ES2257805T3

ES2257805T3 - Perfeccionamiento de la produccion de etanol a partir de lignocelulosa.

Info

Publication number: ES2257805T3
Application number: ES98914397T
Authority: ES
Inventors: Lonnie O. Ingram; Brent E. Wood
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: AU6875898A; WO1998045418A1; CA2285312A1; ZA982740B; EP0981608A1; US6333181B1; AU755248B2; DE69833190T2; PT981608E; DE69833190D1; JP2001518790A; US20030054500A1; ATE315642T1; EP0981608B1

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para mejorar la degradación enzimática de la lignocelulosa, tal como la que se utiliza en la producción de etanol a partir de material lignocelulósico, a través de la utilización de un tratamiento ultrasónico. La invención muestra que el tratamiento ultrasónico reduce las necesidades de celulasa entre 1/3 y 1/2. Teniendo en cuenta que el coste de las enzimas es el mayo problema en la producción de etanol a partir de material lignocelulósico, esta invención representa una mejora significativa sobre los procedimientos actualmente disponibles.

Description

Perfeccionamiento de la producción de etanol a partir de lignocelulosa.

Antecedentes de la invención

Ultrasonido se puede definir como ondas sonoras por encima del rango de la percepción humana (Price, G.J., Tendencias corrientes en Sonoquímica. G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry Special Publication No 116. Royal Society of Chemistry: Cambridge, U.K. (1992). Actualmente son disponibles muchas tecnologías ultrasónicas, tales como SONAR, diagnósticos médicos y limpiadores de superficies. SONAR y las aplicaciones médicas generalmente utilizan baja potencia y alta frecuencia (\geq 1 MHz). Sin embargo, las aplicaciones de limpieza de superficies dependen de cavitaciones ultrasónicas creadas por de más baja frecuencia (20-50 Khz) y alta potencia ultrasonido.

Las cavitaciones ultrasónicas resultan de la rápida compresión y expansión de un líquido. En la fase de expansión, el líquido se "separa o desgarra", dando por resultado la formación de oquedades o burbujas Price, G.J. "Introduction to sonochemistry" Current Trends in Sonochemistry. G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry Special Publication No. 116 Royal Society of Chemistry: Cambridge U.K. (1992); leeman, S. And P.W. Vaughan, Current Trends in Sonochemistry, G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry Special Publication No 116, Royal Society of Chemistry: Cambridge U.K. (1992). Estas burbujas gradualmente aumentan en tamaño hasta que se alcanza un tamaño crítico, donde el tamaño crítico (habitualmente 100-200 \mum en diámetro) es dependiente de la frecuencia de la oscilación y de la presencia de algunos agentes nucleantes, por ejemplo, gases disueltos, fisuras y grietas sobre una superficie sólida o sólidos en suspensión (Atchley, A.A., y L.A. Crum. "Capítulo 1: Cavitación acística y dinámica de burbujas" Ultrasonido: Sus Efectos Químicos, Físicos y Biológicos. K.S. Suslick ed. VCH, New York, N.Y. (1988); Price, G.J. "Introducción ala sonoquímica" Current Trends in Sonochemistry. G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry Special Publication No. 116 Royal Society of Chemistry: Cambridge U.K. (1992).Una vez que se ha alcanzado su tamaño crítico, la burbuja explosiona hacia adentro, a veces, generando temperaturas, que se aproximan a 5.500ºC dentro de la burbuja (Suslick, K.S., "Los Efectos Químicos de Ultrasonido", Scientific American p. 80-86 (Feb. 1989); Price, G.J. "Introduction to sonochemistry" Current, Trends in Sonochemistry. G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry: Cambridge U.K. (1992). Cuando el colapso o hundimiento de una cavidad ocurre en una solución libre de partículas sólidas, el calentamiento es la única consecuencia. Sin embargo, si la implosión hacia adentro ocurre cerca de una superficie sólida, la implosión es asimétrica. A medida que el agua afluye para llenar el hueco dejado por la burbuja de implosión (por ejemplo, a velocidades próximas a los 400 m/s), se pueden generar presiones de choque de 1-5 Kpa (Suslick, K.S., "Capítulo 4. Homogeneous Sonochemistry" Ultrasound: Its Chemical, Physical and Biological Effects. K.S. Suslick ed. VCH, New York, N.Y.1988, 123-146; Suslich, K. S., "The Chemical effects of Ultrasound", Scientific American p. 80-86 (Feb. 1989); Price G.J. "Introduction to sonochemistry" Current Trends in Sonochemistry G.J. Price ed. Royal Society of Chemistry Special Publication No. 116. Royal Society of Chemistry:Cambridge U.K. (1992).

Los efectos físicos de las cavitaciones ultrasónicas han sido conocidos desde las pruebas iniciales del primer destructor Británico, el H.M.S. Daring, en 1894 (Suslick, K. S., Science, 247:1439-1441 (1990). La rápida revolución de una hélice de barco crea las mismas, alta frecuencia, compresiones y expansiones creadas por ultrasonido (Suslick, K.S., "Los Efectos Químicos de Ultrasonido", Scientific American (Febrero 1989) págs. 80-86). Las cavitaciones alrededor de la hélice del Daring causaron picadura de corrosión localizada o alveolar de los metales empleados. Este efecto de cavitaciones sobre superficies metálicas se ha confirmado en estudios sobre cavitaciones ultrasónicas (Leeman, S. and Vaughan, P.W., "Fenómenos de cavitación" Tendencias corrientes en Sonoquímica, G.J. Price ed. royal Society of Chemistry Special Publication No 116. Royal Society of Chemistry: Cambridge, U.K. (1992); Boudjouk.P. "Capítulo 5. Sonoquímica heterogénea" Ultrasonido: Sus Efectos Químicos, físicos y Biológicos. K.S. Suslick ed. VCH, Nueva York, NY. (1988)) La agitación de alta intensidad, la dispersión de sólidos en suspensión, la incrementada difusión a través de los geles de celulosa y la emulsificación o el emulsionamiento de líquidos inmiscibles son otros efectos atribuibles a las cavitaciones ultrasónicas (Ensminger, 1973).

Las altas temperaturas, presiones y velocidades producidas por la cavitación ultrasónica también pueden crear ambientes químicos inusuales (Suslick K.S. "The Chemical Effects of Ultrasoundd" Scientific American (Febrero 1989) p. 80-86). Compuestos en solución acuosa han mostrado formar radicales libres cuando se someten a ultrasonido. El agua, cuando se somete a ultrasonido, crea H. y .OH intermedia produciendo en último lugar H_{2} y H_{2} O_{2} (Suslick, K.S., "Capítulo 4. Sonoquímica Homogénea" Ultrasonido: Sus Efectos Químicos, Físicos y Biológicos. K.S. Suslick ed. VCH, New York, N.Y. (1988), 123-146. Otros efectos químicos se pueden causar por colisiones de alta o gran velocidad impulsada por ondas de choque. Se ha mostrado la aglomeración de partículas metálicas en campos ultrasónicos (Suslick, K.S. "Los Efectos Químicos de Ultrasonido", Scientific American Febr. págs. 80-86 (1989); Suslick,K.S., Science 247:1439-1441 (1990).

Los limpiadores de superficie ultrasónicos han sido disponibles para su uso a principios de la década de 1950 (Shoh.A., "Capítulo 3. Aplicaciones industriales de Ultrasonido" Ultrasonido; Efectos Químicos, Físicos y Biológicos. K.S. Suslick ed. VCH, New York, N.Y. (1988)). El mecanismo de la acción limpiadora confía en la formación de burbujas de cavitación. La capa contaminante se puede erosionar o desgastar gradualmente a través de la acción cavitacional. Alternativamente, la formación de burbujas cavitacionales entre la capa y la superficie efectivamente desprende la capa de la superficie. Otros diseños de sistemas de limpieza ultrasónica tienen una eficiencia extremadamente elevada (> 95%).

La mayoría de las aplicaciones biológicas de tecnología ultrasónica se han dirigido hacia la disrupción o ruptura de membranas de células (Shoh. A., "Capítulo 3. Aplicaciones industriales de Ultrasonido" Ultrasonido: Sus Efectos Químicos, Físicos y Biológicos. K.S. Suslick ed. VCH, New York, N.Y. (1988); Ausubel, F.M., et al. Protocolos corrientes en Biología Molecular Green Publishing and Wiley Interscience, New York, N.Y. (1996). Un dispositivo de este tipo es Fisher Scientific's Model 550 Desmembrador Sónico. Recientemente, se han investigado los efectos de intensidades más bajas de ultrasonido sobre las bacterias. Se ha observado que dosis inocuas de ultrasonido pudieran causar la inducción de la respuesta SOS y la trascripción de proteínas de golpe de calor en Escherichia coli (Volmer, A.C. et al. "Inducción de la respuesta a golpes de calor en Escherichia coli mediante los efectos de cavitación acústica procedente de Ultrasonido" Res. 1-85, pag. 317. Res. 96^{th} Annu. Meett. Am. Soc. Microbiol, American Society for Nicrobiology, Washington, DC (1996)). Algo del daño físico a E. coli, mediante cavitación ultrasónica, se ha ilustrado recientemente (Allison, D.G. et al., "J. Basic Microbiol." 36(1):3-11. (1996)) mostrando la ruptura o disrupción de la membrana del plasma y subsiguiente falta de estanqueidad de los componentes
intracelulares.

En la fermentación de la leche mediante Lactobacillus bulgaricus, la cuota de la hidrólisis de lactosa se incrementa con el uso de ultrasonido discontinuo (Wang, D. et al., J.Chem. Tech. Biotechnol. 65:86-92 (1996)). Presumiblemente, la causa de la cuota incrementada de hidrólisis era la liberación de enzimas intracelulares a los medios. Después de que se detuvo el tratamiento ultrasónico, L. bulgaricus era capaz de recuperarse y crecer.

Barton S. et al., Enzime and Microbial Technology 18:190-194 (1996) da a conocer el efecto del ultrasonido sobre la actividad enzimática, en particular sobre la hidrólisis de almidón y glicógeno catalizada por \alpha-amilasa y amiloglucosidasa.

Se ha mostrado reciente interés en el ultrasonido por aquellas personas implicadas en la investigación en la industria papelera investigando sus usos como un dispositivo de destintado en el reciclado de diverso papel de oficina (Scott, W. E. y P. Gerber. TAPPI J. 78:125-130 (1995); Sell, N,J. et al., Progreso en el Reciclado de Papel págs. 28-34 (Agosto 1995); Norman J.C., et al., TAPPI J.77:151-158 (1994)). Se ha informado que, a causa del tratamiento ultrasónico, se cambió la estructura del papel de tal manera que aumentó su capacidad de retención de agua.

Además del reciclado del producto papel, existe un interés en la fermentación de papel de desecho y otros productos lignocelulósicos a etanol. La producción de etano a partir de esta clase de productos reduce los problemas ambientales de los residuos y reduce la dependencia de carburantes dará automoción basados en el petróleo. Hohmann, N. y C.M. Rendieman, Tecnologías de Emergencia en la Producción de Etanol, USDA Ag. Info. Boletín No 663, U.S. Departamento de Agricultura: Washington, DC (Enero 1993); Sheehan, J.J., "Capítulo 1. Bioconversión para la producción de carburantes para transporte renovables en los Estados Unidos: una perspectiva estratégica" Conversión Enzimática de Biomasa para la Producción de Combustibles. Himmel, M.E.; Baker, J.O.; Overend, R.P., eds. ACS Symposium Series 566, American Chemical Society: Washington, DC (1993)). La accesibilidad del substrato a la celulosa es un factor primario, que influye en la eficiencia de la degradación enzimática de la celulosa (Nazhad, M.M. et al., Enz. Microb. Tech. 17:68-74 (1995).

Celulosa procedente de T. longibrachiatum es conocida para ligarse compactamente (Brooks, T.A. and L.O. Ingram, Biotechnol, Prog. 11(6):619-625 (1995)). La ligazón también ha demostrado ser dependiente de la intensidad de agitación (Kaya F. Et al. J. Biotech 36:1-10 (1994)). Efectos similares se han visto con un reactor de transferencia de masa intensiva, donde se alcanzaron cuotas de hidrólisis extremadamente elevadas (Gusakov, A.V. et al., Appl. Biochem, Biotechnol. 56:141-153 (1996)).

La U.S. Patente Nº 5,424,202 describe la conversión de azucares presentes en la celulosa en etanol, por los huéspedes recombinantes que expresan genes que codifican enzimas etanologénicas.

Sumario de la invención

Son deseable métodos perfeccionados para convertir enzimáticamente la lignocelulosa, por ejemplo, en etanol. Esta invención informa sobre el uso de un tratamiento ultrasónico en un proceso Simultáneo de Sacarificación y Fermentación (SSF) para aumentar la habilidad de la celulosa para hidrolizar papel de desecho para oficinas mezclado (MOWP), reduciendo de este modo los requerimientos de celulosa en 1/3 a 1/2. SSF es un proceso en el cual organismos etanologénicos, tales como los microorganismos genéticamente manipulados, tales como Escherichia coli Koll (Ingram, L.O. et al. , U.S. Patente Nº 5,000,000 (1991) y Klebsiella oxytoca P2 (Ingram, L.O. et al., U.S. Patente 5,424,202 (1995), se combinan con enzimas de celulasa y lignocelulosa para producir etanol. El coste de la enzima es un problema principal para todos los procesos de SSF.

Al realizar la invención no resulta afectada la estabilidad de la enzima y, sorprendentemente, el tratamiento ultrasónico continuo da por resultado una disminución en la hidrólisis con relación al tratamiento discontinuo. Una posible explicación es que la mezcla resultante no permite a la celulasa que se religue a la celulosa un tiempo bastante largo para que se lleve a cabo la catálisis. Por consiguiente, se desea tiempo para permitir la catálisis entre tratamientos ultrasónicos.

El SSF de papel de desecho para oficinas mediante K. oxytoca también pudiera ser "dependiente del ciclo". Considerando el efecto inhibidor del ultrasonido sobre el crecimiento de K. oxytoca P2, parece ser deseado un "período de recuperación". Con la variación en el programa o plan de tratamiento, tal como el aumento o la disminución del tiempo de tratamiento a través del curso de la fermentación, puede ser posible una ulterior optimización de la fermentación.

El uso de ultrasonido en la conversión de la celulosa en etanol representa un mejoramiento significante en el proceso de SSF. Esto es particularmente cierto cuando se usaron residuos de lignina para generar la electricidad necesaria para el proceso. También se puede suministrar ultrasonido en otras maneras, con sistemas silbantes de líquido, que son capaces de aumentar la capacidad del papel reciclado de retener agua (Scott, B.E. y P. Gerber, TAPPI J. 78:125-130 (1995). Este tipo de dispositivo en un circuito de tubería puede producir la deseada disrupción o ruptura de la estructura fina de celulosa, con una entrada inferior de energía.

En el caso de una forma de realización, la invención comprende un método para producir etanol a partir de lignocelulosa, comprendiendo un tratamiento discontinuo de una mezcla acuosa, que contiene lignocelulosa, a una celulasa y un microorganismo etanologénico con ultrasonido bajo unas condiciones suficientes para que se lleve a cabo una hidrólisis de dicha lignocelulosa, a fin de producir etanol de este modo.

En el caso de una forma de realización preferida, el microorganismo etanologénico es una bacteria etanologénica o levadura, que expresa una o más enzimas o sistemas de enzimas, que, a su vez, catalizan (individualmente o conjuntamente) la conversión de un azúcar (por ejemplo, xilosa y/o glucosa) a etanol. Los organismos etanologénicos incluyen especies de Zymomomas, Erwinia, Klebsiella, Xanthomonas y Escherichia. En el caso de una realización altamente preferida, la bacteria es K. oxytoca P2.

En el caso de otra forma de realización el fermento (levadura) etanologénico o la bacteria etanologénico contiene enzimas que degradan el material lignocelulósico, liberándose las enzimas del microorganismo etanologénico mediante una disrupción o rompimiento ultrasónico.

Breve descripción de los dibujos

Lo precedente y otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto partiendo de la siguiente descripción más concreta de formas de realización preferidas de la invención, como queda ilustrado en los dibujos adjuntos, donde como referencia los caracteres se refieren a las mismas partes a través de las diferentes vistas. Los dibujos no son necesariamente a escala, poniéndose, más bien, el énfasis en ilustrar los principios de la invención.

La figura 1 muestra que el tratamiento ultrasónico no afectó a la actividad de la celulasa o \beta-glucosidasa añadida.

Las figuras 2A y 2B muestran la susceptibilidad de K. oxytoca al daño ultrasónico.

Descripción detallada de la invención

Como queda descrito más arriba, la invención se refiere a un método mejorado para la hidrólisis enzimática de la lignocelulosa, el cual comprende el sometimiento de una mezcla acuosa, que contiene lignocelulosa, con ultrasonido; y el contacto de la mezcla con una celulasa bajo unas condiciones suficientes para la hidrólisis. La mezcla acuosa se somete al tratamiento de ultrasonido de modo discontinuo. Generalmente, el ultrasonido se efectuará con un equipo comercialmente disponible. Ejemplos de pruebas ultrasónicas adecuadas incluyen el RS-20 Ultrasonic Tubular Resonator y los RG-36/RS-36 Tube Resonator Systems (Telsonic USA, Bridgeport, NJ). Estas pruebas ultrasónicas se podrán combinar con generadores ultrasónicos para mantener los parámetros de funcionamiento deseados, tales como la frecuencia y la potencia de funcionamiento. Los ejemplos de generadores ultrasónicos adecuados incluyen el RG-20 Ultrasonic-Generator y el MRG-36-150 Module-Cleaning-Generator (Telsonic USA, Bridgeport, NJ). El tratamiento de ultrasonidos se podría realizar en una amplia gama de frecuencias, la totalidad de las cuales exhiben efectos similares. Por ejemplo, la frecuencia puede oscilar entre por encima de 2 y 200 kHz. Se seleccionan la duración y las condiciones del paso ultrasónico para evitar el sobrecalentamiento de la mezcla hasta una temperatura, a la cual se desnaturalizarán cantidades significativos de la(s) enzima(s). Generalmente, la duración del tratamiento de ultrasonidos oscila entre 10 minutos y 30 minutos. Sin ser limitado en modo alguno por la teoría, el tratamiento de ultrasonidos es típicamente suficiente para romper la estructura cristalina del material lignocelulósico.

El término tratamiento "continuo" se define aquí para incluir un tratamiento único con ultrasonido para la duración de la hidrólisis enzimática, es decir, no existen períodos intermedios entre o durante la hidrólisis enzimática, en los cuales no haya ultrasonido. El término tratamiento "discontinuo" se define aquí para incluir tratamientos múltiples con ultrasonido entre o durante la hidrólisis enzimática.

El material de lignocelulosa se puede obtener partiendo de productos de desecho lignocelulósicos, tales como residuos vegetales y papel de desecho. Los ejemplos de residuos vegetales adecuados incluyen tallos, hojas, cortezas, cáscaras, pasta de madera y serrín. Los ejemplos de residuos de papel incluyen papel de fotocopia descartado, papel impreso para ordenadores, papel de agendas, papel de bloc de notas, papel para máquinas de escribir y similar, así como periódicos, revistas, cartón y materiales de embalaje a base de papel.

La mezcla acuosa, que contiene lignocelulosa sometida al tratamiento ultrasónico, comprende además una enzima de celulasa para la hidrólisis enzimática. La celulasa se puede proveer como una enzima purificada o se puede proveer por un microorganismo productor de celulasa en dicha mezcla acuosa. La celulasa, como se usa aquí este término, incluye cualquier enzima que efectúa la hidrólisis o, si no, solubiliza la celulasa (incluyendo celulosa insoluble y productos solubles de celulosa). Se conocen en la técnica enzimas de celulasa, que incluyen preparaciones de enzimas purificadas, organismos que expresan lo mismo. Las fuentes idóneas de celulasa incluyen productos de celulasa comerciales, como Spezime^{TM} CP, Cytolase^{TM} M104 y Multifect^{TM} CL (Genencor, South San Francisco, CA), y aquellos organismos que expresan celulasa como la bacteria recombinante de la U.S. Patente Nº 5,424,202.

Las condiciones para la hidrólisis de la celulosa se seleccionan típicamente en consideración de las condiciones apropiadas para la fuente específica de celulasa, por ejemplo, bacterina o fúngica, (fungal).

Por ejemplo, la celulosa procedente de fuentes fungales típicamente trabaja mejor a temperaturas entre unos 30ºC y 48ºC y un pH entro 4,0 y 6,0 aproximadamente. En general, las condiciones típicas incluyen una temperatura entre unos 30ºC y 60ºC y un pH entre 4,0 y 8.0 aproximadamente.

Además, la mezcla acuosa puede comprender ventajosamente un microorganismo etanologénico, que tiene la habilidad de convertir un azúcar u oligosacárido a etanol. En la técnica se conocen microorganismos etanologénicos e incluyen bacterias etanologénicas y levadura o fermento. Los microorganismos son etanologénicos en virtud de su habilidad de expresar una o más enzimas, las cuales, individual o conjuntamente, convierten un azúcar en etanol. Es bien conocido, por ejemplo, que en la conversión de glucosa en etanol se emplean Saccharomyces (tales como S. cerevisiae). Otros microorganismos, que convierten azúcares en etanol, incluyen especies de Schizosaccharomyces (tales como S. pombe), Zymomonas (incluyendo Z. isobilis), Pichia (P. sfcipitis), Candida (C. shehatae) y Pachysolen (P. tannophilus).

Ejemplos preferidos de microorganismos etanologénicos incluyen microorganismos etanologénicos, que expresan alcohol dehidrogenasa y piruvato decarboxilasa, tales como pueden ser obtenidos con o de Zymomonas mobilis (véase las U.S. Patentes Nºs 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202 y 5,482,846).

En el caso de otra forma de realización, el microorganismo etanolgénico puede expresar xilosa reductasa y xilitol dehidrogenasa, que convierten la xilosa a xilulosa. Asimismo, la xilosa isomerasa convierte la xilosa a xilulosa. Además, el microorganismo etanologénico puede expresar xiluloquinasa, que cataliza la conversión de xilulosa en xilulosa-5-fosfato. Enzimas adicionales para completar la senda o ruta pueden incluir transaldolasa y transquetolasa. Estas enzimas se pueden lograr o derivar de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca y erwinia especies. Por ejemplo, véase la U.S. Patente Nº 5,514,583.

Se prefiere particularmente emplear un microorganismo, que es capaz de fermentar tanto las pentosas como las hexosas a etanol, tal como se obtienen de la preparación de un organismo recombinante, que inherentemente posee un juego o conjunto de enzimas y que es manipulado genéticamente para contener un conjunto o lote complementario de enzimas. Ejemplos de esta clase de microorganismos incluyen los descritos en las U.S. Patentes Nºs. 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202 5,482,846 y 5,514,583; y Ho et al., WO 95/13362. Los microorganismos particularmente preferidos incluyen Klebsiella oxytoca P2 y Escherichia coli KO11.

Las condiciones para convertir azúcares en etanol son típicamente las descritas en las U.S. Patentes anteriormente referenciadas. Generalmente, la temperatura oscila entre unos 30ºC y 40ºC y el pH se sitúa entre 5,0 y 7,0 aproximadamente.

Resulta generalmente ventajoso añadir nutrientes y/o cofactores para los microorganismos y/o enzimas para optimizar las conversiones o transformaciones enzimáticas. Por ejemplo, la xilosa reductasa emplea NADPH y el xilitol dehidrogenasa emplea NAD como cofactores para sus respectivas acciones enzimáticas. En contraste, la xilosa isomerasa bacteriana no requiere cofactor para la directa transformación de xilosa en xilulosa. También resulta deseable añadir o someter el microorganismo separadamente a fuentes de carbono, nitrógeno y azufre asimilables para promover el crecimiento. Son bien conocidos en la técnica muchos medios en los que crecer microorganismos, particularmente Luria broth - caldo de Luria (LB) (Luria and Delbruk, 1943).

Donde el tratamiento de ultrasonidos se efectúa en presencia de un microorganismo, el ultrasonido se puede realizar con una frecuencia y una duración de manera que una porción de todos los microorganismos presentes se lisan o, si no, se someten al rompimiento de la membrana. Este tipo de método puede dar como resultado una liberación controlada de las enzimas de los microorganismos al medio ambiente, permitiendo de esta forma la optimización de enzimas solas o en conjunción con enzimas comerciales y reducir el coste total de las enzimas comerciales.

Ejemplos de microorganismos, que contienen enzimas deseables, incluyen las descritas en la U.S. Patente No 5,424.202 correspondiente a Ingram, et al. Otros microorganismos se dan a conocer en las U.S. Patentes no 5,028,539 correspondiente a Ingram et al., 5,000,000 correspondiente a Ingram et al., 5,487,989 correspondiente a Fowler et al., 5,482,846 correspondiente a Ingram et al., 5,554,520 correspondiente a Fowler et al., 5,514,583 correspondiente a Picataggio et al., U.S. 1 622 330 registrada en 7 de junio, 1995 y textos estándar tales como Ausubel et al. Protocolos corrientes en la Biología Molecular, Wiley-Interscience, "Nueva York (1988)" (a continuación "Ausubel et al."), Sambrook et al. Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Segunda y Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 y 1992) (a continuación "Sarobrook et al.") y Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática; William & Wilkins Co., Baltimore (1984) (a continuación "Manual de Bergey"). Otras formas de realización más incluyen los descritos en US 2003110231, registrada el 7 de abril de 1997 por Ingram, L.O. et al.

Un ejemplo de un dispositivo adecuado para suministrar el ultrasonido es Fisher Scientific's Model 550 Sonic Dismembrator, Telsonic Ultrasonic Tubular Resonator RS-20, Telsonic Ultrasonic-Generator RG-20 o Telsonic Tube Kesonator System Serie RG-36/RS-36. En el caso de una forma de realización, se puede usar un hom de inmersión ultrasónica directamente en el medio acuoso. Alternativamente, el ultrasonido puede ser emitido a una cuba, artesa o cubeta llena de líquido en contacto con una cubeta, que contiene el medio acuoso (tal como una primera cubeta colocada dentro de una segunda cubeta, cualquiera de las cuales puede contener el medio acuoso). También pudiera ser deseable en un sistema continuo fluir el medio acuoso a través de un contenedor o cubeta, con el dispositivo ultrasónico, que discontinuamente emite ultrasonido. En el caso de otra forma de realización más puede resultar deseable controlar la temperatura del medio acuoso rodeando el contenedor o cubeta con agua de enfriamiento o refrigeración, u otra disposición apropiada para el intercambio de calor.

Está dentro de la habilidad de una persona de pericia ordinaria en la técnica de determinar cómo optimizar la liberación de enzimas de microorganismos, dichas enzimas a ser usadas solas o en conjunción con enzimas comerciales, a fin de conseguir una producción óptima de etanol.

Métodos y materiales

Los métodos y materiales descritos más abajo se usaron en la realización del trabajo descrito en los ejemplos, que siguen. Por comodidad y facilidad de comprensión, la sección de métodos y materiales se divide en subtítulos como sigue.

Organismo y Medios

Todas las fermentaciones de Papel de Desecho para Oficinas Mezclado (MWOP) usó K. oxytoca P2 como biocatalizador. Se usó caldo de Luria (LB) (Luria y Delbruk, 1943) como fuente de nutrientes para todos los medios líquidos y sólidos. Los medios sólidos también contenían 15 g/L agar y 20 g/L glucosa. Para la propagación de inoculo, se usaron medios líquidos que contienen 50 g/L glucosa. Se usó cloranfenicol (40 mg/L) como se requirió para la selección. Se mantuvieron cultivos en placas de agar, que contienen 40 mg/L Cm ó 600 mg/L Cm. Se usó la celulasa comercial Spezima^{TM}CP (genencor, South San Francisco, CA), una mezcla de enzimas de celulasa procedentes de Trichoderna longibrachiatum (antaño T. reesel). También se Novozyme 188, \beta-glucosidasa procedente de Aspergillus niger (Novo-Nordsk, Frankihtin NC) en experimentos de sacarificación.

Actividad de las enzimas y Análisis de los azucares

La actividad de la endoglucanasa se determinó como queda descrito previamente (Wood, T.M. y M.K. Bhat, Métodos en la Enzimología 160:87-144 (1988)). Las mezclas de celulasa se diluyeron en 50 mM amortiguador de citrato, pH 5,2, que contenía 2% CMC, y se incubaron a 35ºC. La liberación de azúcares reductores se determinó mediante el método DNS, como queda descrito (Chaplin, 1987). Se determinaron actividades de la cellobiasa mediante la medición de la cuota de liberación de p-nitrofenol (p-NP) (Abs _{410 nm}) de p-nitrofenil-\beta-D-glucósido (p-NPG) con pH 5.2, 35ºC (Wood, T.M. y M.K. Bhat, Métodos en la Enzimología 160:87-144 (1988)). Se diluyeron soluciones de enzimas en 50 mM amortiguador de citrato, pH 5.2, como se requería. Se añadió un ml de enzima diluida a 1 ml de 2 mM p-NPG y se incubó a 35ºC. Las reacciones se terminaron con la adición de 1 M Na_{2} CO_{3}.

Mejoramiento de la Liberación de azúcares de MWOP

Se añadieron 125 g, peso seco, de MWOP triturado o desmenuzado con 25 ml 18 N H_{2}SO_{4} y 2 L H_{2}O en un vaso de boca ancha o para precipitaciones de acero inoxidable, de 3 litros. Se dejó reaccionar la mezcla pastosa completamente con carbonato presente en el papel (monitorizado por la evolución del gas). Luego se ajusto el pH a aproximadamente 2,5 y se trató en la autoclave (121ºC) durante 20 minutos. Después de un enfriamiento toda la noche, se añadieron 125 ml de 1 M citrato sódico y se llevó el volumen a 2,5 L con H_{2}O. El pH se ajustó a 5,2 y se colocó en un baño de temperatura constante, 35ºC. La mezcla se hizo con un impulsor de flujo radial, tipo Rushton de 750 mm y un mezclador de laboratorio modelo Ciambanco BDC-1850. También se añadieron cinco FPU Spezime^{TM} CP por gramo de papel (625 FPU/2,5 L) y 50 U Novozime 188 por litro (250 U/2,5 L). Las unidades usadas fueron como indica el fabricante. Se añadieron timol 0,5 g/L y cloranfenicol, 40 mg/L para prevenir crecimiento microbiano. Se produjo ultrasonido mediante un Telsonic 36 kHz Tube Resonator (> 95% de eficiencia), modelo RS-36-30-1 con un generador ultrasónico acompañante, modelo MRG-36-150 (150 W de potencia efectiva) (Telsonic USA, Bridgeport, NJ). La frecuencia se sintonizó automáticamente. Los ciclos de tratamiento se controlaron por un cronómetro SPER Scientific 810030 (Fisher Scientific Co., St. Louis MO). Las velocidades de mezcla se ajustaron constantemente al reglaje más bajo que permitiera la mezcla (600-75 rpm).

Estabilidad de las enzimas

Las preparaciones de enzimas se diluyeron en 50 mM amortiguador de citrato a concentraciones equivalentes a las usadas en el estudio de liberación de azúcares de MWOP, 250 FPU Spezyme^{TM} CP/L y 50 U/L Novozyme 188. Las soluciones también contenían 0,5 g/L de timol y 40 mg/L Cm para prevenir el crecimiento microbiano. La mezcla de enzimas se agitó (12 h RPM) durante 15 minutos a fin de asegurar o garantizar una dispersión completa de la enzima. Se continuó la agitación durante 48 horas con o sin exposición continua a ultrasonido. Se tomaron muestras en las 0, 12, 24, 36 y 48 horas. Se examinaron las actividades de las enzimas como se describe más arriba.

Viabilidad de las células

Hasta 1,75 L de LB, que contiene 50 g/L de glucosa y 40 mg/L Cm, se usó K. oxytoca P2 para inocular a una densidad inicial de células, medida como O.D. _{550 nm}, de 0,5. El crecimiento se dejó proseguir durante 12 horas con o sin tratamiento ultrasónico inicial. Se tomaron muestras y se hicieron diluciones para continuar el crecimiento de las células en las 0, 1/4, 1/2, 1, 2, 4, 8 y 12 horas. En cada muestra se midieron la densidad óptica (O.D. _{550 nm}) y el pH. Se extendieron las diluciones sobre placas de agar (20 g/l de glucosa) y se incubaron a lo largo de toda la noche (30ºC). Se montaron unidades, que forman colonia (CFUs) como una medición de la viabilidad de las células.

Efectos ultraestructurales

Se investigó el cambio en la estructura de la matriz de celulosa de MWOP usando un microscopio electrónico explorador Hitachi S4000. Se prepararon muestras mediante el sometimiento de 2,5 L mezclas de 50 g/L MWOP en 50 mM de amortiguador de citrato, pH 5,2 y 35ºC, a una hora de ultrasonido continuo. Otras muestras se trataron con celulasa durante 4 horas. Antes de cualquier tratamiento se tomaron muestras de control. Todas las muestras se secaron y se revistieron con oro mediante pulverización o bombardeo fónico antes de ser examinadas (Doran, J.B. et al. Biotechnol. Bioeng. 44:240-247 (1994).

Propagación de las células

Se transfirió K. oxytoca P2 de un cultivo de stock (-20ºC) a placas de agar con 20 g/L de glucosa y Cm (40 mg/l y 600 mg/l). Luego se transfirió una colonia aislada diariamente de la placa con 600 mg/L Cm a placas nuevas, que contienen ambas concentraciones de Cm. Se usaron colonias aisladas procedentes de placas con 40 mg/l Cm para inocular frascos o matraces con LB y 50 g/Ln de glucosa. Se incubaron los frascos inoculados a lo largo de toda la noche a 30ºC, después de lo cual se recogieron mediante centrifugación para su uso ulterior.

SSF con tratamiento ultrasónico

Se efectuaron fermentaciones de MWOP en recipientes de fermentación, de vidrio de 14 L (volumen de trabajo 10 L) usando fermentadores Multiferm^{TM}, modelos 100 y 200 (New Brunswick Sel. Co., NJ). Se modificaron las placas frontales de acero inoxidable retirando los componentes que se extendían en el caldo. Se esterilizaron las placas frontales con 10 g/l de formaldehido mediante el recubrimiento de todas las superficies con el formaldehido mientras se encerraban flojamente en una bolsa grande de plástico para autoclaves. Un kg., peso seco, de MWOP triturado o desmenuzado se colocó en recipientes de fermentación con 8 L H_{2}O y 110 ml 18 N H_{2}SO_{4}. La mezcla se trató en autoclave durante una hora. Después del enfriamiento, la mezcla pastosa se siguió homogeneizando mediante un mezclado vigoroso con una perforadora a mano y un accesorio mezclador de pinturas. Después del tratamiento en autoclave durante una hora adicional y subsiguiente enfriamiento, se añadió 5 FPU Spezyme^{TM} CP/g MWOP, 1 L 10X LB (pH 5.0) y H_{2}O, hasta un volumen final de 10 L. Esta solución se mezcló parcialmente a mano, usando un batido o escobilla de cochura industrial esterilizado, a fin de dispersar las enzimas y nutrientes. Se añadieron células a una inicial O.D. _{550 nm} de 0.5. Los tratamientos ultrasónicos fueron como queda descrito más arriba. A causa de su naturaleza no homogénea, no se tomaron muestras para una determinación inicial de etanol. Se tomaron muestras en las 24, 48, 72 y 96 horas.

En los ejemplos expuestos a continuación, la referencia a tratamiento ultrasónico continuo únicamente tiene un propósito ilustrativo y no pretende formar parte de la invención.

Ejemplo 1 Análisis de Cuotas mejoradas de la Liberación de azúcares

Usando los métodos y materiales bosquejados más arriba para "Mejoramiento de la Liberación de azúcares de MWOP", se ha comprobado que con el uso de energía ultrasónica se incrementaba la cuota o régimen de hidrólisis enzimática hasta un 40%. Cuando la liberación de azúcares con el tratamiento ultrasónico 15 minutos cada cuatro horas se compara con el tratamiento cada dos horas, se constata una fuerte o pronunciada correlación entre la cantidad de energía ultrasónica y la liberación de azucares. La cuota incrementada de liberación de azúcares es debida a una estimulación de la actividad enzimática, no una hidrólisis física o química por productos secundarios o subproductos reactivos procedentes de la sonolisis del agua, como queda ilustrado por los experimentos sin enzimas añadidas. Interesantemente, con tratamiento ultrasónico continuo, la cuota de la hidrólisis desciende. Los resultados se exponen en formato de tabla en la tabla 1.

TABLA 1 Efectos de la cavitación ultrasónica sobre la hidrólisis enzimática de papel de desecho mezclado para oficinas

Tratamiento	Número de	Entrada de	Equivalentes de glucosa^{b,c}
ultrasónico^{a}	experimentos	energía	(mM)
		(w)
			@ 24 h	36 h	48 h
Ningún ultrasonido	3	0	88.1 \pm 6.1	98.3 \pm 6.1	106.9 \pm 7.8
15 min. Por 4 h	3	9.37	96.5 \pm 6.4	113.6 \pm 8.0	128.3 \pm 8.4
15 min. Por 2 h	3	18.75	115.5 \pm 14.3	133.2 \pm 10.6	149.0 \pm 11.0
Continuo	3	150	98.1 \pm 2.5	112.5 \pm 5.5	126.6 \pm 2.1
Continuo (ninguna	2	150	0.67	0.67	0.58
enzima)
^{a} Los tratamientos ultrasónicos se controlaron automáticamente para conectar y desconectar a intervalos fijados.
^{b} Los experimentos contenían 5 FOU Spezyme^{TM} CP y 10 IU Novozyme 188/g de MWOP.
^{c} Basado en análisis de reducción términos o términos reductores y asumiendo que todos son monoméricos

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Ejemplo 2 Estabilidad de las enzimas

Usando los métodos y materiales esbozados más arriba para "Estabilidad de las Enzimas", se ha descubierto que el tratamiento ultrasónico no afectó a la estabilidad de la celulasa añadida o \beta-glucosidasa, como se representa gráficamente en la figura 1. Ambas actividades se mantuvieron completamente estables incluso con exposición continua a ultrasonido. El aparente incremento en \beta-glucosidasa pudiera ser debido a la dispersión de agregados de proteína en la preparación de enzimas, comercial, altamente concentrada.

Ejemplo 3 Viabilidad de las células

Usando los métodos y materiales esbozados más arriba para "Viabilidad de las células", se descubrió que el tratamiento ultrasónico parecía ser inocuo, pero fue inhibidor al crecimiento, como se representa en las figuras 2A y 2B. Esta observación pudiera deberse en parte a una inducción de una respuesta de SOS por las células. Esto se siguió confirmando por las observaciones del pH, que aumentó ligeramente (pH 6,9 partiendo de un pH inicial de 6,7). Con carácter adicional, se observó que la turbidez relativa del caldo tenía pequeño cambio a través de la exposición a ultrasonido. Mientras tanto, sin el tratamiento ultrasónico, se observó una curva de crecimiento clásica.

Ejemplo 4 Efectos sobre SSF

Usando los métodos y materiales bosquejados más arriba para "SSF con Tratamiento ultrasónico", la combinación de K. oxytoca P2 con el tratamiento ultrasónico dio por resultado un incremento del 15% en rendimientos de etanol. En la tabla 2 se resume la producción de etanol partiendo de papel de desecho para oficinas, tratado con ultrasonido y K. oxytoca P2. Como pudiera esperarse de la inhibición del crecimiento de las células, el tratamiento ultrasónico aumentado da por resultado una producción reducida de etanol. El tratamiento cada dos horas no podría ser significativamente diferente del tratamiento cada cuatro horas, sin embargo, se constató una diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento cada cuatro horas y ningún tratamiento.

TABLA 2 Efectos del tratamiento ultrasónico sobre la producción de etanol en SSF de MWOP usando K. oxytoca P2 como biocatalizador

Tratamiento	Repeticiones	[Enzima]^{a}	[Etanol]	Rendimiento^{b,c}
ultrasónico		(FPU/g	(g/L)	(GE/g
		MWOP)		celulosa)
			24h	48h	72h	96k
Ninguno	2	10	15.7	27.3	33.5	35.3	0.39
Ninguno	4	5	9.5 \pm 2.3	19.0 \pm 2.7	25.7 \pm 2.5	29.4 \pm 2.9	0.33
15 min. Por 4h	5	5	14.3 \pm 2.0	26.1 \pm 1.3	31.3 \pm 1.3	34.0 \pm 1.9	0.38
(9.37 W)
15 min Por 2h	2	5	13.4	23.4	28.8	31.4	0.35
(18.75 W)
Continuo	2	5	10.2	11.2	11.3	11.3	0.13
(150 W)
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} La enzima añadida era Spezyme^{TM} CP (Genecor, Inc. South San Francisco, C.A) la actividad de la enzima se determino por el fabricante. \end{minipage}
^{b} El MWOP contiene aproximadamente un 90% de celulosa (Brooks and Ingram, 1995)
^{c} El rendimiento máximo teórico es de 0.568 g de etanol por g de celulosa.
^{d} Los t-tests no apareados o impares muestran que estos resultados son estadísticamente diferentes (p-0, 0224)

Claims

1. Un método para producir etanol a partir de lignocelulosa comprendiendo el hecho de tratar de forma discontinua una mezcla acuosa, que contiene lignocelulosa, una celulasa y un microorganismo etanologénico, con ultrasonido bajo unas condiciones suficientes para lograr una hidrólisis de dicha lignocelulosa, para de este modo producir etanol.

2. Un método según la reivindicación 1, en el cual dicha celulosa se proporciona por un microorganismo productor de celulasa dentro de dicha mezcla acuosa.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el cual dicho ultrasonido se conduce a una frecuencia de entre unos 2 y 200 kHz.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho microorganismo etanologénico es una bacteria o levadura, etanologénica.

5. Un método según la reivindicación 4, en el cual dicho microorganismo etalonogénico es una bacteria o levadura etanologénica, que expresa una o más enzimas, las cuales, a título individual o de manera conjunta, transforman un azúcar en etanol.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho microorganismo etanologénico expresa enzimas, las cuales, a título individual o de manera conjunta, transforman la pentosa y la hexosa en etanol.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicho microorganismo etanologénico expresa la alcohol dehidrogenasa y la piruvato decarboxilasa.

8. Un método según la reivindicación 7, en el cual dicha alcohol dehidrogenasa y dicha piruvato decarboxilasa proceden de Zymomonas mobilis.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicho microorganismo etanologénico expresa la xilosa isomerasa, la xiuloquinasa, la transaldolasa y la transquetolasa.

10. Un método según la reivindicación 9, en el cual dicha xilosa isomerasa, dicha transaldolasa y dicha transquetolasa proceden de Escherichia coli, de Klebsiella oxytoca o de la especie Erwinia.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el cual dicho microorganismo etanologénico es un microorganismo recombinante, que expresa la alcohol dehidrogenasa y la piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis, siendo seleccionado dicho microorganismo de entre el grupo que comprende Escherichia coli, Klebsiella oxytoca y la especie Erwinia.

12. Un método según la reivindicación 11, en el cual dicho microorganismo etanologénico es Klebsiella oxytoca P2 o Escherichia coli K011.