneos mediante escisión con ARNasa separadamente a las hebras Efectora y Antisentido complementarias de la diana de ensayo, se proporcionaron dos emparejamientos erróneos complementarios diferentes (por ejemplo, A-C y G-U o G-T) y por consiguiente dos oportunidades para detectar cada mutación mediante eventos de escisión separados. Myers y col., (1985) utilizaron el análisis de escisión con ARNasa A para rastrear regiones de 615 pb del gen de la \beta-globina humana contenido en las dianas plasmídicas recombinantes. Sondeando con ambas hebras, fueron capaces de detectar la mayoría, pero no todas, las mutaciones de la \beta-globina en su sistema modelo. El grupo de mutantes incluyó ejemplos de los 12 tipos posibles de emparejamientos erróneos entre el ARN y el ADN: rA/dA, rC/dC, rU/dC, rC/dA, rC/dT, rU/dG, rG/dA, rG/dG, rU/dG, rA/dC, rG/dT, y rA/dG.

Myers y col, (1985) demostraron que ciertos tipos de emparejamientos erróneos eran más frecuente y más completamente escindidos por la ARNasa A que otros. Por ejemplo los emparejamientos erróneos rC/dA, rC/dC, y rC/dT fueron escindidos en todos los casos, mientras que el emparejamiento erróneo rG/dA únicamente fue escindido en el 13% de los casos sometidos a ensayo y el emparejamiento erróneo rG/dT fue casi completamente resistente a la escisión. En general, el complemento de un emparejamiento erróneo difícil de detectar era mucho más fácil de detectar. Por ejemplo, el emparejamiento erróneo dG/dT refractario generado sondeando una diana mutante G por A con una sonda de hebra sencilla de tipo salvaje, es complementado por el emparejamiento erróneo rC/dA escindido fácilmente generado sondeando la diana mutante con la hebra antisentido de tipo salvaje. Sondeando ambas hebras diana, Myers y Maniatis (1986) estimaron que al menos el 50% de las mutaciones de una única base podrían ser detectadas mediante el análisis de escisión con ARNasa A. Estos autores establecieron que aproximadamente un tercio de todos los posibles tipos de sustituciones de una única base podrían ser detectados utilizando una sonda sencilla sólo para una hebra del ADN diana (Myers y col., 1985).

En los análisis de escisión con ARNasa típicos, los geles de separación son desarrollados en condiciones desnaturalizantes para el análisis de los productos de escisión. Esto requiere que la ARNasa sea inactivada tratando la reacción con proteasa (usualmente Proteinasa K, a menudo en presencia de SDS) para degradar la ARNasa. Esta reacción está seguida generalmente de una extracción orgánica con una solución de fenol/cloroformo para eliminar las proteínas y la actividad ARNasa residual. La extracción orgánica está seguida después de la concentración y recuperación de los productos de escisión mediante precipitación con alcohol (Myers y col., 1985; Winter y col., 1985; Theophilus y col., 1989).

4. Métodos de Separación

Siguiente a la amplificación, puede ser deseable separar el producto de amplificación del molde y del cebador en exceso con el fin de determinar si se ha producido la amplificación específica. En una realización, los productos de amplificación son separados mediante electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamina o poliacrilamida utilizando métodos normalizados. Ver Sambrok y col., 1989.

Alternativamente, se pueden emplear técnicas cromatografícas para efectuar la separación. Existen muchas clases de cromatografías que pueden ser utilizadas en la presente invención: adsorción, reparto, intercambio iónico y tamices moleculares, y muchas técnicas especializadas para utilizarlas, incluyendo cromatografía en columna, en papel, de capa fina y de gases (Freifelder, 1982).

5. Métodos de Identificación

Los productos de la amplificación pueden ser visualizados con el fin de confirmar la amplificación de las secuencias marcadoras. Un método de visualización típico implica la tinción de un gel con bromuro de etidio y la visualización con luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificación son marcados íntegramente con nucleótidos con marcaje radiactivo o fluorométrico, los productos de la amplificación pueden ser expuestos después a una película de rayos X o visualizados bajo el espectro estimulador apropiado, tras la separación.

En una realización, la visualización se logra indirectamente. Tras la separación de los productos de la amplificación, se pone en contacto una sonda de ácido nucleico, marcada con la secuencia marcadora amplificada. La sonda es conjugada preferiblemente con un cromóforo pero puede ser radiomarcada. En otra realización, la sonda es conjugada con una pareja de unión, tal como un anticuerpo o biotina, y el otro miembro de la pareja de unión porta un radical detectable.

En una realización, la detección es mediante transferencia Southern e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en la transferencia Southern son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden ser encontradas en muchos libros modelo sobre protocolos moleculares. Ver Sambrook y col., 1989. Brevemente, los productos de amplificación son separados mediante eletroforesis en gel. El gel se pone después en contacto con una membrana, por ejemplo de nitrocelulosa, permitiendo la transferencia del ácido nucleico y la unión no covalente. Con posterioridad, la membrana es incubada con una sonda conjugada con un cromóforo que es susceptible de hibridación con un producto de la amplificación diana. La detección es mediante exposición de la membrana a una película de rayos x o dispositivos de detección emisores de iones.

Un ejemplo de lo anterior se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.279.721, incorporada aquí como referencia, que describe un aparato y un método para la electroforesis y la transferencia de ácidos nucleicos automatizadas. El aparato permite la electroforesis y la transferencia sin manipulación externa del gel y es adecuado idealmente para llevar a cabo los métodos según la presente invención.

6. Componentes de Estuche

Todo el material y los reactivos esenciales requeridos para detectar los marcadores MODY en una muestra biológica pueden ser reunidos en un estuche. Este comprenderá generalmente cebadores preseleccionados para los marcadores específicos. Asimismo pueden estar incluidos las enzimas adecuadas para amplificar los ácidos nucleicos incluyendo diferentes polimerasas (RT, Taq, etc.), desoxinucleótidos y tampones para proporcionar la mezcla de reacción necesaria para la amplificación.

Semejantes estuches comprenderán generalmente, de maneras adecuadas, diferentes recipientes para cada reactivo y enzima individual así como para cada par de cebadores marcadores. Los pares preferidos de cebadores para amplificar ácidos nucleicos se seleccionan para amplificar las secuencias especificadas en la SED ID NUM: 3, la SED ID NUM: 5, o la SED ID NUM: 5, junto con los ADNc de HNF1\alpha (SED ID NUM: 1), HNF1\beta (SED ID NUM: 128) u HNF4\alpha (SED ID NUM: 78). En otras realizaciones preferidas los pares de cebadores para la amplificación se seleccionan para emplificar las secuencias especificadas en la SED ID NUM: 34, la SED ID NUM: 36, la SED ID NUM: 38, la SED ID NUM: 40, la SED ID NUM: 42, la SED ID NUM: 44, la SED ID NUM: 46, la SED ID NUM: 48, la SED ID NUM: 50, la SED ID NUM: 52, la SED ID NUM: 54.

En otra realización, semejantes estuches comprenderán sondas de hibridación específicas para MODY3, seleccionadas de un grupo que incluye los ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias especificadas en la SED ID NUM: 1, la SED ID NUM: 3, la SED ID NUM: 5, la SED ID NUM: 7, junto con los ADNc de HNF1\alpha (SED ID NUM: 1). En otra realización más semejantes estuches comprenderán sondas específicas para MODY1 seleccionadas de un grupo que incluye los ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias especificadas en la SED ID NUM: 78, la SED ID NUM: 34, la SED ID NUM: 36, la SED ID NUM: 38, la SED ID NUM: 40, la SED ID NUM: 42, la SED ID NUM: 44, la SED ID NUM: 46, la SED ID NUM: 48, la SED ID NUM: 50, la SED ID NUM: 52, la SED ID NUM: 54, HNF4\alpha. En otra realización más semejantes estuches comprenderán sondas específicas para MODY4 seleccionadas de un grupo que incluye los ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias especificadas en la SED ID NUM: 128, HNF1\beta o cualquiera de los exones mostrados en Fig. 27A-Fig. 27I, o los números de acceso Genbank U90279-90287 y U96079, incorporadas aquí como referencia.

Semejantes estuches comprenderán generalmente, en medios adecuados, recipientes distintos para cada reactivo y enzima individual así como para cada sonda de hibridación marcadora.

L. Utilización de la Huella Dactilar de ARN para Identificar los Marcadores de MODY3, MODY4 y MODY1

La huella dactilar del ARN es un método por medio del cual se pueden tomar muestras simultáneamente de los ARN aislados a partir de muchos tejidos, tipos celulares o grupos de tratamiento diferentes para identificar los ARN cuya abundancia relativa varía. Dos formas de esta tecnología fueron desarrolladas simultáneamente y referidas en 1992 como la huella dactilar del ARN por el despliegue diferencial (Liang y Pardee, 1992; Welsh y col., 1992). (Ver también Liang y Pardee, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.262.311, incorporada aquí como referencia en su totalidad). Algunos de los experimentos descritos aquí fueron realizados de una manera similar por Donahue y col., J. Biol. Chem. 269: 8604-8609, 1994.

Todas las formas de la huella dactilar del ARN mediante PCR son teóricamente similares pero difieren en su diseño y aplicación del cebador. La diferencia más sorprendente entre el despliegue diferencial y otros métodos de la huella dactilar de ARN es que el despliegue diferencial utiliza cebadores ancla que hibridan con las colas poli A de los ARNm. Como consecuencia, los productos de la PCR amplificados en despliegue diferencial tienen propensión hacia las regiones no traducidas 3' de los ARNm.

La técnica básica del despliegue diferencial ha sido descrita con detalle (Liang y Pardee, 1992). El ARN celular total es cebado para la transcripción inversa de la primera hebra con un cebador ancla compuesto de oligo dT y dos cualesquiera de los cuatro desoxinucleósidos. El cebador oligo dT es extendido utilizando una transcriptasa inversa, por ejemplo, transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (MMLV). La síntesis de la segunda hebra es cebada con un oligonucleótido elegido arbitrariamente, utilizando condiciones restrictivas reducidas. Una vez que ha sido sintetizado el ADNc de doble hebra, la amplificación continúa mediante técnicas de PCR normalizadas, utilizando los mismos cebadores. La huella dactilar de ADN resultante es analizada mediante electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio o autorradiografía. Una comparación parte a parte de las huellas dactilares obtenidas a partir por ejemplo de muestras de tejido tumoral frente a normal utilizando los mismos cebadores oligonucleotídicos identifica los ARNm que son expresados diferencialmente.

Se ha demostrado que la tecnología de la huella dactilar de ARN es eficaz para identificar genes que son expresados diferencialmente en el cáncer (Liang y col., 1992; Wong y col., 1993; Sager y col., 1993; Mok y col., 1994; Watson y col., 1994; Chen y col., 1995; An y col., 1995). En la presente invención se utiliza la técnica de la huella dactilar de ARN para identificar genes que son expresados diferencialmente en la diabetes.

Diseño y Consideraciones Teóricas para la RT-PCR Cuantitativa Relativa

La transcripción inversa (RT) de ARN o ADNc seguida de PCR cuantitativa relativa (RT-PCR) puede ser utilizada para determinar las concentraciones relativas de las especies de ARNm específicas aisladas de pacientes con MODY3, MODY4, y MODY1. Determinando que la concentración de una especie de ARNm específico varía, se demuestra que el gen que codifica la especie de ARNm específico es expresado diferencialmente. Esta técnica puede ser utilizada para confirmar que los transcritos de ARNm que se ha demostrado que son regulados diferencialmente por la huella dactilar de ARN son expresados diferencialmente en la diabetes relacionada con MODY.

En la PCR, el número de moléculas del ADN diana amplificado aumenta en un factor de aproximadamente dos con cada ciclo de la reacción hasta que algún reactivo se vuelve limitante. Después de eso, la velocidad de amplificación disminuye crecientemente hasta que no existe incremento de la diana amplificada entre los ciclos. Si se traza un gráfico en el que el número de ciclos está en el eje X y el log de la concentración del ADN diana amplificado está en el eje Y, se establece una línea curva con una forma característica conectando los puntos trazados. Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante. Se dice que es la porción lineal de la curva. Una vez que un reactivo se vuelve limitante, la pendiente de la línea comienza a descender y eventualmente se hace cero. En este momento la concentración del ADN diana amplificado se vuelve asintótica para algunos valores fijos. Se dice que esta es la porción meseta de la curva.

La concentración del ADN diana en la porción lineal de la curva de la amplificación mediante PCR es directamente proporcional a la concentración de partida de la diana antes del comienzo de la reacción. Determinando la concentración de los productos amplificados del ADN diana en las reacciones PCR que han completado el mismo número de ciclos y que están en sus intervalos lineales, es posible determinar las concentraciones relativas de la secuencia diana específica en la mezcla de ADN original. Si las mezclas de ADN son ADNc sintetizados a partir de los ARN aislados de diferentes tejidos o células, se puede determinar la abundancia relativa del ARNm específico a partir del cual derivaba la secuencia diana para los tejidos o las células respectivos. Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos de la PCR y la abundancia relativa de ARNm únicamente se verifica en el intervalo lineal de la reacción PCR.

La concentración final de ADN diana en la porción meseta de la curva es determinada mediante la disponibilidad de reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original de ADN diana. Por consiguiente, la primera condición que debe ser satisfecha antes de que la abundancia relativa de una especie de ARNm pueda ser determinada mediante RT-PCR para una colección de poblaciones de ARN es que se deben tomar muestras de las concentraciones de los productos de la PCR amplificados cuando las reacciones PCR están en la porción lineal de sus curvas.

La segunda condición que debe ser satisfecha para un experimento de RT-PCR para determinar acertadamente la abundancia relativa de una especie de ARNm concreta es que las concentraciones relativas de los ADNc amplificables debe ser normalizada hasta algún patrón independiente. El éxito de un experimento de RT-PCR es determinar la abundancia de una especie de ARNm relativa a la abundancia promedio de todas las especies de ARNm en la muestra. En los experimentos descritos más abajo, los ARNm para la \beta-actina, la asparragina sintetasa y la lipocortina II fueron utilizados como patrones externos e internos con los cuales se compara la abundancia relativa de otros ARNm.

En muchos protocolos para la PCR competitiva se utilizan patrones de PCR internos que son aproximadamente tan abundantes como la diana. Estas estrategias son eficaces si se toman muestras de los productos de las amplificaciones de la PCR durante sus fases lineales. Si se toman muestras de los productos cuando las reacciones se aproximan a la fase meseta, el producto menos abundante se vuelve entonces relativamente representado en exceso. Las comparaciones de la abundancia relativa realizadas para muchas muestras de ADN diferentes, como el caso en el que se examinan las muestras de ARN para la expresión diferencial, se distorsionan de tal manera que hacen que las diferencias en las abundancias relativas de los ARN parezcan menores de lo que realmente son. Este no es un problema significativo si el patrón interno es mucho más abundante que la diana. Si el patrón interno es mucho más abundante que la diana, se pueden realizar comparaciones lineales directas entre las muestras de ARN.

En el estudio anterior se describen las consideraciones teóricas de un análisis RT-PCR para sustancias derivadas clínicamente. Los problemas inherentes a las muestras clínicas son que existe una cantidad variable (que hace problemática la normalización), y que existe una calidad variable (necesitándose la amplificación simultánea de un control interno fiable, preferiblemente de mayor tamaño que la diana). Estos dos problemas son superados si la RT-PCR es realizada como una RT-PCR cuantitativa relativa con un patrón interno en el que el patrón interno es un fragmento de ADN amplificable que es más grande que el fragmento de ADN diana y donde la abundancia del ARNm que codifica el patrón interno es aproximadamente 5-100 veces superior al ARNm que codifica la diana. En este análisis se mide la abundancia relativa, no la abundancia absoluta de las especies de ARNm respectivas.

Se pueden realizar otros estudios utilizando un análisis RT-PCR cuantitativo relativo más convencional con un protocolo con patrón externo. En este análisis se toman muestras de los productos de la PCR en la porción lineal de sus curvas de amplificación. El número de ciclos PCR que es óptimo para la toma de muestras debe ser determinado empíricamente para cada fragmento de ADNc diana. Además, los productos de la transcriptasa inversa de cada población de ARN aislada de las diferentes muestras de tejido deben ser cuidadosamente normalizados para concentraciones iguales de ADNc amplificables. Esta consideración es muy importante puesto que el análisis mide la abundancia absoluta de ARNm. La abundancia absoluta de ARNm puede ser utilizada como medida de la expresión génica diferencial únicamente en muestras normalizadas. Si bien la determinación empírica del intervalo lineal de la curva de amplificación y la normalización de las preparaciones de ADNc son tediosas y son procedimientos que llevan tiempo, los análisis RT-PCR resultantes pueden ser superiores a los derivados del análisis RT-PCR cuantitativo relativo con un patrón
interno.

Una razón de esta ventaja es que sin el patrón interno/competidor, todos los reactivos pueden ser convertidos en un solo producto de la PCR en el intervalo lineal de la curva de amplificación, incrementándose de este modo la sensibilidad del análisis. Otra razón es que con sólo un producto de la PCR, la presentación del producto sobre un gel electroforético u otro método de presentación se vuelve menos complejo, tiene menos fondo y es más fácil de interpretar.

M. Métodos para la Activación de la Expresión Génica

En una realización de la presente invención, se proporcionan métodos para el aumento de la expresión o la activación génica en una célula. Esto es particularmente útil cuando existe una aberración en el producto génico o la expresión génica no es suficiente para el funcionamiento normal. Esto permitirá el alivio de los síntomas de la diabetes de tipo MODY3 experimentada como resultado de la mutación en HNF1\alpha, la diabetes de tipo MODY4 experimentada como resultado de la mutación en HNF1\beta y la diabetes de tipo MODY1 experimentada como resultado de la mutación en HNF4\alpha.

El enfoque general para incrementar la expresión génica mediada por HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha según la presente invención, será proporcionar a la célula un polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, permitiendo de ese modo que tenga efecto la actividad promotora de la transcripción de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha. Si bien es concebible liberar la proteína directamente, una realización preferida implica proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, es decir, un gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, a la célula. Tras esta provisión, el polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha es sintetizado mediante la maquinaria de transcripción y traducción de las células huésped, así como cualquiera que pueda proporcionar el constructo de expresión. Se proporcionarán los elementos reguladores que actúen en cis para apoyar la expresión del gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, en forma de un constructo de expresión. También es posible que la expresión del gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha pueda ser estimulada o intensificada, o el polipéptido expresado estabilizado, logrando de este modo el mismo o similar efecto.

Con el fin de efectuar la expresión de los constructos que codifican los genes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, el constructo de expresión puede ser liberado en una célula. Un mecanismo de liberación es a través de la infección viral, en la que el constructo de expresión es encapsidado en una partícula viral que liberará un ácido nucleico replicante o no replicante. En algunas realizaciones se utiliza un vector HSV, si bien cualquier vector sería virtualmente suficiente.

En la presente invención también se contemplan diversos métodos no virales para la transferencia de los constructos de expresión a células de mamífero cultivadas. Entre estos se incluyen las precipitación con fosfato de calcio (Graham y Vac der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990), DEAE-Dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa y col., 1986; Potter y col., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y col., 1979) y complejos de lipofectamina-ADN, sonicación celular (Fechheimer y col., 1987), bombardeo de genes utilizando microproyectiles de alta velocidad (Yang y col., 1990), y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas técnicas pueden ser adaptadas con éxito para el uso in vivo o ex vivo, como se estudia más abajo.

En otra realización de la invención, el constructo de expresión puede constar simplemente de ADN o plásmidos recombinantes desnudos. La transferencia del constructo se puede realizar mediante cualquiera de los métodos mencionados antes que permeabilizan físicamente o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero puede ser aplicado también al uso in vivo. Otra realización de la invención para transferir un constructo de expresión de ADN desnudo a las células puede implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar microproyectiles recubiertos con ADN a una alta velocidad permitiendo perforar las membranas celulares e introducirse en las células sin destruirlas (Klein y col., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Uno de tales dispositivos cuenta con una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, lo que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang y col., 1990). Los microproyectiles utilizados han constado de sustancias biológicamente inertes tales como cuentas de tungsteno u
oro.

En una realización adicional de la invención, el constructo de expresión puede ser atrapado en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos son suspendidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan autorreordenamiento antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). También están contemplados los complejos de lipofectamina-ADN.

La liberación de ácido nucleico mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha sido muy acertada. Wong y col., (1980) demostraron la viabilidad de la liberación mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo en embriones de pollo cultivados, células HeLa y de hepatoma. En algunas realizaciones de la invención, el liposoma puede formar complejos con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada en la célula del ADN encapsulado en el liposoma (Kaneda y col., 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede formar complejos o ser empleado junto con proteínas cromosómicas nucleares no histónicas (HMG-1) (Kato y col., 1991). En otras realizaciones adicionales, el liposoma puede formar complejos o ser empleado junto con HVJ y HMG-1. En otras realizaciones, el vehículo de liberación puede comprender un ligando y un liposoma. Cuando se emplea un promotor bacteriano en el constructo de ADN, también será deseable incluir en el liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.

Otros constructos de expresión que pueden ser empleados para liberar un ácido nucleico que codifica un transgen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha en las células son los vehículos de liberación mediada por receptores. Estos sacan ventajas de la absorción selectiva de macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptores en casi todas las células eucarióticas. Debido a la distribución específica del tipo celular de los diferentes receptores, la liberación puede ser altamente específica (Wu y Wu, 1993).

Los vehículos para el redireccionamiento de genes mediado por receptores consta generalmente de dos componentes: un ligando específico del receptor celular y un agente de unión al ADN. Se han utilizado diversos ligandos para la transferencia génica mediada por receptores. Los ligandos caracterizados más extensamente son los asialoorosomucoides (ASOR) (Wu y Wu, (1987) y la transferrina (Wagner y col., 1990). Recientemente, se ha utilizado una neoglicoproteína sintética, que reconoce el mismo receptor que ASOR, como vehículo de liberación génica (Ferkol y col., 1993; Perales y col., 1994). La manosa puede ser utilizada para redireccionar el receptor de manosa en las células del hígado. Asimismo, los anticuerpos para CD5 (CLL), CD22 (linfoma), CD25 (leucemia de células T) y MAA (melanoma) pueden ser utilizadas de un modo similar como radicales de redireccionamiento. En otras realizaciones, el vehículo de liberación puede comprender un ligando y un liposoma.

Se pueden preparar cultivos de células de mamífero primarios de diferentes formas. Con el fin de mantener viables las células mientras están in vitro y en contacto con el constructo de expresión, es necesario asegurar que las células mantienen el contacto con la proporción correcta de oxígeno y de dióxido de carbono y nutrientes pero están protegidas de la contaminación microbiana. Las técnicas de cultivo celular están bien documentadas y son descritas aquí como referencia (Freshner, 1992).

Una realización de lo anterior implica el uso de transferencia génica para inmortalizar células para la producción de proteínas. El gen para la proteína de interés puede ser transferido como se ha descrito antes a las células huésped apropiadas seguido del cultivo de las células en las condiciones apropiadas. El gen virtualmente para cualquier polipéptido puede ser empleado de esta manera. La generación de vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos allí, han sido estudiados antes. Alternativamente, la proteína que se va a producir puede ser una proteína endógena sintetizada normalmente en la célula en cuestión.

Los ejemplos de las líneas celulares de mamíferos útiles son las células Vero y Hela y las líneas celulares de ovario de hámster Chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN y las células MDCK. Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y madure el producto génico de la manera deseada. Semejantes modificaciones (v.g., glucosilación) y maduraciones (v.g., escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para el funcionamiento de la proteína. Las diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para la maduración post-traduccional de las proteínas. Se pueden elegir las líneas celulares o los sistemas huésped apropiados para asegurar la correcta modificación y maduración de la proteína foránea expresada.

Se pueden utilizar varios sistemas de selección incluyendo, pero no limitados a los genes de la timidina quinasa de HSV, hipoxantina-guanina fosforribosil-transferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o
aprt-, respectivamente. Asimismo, se puede utilizar la resistencia a anti-metabolitos como la base de la selección para dhfr, que confiere resistencia a; gtp, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G418; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.

Las células animales pueden ser propagadas in vitro de dos maneras: como células no dependientes de ancla que crecen en suspensión a lo largo del volumen del cultivo o como células dependientes de ancla que requieren el anclaje a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un tipo de crecimiento celular monocapa).

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Los cultivos no dependientes de ancla o en suspensión de líneas celulares establecidas continuas son los medios más ampliamente utilizados para la producción a gran escala de células y productos celulares. No obstante, las células cultivadas en suspensión tienen limitaciones, tales como potencial tumorígeno e inferior producción de proteínas que las células adherentes.

El cultivo en suspensión a gran escala de células de mamíferos en tanques agitados es un método común para la producción de proteínas recombinantes. Dos diseños de reactor para el cultivo en suspensión tienen un uso considerable, el reactor agitado y el reactor de extracción neumática. El diseño agitado ha sido utilizado con éxito con una capacidad de 8000 litros para la producción de interferón. Las células se desarrollan en un tanque de acero inoxidable con una razón de altura a diámetro de 1:1 a 3:1. El cultivo se mezcla usualmente con uno o más agitadores, basados en discos de paletas o modelos de hélices marinas. Se han descrito sistemas agitadores que ofrecen menos fuerzas de cizalla que las paletas. La agitación puede ser accionada bien directamente o indirectamente mediante propulsores acoplados magnéticamente. Los propulsores indirectos reducen el riesgo de contaminación microbiana a través de las juntas sobre los ejes agitadores.

El reactor de extracción neumática, también descrito inicialmente para la fermentación microbiana y adaptado más tarde para el cultivo mamífero, cuenta con una corriente de gas tanto para mezclar como para oxigenar el cultivo. La corriente de gas se introduce en una sección ascendente del reactor e impulsa la circulación. El gas desocupa la superficie del cultivo haciendo que un líquido más denso sin burbujas de gas se desplace descendentemente en la sección en caída del reactor. La ventaja principal de este diseño es la simplicidad y la carencia de necesidad de mezclado mecánico. Típicamente, la razón del diámetro al radio es de 10:1. El reactor de extracción neumática aumenta proporcionalmente de manera relativamente fácil, tiene una buena transferencia masas de gases y genera relativamente pocas fuerzas de cizalla.

N. Métodos para Bloquear la Acción de HNF1\alpha, HNF1\beta y HNF4\alpha Mutantes

En otra realización de la presente invención, se contempla el método de bloqueo de la función de HNF1\alpha en MODY3, HNF1\beta en MODY4, y HNF4\alpha en MODY1 mutados. De este modo, puede ser posible restringir los efectos de la mutación en la diabetes. Además, se puede mostrar efectivo el uso de esta clase de intervención terapéutica combinada con terapias para la diabetes más tradicionales, tales como la administración de insulina.

La forma general que este aspecto de la invención tomará es la provisión, a una célula, de un agente que inhibirá la función de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutados. Se contemplan cuatro de tales agentes. Primero, se puede emplear un ácido nucleico antisentido que hibridará con el gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado o con el transcrito del gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado, evitando de ese modo la transcripción o la traducción, respectivamente. Las consideraciones relevantes para el diseño de constructos antisentido han sido presentadas antes. Segundo, se puede utilizar una proteína o péptido de unión a HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado, por ejemplo, un péptido mimético o un anticuerpo que se una inmunológicamente a un HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado respectivamente, la unión de cualquiera bloqueará o reducirá la actividad del HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado respectivamente. Los métodos para elaborar y seleccionar parejas de unión peptídicas o anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tercero, se puede proporcionar a la célula un antagonista de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado, por ejemplo, la secuencia diana de transactivación, sola o acoplada a otro agente. Y cuarto, se puede proporcionar un agente que se una a la diana HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutada sin el mismo resultado funcional que se produciría con la unión a HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutada.

La provisión de un gen HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, una proteína HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutada, o un antagonista de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado, podría ser según cualquier ruta farmacéutica apropiada. La formulación de semejantes composiciones y su liberación a los tejidos se estudia más abajo. El método por medio del cual el ácido nucleico, la proteína o el producto químico es transferido, junto con la ruta de liberación preferida, será seleccionado basándose en el sitio concreto que se vaya a tratar. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar los métodos más apropiados basándose en consideraciones clínicas relevantes.

Muchas de las técnicas de transferencia de genes que se aplican generalmente in vitro pueden ser adaptadas para el uso ex vivo o in vivo. Por ejemplo, órganos seleccionados incluyendo el hígado, la piel, y el tejido muscular de ratas y ratones han sido bombardeados in vivo (Yang y col., 1990; Zelenin y col., 1991). También ha sido utilizado ADN desnudo en escenarios clínicos para efectuar terapia génica. Estos enfoques pueden requerir la exposición quirúrgica del tejido diana o la inyección directa en el tejido diana. Nicolau y col. (1987) completaron con éxito la transferencia génica mediada por liposomas en ratas tras la inyección intravenosa.

Dubensky y col., (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de productos precipitados en CaPO_{4} en el hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados en CaPO_{4} producían la expresión de los genes transfectados. En ese caso se prevé que el ADN que codifica un constructo antisentido también puede ser transferido de una manera similar in vivo.

Cuando la realización implica el uso de un anticuerpo que reconoce un polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado, se debe prestar atención al mecanismo por medio del cual es introducido el anticuerpo en el citoplasma celular. Esto se puede lograr, por ejemplo, proporcionando un constructo de expresión que codifique una versión del anticuerpo de cadena sencilla del anticuerpo. La mayoría de los estudios anteriores referidos a constructos de expresión para versiones antisentido de genes HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha serán relevantes en este aspecto de la invención. Alternativamente, es posible presentar un anticuerpo bifuncional, donde un brazo de unión al antígeno del anticuerpo reconoce el polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha y el otro brazo de unión al antígeno reconoce un receptor sobre la superficie de la célula que va a ser buscada como diana. Los ejemplos de los receptores adecuados podrían ser glicoproteínas de HSV tales como gB, gC, gD, o gH. Además, puede ser posible explotar la función de unión a Fc asociada con gE de HSV, obviando de ese modo la necesidad de sacrificar un brazo del anticuerpo con el propósito de buscar la célula diana.

Ventajosamente, se puede combinar este enfoque con opciones de terapia de la diabetes más convencionales.

O. Fármacos y Métodos In Vivo para el Tratamiento de la Enfermedad

Las composiciones farmacéuticas acuosas de la presente invención tendrán una cantidad efectiva de un constructo de expresión HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, un constructo de expresión HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha antisentido, un constructo de expresión que codifique un gen terapéutico junto con HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha, una proteína o compuesto que inhiba la función de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado respectivamente, tal como un anticuerpo anti- HNF1\alpha mutante, un anticuerpo anti-HNF1\beta mutante o un anticuerpo anti-HNF4\alpha mutante, o un polipéptido HNF1\alpha mutado, un polipéptido HNF1\beta mutado o un polipéptido HNF4\alpha mutado. Tales composiciones generalmente serán disueltas o dispersadas en un portador farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Una "cantidad efectiva", con el propósito de la terapia, es definida como la cantidad de ocasiona una diferencia medida clínicamente de la condición del sujeto. Esta cantidad variará dependiendo de la sustancia, la condición del paciente, el tipo de tratamiento, la localización de la lesión, etc.

Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" hacen referencia a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un animal, o humano, según sea apropiado. Según se utiliza aquí, en "portador farmacéuticamente aceptable" se incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de tales medio y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto cuando cualquier medio convencional o agente sea incompatible con los ingredientes activos, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden ser incorporados a las composiciones ingredientes activos suplementarios tales como otros agentes antidiabéticos.

Además de los compuestos formulados para la administración parenteral, tales como aquellos para la inyección intravenosa o intramuscular, entre otras formas farmacéuticamente aceptables se incluyen, v.g., tabletas y otros sólidos para la administración oral; cápsulas de liberación retardada, y cualquier otra forma utilizada actualmente, incluyendo cremas, lociones, enjuagues bucales, inhalantes y similares.

Los compuestos activos de la presente invención serán formulados a menudo para la administración parenteral, v.g., formulados para la inyección vía rutas intravenosa, intramuscular, subcutánea, o incluso intraperitoneal. La preparación de una composición acuosa que contenga compuestos inhibidores de HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha mutado solos o combinados con agentes para la terapia de la diabetes convencionales como ingredientes activos será conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones pueden ser preparadas en forma de inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para el uso en la preparación de soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de la inyección; y las preparaciones también pueden ser emulsionadas.

Las soluciones de los compuestos activos en forma de base libre o sales farmacéuticamente aceptables pueden ser preparadas en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Entre las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones incluyendo aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En muchos casos, la forma puede ser estéril y puede ser fluida hasta el punto de ser fácilmente inyectable. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Los compuestos activos pueden ser formulados en una composición en una forma neutra o salina. Entre las sales farmacéuticamente aceptables, se incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que están formados con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden estar derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, por ejemplo de lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido y en el caso de la dispersión mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede ser producida mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles son preparadas mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con algunos de los otros ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando los diferentes ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados antes. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado a vacío y de liofilización que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo.

Tras la formulación, las soluciones serán administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación y en cualquier cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones pueden ser administradas fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas antes, siendo utilizables incluso con cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser tamponada adecuadamente si fuera necesario y volver isotónico primero el diluyente líquido con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas concretas son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea y peritoneal. Con respecto a esto, los medios acuosos estériles que se pueden emplear son conocidos para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, se podría disolver una dosis en 1 mL de solución de NaCl isotónica y o bien añadir a 1000 mL de fluido de hipodermoclisis o bien inyectar al sitio propuesto de infusión; (ver por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que esté siendo tratado. La persona responsable de la administración podrá, en cualquier caso, determinar la dosis apropiada para el sujeto individual.

P. Ejemplos

Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Deberá ser apreciado por los expertos en la técnica que los mecanismos descritos en los ejemplos que siguen representan mecanismos descubiertos por el autor de la presente invención que funcionan bien en la práctica de la invención, y de este modo se debe considerar que constituyen las modalidades preferidas para su práctica. No obstante, los expertos en la técnica deberán apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones es-
pecíficas descritas y que aún se obtendrán resultados similares sin apartarse del espíritu y del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Respuestas Secretoras Insulínicas a la Glucosa Alteradas en Sujetos Diabéticos y No Diabéticos con Mutaciones en el Gen de Susceptibilidad a la Diabetes Mellitus MODY3 en el Cromosoma 12

En el presente Ejemplo se determina si las alteraciones en las relaciones dosis-respuesta entre la concentración de glucosa en plasma y la tasa de secreción de insulina (ISR) pueden ser identificadas en sujetos que han heredado un alelo con riesgo de MODY3 pero todavía no han desarrollado diabetes evidente.

1. Métodos Sujetos de la genealogía MODY3

Se estudiaron trece sujetos caucásicos que fueron positivos a los marcadores para MODY3 en el cromosoma 12q. Dos sujetos eran miembros de una genealogía Francesa F549 (Vaxillaire y col., 1995), tres eran de la genealogía P de Michigan (Menzel y col., 1995), dos de una genealogía de Nueva York, la genealogía H descrita en la Fig. 1, dos eran de una genealogía de Liverpool, la genealogía BDA1 y cuatro de una genealogía de Nottingham, la genealogía BDA12 (Fig. 1). Se determinó el tipo de cada sujeto con una serie de marcadores de ADN en la región de MODY3 para determinar si habían heredado o no el haplotipo de riesgo que segregaba MODY3 en esa familia. El estado de diabetes de cada sujeto excepto para MD13, había sido determinado mediante ensayo de tolerancia a la glucosa oral (OGTT)
conforme a los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Grupo de Estudio sobre la Diabetes Mellitus de la OMS, 1985) y fue confirmado en el momento de los estudios midiendo la hemoglobina glucosilada. Basándose en los resultados del OGTT y los valores de hemoglobina glucosilada en o por encima del intervalo normal del laboratorio de los autores de la presente invención (<7,4%) los sujetos fueron divididos en grupos diabéticos y no diabéticos.

Sujetos MODY3 No Diabéticos (n = 6)

Los perfiles clínicos de estos sujetos se describen en la Tabla 4. Todos tenían niveles normales de glucosa y hemoglobina glucosilada (<7,4%) en ayunas en el momento de este estudio. En el momento del estudio 4 sujetos tenían IGT (MD1, MD4, MD9, MD13) y 2 sujetos tenía tolerancia a la glucosa normal (NGT) (MD3, MD5). Basándose en ensayos de tolerancia a la glucosa previos MD1 tenía IGT, MD3 demostró constantemente NGT en OGTT consecutivos, MD4 fue diagnosticado de IGT en 6/93 y tiene IGT persistente con un nivel de glucosa en sangre 2 h postprandial de 147 mg/dl, MD5 fue diagnosticado inicialmente de IGT y con posterioridad tenía 2 OGTT normales, con valores de glucosa en sangre a las 2 horas de 130 mg/dl y 105 mg/dl, respectivamente, MD9 tenia IGT, con un nivel de glucosa en sangre a las dos horas de la prueba de 167 mg/dl con ningún otro nivel de glucosa por encima de 200 mg/dl y MD13 tenía IGT con niveles de glucosa en sangre postprandiales elevados en el pasado por encima de 160 mg/dl. La edad de la diagnosis hace referencia a la edad a la cual fue diagnosticada la tolerancia anómala a la glucosa. Ninguno de estos sujetos fue diagnosticado nunca de NIDDM.

Sujetos MODY3 Diabéticos (n = 7)

Los perfiles clínicos se muestran en la Tabla 4. Todos los sujetos habían sido tratados con agentes hipoglucémicos orales excepto MD8 que había tomado insulina que se interrumpió dos días antes del estudio y MD12 que fue tratado solo con dieta. Todos los sujetos habían interrumpido el tratamiento con agentes hipoglucémicos orales al menos tres semanas antes de ser estudiados. Como se muestra en la Tabla 4, los niveles de glucosa en plasma y de hemoglobina glucosilada totales en ayunas fueron superiores en el grupo diabético y los niveles de insulina en ayunas fueron inferiores. El grupo diabético también tenía significativamente más edad que los otros dos grupos.

Controles No Diabéticos

Los grupos de control constaban de 5 varones y una hembra (5 Caucasianos y 1 Afroamericano) que no tenían un historial personal o familiar de NIDDM. Todos estaban dentro del 20% del peso corporal ideal, no tenían enfermedades médicas y no recibieron ninguna medicación. Los datos de cuatro de los sujetos de control han sido publicados previamente (Byrne y col., 1994; Byrne y col., 1995a). BMI no fue significativamente diferente entre los grupos de control y diabético y no diabético MODY3.

Las voluntarias femeninas tenían ciclos menstruales regulares y fueron estudiadas únicamente en la fase folicular temprana. El estudio fue aprobado por el Institutional Board of the University of Chicago Medical Center y todos los sujetos y/o progenitores proporcionaron su consentimiento comunicado por escrito.

Protocolo Experimental

Los estudios comenzaron a la 0800 h con los sujetos tumbados al cabo de 12 horas de ayuno nocturno. Se colocó un catéter intravenoso en cada antebrazo, uno para la extracción de sangre y otro para la administración de glucosa. En todos los experimentos, el brazo que contenía el catéter de muestra fue mantenido en una manta térmica o caja de manos calientes para asegurar la arterialización de la muestra venosa.

Estudios de Infusión de Glucosa Graduada

Estos estudios fueron diseñados para caracterizar las relaciones dosis-respuesta entre la glucosa y la tasa de secreción de insulina (ISR). Con el fin de eliminar los efectos potencialmente confusos de las diferencias en la concentración basal de glucosa, cada estudio comenzó con la administración de pequeños bolos de insulina intravenosamente (0,007 U/kg) seguido de una infudión continua de baja dosis de insulina para disminuir la glucosa en plasma en ayunas a niveles similares en todos los grupos (glucosa en plasma objetivo = 5 mM). Tras un período de 20 minutos, tiempo durante el cual se dejaba decaer la insulina administrada exógenamente, se tomaron muestras a intervalos de 10 minutos durante 30 minutos para definir los niveles de la línea base de insulina, de glucosa y de péptido C. Después comenzó una infusión intravenosa de dextrosa al 20% a una velocidad de 1 mg/kg/min, seguido de infusiones de 2 mg/kg/min, 3 mg/kg/min, 4 mg/kg/min, 6 mg/kg/min y 8 mg/kg/min. Cada velocidad de infusión fue administrada durante un período de 40 minutos. Se midieron las concentraciones de insulina, péptido C y glucosa a los 10, 20, 30 y 40 minutos de cada período de infusión.

Efectos de la administración de glucosa intravenosa prolongada sobre las respuestas secretoras insulínicas a infusiones de glucosa graduadas

Al completarse el estudio sobre infusión de glucosa graduada descrito antes, la glucosa fue infundida intravenosamente durante un período de 42 horas a una velocidad de 4-6 mg/kg/min para determinar si las respuestas secretoras insulínicas a la glucosa podrían ser cebadas mediante la exposición a hiperglucemia suave. Los sujetos también consumieron tres comidas enriquecidas en hidratos de carbono durante el segundo día de esta infusión de glucosa. A la conclusión del período de infusión de 42 horas, la velocidad de infusión se redujo a lo largo de un período de 60 minutos y después se detuvo. Al cabo de treinta minutos, se repitió el estudio de infusión de glucosa graduada. Los niveles de glucosa en plasma fueron obtenidos cada cuatro horas durante la infusión de glucosa de 42 horas.

Análisis

Se midió la glucosa en plasma mediante la técnica de la glucosa oxidasa (analizador YSI, Yellow Springs, OH). El coeficiente de variación de este método es de <2%. Se analizó la insulina en suero mediante una técnica con doble anticuerpo (Morgan y Lazarow, 1963). El coeficiente de variación medio intra-análisis fue del 6%. El péptido C en plasma fue medido como se ha descrito previamente (Faber y col., 1978). El límite inferior de sensibilidad del análisis fue de 0,02 pmol/ml y el coeficiente de variación intra-análisis promedió el 6%. Todas las muestras fueron medidas por duplicado. Los análisis fueron realizados en la universidad de Chicago.

Análisis de los Datos

Estimación de las ISR. Las ISR fueron derivadas mediante la desconvolución de las concentraciones de péptido C en plasma suponiendo un modelo bicompartimentado de las cinéticas de aclaramiento de péptido C (Van Cauter y col., 1992; Eaton y col, 1980; Polonsky y col., 1986).

Relación entre la glucosa y las ISR

La relación entre la glucosa en plasma y la ISR fue explorada en cada individuo analizando los datos de los estudios de infusión de glucosa graduada. Se calcularon la glucosa, la insulina, el péptido C y las ISR de la línea base como la media de los valores en las muestras a los 30, 20, 10 y 0 min. Durante cada período de infusión de glucosa, se calcularon la glucosa y la ISR promedio. La ISR media para cada período se trazó después frente a al nivel de glucosa medio correspondiente, estableciéndose de ese modo una relación dosis-respuesta entre la glucosa y la ISR. Las ISR medias fueron determinadas para intervalos de concentración de glucosa 1 mM calculando el área bajo la curva para cada intervalo utilizando la regla trapezoidal. Esta área fue dividida por 1 mM para obtener las unidades correctas (pmol/min).

Análisis estadísticos

Todos los resultados son expresados como la media \pm EMS. Los análisis de los datos fueron realizados utilizando el Statistical Analysis System (SAS Version 6 Edition for Personal Computers, SAS Institute, Inc., Cary, NC). La significación de las diferencias entre los grupos fue determinada utilizando los test de la t apareados y no apareados o el análisis de la varianza cuando sea apropiado. Se utilizó el test de recorrido estudentizado de Tukey para las comparaciones post hoc. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar las correlaciones entre pares de parámetros.

2. Resultados Glucosa, insulina e ISR durante la infusión de glucosa intravenosa graduada

Los niveles de glucosa en plasma en ayunas fueron superiores en el grupo diabético MODY3 en comparación con el grupo no diabético o los controles (7,5 \pm 0,7 mM vs 4,5 \pm 0,2 y 4,7 \pm 0,2, respectivamente; P > 0,0008). Los niveles de insulina en plasma en ayunas correspondientes fueron inferiores en al grupo MODY3 diabético en comparación con los no diabéticos y los controles (Tabla 4). La glucosa, la insulina y las respuestas ISR a las infusiones de glucosa se muestran en la Fig. 2A, Fig. 2B y Fig. 2C, respectivamente. Las concentraciones medias de glucosa durante la duración del estudio fueron más altas en los sujetos MODY3 diabéticos en comparación con los sujetos MODY3 no diabéticos y de control (8,5 \pm 0,4 mM vs 6,3 \pm 0,3 mM y 64 \pm 0,2; P < 0,0002) (Fig. 2A). Los niveles medios de insulina fueron más bajos en los grupos MODY3 diabéticos y no diabéticos que en los controles (57,4 \pm 8,2 pmol/L y 79,8 \pm 11,0 vs 139,3 \pm 14,7 pmol/L; P < 0,0006) (Fig. 2B). Las ISR medias fueron significativamente inferiores en sujetos MODY3 diabéticos en comparación con los no diabéticos y los controles (116 \pm 18,8 pmol/min vs 179,7 \pm 19,9 pmol/min y 1995 \pm 18,7; P < 0,02) (Fig. 2C).

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TABLA 5

	Insulina Secretada entre glucosa 5 y 9 mM
ID	Línea Base	Post-Glucosa	Efecto cebador %
MODY3 No diabéticos
\hskip0.5cm MD1	188,1	221,6	17,9
\hskip0.5cm MD3	164,5	255	55
\hskip0.5cm MD4	136,6	208,3	52,5
\hskip0.5cm MD5	297,5	342,5	15,1
\hskip0.5cm MD9	249,1	292,1	34,5
\hskip0.5cm MD13	248,1	234,2	-5,9
\hskip0.5cm Media	214,3 \pm 24,8	259 \pm 20,6	35 \pm 8

MODY3 Diabéticos
\hskip0.5cm MD2	67,4	68,9	2,2
\hskip0.5cm MD6	131,5	109,1	-17
\hskip0.5cm MD7	144,6	85,2	-41
\hskip0.5cm MD8	156,6	189,3	20,9
\hskip0.5cm M10	63,7	34,9	-45
\hskip0.5cm M11	38,2	28,4	-26
\hskip0.5cm M12	102,6	115,1	12,2
\hskip0.5cm Media	100,8 \pm 17,3*	90,0 \pm 20,8*	-13,4 \pm 9,8*

Controles
\hskip0.5cm CO5	318,1	356,8	12,2
\hskip0.5cm CO7	209,5	272,1	29,2
\hskip0.5cm CO9	166,9	223,1	33,7
\hskip0.5cm C12	235,6	381,6	62,0
\hskip0.5cm C13	215,6	306,5	42,2
\hskip0.5cm C18	120,1	180,5	50,3
\hskip0.5cm Media	211 \pm 27	287 \pm 32	38 \pm 7
valor P	p<0,004	p<0,002	p<0,009
\begin{minipage}[t]{145mm} La cantidad de insulina secretada a medida que la glucosa aumentaba de 5 a 9 mM en los sujetos a estudio antes y después de una infusión intravenosa cebadora de glucosa. Los asteriscos hacen referencia a diferencias significativas estadísticamente entre los sujetos diabéticos y los otros dos grupos utilizando el test de recorrido estudentizado de Tukey para las comparaciones post hoc.\end{minipage}

Cambios en la sensibilidad a la insulina

La resistencia a la insulina estimada mediante el Método de Evaluación del Modelo de Homeostasis (Homeostasis Model Assessment Method "HOMA") (Matthews y col., 1985) fracasó para demostrar diferencias significativas entre los grupos (MODY3 diabético: 1,9 \pm 0,2; MODY3 no diabético: 1,7 \pm 0,3; controles: 2,4 \pm 0,2; P = 0,11).

Relación dosis-respuesta entre glucosa e ISR

La ISR de los tres grupos fue comparada al mismo nivel de glucosa en plasma trazando la ISR media a cada tasa de infusión de glucosa frente al nivel de glucosa medio correspondiente. Las relaciones dosis-respuesta de glucosa-ISR resultantes se muestran en la Fig. 3. A lo largo del intervalo de concentración de glucosa 5-9 mM el grupo MODY3 diabético secretó significativamente menos insulina que los sujetos de los grupos MODY3 no diabéticos y de control (101 \pm 17 pmol/min vs 214 \pm 25 y 211 \pm 27 pmol/min, respectivamente; p < 0,004). La tasa de secreción de insulina media no difería entre estos dos últimos grupos.

Las curvas dosis-respuesta (Fig. 3) indican que la tasa de secreción de insulina eran similares en los sujetos MODY no diabéticos y los controles a concentraciones de glucosa inferiores. La cantidad de insulina secretada a medida que aumentaba la concentración de glucosa de 5 a 7 mM fue similar en estos dos grupos (180 \pm 19 vs 160 \pm 17 pmol/min; p = 0,45). A lo largo del intervalo de glucosa 7-8 mM los sujetos MODY3 no diabéticos secretaron 243,5 \pm 31,5 pmol/min en comparación con 284,7 \pm 30,5 pmol/min en los controles P = 0,37. A partir de glucosa 8-9 mM secretaban 257,1 \pm 35,0 pmol/min en comparación con 354,0 \pm 43,4 pmol/min en los controles P = 0,12 (Fig. 3). A medida que aumentaba la concentración de glucosa de 7-8 mM a 8-9 mM el aumento de la tasa de secreción de insulina en los sujetos MODY3 no diabéticos era significativamente menor que en los controles (37,3 \pm 13,5 vs 75,7 \pm 9,5 pmol/min; P < 0,05.).

Efecto de la Infusión de glucosa a una baja dosis sobre las relaciones entre la glucosa y la ISR

Los niveles medios de glucosa alcanzados durante las 42 horas de infusión constante de glucosa fueron significativamente mayores en el grupo MODY3 diabético en comparación con el no diabético y los controles (14,9 \pm 0,6 mM vs 10,0 \pm 1,4 mM vs 6,6 \pm 0,3 mM; P < 0,0001). La infusión de glucosa fue interrumpida al cabo de 42 horas y se administró insulina a dosis baja produciendo una caída de la concentración de glucosa en plasma a niveles similares en los dos grupos. El estudio de infusión de glucosa graduada se repitió después en cada sujeto.

Con el fin de cuantificar el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina, se trazó la ISR media medida durante cada tasa de infusión de glucosa frente a la concentración de glucosa en plasma media y se comparó con los valores obtenidos antes de la infusión de glucosa. A lo largo del intervalo de concentración de glucosa entre glucosa 5 mM y 9 mM los sujetos de control secretaron 211 \pm 27 pmol/min antes y 287 \pm 32 pmol/min (P z 0,005) de insulina tras la infusión de glucosa (Fig. 4A). Existía un desplazamiento en las curvas dosis-respuesta de ISR-glucosa hacia arriba y hacia la izquierda, incrementándose la ISR en 38 \pm 7%. En el grupo MODY3 no diabético se incrementó su ISR de 214 \pm 25 pmol/min a 259 \pm 21 pmol/min (P < 0,03) (Fig. 4B). El grupo MODY3 diabético tenía un descenso pequeño y no significativo, 13 \pm 10%, de la ISR tras la administración de glucosa (101 \pm 17 pmol/min a 90 \pm 21 pmol/min; P < 0,9) (Fig. 4C). Los valores individuales para la ISR de la glucosa 5-9 mM antes y después de la infusión de glucosa a baja dosis se dan en la Tabla 5.

Relación entre los niveles de hemoglobina glucosilada y los parámetros de la respuesta secretora insulínica a la glucosa

Existía una correlación negativa significativa entre la hemoglobina glucosilada y el porcentaje de cebado (r = -0,78; P < 0,002) y entre la hemoglobina glucosilada y la ISR de la glucosa 5-9 mM (r = 0,61; P < 0,03). En contraste no existía un descenso significativo en la ISR a medida que las concentraciones de glucosa subían de 7-8 mM a 8-9 mM con niveles crecientes de hemoglobina glucosilada (r = -0,07; P = 0,82).

3. Discusión

Los niveles basales de glucosa fueron superiores y los niveles de insulina fueron inferiores en sujetos MODY3 con diabetes en comparación con los sujetos no diabéticos o con los controles sanos normales. En respuesta a la infusión de glucosa graduada, las tasas de secreción de insulina fueron significativamente inferiores en los sujetos diabéticos a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones de glucosa. Las tasas de secreción de insulina en los sujetos MODY3 no diabéticos no fueron significativamente diferentes de los controles a niveles en plasma de <8 mM. A medida que la glucosa aumentaba por encima de este nivel, no obstante, el incremento de la secreción de insulina en estos sujetos resultaba significativamente reducida. La administración de glucosa mediante infusión intravenosa durante 42 horas produjo un incremento significativo de la cantidad de insulina secretada a lo largo del intervalo de concentración de glucosa 5-9 mM en los controles y en los sujetos MODY3 no diabéticos (en un 38% y 35%, respectivamente) pero no se observaba un cambio significativo en los sujetos MODY3 diabéticos. Para terminar, en los sujetos MODY3 no diabéticos se demostraba una disminución de respuesta de la capacidad de secreción de insulina cuando la glucosa en sangre excedía de 8 mM. Se conserva el efecto cebador de la glucosa sobre la secreción de insulina. De este modo, las disfunción de las células \beta se presenta antes del comienzo de la hiperglucemia evidente en esta forma de MODY.

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El defecto en la secreción de insulina en los sujetos MODY3 no diabéticos difiere de la referida previamente en los sujetos MODY1 no diabéticos o MODY2 medianamente diabéticos.

Ejemplo 2 Mutaciones en HNF1\alpha Relacionadas con la Diabetes de Tipo MODY3 1. Materiales y Métodos Aislamiento de la Secuencia Parcial del gen HNF1\alpha Humano

El clon PAC, 254A7, que contenía el gen HNF1\alpha humano fue aislado de una genoteca (Genome Systems, St. Louis, MO) rastreando las reservas de ADN de PAC con PCR y los cebadores HNF1P1 (5'-TACACCACTCTGG
CAGCCACACT-3' SEC ID NUM: 10) y HNF1P2 (5'-CGGTGGGTACATTGGTGACAGAAC-3' SEC ID NUM: 11). Las secuencias de los exones y los intrones limítrofes fueron determinadas tras la subclonación de los fragmentos de 254A7 en pGEM-4Z (Promega Biotec, Madison, WI) o pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) y secuenciación utilizando cebadores basados en la secuencia del ADN HNF1\alpha humano (Bach y col., 1990; y Bach y Yaniv, 1993) y seleccionados utilizando la organización exón-intrón conservada de los genes de ratón y rata (Bach y col., 1992) como guía. La secuenciación se llevó a cabo utilizando un AmpliTaq FS Dye Terminator Cycle Sequening Kit (ABI, Foster City, CA) en un ABI Prism® 377 DNA Sequencer (ABI). Las secuencias de las uniones del exón 2/intrón 2, exón 3/intrón 3, intrón 6/exón 7, e intrón 8/exón 9/intrón 9 fueron determinadas secuenciando directamente los productos de la PCR generados mediante la amplificación de PAC 254A7 o del ADN genómico humano. La Fig. 11 muestra la secuencia de ADNc de HNF1\alpha.

Rastreo de las mutaciones del gen HNF1\alpha

Los diez exones e intrones limítrofes del gen HNF1\alpha de un sujeto afectado de las familias en las que de MODY3 cosegregaban los sujetos con los marcadores que abarcaban la región MODY3 del cromosoma 12 con la forma MODY3 de NIDDM fueron amplificados utilizando PCR y cebadores específicos (Tabla 6). Las condiciones de la PCR fueron desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, recocido a 62ºC durante 30 segundos (excepto para el exón 9 la temperatura de recocido fue de 60ºC) y extensión a 72ºC durante 45 segundos, y extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los productos de la PCR fueron purificados utilizando una membrana Centricon 100 (Amicon, Beverly, MA) y secuenciados desde ambos extremos utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 6, un AmpliTaq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit y un ABI Prism® 377 DNA Sequencer. La presencia de la mutación específica en otros miembros de la familia fue evaluada amplificando y secuenciando directamente el exón apropiado. También fueron rastreados de un modo similar al menos 40 sujetos blancos no Hispanos no diabéticos sanos no relacionados normales (80 cromosomas). Los polimorfismos del ADN identificados durante el curso del rastreo de las mutaciones en los pacientes fueron caracterizados mediante PCR y secuenciación directa o digestión mediante una endonucleasa de restricción apropiada y electroforesis en gel.

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2

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2. Resultados

En la Tabla 7 se identifican los polimorfismos del ADN identificados en la región codificadora del gen HNF1\alpha. Por supuesto estos son polimorfismos ejemplares y los expertos en la técnica serán capaces de emplear los métodos y las descripciones mostradas en la presente invención para identificar otros polimorfismos.

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TABLA 7 Polimorfismos de ADN identificados en la región codificadora del gen HNF1\alpha humano

Exón	Codón	Cambio de Nucleótido	Frecuencia
1	17	CTL(Leu) \rightarrow CTG(Leu)	C, 0,57; \hskip0,2cm G, 0,43
1	27	ATC(Ile) \rightarrow CTC(Leu)	A, 0,63; \hskip0,2cm C, 0,37
1	98	CCC(Ala) \rightarrow GTC(Val)	C, 0,98; \hskip0,2cm T, 0,02
4	279	GGG(Gly) \rightarrow GGC(Gly)	G, 0,69; \hskip0,2cm C, 0,31
7	459	ATC(Leu) \rightarrow TTG(Leu)	C, 0,63; \hskip0,2cm T, 0,37
7	487	AGC(Ser) \rightarrow AAC(Asn)	G, 0,68; \hskip0,2cm C, 0,32
8	515	ACG(Thr) \rightarrow ACA(Thr)	G, 0,79; \hskip0,2cm A, 0,21
Intrón 1	nt-91	A \rightarrow G	A, 0,88; \hskip0,2cm G, 0,12
Intrón 1	nt-42	G \rightarrow A	G, 0,66; \hskip0,2cm A, 0,34
Intrón 2	nt-51	T \rightarrow A	T, 0,85; \hskip0,2cm A, 0,15
Intrón 2	nt-23	C \rightarrow T	C, 0,88; \hskip0,2cm T, 0,12
Intrón 5	nt-47	C \rightarrow T	C, 0,99; \hskip0,2cm T, 0,01
Intrón 7	nt-7	G \rightarrow A	G, 0,57; \hskip0,2cm A, 0,43
Intrón 9	nt-44	C \rightarrow T	C, 0,96; \hskip0,2cm T, 0,04
Intrón 9	nt-24	T \rightarrow C	T, 0,59; \hskip0,2cm C, 0,41

En la Tabla 8 se muestra un resumen de las mutaciones identificadas en HNF1\alpha humano de pacientes con MODY3. Se identificaron dieciséis mutaciones ejemplares en el gen HNF1\alpha humano de pacientes con MODY3 pero no estuvieron presentes en individuos no afectados, entre estas mutaciones se incluyen desplazamientos de marco en los exones 1, 4, 6, y 9, codificación sin sentido en los exones 2 y 7 así como empalme anómalo en los intrones 5 y 9. Los resultados descritos aquí demuestran que las mutaciones en este factor de transcripción puede ocasionar diabetes mellitus y se ha prestado atención al papel del HNF1\alpha para determinar la función de las células \beta pancreáticas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

3. Discusión

El análisis de ligamiento localizó MODY3 en un intervalo de 10 cM del cromosoma 12 entre los marcadores D12S86 y D12S342 (Vaxillaire y col., 1995) y después en un intervalo de 5 cM entre los marcadores D12S86 y D12S807/D12S820 (Menzel, S. y col, 1995). Se generó un cóntigo de YAC, BAC y PAC combinados que abarcaban D12S86 y D12S807 (Fig. 9) utilizando la información de bases de datos públicas (Chemakov y col., 1995; Hudson y col. 1995) y rastreando las genotecas apropiadas (YAC y BAC, Research Genetics, Huntsville, Alabama; y PAC, Genome Systems, St. Louis, Missouri) con STS de la región MODY3. El mapa físico permitió la localización de nuevos polimorfismos a medida que fueron referidos así como generar nuevos marcadores para localizar adicionalmente eventos de recombinación en individuos clave. Tales estudios clarificaron la localización de MODY3 en el intervalo de 3 cM entre D12S1666 y el STS polimórfico UC-39. La hibridación cromosómica in situ con fluorescencia utilizando el BAC 162B15 cartografió el cóntigo de la banda cromosómica 12q24.2.

Esta combinación de información por cartografía genética y física fue utilizada para comenzar una búsqueda sistemática de MODY3. Utilizando una combinación de enfoques que incluía los genes de ensayo que se sabe que están en el brazo largo del cromosoma 12 para ver si estaban cartografiados en el cóntigo, la captura de exones (Church, y col., 1994), y la selección de ADNc (Kaplan y col., 1992) utilizando ADNc de islotes pancreáticos humanos (en estudios clínicos se demostró que la secreción de insulina era anómala en pacientes con MODY3, y en ese caso los islotes eran un sitio probable de expresión de ARNm y proteína de MODY3), los autores de la presente invención identificaron 14 genes que codificaban proteínas conocidas (subunidad g de la proteína quinasa activada con AMP, citrón, proteína rayo H de unión a GTP, paxilina, fosfoproteína PO ribosómica ácida, fosfolipasa pancreática A2, factor de empalme SRp30, subunidad VIa de la citocromo C oxidasa, acil CoA deshidrogenasa de cadena corta, HNF1\alpha, proteína interactiva con el receptor del tiroides (TRIP14), proteína quinasa dependiente de Ca^{2+}/calmodulina, purinoreceptor P_{2X4} y restina), 5 seudogenes (de tipo metalopanestimulina, de tipo proteína de unión a heparina de la superficie celular, de tipo proteína L12 ribosomal, de tipo nucleósidodifosfato quinasa y de tipo factor de ribosilación de ADP), 12 EST (yq81d09, yd50d03, IB383, hbc3028, yu36h05, yn75d09, yz51b06, yd88g07, ym03h09, ym30e05, WI-6178/c-01h06, WI-6239/c-04b12) y 9 genes desconocidos (Fig 9).

Estos genes estaban siendo secuenciados sistemáticamente en sujetos afectados y no afectados utilizando PCR anidada y transcripción ilegítima de ARN linfoblastoide (Kaplan y col., 1992), así como PCR de los exones individuales del gen. La comparación de las secuencias de los genes de la fosfolipasa pancreática A2, la subunidad g de la proteína quinasa activada con AMP, la rayo H, la subunidad VIA de la citocromo C oxidasa, la fosfoproteína PO ribosómica, la paxilina, el factorde empalme SRp30, la acil CoA deshidrogenasa de cadena corta, y los purinoceptores P_{2X4} de los pacientes y los controles revelaron algunos polimorfismos pero no mutaciones asociadas a MODY3.

El gen HNF-1\alpha fue localizado en el intervalo que contenía MODY3 utilizando PCR y cebadores específicos para el gen HNF-1\alpha (Fig. 9). Los ADNc de HNF-1\alpha también fueron aislados con una elevada frecuencia mediante selección del ADNc a partir del ADNc de islotes pancreáticos humanos utilizando PAC 254A7, un resultado coherente con el informe de Emens y col., (1992) demostró que HNF-1\alpha era expresado en células de insulinoma de hámster y funcionaba con un transactivador débil del gen I de insulina de rata. El gen HNF-1\alpha humano fue aislado y parcialmente secuenciado para proporcionar la organización exón-intrón y la secuencia de los intrones de los cuales podrían ser seleccionados los cebadores para la PCR. El gen humano constaba de 10 exones con los intrones 1-8 localizados en las mismas posiciones que los genes de rata y de ratón (Bach y col., 1992). El intrón 9 interrumpe el codón 590 (fase 1) y no está presente en los genes de rata y de ratón pero no existe en el gen de pollo (Hörlein y col., 1993) compatible con la pérdida de este intrón durante el período en el que los humanos y los roedores compartían su último antecesor común. La amplificación y la secuenciación directa del exón 4 del sujeto EA1 (genealogía Edimburgo, Fig. 5A) demostró una inserción de una C en el codón 289 (Pro) produciendo un desplazamiento del marco y la terminación prematura (denominada P289fsinsC) (Fig. 10). Esta mutación estaba presente en todos los miembros afectados y los miembros no afectados de esta familia. Tampoco se encontró al rastrear 55 sujetos de raza blanca no diabéticos sanos (110 cromosomas). Por tanto, se concluyó que el gen HNF-1\alpha es MODY3 y condujo a los autores de la invención a secuenciar el gen HNF-1\alpha en otras familias en las que NIDDM cosegregaba con los marcadores de la región MODY3.

Se encontraron quince mutaciones adicionales (Tabla 8), todas las cuales cosegregaban con NIDDM, y no se producían en ninguno de los al menos 50 sujetos de raza blanca no diabéticos sanos. No obstante, hubo individuos en algunas genealogías (genealogía GK, III-3; genealogía Ber, V-2; y genealogía P, IV-5 y IV-6) que habían heredado el cromosoma mutante (y el haplotipo de riesgo del cromosoma 12) pero no eran diabéticos o sólo mostraron evidencia de tolerancia a la glucosa debilitada o diabetes durante el embarazo. Estos individuos desarrollarán igualmente NIDDM en el futuro. Además, un sujeto con NIDDM no tenía el alelo mutante (genealogía Ber, II-2). Este fue diagnosticado de NIDDM a los 65 años de edad momento en el cual era medianamente obeso con un índice de masa corporal de 27 kg/m^{2} sugiriendo una diagnosis tardía de NIDDM de comienzo tardío en lugar de MODY. Semejante heterogeneidad en las familias con MODY había sido observada previamente (Bell y col., 1991; Vionnet 1992) y es debida a la elevada frecuencia de NIDDM de comienzo tardío que afecta al 10% o más de individuos con una edad de más de 65 años (Kenny y col., 1995). Además de las mutaciones enumeradas en la Tabla 8, se encontraron tres polimorfismos de aminoácidos (I/L27, A/V98 y S/N487), cuatro polimorfismos silenciosos (en los codones para L17, G288, L459 y T515) y siete polimorfismos en intrones en el gen HNF-1\alpha (Tablas 7 y 8).

Se identificaron dieciséis mutaciones diferentes en el gen HNF-1\alpha en pacientes con la forma MODY3 de diabetes. Se podrían pronosticar las mutaciones de empalme y de desplazamiento del marco para producir la expresión de una proteína truncada que tenga al menos los aminoácidos 1-290 de la proteína natural. Estas mutaciones sin sentido, R131Q y P447L, son de restos que se conservan en HNF-1\alpha de humano, rata, ratón, hámster, pollo, Xenopus y salmón y el factor de transcripción HNF-1\beta humano estructuralmente relacionado sugieren que estos restos son importantes funcionalmente.

El HNF-1\alpha es uno de un grupo de factores de transcripción expresados en el hígado que actúan juntos para conferir la expresión específica de tejidos de genes en este tejido (Tronche y col., 1992; Bach y col., 1990). También se ha encontrado en riñón, intestino, estómago y páncreas, incluyendo islotes de Langerhans, y a bajos niveles en el bazo y testículos sugiriendo que también juega un papel en la regulación de la transcripción en estos tejidos. El HNF-1\alpha está compuesto de tres dominios funcionales; un dominio de dimerización terminal NH_{2} (aminoácidos 1-32), un dominio de unión al ADN con unidades de tipo POU y de tipo homeodominio (aminoácidos 150-280) y un dominio de transactivación terminal COOH (aminoácidos 281-631). La forma funcional del HNF-1\alpha es un dímero y HNF-1\alpha puede formar homodímeros o heterodímeros con la proteína HNF-1\beta estructuralmente relacionada (Mendel y col., 1991).

Pontoglio y col (1996) han generado ratones que carecen de HNF-1\alpha. Los animales carentes de HNF-1\alpha homocigóticos fracasan al desarrollarse y usualmente mueren en torno al período de destete. También padecían fenilcetonuria y disfunción de los túbulos renales. No obstante, los ratones carentes de HNF-1\alpha homocigóticos no parecen ser diabéticos puesto que tienen niveles de glucosa en sangre normales y respuestas normales a una inyección intravenosa de bolo de glucosa. Se cree que la glucosuria masiva en estos animales puede haber enmascarado la presencia de diabetes mellitus. No se informó sobre las respuestas secretoras de los ratones carentes de HNF-1\alpha heterocigóticos, los animales que pueden ser los más similares a los sujetos humanos con mutaciones HNF-1\alpha y MODY. En vista de los presentes descubrimientos de que las mutaciones en el gen HNF-1\alpha ocasionan NIDDM de comienzo temprano, se indica una evaluación más detallada de la función de las células \beta y del hígado en ratones carentes de HNF-1\alpha.

El mecanismo por el cual las mutaciones en el gen HNF-1\alpha cuando están presentes en un solo alelo pueden ocasionar diabetes no está claro no obstante, es posible que la carencia parcial de HNF-1\alpha pudiera conducir a disfunción de las células \beta y diabetes. Alternativamente, las mutaciones en HNF-1\alpha pueden ocasionar diabetes mediante un mecanismo dominante negativo (Herskowitz, 1987) interfiriendo en la función de HNF-1\alpha de tipo salvaje y de otras proteínas que actúan en concierto con HNF-1\alpha para regular la transcripción en las células \beta y/o en el hígado. Todas las mutaciones en los genes HNF-1\alpha identificadas hasta la fecha podrían producir la síntesis de una proteína mutante deteriorada en la unión o transactivación pero no en la dimerización del ADN. Estas proteínas mutantes podrían formar dímeros no productivos con el producto del alelo normal de HNF-1\alpha u otras proteínas tales como HNF-1\beta y de ese modo deteriorar la función normal de HNF-1\alpha.

Los autores de la presente invención han demostrado previamente que la diabetes mellitus en la rata obesa diabética de Zucker, un modelo de obesidad y NIDDM en roedor, está asociada con el descenso de expresión de un gran número genes de células \beta incluyendo genes tales como el de la insulina cuya expresión está restringida a las células \beta así como otros con una distribución en los tejidos mucho más amplia (Tokuyama y col, 1995). En ese caso, se cree que es probable que la NIDDM sea un trastorno de la transcripción con defectos genéticos o adquiridos que afectan a proteínas clave que regulan la transcripción conduciendo a la disfunción de las células \beta y a diabetes.

Ejemplo 3 Mutaciones en HNF-4\alpha Relacionadas con la Diabetes de Tipo MODY1

El clon PAC, 114E13, 130B8, 207N8, que contiene el gen HNF-4\alpha humano fue aislado de una genoteca (Genome Systems, St. Louis, MO) rastreando reservas de ADN PAC con PCR y los cebadores HNF4P1 (5'-CACCTGGTGAT
CACGTGGTC-3' SEC ID NUM: 81) y HNF4P2 (5'-GTAAGGCTCAAGTCATCTCC-3' SEC ID NUM: 82). Las secuencias de los exones y de los intrones limítrofes fueron determinadas mediante secuenciación directa utilizando cebadores basados en la secuencia de ADNc de HNF-4\alpha humano (Chartier y col., 1994; Drewes y col., 1996) y seleccionados utilizando la organización exón-intrón conservada del ratón (Taraviras y col., 1994) como guía. La secuenciación se llevó a cabo utilizando un AmpliTaq FS Dye Terminator Cycle Sequening Kit (ABI, Foster City, CA) o un ABI Prism TM 377 DNA Sequencer (ABI).

Rastreo de las mutaciones en el gen HNF4\alpha

Los once exones y los intrones limítrofes del gen HNF4\alpha de un sujeto afectado de las familias en las que MODY cosegregaba con los marcadores que abarcaban la región MODY1 del cromosoma 20 de sujetos con la forma MODY1 de NIDDM fueron amplificados utilizando PCR y cebadores específicos (Tabla 9). Las condiciones para la PCR fueron desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, recocido a 60ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 seg, y extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los productos de la PCR fueron purificados utilizando una membrana Centricon 100 (Amicon, Beverly, MA) y secuenciados a partir de ambos extremos utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 9, un AmpliTaq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit y un ABI Prism® 377 DNA Sequencer. Se evaluó la presencia de mutación específica en otros miembros de la familia mediante restricción con endonucleasa de restricción Bta3 resultante de mutación y electroforesis en gel. También fueron rastreados de un modo similar al menos 100 sujetos de raza blanca no Hispanos no diabéticos sanos no relacionados (200 cromosomas normales). Los polimorfismos de ADN identificados en el curso del rastreo de mutaciones en los pacientes fueron caracterizados mediante PCR y secuenciación directa, o digestión con una endonucleasa de restricción apropiada y electroforesis en gel.

4

En la Tabla 10 se identifican los polimorfismos de ADN y las mutaciones identificadas en la región codificadora del gen HNF4\alpha. Por supuesto, estos son polimorfismos ejemplares y los expertos en la técnica serán capaces de emplear fácilmente los métodos y las descripciones mostrados en la presente invención para identificar otros polimorfismos. En la Fig. 7 se muestra un alineamiento de la secuencia de proteínas de HNF4\alpha de humanos con secuencias de humano-ratón, X. Laves y Drosophila. Los supuestos sitios de unión al ADN están subrayados y los supuestos sitios de unión al ligando están en negrita. Las secuencias de ADN para el exón 1, el exón 1b, el exón 2, el exón 3, el exón 4, el exón 5, el exón 6, el exón 7, el exón 8, el exón 9 y el exón 10 de HNF4\alpha se muestran en la Fig. 8A, la Fig. 8B, la Fig. 8C, la Fig. 8D, la Fig. 8E, la Fig. 8F, la Fig. 8G, la Fig. 8H, la Fig. 8I y en la SEC ID NUM: 34, la SEC ID NUM: 36, la SEC ID NUM: 38, SEC ID NUM: 40, la SEC ID NUM: 42, la SEC ID NUM: 44, SEC ID NUM: 46, la SEC ID NUM: 48, la SEC ID NUM: 50, SEC ID NUM: 52, y la SEC ID NUM: 54, respectivamente. Se contempla que las mutaciones en cualquiera de estos exones, o en las regiones intrónicas relacionadas entre ellos, de HNF4\alpha, producirán diabetes de tipo MODY1.

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TABLA 10 Polimorfismos y Mutaciones en el Gen HNF4\alpha Humano

Exón de	Cambio de	Frecuencia
Localización	Nucleótido
	Codón
4	130 ACT(Thr)-ATT(Ile)	C:T = 105:5 C-0,95, T-0,05
7	273 GAT(Asp)-GAC(Asp)	T:C = 169:1 T-0,004, C-0,006
7	268 GAG(Gln)-TAG(parada)	0/216 cromosomas de control

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La genealogía R-W, que incluye más de 360 miembros que abarcan 6 generaciones y 74 miembros con diabetes incluyendo aquellos con MODY, han sido estudiados en perspectiva desde 1958 (Fajans, 1989). Los miembros de esta familia son descendientes de hombres nacidos en Prusia del Este en 1809 y emigrados a Detroit, Michigan en 1861 con sus cuatro hijos, tres de los cuales eran diabéticos, y cinco hijas, una de las cuales era diabética (Fajans, 1989; Fajans y col., 1994). Estudios de ligamiento han demostrado que el gen responsable de MODY en esta familia, MODY1, está unido estrechamente a los marcadores en la banda cromosómica 20q12-q13.1 con una puntuación lod multipuntual >14 en aquellas ramas de la familia en las que segregaba MODY (Bell, y col., 1991; Bowden, y col., 1992; Irwin, y col., 1994). El análisis de los recombinantes clave en la genealogía R-W localizó MODY1 en un intervalo de 13 cM (\sim7 Mb) entre D20S169 y D20S176, un intervalo que también incluye el gen que codifica HNF-4 (Stoffel, M. y col., 1996). La demostración en los Ejemplos previos de que las mutaciones en el gen HNF-1\alpha son la causa de la forma MODY3 de la NIDDM movieron a los autores de la presente invención a rastrear las mutaciones en el gen HNF-4\alpha en la genealogía R-W.

El gen HNF-4\alpha humano consta de 11 exones estando localizados los intrones en las mismas posiciones que en el gen de ratón (Tavaviras, y col., 1994). El empalme alternativo genera una familia de ARNm de HNF-4\alpha, HNF-4 1, 2 y 4, los dos últimos de los cuales contienen insertos de 30 a 90 nucleótidos, respectivamente (Tavaviras, y col., 1994; Laine y col., 1994; Drewes, 1996). De estos, el ARNm de HNF-4 2 parece ser el transcrito más abundante en muchos tejidos. En contraste con un informe previo (Drewes y col., 1996), los estudios de los autores de la presente invención demuestran que el ARNm de HNF-4\alpha codifica una forma de HNF-4\alpha truncada y presumiblemente no funcional. La secuencia del exón 1B, el exón que codifica la inserción en el ARNm de HNF-4\alpha reveló una T adicional entre los nucleótidos 219 y 220 en ambos alelos de cinco individuos no relacionados (10 cromosomas) no presentes en la secuencia de ADNc (Drewes y col., 1996) lo que ocasiona un desplazamiento del marco y la generación de una proteína de 98 aminoácidos cuya función, si la tuviera, es desconocida. Los 11 exones del gen HNF-4\alpha de dos sujetos afectados, V-20 y 22, y uno no afectado, VI-9, de la genealogía R-W fueron amplificados y los productos de la PCR secuenciados directamente. Las secuencias fueron idénticas entre sí y a la del ADNc (Drewes y col., 1996; Laine y col., 1994)) excepto por una sustitución C\rightarrowT en el exón 4, codón 130 y en el exón 7, codón 268. La sustitución C\rightarrowT en el codón 130 produce una sustitución Thr(ACT)\rightarrowIle(ATT) y es un polimorfismo (T/I130) con una frecuencia del alelo Ile en un grupo de 55 sujetos de raza blanca no Hispanos no diabéticos no relacionados del 5%. La sustitución C\rightarrowT en el codón 268 produce una mutación sin sentido CAG (Gln)\rightarrowTAG(AM) (Q268X). La mutación sin sentido fue confirmada clonando y secuenciando los productos de la PCR derivados de ambos alelos. La mutación Q268X creó un sitio para la enzima Bfa I generando la digestión del alelo normal fragmentos de 281 y 34 pb, y del alelo mutante, de 152, 129 y 34 pb y facilitando el análisis de esta mutación en otros miembros de la genealogía R-W. En la genealogía R-W, la Ile130 y la mutación ámbar en el codón 268 estaban presentes en el mismo alelo.

La mutación Q268X cosegregaba con el haplotipo de riesgo y no se observaba NIDDM en la genealogía R-W al rastrear 108 sujetos de raza blanca no Hispanos no diabéticos sanos (216 cromosomas normales). Siete sujetos de la genealogía R-W que habían heredado el alelo mutante (V-18, 37 y 48; y VI-6, 11, 15 y 20) tenían tolerancia normal a la glucosa. Las edades de cinco de estos sujetos (V-48 y VI-6, 11, 15, y 20) era de menos de 25 años y en ese caso, todavía están en el intervalo de edad en el que la diabetes se desarrolla usualmente en los individuos de riesgo de esta familia. De los otros, el sujeto V-18 tiene 44 años de edad y ha mostrado tolerancia normal a la glucosa en todos los ensayos de tolerancia a la glucosa orales, y el sujeto V-37 que tiene 36 años de edad tenía un ensayo de tolerancia a la glucosa característico de tolerancia a la glucosa debilitada y uno de diabetes a los 16-17 años de edad pero pasados los 19 años cada ensayo de tolerancia a la glucosa había sido normal incluso aunque ella tuviera una respuesta de insulina baja a la glucosa administrada oralmente. Ella es muy delgada y activa, y tiene sensibilidad incrementada a la insulina durante el ensayo de tolerancia a la glucosa intravenosa con toma de muestras frecuente. Durante una infusión de glucosa a dosis baja prolongada, ella se volvió notablemente hiperglucémica (Herman, y col., 1994; Byrne, y col., 1995). Dos sujetos (V-1 y 4) que tienen la mutación fueron considerados no diabéticos basándose en el historial médico y se necesita evaluar su estado de afección mediante el ensayo de tolerancia oral a la glucosa. Los resultados indican que la mutación sin sentido en el gen HNF-4 en la genealogía R-W es altamente pero no completamente penetrante aunque la edad de comienzo de la diabetes sea variable.

Además de los sujetos que heredaban la mutación Q268X pero que en la actualidad no son diabéticos, existen sujetos en la genealogía R-W que tienen NIDDM pero no heredan la mutación Q268X o un haplotipo de riesgo. El sujeto IV-9 fue diagnosticado de NIDDM a los 48 años de edad y era hiperinsulinémico, una diagnosis coherente con la NIDDM de comienzo tardío en lugar de MODY. Los autores de la presente invención también sometieron a ensayo a sus seis hijos, uno de los cuales tenía NIDDM y otro tolerancia a la glucosa debilitada, y todos tenían dos alelos normales. De un modo similar, también se sometieron a ensayo 10 hijos del sujeto III-7, cinco de los cuales tenían NIDDM, y ninguno había heredado la mutación Q268X, sugiriendo que la NIDDM de esta rama de la familia R-W tiene una etiología diferente. Finalmente, los cinco hijos no diabéticos de III-11 también fueron sometidos a ensayo y todos fueron normales. Ya había sido advertida previamente la presencia tanto de MODY como de NIDDM de comienzo tardío en la familia R-W (Bell, y col., 1991; Bowden, y col., 1992). El fenotipo MODY resulta de una mutación en el gen HNF-4. La causa o causas de la NIDDM de comienzo tardío son desconocidas.

HNF-4 es un miembro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroides/tiroideas y es expresados a los niveles más altos en el hígado, el riñón y el intestino (Xanthopoulos y col., 1991; Sladek y col., 1990). También es expresado en los islotes pancreáticos y las células de insulinoma (Miquerol, y col., 1994). En el hígado, HNF-4\alpha es un regulador clave de la expresión génica hepática y es un activador principal de HNF-1\alpha que a su vez activa la expresión de un gran número de genes específicos del hígado incluyendo aquellos implicados en el metabolismo de la glucosa, el colesterol y los ácidos grasos (Sladek y col., 1990; Kuo y col., 1992). Su expresión en riñón, intestino e islotes pancreáticos implica que también juega un papel central en la regulación específica de los tejidos de la expresión génica en estos tejidos, aunque su función específica en tejidos no hepáticos no ha sido estudiada. La pérdida homocigótica de la proteína HNF-4\alpha funcional ocasiona mortalidad embriónica caracterizada por defectos en la gastrulación subrayando el papel clave jugado por este factor de transcripción en el desarrollo y la diferenciación (Chen y col., 1994). No se describió el fenotipo de los animales heterocigóticos y son necesarios estudios adicionales para determinar si representan un modelo en ratón de MODY.

HNF-4\alpha define una subclase de receptores nucleares que residen primordialmente en el núcleo y se unen a su sitio de reconocimiento y regulan la transcripción en forma de homodímeros (Sladek y col., 1994; Kuo y col., 1992). El papel clave jugado por HNF-4\alpha en la regulación de la expresión génica hepática es bien conocido (Sladek y col., 1994; Kuo y col., 1992). No obstante, su papel así como el de HNF-1\alpha, el producto de MODY3 y una diana de la acción de HNF-4\alpha aguas abajo, en la regulación de la expresión génica de las células \beta pancreáticas secretoras de insulina es desconocido en gran parte, aunque Emens y col. (1992) han demostrado que HNF-1\alpha es un transactivador débil del gen de la insulina. Así, el mecanismo por medio del cual las mutaciones en HNF-4\alpha producen una forma dominante autosómica de NIDDM caracterizada por la disfunción de las células pancreáticas no está claro. Se pronostica que la mutación sin sentido en HNF-4\alpha encontrada en la familia R-W produce la síntesis de una proteína de 267 aminoácidos con un dominio de unión al ADN intacto. No obstante, está perdiendo las regiones implicadas en la dimerización y la activación transcripcional en otros miembros de la superfamilia de hormonas esteroides/tiroideas, Zhang, y col., 1994; Bourget, y col., 1995; Renaud, y col., 1995; Wagner, R.L. y col., 1995) y como consecuencia se pronostica que es incapaz de dimerizarse, unirse a su sitio de reconocimiento y activar la transcripción. De este modo, la herencia dominante es debida a una reducción de la cantidad de HNF-4\alpha per se en lugar de un mecanismo negativo dominante. Parece que los niveles decrecientes de HNF-4\alpha funcional tienen un efecto crítico sobre la función de las células \beta quizás como consecuencia de la disminución de la expresión génica de HNF-1\alpha, conduciendo también las mutaciones en este gen a MODY como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Los sujetos prediabéticos con mutaciones en cualquiera de los genes HNF-4\alpha o HNF-1\alpha manifiestan anomalías similares en la secreción de insulina estimulada por glucosa con tasas de secreción de insulina normales a concentraciones de glucosa más bajas pero superiores a las tasas normales a medida que aumenta la concentración de glucosa (Byrne y col., 1995), un resultado compatible con que HNF-4\alpha y HNF-1\alpha afecten a una ruta común de las células \beta pancreáticas. La ausencia de disfunción hepática, gastrointestinal o renal evidente en miembros afectados de la genealogía R-W sugiere que los niveles de HNF-4\alpha en estos tejidos, si bien posiblemente inferiores a los normales, son suficientes para asegurar la función normal o que las rutas alternativas son suficientes para la expresión de genes clave. No obstante, no se han realizado estudios detallados sobre la producción y el metabolismo de la glucosa hepática en sujetos de la genealogía R-W y es posible que puedan estar presentes alteraciones sutiles en estos procedimientos.

La demostración de que MODY puede resultar de mutaciones en los genes HNF-1\alpha y HNF-4\alpha sugiere que esta forma de NIDDM es primordialmente una alteración de la expresión génica anómala. Con respecto a esto, los genes que codifican otras proteínas en la cascada reguladora de HNF-1\alpha/HNF-4\alpha tales como otros miembros de las familias HNF-1 (Mendel y col., 1994) y HNF-4 (Drewes y col., 1996) así como HNF-3 (Lai y col., 1993), HNF-6 (Lemaigre, y col., 1996).), y quizás el cofactor de dimerización de HNF-1 (Mendel y col., 1991) deben ser considerados candidatos para otras formas de MODY y/o NIDDM de comienzo tardío. El papel de HNF-4\alpha en el desarrollo de la NIDDM de comienzo tardío más común es desconocido. No existe evidencia del ligamiento de los marcadores que flanquean el gen HNF-4\alpha con la NIDDM de comienzo tardío en Americanos Mejicanos o Japoneses implicando que es improbable que las mutaciones en el gen HNF-4\alpha sean un factor genético significativo que contribuya al desarrollo de la NIDDM de comienzo tardío. No obstante, los defectos adquiridos en la expresión de HNF-4\alpha pueden contribuir, al menos en parte, a la disfunción de las células \beta que caracteriza a la NIDDM de comienzo tardío (Polonsky y col., 1996) especialmente si juega un papel central en la regulación de la expresión génica en las células \beta pancreáticas como es sugerido por su asociación con MODY. Además, la similitud entre HNF-4\alpha y los factores de transcripción dependientes de los ligandos aumentan la posibilidad de que HNF-4\alpha y los genes que regula respondan a un ligando no identificado. La identificación de semejante ligando mediante los métodos de la presente invención conducirá a nuevos enfoques para tratar la diabetes.

Ejemplo 4 Organización y Secuencia Parcial del Gen HNF-4\alpha/MODY1 e Identificación de la Mutación de Cambio de Sentido, R127W, en una Familia Japonesa con MODY

HNF-4\alpha es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares, una clase de factores de transcripción activados por ligandos. Se ha encontrado recientemente una mutación sin sentido en un gen que codifica este factor de transcripción en una familia de raza blanca con una forma de diabetes que comienza en la madurez de los jóvenes, MODY1. En el presente ejemplo, los autores de la presente invención informan sobre la organización exón-intrón y la secuencia parcial del gen HNF-4\alpha humano. Además, los autores de la presente invención han rastreado los doce exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima en cuanto las mutaciones en un grupo de 57 sujetos Japoneses no relacionados con NIDDM de comienzo temprano/MODY de origen desconocido. Se observaron ocho sustituciones de nucleótidos, de las cuales una produjo la mutación de un resto arginina conservado, Arg127(CGG)\rightarrowTrp(TGG) (denominada R127W), localizada en la caja T, una región de la proteína que puede jugar un papel en la dimerización de HNF-4\alpha y la unión al ADN. Esta mutación no fue encontrada en 214 sujetos no diabéticos no relacionados (53 Japoneses, 53 Chinos, 51 blancos y 57 Afroamericanos). La mutación R127W estuvo presente únicamente en tres de los cinco miembros diabéticos de esta familia indicando que no es la única causa de diabetes en esta familia. Las siete sustituciones nucleotídicas restantes fueron localizadas en la región promotora proximal y en los intrones. No se pronostica que afecten a la transcripción del gen o a la maduración del ARNm y representan polimorfismos y variantes raras. Los resultados sugieren que las mutaciones en el gen HNF-4\alpha pueden ocasionar NIDDM de comienzo temprano/MODY en Japoneses pero son menos comunes que las mutaciones en el gen HNF-1\alpha/MODY3. La información de la secuencia del gen HNF-4\alpha y de su región promotora facilitará la búsqueda de mutaciones en otras poblaciones y los estudios del papel de este gen para determinar la función normal de las células \beta pancreáticas.

1. Métodos Aislamiento y secuencia parcial del gen HNF-4\alpha humano

Se aislaron tres clones de cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC), 114E3, 130B8 y 207N8, que contienen el gen HNF-4\alpha humano rastreando las reservas de ADN PAC (Genome System, St. Louis, MO) mediante PCR® con cebadores específicos de HNF-4\alpha (Yamagata y col., 1996a). La secuencia parcial del gen HNF-4\alpha fue determinada utilizando ADN de los PAC 114E13 y 207N8 y cebadores de secuencia específica con un AmpliTaq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit y un ABI Prism® 377 DNA Sequencer (ABI, Foster City, CA). Se examinaron los sitios de unión al factor de transcripción de la secuencia promotora utilizando MatInspector (Quandt y col., 1995) y TFSEARCH (Versión 1.3 http//www.genome.ad.gp/kit/tfsearch.html). Las secuencias de los ARNm empalmados alternativamente fueron confirmadas mediante secuenciación de productos de la PCR® generados mediante amplificación de ADNc de hígado humano utilizando cebadores específicos.

Rastreo de las mutaciones en el gen HNF4\alpha

Se rastrearon las mutaciones en los doce exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima amplificando y secuenciando directamente ambas hebras del producto de la PCR® utilizando cebadores específicos (las secuencias de los cebadores están disponibles en www.diabetes.org/diabetes). La secuencia de la mutación de cambio de sentido (R127W) fue confirmada clonando el producto de la PCR® en pGEM-T (Promega, Madison, WI) y representando los clones de la secuenciación ambos alelos. La mutación R127W conduce a la pérdida del un sitio Msp I y se evaluó en los sujetos la presencia de esta mutación mediante digestión del producto de la PCR® del exón 4 con Msp I, separación de los fragmentos mediante electroforesis en un gel de agarosa NuSieve® 3:1 al 3% (FMC BioProducts, Rockland, ME) y visualización mediante tinción con bromuro de etidio. Las secuencias de los polimorfismos de ADN están basadas en la secuenciación de ambas hebras del producto de la PCR® y no fueron confirmadas directamente clonando y secuenciando el producto de la PCR®.

Sujetos

La población del estudio constaba de 57 sujetos Japoneses no relacionados asistidos en la Diabetes Clinic, Tokyo Women's Medical College que fueron diagnosticados de NIDDM antes de los 25 años de edad y/o que eran miembros de familias en los que la NIDDM estaba presente en tres o más generaciones: edad a la diagnosis, 20,1 \pm 7,5 años (media \pm EE); varones/mujeres, 31/26; y tratamiento, insulina - 36, agentes hipoglucémicos orales - 10, y dieta - 11.
Treinta y dos de los sujetos cumplían criterios estrictos para una diagnosis de MODY (esto es, NIDDM en al menos tres generaciones con transmisión autosómica dominante y diagnosis antes de los 25 años de edad en al menos un sujeto afectado). La NIDDM fue diagnosticada utilizando los criterios de la Organización Mundial de la Salud (Bennet y col., 1994). En el momento del reclutamiento, se obtuvo el permiso por escrito de cada sujeto y se tomó una muestra de sangre para el aislamiento del ADN. Se sometieron a ensayo 53 sujetos Japoneses no diabéticos no relacionados en cuanto a cada sustitución de nucleótidos y mutación para determinar si el cambio de la secuencia era un polimorfismo o una mutación asociada a la enfermedad. Además, se sometieron a ensayo 53 sujetos Chinos (15), 51 blancos (16), y 57 Afroamericanos no diabéticos no relacionados (16) en cuanto a la mutación R127W.

2. Resultados

Organización y secuencia parcial del gen HNF-4\alpha humano. El gen HNF-4\alpha humano (símbolo del gen, TCF14) consta de 12 exones que abarcan aproximadamente 30 kb, de las cuales fueron secuenciadas aproximadamente 10 kb incluyendo 1 kb de la región promotora (la secuencia génica está disponible en www.diabetes.org/diabetes). El ARNm de HNF-4\alpha humano es empalmado alternativamente (Hata y col., 1992; Chartier y col., 1994; Drewes y col., 1996; Kritis y col., 1996) lo que puede generar tantas como seis formas diferentes de HNF-4\alpha (Fig. 12). HNF-4\alpha2 es la forma predominante presente en muchos tejidos adultos incluyendo el hígado, el riñón y el intestino. Los autores de la presente invención han utilizado RT-PCR® para determinar qué transcritos de HNF-4\alpha son expresados en los islotes pancreáticos humanos. Este análisis demostró que los islotes expresan los ARNm de HNF-4\alpha1, 2 y 3. Los autores de la presente invención no pudieron detectar transcritos de los islotes que incluían los exones 1C y 1B aunque los transcritos que contenían estos dos exones pudieron ser detectados en el hígado humano mediante RT-PCR®.

Se determinó la secuencia de 1 kb de la región promotora del gen HNF-4\alpha humano (Fig. 13). La comparación de las secuencias de los genes humano y de ratón mostraron regiones de conservación de la secuencia que incluían los sitios de inicio de la transcripción y de unión pronosticados para diversos factores de transcripción incluyendo HNF-6, AP-1, HNF-3, HNF-1\alpha y NF-1. El sitio de inicio de la transcripción para el gen humano no ha sido determinado directamente pero ha sido inferido de estudios del gen de ratón que mostraba múltiples sitios de inicio diseminados a lo largo de un intervalo de 10 pb (Zhong y col., 1994; Tavaviras y col., 1994) de los cuales uno fue definido como nucleótido + 1 (Zhong y col., 1994). La homología de la secuencia en el promotor de los genes humano y de ratón sugiere que la transcripción del gen HNF-4\alpha puede ser regulada de una manera similar. Con respecto a esto, Zhong y col., (Zhong y col., 1994) han demostrado que la actividad promotora principal en una línea celular de hepatoma estaba asociada con un fragmento de 126 pb del promotor de ratón (nucleótidos 289-414 en la Fig. 13). Existe una identidad del 83% entre las secuencias humanas y de ratón en esta región promotora mínima.

Mutaciones y polimorfismos en el gen HNF-4\alpha. Las mutaciones en los doce exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima fueron rastreadas en 57 sujetos Japoneses no relacionados con NIDDM de comienzo temprano/MODY. Este análisis reveló una supuesta mutación (Fig. 14) y siete polimorfismos de ADN/variantes (Tabla 11). La supuesta mutación en el exón 4 en el codón 127, CGG(Arg)\rightarrowTGG(Trp)(R127W) altera un aminoácido conservado que está localizado en la caja T, una región implicada en la dimerización del receptor y la unión al ADN (Lee y col., 1993; Rastinejad y col., 1995; Gronemeyer y Moras, 1995; Jiang y Sladek y col., 1997). La sustitución C\rightarrowT en el codón 127 produce la pérdida de un sitio para la enzima Msp I y la digestión de los alelos normales genera fragmentos de 104, 91, y 76 pb, con lo que el alelo mutante genera fragmentos de 104 y 167 pb. El análisis mediante PCR®\cdotRFLP demostró que la mutación R127W no estaba presente en ninguno de los 214 sujetos no diabéticos no relacionados de los diferentes grupos étnicos (53 Japoneses, 53 Chinos, 51 blancos y 57 Afroamericanos).

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La mutación R127W estaba presente en tres de los cinco miembros diabéticos de la familia J2-21, una familia MODY caracterizada por complicaciones microvasculares graves (Iwasaki y col., 1988) (Fig. 15). Además, el sujeto II-2 puede ser portador puesto que tiene hijos con genotipos tanto homocigóticos como heterocigóticos. La edad en el momento de la diagnosis de la diabetes en dos de los cuatro sujetos con la mutación R127W era de <25 años (sujeto II-2, 16 años, y sujeto III-4, 17 años). Uno de los sujetos con la mutación R127W fue diagnosticado de diabetes a los 90 años de edad indicando la penetrancia variable del alelo mutante. Otro sujeto, el hijo de 12 años del sujeto III-4, ha heredado el alelo mutante pero no es diabético. No obstante, todavía no ha alcanzado la edad de riesgo y puede desarrollar diabetes en el futuro. Hay dos sujetos con diabetes en la familia J2-21 que no heredan el alelo de riesgo (sujetos III-3 y -6). Semejante heterogeneidad etiológica ha sido observada previamente (Bell y col., 1991).

Los siete polimorfismos de ADN/variantes se localizaron en la región promotora y en los intrones (Tabla 11, Fig. 13). En el sujeto J2-96 (Fig. 15), había una sustitución G\rightarrowA en el nucleótido 922 en la región promotora proximal que cambia la secuencia humana de manera que se parece más fielmente a la secuencia del gen de ratón (Fig. 13). Esta sustitución no se encontró al rastrear 53 sujetos no diabéticos. Puesto que esta sustitución no altera un resto conservado o interrumpe el sitio de unión para uno de los factores que se pronostica que regulan la transcripción del gen HNF-4\alpha, los autores de la presente invención creen que es una variante rara en lugar de una mutación asociada con la diabetes. No obstante, son necesarios estudios adicionales para distinguir entre estas dos posibilidades.

Las seis sustituciones encontradas en los intrones (Tabla 11) no interrumpen los dinucleótidos GT y AG conservados de los sitios donador y aceptor de empalme, respectivamente, y en ese caso es improbable que afecten al empalme. Las sustituciones en los nucleótidos 1486, 2420, 3142 y 3175 fueron encontradas en sujetos Japoneses tanto diabéticos como no diabéticos indicando que existen polimorfismos en lugar de mutaciones asociadas con la diabetes. Las sustituciones en los nucleótidos 1364 y 2218 fueron encontradas únicamente en dos sujetos diferentes no relacionados con NIDDM de comienzo temprano/MODY. Los autores de la presente invención creen que estas son variantes raras en lugar de mutaciones asociadas con la diabetes puesto que no están próximas a los sitios donador o aceptor de empalme sino que en su lugar están en la porción central del intrón.

Ejemplo 5 Función Hepática en una Familia con una Mutación Sin Sentido (R154X) en el Gen HNF-4\alpha/MODY1

La MODY es un trastorno monogénico genéticamente heterogéneo caracterizado por herencia dominante autosómica, comienzo usualmente antes de los 25 años de edad y función anómala de las células \beta pancreáticas. Las mutaciones en los genes del factor nuclear de hepatocitos (HNF)-4\alpha/MODY1, glucoquinasa/MODY2 y HNF-1\alpha/MODY3 pueden ocasionar esta forma de diabetes. En contraste con los genes de la glucoquinasa y HNF-1\alpha, las mutaciones en el gel HNF-4\alpha son una causa relativamente poco común de MODY y la comprensión por los autores de la presente invención de la forma MODY1 de diabetes está basada en estudios de una sola familia, la genealogía R-W. Aquí los autores de la presente invención informan sobre la identificación de otra familia con MODY1 y la primera en la que ha habido una caracterización detallada de la función hepática. Los miembros afectados de esta familia, Dresden-11 han heredado una mutación sin sentido, R154X en el gen HNF-4\alpha y se ha pronosticado que tienen niveles reducidos de este factor de transcripción en los tejidos en los que es expresado incluyendo los islotes pancreáticos, el hígado, el riñón y el intestino. Los sujetos con la mutación R154X manifestaban una disminución de la respuesta secretora de insulina a la glucosa oral. HNF-4\alpha juega un papel central en la regulación específica de tejido de la expresión génica en el hígado incluyendo el control de la síntesis de proteínas implicada en el metabolismo del colesterol y las lipoproteínas y la cascada de la coagulación. No obstante, los sujetos con la mutación R154X no mostraron anomalías en el metabolismo de lípidos o en la coagulación excepto por un incremento paradójico de 3,3 veces en los niveles de lipoproteína(a) en suero. No existe ninguna evidencia de disfunción renal en estos sujetos. Los resultados sugieren que MODY1 es primordialmente un trastorno de la función de las células \beta.

1. Métodos Sujetos

La población del estudio constaba de miembros de dos familias no relacionadas con NIDDM de comienzo temprano determinados a través del Department of Internal Medicine III, University Clinic Carl Gustav Carus of the Technical University, Dresden, Germany. Las familias fueron seleccionadas basándose en la presencia de diabetes mellitus no dependiente de insulina (tipo 2) NIDDM en dos o más generaciones con diagnosis antes de los 35 años de edad al menos en un sujeto. Estuvieron disponibles suficientes datos familiares para sugerir una diagnosis de MODY en nueve de estas familias (es decir, NIDDM en tres generaciones con herencia dominante autosómica y comienzo antes de los 25 años de edad al menos en un sujeto afectado) (Fajans y col., 1994). Las tres familias restantes fueron clasificadas por tener NIDDM de comienzo temprano. La edad media en el momento de la diagnosis de la diabetes en los miembros afectados de estas doce familias fue de 29,9 \pm 2,8 años (intervalo, 14-60 años) (media \pm EEM) e incluía 18 hombres y 13 mujeres de los cuales 12, 12 y 7 estaban siendo tratados con insulina, agentes hipoglucémicos orales y dieta, respectivamente. En el momento del reclutamiento, se obtuvo el permiso por escrito de cada sujeto y se obtuvieron muestras de sangre y de orina para el aislamiento del ADN y el análisis clínico.

Rastreo de las mutaciones del gen HNF-4\alpha

Se rastrearon las mutaciones de la región promotora mínima (nucleótidos -21 a -459) (Zhong y col., 1994) y 10 exones que codifican la forma HNF-4\alpha (Drewes y col., 1996) de HNF-4\alpha mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR®) y secuenciación directa de ambas hebras del producto de la PCR® amplificado como se ha descrito previamente (Yamagata y col., 1996). Los cambios en la secuencia fueron confirmados clonando el producto de la PCR® en pGEM-4Z (Promega, Madison, WI) y los clones de la secuenciación derivados de ambos alelos. Las secuencias de los cebadores para la amplificación y la secuenciación de la región promotora mínima son P1, 5'-CAAGGATCCAGAAGATTGGC-3' (SEC ID NUM: 120), y P2, 5'-CGTCCTCTGGGAAGATCTGC-3' (SEC ID NUM: 121); el tamaño del producto de la PCR® es de 479 pb. La secuencia del promotor del gen HNF-4\alpha humano ha sido consignada en la base de datos GenBank con el número de acceso U72959.

Análisis de Ligamiento

Se realizo el tipaje de los miembros de la familia con los marcadores D20S43, D20S89, D20S96, D20S119, D20S169 y D20S424, todos los cuales estaban ligados estrechamente al gen HNF-4\alpha (Stoffel y col., 1996). Se llevaron a cabo los ensayos de ligamiento utilizando el haplotipo formado a partir de estos marcadores y suponiendo una frecuencia de recombinación entre marcadores adyacentes de 0,001 con el programa de ordenador ILINK (Lathrop y col., 1984; Lathrop y Lalouel, 1984). Las frecuencias de los haplotipos fueron estimadas a partir de los datos. El análisis adoptó una frecuencia alélica para la enfermedad de 0,001 y dos clases de riesgo. En la clase de riesgo 1 se incluyeron los individuos que tenían 25 años de edad con penetrancias de 0,00, 0,95 y 0,95 para el homocigoto normal, el heterocigoto y el homocigoto susceptible, respectivamente. La clase de riesgo 2 incluía individuos que tenían <25 años de edad con penetrancias de 0,00, 0,60 y 0,95 para el homocigoto normal, el heterocigoto y el homocigoto susceptible, respectivamente. El estado de afección del sujeto uno con tolerancia a la glucosa debilitada fue codificado a medida que resultaba afectado. La puntuación lod máxima esperada (ELOD) fue determinada utilizando el programa de ordenador (Ott, 1989; Weeks y col., 1990).

Estudios Clínicos

Se impuso un ensayo de tolerancia a 75 g de glucosa oral normalizado a sujetos tras 12 horas de ayuno durante la noche. El tratamiento con insulina y agentes hipoglucémicos orales se interrumpió durante 12 h y 24 horas, respectivamente, antes del ensayo. Se tomaron muestras de sangre para la glucosa, insulina, péptido C y proinsulina a los 0, 30, 60, 90 y 120 minutos. También se tomaron muestras de sangre en ayunas para la medición de la insulina, anticuerpos de las células de los islotes y ácido glutámico descarboxilasa (GAD), hemoglobina glucosilada (HbA_{lc}), lipoproteína(a), apolipoproteínas AI, AII, B, CII, CIII, y E, colesterol (total y VLDL, LDL, HDL, HDL2 y HDL3), triglicéridos (totales y VLDL y LDL+HDL), tiempo de coagulación (ensayo QUICK) y tiempo de tromboplastina parcial (PTT), fibrinógeno, antígeno de factor de von Willebrand (vWFr:Ag), inhibidor del activador de plasminógeno-1 (PAI-1), activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA), alanina aminotransferasa, \gamma-glutamil transferasa, bilirrubina, albúmina, proteína total, hemoglobina, creatinina, urea, amilasa, lipasa y ácido úrico. Se tomó una muestra de orina (de una recogida de orina de 24 horas) para las mediciones de la creatinina y la microalbúmina.

Análisis

Se midió la glucosa en sangre con el método de la hexoquinasa (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania), la insulina y el péptido C en plasma mediante radioinmunoanálisis (DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim, Alemania; y C peptide Diagnostic Systems Laboratories, Sinsheim, Alemania, respectivamente), proinsulina en plasma mediante ELISA (DRG Instruments, Marburg, Alemania), HbA_{Ic} mediante HPLC (DIAMAT Analyzer, Bio-Rad, Munich, Germany), fibrinógeno mediante el método Clauss (Fibrinogen A Kit, Boehringer-Mannheim), PAI-1 mediante bioinmunoanálisis y ELISA (TC® Actibind PAI-1 ELISA, Technoclone/Immuno GmbH Deutchland, Heidelberg, Alemania), tPA mediante ELISA (TintElize® tPA, Biopool AB, Ume\ring{a}, Suecia), vWFr:Ag enzimáticamente (ELISA Asserachrom® vWF, Boehringer-Mannheim), insulina y GAD-Ab mediante ELISA y radioinmunoanálisis (Elias, Freiburg, Alemania), Ab de las células de los islotes mediante un análisis de inmunofluorescencia (utilizando una muestra positiva de EUROIMMUN Ummunologie GmbH, Grönau, Alemania), la coagulación y el tiempo de tromboplastina parcial mediante el AMAX Analyzer (Munich, Alemania). El colesterol total, el colesterol en VLDL, HDL, LDL+HDL, y HDL3 fue medido mediante CHOD-PAP, los triglicéridos totales y triglicéridos en VLDL y LDL+HDL mediante el método GPO-PAP utilizando el Ciba Corning 550 Express Clinical Chemistry Analyzer (Boehringer-Mannheim). El colesterol HDL2 fue calculado utilizando la fórmula HDL2=HDL-HDL3. Las muestras para la medición del colesterol, los triglicéridos en VLDL, HDL, LDL+HDL fueron preparadas mediante ultracentrifugación preparativa utilizando una Beckman Optima tabletop TLX ultracentrifuge con un rotor TLA-120.2. La creatinina, la urea, el ácido úrico, las proteínas totales, la alanina aminotransferasa, la \gamma-glutamil transferasa, la bilirrubina, la amilasa en suero y la creatinina en orina fueron medidos utilizando el BM Hitachi 717 Chemistry Analyzer (Boehringer Mannheim). La lipasa fue medida utilizando el Monarch System (Sigma Germany, Munich, Alemania). las apolipoproteínas AI, AII y B y la microalbúmina de la orina fueron medidas utilizando el Behring-Nephelometer BN II (Behringwerke, Marburg, Alemania). Las apolipoproteínas CIII y E fueron medidas utilizando el Sebia System (Fulda, Germany), apolipoproteína CII utilizando el RID System (Wak, Bad Homburg, Alemania).

2. Resultados Identificación de una mutación sin sentido en el gen HNF-4\alpha

Se determinaron doce familias con NIDDM de comienzo temprano/MODY para estudios genéticos de MODY en sujetos con antepasados Alemanes. Las mutaciones en el gen HNF-1\alpha/MODY3 (Yamagata y col., 1996) fueron encontradas en tres de estas familias (Kaisaki y col., 1997). Se rastrearon las mutaciones en el gen HNF-4\alpha en un sujeto afectado de las nueve familias restantes. Existía una sustitución C\rightarrowT en el codón 154 del exón 4 en el probando (II-4) de la familia Dresden-11 (Fig. 16) que generaba una mutación sin sentido CGA(Arg)\rightarrowTGA(OP) (R154C, Fig. 17). La mutación R154X podría producir la síntesis de una proteína truncada de 153 aminoácidos con un dominio de unión al ADN intacto pero careciendo del dominio de unión al ligando y de transactivación (Sladek y col., 1990). Además de esta mutación, existía una mutación silenciosa C\rightarrowT en el codón para Ala58 (GCC/GCT) en un sujeto que no cosegregaba con MODY/NIDDM de comienzo temprano.

La presencia de la mutación R154X en otros miembros de la familia Dresden-11 fue determinada mediante amplificación PCR® y secuenciación directa del exón 4. La mutación R154X cosegregaba con MODY en la familia Dresden-11 (Fig. 16). Todos los individuos diabéticos tenían la mutación R154X como la tenía un varón (III-2) de 14 años de edad con tolerancia a la glucosa debilitada. El haplotipo de riesgo demostró cierta evidencia de ligamiento con MODY con una puntuación lod de 1,20 a una recombinación de 0,00 (la puntuación lod máxima esperada en esta genealogía es de 1,20).

Edad en el Momento de la Diagnosis

Tres sujetos fueron diagnosticados de NIDDM entre 15-25 años de edad y otros dos a 28 y 44 años (Fig. 16). El sujeto I-1, diagnosticado de diabetes a los 44 años de edad tenía retinopatía proliferativa en el momento de la diagnosis sugiriendo que el comienzo de la diabetes había sido muchos años antes.

Severidad Clínica de la Diabetes

La diabetes en la familia Dresden-11 era severa y todos los sujetos diabéticos fueron tratados con insulina o con agentes hipoglucémicos orales. Los sujetos con diabetes de larga duración (v.g., I-1, II-4) tenían complicaciones diabéticas incluyendo retinopatía proliferativa, enfermedades macrovasculares (enfermedades cardiacas coronarias) y polineuropatía periférica. Sorprendentemente, ninguno de los sujetos con la mutación R154X tenía evidencia de nefropatía. Así, el fenotipo diabético de la familia Dresden-11 es muy similar al observado en la genealogía R-W (Fajans y col., 1994). Ninguno de los sujetos de la familia Dresden-11 fueron positivos para los anticuerpos de los islotes, insulina o GAD.

Respuesta Secretora Insulínica

Estudios previos han demostrado que sujetos prediabéticos con una mutación en HNF-4\alpha manifiestan un defecto característico en el patrón normal de secreción de insulina estimulada por glucosa así como anomalías en otras medidas de la función de las células \beta normales (Herman y col., 1994; Byrne y col., 1995). Los estudios de OGTT demostraron una profunda reducción de la secreción de insulina acompañada de la disminución de los niveles de péptido C y proinsulina en sujetos con la mutación R154X (Fig. 18).

Niveles de lípidos

Ninguno de los sujetos con la mutación R154X demostró evidencia de hipertrigliceridemia secundaria, ni siquiera aunque algunos (I-1, II-4, III-1) tuvieran un escaso control metabólico con niveles de HbA_{IC} de 10,6, 8,8 y 10,1, respectivamente (Tabla 12).

TABLA 12 Parámetros Clínicos de la Familia Dresden-11

\hskip0,3cm Parámetro	Genotipo
	Normal/Mutante	Normal/Normal	Valores de
		(hembra/varón)	Referencia
Edad Diagnosis (años)	26,40\pm3,47	- -	- -
Edad Actual (años)	35,50\pm7,58	62/41	- -
n (hembras/varones)	2/4	1/1	- -
BMI (kg/m^{2})	25,21\pm1,15	41,08/22,86	<25,00
HbA_{Ic} (%)	8,13\pm0,78	5,60/5,30	<6,50

TABLA 12 (continuación)

\hskip0,3cm Parámetro	Genotipo
	Normal/Mutante	Normal/Normal	Valores de
		(hembra/varón)	Referencia
Insulina basal (nM)	0,067\pm0,005	0,080/0,040	0,059-0,253
Péptido C basal (nM)	0,60\pm0,08	0,68/0,45	<1,06
Colesterol (mM), total	4,72\pm0,41	5,03/5,01	<5,20
en VLDL (mM)	0,79\pm0,31	0,21/0,70	0,10-1,40
en LDL (mM)	2,86\pm0,25	3,62/3,34	1,80-5,10
en HDL (mM)	1,17\pm0,18	1,32/1,26	0,80-2,50
en HDL2 (mM)	0,31\pm0,06	0,44/0,27	0,10-0,60
en HDL3 (mM)	0,86\pm0,12	0,88/0,99	0,80-1,90
Triglicéridos (mM), total	0,70\pm0,13	0,65/1,45	0,40-2,80
en VLDL (mM)	0,43\pm0,13	0,34/1,06	0,10-2,10
en LDL+HDL (mM)	0,28\pm0,02	0,33/0,47	0,20-0,80
Lipoproteína(a) (mg/l)	816,0\pm90,4	3,0/6,0	<250,0
ApoB (g/l)	1,38\pm0,22	1,33/1,38	0,72-1,50
ApoAI (g/l)	1,66\pm0,16	1,89/2,00	1,12-1,75
ApoAII (g/l)	0,32\pm0,02	0,29/0,53	0,30-0,70
ApoE (mg/l)	61,2\pm12,2	65,0/55,0	13,0-76,0
ApoCII (g/l)	36,0\pm5,3	36,0/61,1	7,0-63,0
ApoCIII (g/l)	26,7\pm3,7	23,0/36,0	16,0-45,0
Creatinina (mM)	95,5\pm5,6	73,0/80,0	<124,0
Urea (mM)	5,6\pm0,8	6,6/1,0	3,6-8,9
Proteína total (g/l)	72,7\pm1,7	77,2/84,0	65,0-85,0
Albúmina (g/l)	38,6\pm1,0	38,5/43,5	37,0-53,0
Alanina aminotransferasa	0,39\pm0,06	0,39/0,91	0,10-0,67
(\mumoles/l^{-}s))
\gamma-glutamil transferasa	0,54\pm0,12	0,55/1,11	0,18-0,83
(\mumoles/l^{-}s))
Bilirrubina (\muM), total	16,7\pm5,2	13,7/24,3	1,0-16,0
Acido úrico (\muM)	249\pm28	317/359	208-416
Función Exocrina Pancreática
Amilasa (U/l)	56,8\pm6,7	30,0/58,0	17,0-115,0
Lipasa (\mumoles/(l^{-}s))	1,22\pm0,40	0,20/3,00	0,38-3,40
Parámetros de coagulación
Tiempo de coagulación (%)	117\pm6	108/125	17,0-115,0
Tiempo de protrombina	33\pm1	29/35	30-40
parcial (s)
Fibrinógeno (g/l)	3,54\pm0,23	2,89/3,69	1,50-4,00
Antígeno del Factor	103\pm11	145/115	70-200
de Von Willebrand (%)
PAI-1 (ng/ml), total	36\pm8	102/40	30-80
tPA (ng/ml)	10,6\pm1,5	17,2/16,0	2,0-10,0
Análisis de orina
Creatinina	8,36\pm0,88	7,96/2,86	4,66-18,00
Microalbúmina	<2,2	13,5/<2,2	2,2-18,0
\begin{minipage}[t]{145mm} Los valores son las medias \pm EEM (Error estándar de las medias). Los dos sujetos normales se muestran con los valores sencillos. Los valores de referencia son los del Institute of Clinical Laboratory Diagnostics, University Clinic Carl Gustav Carus, Dresden.\end{minipage}

\newpage

Función Hepática y Renal

El HNF-4\alpha es expresado en el hígado y el riñón y se podría esperar que como tales las mutaciones en HNF-4\alpha afecten a la función normal de estos tejidos (Sladek y col., 1990; Cereghini, 1996). Con respecto a esto, HNF-4\alpha regula la expresión de varias apolipoproteínas incluyendo AI, AIV, B y CIII (Cereghini, 1996). Los niveles de apolipoproteínas en suero y de fracciones lipoproteicas fueron normales en sujetos con la mutación R154X excepto para los niveles de \hbox{lipoproteína(a),} que aumentaban 3,3 veces (Tabla 12). Se ha informado que los niveles de \hbox{lipoproteína(a)} aumentaban en sujetos con NIDDM en algunos estudios (Nakagawa y col., 1996; Hirata y col., 1995) pero no en otros (Durlach y col., 1996; Chico y col., 1996). No obstante una elevación de los niveles de lipoproteína(a) en sujetos con deficiencia de HNF-4\alpha parece ser paradójica puesto que la expresión de lipoproteína(a) es controlada por HNF-1\alpha (Wade y col., 1994) que a su vez es regulado por HNF-4\alpha (Cereghini, 1996). Así, se esperarían niveles de \hbox{lipoproteína(a)} más bajos no más altos en sujetos con la mutación R154X. Serán necesarios estudios adicionales para determinar la relación entre los niveles de lipoproteína(a) y las mutaciones en HNF-4\alpha.

HNF-4\alpha también regula la expresión de la albúmina, el fibrinógeno y los factores de coagulación VII, VIII, IX y X (Cereghini, 1996; Erdmann y Heim, 1995; Figueiredo y Brownlee, 1995; Naka y Brownlee, 1996; Hung y High, 1996). Los niveles en suero de albúmina y fibrinógeno y las mediciones del tiempo de coagulación fueron normales en sujetos con la mutación R154X (Tabla 12). HNF-4\alpha también es expresado en el riñón aunque la identidad de los genes diana en este órgano es desconocida (Sladek y col., 1990; Cereghini, 1996). Los niveles de creatinina y microalbúmina en orina fueron normales en individuos con la mutación R154x (Tabla 12) sugiriendo que la función renal no resultaba dañada en sujetos con mutaciones en el gen HNF-4\alpha.

Ejemplo 6 Disminución de las Respuestas Secretoras de Insulina y Glucagón a la Arginina en Sujetos No Diabéticos con una Mutación en el Gen HNF-4\alpha/MODY1

Los sujetos no diabéticos con la mutación Q268X en el gen del factor nuclear de hepatocitos (HNF)-4\alpha/MODY1 tienen dañada la secreción de insulina inducida por glucosa. Para averiguar los efectos de la arginina secretagogo no glucosado sobre la secreción de insulina y glucagón en estos sujetos, los autores de la presente invención estudiaron 18 miembros de la genealogía RW: 7 negativos a la mutación no diabéticos negativa (ND[-]), 7 positivos a la mutación no diabéticos (ND[+]), y 4 positivos a la mutación diabéticos (D[+]). Los autores de la presente invención les administraron arginina en forma de bolos de 5 g seguido de una infusión de 25 minutos a concentraciones basales de glucosa y tras la infusión de glucosa para fijar la glucosa en plasma a \sim200 mg/dl. La respuesta insulínica aguda (AIR), el área bajo la curva (AUC) de insulina a los 10-60 minutos, y la tasa de secreción de insulina (ISR) fueron comparadas como lo fueron la respuesta de glucagón aguda (AGR) y el AUC del glucagón. En los grupos ND[+] y D[+] había una disminución del AUC y de la ISR de insulina y disminución de la potenciación con glucosa de la AIR, AUC de insulina, e ISR a la administración de arginina cuando se comparaba con el grupo ND[-]. A concentraciones basales de glucosa, el AUC del glucagón fue la mayor para ND[-], intermedia para ND[+], y la más baja para el grupo D[+]. Durante la pinza hiperglucémica hubo un descenso de la supresión del AUC del glucagón para los dos grupos ND[+] y D[+] en comparación con el grupo ND[-]. La disminución de la ISR a la arginina en el grupo ND[+] en comparación con el grupo ND[-], magnificó la potenciación de la glucosa, indicando que HNF-4\alpha afecta a la ruta de señalización de la secreción de insulina inducida por arginina. El descenso del AUC del glucagón y la supresión del descenso del AUC del glucagón con hiperglucemia sugiere que las mutaciones en HNF-4\alpha pueden conducir a defectos secretores en las células \alpha así como en las células \beta o a una reducción de la masa de los islotes pancreáticos.

1. Métodos Sujetos

Se estudiaron dieciocho miembros de la genealogía RW de las ramas II-2 y II-5, generaciones III, IV, y V (Fajans, 1990; Fajans y col., 1994). El estudio fue revisado y aprobado por el Institutional Rewiew Board of the University of Michigan Medical Center, y todos los sujetos y/o progenitores dieron su permiso por escrito. El estado glucémico de cada sujeto fue determinado mediante el ensayo de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) definido por el National Diabetes Data Group (NDDG) (1979). Se obtuvo el tipaje de cada sujeto con una serie de marcadores de ADN sobre el cromosoma 20q para determinar si el o ella habían heredado el haplotipo de riesgo extendido (definido por los alelos en el loci ADA, D20S17, D20S79, y D20S4) asociado con MODY1 (Bell y col., 1991; Bowden y col., 1992; Cox y col., 1992; Rothschild y col., 1993). Cuando se demostró que la mutación Q268X en el gen HNF-4\alpha era la causa de MODY1 en la genealogía RW (Yamagata y col., 1996a), estos sujetos fueron sometidos a ensayo directamente en cuanto a esta mutación. Todos los sujetos incluidos en este estudio, excepto el individuo GM11626 no diabético, fueron sometidos a ensayo en cuanto a la presencia de la mutación Q268X. No obstante, su padre no diabético, IV-16, fue sometido a ensayo y no tiene la mutación Q268X. Basándose en los resultados del OGTT y en la presencia o ausencia de la mutación Q268X o el haplotipo de riesgo, los miembros de las familias fueron subdivididos en tres grupos:

\newpage

Grupo Negativo a la Mutación Q268X no diabético (ND[-])

Se estudiaron siete sujetos negativos a la mutación no diabéticos. Los números de identificación GM (Human Genetic Mutant Cell Repository) proporcionados por Bell y col., (1991), la generación de la genealogía RW y los números personales proporcionados por Fajans y col., (1994), y la edad en el momento del estudio fueron: GM10085, IV-22, 45 años; GM11429, IV-41, 32 años; GM11626, descendiente de IV-16, 17 años; GM10153, descendiente de IV-17, 18 años; GM11579, descendiente de IV-19, 16 años; GM11331, descendiente de IV-21, 21 años; y GM11333, descendiente de IV-21, 22 años. Cuatro de estos sujetos eran descendientes de progenitores diabéticos (GM10085, GM11429, GM10153, y GM11579).

Grupo positivo a la Mutación Q268X no diabético (ND[+])

En este grupo se incluyeron siete sujetos. Dos sujetos nunca tuvieron diabetes o tolerancia a la glucosa debilitada en OGTT: GM11090, descendiente de IV-143, 16 años; y GM10668, descendiente de IV-141, 16 años. Cinco sujetos tienen anomalías previas de tolerancia a la glucosa pero ninguno había tenido nunca una concentración anómala en ayunas de glucosa en plasma o de hemoglobina glucosilada. Dos tuvieron OGTT diabéticos sencillos a los 4 y 22 años, respectivamente, antes del estudio pero tuvieron numerosos ensayos de tolerancia a la glucosa normales con posterioridad: GM10018, IV-168, 25 años; y GM8072, IV-143, 39 años. Tres sujetos habían cumplido los criterios de diagnóstico NDDG para la diabetes mediante OGTT en el pasado. Antes del estudio tenían OGTT normales en 2, 4 y 5 ocasiones, a lo largo de 2, 4, y 4 años, respectivamente. Fueron: GM11600, descendiente de IV-143, 14 años; GM8759, IV-166, 31 años; y GM8073, descendiente de 143, 19 años.

Grupo positivo a la mutación Q268X Diabético (D[+])

Los cuatro sujetos de este grupo tuvieron OGTT constantemente diabéticos durante 6 o más años o tuvieron hiperglucemia en ayunas suave (<200 mg/dl) cuando no se trataron. Fueron GM8106, III-35, 59 años; GM7974, IV-141, 43 años; GM8107, IV-165, 26 años; y GM10724, descendiente de IV-142, 17 años. El sujeto GM8106 fue tratado con tolbutamida entre 1958 y 1968 y con clorpropamida desde Mayo de 1.995. Cuando no se trató, su glucosa en plasma en ayunas más alta fue de 160 mg/dl y su hemoglobina glucosilada total más alta fue del 9,1% (normal <6,3%). Con 100 mg de clorpropamida al día, su glucosa en plasma en ayunas fue de 91 mg/dl y su hemoglobina glucosilada fue del 5,3%. La clorpropamida fue interrumpida durante 26 días antes del estudio y la glucosa en plasma en ayunas fue de 99 mg/dl y la concentración de hemoglobina glucosilada total fue del 5,8% el día del estudio. El sujeto GM7974 fue tratado solo con dieta. Ella tuvo OGTT diabéticos intermitentemente desde 1969; los OGTT fueron constantemente diabéticos desde 1990. Su glucosa en plasma en ayunas fue de 84 mg/dl y su hemoglobina glucosilada total fue del 6,9% en el momento del estudio. La glucosa en plasma en ayunas más alta del sujeto GM8107 fue de 192 mg/dl y la hemoglobina glucosilada total más alta fue del 9,5% cuando no se trató. Cuando se trató con 1,25 mg de Glyburide diariamente, ella tuvo concentraciones de glucosa en plasma en ayunas y postprandial normales y una hemoglobina glucosilada total del 6,7%. El Glyburide se interrumpió 11 días antes del estudio. Su concentración de glucosa en plasma en ayunas fue de 106 mg/dl y su hemoglobina glucosilada total fue del 6,9% el día del estudio. El sujeto GM10725 había sido tratado con 2,5 mg de Glyburide dos veces al día desde 1989. Su concentración de hemoglobina glucosilada total más alta fue del 9%. Ella interrumpió la medicación 5 días antes del estudio y su glucosa en plasma en ayunas fue de 158 mg/dl y su hemoglobina glucosilada total fue del 7,7% en el momento del estudio.

Protocolo

Los sujetos fueron estudiados en el University of Michigan Clinical Research Center (CRC). Los sujetos fueron admitidos en el CRC por la tarde y estudiados en posición yacente después de un ayuno nocturno de 10-12 horas. Se insertó un catéter para la toma de muestras intravenoso en una dirección retrógrada en una vena del dorso de la mano y la mano se mantuvo en una caja de madera calentada termostáticamente a 60ºC para lograr la arterialización de la sangre venosa. Se insertó un segundo catéter para la administración de insulina, arginina y glucosa en la vena antecubital contralateral. En los sujetos con hiperglucemia en ayunas, se administró un pequeño bolo intravenoso de insulina regular humana (0,007 U/kg o aproximadamente 0,5 U) a los 50 minutos para disminuir la glucosa en plasma a aproximadamente 75 mg/dl.

Se obtuvieron muestras de sangre para la medición de las concentraciones de glucosa, insulina, péptido C, y glucagón basales a -30, -20, -10, y 0 minutos. A los 0 minutos se administró arginina. La dosis de arginina total fue calculada como 0,41 g/kg de peso corporal hasta un máximo de 30 gramos. En ese momento se administraron 0,5 gramos de arginina como un bolo IV a lo largo de 30 segundos y a los 5 minutos, la arginina restante fue infundida con una bomba a un ritmo constante a lo largo de 25 minutos. Se tomaron muestras a los 2, 3, 5, 7, 10, 20, y 30 minutos para la medición de la glucosa, la insulina, el péptido C, y el glucagón. Tras el primer bolo de arginina y su infusión, hubo un período de interrupción de 60 minutos. Las muestras de sangre para la medición de los mismos constituyentes fueron obtenidas a los 40, 50, 60, 70, 80, y 90 minutos. Al cabo de 90 minutos, se administró glucosa (150 mg/kg) a lo largo de 30 segundos y comenzó una infusión de dextrosa al 20% con 10 mEq de KCl/l a ritmo variable para fijar el nivel de glucosa en plasma a 200 mg/dl para el resto del estudio, según se determinó mediante frecuentes mediciones de la glucosa en sangre del enfermo. Las muestras de sangre para los constituyentes anteriores fueron obtenidas a los 92, 93, 95, 97, 100, 110, 120, 130, 140, y 150 minutos. A los 150 minutos, se administró de nuevo arginina (0,41 g/kg, 30 gramos máximo) en forma de un bolo de 5 gramos seguido al cabo de 5 minutos de una infusión a lo largo de 25 minutos, como antes, y se tomaron muestras a los 152, 153, 155, 157, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, y 240 minutos para las mediciones de glucosa, insulina, péptido C, y glucagón.

Procedimientos de análisis

Todas las muestras de sangre fueron recogidas sobre hielo y almacenadas a -70ºC hasta que se analizaron. La glucosa en plasma se midió en un Kodak Ektachem 700 Analyzer utilizando el método de la hexoquinasa (coeficiente de variación intra-análisis [CV] del 1,7% a 5,0 mmoles y del 1,2% a 16,1 mmoles). La insulina inmunorreactiva fue medida mediante radioinmunoanálisis (RIA) de doble anticuerpo (CV intra-análisis del 6,4%) (Hayashi y col., 1977). El péptido C fue medido mediante un RIA específico (CV intra-análisis del 3,9%) (Faber y col., 1978). El glucagón se midió mediante radioinmunoanálisis de doble anticuerpo (CV intra-análisis del 3,2%) (Hayashi y col., 1977). Todas las muestras fueron medidas por duplicado y se utilizaron sus medias. Las muestras de los casos individuales fueron medidas en un solo análisis. Todos los análisis fueron realizados en el laboratorio del Michigan Diabetes Research and Training Center Chemistry Core.

Análisis de los datos

Las respuestas insulínicas agudas (AIR), las respuestas de péptido C agudas (ACR), y las respuestas de glucagón agudas (AGR) fueron calculadas como la media de los niveles hormonales a los 2, 3, 4, y 5 minutos menos la media de los niveles hormonales a los -10, -5, y 0 minutos. Las áreas bajo la curva de glucosa, insulina, péptido C, y glucagón fueron calculadas con la regla trapezoidal para el intervalo de tiempo de 10 a 60 minutos cuando el bolo de arginina fue administrado a tiempo 0 y la infusión de arginina comenzó a los 5 minutos. Los valores de la línea base, calculados como los niveles hormonales medios medidos a -10, -5 y 0 minutos inmediatamente antes del bolo de arginina, fueron restados de las áreas bajo la curva. Las tasas de secreción de insulina fueron calculadas mediante la desconvolución de los valores del péptido C (Polonsky y col, 1986). Todos estos índices de secreción de insulina fueron evaluados durante la administración de arginina a niveles de glucosa de la línea base, durante la administración de glucosa, y durante la administración de arginina durante la pinza hiperglucémica. La pendiente de potenciación fue calculada como la diferencia entre AIR o ACR respecto de la arginina obtenida durante la pinza hiperglucémica y a niveles de glucosa de la línea base divididos por la diferencia entre estos dos niveles de glucosa (Halter y col., 1979). Los resultados son expresados como la media \pm el error estándar de la media. Se evaluó la significación estadística de las diferencias entre los grupos con los tests de chi cuadrado y de la t no pareado. Las comparaciones principales de interés fueron entre el grupo ND[-] y ND[+]. P < 0,05 fue definido como el límite de significación estadístico.

2. Resultados

Se estudiaron 18 miembros de la Genealogía RW: Siete negativos a la mutación no diabéticos (ND[-]), siete positivos a la mutación no diabéticos (ND[+], y cuatro positivos a la mutación diabéticos (D[+]) (Tabla 13). No había diferencias significativas entre los grupos con respecto al género o la edad, si bien los sujetos D[+] tendían a ser más mayores. Ningún sujeto era obeso. Los niveles de glucosa e insulina en ayunas no diferían significativamente entre los grupos aunque los sujetos D[+] tendían a tener niveles de glucosa más altos y niveles de insulina más bajos. Los niveles de péptido C en ayunas no diferían entre los grupos. La concentración de hemoglobina glucosilada no difería entre los dos grupos no diabéticos, pero era superior en el grupo D[+].

TABLA 13 Características de los Sujetos de la Genealogía RW mediante la Tolerancia a la Glucosa y el Estado de Mutación

Tolerancia a la Glucosa	No diabético	No diabético	Diabético
Genotipo*	[-]	[+]	[+]
Número y género (M/F)	5/2	3/4	1/3
Edad (años)	24 \pm 4	23 \pm 4	36 \pm 9
Indice de masa corporal (kg/m^{2})	25,2 \pm 1,5	23,1 \pm 1,0	22,5 \pm 0,4
Glucosa en ayunas (mg/dl)	91 \pm 2	87 \pm 2	112 \pm 16
Insulina en ayunas (\muU/ml)	10 \pm 1	11 \pm 2	7 \pm 1
Péptido C en ayunas (ng/dl)	1,8 \pm 0,1**	1,6 \pm 0,2	1,3 \pm 0,2
Glucagón en ayunas (pg/ml)	73 \pm 6	64 \pm 9	77 \pm 12
Hemoglobina glucosilada	5,5 \pm 0,1**	5,7 \pm 0,2**	7,8 \pm 0,4
*[-] = Normal/Normal	**p < 0,5 vs diabético [+]
\hskip0,1cm [+] = Normal/Mutación Q268X	Todos los valores son media + EEM

En la Fig. 19 se demuestra el protocolo y se ilustran las concentraciones de glucosa (Fig. 19A), insulina (Fig. 19B), péptido C (Fig. 19C), y glucagón (Fig. 19D) durante las tres fases del estudio. Estas fueron: A) administración de arginina (bolo e infusión) a concentraciones de glucosa basales, B) administración de glucosa (bolo e infusión a ritmo variable) para fijar el nivel de glucosa a 200 mg/dl, y C) administración de arginina (bolo e infusión) durante la pinza hiperglucémica.

En la Tabla 14 se resumen los niveles de glucosa medios; las respuestas insulínicas agudas (AIR) y las respuestas de péptido C (ACR) a la arginina; y las áreas de hormona bajo la curva (AUC) y la tasa de secreción de insulina (ISR) medidas de 10 a 60 minutos después del comienzo de las tres fases de estudio. Estas son A) administración de arginina a niveles de glucosa basales, B) administración de glucosa, y C) administración de arginina durante la pinza hiperglucémica.

TABLA 14 Concentraciones de Glucosa en Plasma, Respuestas Insulínica aguda y de Péptido C (AIR y ACR), Areas Bajo la Curva (AUC 10-60 minutos) para la Insulina y el péptido C y Tasa de Secreción de Insulina (ISR) durante la administración de A) Arginina a concentraciones de glucosa basales (Bolo e Infusión), B) glucosa (Bolo e infusión) y C) Arginina (Bolo e Infusión) durante la pinza hiperglucémica

Período	Número	No diabético	No diabético	Diabético
	de Grupo	(-)	(+)	(+)
		n = 7	n = 7	n = 4
A.	Administración de arginina a una concentración de glucosa basal
	Glucosa (mg/dl)*	107 \pm 3	102 \pm 2	115 \pm 15
	AIR (\muU/ml)	48 \pm 10	70 \pm 19	27 \pm 7
	ACR (ng/ml)	3,05 \pm 0,61	3,25 \pm 0,44	2,19 \pm 0,55
	AUC_{I} (ng/ml)	78,5 \pm 7,7	25,6 \pm 5,5^{\dagger}	3,5 \pm 0,8^{\ddagger \NAK}
	AUC_{c} (ng/ml)	205 \pm 12	71 \pm 9^{\dagger}	38 \pm 6^{\ddagger \NAK}
	ISR (\mug)	76 \pm 6	31 \pm 3''	16 \pm 3^{\P \NAK}

B.	Administración de glucosa
	Glucosa (mg/dl)*	207 \pm 2	207 \pm 5	203 \pm 7
	AIR (\muU/ml)	72 \pm 10	63 \pm 15	16 \pm 6^{\P}
	ACR (ng/ml)	4,03 \pm 0,61	2,83 \pm 0,54	1,25 \pm 0,58^{#}
	AUC_{I} (ng/ml)	43,9 \pm 6,3	47,1 \pm 11,4	16,1 \pm 4,1^{\P}
	AUC_{c} (ng/ml)	131 \pm 12	103 \pm 16	61 \pm 22^{#}
	ISR (\mug)	63 \pm 4	51 \pm 6	33 \pm 2^{\P}

C.	Administración de arginina durante la pinza hiperglucémica
	Glucosa (mg/dl)*	198 \pm 2	209 \pm 7	201 \pm 6
	AIR (\muU/ml)	271 \pm 33	162 \pm 36**	50 \pm 10^{\ddagger \NAK}
	ACR (ng/ml)	10,33 \pm 1,31	5,87 \pm 0,72	3,21 \pm 0,91^{\P \NAK}
	AUC_{I} (ng/ml)	628 \pm 69	149 \pm 40^{\dagger}	25 \pm 7^{\ddagger \NAK}
	AUC_{c} (ng/ml)	739 \pm 52	209 \pm 40^{\dagger}	109 \pm 42^{\ddagger}
	ISR (\mug)	276 \pm 18	101 \pm 19^{\dagger}	54 \pm 16^{\ddagger}
* media de un período de 10-60 minutos.
Todos los valores son media \pm EEM
** p \leq 0,05 \; ''p \leq 0,01 \; ^{\dagger}p \leq 0,001, ND[+] vs ND[-]
#p < 0,05 \; ^{\P}p < 0,01 \; ^{\ddagger}p < 0,001, D[+] vs ND[-]
^{\NAK}p < 0,05 D[+] vs ND[+]

Efectos de la Arginina y la Glucosa sobre la Secreción de Insulina Administración de Arginina a Concentraciones de Glucosa Basales

En la línea base, los niveles de glucosa no diferían entre los grupos (Tabla 13). Tras el bolo de 5 g de arginina, AIR y ACR no diferían entre los grupos pero tendían a ser inferiores para el grupo D[+] (Tabla 14). Durante y después de la subsiguiente infusión de arginina, los niveles de glucosa fueron ligeramente superiores a intervalos de 10, 20, y 30 minutos en ND[-] en comparación con el grupo ND[+] (Fig. 19) pero los niveles medios de glucosa durante el intervalo de tiempo de 10-60 minutos (Tabla 14) y el área bajo la curva de glucosa (1171 \pm 99 vs 1012 \pm 141 mg/dl, respectivamente, p = 0,37) no diferían. Los niveles de insulina y de péptido C ascendieron hasta un pico a los 30 minutos en el grupo ND[-] pero disminuyeron notablemente en ambos grupos ND[+] y D[+] (Fig. 19). El área bajo la curva de insulina (AUC_{I}) y el área bajo la curva de péptido C (AUC_{c}) se redujeron significativamente en el grupo ND[+] en comparación con el grupo ND[-] (Tabla 14). Se redujeron adicionalmente en el grupo D[+] en comparación con el grupo ND[+] (Tabla 14). La ISR se redujo significativamente en ND[+] en comparación con los sujetos ND[-] y se redujo adicionalmente en D[+] en comparación con los sujetos ND[+] (Tabla 14).

Administración de Glucosa

Los niveles de glucosa no diferían entre los grupos durante el bolo y la infusión de glucosa a ritmo variable (Tabla 14). La AIR y la ACR a la glucosa no diferían entre los grupos ND[+] y ND[-] pero ser redujeron significativamente en el grupo D[+] en comparación con el grupo ND[-] (Fig. 19, Tabla 14). Las AUC_{I}, AUC_{c}, e ISR durante la infusión de glucosa no diferían entre los grupos ND[-] y ND[+] (Tabla 14). Se redujeron en el grupo D[+] en comparación con el grupo ND[-] (Tabla 14).

Administración de Arginina durante la Pinza Hiperglucémica

Los niveles de glucosa no diferían entre los grupos durante la infusión de glucosa a ritmo variable y el segundo bolo y la infusión de arginina (Tabla 14). A niveles de glucosa en plasma hiperglucémicos, en comparación con los niveles euglucémicos, la AIR y la ACR para la arginina, el AUC_{I}, el AUC_{c} y la ISR aumentaron y las diferencias entre los grupos se ampliaron enormemente (Fig. 19, Tabla 14). Todos los índices de secreción de insulina se redujeron significativamente en el grupo ND[+] en comparación con el grupo ND[-] y hubo una reducción adicional en el grupo D[+] (Tabla 14).

La Fig. 20A y la Fig. 20B muestran las pendientes de potenciación para la insulina y el péptido C respectivamente. La potenciación con glucosa de la secreción de insulina estimulada con arginina se redujo en los grupos tanto ND[+] (0,80 \pm 0,18) como D[+] (0,24 \pm 0,04) en comparación con el grupo ND[-] (2,12 \pm 0,25, p < 0,001). La pendiente de potenciación de insulina también se redujo en el grupo D[+] en comparación con el grupo ND[+] (p < 0,05). La potenciación con glucosa de la secreción de péptido C estimulada con arginina también se redujo en los grupos ND[+] (0,02 \pm 0,00) y D[+] (0,01 \pm 0,00) en comparación con el grupo ND[-] (0,07 \pm 0,01), p < 0,01).

Efectos de la Arginina sobre las Concentraciones de Glucagón en Plasma

En la línea base, los niveles de glucagón no diferían entre los grupos (Tabla 13). Las respuestas de glucagón agudas al bolo de 5 g de arginina administrado a concentraciones de glucosa basales no diferían significativamente entre los grupos ND[-], ND[+], y D[+] (104 \pm 19, 92 \pm 16, y 82 \pm 23 pg/ml, respectivamente). Por otra parte, el área bajo la curva de glucagón (10-60 minutos) durante y siguiente a la infusión de arginina a concentraciones de glucosa basales se redujo en D[+] en comparación con los sujetos ND[-] (4,778 \pm 1,087 vs 7,549 \pm 639 pg/ml, p < 0,05). Los sujetos ND[+] mostraron volúmenes intermedios (5,772 \pm 734 pg/ml; p = 0,09 vs el grupo ND[-]). Durante la pinza hiperglucémica no existieron diferencias significativas entre las áreas bajo la curva de glucagón para ninguno de los grupos (4,237 \pm 406, 3,963 \pm 508, y 2,941 \pm 568 pg/ml, para ND[-], ND[+] y D[+], respectivamente). Para evaluar el impacto de la infusión de glucosa sobre la respuesta de glucagón a la arginina en los tres grupos de estudio, los autores de la presente invención evaluaron las diferencias en el área bajo la curva de glucagón entre los períodos euglucémico e hiperglucémico. Los descensos en las áreas de glucagón inducidos por la pinza hiperglucémica entre la primera y la segunda infusión de arginina fueron 3312 \pm 404, 1809 \pm 387, y 1836 \pm 535 pg/ml, para los grupos ND[-], ND[+] y D[+], respectivamente (p < 0,02 ND[-] vs ND[+].

Ejemplo 7 MODY Debida a Mutaciones en el Sitio de Unión a HNF-4\alpha en el Promotor del Gen HNF-1\alpha

Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en el factor de transcripción factor nuclear de hepatocitos (HNF)-1\alpha son la causa de una forma de diabetes que comienza en la madurez de los jóvenes, MODY3. Estos estudios han identificado mutaciones en las regiones codificadoras de ARNm y proteínas de este gen que producen la síntesis de ARNm o proteínas anómalos. Aquí, los autores de la presente invención informan de una familia Italiana en la que una sustitución A\rightarrowC en el nucleótido 58 de la región promotora del gen HNF-1\alpha cosegrega con MODY. Esta mutación está localizada en una región altamente conservada del promotor e interrumpe el sitio de unión para el factor de transcripción HNF-4\alpha, siendo las mutaciones en el gen que codifica HNF-4\alpha otra causa de MODY (MODY1). Este resultado demuestra que el descenso de los niveles de HNF-1\alpha per se puede ocasionar MODY. Por otra parte, indica que tanto el promotor como las regiones codificadoras del gen HNF-1\alpha deben ser rastreadas en cuanto a las mutaciones en sujetos que se pensaba tenían MODY debido a las mutaciones en este gen.

1. Método Sujetos

La familia MODY Italia-1 fue determinada a través de la clínica para diabetes del Santo Spirito's Hospital. El estado de afección fue determinado utilizando los criterios del National Diabetes Data Group. El estado de afección de los miembros de la familia no afectados fue definida como normal o debilitado basándose en los resultados de un OGTT de 75 g estándar. Este estudio tenía la aprobación institucional y todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito.

Análisis de Ligamiento

Los miembros de la familia fueron sometidos a genotipaje con los marcadores D12S321, D12S76 y UC-39 todos los cuales están estrechamente ligados a gen HNF-1\alpha (MODY3) (Yamagata y col., 1996). Los cebadores directo e inverso para el sitio marcado de la secuencia polimórfica (STS) UC-39 son 5'-GCAACAGAGCAAGACTCCATCT
CA-3' (SEC ID NUM: 122) y 5'-GAGTTTAATGGAAGAACTAACC-3' (SEC ID NUM: 123) respectivamente, y la PCR incluyó una desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos y 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, recocido a 63ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC durante 1 minuto con una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. El cebador directo se marcó con P^{32} y la concentración de MgCl_{2} en la reacción fue de 1,0 mM. La PCR se llevó a cabo en un GeneAmp 9600 PCR System (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Los productos de la PCR fueron separados mediante electroforesis en un gen de secuenciación de poliacrilamida al 5% y visualizados mediante autorradiografía. Los ensayos de unión se llevaron a cabo utilizando el haplotipo formado a partir de D12S321, D12S76 y UC-39 y suponiendo una frecuencia de recombinación entre marcadores adyacentes de 0,001 con el programa de ordenador MLINK del paquete LINKAGE (versión 5.1) (Lathrop y col., 1985). Las frecuencias de los haplotipos fueron estimadas a partir de los datos. En el análisis se supuso una frecuencia de alelos de la enfermedad de 0,001 y dos clases de riesgo. El riesgo de clase 1 incluía individuos cuya edad era \geq25 años de edad con penetrancias de 0,00, 0,95 y 0,95 para el homocigoto normal, el heterocigoto y el homocigoto susceptible, respectivamente. El riesgo de clase 2 incluía individuos <25 años de edad con penetrancias de 0,00, 0,50 y 0,95 para el homocigoto normal, el heterocigoto y el homocigoto susceptible, respectivamente. El estado de afección del sujeto uno con tolerancia a la glucosa debilitada fue codificado como desconocido.

Identificación de las Mutaciones

Se rastrearon cada exón y la región promotora mínima del gen HNF-1\alpha de los sujetos II-5 y III-1 en cuanto a las mutaciones como se ha descrito previamente (Yamagata y col., 1996; Kaisaki y col., 1997). La mutación fue confirmada clonando el producto de la PCR en pGEM-4Z y secuenciando los clones derivados de ambos alelos. La presencia de la mutación en otros miembros de la familia y en sujetos no diabéticos relacionados fue sometida a ensayo mediante amplificación PCR de la región promotora proximal y secuenciación directa.

2. Resultados Estudios de Ligamiento

La NIDDM en la genealogía Italia-1 tiene las características clínicas de MODY incluyendo la herencia dominante autosómica y una edad en el momento de la diagnosis de <25 años en muchos miembros de la familia (Fig. 21). Los seis miembros afectados son tratados con insulina (individuos II-1, II-5 y III-9) o agentes hipoglucémicos orales (II-7, III-1 y III-2). Los tres sujetos en terapia con insulina mostraron evidencia de complicaciones diabéticas incluyendo retinopatía (II-1 y II-5) y nefropatía (III-9). Un miembro de esta genealogía, III-6, tiene tolerancia a la glucosa debilitada.

Los marcadores polimórficos D12S321, D12S76 y UC-39 que están estrechamente ligados al gen HNF-1\alpha (orden: cen - D12S321 - D12S76 - HNF-1\alpha - UC-39 -qter) fueron sometidos a tipaje en esta familia. El haplotipo 3-3-7 cosegregaba con MODY sin recombinantes obligados (Fig. 21). Un sujeto con IGT (edad, 18 años) también heredó este haplotipo como lo hicieron dos mujeres jóvenes no afectadas, los individuos III-5 y III-13, de 21 y 14 años de edad, respectivamente. Estos tres sujetos pueden tener el riesgo de desarrollar diabetes en el futuro. La puntuación LOD en esta familia fue de 1,28 a una fracción de recombinación de 0,00. Aunque esta puntuación LOD no cumple los criterios formales para establecer ligamiento (es decir la puntuación LOD es <3,0), el valor de p asociado a la evidencia de ligamiento es 0,008 lo que es suficiente para justificar una búsqueda de mutaciones en el gen HNF-1\alpha.

Rastreo de Mutaciones

Dos sujetos diabéticos, II-5 y III-1, fueron rastreados en cuanto a las mutaciones en el gen HNF-1\alpha. No se encontraron mutaciones al rastrear las regiones codificadoras de ARNm/proteína, exones 1-10, aunque los sujetos eran heterocigotos para varios polimorfismos descritos previamente (Yamagata y col., 1996). Puesto que no se encontraron mutaciones en la región codificadora del gen HNF-1\alpha, se rastreó la región promotora proximal. Este análisis reveló que ambos sujetos afectados eran heterocigotos para una sustitución A\rightarrowC en el nucleótido -58 que está localizado en una región altamente conservada del promotor del gen HNF-1\alpha que incluye el sitio de unión para HNF-4\alpha (Fig. 22) (Tian y Schibler y col., 1991; Kuo y col., 1992). Puesto que esta mutación no conduce a la ganancia o pérdida de un sitio para la endonucleasa de restricción, se sometió a ensayo mediante amplificación PCR y secuenciación directa. La sustitución A\rightarrowC en el nucleótido -58 cosegregaba con el haplotipo de riesgo en la genealogía Italia-1 (Fig. 21) y no estaba presente en una muestra de 50 sujetos de raza blanca no relacionada implicando que es la mutación responsable de MODY en esta familia.

Ejemplo 8 Mutación en HNF-1\beta asociada con MODY

HNF-1\alpha y HNF-4\alpha son miembros de una red reguladora de la transcripción compleja en la que se incluyen otras proteínas con homeodominio y receptores nucleares así como la hélice en horquilla/lazo y los miembros de las familias de la cremallera de leucina CCAAT/proteínas intensificadoras de la unión (Cereghini, 1996). Los inventores han rastreado otros dos miembros de esta red, HNF-1\beta (Mendel y col., 1991a; De Simone y col., 1991; Rey-Campos y col., 1991; Bach y Yaniv, 1993) y el cofactor de dimerización de proteínas bifuncional de HNF-1 (DCoH)/pterin-4-carbinolamina deshidratasa (PCBD) (Mendel y col., 1991b; Citron y col., 1992) en cuanto a las mutaciones en sujetos Japoneses con MODY. No se encontraron mutaciones asociadas con la diabetes en DCoH. No obstante, los autores de la presente invención encontraron un sujeto con una mutación sin sentido, R177X, en HNF-1\beta que cosegregaba con la diabetes de comienzo temprano. La identificación de las mutaciones en tres miembros de la familia HNF de factores de transcripción de hepatocitos indica la importancia de esta red reguladora en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa.

1. Métodos Población del estudio

La población del estudio constaba de 57 sujetos Japoneses no relacionados que asistían al Diabetes Clinic of Tokyo Women's Medical College que fueron diagnosticados de NIDDM antes de los 25 años de edad y/o que eran miembros de las familias en las que estaba presente NIDDM en tres o más generaciones; edad en el momento de la diagnosis, 20,1 \pm 7,5 años (media \pm EE); varón/hembra, 31/26; y tratamiento, insulina - 36, agentes hipoglucémicos orales - 10, y dieta - 11. Estos sujetos habían sido rastreados en cuanto a las mutaciones en el gen HNF-1/MODY3 y todos dieron negativo para las mutaciones en este gen (Lazzaro y col., 1992). Treinta y dos de los sujetos cumplieron criterios estrictos para la diagnosis de MODY (es decir, NIDDM al menos en tres generaciones con transmisión dominante autosómica y diagnosis antes de los 25 años de edad al menos en un sujeto afectado). La NIDDM fue diagnosticada utilizando los criterios de la Organización Mundial de la Salud (Bennett, 1994). En el momento del reclutamiento, se obtuvo el permiso por escrito de cada sujeto y se extrajeron muestras de sangre para el aislamiento del ADN. Se sometieron a ensayo cincuenta y tres sujetos Japoneses no diabéticos no relacionados en cuanto a cada sustitución de nucleótido y mutación para determinar si el cambio de secuencia era un polimorfismo o una mutación asociada a enfermedad.

Genealogía J2-20

El probando (sujeto III-2, Fig. 25) presentaba glucosuria a los 10 años de edad y fue hospitalizado. Fue diagnosticada de diabetes y tratada con insulina durante dos días y después sólo con dieta durante dos años. A los 12 años de edad, reanudó la terapia de insulina (28U/día). Volvió a la atención clínica de nuevo a los 21 años a causa de una pielonefritis y diabetes poco controlada. A los 23 años de edad, fue admitida en el hospital del Tokyo Women's Medical College a causa de visión borrosa. Sus niveles de péptido C en orina en este momento fueron de 3,2 g/día (normal, 50 \pm 25 g/día) indicando baja capacidad secretora de insulina. A pesar de los persistentes niveles altos de glucosa en sangre, no tuvo historial de cetosis. El sujeto fue diagnosticado de NIDDM basándose en su trayectoria clínica. El sujeto III-3 presentaba fatiga general a los 15 años de edad. Ganó 15 kg durante los tres meses anteriores y su peso en el momento de la presentación fue de 75 kg. Fue diagnosticado de diabetes y fue tratado primero con insulina y después con dieta y con ejercicio. Estuvo bien controlado cuando mantuvo su peso en 60 kg. A los 18 años de edad ganó peso de nuevo y se inició el tratamiento con insulina. Su péptido C en orina en este momento fue de 57,5 g/día con niveles de péptido C y glucosa en ayunas de 2,4 ng/ml y 106 mg/dl, respectivamente. No tuvo historial de cetosis y fue diagnosticado de NIDDM. En la actualidad muestra una disminución de la función celular pancreática sin incremento de los niveles de péptido C siguiente a la administración de glucagón. Todos los individuos mostrados en la Fig. 25 fueron invitados a participar en este estudio pero muchos declinaron hacerlo.

Aislamiento y secuencia parcial del gen HNF-1b humano

El clon PAC 319P12 que contenía el gen HNF-1\beta fue aislado de una genoteca (Genome Systems, St. Louis, MO) rastreando las reservas de ADN PAC utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR®) y los cebadores vHNFP1 (5'-CCTCATGGAGAAACATCCTAAGT-3') (SEC ID NUM: 124) y vHNFP2 (5'-AGGGAGTG
CACGGCTGAGCTCCTG-3') (SEC ID NUM: 125). Las secuencias de los exones, los intrones limítrofes y la región promotora fueron determinadas secuenciando los productos de la PCR® y los fragmentos de restricción apropiados clonados en pGEM®-4Z (Promega, Madison, WI) con un estuche de secuenciación por ciclos AmpliTaq FS Dye Terminator (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y un secuenciador de ADN ABI Prism® 377. Los cebadores para la PCR® y la secuenciación fueron seleccionados utilizando la organización exón-intrón del gen HNF-1\alpha humano (Yamagata y col., 1996a) como guía puesto que los genes relacionados tienen a menudo organizaciones exón-intrón similares. La secuencia parcial del gen HNF-1\beta incluyendo el promotor ha sido consignada en la base de datos GenBank con los números de acceso U90279-90287 y U96079.

Rastreo de Mutaciones

Los nueve exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima del gen HNF-1\beta fueron amplificados utilizando PCR® y cebadores específicos (Tabla 17) y los productos de la PCR® fueron secuenciados desde ambos extremos como se ha descrito antes. La PCR® para el exón 1 se llevó a cabo utilizando ELONGASE Enzyme® Mix (Life Technologies, Grand Island, NY) con desnaturalización a 94º durante 1 minuto seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, recocido a 55ºC durante 30 s y extensión a 68ºC durante 1 min, y extensión final a 68ºC durante 10 minutos. La PCR® para los exones 2-9 se llevó a cabo utilizando polimerasa Taq y MgCl_{2} 1,5 mM con desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, recocido a 60ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos, y extensión final a 72ºC durante 10 min. La secuencia de cada mutación fue confirmada clonando el producto de la PCR® en pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI) y secuenciando los clones que representan ambos alelos. Los exones 2-4 del gen DCoH fueron amplificados utilizando ADN polimerasa Taq/MgCl_{2} 1,5 mM y cebadores específicos (Tabla 16) y secuenciados como se ha descrito antes. El exón 1 del gen DCoH que codifica la región 5' no traducida y la Met de iniciación fue refractario a la amplificación mediante PCR® y por consiguiente no fue rastreado en cuanto a las mutaciones. La presencia de una mutación específica o polimorfismo en otros individuos fue determinada mediante análisis PCR-RFLP si se producía la ganancia/pérdida de un sitio para una endonucleasa de restricción, o PCR® y secuenciación directa si no había cambio en un sitio.

Estudios de Ligamiento

Los genes HNF-1\beta humano (STS WI-7310) y DCoH fueron cartografiados y confirmados para YACs 969C9 (cromosoma 17) (Schuler y col., 1996) y 849H3 (cromosoma 10), respectivamente. Los STS polimórficos adyacentes D17S1788 y D10S1688 fueron sometidos a ensayo en cuando al ligamiento con la NIDDM en pares sib afectados Japoneses (258 y 268 pares posibles, respectivamente). En el amplio rastreo genómico de 23 pares sib afectados Mejicanos-Americanos, los genes HNF-1\beta y DCoH se encuentran en los intervalos D17S1293-D17S1299 y D10S589-D10S535, respectivamente (Schuler y col., 1996).

Estudios de transactivación de HNF-1b humano normal y mutante

El constructo pcDNA3.1-HNF-1\beta fue preparado clonando el ADNc de HNF-1\beta humano de tipo A (nucleótidos 195-2793 inclusive, Núm. Acceso Genbank X58840; SEC ID NUM: 128) en pcDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA). La mutación R177X fue introducida mediante mutagénesis dirigida al sitio (estuche de mutagénesis QuikChange®; Stratagene, La Jolla, CA) para generar pcDNA3.1-HNF-1\beta-R177X. El constructo del gen indicador pGL3-RA fue preparado clonando el promotor del gen de la albúmina de rata, nucleótidos -170 a +5 (Ringeisen y col., 1993), en el vector indicador de la luciferasa de luciérnaga pGL3-Basic (Promega, Madison, WI). Se confirmaron las secuencias de todos los constructos. Se transfectaron células HeLa durante 5 horas utilizando lipofectAMINE® (GIBCO BRL, Gaithesburg, MD) con 500 ng de pGL3-RA, 250 ng de pcDNA3.1-HNF-1\beta o pcDNA3.1-HNF-1\beta-R177X, y 25 ng de pRL-SV40 para controlar la eficacia de la transfección. Se añadió ADN pcDNA3.1+ a cada transfección de manera que la cantidad final de ADN añadida fuera de 2 g. Al cabo de 24 horas, se midió la actividad de transactivación de las proteínas HNF-1\beta normal y mutante utilizando el Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI).

2. Resultados

Los nueve exones, los intrones limítrofes y la región promotora mínima del gen HNF-1\beta humano (TCF2) que codifican todas las formas de HNF-1\beta fueron rastreados en cuanto a las mutaciones en 57 sujetos Japoneses no relacionados con MODY. Este análisis reveló cuatro sustituciones nucleotídicas, una sustitución C T en el codón 177 (exón 2) en el probando de la familia J2-20 que generaba una mutación sin sentido CGA (Arg) TGA (OP) (R177X) (Fig. 24), una mutación silenciosa poco común en el codón 463 (exón 7) para la cual un sujeto era homocigótico, y dos polimorfismos en el intrón 8 (Tabla 15), ninguna de las cuales se pronostica afectará al empalme del ARN. La mutación sin sentido R177X no fue encontrada al rastrear 53 sujetos Japoneses no diabéticos no relacionados. Un sujeto no diabético era heterocigótico para la mutación silenciosa en el codón 463 (Tabla 15).

6

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Los polimorfismos de ADN encontrados en los intrones son observados con respecto al sitio donador o aceptor de empalme. nt, nucleótido. En el gen HNF-1\beta la sustitución C\rightarrowT en el codón 463 y el polimorfismo por inserción de C en el nt 48 del intrón 8, producen la ganancia de un sitio Dde I y la pérdida de Nae I, respectivamente. En el gen DCoH humano (Núm. de Acceso GenBank L41560, incorporado aquí como referencia), el nt 9306 está en la región que codifica la región 3' no traducida del ARNm de DCoH y está 36 nucleótidos después del codón de terminación.

La familia J2-20 muestra una herencia bilineal de la diabetes (Fig. 25). La mutación R177X, que era heredada por vía materna, está asociada con la NIDDM de comienzo temprano, progresión frente al tratamiento con insulina y complicaciones severas. La edad temprana en el momento de la diagnosis en el probando y su hermano puede ser debida a la herencia de los genes de susceptibilidad a la diabetes de ambos progenitores. El gen de la diabetes paterno que puede potenciar el efecto de la mutación en HNF-1\beta es desconocido pero no es otro gen MODY conocido puesto que las mutaciones no fueron encontradas en los genes HNF-1\alpha y HNF-4\alpha y de la glucoquinasa del probando (Iwasaki, y col., 1997; Furuta y col., 1997; Iwasaki y col., 1995). El hermano mayor del probando había sido sano hasta desarrollar un catarro común y murió una semana después de cetoacidosis diabética. Se sabía que los abuelos maternos del probando, fallecidos ambos, no tuvieron diabetes. No obstante, ella tenía un tio materno con NIDDM controlada con dieta suave diagnosticada con 60 años de edad. La diferencia en el fenotipo entre la madre del probando y el tio materno y la ausencia de diabetes en los abuelos maternos sugiere que la mutación R177X puede representar una nueva mutación en la madre del probando. El padre y dos tíos paternos tenían NIDDM de comienzo tardío tratada con agentes hipoglucémicos orales. Se informó que la abuela paterna del probando ha tenido diabetes. La presencia de MODY y NIDDM de comienzo tardío en la misma familia no es inusual y ha sido referida previamente (Bell y col., 1991). Con respecto a la presencia de nefropatía en los sujetos con la mutación R177X en HNF-1\beta, es interesante observar que HNF-1\beta es expresado a niveles más altos en el riñón (Mendel y col., 1991a; De Simone y col., 1991; Rey-Campos y col., 1991; Bach y Yaniv, 1993; Lazzaro y col., 1992) y quizás los niveles decrecientes de su factor de transcripción contribuyen a la disfunción renal.

HNF-1\beta contiene una región de unión al ADN bipartita que consta de un elemento de tipo POU y un homeodominio (Mendel y col., 1991a; De Simone y col., 1991; Rey-Campos y col., 1991; Bach y Yaniv, 1993). La mutación R177X está localizada al final del dominio de tipo POU y genera una proteína de 176 aminoácidos que tiene los dominios de dimerización de NH_{2} y POU (Cereghini, 1996; Mendel y col., 1991a; De Simone y col., 1991; Rey-Campos y col., 1991; Bach y Yaniv, 1993). Esta proteína truncada no puede estimular la transcripción de un gen indicador conectado al promotor de la albúmina de rata y no inhibe la actividad de HNF-1\beta de tipo salvaje (Tabla 16). Esto sugiere que la mutación R177X representa una mutación con pérdida de función que produce una disminución de los niveles de HNF-1\beta y la reducción correspondiente de la expresión de los genes diana HNF-1\beta.

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TABLA 16 Actividad de transactivación de HNF-1\beta humano y la mutación R177X

Constructo	Actividad Normalizada
	(Luciferasa de Luciérnaga/
	Luciferasa de Renilla)
pcDNA 3.1	3,5 \pm 0,5
pc DNA 3.1-HNF-1\beta	25,1 \pm 3,2
pc DNA 3.1-R177X	3,8 \pm 1,0
pcDNA 3.1-HNF-1\beta-R177X	32,2 \pm 2,8

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La actividad de cada constructo fue medida por triplicado y se muestra la media \pm DT. Estos resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes.

7

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El DCoH humano es una proteína de 104 aminoácidos (incluyendo la metionina de iniciación) (Thöny y col., 1995). Los exones 2-4 que codifican los aminoácidos 2-104 fueron rastreados en cuanto a las mutaciones en los 57 sujetos Japoneses no relacionados con MODY como se ha descrito antes. Las secuencias fueron idénticas entre sí excepto por un polimorfismo A G localizado en la región 3' no traducida (Tabla 15), cuya frecuencia no era diferente entre los sujetos MODY y no diabéticos. Así, no parece que las mutaciones en DCoH contribuyan al desarrollo de MODY en Japoneses.

La frecuencia de mutaciones en HNF-1\beta en los estudios de población de sujetos Japoneses con MODY de los autores de la presente invención es del 2% (1/57) que es la misma que para las mutaciones en HNF-4\alpha (Furuta y col., 1997) mientras que la frecuencia de las mutaciones en HNF-1\alpha es de aproximadamente el 8% (Iwasaki, y col., 1997) (la frecuencia de las mutaciones de la glucoquinasa en esta muestra es desconocida). No obstante, no es probable que la variación genética en HNF-1\beta o DCoH sea un factor principal que contribuya a la NIDDM de comienzo tardío más común puesto que no existe evidencia de ligamiento de los marcadores adyacentes a estos genes con la diabetes en pares sib afectados Japoneses o Mejicanos-Americanos (Hanis y col., 1996).

La asociación de una mutación en HNF-1\beta con la diabetes indica la importancia de la red reguladora HNF en la determinación de la función de las células pancreáticas. Por otra parte, HNF-1\alpha no es capaz de compensar la reducción de actividad de HNF-1\beta implicando que los genes diana primarios para estos factores de transcripción en las células \beta pancreáticas son diferentes. La identificación de estos genes diana proporcionará una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que determinan la función celular normal y puede conducir a nuevos enfoques para tratar la diabetes.

Ejemplo 9 Elucidación de los Genes Responsables de los Estados de Enfermedad MODY Adicionales

Los autores de la presente invención han identificado que diferentes estados de enfermedad de diabetes de tipo MODY están ocasionados por mutaciones en diferentes proteínas HNF en los individuos enfermos. No obstante, los autores de la presente invención ya saben de familias que manifiestan estados de enfermedad "MODY" clásicos que no están ocasionados por mutaciones en HNF-1\alpha, HNF-1\beta, o HNF-4\alpha. Por consiguiente, un aspecto de esta invención es continuar rastreando el complemento genético de estas familias para determinar los genes que ocasionan estos estados de enfermedad MODY adicionales. Semejante rastreo se puede realizar de la manera utilizada exitosamente por los autores de la presente invención para rastrear las causas de MODY1, MODY2, y MODY3. Un experto normal estará capacitado y motivado en vista de las enseñanzas de esta solicitud, para trabajar hacia la elucidación de los genes que, cuando muten, ocasionen estados de enfermedad MODY. Una vez elucidados tales genes, todos los aspectos diagnósticos, de tratamiento, y otros aspectos de la invención serán realizables por los expertos en la técnica para las causas de MODY adicionales. Con el fin de alcanzar estos aspectos de la invención, simplemente se tendrán que modificar el procedimiento y protocolos ilustrados en esta memoria para que sean apropiados para determinar el gen específico que ocasiona un estado de enfermedad MODY.

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Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados aquí pueden ser realizados y ejecutados sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Si bien las composiciones y los métodos de esta invención han sido descritos en términos de las realizaciones preferidas, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden ser aplicadas diferentes variaciones a las composiciones y/o los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método aquí descrito sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, resultará evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto químicamente como fisiológicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos aquí mientras se logren los mismos o similares resultados. Se considera que todos los sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención definida y en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

Las siguientes referencias, hasta el punto que proporcionan detalles relativos al procedimiento ejemplares u otros suplementarios a los mostrados aquí, son incorporadas específicamente como referencia.

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Solicitud PCT Núm. PCT/US87/00880 (i.e. W0 87/06270)

Solicitud PCT Núm. PCT/US87/00880 (i.e. W0 89/09284)

Solicitud PCT Núm. PCT/US88/10315

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Patente de los Estados Unidos Núm. 3.939.350

Patente de los Estados Unidos Núm. 3.996.345

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.215.051

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.275.149

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.277.437

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.366.241

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.554.101

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.195

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.800.159

Patente de los Estados Unidos Núm. 4.883.750

Patente de los Estados Unidos Núm. 5.262.311

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: ARCH DEVELOPMENT CORPORATION

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1101 EAST 58TH

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): 60637

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELEFONO: (512) 418-3000

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: (713) 789-2679

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Graeme I. Bell

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Kazayu Yamagata

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Naoisha Oda

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Pamela J. Kaisaki

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Hiroto Furuta

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Stephen Menzel

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CHICAGO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): Desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: MUTACIONES EN EL FACTOR NUCLEAR DE HEPATOCITOS DE GENES DE SUSCEPTIBILIDAD A LA DIABETES (HNF)1 ALFA, HNF-1BETA Y HNF-4\alpha

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 147

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disco Flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LOGICO: PatentIn Release #1,0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD: US Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-SEPT-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/029.679

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-OCT-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/029.056

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-OCT-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/025.719

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-SEPT-1996

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID. NUM: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3238 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 988

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN:/base_mod = OTRA /nota = "N = A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (24..986, 990..1916)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 630 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3238 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): RASGOS/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 988

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /base_mod = OTRA /nota = "N = A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (24..986, 990..1916)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 630 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3239 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): RASGOS/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 989

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /base_mod = OTRA /nota = "N = A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 24..965

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 5:

22

23

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 314 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3236 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): RASGOS/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 988

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /base_mod = OTRA /nota = "N = A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (24..986, 990..1271)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 7:

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 415 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): RASGOS/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /base_mod = OTRA /nota = "N = A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTAATNATT ACC

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACACCACTC TGGCAGCCAC ACT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTGGGTAC ATTGGTGACA GAAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAGGCAAA CGCAACCCAC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGGGGGC TCGTTAGGAG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGCACAGT CCCCACCCTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCCAGCCC CCACCTATGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCAAGGTC AGGGGAATGG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCCCAGAC CAAACCAGCA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAACCCTC CCCTTCATGC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGACTGCT GTCAATGGGA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAGACAGG CAGATGGCCT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTCCCTAG GGACTGCTCC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGCAGTC CCTAGGGAGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTGCCCCAT GAGCCTCCCA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCTTGGGC AGGGGTGGGA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCAATGCC TGCCAGGCAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCTGCATC CATTGACAGC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCCTGGG ACTAGGGCTG T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTGTCACA GGCCGAGGGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGTGACAG AGCCCCTCAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGACAGCAA CAGAAGGGGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGCCCCT CACCCCCACA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCCCTAG GGACAGGCAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCCCTAG GGACAGGCAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 671 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 104..217

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 796 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (286..312, 316..375)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 634 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 326..499

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 458 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (171..173, 177, 265)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 662 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 84..188

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 43:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 647 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 185..340

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 844 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 429..515

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 47:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 937 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (485..529, 533..640)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 978 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (376..387, 391..432, 436..534, 538..610)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 75 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 51:

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 984 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (443..490, 494..595)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 53:

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1103 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (289..429, 433..477, 481..492, 496..603, 607..630, 634..750, 754..810, 814..843, 847..1023, 1027..1071, 1075..1103)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCACTGGG AGGAGGCAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTGTGGA CCAACCTACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGTGTGC ACGACTGCAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGAGCTGC AGCCTCATAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCTCCCT TAGAGTGCCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACTCAGGG AGAAGACAGA CCT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTAGTTCTG TCCTAAGAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATAAAGT GTGGCTACAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCCCCTA CTCCATCCCT GT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTCCCGTC AGCTGCTCCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCAGGGGA CAGAGAATGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATCAAGCCA GTCCACGGCT AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCAGCGTC ACTGAGTTGG CTA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCCTGGGT GAGTGCCATG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACCAGCTA TCTTGCCAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAGAAGTC TGGCAGAGCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTTGTGT GACACAAGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCACTGTGT GAGGCCTGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTTGATTG GCCACGCCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCTGGTTC TACCTTCTAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTACTCC CACAAAGGCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCACGTGA TCACCAGGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1441 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 20..1414

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 465 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2329 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCTGGTCA TCACGTGGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGGCTCA AGTCATCTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Cys Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Cys Lys Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gly Cys Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..36

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 86:

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Tyr Ser Gly Pro Pro Pro Gly Pro Gly Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..36

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 88:

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Tyr Ser Gly Pro Pro Pro Arg Ala Arg Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGAACCCC GAAGAGTGGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTCCAGAC ACCTGTTACT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGATCATG GCAAGTTAGA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGTGAGAG TATGGAAGAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTTTGCT TGTGAAACTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGTGGGAA ACGGGCTTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCCACTAG TACCCTAACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGGGCAA AGGTCACTTC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGAAGGCT ACAGACCCTA TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCTGGGTC TGTGTACTTG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGTTTTGG GCCAAGCACC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCAGATAA GATCCGTGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCAGACTC ACAGCCTGAA CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAGGGCA ATGGCTGAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCGAGTCA TTGTTCCAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTTATCT TATCAGCTCC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTCTTTG TGGTCCAAGT CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTTTGAAG GAGACCTACA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCACCTCT CCTTATCCCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTCCGAGA AAGTTCAGAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGCCTGTG TATGCACCTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 111:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGAGTCCA TGCTTGCCAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 112:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTGCTGT TGAGTTGGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 113:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCATGACA GCTGCCCAGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 114:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAAGGTTGG AGCCCCTCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTAAGGTG ACCCCATCAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 116:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGTGATGT CCAGAAGTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 117:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAATGTGT CAGAGTTCGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 118:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCCTCCTG TTCTTAAGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 119:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGACTCCC AGTTCAGTCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGGATCCA GAAGATTGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 121:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCCTCTGG GAAGATCTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 122:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAACAGAGC AAGACTCCAT CTCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 123:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTTTAATG GAAGAACTAA CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 124:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCATGGAG AAACATCCTA AGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 125:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGAGTGCA CGGCTGAGCT CCTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6254 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1287..4273

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota: "N = A o G o C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 126:

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

77

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 631 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 127:

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6433 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 128:

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 609 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 129:

87

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10014 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 130:

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

92

93

94

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 131:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 567 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 131:

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 132:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 132:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 133:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 467 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 133:

\vskip1.000000\baselineskip

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 134:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 479 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 134:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 135:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 605 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 135:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\hskip0,4cm105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 136:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 478 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 136:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 137:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 622 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 137:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 138:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 138:

\vskip1.000000\baselineskip

108

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 139:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 557 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 139:

\vskip1.000000\baselineskip

110

111

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 140:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 516 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 140:

113

114

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 141:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 141:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGACCGG ATCAGCA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 142:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 142:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Arg Ile Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 143:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 143:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGACTGG ATCAGCA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 144:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 144:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Val Leu Ser Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 145:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "N = C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 145:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGAGGTCC TGTCCNGACA GGTACCGGGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 146:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "N = C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 146:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGCAANGA GAGAT

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 147:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "X = R o cualquier aminoácido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 147:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Xaa Glu}

Claims

1. Un método in vitro para rastrear la diabetes que comprende:

: analizar un ácido nucleico muestra obtenido previamente de un animal para detectar una mutación en un segmento de ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha, HNF-1\beta o HNF-4\alpha; donde una mutación en el ácido nucleico que codifica el HNF es indicativa de propensión a la diabetes no dependiente de insulina.

2. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha está localizado en el cromosoma humano 12q.

3. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha está localizado en el locus MODY3.

4. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha está localizado en el cromosoma humano 20.

5. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha está localizado en el locus MODY1.

6. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\beta.

7. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es ADN.

8. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de análisis del ácido nucleico que codifica HNF comprende secuenciar el ácido nucleico que codifica HNF para obtener una secuencia.

9. El método de la reivindicación 8, donde la secuencia del ácido nucleico que codifica HNF es comparada con una secuencia de ácido nucleico natural de un gen HNF.

10. El método de la reivindicación 9, donde la secuencia del ácido nucleico que codifica HNF es comparada con una secuencia de ácido nucleico natural de HNF-1\alpha.

11. El método de la reivindicación 10, donde la secuencia de ácido nucleico natural de HNF-1\alpha tiene una secuencia mostrada en la SEC ID NUM: 1.

12. El método de la reivindicación 9, donde la secuencia del ácido nucleico que codifica HNF es comparada con una secuencia de ácido nucleico natural de HNF-4\alpha.

13. El método de la reivindicación 12, donde la secuencia de ácido nucleico natural de HNF-4\alpha tiene una secuencia mostrada en la SEC ID NUM: 78.

14. El método de la reivindicación 9, donde la secuencia del ácido nucleico que codifica HNF es comparada con una secuencia de ácido nucleico natural de HNF-1\beta.

15. El método de la reivindicación 14, donde la secuencia de ácido nucleico natural de HNF-1\beta tiene una secuencia mostrada en la SEC ID NUM: 128.

16. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF comprende al menos una mutación puntual.

17. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF tiene una mutación por translocación o una mutación por deleción, o una mutación por inserción.

18. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha y se produce una mutación en el exón 2, el exón 4, el exón 6, o el exón 9 del ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha.

19. El método de la reivindicación 1, donde se produce una mutación en el codón 131, 142, 159, 171, 289, 291, 292, 273, 379, 401, 447, 547, o 548 de un ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha que tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 1.

20. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha y se produce una mutación en el aceptor de empalme del intrón 5 o del intrón 9.

\newpage

21. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\alpha y la mutación es una mutación definida en la siguiente tabla:

\vskip1.000000\baselineskip

Localización Mutación/Localización Efecto Exón 1 R55G56fsdelGAGGG Desplazamiento del marco Exón 2 codón 122 Y\rightarrowC \hskip0,2cm codón 131 R\rightarrowQ \hskip0,2cm codón 142 S\rightarrowF \hskip0,2cm codón 159 R\rightarrowQ \hskip0,2cm codón 171 R\rightarrowX Exón 4 P291fsinsC Desplazamiento del marco P291fsdelC Desplazamiento del marco G292fsdelG Desplazamiento del marco Intrón 5 IVS5nt-2A\rightarrowG empalme anómalo Exón 6 P379fsdelCT Desplazamiento del marco P379fsinsC Desplazamiento del marco Q401fsdelC Desplazamiento del marco Exón 7 codón 447 P\rightarrowL Exón 9 T547E548fsdelTG Desplazamiento del marco Intrón 9 IVS9nt+1G\rightarrowA empalme anómalo

\vskip1.000000\baselineskip

22. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha y se produce una mutación en el exón 7 del ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha.

23. El método de la reivindicación 1, donde se produce una mutación en el codón 268, 130 o 273 de un ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha que tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 78.

24. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-4\alpha y la mutación es una mutación definida en la siguiente tabla:

\vskip1.000000\baselineskip

Localización Cambio de Nucleótido Exón Codón 4 130 ACT(Thr)-ATT(Ile) 7 273 GAT(Asp)-GAC(Asp) 7 268 GAG(Gln)-TAG(parada)

\vskip1.000000\baselineskip

25. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\beta y se produce una mutación en el exón 2, el exón 7 o el intrón 8 del ácido nucleico que codifica HNF-1\beta.

26. El método de la reivindicación 1, donde se produce una mutación en el codón 177, 463 en el nucleótido 48 del intrón 8, o en el nucleótido 22 del intrón 8 de un ácido nucleico que codifica HNF-1\beta que tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 128.

27. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica HNF es un ácido nucleico que codifica HNF-1\beta y la mutación es una mutación definida en la siguiente tabla:

Localización Nucleótido Sitio Codón Cambio A. HNF-1\beta Exón 2 177 CGA(Arg)\rightarrowTGA(OP) Exón 7 463 GCC(Ala)\rightarrowGCT(Ala) Intrón 8 nt48 inserción de C Intrón 8 nt-22 C\rightarrowT B. DCoH Exón 4 nt9306 A\rightarrowG

28. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de análisis del ácido nucleico que codifica HNF comprende PCR o un análisis de protección de la ARNasa, o un procedimiento RFLP.

29. El uso de polipéptidos HNF-1\alpha o moduladores de HNF-1\alpha, polipéptidos HNF-1\beta o moduladores de HNF-1\beta, o polipéptidos HNF-4\alpha o moduladores de HNF-4\alpha para preparar un medicamento para la regulación de la diabetes en un animal.

30. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende un polipéptido HNF1\alpha.

31. El uso de la reivindicación 30, donde el polipéptido HNF1\alpha es un polipéptido HNF1\alpha natural.

32. El uso de la reivindicación 30, donde el polipéptido HNF1\alpha natural tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 2.

33. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HNF1\alpha para preparar un medicamento para la regulación de la diabetes en un animal.

34. El uso de la reivindicación 30, donde dicho polipéptido HNF1\alpha es proporcionado para inyectarlo en el animal.

35. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende un modulador de la función de HNF1\alpha.

36. El uso de la reivindicación 35, donde el modulador de la función de HNF1\alpha es un agonista de HNF1\alpha.

37. El uso de la reivindicación 35, donde el modulador de la función de HNF1\alpha modula la transcripción o la traducción de un ácido nucleico que codifica HNF1\alpha.

38. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende el polipéptido HNF4\alpha.

39. El uso de la reivindicación 38, donde el polipéptido HNF4\alpha es un polipéptido HNF4\alpha natural.

40. El uso de la reivindicación 38, donde el polipéptido HNF4\alpha natural tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 79.

41. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HNF4\alpha para preparar un medicamento para la regulación de la diabetes en un animal.

42. El uso de la reivindicación 38, donde dicho polipéptido HNF4\alpha es proporcionado para inyectarlo en el animal.

43. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende un modulador de la función de HNF4\alpha.

44. El uso de la reivindicación 43, donde el modulador de la función de HNF4\alpha es un agonista de HNF4\alpha.

45. El uso de la reivindicación 43, donde el modulador de la función de HNF4\alpha modula la transcripción o la traducción de un ácido nucleico que codifica HNF4\alpha.

46. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende un polipéptido HNF1\beta.

47. El uso de la reivindicación 46, donde el polipéptido HNF1\beta es un polipéptido HNF1\beta natural.

48. El uso de la reivindicación 46, donde el polipéptido HNF1\beta natural tiene la secuencia de la SEC ID NUM: 129.

49. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HNF1\beta para preparar un medicamento para la regulación de la diabetes en un animal.

50. El uso de la reivindicación 46, donde dicho polipéptido HNF1\beta es proporcionado para inyectarlo en el animal.

51. El uso de la reivindicación 29, donde dicho medicamento comprende un modulador de la función de HNF1\beta.

52. El uso de la reivindicación 51, donde el modulador de la función de HNF1\beta es un agonista de HNF1\beta.

53. El uso de la reivindicación 51, donde el modulador de la función de HNF1\beta modula la transcripción o la traducción de un ácido nucleico que codifica HNF1\beta.

54. Un método para rastrear candidatos a fármacos antidiabéticos, que modulan la función de HNF que comprende las etapas de:

(a): obtener un polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha;

(b): determinar un perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha;

(c): poner en contacto el polipéptido HNF1\alpha, HNF1\beta o HNF4\alpha con una sustancia candidato; y

(d): analizar el cambio en el perfil de actividad normalizada

(e): identificar los candidatos que ocasionan el cambio de (d) en el perfil de actividad normalizada.

55. El método de la reivindicación 54, donde el perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF1\alpha es determinado midiendo la unión del polipéptido HNF1\alpha a un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 9.

56. El método de la reivindicación 55, donde el segmento polipeptídico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 2 comprende una marca detectable.

57. El método de la reivindicación 54, donde el polipéptido HNF1\alpha comprende una marca detectable.

58. El método de la reivindicación 54, donde el perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF1\alpha es determinado determinando la capacidad del polipéptido HNF1\alpha para estimular la transcripción de un gen indicador, situado el gen indicador operativamente bajo el control de un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 1.

59. El método de la reivindicación 54, donde el perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF4\alpha es determinado midiendo la unión del polipéptido HNF4\alpha a un segmento de aminoácidos que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 85.

60. El método de la reivindicación 59, donde el segmento polipeptídico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM. 79 comprende una marca detectable.

61. El método de la reivindicación 54, donde el polipéptido HNF4\alpha comprende una marca detectable.

62. El método de la reivindicación 54, donde el perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF4\alpha es determinado determinando la capacidad del polipéptido HNF4\alpha para estimular la transcripción de un gen indicador, situado el gen indicador operativamente bajo el control de un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 78.

63. El método de la reivindicación 54, donde el polipéptido HNF1\beta comprende una marca detectable.

64. El método de la reivindicación 63, donde el perfil de actividad normalizada del polipéptido HNF1\beta es determinado determinando la capacidad del polipéptido HNF1\beta para estimular la transcripción de un gen indicador, situado el gen indicador operativamente bajo el control de un segmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NUM: 128.