JPS637781A - セルラ−ゼ類の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明はセルラーゼ類の回収方法に関し、さらに詳しく
は、セルラーゼやヘミセルラーゼなどのセルラーゼ類に
よるセルロース性物質の分解糖化終了液から、残存する
前記のセルラーゼ類を極めて簡便な操作によって高得率
で回収する方法に関するものである。

Ｂ、従来の技術 近年、エネルギー問題、環境汚染、未利用資源の有効利
用などの観点から、セルロース性物質の糖化の研究が盛
んに行われており、なかでも装置や操作が簡単であって
、しかも温和な条件で行うことができ、その上生成した
糖がそれ以上分解することのない酵素糖化法が有効な方
法として注目されている。

この酵素糖化法においては、−般に、酵素として用いる
セルラーゼやヘミセルラーゼなどのセルラーゼ類を生産
する費用が全経費の約半分を占めるといわれており、そ
のためこの高価な酵素を回収再利用することが極めて重
要な問題となっている。

しかしながら、従来、セルロース性物質の分解糖化終了
液に遠心分離などを施して分離された溶液中に残存する
セルラーゼ類を回収する方法は種々提案されているもの
の、分離された固形物中に残存するセルラーゼ類を回収
する方法については、まだ報告は少なく、その回収率は
たかだか３０％以下である。その中で特に、本発明者の
先の発明（特許第１２９９０６８号）（以下、「先願発
明」と記す。）が知られており、それは、セルラーゼ類
によるセルロース性物質の分解糖化終了液から該セルラ
ーゼ類を回収するに当り、まず分解糖化終了液を溶液と
固形物とに分離したのち、該溶液中がら常法に従ってセ
ルラーゼ類を回収するとともに、該固形物中に残存する
セルラーゼ類を水溶性多糖類、オリゴ糖類又はアルコー
ル類の水溶液若しくはｐｉ（緩衝溶液により処理して回
収することを特徴としたものであり、対象とするセルロ
ース性物質の範囲の広さや、操作が室温〜５５°Ｃの温
度でゆるやかにかきまぜるか、あるいは振どうなどを行
って該固形物と溶液を接触させるといった極めて簡便で
あるなどすぐれたものである。しかしながら、回収率は
固形物に残存する量の６０り７０％であり、さらに回収
率の向上が望ましい。

Ｃ６発明が解決しようとする問題点 したがって本発明は、固形物に残存する酵素をほぼ完全
に回収し、操作や処理時間をさらに短縮簡便にすること
を目的とするものである。

Ｄ０問題点を解決するための手段 上記目的達成のため本発明者らは、各方面から鋭意検討
を重ねた結果、超音波を用いることにより、糖タンパク
質である酵素と未反応固形物との間の水素結合の切断、
及び、未反応固形物の細孔を破壊することにより、酵素
の未反応固形物への化学的結合及び物理的な吸着を減少
させることを見い出した。さらにこの処理を本発明者ら
の先願発明と共に用いることにより、上記化学結合及び
物理吸着の減少は極めて容易に行われることを見い出し
、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明方法においては、分解糖化終了液から
、残存するセルラーゼ類を回収するために、まず該分解
糖化終了液を遠心分離などの手段によって溶液と固形物
とに分離したのち、該溶液中に含まれるセルラーゼ類を
通常用いられている方法、例えば限外ろ過などによって
回収する。この際の回収率は溶液中の残存量に対し９０
〜１００％である。−方分離された固形物中に残存する
セルラーゼ類は、水溶性多糖類、オリゴ糖類又はアルコ
ール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液に含浸し、超音波
を加える。

温度は５℃から６０℃で行われるが、通常室温で行われ
る。超音波処理に要する時間は、未反応固形物の状態に
より多少異なるが、１分以上が必要であり１通常は５分
程度で十分である。

本発明方法において用いるセルロース性物質としては１
例えば針葉樹や広葉樹、南洋材や北洋材などから得られ
る木屑、のこぎり肩、樹皮、廃木材などすべての木質が
挙げられ、さらに農業廃棄物として廃棄するために経費
を必要とする稲ワラやサトウキビ、トウモロコシなどの
廃棄物、あるいは新聞紙、段ボールのような紙類などが
挙げられる。

また１本発明方法において用いる酵素のセルラーゼ類と
しては、例えばアスペルギルス届の菌体やトリコデルマ
属の菌体などから生産されるセルラーゼ若しくはセルラ
ーゼとへミセルラーゼを含む酵素などが挙げられる。ま
た、本発明においては、これらの酵素はそれぞれ起源の
異なるものを単独で用いてもよいし、あるいは２種以上
同時に用いてもよく、さらに酵素源としてこれらの酵素
を含む菌体抽出液や菌培養液を用いることもできる。

このセルラーゼ類の回収に用いる水溶性多糖類としては
例えばグルコマンナンなどが、オリゴ糖類としては例え
ばセロビオースなどが、アルコール類としては例えばエ
タノールのような１価アルコールやエチレングリコール
のような多価アルコールなどが挙げられる。またグルコ
ースや、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドのよ
うな糖誘導体を用いてもよい。水溶性多糖類やオリゴ糖
類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃度は０．０５〜５
重景％の範囲が好適である。また単糖の誘導体では０．
０２重量％から好適な条件となる。

ｐＨ緩衝溶液は、回収後のセルラーゼ類の安定性を増す
ために用いられ、好ましいｐＨは３．０〜８．０の範囲
である。このｐＨ緩衝溶液としては、通常酢酸緩衝溶液
が好ましく用いられる。

これらの糖類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液を用いて得
られたセルラーゼ類を含有する回収液は、そのまま多糖
類やオリゴ糖類の分ｓ′ｕ素源として使用することがで
き、さらにセルロース性物質の分解糖化酵素源として再
使用できる。−方アルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩
衝溶液の濃度は１〜３０重量％の範囲が好適である。

Ｅ０発明の効果 本発明方法においては、未反応固形物に吸着された酵素
の回収率は、９０〜９５％であり、従って溶液からの回
収と合わせて高率に使用した酵素を回収することができ
る。またその操作は室温において行われるため、加温の
ためのエネルギーを必要とせず、また操作時間を大幅に
短縮でき、したがって、セルロース性物質の酵素糖化に
本発明方法を適用することにより、その経費を大幅に節
減することができる。

Ｆ、実施例 次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例−１ ｐＨ４，５酢酸塩緩衝溶液５０ｍＱにボールミル粉砕を
行ったアカマツ木粉２ｇを加え、さらに市販のアスペル
ギルス、ニゲル起源のセルロジンＡＰとトリコデルマ・
ビリデ起源のセルラーゼオノヅカＲ−１０の　ｌ：１混
合物２００　ｍ　ｇを加えて４８時間４０℃で振とうし
、反応終了液をろ過し、溶液と固形物７８０ｍｇとに分
離した。

木粉の６１％が分解した。溶液中には、当初加えた酵素
の６０％が残存した。　固形物を５０ｍＱ共栓フラスコ
に入れ、１％カルボキシメチルセルロースのｐＨ４，５
酢酸塩緩衝溶液２５ｍａを加えて室温で５分間超音波処
理を行い、遠心分離を行って上澄液を得た。上澄液に含
まれる酵素は当初用いた酵素の３６％であった。上澄液
にさらにボールミル粉砕を行ったセルロース１ｇを加え
そのまま４０℃で振とうした。４８時間後生成したグル
コースをＮｅｌｓｏｎ−５ｏｍｏｇｙｉ法で定量を行っ
たところ、９４０　ｍ　ｇであった。

実施例−２ ５００ｃｃ容のフラスコに炭素源として適量のセルロー
ス粉末を加えた水溶性栄養培地１００ｍｍを入れて滅菌
したのち、これにトリコデルマ・ビリデＱＭ４１４を接
種し、３０℃の温度で好気条件下に６日間培養した。培
養液のＰＨは常に５．４に調節した。

別のｒｏｏｍＱ容フラスコにボールミル粉砕を行ったブ
ナ木粉２ｇを入れ、これに前記の培養液５０　ｍ　ｍ　
（酵素含有量１２０ｍｇ）を加え、４０℃にて４８時間
分解を行って木粉のの５６％を分解したのち１反応終了
液を遠心分離により溶液と固形物とに分離した。　溶液
には５０ｍｇの酵素が残存しており、限外ろ過により酵
素４２　ｍ　ｇを回収した。−方固形物を０．８％カル
ボキシメチルセルロース水溶液２０ｍ（ｌに含浸し、１
０分間室温で超音波を加えた。固形物をろ別したろ液に
は６５ｍｇの酵素が含まれていた。ろ液にｐＨ４，８の
リン酸塩緩衝溶液を加え全容を２５ｍＱとし、１ｇの過
酸化水素−アルカリ蒸解によりバガスがら作製された紙
を細片（１ｃｍＸ１ｃｍ）にしたものを加え、４０’Ｃ
で振とうした。８時間後には紙は完全に溶解し、Ｎｅｌ
ｓｏｎ−５ｏｍｏｇｙｉ法によるグルコースの生成量は
１２００ｍｇであった。

実施例−３ 新聞紙を乾燥し、−辺３ｍの正方形片として２ｇを５０
ｍＭの水に悲濁し、これにセルラーゼーオノヅカＲ−１
０，１００ｍｇを加えて４０℃で２４時間分解を行った
のち１反応終了液を遠心分離により溶液と固形物１．４
ｇとに分離した。溶液には３５ｍｇのセルラーゼが残存
していた。

前記で得られた固形物１．４ｇに１５重量％エチレング
リコール水溶液４０ｍＭを加えて。

室温で１０分間超音波を加えた。エチレングリコール水
溶液中には６２ｍｇの酵素が含まれていた。

実施例−４ ボールミル粉砕したイエローラワン木粉２ｇをｌ　ＯＯ
ｍ　ｍ容の三角フラスコにはかり込み。

４５ｍＭのＰＨ５，０酢酸塩緩衝溶液を加えて４５℃で
加温した。セルロジンＡＰとトリコデルマ・ビリデ起源
のメイセラーゼ　１：ｌ　混合物６％　５ｍＭを加え、
そのまま４８時間振とうした後、ろ別した。ろ液には、
　グルコースに換算して１１６０ｍｇが検出された。ま
たろ液のβ−グルコシダーゼ活性は当初加えた量の８０
％が検出された。未反応固形物４０ｍｇを０．０３％Ｐ
−ニトロフェニルーβ−Ｄ−グルコシドＰＨ４，５酢酸
塩緩衝溶液に加え５分間超音波処理を行い、遠心分離後
上澄液を４０℃で１０分間浸漬して溶出したβ−グルコ
シダーゼ活性を測定した。固形物に吸着された量に対し
て９４％が溶出した。

特許出願人　工業技術院長　飯　塚　幸　三指定代理人
　工業技術院大阪工業技術試験所長速水諒三

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）セルラーゼ類によるセルロース性物質の分解糖化
   終了液から該セルラーゼ類を回収するに当り、まず分解
   糖化終了液を溶液と固形物とに分離した後、該溶液中か
   ら常法に従ってセルラーゼ類を回収するとともに、該固
   形物中に残存するセルラーゼ類を水溶性の多糖類、オリ
   ゴ糖類、及び単糖類との誘導体の水溶液若しくは上記の
   ｐＨ緩衝溶液、若しくはアルコール溶液に含浸し、超音
   波で処理して回収することを特徴とするセルラーゼ類の
   回収方法。
2. （２）水溶性多糖類又はオリゴ糖類の水溶液若しくはｐ
   Ｈ緩衝溶液の濃度が０．５〜５重量％である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
3. （３）アルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃
   度が１〜３０重量％である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
4. （４）ｐＨ緩衝溶液のｐＨが３．０〜８．０である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。