ES2300453T3 - Enfermadad de paget de los huesos. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una condición asociada con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende ensayar una muestra para descubrir (a) un ácido nucleico que codifica la proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ. ID NO. :3 o un fragmento de la misma; o (b) una proteína que tiene la secuencia mostrada en SEQ. ID NO.: 4 o un fragmento de la misma.

Description

Enfermedad de Paget de los huesos.

Campo técnico

El presente invento se refiere a métodos y materiales destinados a detectar un gen humano situado junto al locus (lugar) PDB3 en el cromosoma 5q35: la proteína p62 que interactúa con la proteína cinasa C atípica / secuestrosoma 1 (p62/SQSTM1), algunas de cuyas mutantes causan la enfermedad de Paget de los huesos. El invento se refiere también a métodos terapéuticos para tratar la enfermedad de Paget de los huesos.

Antecedentes del invento

La enfermedad de Paget de los huesos (Mendelian Inheritance in Man [Herencia mendeliana en seres humanos] MIM 167250) es un trastorno óseo metabólico progresivo monostótico localizado (solamente es afectado un sitio) o poliostótico (son afectados varios sitios). La enfermedad está caracterizada por un proceso aumentado de remodelación en el que una resorción anormal de huesos permanece acoplada a una nueva formación osteoblástica de huesos. El proceso es iniciado por unos aumentos en la resorción ósea mediada por osteoclastos, con subsiguientes aumentos compensatorios en la formación de nuevos huesos, dando como resultado un mosaico desorganizado de huesos entretejidos y laminares junto a los sitios afectados. Este cambio estructural produce un hueso que está expandido en su tamaño, es menos compacto, más vascular, y más susceptible a sufrir una deformidad o una fractura que lo que es normal (Siris y Canfield 1990).

Los signos y síntomas clínicos variarán de un paciente al siguiente dependiendo del número y de la situación de los sitios afectados en el esqueleto, así como de la rapidez del recambio óseo anormal. Se cree que la mayor parte de los pacientes carecen de síntomas (es decir, son asintomáticos) pero aproximadamente un 5% de los pacientes pagéticos presentan unos síntomas que requieren un tratamiento (Kanis 1998). Las quejas más frecuentes son dolor, ensanchamiento y deformidades en los huesos (Kanis 1998). Otras manifestaciones de la enfermedad incluyen una susceptibilidad aumentada a sufrir fracturas, sordera y complicaciones neurológicas causadas en la mayor parte de los casos por una compresión de los tejidos neurales adyacentes a un hueso pagético, así como una susceptibilidad aumentada a sufrir osteosarcomas (Hamdy 1995).

La enfermedad de Paget de los huesos aparece usualmente después de los 40 años de edad (Klein y Norman 1995) y afecta principalmente al esqueleto axial. En los países occidentales, la enfermedad de Paget de los huesos es el segundo trastorno óseo metabólico más corriente después de la osteoporosis. En los Estados Unidos de América, el trastorno tiene una frecuencia estimada de 1 - 3% en la población con una edad superior a los 40 y de 8 -10% para los que tienen una edad superior a los 80 años (Siris y Canfield 1990).

La etiología de la enfermedad de Paget de los huesos sigue siendo desconocida. Sin embargo, hay una evidencia apremiante de que ciertos factores genéticos desempeñan un cometido principal en la etiología del trastorno. La enfermedad es sumamente común en Europa Occidental (Detheridge y colaboradores 1983), América del Norte (Rosenbaum y Hanson 1969; Guyer y Chamberlain 1980), Australia (Barker 1984) y Nueva Zelanda (Reasbeck y colaboradores 1983) presentándose la predominancia más alta en el Reino Unido, particularmente en el Lancashire (predominancia > 6,3%) (Barker y colaboradores 1980). El riesgo familiar de sufrir la enfermedad de Paget de los huesos ha sido evaluado por varios autores. Sofaer y colaboradores observaron una predominancia aumentada en diez veces entre los padres y hermanos de sangre de pacientes en comparación con sus cónyuges (Sofaer y colaboradores 1983). En los Estados Unidos de América, Siris y colaboradores informaron además acerca un parentesco de primer grado afectado en un 12% de pacientes pagéticos y calcularon un riesgo aumentado en siete veces de desarrollar la enfermedad para los parientes de primer grado (Siris y colaboradores (1991). En España, Morales-Piga y colaboradores observaron que un 40% de sus casos de índice tenían por lo menos un familiar de primer grado afectado con la enfermedad de Paget de los huesos (Morales-Piga y colaboradores 1995). La agrupación en las familias de la enfermedad de Paget de los huesos se demostró también con frecuencia documentalmente (Sofaer y colaboradores 1983; Siris y colaboradores, 1991; Morales-Piga y colaboradores 1995; Haslam y colaboradores 1998; Hocking y colaboradores 2000). En los parentescos investigados hasta la fecha, la enfermedad de Paget de los huesos manifestó ser transmitida con un modo dominante autosómico de herencia con una penetrancia incom-
pleta.

Una evidencia sugerente de una vinculación fue informada por primera vez entre la enfermedad de Paget de los huesos y el locus de HLA junto a 6p (Fotino y colaboradores 1977; Tilyard y colaboradores 1982). Este locus potencial fue denominado PDB1 (MIM 167250). Sin embargo, ciertos estudios ulteriores no han confirmado la vinculación junto a este sitio (Breanndan Moore y Hoffman 1988; Nance y colaboradores 2000; Good y colaboradores 2001), sugiriendo que el cometido del locus de HLA puede ser de importancia secundaria en la etiología de la enfermedad de Paget de los huesos.

Un trastorno óseo raro, la osteólisis expansiva familiar [del inglés familial expansile osteolysis = FEO (MIM #174810)], ha sido cartografiado en el cromosoma 18q21-q22 (Hughes y colaboradores 1994). Usando un enfoque de locus candidato y una gran familia pagética, Cody y colaboradores informaron de una evidencia de vinculación entre la enfermedad de Paget de los huesos y la misma región 18q con una calificación LOD de 3,40 junto al D18S42 (Cody y colaboradores 1997). Este locus fue denominado PDB2 (MIM 602080). Estos autores propusieron que el (o los) gen(es) responsables de la FEO y de la enfermedad de Paget de los huesos, o bien estaban íntimamente vinculados o eran variantes alélicas del mismo gen mutante. Subsiguientemente, Haslam y colaboradores confirmaron la vinculación con el 18q en cinco familias pagéticas y observaron una heterogeneidad genética en otros tres parentescos (Haslam y colaboradores 1998). Unos estudios más recientes confirmaron una heterogeneidad genética del trastorno y sugirieron que la vinculación de la enfermedad de Paget junto al 8q21-q22 era relativamente poco corriente (Hocking y colaboradores 2000; Nance y colaboradores 2000; Good y colaboradores 2001).

Recientemente, el gen de la enfermedad FEO ha sido identificado como el gen TNFRSF11A (MIM 603499) que codifica el RANK, que es el receptor activador del factor nuclear-\kappaB (Hughes y colaboradores 2000). La misma inserción heterocigótica (84dup18) fue detectada en el exón 1 del TNFRSF11A en tres familias con la FEO o casos relacionados con la FEO. Una genealogía de origen japonés con una enfermedad de Paget atípica en los huesos llevaba también una inserción de 27 pb [= pares de bases] (75dup27) en el gen TNFRSF11A. Sus síntomas poco corrientes incluían una iniciación temprana y problemas dentales, sugiriendo que estos pacientes pueden sufrir de una forma más suave de la FEO o una forma particular con iniciación temprana de la enfermedad de Paget de los huesos (Leach y colaboradores 2001). No se han observado todavía mutaciones del RANK para ciertos pacientes que manifiestan casos típicos de la enfermedad de Paget de los huesos (Hughes et al. 2000; Sparks y colaboradores 2001). Estas observaciones muestran que el o los gen(es) que causa(n) la forma típica de la enfermedad de Paget de los huesos sigue(n) pendiente(s) de ser caracterizado(s).

Sumario del invento

El presente invento se refiere a métodos y materiales usados para aislar y detectar un gen humano situado junto al locus PDB3, que causa la enfermedad de Paget de los huesos. El gen codifica la proteína p62 que interactúa con la proteína cinasa C atípica, que también es denominada secuestrosoma (en inglés sequestosome) 1 (SQSTM1), algunos de cuyos alelos causan la enfermedad de Paget de los huesos. Más específicamente, el presente invento se refiere a mutaciones del linaje germinal en la proteína p62 que interactúa con la proteína cinasa C atípica/secuestrosoma 1 (p62/SQ5TM1) y a su uso en el diagnóstico de, y de la predisposición a, la enfermedad de Paget de los huesos. El invento se refiere también a la terapia presintomática de individuos que llevan alelos perjudiciales del gen de p62/SQSTM1. El invento se refiere también a la terapia de la enfermedad de Paget de los huesos de individuos que tienen mutaciones en el gen de p62/SQSTM1 (incluyendo a la terapia génica, a la terapia por reemplazo de proteínas, a compuestos miméticos e inhibidores de proteínas, a la interferencia y el antisentido de ARN). El invento se refiere también a la terapia presintomática de individuos que llevan alelos perjudiciales del gen de p62/SQSTM1. El invento se refiere además al escrutinio de fármacos para la enfermedad de Paget de los huesos. Finalmente, el invento se refiere al escrutinio del gen de p62/SQSTM1 para descubrir mutaciones, que sean útiles para diagnosticar la enfermedad de Paget de los huesos.

Correspondientemente, el presente invento proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia que codifica una proteína que interactúa con la proteína cinasa C atípica, que tiene un peso molecular de aproximadamente 62 kD (una forma mutada de p62/SQSTM1) que es de carácter diagnóstico de una enfermedad de los huesos. La molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, en la que el fragmento comprende la posición de aminoácido 392. En una forma de realización preferida, la molécula aislada de ácido nucleico codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, que es de carácter diagnóstico de la enfermedad de Paget de los huesos.

En otra forma de realización, el invento proporciona una proteína aislada que interactúa con la proteína cinasa C atípica, que tiene un peso molecular de aproximadamente 62 kD (una forma mutada de p62/SQSTM1) que es de carácter diagnóstico de una enfermedad de los huesos. La proteína tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, en la que el fragmento comprende la posición de aminoácido 392. En una forma de realización preferida, la proteína es una forma mutada de la p62/SQSTM1, que es de carácter diagnóstico de la enfermedad de Paget de los huesos.

En una forma de realización adicional, el invento proporciona un método para identificar sustancias que se pueden fijar con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende las operaciones de:

(a) incubar una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, y un substrato de ensayo, en unas condiciones que permiten la formación de un complejo entre la proteína p62/SQSTM1 y la sustancia de ensayo, y

(b) ensayar para descubrir complejos de la proteína p62/SQSTM1 mutada y de una sustancia de ensayo, para descubrir una sustancia libre o para descubrir una proteína p62/SQSTM1 mutada que no ha formado ningún complejo, en que la presencia de complejos indica que la sustancia de ensayo es capaz de fijarse a la proteína p62/SQSTM1 mutada.

El invento proporciona también métodos para identificar a un compuesto que afecta a la actividad o a la expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende:

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(a) incubar un compuesto de ensayo con una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, o un ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, teniendo el ácido nucleico la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; y

(b) determinar una cantidad de actividad o expresión de una proteína p62/SQSTM1 mutada y compararla con un testigo, en que un cambio en la actividad o expresión de una proteína p62/SQSTM1 mutada, en comparación con el testigo, indica que el compuesto de ensayo tiene un efecto sobre la actividad o expresión de una proteína p62/SQSTM1 mutada.

En otra forma de realización, el invento proporciona un método para detectar una condición asociada con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende ensayar una muestra con el fin de descubrir (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, o un fragmento de la misma, o (b) una proteína p62/SQSTM1 mutada, que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma.

Se describe también un método para tratar una enfermedad ósea, que comprende la administración a una célula, o a un animal que necesita de ella, una cantidad efectiva de un agente que modula la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1. El invento proporciona también un uso de una cantidad efectiva de un agente que modula la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1 para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad ósea. En una forma preferida de realización, la enfermedad ósea es la enfermedad de Paget de los huesos.

Todavía en otra forma de realización, el invento proporciona un animal no humano que lleva una mutación en el gen que codifica una proteína p62/SQSTM1, que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4, y que corresponde a un residuo P392L humano, en que el animal es un modelo para una enfermedad ósea.

Otras particularidades y ventajas del presente invento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Deberá entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican formas preferidas de realización del invento, se dan solamente a título ilustrativo, puesto que diversos cambios y diversas modificaciones situados/as dentro del espíritu y alcance del invento resultarán evidentes a los expertos en la especialidad a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Se describen ciertas formas de realización del invento, haciéndose referencia a los dibujos anejos, en los que:

La Figura 1 es un diagrama que muestra el orden de marcadores genéticos junto al locus PDB3 vecino del gen de p62/SQSTM1, un mapa esquemático de BAC's [de Bacterial Artificial Chromosomes = cromosomas artificiales de bacterias] que franquean el locus de PDB3, y muestra también la situación del gen de p62/SQSTM1 dentro del intervalo definido genéticamente. La Figura 1 muestra también la unidad de transcripción de p62/SQSTM1, que muestra la situación de los exones de p62/SQSTM1 con relación a un cóntigo [en inglés contig] de BAC que se construyó "in silico" [es decir en un ambiente de simulación visual tridimensional]. Los exones individuales están numerados, y estos números corresponden a las secuencias mostradas en la Figura 4.

La Figura 2 es un diagrama que muestra la segregación de la mutación que cambia el aminoácido Pro por el Leu en la posición de aminoácido 392 en la secuencia que codifica la proteína p62/SQSTM1 dentro de una gran familia afectada por la enfermedad de Paget de los huesos.

La Figura 3 es un diagrama que muestra la secuencia de ADNc de una p62/SQSTM1 mutada. La Figura describe la posición de la mutación que causa la enfermedad de Paget de los huesos.

La Figura 4 es un diagrama que muestra una parte de la secuencia genómica del gen de p62/SQSTM1, que incluye una secuencia completa de los ocho exones así como las secuencias de los linderos entre intrones y exones. Las secuencias de los cebadores usados para secuenciar los exones se proporcionan en las Tablas 1 y 2. La Tabla 1 muestra la secuencia de cebadores de marcadores microsatélites, usados para tipificar genómicamente en el intervalo de localización de la p62/SQSTM1. La Tabla 2 muestra las secuencias de cebadores diseñados en los intrones del gen de p62/SQSTM1 para secuenciar al gen de p62/SQSTM1.

Descripción detallada del invento

Los autores del invento realizaron unos análisis de vinculaciones genéticas en 24 grandes familias del Canadá francófono (479 individuos), en las que la enfermedad de Paget de los huesos se segregaba como un rasgo dominante autosómico. Después de haber excluido al PDB2, se realizó una exploración a lo largo de todo el genoma sobre los tres núcleos familiares más informativos que incluían 44 individuos. Unas calificaciones de probabilidad relativa total LOD (de números impares logarítmicos) [en inglés Logarithmiic Odd Scores] mayores que 1,0 se observaron en siete situaciones en el genoma humano. Luego, las 24 familias se usaron para detectar una fuerte evidencia de una vinculación junto al cromosoma 5q35-qter. Mediando heterogeneidad, un valor máximo de calificación de LOD de 8,58 se obtuvo junto al D5S2073 con \theta = 0,1. El mismo haplotipo característico era llevado por todos los pacientes en ocho familias, sugiriendo un efecto de fundador. Un suceso de recombinación en una familia clave confinaba la región de enfermedad dentro de un intervalo de 6 cM entre el D5S469 y el telómero. Las otras 16 familias, que tenían una muy baja probabilidad condicional de vinculación junto al 5q35-qter, se usaron adicionalmente para cartografiar un segundo locus junto al 5q31. Mediando heterogeneidad, se detectó un valor máximo de calificación de LOD de 3,70 junto al D5S500 con \theta = 0,00. Los sucesos de recombinación refinaron la región del 5q31 dentro de 11,7 cM entre el D5S642 y el D5S1972. Estas observaciones demostraron por lo tanto el cartografiado de dos nuevos loci (lugares) para la enfermedad de Paget de los huesos y proporcionaron una evidencia adicional de su heterogeneidad genética. Los loci de 5q35-qter y de 5q31 han sido denominados PDB3 y PDB4, respectivamente.

Los inventores escrutaron además muchos genes junto al locus PDB3 para descubrir su implicación en la enfermedad de Paget de los huesos. Entre los muchos genes que fueron escrutados para descubrir una mutación, uno de estos genes era el de la proteína p62 que interactúa con la proteína cinasa C atípica (p62), también conocida como secuestrosoma 1 (SQSTM1). Una variación de nucleótidos en la posición de nucleótido 1215 de gen de p62/SQSTM1, que cambia el aminoácido Pro por el Leu en la posición de aminoácido 392 (Pro392Leu), se detectó en 11 parentescos de los recursos familiares. Este cambio no conservativo flanquea al dominio asociado con la ubiquitina (ubiquitin-associated domain = UBA) (posiciones 394-440) de la proteína. Se encontró que está variación se segregaba con el trastorno en estas familias. La secuenciación de los 112 casos esporádicos reveló que 18 pacientes llevaban también la variación. La secuenciación de 86 cónyuges no afectados y de 205 individuos de la población general no revela ningún cambio en la secuencia de la p62/SQSTM1 de tipo salvaje. Estos datos demuestran por lo tanto que la variación de C a T en la posición 1215 del gen de p62/SQSTM1 es, de hecho, una mutación que causa la enfermedad de Paget de los huesos.

El gen de p62/SQSTM1 fue identificado en 1995 (PNAS 92: 12338 (1995)). La p62/SQSTM1 fue descrita originalmente como una fosfoproteína de 62 kilodalton (kD) que interactuaba con la p56lck. Se mostró que la proteína estaba situada dentro del citosol y se fijaba a ubiquitina. La p62/SQSTM1 interactúa con varias moléculas de transducción de señales, que incluyen a la tirosina cinasa p56lck y a la proteína cinasa C-zeta atípica. Unos recientes experimentos mostraron que la p62/SQSTM1 actúa como un punto de convergencia de las trayectorias de señalización de la IL-1 y del TNFalfa. Una interacción entre la p62/SQSTM1 con la RIP vincula a las proteínas cinasas C atípicas con la activación de NF-kappa B (NF\kappaB) por medio de la trayectoria de señalización del TNFalfa. Desde luego, unas recientes evidencias sugieren que la p62/SQSTM1 interactúa selectivamente con TRAF6 y con RIP y es un compuesto intermedio importante en la señalización de interleucina-1 (IL-1) y del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) que señala hacia la activación de NF\kappaB (Sanz y colaboradores 1999; Sanz y colaboradores 2000). La importancia funcional de una p62/SQSTM1 en la activación de NF\kappaB ha sido subrayada por la observación de que su agotamiento anula gravemente la activación de NF\kappaB tanto por el TNF\alpha como por la IL-1 (Sanz y colaboradores 2000).

La secuencia de p62/SQSTM1 fue depositada en el banco de genes GenBank el 1 de Noviembre de 2000 bajo el número de acceso GI 4505570. Esta secuencia fue reemplazada el 4 de Abril de 2002 por el número de acceso GI 19923742. Las diferencias entre las dos secuencias se encontraban en las regiones no traducidas en 5' y 3', y la secuencia de la proteína p62/SQSTM1 es la misma. En la presente solicitud, la secuencia de p62/SQSTM1 de tipo salvaje procede del número de acceso GI 19923742. mientras que en la solicitud prioritaria (solicitud provisional de patente de los EE.UU. número de serie 60/308.135, presentada el 30 de Julio de 2001), la secuencia 62 de tipo salvaje procedía del número de acceso GI 4505570. Como un resultado de la secuencia corregida en la presente solicitud, la posición de nucleótido (nt) de la mutación asociada con la enfermedad de Paget se cambió desde el nt 1227 al nt 1215. La posición del cambio de aminoácidos (posición 392) estaba inalterada. La secuencia de la mutación tanto en la secuencia de nucleótidos (C \rightarrow T) como en la secuencia de aminoácidos (Pro \rightarrow Leu) sigue siendo la misma.

I. Moléculas de ácidos nucleicos del invento

Se describe aquí una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia que codifica una proteína que interactúa con una proteína cinasa C atípica, que tiene un peso molecular de aproximadamente 62 kD. Esta proteína es citada aquí generalmente como "p62/SQSTM1": Los términos "p62/SQSTM1", "p62" y "secuestrosoma 1" (o SQSTM1) son sinónimos y se pueden usar intercambiablemente en la presente solicitud (el número de acceso al GenBank GI 19923742; el número de MIM: 601530; y el PubMed ID: 8650207).

El invento incluye unas formas mutadas de una p62/SQSTM1, asociadas con la enfermedad de Paget o con cualquier enfermedad ósea, en la que la forma mutada tiene una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ.ID.NO.:3. La secuencia mostrada en SEQ.ID.NO.:3 difiere de la SEQ.ID.NO.:1 (la secuencia de p62/SQSTM1 de tipo salvaje) en el hecho de que hay un T en lugar de un C en la posición 1215.

El término "aislado" se refiere a un ácido nucleico sustancialmente exento de material celular o de medio de cultivo, cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o a compuestos precursores químicos, o a otros productos químicos cuando se sintetiza por vía química. Se pretende que el término "ácido nucleico" incluya un ADN y un ARN y puede ser o bien bicatenario o monocatenario.

En una forma de realización del invento, se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica una p62/SQSTM1, que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ.ID.NO.:4.

En una forma preferida de realización, el invento proporciona una secuencia de ácido nucleico aislado, que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ.ID.NO.:3, en que el T puede también ser U;

(b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con una secuencia de ácido nucleico de (a);

(c) una secuencia de ácido nucleico que tiene una homología sustancial de secuencias con una secuencia de ácido nucleico de (a) o (b);

(d) una secuencia de ácido nucleico que es una análoga a una secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c); o

(e) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) en condiciones rigurosas de hibridación.

La expresión "secuencia que tiene una homología sustancial de secuencias" significa aquellas secuencias de ácido nucleico que tienen variaciones de secuencias ligeras o de poca importancia con respecto de las secuencias en (a) o (b), es decir que las secuencias actúan sustancialmente de la misma manera y se pueden usar para detectar, estudiar o tratar la enfermedad de Paget de los huesos. Las variaciones pueden ser atribuibles a mutaciones locales o a modificaciones estructurales. Las secuencias de ácidos nucleicos que tienen una homología sustancial incluyen unas secuencias de ácidos nucleicos que tienen una identidad de por lo menos 65%, más preferiblemente de por lo menos 85%, y de modo sumamente preferible de 90 - 95% con las secuencias de ácidos nucleicos que se muestran en SEQ.ID.NO.:1 o SEQ.ID.NO.:3.

La expresión "secuencia que se hibrida" significa una secuencia de ácido nucleico que se puede hibridar con una secuencia de (a), (b), (c) o (d) en condiciones rigurosas de hibridación. Unas apropiadas "condiciones rigurosas de hibridación" que favorecen una hibridación de ADN's son conocidas para los expertos en la especialidad, o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular), John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, se pueden emplear las siguientes: 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (= SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por un lavado con 2,0 x SSC a 50ºC; con 0,2 x SSC a 50ºC hasta 65ºC; o con 2,0 x SSC a 44ºC hasta 50ºC. La rigurosidad se puede seleccionar basándose en las condiciones usadas en la operación de lavado. Por ejemplo, la concentración de una sal en la operación de lavado se puede seleccionar entre una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la operación de lavado puede ser, en condiciones de alta rigurosidad, de aproximadamente 65ºC.

La expresión "una secuencia de ácido nucleico que es una análoga" significa una secuencia de ácido nucleico que ha sido modificada en comparación con la secuencia de (a), (b) o (c), en que la modificación no altera a la utilidad de la secuencia que se ha descrito aquí. La secuencia modificada, o una análoga, puede tener propiedades mejoradas con respecto a la secuencia mostrada en (a), (b), o (c). Un ejemplo de una modificación para preparar una secuencia análoga consiste en reemplazar una de las bases presentes por naturaleza (es decir adenina, guanina, citosina o timidina) de la secuencia mostrada en SEQ.ID.NO.:1 o 3, por una base modificada tal como xantina, hipoxantina, 2-amino adenina, 6-metil, 2-propil y otras alquil adeninas, 5-halo uracilo, 5-halo citosina, 6-aza uracilo, 6-aza citosina y 6-aza timina, pseudo uracilo, 4-tio uracilo, 8-halo adenina, 8-amino adenina, 8-tiol adenina, 8-tiolalquil adeninas, 8-hidroxil adenina y otras adeninas sustituidas en posición 8, 8-halo guaninas, 8-amino guaninas, 8-tiol guanina, 8-tiolalquil guaninas, 8-hidroxil guanina y otras guaninas sustituidas en posición 8, otros/as aza y desaza uracilos, timidinas, citosinas, adeninas o guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluoro citosina.

Otro ejemplo de una modificación consiste en incluir heteroátomos de fósforo u oxígeno modificados en el entramado de fosfato, enlaces entre azúcares del tipo de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, o enlaces entre azúcares del tipo heteroatómico de cadena corta o heterocíclico en la molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ.ID.NO.:1 o SEQ.ID.NO.:3. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos pueden contener fosforotioatos, fosfotriésteres, metil fosfonatos y fosforoditioatos.

Un ejemplo adicional de un compuesto análogo a una molécula de ácido nucleico del invento, es un ácido nucleico peptídico (ANP) en el que el entramado de desoxirribosa (o de ribosa) fosfato en el ADN (o en el ARN), es reemplazado por un entramado de poliamida que es similar al que se encuentra en péptidos (P.E. Nielsen, y colaboradores Science 1991, 254, 1497). Se ha mostrado que ciertos compuestos análogos a APN son resistentes a la degradación por enzimas y que tienen unas vidas "in vivo" e "in vitro" prolongadas. Los ANP's se fijan también más fuertemente a una secuencia de ADN complementaria, debido a la falta de repulsión de cargas entre la cadena de APN y la cadena de ADN. Otros compuestos análogos a ácidos nucleicos pueden contener unos nucleótidos que contengan entramados poliméricos, entramados cíclicos, o entramados acíclicos. Por ejemplo, los nucleótidos pueden tener estructuras de entramados morfolínicos (patente de los EE.UU. nº 5.034.506). Los compuestos análogos pueden contener también grupos tales como grupos reporteros, o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de una secuencia de ácido nucleico.

Se apreciará que el invento incluye moléculas de ácidos nucleicos que codifican truncamientos de proteínas del invento, y compuestos análogos a, y homólogos de, proteínas del invento y truncamientos de las mismas, tal como se describen más adelante. Se apreciará además que están abarcadas por este invento unas formas variantes de moléculas de ácidos nucleicos del invento que surgen por empalme alternativo de un ARNm (mensajero) que corresponde a un ADNc (cromosomal) del invento.

Ciertas moléculas de ácidos nucleicos aisladas y purificadas, que tienen unas secuencias que difieren de la secuencia de ácido nucleico del invento debido a una degeneración en el código genético, se encuentran también dentro del alcance del invento. Dichos ácidos nucleicos codifican unas proteínas funcionalmente equivalentes, pero difieren en su secuencia con respecto de las secuencias antes mencionadas debido a una degeneración en el código genético.

Una molécula aislada de ácido nucleico del invento, que comprende un ADN, puede ser aislada preparando una sonda de ácido nucleico marcado, que se basa en la totalidad o una parte de las secuencias de ácido nucleico del invento, y usando esta sonda de ácido nucleico marcado para escrutar una apropiada biblioteca de ADN (p.ej. una biblioteca de ADNc o de ADN genómico. Por ejemplo, una biblioteca genómica aislada se puede usar para aislar un ADN que codifica una nueva proteína del invento por escrutinio de la biblioteca con la sonda marcada, usando técnicas clásicas. Los ácidos nucleicos aislados por escrutinio de una biblioteca de ADNc o de ADN genómico se pueden secuenciar por técnicas clásicas.

Una molécula aislada de ácido nucleico del invento, que es un ADN, puede ser aislada también amplificando selectivamente un ácido nucleico que codifica una nueva proteína del invento usando los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (del inglés polymerase chain reaction, PCR) y un ADNc o ADN genómico. Es posible diseñar cebadores de oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia de ácido nucleico del invento para su uso en una PCR. Un ácido nucleico puede ser amplificado a partir de un ADNc o ADN genómico usando estos cebadores de oligonucleótidos, y unas clásicas técnicas de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado puede ser clonado dentro de un vector apropiado y caracterizado por un análisis de secuencias de ADN. Se apreciará que un ADNc se puede preparar a partir de un ARNm, aislando el ARNm celular total por una diversidad de técnicas, por ejemplo, usando el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin y colaboradores, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). Luego, el ADNc es sintetizado a partir del ARNm usando una transcriptasa inversa (por ejemplo, una transcriptasa inversa MLV de Moloney, disponible a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA, o una transcriptasa inversa AMV disponible a partir de Seikagaku América, Inc., St. Petersburg, FL).

Una molécula aislada de ácido nucleico del invento, que es un ARN, puede ser aislada clonando un ADNc que codifica una nueva proteína del invento dentro de un vector apropiado, que permite una transcripción del ADNc, para producir una molécula de ARN que codifica una proteína del invento. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado en la dirección secuencia debajo de un promotor de bacteriófago, (p.ej. un promotor de T7) en un vector, un ADNc puede ser transcrito "in vitro" con una polimerasa de T7, y el resultante ARN puede ser aislado por técnicas clásicas.

Una molécula de ácido nucleico del invento puede también ser sintetizada químicamente usando técnicas clásicas. Se conocen diversos métodos para sintetizar químicamente polidesoxinucleótidos, incluyendo una síntesis en fase sólida la cual, de un modo similar a la síntesis de péptidos, ha sido totalmente automatizada en aparatos sintetizadores de ADN comercialmente disponibles (véanse p.ej. la patente de los EE.UU. nº 4.598.049; de Itakura y colaboradores; la patente de los EE.UU. nº 4.458.066 de Caruthers y colaboradores; y las patentes de los EE.UU. nº^{s} 4.401.796 y 4,373,071 de Itakura).

La determinación de si una molécula de ácido nucleico particular codifica una nueva proteína del invento se puede conseguir expresando el ADNc en una célula hospedadora apropiada por técnicas clásicas, y ensayando la actividad de la proteína por uso de los métodos que aquí se describen. Un ADNc que tiene la actividad de una nueva proteína del invento, aislada de esta manera, se puede secuenciar por técnicas clásicas, tales como una terminación con una cadena de didesoxinucleótido o la secuenciación química de Maxam-Gilbert, para determinar la secuencia de ácido nucleico y la secuencia predicha de aminoácidos de la proteína codificada.

El codón de iniciación y las secuencias no traducidas de moléculas de ácidos nucleicos del invento se pueden determinar usando un programa lógico (software) de ordenador actualmente disponible, diseñado para esta finalidad, tal como el PC/Gene (de IntelliGenetics Inc., California). Unos elementos reguladores se pueden identificar usando técnicas convencionales. La función de los elementos se puede confirmar usando estos elementos para expresar un gen reportero, que está enlazado operativamente a los elementos. Estas construcciones artificiales se pueden introducir dentro de células cultivadas usando procedimientos clásicos. Además de para identificar unos elementos reguladores en un ADN, dichas construcciones artificiales se pueden usar también para identificar las proteínas que interactúan con los elementos, usando técnicas conocidas en la especialidad.

La secuencia de una molécula de ácido nucleico del invento puede ser invertida en relación con su presentación normal para una transcripción con el fin de producir una molécula de ácido nucleico antisentido, que se describe más plenamente en el presente texto. Preferiblemente, una secuencia antisentido es construida invirtiendo una región que precede al codón de iniciación o una región no conservada. En particular, las secuencias de ácidos nucleicos, contenidas en las moléculas de ácidos nucleicos del invento o un fragmento de las mismas, se pueden invertir con relación a su presentación normal para una transcripción con el fin de producir moléculas de ácidos nucleicos antisentido.

El invento proporciona también unos ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden una nueva proteína del invento y una proteína seleccionada, o una proteína marcadora seleccionable (véase más adelante).

Se proporcionan también unas porciones de la secuencia de ácido nucleico, que codifican fragmentos, dominios funcionales o determinantes antigénicos de la proteína p62/SQSTM1 o de una proteína p62/SQSTM1 mutada. El presente invento proporciona también el uso de ciertas porciones de la secuencia como sondas y como cebadores de la PCR para una p62/SQSTM1 y proteínas afines y asimismo para determinar ciertos aspectos funcionales de la secuencia.

Una persona con experiencia ordinaria en la especialidad está ahora capacitada para identificar y aislar genes o ADNc's de una p62/SQSTM1 que son variantes alélicas de la secuencia de p62/SQSTM1 descrita, usando técnicas clásicas de escrutinio por hibridación o de PCR.

II. Nuevas proteínas del invento

El invento considera además ampliamente una proteína aislada que interactúa con la proteína cinasa C atípica, que tiene un peso molecular de aproximadamente 62 kD. La proteína tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma que comprende la posición de aminoácido 392. También se describe una secuencia de p62/SQSTM1 aislada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 3 (SEQ.ID.NO.:2).

El invento incluye por lo tanto formas mutadas de una p62/SQSTM1 que son de carácter diagnóstico de la enfermedad de Paget de los huesos u otras enfermedades óseas. En una forma de realización, la p62/SQSTM1 mutada tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3 o en la SEQ.ID.NO.:4. La secuencia mostrada en SEQ.ID.NO.:4 difiere de la secuencia de tipo salvaje mostrada en SEQ.ID.NO.:2 en la posición de aminoácido 392, en la que la prolina del tipo salvaje se ha cambiado a leucina en la forma mutada.

Dentro del contexto del presente invento, una proteína del invento puede incluir diversas formas estructurales de la proteína primaria, que retienen una actividad biológica. Por ejemplo, una proteína del invento puede estar en la forma de sales de carácter ácido o básico o en una forma neutra. Además, ciertos residuos de aminoácidos individuales pueden ser modificados por oxidación o por reducción.

Además de la secuencia de aminoácidos de plena longitud, la proteína del presente invento puede incluir también fragmentos o truncamientos de la proteína, como se describen aquí con la condición de que ellos han de incluir la posición de aminoácido 392 mostrada en SEQ.ID.NO.:4. Las proteínas o los fragmentos truncadas/os pueden comprender unos péptidos de por lo menos 5, de manera preferible 10 y de manera más preferible 15 residuos de aminoácidos de la secuencia mostrada en SEQ.ID.NO.:4.

El invento proporciona además unos polipéptidos que comprenden por lo menos un dominio funcional o por lo menos un determinante antigénico de una proteína p62/SQSTM1 o de una proteína p62/SQSTM1 mutada. Estos fragmentos contienen la mutación de prolina a leucina en la posición 392. El fragmento de la proteína p62/SQSTM1 puede incluir también el dominio asociado con la ubiquitina en las posiciones de aminoácidos 394-440.

Se describen aquí unos compuestos análogos a la proteína y/o unos truncamientos de la misma, que pueden incluir, pero no se limitan a, una secuencia de aminoácidos que contienen una o más sustituciones, inserciones, supresiones (deleciones) y/o mutaciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de una naturaleza conservada o no conservada. Las sustituciones de aminoácidos conservadas implican reemplazar uno o más aminoácidos de las proteínas del invento por aminoácidos con una carga, un tamaño y/o unas características de hidrofobia similar(es). Cuando solamente se hacen sustituciones conservadas, el resultante compuesto análogo deberá ser equivalente funcionalmente. Las sustituciones no conservadas implican reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos por uno o más aminoácidos que poseen una carga, un tamaño y/o unas características de hidrofobia
diferente(s).

Se describen también una o más inserciones de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de la proteína. Las inserciones de aminoácidos pueden componerse de residuos de aminoácidos únicos o de aminoácidos secuenciales que varían entre 2 y 15 aminoácidos en cuanto a su longitud. Por ejemplo, se pueden usar ciertas inserciones de aminoácidos para destruir secuencias dianas, de manera tal que la proteína ya no sea activa. Este proceso se puede usar "in vivo" para inhibir la actividad de una proteína.

Las supresiones (deleciones) pueden consistir en la eliminación de uno o más aminoácidos, o de porciones discretas procedentes de la secuencia de aminoácidos de la proteína p62/SQSTM1. Los aminoácidos suprimidos pueden ser o no contiguos. La longitud límite inferior del compuesto análogo resultante con una mutación por supresión es de aproximadamente 10 aminoácidos, preferiblemente de 100 aminoácidos.

Los compuestos análogos a una proteína aquí descrita se pueden preparar introduciendo mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína.

Las mutaciones se pueden introducir en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que hacen posible la ligación a fragmentos de la secuencia natural. A continuación de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un compuesto análogo que tiene la deseada inserción, sustitución o supresión de aminoácidos.

Alternativamente, unos procedimientos de mutagénesis específica para un sitio, dirigida a un oligonucleótido, se pueden emplear para proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, la supresión o la inserción que se requiera. La supresión o el truncamiento de una proteína del invento se puede construir también utilizando convenientes sitios para endonucleasas de restricción adyacentes a la supresión deseada. Subsiguientemente a una restricción, unas partes colgantes sobresalientes pueden ser rellenas, y el ADN puede ser vuelto a ligar. Métodos ilustrativos para hacer las alteraciones arriba expuestas son descritos por Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, [Clonación molecular, un manual de laboratorio] 2ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

También se describen aquí unos compuestos homólogos de la secuencia de aminoácidos de la proteína p62/SQS
TM1, de la proteína p62/SQSTM1 mutada y/o de truncamientos de las mismas. Dichos compuestos homólogos son unas proteínas cuyas secuencias de aminoácidos se componen de secuencias de aminoácidos que se hibridan en condiciones rigurosas de hibridación (véase el debate sobre las condiciones rigurosas de hibridación en el presente contexto) con una sonda usada para obtener una proteína del invento. Los compuestos homólogos de dicha proteína tendrán las mismas regiones que son característica de la proteína.

Una proteína homóloga incluye una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de por lo menos 70%, de manera preferida de 80-95%, con la secuencia de aminoácidos de la proteína p62/SQSTM1 o de una proteína p62/SQSTM1 mutada.

El invento considera también ciertas isoformas de las proteínas del invento. Una isoforma contiene el mismo número y las mismas clases de aminoácidos que una proteína del invento, pero la isoforma tiene una diferente estructura molecular. Las isoformas consideradas por el presente invento son las que tienen las mismas propiedades que una proteína del invento, tal como se describe aquí.

El presente invento incluye también una proteína del invento, que está conjugada con una proteína seleccionada, o una proteína marcadora seleccionable para producir proteínas de fusión. Por ejemplo, la secuencia de ADNc de una p62/SQSTM1 es introducida dentro de un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica otro péptido (p.ej. la GST - glutatión succinil transferasa). La proteína de fusión es expresada y recuperada a partir de células procarióticas (p.ej. de bacterias o baculovirus) o células eucarióticas. La proteína de fusión puede luego ser purificada mediante una cromatografía de afinidad basada en la secuencia del vector de fusión y en la proteína p62/SQSTM1 obtenida por disociación enzimática de la proteína de fusión.

Las proteínas del invento (que incluyen truncamientos, etc) se pueden preparar usando métodos de ADN recombinante. Correspondientemente, unas moléculas de ácidos nucleicos del presente invento, que tienen una secuencia que codifica una proteína del invento, se pueden incorporar, de acuerdo con procedimientos conocidos en la especialidad, dentro de un apropiado vector de expresión que asegura una buena expresión de la proteína. Posibles vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados (p.ej. retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), siempre y cuando que el vector sea compatible con la célula hospedadora usada. La expresión "vectores apropiados para la transformación de una célula hospedadora" significa que los vectores de expresión contienen una molécula de ácido nucleico del invento y secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras que se han de usar para la expresión, que están enlazadas operativamente con la molécula de ácido nucleico. Se pretende que la expresión "enlazada operativamente" signifique que el ácido nucleico está enlazado a unas secuencias reguladoras de una manera que permite una expresión del ácido nucleico.

El invento considera por lo tanto un vector de expresión recombinante del invento, que contiene una molécula de ácido nucleico del invento, o un fragmento de la misma, y las necesarias secuencias reguladoras para la transcripción y la traducción de la secuencia de proteína introducida. Apropiadas secuencias reguladoras se pueden derivar de una diversidad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos o víricos (por ejemplo, véanse las secuencias reguladoras descritas en la obra de Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology [Tecnología de expresión de genes: métodos en enzimología] 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). La selección de apropiadas secuencias reguladoras es dependiente de la célula hospedadora escogida, y se puede realizar con facilidad por una persona que tenga experiencia ordinaria en la especialidad. Ejemplos de dichas secuencias reguladoras incluyen: un promotor e intensificador de la transcripción o una secuencia de fijación a una polimerasa de ARN, una secuencia de fijación a ribosomas, que incluye una señal de iniciación de la traducción. Adicionalmente, dependiendo de la célula hospedadora escogida y del vector empleado, otras secuencias, tales como un origen de replicación, adicionales sitios de restricción de ADN, intensificadores, y secuencias que confieren una capacidad de inducción de la transcripción, se pueden incorporar dentro del vector de expresión. Se apreciará también que las necesarias secuencias reguladoras pueden ser suministradas por la proteína natural y/o sus regiones flanqueadoras.

El invento proporciona además un vector de expresión recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico de ADN del invento, clonada dentro del vector de expresión en una orientación antisentido. Esto es, que la molécula de ADN está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite una expresión, por transcripción de la molécula de ADN, de una molécula de ARN que es antisentido con respecto a una secuencia de nucleótidos del invento. Se pueden escoger unas secuencias reguladoras enlazadas operativamente al ácido nucleico antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido.

Los vectores de expresión recombinantes del invento pueden contener también un gen marcador seleccionable, que facilita la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas con una molécula recombinante del invento. Ejemplos de genes marcadores seleccionables son unos genes que codifican una proteína tal como la G418 y la higromicina, que confiere resistencia a ciertos fármacos, \beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. La transcripción del gen marcador seleccionable es vigilada por cambios en la concentración de la proteína marcadora seleccionable, tal como \beta-galactosidasa cloramfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. Si el gen marcador seleccionable codifica una proteína que confiere una resistencia a antibióticos, tal como una resistencia a neomicina, se pueden seleccionar con G418 células transformantes. Las células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán. Esto hace posible visualizar y ensayar para descubrir una expresión de vectores de expresión recombinantes del invento, y en particular para determinar el efecto de una mutación sobre la expresión y el fenotipo. Se apreciará que se pueden introducir marcadores seleccionables en un vector separado con respecto del ácido nucleico que interesa.

Los vectores de expresión recombinantes pueden contener también unos genes que codifican un resto de fusión, que proporciona una expresión aumentada de la proteína recombinante; una solubilidad aumentada de la proteína recombinante; y que ayuda en la purificación de una proteína recombinante diana por actuación como un ligando en una purificación por afinidad. Por ejemplo, un sitio de disociación proteolítica puede ser añadido a la proteína recombinante diana, pera permitir una separación de la proteína recombinante con respecto del resto de fusión, posteriormente a la purificación de la proteína de la fusión.

Unos vectores de expresión recombinantes se pueden introducir en células hospedadoras para producir una célula hospedadora transformada. Correspondientemente, el invento incluye una célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante del invento. Se pretende que la expresión "célula hospedadora transformada" incluya a células procarióticas y eucarióticas, que han sido transformadas o transfectadas con un vector de expresión recombinante del invento. Los términos "transformadas con", "transfectadas con", "transformación" y "transfección" están destinados a abarcar una introducción de un ácido nucleico (p.ej. un vector) dentro de una célula por una de las muchas técnicas posibles que se conocen en la especialidad. Las células procarióticas pueden ser transformadas con un ácido nucleico, por ejemplo, por una electroporación o por una transformación mediada con cloruro de calcio. El ácido nucleico se puede introducir en células de mamíferos a través de técnicas convencionales, tales como una precipitación concomitante con fosfato de calcio o con cloruro de calcio, una transfección mediada con DEAE-dextrano, uso de una lipofectina, una electroporación o una microinyección. Apropiados métodos para transformar y transfectar células hospedadoras pueden encontrarse en la obra de Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), y otros de los referidos manuales de laboratorio.

Las apropiadas células hospedadoras incluyen una amplia diversidad de células hospedadoras procarióticas y eucarióticas. Por ejemplo, las proteínas del invento pueden ser expresadas en el seno de células bacterianas tales como E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtillus, células de insectos (usando baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Otras apropiadas células hospedadoras pueden encontrarse en la obra de Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

Como un ejemplo, para producir por vía recombinante proteínas p62/SQSTM1, se puede usar una E. coli usando el sistema de polimerasa de ARN de T7 y promotor, usando dos plásmidos o por marcación de proteínas codificadas por plásmidos, o mediante una expresión por infección con el Fago de M13 mGPl-2. Se pueden usar también unos vectores de E. coli con secuencias reguladoras del Fago lambda, mediante vectores de proteínas de fusión (p.ej. lacZ y trpE), por fusiones con proteínas que se fijan a maltosa, y por proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa.

Alternativamente, la proteína p62/SQSTM1 puede ser expresada en células de insectos usando vectores de baculovirus, o en células de mamíferos usando virus de vaccinia. Para la expresión en células de mamíferos, la secuencia de ADNc puede ser ligada a promotores heterólogos, tales como el promotor de virus de simio (SV40) en el vector pSV2, y puede ser introducida en células, tales como células COS para conseguir una expresión transitoria o a largo plazo. La integración estable de la construcción artificial del gen quimérico se puede mantener en células de mamíferos mediante una selección bioquímica, tal como con neomicina y ácido micofoenólico.

La secuencia de ADN de una p62/SQSTM1 puede ser alterada usando procedimientos tales como una digestión con enzimas de restricción, un relleno con una polimerasa de ADN, una supresión mediante una exonucleasa, una prolongación mediante una transferasa de desoxinucleótido terminal, una ligación de secuencias de ADN sintéticas o clonadas, una alteración de una secuencia dirigida a un sitio con el uso de oligonucleótidos específicos, conjuntamente con una PCR.

La secuencia de ADNc o porciones de la misma, o un mini gen que se compone de un ADNc con un intrón y su propio promotor, se introduce(n) en vectores de expresión eucarióticos mediante técnicas convencionales. Estos vectores permiten la transcripción del ADNc en células eucarióticas, proporcionando secuencias reguladoras que inician e intensifican la transcripción del ADNc y aseguran su apropiado empalme y su poliadenilación. Se puede usar también el promotor del gen de p62/SQSTM1 endógeno. Diferentes promotores dentro de los vectores tienen diferentes actividades que alteran el nivel de expresión del ADNc. Además, pueden también modular la función ciertos promotores tales como el promotor que responde a glucocorticoides, procedente del virus de tumor mamario de
ratón.

Algunos de los vectores enumerados contienen unos marcadores seleccionables o neo genes bacterianos, que permiten un aislamiento de células mediante una selección química. Unos vectores estables a largo plazo se pueden mantener en células como entidades episomales, que se replican libremente, por uso de elementos reguladores de virus. Se pueden producir también unos linajes celulares que tienen el vector integrado dentro del ADN genómico. De esta manera, el producto génico es producido sobre una base continua.

Se introducen unos vectores dentro de células recipientes por diversos métodos, incluyendo el tratamiento con fosfato de calcio, con fosfato de estroncio, una electroporación, una lipofección, uso de DEAE dextrano, una microinyección, o mediante una fusión de protoplastos. Alternativamente, el ADNc se puede introducir por infección usando vectores víricos.

Las proteínas p62/SQSTM1 pueden también ser aisladas a partir de células o tejidos, incluyendo células o tejidos de mamíferos, en las/los que la proteína es expresada normalmente.

La proteína puede ser purificada por convencionales métodos de purificación, que son conocidos para los expertos en la especialidad, tales como métodos de cromatografía, métodos de cromatografía de fase líquida de alto rendimiento o una precipitación.

Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos contra una p62/SQSTM1 (tal como se describen a continuación) para aislar una proteína p62/SQSTM1, que luego es purificada por métodos clásicos.

Las proteínas del invento se pueden preparar también por síntesis químicas, usando técnicas bien conocidas en la química de las proteínas, tales como una síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) o una síntesis en una solución homogénea (Houben Weyl, 1987, Methods of Organic Chemistry [Métodos de química orgánica], coordinador de edición E. Wansch, volúmenes 15 I y II, editorial Thieme, Stuttgart).

III. Usos

El presente invento incluye todos los usos de las moléculas de ácidos nucleicos y de las proteínas p62/SQSTM1 del invento incluyendo, pero sin limitarse a, la preparación de anticuerpos y de oligonucleótidos antisentido, la preparación de sistemas experimentales para estudiar a una p62/SQSTM1 y a formas mutadas de la misma, el aislamiento de sustancias que modulan la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1, así como el uso de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de una p62/SQSTM1 y moduladores de las mismas en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Algunos de los usos se describen seguidamente de modo adicional.

(a) Anticuerpos

El aislamiento de la proteína p62/SQSTM1 y de una proteína p62/SQSTM1 mutada hace posible la preparación de anticuerpos específicos para la p62/SQSTM1 y/o para una p62/SQSTM1 mutada. Correspondientemente, el presente invento proporciona un anticuerpo que se fija a una proteína p62/SQSTM1 mutada, que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma que comprende la posición de aminoácido 392, en la posición de aminoácido 392. Se pueden usar de manera ventajosa unos anticuerpos, que solamente reaccionan con una p62/SQSTM1 mutada, para diagnosticar la enfermedad de Paget de los huesos u otras enfermedades óseas. Se pueden preparar unos anticuerpos que se fijan a un epítopo distinto en la región mutada de la proteína.

Se pueden usar métodos convencionales para preparar los anticuerpos. Por ejemplo, usando un péptido de una p62/SQSTM1, se pueden producir antisueros policlonales o anticuerpos monoclonales, usando métodos clásicos. Un mamífero (p.ej. un ratón, hámster o conejo) se puede inmunizar con una forma inmunogénica del péptido que provoca una respuesta de anticuerpo en el mamífero. Las técnicas para conferir inmunogenidad a un péptido, incluyen una conjugación a soportes u otras técnicas bien conocidas en la especialidad. Por ejemplo, la proteína o el péptido se puede administrar en la presencia de un adyuvante. El progreso de la inmunización se puede vigilar por detección de títulos de anticuerpos en un plasma o un suero. Procedimientos de ELISA clásicos u otros procedimientos de inmunoanálisis se pueden usar con el inmunógeno como antígeno para comprobar los niveles de anticuerpos. Después de una inmunización, se pueden obtener antisueros y, si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales a partir de los sueros.

Para producir anticuerpos monoclonales, unas células productoras de anticuerpos (linfocitos) se pueden cosechar a partir de un animal inmunizado y fusionar con células de mieloma por clásicos procedimientos de fusión de células somáticas, inmortalizando de esta manera a estas células y proporcionando células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en la especialidad (p.ej. la técnica del hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)), así como otras técnicas tales como la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y colaboradores, Immunol. Today 4, 72 (1983)), la técnica del hibridoma de EBV, para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y colaboradores Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy [Anticuerpos monoclonales en la terapia de un cáncer] (1985) Allen R. Bliss, Inc., páginas 77-96), y un escrutinio de bibliotecas combinatorias de anticuerpos (Huse y colaboradores, Science 246, 1275 (1989)). Unas células de hibridoma se pueden escrutar inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos que son reactivos específicamente con el péptido, y se pueden aislar los anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, el invento considera también unas células de hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales que tienen una especificidad para una p62/SQSTM1 y/o para una p62/SQSTM1 mutada como se describe aquí.

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Se pretende que el término "anticuerpo", tal como se usa en el presente contexto, incluya fragmentos del mismo que también reaccionan específicamente con una p62/SQSTM1 mutada. Los anticuerpos pueden ser fragmentados usando técnicas convencionales y los fragmentos se pueden escrutar para descubrir su utilidad de la misma manera que arriba se ha descrito. Por ejemplo, fragmentos F(ab')2 se pueden generar tratando un anticuerpo con pepsina. El resultante fragmento F(ab')2 se pueden tratar adicionalmente para producir fragmentos Fab'.

Ciertos derivados de anticuerpos quiméricos, es decir moléculas de anticuerpos que combinan una región variable de un animal no humano y una región constante de un ser humano, se consideran también dentro del alcance del invento. Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, el dominio de fijación a un antígeno procedente de un anticuerpo de un ratón, de una rata o de otra especie, con regiones constantes humanas. Se pueden usar métodos convencionales para producir anticuerpos quiméricos que contienen la región variable de una inmunoglobulina, que reconoce al producto génico de antígenos de una p62/SQSTM1 del invento (véanse, por ejemplo, Morrison y colaboradores, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda y colaboradores, Nature 314, 452 (1985), la patente de los EE.UU. nº 4.816.567 de Cabilly y colaboradores; la patente de los EE.UU nº 4.816.397 de Boss y colaboradores; la publicación de patente europea EP171496; la publicación de patente europea 0173494, y la patente del Reino Unido GB 2177096B de Tanaguchi y colaboradores). Se espera que los anticuerpos quiméricos sean menos inmunogénicos en un individuo humano que el correspondiente anticuerpo no quimérico.

Unos anticuerpos monoclonales o quiméricos, que son específicamente reactivos con una proteína del invento, como aquí se describe, pueden ser humanizados adicionalmente produciendo quimeras con regiones constantes humanas, en las que ciertas partes de las regiones variables, particularmente las regiones de armazón conservado del dominio de fijación a antígenos, son de origen humano, y solamente las regiones hipervariables son de origen no humano. Dichas moléculas de inmunoglobulinas se pueden producir por técnicas conocidas en la especialidad (p.ej. Teng y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor y colaboradores, Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson y colaboradores, Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), y la publicación de patente PCT WO92/06193 o la publicación de patente europea EP 0239400). También se pueden producir comercialmente anticuerpos humanizados (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña).

Específicos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, que son reactivos frente a proteínas p62/SQSTM1, se pueden generar también mediante escrutinio de bibliotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulinas, o porciones de los mismos, expresados en bacterias con péptidos producidos a partir de las moléculas de ácidos nucleicos de las p62/SQSTM1. Por ejemplo, fragmentos Fab completos, regiones VH y regiones FV se pueden expresar en bacterias usando bibliotecas de expresión de fagos (véanse por ejemplo Ward y colaboradores, Nature 341, 544-546: (1989); Huse y colaboradores, Science 246, 1275-1281 (1989); y McCafferty y colaboradores Nature 348, 552-554 (1990)). Alternativamente un ratón SCID-hu, por ejemplo el modelo desarrollado por Genpharm, se puede usar para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.

(b) Oligonucleótidos antisentido

El aislamiento de una molécula de ácido nucleico que codifica una p62/SQSTM1 y una p62/SQSTM1 mutada hace posible la producción de oligonucleótidos antisentido, que pueden modular la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1 y/o de una p62/SQSTM1 mutada.

Correspondientemente, el presente invento proporciona un oligonucleótido antisentido, que es complementario con una secuencia de ácido nucleico que codifica una p62/SQSTM1 mutada. En contraste, un ejemplo de una secuencia de ácido nucleico que codifica una p62/SQSTM1 normal y se muestra en SEQ.ID.NO.:1 o se muestra en el GenBank con el nº de acceso NM003900, XM035281 o GI 19923742.

En otra forma de realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una p62/SQSTM1 mutada que está asociada con la enfermedad de Paget u otra enfermedad ósea. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es tal como se muestra en SEQ.ID.NO.:3.

El término "oligonucleótido antisentido" tal como se usa en el presente contexto, significa una secuencia de nucleótidos que es complementaria con su diana.

El término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de monómeros nucleótidos o nucleósidos que se componen de bases presentes en la naturaleza, azúcares, y enlaces entre azúcares (de entramado). El término incluye también oligómeros modificados o sustituidos, que comprenden monómeros que no se presentan en la naturaleza o porciones de los mismos, que funcionan de una manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos pueden ser preferidos con respecto de las formas que se presentan en la naturaleza. a causa de unas propiedades tales como una absorción celular aumentada, o una estabilidad aumentada en la presencia de nucleasas. El término incluye también oligonucleótidos quiméricos que contienen dos o más regiones químicamente distintas. Por ejemplo, ciertos oligonucleótidos quiméricos pueden contener por lo menos una región de nucleótidos modificados, que confiere propiedades beneficiosas (p.ej. una resistencia aumentada a nucleasas, una absorción aumentada dentro de células), o dos o más oligonucleótidos del invento se pueden juntar para formar un oligonucleótido quimérico.

Los oligonucleótidos antisentido del presente invento pueden ser ácidos ribonucleicos o desoxirribonucleicos y pueden contener bases que se presentan en la naturaleza, incluyendo a adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Los oligonucleótidos pueden contener también bases modificadas tales como xantina, hipoxantina, 2-amino adenina, 6-metil, 2-propil y otras alquil adeninas, 5-halo uracilo, 5-halo citosina, 6-aza uracilo, 6-aza citosina y 6-aza timina, pseudo uracilo, 4-tio uracilo, 8-halo adenina, 8-amino adenina, 8-tiol adenina, 8-tiolalquil adeninas, 8-hidroxil adenina y otras adeninas sustituidas en posición 8, 8-halo guaninas, 8-amino guaninas, 8-tiol guanina, 8-tiolalquil guaninas, 8-hidroxil guanina y otras guaninas sustituidas en posición 8, otros/as aza y desaza uracilos, timidinas, citosinas, adeninas o guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluoro citosina.

Otros oligonucleótidos antisentido del invento pueden contener heteroátomos de fósforo u oxígeno modificados en el entramado de fosfato, enlaces entre azúcares del tipo de alquilo de cadena corta o cicloalquilo o enlaces entre azúcares de tipo heteroatómico de cadena corta o heterocíclico. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden contener fosforotioatos, fosfotriésteres, metil fosfonatos y fosforoditioatos. En una forma de realización del invento hay uniones por enlaces de fosforotioatos entre las cuatro a seis a bases del extremo terminal en 3'. En otra forma de realización, unos enlaces de fosforotioatos unen a todos los nucleótidos.

Los oligonucleótidos antisentido del invento pueden comprender también compuestos análogos a nucleótidos que pueden ser mejor idóneos como reactivos terapéuticos o experimentales. Un ejemplo de un compuesto análogo a oligonucleótido es un ácido nucleico peptídico (ANP) en el que el entramado de fosfato desoxirribosa (o ribosa) en el ADN (o ARN) es reemplazado por un entramado de poliamida que es similar al que se encuentra en péptidos (P.E. Nielsen, y colaboradores Science 1991, 254, 1497). Se ha mostrado que los compuestos análogos a ANP son resistentes a la degradación por enzimas y tienen unas vidas prolongadas "in vivo" e "in vitro". Los ANP's se fijan también más fuertemente a una secuencia de ADN complementaria debido a la falta de repulsión de cargas entre la cadena de ANP y la cadena de ADN. Otros oligonucleótidos pueden contener unos nucleótidos que contengan entramados poliméricos, entramados cíclicos o entramados acíclicos. Por ejemplo, los nucleótidos pueden tener estructuras de entramados morfolínicos (patente de los EE.UU. nº 5.034.506). Los oligonucleótidos pueden contener también grupos tales como grupos reporteros, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden tener también compuestos miméticos de azúcares.

Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido se pueden construir usando síntesis químicas y reacciones de de ligación enzimática que usan procedimientos conocidos en la especialidad. Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido del invento o un fragmento de las mismas, se puede(n) sintetizar químicamente usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos diversamente modificados, diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado con un ARNm o el gen natural, p.ej. derivados fosforotioatos y nucleótidos sustituidos con acridina. Las secuencias antisentido se pueden producir biológicamente usando un vector de expresión introducido dentro de células en la forma de un plásmido recombinante, de un fagémido o de un virus atenuado, en el que se producen secuencias antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad se puede determinar por medio del tipo de células en las que se introduce el vector.

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser introducidos en tejidos o células usando técnicas en la especialidad que incluyen vectores (vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y vectores de virus de ADN) o técnicas físicas, tales como una microinyección. Los oligonucleótidos antisentido se pueden administrar directamente "in vivo" o se pueden usar para transfectar "in vitro" células, que luego son administradas "in vivo". En una forma de realización, el oligonucleótido antisentido puede ser suministrado a macrófagos y/o a células endoteliales en una formulación de liposomas.

(c) Ensayos de diagnóstico

El descubrimiento hecho por los presentes autores del invento, de que la p62/SQSTM1 mutada está implicada en la enfermedad de Paget de los huesos, permite el desarrollo de ensayos de diagnóstico para detectar la enfermedad de Paget de los huesos u otras enfermedades óseas.

Correspondientemente, el presente invento proporciona un método para detectar una condición asociada con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende ensayar una muestra para descubrir (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3, o un fragmento de la misma, o (b) una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4, o un fragmento de la misma. En una forma de realización, la condición asociada con la proteína mutada es la enfermedad de Paget de los huesos.

(i) Moléculas de ácidos nucleicos

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican una p62/SQSTM1 mutada como aquí se describe. o fragmentos de la misma, permite a los expertos en la especialidad construir sondas de oligonucleótidos destinadas a su uso en el descubrimiento de secuencias de nucleótidos que codifican una p62/SQSTM1 mutada o fragmentos de la misma en muestras, preferiblemente en muestras biológicas, tales como células, tejidos y fluidos corporales. Las sondas pueden ser útiles para detectar la presencia de una condición asociada con una p62/SQSTM1 mutada o la vigilancia del progreso de dicha condición. Tales condiciones incluyen la enfermedad de Paget de los huesos.

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También se describe aquí un método para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica una p62/SQSTM1 mutada en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con una sonda de nucleótidos que es capaz de hibridarse con la molécula de ácido nucleico para formar un producto de hibridación, en unas condiciones que permiten la formación del producto de hibridación, y ensayar para descubrir el producto de hibridación.

La sonda de nucleótidos, usada en el ensayo de diagnóstico, se hibridará con una p62/SQSTM1 mutada (que contiene la mutación de prolina a leucina en la posición 392), pero no con una p62/SQSTM1 de tipo salvaje. Ejemplos de sondas que se pueden usar en al anterior método, incluyen fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos que se muestran en la Figura 3 o en SEQ.ID.NO.:3. Una sonda de nucleótidos puede ser marcada con una sustancia detectable tal como una marca radiactiva que proporciona una señal adecuada y que tiene una vida de semidescomposición suficiente, tal como 32P, 3H, 14C o similares. Otras sustancias detectables, que se pueden usar, incluyen unos antígenos que son reconocidos por un anticuerpo marcado específico, compuestos fluorescentes, enzimas, anticuerpos específicos para un antígeno marcado, y una quimioluminiscencia. Una marca apropiada se puede seleccionar tomando en consideración la velocidad de hibridación y la fijación de la sonda al ácido nucleico que se ha de detectar y la cantidad de ácido nucleico disponible para la hibridación. Las sondas marcadas se pueden hibridar con ácidos nucleicos sobre soportes sólidos tales como filtros de nitrocelulosa o membranas de nylon, tal como se describen generalmente en la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª edición). Las sondas de oligonucleótidos se pueden usar para detectar genes, preferiblemente en células humanas, que se hibridan de manera preferible con la molécula de ácido nucleico del presente invento, moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan con la molécula de ácido nucleico del invento en unas condiciones rigurosas de hibridación que aquí se describen.

En una forma de realización, el ensayo de hibridación puede ser un análisis de Southern en que la muestra del paciente es ensayada para descubrir una secuencia de ADN que se hibrida con una sonda específica para una p62/SQSTM1 mutada. En otra forma de realización, el ensayo de hibridación puede ser un análisis de Northern en el que la muestra del paciente es ensayada para descubrir una secuencia de ARN que se hibrida con una sonda específica para una p62/SQSTM1 mutada. Los análisis de Southern y Northern se pueden realizar usando técnicas conocidas en la especialidad (véase, por ejemplo, la obra Current Protocols in Molecular Biology [protocolos actuales en la biología molecular], Ausubel, F. y colaboradores, coordinadores de edición, John Wiley & Sons).

Unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína p62/SQSTM1 mutada, se pueden amplificar selectivamente en una muestra usando los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y un ADNc o ADN genómico. Es posible diseñar cebadores de oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ.ID.NO.:3 para su uso en una PCR. Un ácido nucleico puede ser amplificado a partir de un ADNc o ADN genómico usando cebadores de oligonucleótidos y técnicas clásicas de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado puede ser clonado dentro de un vector apropiado y caracterizado mediante un análisis de las secuencias de ADN. Un ADNc se puede preparar a partir de un ARNm, asilando el ARNm celular total por una diversidad de técnicas, por ejemplo, usando el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin y colaboradores, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). El ADNc es luego sintetizado a partir del ARNm usando una transcriptasa inversa (por ejemplo una transcriptasa inversa MLV de Moloney disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o una transcriptasa inversa AMV disponible de Seikagaku América, Inc., St. Petersburg, FL).

Los pacientes se pueden explorar de una manera rutinaria usando unas sondas para detectar la presencia de un gen de p62/SQSTM1 mutante por una diversidad de técnicas. Un ADN genómico usado para el diagnóstico se puede obtener a partir de células corporales, tales como las que están presentes en la sangre, en una biopsia de tejido, en una muestra quirúrgica, o en un material de autopsia. El ADN se puede aislar y usar directamente para la detección de una secuencia específica o se puede amplificar por una PCR antes de realizar el análisis. Se puede usar también un ARN o ADNc. Para detectar una hibridación con una secuencia de ADN específica usando oligonucleótidos específicos, una secuenciación directa con ADN, una digestión con enzimas de restricción, una protección por una RNasa, una disociación química y una detección mediada por ligasas, son todos los métodos que se pueden utilizar. Unos oligonucleótidos específicos para secuencias mutantes se pueden sintetizar químicamente y marcar radiactivamente con isótopos, o no radiactivamente usando marcas de biotina, y se pueden hibridar con muestras de ADN individuales que están inmovilizadas sobre membranas u otros soportes sólidos mediante el método de "dot-blot" (borrón de puntos) o una transferencia a partir de geles después de una electroforesis. La presencia o ausencia de estas secuencias mutantes es luego visualizada usando métodos tales como una autorradiografía, una fluorometría o una reacción colorimétrica. Se pueden generar unos apropiados cebadores de PCR que son útiles, por ejemplo, en porciones en amplificación de la secuencia en cuestión que contiene unas mutaciones identificadas.

La secuenciación directa de los ADN revela diferencias de secuencias entre un ADN de una p62/SQSTM1 normal y otra mutante. Unos segmentos de ADN clonados se pueden usar como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. Una PCR se puede usar para intensificar la sensibilidad de este método. Una PCR es una amplificación enzimática dirigida por cebadores específicos para ciertas secuencias, e implica unos ciclos repetidos de desnaturalización por calor del ADN, un reanillamiento de los cebadores complementarios y una prolongación del cebador reanillado con una polimerasa de ADN. Esto da como resultado un aumento exponencial del ADN diana.

Se pueden usar otras técnicas de amplificación de secuencias de nucleótidos, tales como una PCR mediada por una ligación, una amplificación por PCR anclada y enzimática, tal como se comprenderá por los expertos en la especialidad.

Unas alteraciones de las secuencias pueden generar también sitios fortuitos de reconocimiento por enzimas de restricción, que son revelados por el uso de una apropiada digestión con enzimas, seguida por una hibridación de gel y borrón (blot). Los fragmentos de ADN que llevan el sitio (normal o mutante) se detectan por su aumento o reducción en el tamaño, o por el aumento o reducción de los correspondientes números de fragmentos de restricción. Unas muestras de ADN genómico se pueden amplificar también por una PCR antes de un tratamiento con la apropiada enzima de restricción. y los fragmentos de diferentes tamaños son visualizados bajo una luz ultravioleta (UV) en la presencia de bromuro de etidio después de una electroforesis en gel.

Un ensayo genético basado en diferencias entre secuencias de ADN se puede conseguir por detección o alteración en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles. Unas pequeñas supresiones e inserciones de secuencias se pueden visualizar mediante una electroforesis en gel de alta resolución. Unos pequeñas supresiones se pueden detectar también en forma de cambios en la pauta de migración de heteroduplexes de ADN en una electroforesis en un gel no desnaturalizante. Alternativamente, se puede detectar una mutación por sustitución de una única base, basada en una longitud de cebador diferencial en una PCR. Los productos de PCR del gen normal y del mutante se podrían detectar de una manera diferencial en geles de acrilamida.

Unos ensayos de protección con nucleasas (mediados por S1 o por una ligasa) revelan también cambios de secuencias en lugares específicos. Alternativamente, para confirmar o detectar un polimorfismo se pueden usar cambios de cartografiado por restricción ligados por PCR, ASO, REF-SSCP y SSCP. Tanto la REF-SSCP como la SSCP son ensayos de desplazamiento por movilidad, que están basados en el cambio en la conformación debido a mutaciones.

Unos fragmentos de ADN pueden ser también visualizados por unos métodos en los cuales las muestras de ADN individuales no están inmovilizadas sobre membranas. La sonda y las secuencias dianas pueden estar en solución, o la secuencia de la sonda puede ser inmovilizada. Se pueden usar también una autorradiografía, una extinción radiactiva, una espectrofotometría y una fluorometría para identificar específicos genotipos individuales.

De acuerdo con una forma de realización del invento, la porción del segmento de ADN que es específica para una mutación se puede amplificar usando una PCR. Por ejemplo, para detectar la mutación de prolina a leucina en la posición de aminoácido 392, el ADN situado alrededor de la posición de nucleótido 1215 puede ser amplificado. El segmento de ADN que rodea inmediatamente a una mutación específica adquirida a partir de una sangre periférica o de otras muestras de tejidos procedentes de un individuo, se puede explorar usando cebadores de oligonucleótidos construidos. Esta región sería luego amplificada por una PCR, los productos serían separados por electroforesis y transferidos a una membrana. Las sondas marcadas son luego hibridadas a los fragmentos de ADN y se realiza una autorradiografía.

(ii) Proteínas

La proteína p62/SQSTM1 mutada puede ser detectada en una muestra usando anticuerpos que se fijan a la proteína, tal como se ha descrito arriba con detalle. Correspondientemente, en una forma de realización, el método para detectar una proteína p62/SQSTM1 mutada comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se fija a una p62/SQSTM1 mutada, que es capaz de ser detectado después de que ha resultado unido a la p62/SQSTM1 mutada en la muestra.

Anticuerpos, que son específicamente reactivos con una p62/SQSTM1 mutada, o con derivados de la misma, tales como conjugados con enzimas o derivados marcados, se pueden usar para detectar una p62/SQSTM1 mutada en diversos materiales biológicos, por ejemplo se pueden usar en cualesquiera inmunoanálisis conocidos, que recurren a la interacción de fijación entre un determinante antigénico de una p62/SQSTM1 mutada, y los anticuerpos. Ejemplos de dichos ensayos son radioinmunoensayos, inmunoensayos con enzimas (p.ej. ELISA), una inmunofluorescencia, una inmunoprecipitación, una aglutinación con un látex, una hemoaglutinación y ensayos histoquímicos. Por lo tanto, los anticuerpos se pueden usar para detectar y cuantificar una p62/SQSTM1 mutada en una muestra con el fin de determinar su cometido en sucesos celulares o estados patológicos particulares, y para diagnosticar y tratar dichos estados patológicos, preferiblemente la enfermedad de Paget de los huesos.

En particular, los anticuerpos del invento se pueden usar en análisis inmuno-histoquímicos, por ejemplo, a los niveles celulares y sub-subcelulares para detectar una p62/SQSTM1 mutada, con el fin de localizarla en células y tejidos particulares y en específicas situaciones subcelulares, y de cuantificar el nivel de la expresión.

Se pueden usar técnicas citoquímicas conocidas en la especialidad para localizar antígenos usando un examen en microscopios ópticos y electrónicos, con el fin de detectar una p62/SQSTM1 mutada. Generalmente, un anticuerpo del invento puede ser marcado con una sustancia detectable y una p62/SQSTM1 mutada puede ser localizada en un tejido basándose en la presencia de la sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, diversos materiales fluorescentes, diversos materiales luminiscentes y diversos materiales radiactivos. Ejemplos de apropiadas enzimas incluyen la peroxidasa de rábano rusticano, biotina, una fosfatasa alcalina, una \beta-galactosidasa o acetilcolina - esterasa; ejemplos de apropiados materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamino fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye al luminol; y ejemplos de un apropiado material radiactivo incluyen un yodo radiactivo I-125, I-131 o 3-H. Los anticuerpos pueden también ser acoplados a sustancias densas en electrones, tales como ferritina u oro coloidal, que son visualizadas con facilidad por un examen en microscopio electrónico.

Se pueden emplear también métodos indirectos, en los que la reacción primaria de un antígeno y un anticuerpo es amplificada por la introducción de un segundo anticuerpo, que tiene una especificidad para el anticuerpo que es reactivo frente a una p62/SQSTM1 mutada. Por vía de ejemplo, si el anticuerpo que tiene una especificidad frente a una p62/SQSTM1 mutada es un anticuerpo IgG de conejo, el segundo anticuerpo puede ser una gamma-globulina de cabra anti-conejo, marcada con una sustancia detectable como aquí se describe.

Cuando se usa una marca radiactiva como una sustancia detectable, una p62/SQSTM1 mutada puede ser localizada mediante una autorradiografía. Los resultados de la autorradiografía pueden ser cuantificados determinando la densidad de partículas en las autorradiografías por diversos métodos ópticos, o recontando los granos.

(d) Sistemas experimentales

Se pueden usar sistemas de expresión eucarióticos para muchos estudios del gen de p62/SQSTM1 y del (de los) producto(s) de este gen, incluyendo la producción de grandes cantidades de la proteína normal y de la proteína mutante para su aislamiento y purificación, usar células que expresan la proteína p62/SQSTM1 o la proteína p62/SQSTM1 mutada como un sistema de ensayo funcional para descubrir anticuerpos generados contra la proteína, o ensayar la efectividad de agentes farmacológicos, estudiar la función de la proteína completa normal, de porciones específicas de la proteína o de proteínas mutantes presentes en la naturaleza y producidas artificialmente.

Usando las técnicas mencionadas, los vectores de expresión que contienen la secuencia de ADNc de una p62/SQS
TM1 o de una p62/SQSTM1 mutada, o porciones de la misma, se pueden introducir dentro de una diversidad de células de mamíferos procedentes de otras especies o dentro de células que no son de mamíferos.

El vector de clonación recombinante, de acuerdo con este invento, comprende el ADN seleccionado de las secuencias de ADN de este invento para su expresión en un anfitrión apropiado. El ADN es enlazado operativamente dentro del vector a una secuencia de control de la expresión en la molécula de ADN recombinante de manera tal que se puede expresar una proteína p62/SQSTM1. La secuencia de control de la expresión se puede seleccionar entre el conjunto que se compone de secuencias que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus virus y combinaciones de los mismos. La secuencia de control de la expresión se puede seleccionar entre el conjunto que se compone del sistema lac, del sistema trp, del sistema tac, del sistema trc, de regiones de operadores y promotores principales del fago lambda, de la región de control de la proteína de revestimiento fd, de promotores tempranos y tardíos de SV40, de promotores derivados de un polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus de simio, el promotor de 3-fosfoglicerato cinasa, promotores de fosfatasas ácidas de levaduras, factores de apareamiento alfa de levadura, y sus combinaciones.

Una expresión del gen de p62/SQSTM1 en sistemas de células heterólogas se puede usar también para demostrar las relaciones entre la estructura y la función, así como también para proporcionar linajes celulares para las finalidades de escrutinio de fármacos. Una secuencia de ADN de una p62/SQSTM1 dentro un vector de expresión de plásmidos para transfectar células, es un método útil para ensayar la influencia de las proteínas sobre diversos parámetros bioquímicos celulares, incluyendo la identificación de substratos así como de activadores e inhibidores del gen. Unos vectores de expresión de plásmidos, que contienen o bien la secuencia de codificación entera para una p62/SQSTM1, o para porciones de la misma, se pueden usar en experimentos de mutagénesis "in vitro", que identificarán a porciones de la proteína que sean cruciales para la función.

La secuencia de ADN puede ser manipulada en ciertos estudios para entender la expresión del gen y de su producto. Los cambios en la secuencia pueden alterar o no la pauta de expresión en términos de las cantidades relativas, de la especificidad para tejidos y de propiedades funcionales.

También se describen aquí métodos para examinar la función de la proteína p62/SQSTM1 mutada, codificada por las moléculas de ácidos nucleicos del invento. Se pueden desarrollar células, tejidos, y animales no humanos que carecen de expresión, o que carecen parcialmente de expresión, de la proteína, usando moléculas recombinantes del invento que tienen mutaciones específicas por supresión o inserción en la molécula de ácido nucleico del invento. Una molécula recombinante se puede usar para desactivar o alterar al gen endógeno mediante una recombinación homóloga, y crear de esta manera una célula, un tejido o un animal deficiente. Dicha célula mutante, dicho tejido o dicho animal se puede usar para definir poblaciones de células específicas, pautas de desarrollo y procesos "in vivo", que normalmente son dependientes de la proteína que es codificada por la molécula de ácido nucleico del
invento.

Para confirmar la importancia de la proteína p62/SQSTM1 en la enfermedad de Paget de los huesos, se puede preparar un ratón suprimido genéticamente (en inglés knockout) de p62/SQSTM1. Por vía de ejemplo, se puede usar una estrategia de recombinación dirigida hacia una diana para desactivar al gen de p62/SQSTM1 endógeno. Un gen que introduce codones de expresión en todos los cuadros de lectura y anula a la actividad biológica de la proteína, se puede introducir dentro de una copia genómica de la proteína. El fragmento mutado se puede introducir en células tronco embrionarias y se pueden seleccionar colonias para obtener una recombinación homóloga con genes de resistencia positiva (para neomicina)/negativa (para ganciclovir y timidina cinasa). Para establecer una transmisión del linaje germinal, dos clones que llevan el gen roto en un alelo se pueden inyectar dentro de blastocitos de ratones C57BI/6 y se pueden transferir a madres en cría B6/SJL. Unas quimeras se pueden aparear con ratones C57BI/6 y la progenie se puede analizar para detectar animales homocigóticos para la mutación (p62/SQSTM1 -/-). Se pueden determinar los efectos de la mutación en la enfermedad de Paget de los huesos o en otras condiciones de los huesos, en comparación con testigos no mutados, y se puede analizar la pauta de supervivencia e histológica de una enfermedad.

El dominio UBA está conservado entre otras especies (de ratón y rata) incluyendo al residuo de P392. Correspondientemente, el invento proporciona también la construcción de un animal no humano que lleva la mutación puntual que codifica a la proteína p62/SQSTM1 mutada con P392L, en que dicha mutación corresponde a la proteína p62/SQSTM1 humana que se muestra en SEQ ID NO:4. Dicha célula, dicho tejido o dicho animal mutante se puede usar como un modelo para una enfermedad ósea, preferiblemente la enfermedad de Paget de los huesos.

(e) Moduladores de SEQ ID NO:4

Además de los anticuerpos y oligonucleótidos antisentido que arriba se han descrito, se pueden identificar también otras sustancias que modulan la expresión o la actividad de una p62/SQSTM1, así como sustancias que modulan formas mutadas de una p62/SQSTM1.

(i) Sustancias que se fijan a una p62/SQSTM1

Las sustancias que afectan a la actividad de una p62/SQSTM1 se pueden identificar basándose en su capacidad para fijarse a una p62/SQSTM1 y/o a una p62/SQSTM1 mutada.

Las sustancias que se pueden fijar con una p62/SQSTM1 se pueden identificar haciendo reaccionar la p62/SQSTM1 con una sustancia que potencialmente se fija a la p62/SQSTM1, y ensayando para descubrir complejos, para descubrir una sustancia libre o para descubrir una p62/SQSTM1 no convertida en complejos, o para descubrir la activación de una p62/SQSTM1. En particular, se puede usar un sistema de ensayo con dos híbridos de levadura para identificar proteínas que interactúan con una p62/SQSTM1 (Fields, S. and Song, O., 1989, Nature, 340:245-247). Los sistemas de análisis que se pueden usar también incluyen un ELISA.

Correspondientemente, el invento proporciona un método de identificar sustancias que se pueden fijar con una p62/SQSTM1 mutada, que comprende las operaciones de:

(a)

hacer reaccionar una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, y una sustancia de ensayo, en unas condiciones que permiten la formación de un complejo entre la p62/SQSTM1 y la sustancia de ensayo, y

(b)

ensayar para descubrir complejos de la p62/SQSTM1 mutada y de la sustancia de ensayo, para descubrir una sustancia libre o para descubrir una p62/SQSTM1 mutada no convertida en complejo, en que la presencia de complejos indica que la sustancia de ensayo es capaz de fijarse a una p62/SQSTM1 mutada.

Las condiciones que permiten la formación de complejos de una sustancia y de una p62/SQSTM1 se pueden seleccionar teniendo en cuenta factores tales como la naturaleza y las cantidades de la sustancia y de la proteína.

El complejo de una sustancia y de una proteína, una sustancia libre o proteínas no convertidas en complejos se puede(n) aislar por convencionales técnicas de aislamiento, por ejemplo, por precipitación salina, cromatografía, electroforesis, filtración a través de gel, fraccionamiento, absorción, electroforesis en gel de poli(acrilamida), aglutinación, o combinaciones de las mismas. Para facilitar el ensayo de los componentes, se puede utilizar un anticuerpo contra una p62/SQSTM1 o contra la sustancia, o una p62/SQSTM1 marcada, o una sustancia marcada. Los anticuerpos, las proteínas o las sustancias se pueden marcar con una sustancia detectable tal como arriba se ha descrito.

Una p62/SQSTM1, o la sustancia usada en el método del invento, puede ser insolubilizada. Por ejemplo, una p62/SQSTM1 o una sustancia puede estar fijada a un soporte apropiado. Ejemplos de apropiados soportes son agarosa, celulosa, dextrano, Sephadex, Sepharose, carboximetil celulosa, poliestireno, un papel de filtro, una resina de intercambio de iones, una película de material plástico, un tubo de material plástico, perlas de vidrio, un copolímero de poliamina, metil-vinil-éter y ácido maleico, un copolímero de aminoácidos, un copolímero de etileno y ácido maleico, nylon, seda, etc. El soporte puede estar en la configuración, por ejemplo, de un tubo, una placa de ensayo, perlas, un disco, una esfera, etc.

La proteína o la sustancia insolubilizada se puede preparar haciendo reaccionar el material con un apropiado soporte insoluble, usando conocidos métodos químicos o físicos, por ejemplo un acoplamiento con bromuro de cianógeno.

Las proteínas o la sustancia se puede(n) expresar también sobre la superficie de una célula usando los métodos que aquí se describen.

El invento considera también ensayar para descubrir un antagonista o agonista de la acción de una p62/SQSTM1.

Se entenderá que los agonistas y antagonistas que se pueden ensayar usando los métodos del invento, pueden actuar sobre uno o más de los sitios de fijación situados en la proteína o en la sustancia,.incluyendo sitios de fijación de agonistas, sitios de fijación de antagonistas competitivos, sitios de fijación de antagonistas no competitivos o sitios alostéricos.

El invento hace posible también escrutar para descubrir antagonistas que inhiban los efectos de un agonista de una p62/SQSTM1. Por lo tanto, el invento se puede usar para ensayar con el fin de descubrir una sustancia que compita para el mismo sitio de fijación de una p62/SQSTM1.

(ii) Compuestos miméticos péptidos

También se describen aquí compuestos miméticos péptidos de las proteínas p62/SQSTM1 y p62/SQSTM1 mutadas del invento. Por ejemplo, un péptido derivado de un dominio mutado de una p62/SQSTM1 interactuará directa o indirectamente con una molécula asociada, de tal manera que imitará la fijación natural de la proteína mutada. El compuesto mimético péptido se puede derivar del dominio UBA de una p62/SQSTM1. Tales péptidos pueden incluir inhibidores competitivos, intensificadores, compuestos miméticos péptidos, y similares. Todos estos péptidos, así como moléculas sustancialmente homólogas, complementarias o equivalentes funcional o estructuralmente de otra manera a estos péptidos, se pueden usar para las finalidades del presente invento.

Los "compuestos miméticos péptidos" son unas estructuras que sirven como sustitutos de péptidos en interacciones entre moléculas (véase Morgan y colaboradores (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252 para una recopilación). Los compuestos miméticos péptidos incluyen unas estructuras sintéticas que pueden contener o no enlaces de aminoácidos y/o de péptidos, pero retienen las características estructurales y funcionales de un péptido, o de un intensificador o inhibidor del invento. Los compuestos miméticos péptidos incluyen también peptoides, oligopeptoides (Simon y colaboradores (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367); y bibliotecas de péptidos que contienen unos péptidos con una longitud diseñada, que representan a todas las posibles secuencias de aminoácidos que corresponden a un péptido del invento.

Los compuestos miméticos péptidos se pueden diseñar basándose en una información obtenida por un reemplazo sistemático de L-aminoácidos por D-aminoácidos, por un reemplazo de cadenas laterales por grupos que tienen diferentes propiedades electrónicas, y por un reemplazo sistemático de enlaces de péptidos con reemplazos de enlaces de amidas. También se pueden introducir restricciones locales de conformación con el fin de determinar los requisitos de conformación para obtener la actividad de un compuesto mimético péptido candidato. Los compuestos miméticos pueden incluir enlaces isostéricos de amidas o D-aminoácidos para estabilizar o favorecer las conformaciones de turno inverso y para ayudar a estabilizar a la molécula. Se pueden usar unos compuestos análogos a aminoácidos cíclicos para restringir los residuos de aminoácidos a estados particulares de conformación. Los compuestos miméticos pueden incluir también residuos imitadores de estructuras secundarias de péptidos inhibidores. Estas estructuras pueden modelar la orientación tridimensional de residuos de aminoácidos dentro de las conocidas conformaciones secundarias de las proteínas. Se pueden usar también unos peptoides, que son oligómeros de aminoácidos sustituidos en N y que se pueden usar como radicales motivos para la generación de bibliotecas químicamente diversas de nuevas moléculas.

Los péptidos del invento se pueden usar también para identificar compuestos directores principales para el desarrollo de fármacos. La estructura de los péptidos aquí descritos se puede determinar con facilidad por un cierto número de métodos tales como una RMN (resonancia magnética nuclear) y una cristalografía de rayos X. Una comparación de las estructuras de péptidos similares en su secuencia, pero que difieren en las actividades biológicas que ellos provocan en moléculas dianas, puede proporcionar información acerca de la relación entre la estructura y la actividad de la diana. Una información obtenida a partir del examen de las relaciones entre la estructura y la actividad se puede usar para diseñar o bien péptidos modificados, u otras pequeñas moléculas o compuestos directores principales que se pueden ensayar para descubrir propiedades predichas en relación con la molécula diana. La actividad de los compuestos directores principales se puede evaluar usando ensayos similares a los que aquí se han descrito.

Una información acerca de las relaciones entre la estructura y la actividad se puede obtener también a partir de estudios de cristalización concomitante. En estos estudios, un péptido con una actividad deseada es cristalizado en asociación con una molécula diana, y se determina la estructura según los rayos X del complejo. La estructura se puede comparar entonces con la estructura de la molécula diana en su estado natural, y la información procedente de dicha comparación se puede usar para diseñar compuestos de los que se espera que posean.

(iii) Métodos de escrutinio de fármacos

De acuerdo con una forma de realización, el invento hace posible un método para escrutar compuestos candidatos con el fin de determinar su capacidad para aumentar o disminuir la actividad de la proteína p62/SQSTM1 mutada. El método comprende proporcionar un sistema de ensayo para ensayar la actividad de una p62/SQSTM1, ensayar la actividad en la presencia o ausencia del compuesto candidato o de ensayo, y determinar si el compuesto ha aumentado o disminuido la actividad de la p62/SQSTM1. Dichos compuestos pueden ser útiles para tratar la enfermedad de Paget de los huesos.

Correspondientemente, el presente invento proporciona un método para identificar un compuesto que afecta a la actividad o la expresión de una proteína de p62/SQSTM1 mutada, que comprende:

(a)

incubar un compuesto de ensayo con una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, o un ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, teniendo el ácido nucleico la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma, y

(b)

determinar una cantidad de actividad o expresión de una proteína p62/SQSTM1 mutada y compararla con la de un testigo (es decir, en la sustancia de ensayo), en que un cambio en la actividad o la expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada en comparación con la del testigo indica que el compuesto de ensayo tiene un cierto efecto sobre la actividad o expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada.

De acuerdo con una forma de realización adicional, el invento hace posible un método para escrutar compuestos candidatos para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la expresión de una proteína p62/SQSTM1. El método comprende poner en contacto una célula con un compuesto candidato, en que la célula incluye una región reguladora de un gen de p62/SQSTM1 unido operativamente a una región codificadora de gen reportero, y detectar un cambio en la expresión del gen reportero.

En una forma de realización, el presente invento hace posibles unos sistemas de cultivo en los que unos linajes celulares, que expresan el gen de una p62/SQSTM1 mutada, se incuban con compuestos candidatos con el fin de ensayar sus efectos sobre la expresión de la p62/SQSTM1 mutada. Dichos sistemas de cultivo se pueden usar para identificar unos compuestos que regulan en sentido ascendente o descendente la expresión de la p62/SQSTM1 o su función, por medio de la interacción con otras proteínas.

Dichos compuestos se pueden seleccionar a partir de compuestos proteínicos, compuestos químicos y diversos fármacos, que se añaden al medio de cultivo. Después de un cierto período de tiempo de incubación en la presencia de uno o varios compuesto(s) de ensayo seleccionado(s), la expresión de una p62/SQSTM1 mutada se puede examinar cuantificando los niveles del ARNm de la p62/SQSTM1 usando un procedimiento clásico de transferencia de borrones Northern, tal como se describe en los ejemplos que aquí se incluyen, con el fin de determinar cualesquiera cambios en la expresión como un resultado del compuesto de ensayo. Unos linajes celulares transfectados con construcciones artificiales, que expresan una p62/SQSTM1, se pueden usar también para ensayar la función de compuestos desarrollados con el fin de modificar la expresión de proteínas.

(f) Usos terapéuticos

Como se ha descrito con anterioridad, la p62/SQSTM1 del invento está probablemente implicada en la enfermedad de Paget de los huesos y en otras enfermedades relacionadas de los huesos, incluyendo a la osteoporosis. Correspondientemente, se describe aquí un método de tratar una enfermedad ósea, que comprende administrar a una célula, o a un animal que necesita de ella, una cantidad efectiva de un agente que modula la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1. El presente invento proporciona un uso de un agente que modula la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1 para la producción de un medicamento destinado a tratar una enfermedad ósea.

La expresión "agente que modula la expresión y/o la actividad de una p62/SQSTM1" significa cualquier sustancia que puede alterar la expresión y/o la actividad de la p62/SQSTM1 mutada encontrada en el paciente, que esté en consonancia con la p62/SQSTM1 de tipo salvaje. Ejemplos de agentes que se pueden usar para incluir la administración: una molécula de ácido nucleico que codifica una p62/SQSTM1 de tipo salvaje; la propia proteína p62/SQSTM1 de tipo salvaje, así como fragmentos, compuestos análogos, derivados homólogos de la misma; anticuerpos; ácidos nucleicos antisentido; compuestos miméticos péptidos; y sustancias aisladas usando los métodos de escrutinio que aquí se describen, que puedan corregir la mutación para dar como resultado unos niveles y/o una función de una p62/SQSTM1, que sean compatibles con una persona sin la enfermedad.

El término "cantidad efectiva", tal como se usa en el presente contexto, significa una cantidad que es efectiva, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios para conseguir los resultados deseados.

El término "animal", tal como se usa en el presente contexto, incluye todos los miembros del reino animal, incluyendo seres humanos.

También se describe aquí un método de tratar la enfermedad de Paget de los huesos por administración a una célula o a un animal de una cantidad eficaz de un agente que modula la expresión o la actividad biológica de la proteína p62/SQSTM1 mutada. En una forma de realización del presente invento, se proporciona el uso de una cantidad efectiva de un agente que modula la expresión o la actividad biológica de la proteína p62/SQSTM1 mutada, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Paget de los huesos. Las sustancias que inhiben la actividad de una p62/SQSTM1 mutada, incluyen compuestos miméticos péptidos, antagonistas de una p62/SQSTM1 y ciertos anticuerpos para una p62/SQSTM1. Las sustancias que inhiben la expresión del gen de una p62/SQSTM1 mutada incluyen unos oligonucleótidos antisentido para una secuencia de ácido nucleico de una p62/SQSTM1 mutada.

Todas las enfermedades de los huesos se presentan como una consecuencia de los efectos del proceso morboso sobre los sucesos celulares en el ciclo normal de remodelación de huesos. El esqueleto de un adulto está en un estado dinámico, que es descompuesto y vuelto a formar continuamente por las acciones coordinadas de osteoclastos y osteoblastos sobre superficies trabeculares y en sistemas haversianos (de hueso cortical). Los conceptos actuales de la remodelación o del recambio de huesos están basados en las observaciones morfológicas de Frost y colegas (Hattner R, Etker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodeling [El modo secuencial sugerido de control de los cambios en el comportamiento de las células en la remodelación de huesos adultos]. Nature 1965; 206 (983): 489-490.), los cuales observaron que una formación de hueso en adultos normales se realizaba casi exclusivamente en los sitios que habían experimentado recientemente una resorción osteoclástica. Este recambio o esta remodelación de huesos se produce en paquetes focales y discretos a lo largo del esqueleto. Se reconoce ahora que la remodelación de cada paquete se toma un período de tiempo finito (que se estima que es de aproximadamente 3-4 meses). La remodelación que se produce en cada paquete (denominado como una unidad de remodelación de hueso por Frost) está separada geográfica y cronológicamente de otros paquetes de remodelación. Esto sugiere que una activación de la frecuencia (también denominada frecuencia de activación) de sucesos celulares responsables de la remodelación, está controlada localmente, posiblemente por un mecanismo de autorregulación, probablemente por factores autocrinos o paracrinos generados en el microentorno de los huesos. La secuencia es siempre la misma - una resorción osteoclástica de hueso (durante 10 días) seguida por una formación osteoblástica de hueso (durante 3 meses) para reparar el defecto. El nuevo hueso que se ha formado es denominado como una unidad estructural de hueso (de bone structural unit, BSU) (Frost HM. Dynamics of the bone remodelling. In: Bone Biodynamics [Condiciones dinámicas de la remodelación de huesos en: Biodinámica de huesos]. Boston: Little & Brown, 1964: 315.).

La activación de los osteoclastos es la operación inicial en la secuencia de remodelación. Los osteoclastos son activados en sitios focales específicos por unos mecanismos que todavía no han sido comprendidos. Este período es seguido por una reparación del defecto de resorción mediante un equipo de osteoblastos, que son atraídos al sitio con el defecto de resorción y luego prosiguen para producir un nuevo hueso. La secuencia completa de los sucesos celulares que se producen en la superficie ósea durante el proceso de remodelación, ha sido descrita con detalle por Baron y colaboradores (Baron R, Vignery A, Horowitz M., Lymphocytes, macrophages and the regulation of bone remodeling. In: Bone and Mineral Research [Linfocitos, macrófagos y la regulación de la remodelación de hueso. En: Investigación de huesos y minerales], Peck WA coordinadores de edición, Amsterdam, Elsevier, 1984: 175-243.) a partir de estudios acerca del hueso alveolar de una rata, y por Boyce y colaboradores (Boyce BF, Yates AJP, Mundy GR. Bolus injections of recombinant human interleukin-1 cause transient hypocalcemia in normal mice [Unas inyecciones de bolos de la interleucina-1 humana recombinante pueden causar una hipocalcemia transitoria en ratones normales]. Endocrinology 1989; 125:2780-3) a partir de estudios del hueso craneal de un ratón. Los sucesos celulares que se producen en estos modelos son similares a los que se producen en un hueso humano adulto. En condiciones normales, la resorción de hueso y la formación de hueso están acopladas y en equilibrio. Es útil establecer una distinción entre el equilibrio del esqueleto y el acoplamiento de la formación de hueso con la resorción de hueso. Un desacoplamiento implica la disociación de estos dos procesos; o bien la creación de cavidades de resorción sin ninguna subsiguiente atracción de osteoblastos, como a veces se observa en una neoplasia, tal como en un mieloma múltiple, o inversamente, la deposición de nuevo hueso en sitios distintos de los sitios de la precedente resorción. Esto último ocurre de una manera llamativa en diversos tumores. tales como una enfermedad ósea metastásica debida a un carcinoma de mama o próstata. La extensión en la que una resorción o formación desacoplada se produce en un adulto sano no es conocida, pero es probable que sea un componente muy pequeño de un recambio (Jaworski ZFG, Meunier PJ y Frost HM. Observations on two types of resorption cavities in human lamellar cortical bone [Observaciones acerca de dos tipos de cavidades de resorción en un hueso cortical laminar humano]. Clin Orthop 1972; 83: 279-285.), posiblemente de manera principal en la reparación de microfracturas.

En el caso de la enfermedad de Paget de los huesos, hay poca evidencia de una formación desacoplada de hueso incluso en la presencia de una osteoesclerosis densa. Cuando el nuevo hueso formado está entretejido, como en la enfermedad de Paget de los huesos, puede surgir una osteoesclerosis trabecular sin necesariamente un aumento en la cantidad de colágeno (o de calcio) debido al colágeno empaquetado en una forma suelta (hueso entretejido en vez del hueso laminar normal bien organizado). Cuando es perturbado el equilibrio entre la formación y la resorción de hueso, cada secuencia de remodelación da como resultado una ganancia finita (o un equilibrio positivo, tal como en la enfermedad de Paget de los huesos, y un hiperparatiroidismo primario o secundario) o una pérdida de hueso (equilibrio negativo, como en una osteoporosis posterior a la menopausia, una osteoporosis de varones, una osteoporosis inducida por glucocorticoides, y una algodistrofia). La velocidad de ganancia o pérdida será amplificada en proporción a la frecuencia de activación de nuevas unidades de remodelación. La frecuencia de la activación es aumentada espectacularmente, pero sólo en un hueso afectados por la enfermedad de Paget de los huesos, mientras que aparece como normal en los sitios no afectados de los huesos. En otros enfermedades óseas, la frecuencia de activación es aumentada a lo largo de todo el esqueleto. Una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el aumento focal en la frecuencia de activación y en el equilibrio positivo observado en la enfermedad de Paget de los huesos, por lo tanto, conducirá al descubrimiento de terapias innovadoras dirigidas hacia modulaciones de los procesos de remodelación de hueso en otras enfermedades óseas metabólicas asociadas con un aumento universal de la frecuencia de activación a lo largo de todo el esqueleto: un hiperparatiroidismo primario y secundario, una osteoporosis posterior a la menopausia, osteoporosis inducida por glucocorticoides, y una algodistrofia. Puesto que una p62/SQSTMI está vinculada con la enfermedad de Paget de los huesos, ella será una diana potencial para intervenciones terapéuticas en otras enfermedades óseas metabólicas.

Por lo tanto, los autores del invento reivindican que ciertas mutaciones en el gen de p62/SQSTM1 pueden también estar asociadas con otros trastornos óseos, incluyendo a una osteoporosis. Correspondientemente, los métodos terapéuticos aquí descritos se pueden usar para tratar cualquier enfermedad ósea (incluyendo a la enfermedad de Paget de los huesos y a la osteoporosis).

También se describe aquí el hecho de que el presente invento hace posible una terapia génica como un enfoque terapéutico particular para una enfermedad ósea, en el que unas copias normales del gen de p62/SQSTM1 se introducen en pacientes para codificar con éxito una proteína p62/SQSTM1 normal en diversos tipos de células afectadas diferentes.

Los vectores retrovíricos se pueden usar para una terapia génica de células somáticas, especialmente a causa de su alta eficiencia de infección y de su integración y expresión estables. Las células establecidas como dianas, sin embargo, deben de ser capaces de dividirse, y la expresión de los niveles de una proteína normal deberá ser alta. El gen de p62/SQSTM1 normal de plena longitud puede ser clonado dentro de un vector retrovírico e impulsado desde su promotor endógeno o desde la repetición terminal larga retrovírica o desde un promotor específico para el tipo de célula diana que interesa (tal como células linfoides). Otros vectores víricos que se pueden usar incluyen virus adeno-asociados, virus de vaccínia, virus de papiloma bovino, o un virus de herpes tal como un virus de Epstein-Barr. Una transferencia de genes se podría conseguir también usando unos medios no víricos que requieran una infección "in vitro". Esto podría incluir a fosfato de calcio, a DEAE dextrano, una electroporación, a formulaciones lipídicas catiónicas o aniónicas (liposomas) y una fusión de protoplastos. Aunque estos métodos están disponibles, muchos de ellos son de menor eficiencia.

Unas estrategias basadas en un antisentido se pueden emplear para inhibir la función del gen de p62/SQSTM1 mutada y como una base para el diseño de fármacos terapéuticos. El principio está basado en la hipótesis de que una supresión de la expresión del gen, específica para una secuencia, se puede conseguir mediante una hibridación intracelular entre un ARNm y una especie antisentido complementaria. Es posible sintetizar nucleótidos con una hebra antisentido, que se fijan a la hebra del mismo sentido de ARN o ADN con un alto grado de especificidad. La formación de un dúplex híbrido de ARN puede interferir con el tratamiento/el transporte/la traducción y/o la estabilidad de un ARNm diana.

Se requiere una hibridación para que se produzca un efecto antisentido. Se han descrito efectos antisentido que usan una diversidad de enfoques, que incluyen el uso de oligonucleótidos antisentido, la inyección de un ARN antisentido, de un ADN y de un ADN y la transfección de vectores de expresión de un ARN antisentido.

Se pueden producir nucleótidos antisentido terapéuticos como oligonucleótidos o nucleótidos expresados. Los oligonucleótidos son cortas cadenas simples de ADN que usualmente tienen una longitud de 15 a 20 bases de un ácido nucleico. Los nucleótidos expresados se producen mediante un vector de expresión tal como un vector adenovírico, retrovírico o plasmídico. El vector es administrado a las células en fase de cultivo, o a un paciente, cuyas células constituyen entonces el nucleótido antisentido. Se pueden diseñar los vectores de expresión para producir un ARN antisentido, que puede variar en cuanto a su longitud desde unas pocas docenas de bases hasta varios millares de ellas.

Unos efectos antisentido se pueden inducir mediante secuencias (del mismo sentido) testigos. La extensión de los cambios fenotípicos es altamente variable. Los efectos fenotípicos inducidos por un antisentido están basados en cambios en criterios tales como los puntos finales biológicos, los niveles de proteínas, la medición de la activación de proteínas y los niveles del ARNm diana.

(g) Composiciones farmacéuticas

Las sustancias arriba descritas, incluyendo unos ácidos nucleicos que codifican una p62/SQSTM1 y una p62/SQS
TM1 mutada, unas proteínas p62/SQSTM1 y p62/SQSTM1 mutadas, unos anticuerpos, y unos oligonucleótidos antisentido, así como otros agentes que modulan a una p62/SQSTM1 y/o a una p62/SQSTM1 mutada, se pueden formular para dar composiciones farmacéuticas destinadas a su administración a individuos en una forma compatible biológicamente, que sea apropiada para su administración "in vivo". Por el concepto de "una forma biológicamente compatible que sea apropiada para su administración "in vivo"" se entiende una forma de la sustancia que se ha de administrar en la que cualesquiera efectos tóxicos son contrapesados por los efectos terapéuticos. Las sustancias se pueden administrar a organismos vivos, incluyendo a seres humanos y animales.

La administración de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones farmacéuticas del presente invento se define como una cantidad efectiva, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo que se necesitan para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de una sustancia puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo, y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente, o la dosis se puede reducir de una manera proporcional tal como se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

Una sustancia activa se puede administrar de una manera conveniente, tal como por inyección (por vía subcutánea, intravenosa, etc), mediante una administración por vía oral, por inhalación, mediante aplicación por vía transdérmica, o mediante administración por vía rectal. Dependiendo de la ruta de la administración, la sustancia activa puede ser revestida con un material para proteger al compuesto con respecto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar al compuesto. Si la sustancia activa es un ácido nucleico que codifica, por ejemplo, una p62/SQSTM1 modificada, ella se puede suministrar usando técnicas conocidas en la especialidad.

Las composiciones aquí descritas se pueden preparar por métodos conocidos de por sí para la preparación de composiciones aceptables farmacéuticamente, que se pueden administrar a individuos, de manera tal que una cantidad efectiva de la sustancia activa es combinada en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos apropiados se describen, por ejemplo, en la obra Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE.UU. 1985) o en el manual Handbook of Pharmaceutical Additives [Manual de aditivos farmacéuticos] (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)). Sobre esta base, las composiciones incluyen, si bien no de manera exclusiva, unas soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden estar contenidas en soluciones tamponadas con un apropiado pH y/o pueden ser iso-osmóticas con fluidos fisiológicos. A este respecto, se puede hacer referencia a la patente de los EE.UU. 5.843.456. Como se apreciará también por parte de los expertos, la administración de las sustancias aquí descritas puede efectuarse mediante un vehículo vírico inactivo.

(h) Estuches

Los reactivos apropiados para llevar a cabo los métodos del invento se pueden envasar dentro de estuches convenientes que proporcionen los materiales necesarios, envasados dentro de recipientes apropiados. Tales estuches pueden incluir todos los reactivos requeridos para detectar una molécula de ácido nucleico o proteína del invento en una muestra, por medio de los métodos aquí descritos, y opcionalmente unos apropiados soportes útiles para realizar los métodos del invento. Los estuches pueden ser útiles para detectar la enfermedad de Paget de los huesos u otras enfermedades óseas.

Se describe un estuche que incluye unos cebadores que son capaces de amplificar una molécula de ácido nucleico del invento o un fragmento de oligonucleótido predeterminado de la misma, todos los reactivos requeridos para producir la molécula amplificada de ácido nucleico o un fragmento previamente determinado de la misma en la reacción en cadena de la polimerasa, y unos medios para ensayar las secuencias amplificadas.

En un estuche, los cebadores pueden amplificar a un ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, preferiblemente la proteína de SEQ.ID.NO.:4. En dicho caso, el cebador amplificará a la región que rodea al nucleótido 1215 en la secuencia mostrada en SEQ.ID.NO.:3.

El estuche puede incluir también unas enzimas de restricción para digerir a los productos de la PCR. Otro estuche contiene una sonda de nucleótidos que se hibrida con una molécula de ácido nucleico del invento, los reactivos requeridos para la hibridación de la sonda de nucleótidos con la molécula de ácido nucleico, e instrucciones para su uso. Un estuche adicional incluye anticuerpos del invento y los reactivos requeridos para fijar el anticuerpo a una proteína p62/SQSTM1 mutada del invento en una muestra.

Los métodos y los estuches aquí descritos se pueden usar para detectar la enfermedad de Paget de los huesos. Las muestras que se pueden ensayar incluyen materiales corporales tales como sangre, orina, suero, lágrimas, saliva, heces, tejidos, células y similares. Además de nuestras humanas, se pueden tomar muestras a partir de mamíferos, tales como primates no humanos, etc.

Antes de ensayar una muestra de acuerdo con los métodos aquí descritos, la muestra se puede concentrar usando técnicas conocidas en la especialidad, tales como las de centrifugación y filtración. Para la hibridación y/o para los métodos basados en una PCR, que aquí se describen, los ácidos nucleicos se pueden extraer a partir de extractos celulares de la muestra en ensayo usando técnicas conocidas en la especialidad.

La anterior descripción describe generalmente el presente invento. Una comprensión más completa se puede obtener haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen solamente con la finalidad de proporcionar una ilustración y no se pretende que limiten el alcance del invento. Ciertos cambios en la forma y en la sustitución de equivalentes se consideran como circunstancias que se pueden sugerir como, o hacer, convenientes. Aunque se han empleado aquí unos términos específicos, se entienden dichos términos en un sentido descriptivo y no para finalidades de limitación.

Los siguientes Ejemplos no limitativos son ilustrativos del presente invento.

Ejemplos Ejemplo 1

Los autores del invento han identificado una proteína p62 que interactúa con una proteína cinasa C atípica mutada secuestrosoma 1 (p62/SQSTM1) como el gen que causa la enfermedad de Paget de los huesos.

Estrategia general

Una región en el cromosoma 5 banda q35 para el telómero del genoma humano que contiene el locus genético PDB3,.que causa la enfermedad de Paget de los huesos, ha sido confinada dentro de un intervalo de 6 cM. Este locus de PDB3 que contiene el gen de p62/SQSTM1, fue identificado usando una diversidad de técnicas genéticas, inclusive el cartografiado genético que arriba se ha definido. Basándose en los estudios de grandes familias extendidas ("parentescos o genealogías") con múltiples casos de la enfermedad de Paget de los huesos, así como aproximadamente 100 pacientes esporádicos afectados por el trastorno, la región cromosomal que contenía el gen de la enfermedad se refinó a aproximadamente 2 millones de nucleótidos en el cromosoma 5q35. La región que contiene la p62/SQSTM1 fue unida físicamente por CA5-5 y CA5-26. (Los inventores han desarrollado sus propios marcadores de dinucleótidos partiendo de una secuencias que están disponibles públicamente).

Recursos de población

Para identificar la base molecular de la enfermedad de Paget en los huesos, los autores del invento realizaron estudios de vinculación genética y de haplotipo en familias del Canadá francófono. Los parentescos que se originan de esta población son particularmente bien idóneos para dichos estudios (Morissette y colaboradores 1995; Morissette y colaboradores 1998). Desde luego, por razones sociales y lingüísticas, esta población ha mantenido durante las últimas tres centurias un crecimiento demográfico sin inmigración y, hasta una época reciente, un tasa alta de nacimientos con grandes hermandades de sangre, que contienen de 10 a 15 hermanos de sangre por generación (Bouchard and Braekeleer 1991). La reconstrucción de la genealogía fue facilitada también por su conservación de registros genealógicos, incluyendo los certificados de nacimiento, de matrimonio y de defunción, que se remontan hasta los primeros inmigrantes. Con el fin de contrarrestar la heterogeneidad genética de la enfermedad de Paget de los huesos, los autores del invento aprovecharon estos atributos y emprendieron el escrutinio sistemático de grandes familias del Canadá francófono, afectadas por trastorno.

Los autores del invento reclutaron 24 familias del Canadá francófono con por lo menos dos parientes de primer grado afectados, para un total de 554 individuos, incluyendo 56 cónyuges. Estos parentescos eran de diferentes tamaños y complejidades. Ocho de ellos comprendían entre 30 y 71 individuos y 14 presentaban la enfermedad de Paget de los huesos a lo largo de dos generaciones. Doce genealogías procedían de la misma zona geográfica.

Entre estos 554 individuos, a 105 se les diagnosticó la enfermedad de Paget de los huesos. La edad al realizar el diagnóstico variaba entre los 29 y 89 años, con una edad media de 58 años. La mayoría de estos pacientes fueron diagnosticados con una edad de 60 años o eran más viejos (63/105; 60%) mientras que sólo un pequeño número de ellos se diagnosticaron antes de los 40 años de edad (3/105; 2,9%). La enfermedad de Paget de los huesos se estaba segregando como un rasgo dominante autosómico con una penetrancia incompleta, dependiente de la edad dentro de las genealogías.

Con el fin de identificar a uno de p62/SQSTM1 como el gen mutado que causa la enfermedad de Paget de los huesos, los autores del invento estudiaron también a 112 pacientes afectados por el trastorno. Estos pacientes fueron reclutados como casos esporádicos.

Cartografiado genético y confinamiento de la enfermedad de Paget de los huesos junto al locus PDB3 en el cromosoma 5q35-qter

Unos marcadores genéticos, útiles en la búsqueda de un locus genético asociado con una enfermedad, se pueden seleccionar sobre una base "ad hoc" cubriendo densamente a un cromosoma específico, o por un análisis detallado de una región específica de un cromosoma. Los autores del invento realizaron unos análisis de la vinculación genética en 24 parentescos del Canadá francófono, en los que el trastorno se estaba segregando como un rasgo dominante autosómico. Dos nuevos loci para la enfermedad de Paget de los huesos fueron cartografiados junto al cromosoma 5q35-qter y junto al cromosoma 5q31. Estos dos loci han sido denominados PDB3 y PDB4, respectivamente.

Una vez que se ha establecido la vinculación, unos marcadores que flanquean al locus de la enfermedad, es decir uno o más marcadores próximos al locus de la enfermedad, y uno o más materiales alejados del locus de enfermedad, necesitan ser identificados. El locus PDB3 fue definido por el marcador AFM 137xf6 junto al locus D5S469 y el telómero. Para refinar aún más el intervalo genético. 11 marcadores polimorficos de dinucleótidos fueron diseñados dentro del intervalo genético. Estos marcadores fueron diseñados buscando "in silico" el proyecto del genoma humano disponible electrónicamente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ para repeticiones de dinucleótidos. Una síntesis de cebadores apropiados situados alrededor de estas repeticiones se realizó con el fin de amplificar a los dinucleótidos. Los cebadores usados para tipificar genómicamente los marcadores dinucleótidos polimórficos diseñados para confinar el intervalo de PDB3 se muestran en la Tabla 1 (SEQ.ID.NOS.:5-20). 112 pacientes esporádicos fueron tipificados genómicamente para encontrar pacientes que llevaban los mismos alelos que los que se identificaron en las familias vinculadas junto al sitio PDB3 (haplotipos: PDB3H1 y PDB3H2). Los alelos de los marcadores ensayados, definieron una signatura genética que se usó para refinar aún más el intervalo genético de PDB3 dentro de los marcadores CA5-5 y CA5-26.

Construcción de un mapa físico integrado del locus PDB3

Estando dado un intervalo definido genéticamente por recombinantes genéticos y meióticos, se necesita generar un cóntigo de clones genómicos que franquee el intervalo. Unos recursos públicamente disponibles, tales como los del The National Center for Bioinformatics, y del Laurence Livermore Laboratory (cromosoma 5 mapa de Marzo de 2001), proporcionan unos mapas de cromosomas alineados de marcadores genéticos, unos sitios marcados por secuencias (STSs de Sequence Tagged Sites), unos datos de mapas híbridos con radiación, unos clones de cromosomas artificiales de levadura (YAC's de Yeast Artificial Chromosomes) CEPH, cromosomas artificiales de bacterias (BAC's de Bacterial Artificial Chromosomes) y unos cromosomas artificiales de P1 (PAC's de P1 Artificial Chromosomes). Los autores del invento usaron algunos de estos recursos, todos los cuales están disponibles electrónicamente, para construir in silico un cóntigo de BAC que cubre al locus PDB3. Unos pares de cebadores de oligonucleótidos para los marcadores situados en el intervalo fueron sintetizados a fin de validar a algunos de los BACs que franqueaban el intervalo definido genéticamente.

Secuenciación genómica de genes candidatos para la enfermedad de Paget de los huesos dentro del intervalo mínimo

Se usaron unos recursos procedentes del Proyecto del Genoma Humano para identificar "in silico" a genes situados dentro del intervalo genético. Estos genes representan a candidatos potenciales para causar la enfermedad de Paget de los huesos. Estos genes fueron cartografiados "in silico" sobre el cóntigo de BAC en la trayectoria de planeo. Algunas marcas de secuencias expresadas (EST's de Expressed Sequence Tags), fueron también cartografiados "in silico" en el cóntigo de BAC. Algunos genes de estos genes candidatos fueron secuenciados, pero no se encontraron mutaciones en ellos.

Escrutinio de mutaciones del gen de p62/SQSTM1 e identificación de una mutación que causa la enfermedad de Paget de los huesos

Entre los muchos genes que fueron escrutados para descubrir una mutación, uno de estos genes era la proteína p62 que interactúa con la proteína cinasa C atípica/secuestrosoma 1 (p62/SQSTM1). La Tabla 2 muestra la secuencia de los cebadores que se usaron para secuenciar al gen de p62/SQSTM1 (SEQ.ID.NOS.:21-36). Una variación de nucleótidos en la posición de nucleótido 1215 del gen de p62/SQSTM1, que cambiaba el aminoácido Pro por el Leu en la posición de aminoácido 392 (Pro392Leu), fue detectada en 11 parentescos de los recursos familiares. Se encontró que esta variación se segregaba con el trastorno en estas familias. La secuenciación de los 112 casos esporádicos reveló que 18 pacientes llevaban también la variación. La secuenciación de 86 cónyuges no afectados y de 205 individuos procedentes de la población general no revela ningún cambio en la secuencia de p62/SQSTM1 de tipo salvaje. Estos datos demuestran por lo tanto que la variación de C a T en la posición 1215 del gen de p62/SQSTM1 es, de hecho, una mutación que causa la enfermedad Paget de los huesos.

No se encontraron mutaciones adicionales causantes de la enfermedad. No obstante, se identificaron cinco SNP's [de Single Nucleotide Polymorphisms = polimorfismos de un único nucleótido]: 380C\rightarrowT (A117V), en el exón 3; 862G\rightarrowC (Q274E), en el exón 6; 916C\rightarrowT (D292D), en el exón 6; 976G\rightarrowA (R312R), en el exón 6; y 994C\rightarrowA (S318S) en el exón 6. Las frecuencias de estos cinco SNP's eran similares en tres individuos afectados y no afectados. Ninguno de estos SNP's tenía alelos asociados con la mutación. Sin embargo, dos de estos SNP's, el 916C\rightarrowT y el 976G\rightarrowA mostraron unos alelos distintos que se segregaban concomitantemente con los haplotipos de la enfermedad. Por ejemplo, el haplotipo PDB3H1 albergaba un T y un A en las posiciones 916 y 976 respectivamente, mientras que la signatura PDB3H2 presentaba un C y un G en estas dos posiciones.

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TABLA 1

1

TABLA 2

2

Citas completas para las referencias mencionadas en la memoria descriptiva

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<210> 1

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<212> ADN

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3

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<223> Cebador inverso CA5-9

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<223> Cebador en avance CA5-25

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<223> Cebador inverso CA5-25

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<223> Cebador en avance CA5-27

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<223> Cebador inverso CA5-27

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcccggcta aaaatacat

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcccatttt ccgccagc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttggtcacc actccagtca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggggtagt cttgcctctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagccctca aattgctgac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtttcctgg tggacccatt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgacagccc cacagtgac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaattctt gccttgcaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacctgtct gaggtgagc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtggtcc agcactacta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagtgggag gaaggagagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttagctgct tgtggggact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccctcggg tttgtaagtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador del mismo sentido p62-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agacccctgc agccttaact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaactccta acctcccaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador del mismo sentido p62-8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactgtggcc tgtgaggac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador antisentido p62-8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgagcct tgggtctcg

\hfill

19

Claims (18)

1. Un método para detectar una condición asociada con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende ensayar una muestra para descubrir

(a) un ácido nucleico que codifica la proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ. ID NO. :3 o un fragmento de la misma; o

(b) una proteína que tiene la secuencia mostrada en SEQ. ID NO.: 4 o un fragmento de la misma.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la condición es la enfermedad de Paget de los huesos.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el método comprende poner en contacto la muestra con una sonda de nucleótidos capaz de hibridarse con la molécula de ácido nucleico para formar un producto de hibridación, en unas condiciones que permiten la formación del producto de hibridación, y ensayar para descubrir el producto de hibridación.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se fija a una p62/SQSTM1 mutada, que es capaz de ser detectada después de que haya quedado unida a la p62/SQSTM1 mutada en la muestra.

5. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ. ID NO.: 4 o un fragmento de la misma, en la que dicho fragmento comprende la posición de aminoácido 392 mostrada en SEQ. ID NO.: 4.

6. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho fragmento comprende un dominio asociado a ubiquitina.

7. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende

(a) una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ.ID.NO.:3, en la que la T puede también ser U;

(b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con una secuencia de ácido nucleico de (a);

(c) una secuencia de ácido nucleico que tiene una homología sustancial de secuencias con una secuencia de ácido nucleico de (a) o (b);

(d) una secuencia de ácido nucleico que es una análoga a una secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c); o

(e) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) en condiciones rigurosas de hibridación,

en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un aminoácido en la posición 392 como se muestra en SEQ. ID NO :4.

8. Una proteína aislada que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ. ID NO: 4 o un fragmento de la misma, en la que dicho fragmento comprende la posición de aminoácido 392 mostrada en SEQ. ID NO: 4.

9. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 8, en la dicho fragmento comprende un dominio asociado a ubiquitina.

10. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una proteína de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 para detectar una enfermedad de los huesos.

11. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 para detectar la enfermedad de Paget de los huesos.

12. Un oligonucleótido antisentido que es complementario con la longitud entera de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

13. Un vector de expresión que comprende un módulo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

14. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión de la reivindicación 13.

15. Un anticuerpo que se puede fijar a una proteína de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en la posición de aminoácido 392.

16. Un método de identificar una sustancia que se puede fijar con una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende las operaciones de:

(a)

incubar una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma, y una sustancia de ensayo, en unas condiciones que permiten la formación de un complejo entre la proteína p62/SQSTM1 y la sustancia de ensayo, y

(b)

ensayar para descubrir complejos de la proteína p62/SQSTM1 mutada y de la sustancia de ensayo, para descubrir a la sustancia libre o para descubrir a la proteína p62/SQSTM1 mutada no convertida en complejo, en que la presencia de complejos indica que la sustancia de ensayo es capaz de fijarse a la proteína p62/SQSTM1 mutada.

17. Un método para identificar un compuesto que afecta a la actividad o la expresión de una proteína p62/SQSTM1 mutada, que comprende:

(a)

incubar un compuesto de ensayo con una proteína p62/SQSTM1 mutada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 4 o un fragmento de la misma o un ácido nucleico que codifica una proteína p62/SQSTM1 mutada, teniendo el ácido nucleico la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 3 o un fragmento de la misma, y

(b)

determinar una cantidad de actividad o expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada y compararla con un testigo, en que un cambio en la actividad o expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada en comparación con el testigo indica que el compuesto de ensayo tiene un efecto sobre la actividad o la expresión de la proteína p62/SQSTM1 mutada.

18. Un animal no humano que es portador de una mutación en un gen que codifica una proteína p62/SQSTM1, en el que dicha mutación corresponde a la proteína p62/SQSTM1 humana mostrada en SEQ. ID NO. 4.