ES2258026T3 - Procedimiento de separacion de un compuesto quimico o biologico presente en una mezcla de compuestos similares, por difusion de un medio apropiado tal como un gel. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de separación de un compuesto químico o biológico presente en una mezcla de compuestos similares, por difusión en un medio (10) tal como un gel, comprendiendo este procedimiento una etapa de introducción de la mezcla de compuestos en el medio, caracterizado porque consiste: - en hacer reaccionar en el medio (10) los compuestos (Ci) de la mezcla con un componente (P) presente en el medio para obtener productos (Qi) siendo las reacciones de Ci + P - Qi reversibles y con constantes cinéticas (k1, i) en el sentido de la obtención de los productos (Qi) y (k2, i) en sentido inverso, y - en aplicar al medio (10) un campo que varía periódicamente en el tiempo y en el cual los compuestos (Ci) son sensibles, determinándose el período de tiempo del campo (T) y la concentración (p) del componente (P) en el medio (10) en función de las constantes cinéticas (k1, k2) del compuesto (C) a separar para establecer condiciones de resonancia entre las reacciones anteriormente citadas y el campo para las cuales el compuesto (C) tiene un coeficiente de difusión aparente (Da) en el medio (10) cuyo valor es máximo.

Description

Procedimiento de separación de un compuesto químico o biológico presente en un mezcla de compuestos similares, por difusión de un medio apropiado tal como un gel.

La invención se refiere a un procedimiento de separación de un compuesto químico o biológico presente en una mezcla de compuestos similares, por difusión en una medio apropiado tal como un gel.

Los métodos conocidos de separación de un compuesto presente en una mezcla comprenden en general la aplicación de una reacción química (en el sentido amplio) y/o de un conjunto de fuerzas externas a la mezcla de compuestos. Por ejemplo, el documento WO 99/45374 describe la separación de un analito de otros componentes de una muestra, mediante un procedimiento de electrofóresis por afinidad. Las cromatografías de afinidad permiten extraer de una mezcla las moléculas más retenidas o las moléculas menos retenidas respecto a emplazamientos de interacción relacionados con el soporte cromatográfico, pues estas moléculas ocupan posiciones privilegiadas, en cabeza y en la cola de elución. Sin embargo, particularmente cuando la mezcla contiene una decena o más de compuestos similares, resulta difícil separar compuestos de afinidad intermediaria, muy difícil de separar compuestos de afinidad cuantitativamente definida, e imposible de separar compuestos cuyas afinidades serían idénticas, pero que tendrían constantes cinéticas de interacción distintas.

El problema de la separación de compuestos presentes en una mezcla y con constantes cinéticas de interacción para un blanco dado que son arbitrariamente definidas por un operario, se plantea particularmente en el marco del desarrollo de nuevos tratamientos terapéuticos que se basan en la optimización de la interacción de moléculas con blancos de interés biológico adecuadamente seleccionados (secuencias genómicas, proteínas, ...) y en el ámbito de la química combinatoria, donde las moléculas sometidas a ensayo se obtienen a menudo en forma de "mezclas controladas" de moléculas similares.

La presente invención tiene particularmente por objeto aportar a este problema una solución sencilla, eficaz y relativamente fácil de realizar.

La invención propone a este respecto un procedimiento de separación de un compuesto químico o biológico en una mezcla de compuestos similares, por difusión en un medio tal como un gel, comprendiendo este procedimiento una etapa de introducción de la mezcla de compuestos en el medio, caracterizado porque consiste:

-

en hacer reaccionar en el medio los compuestos Ci de la mezcla con un componente P presente en el medio para obtener productos Q_{i}, siendo las reacciones C_{i} + P \rightarrow Q_{i} reversibles y con constantes cinéticas k_{1,i} en el sentido de la obtención de los productos Q_{i} y k_{2,i} en el sentido inverso, y

-

en aplicar al medio un campo que varía periódicamente con el período de tiempo y al cual los compuestos Ci son sensibles, determinándose el tiempo del campo y la concentración del componente P en el medio en función de las constantes cinéticas k_{1}, k_{2} del compuesto C a separar para establecer condiciones de resonancia entre las reacciones anteriormente citadas y el campo, para las cuales el compuesto C tiene un coeficiente de difusión aparente en el medio que se encuentra a un valor máximo.

Según la invención, el conocimiento de las constantes cinéticas de reacción de un compuesto C con un blanco, permite determinar una concentración del blanco en el medio y una periodicidad del campo para las cuales el coeficiente de difusión aparente del compuesto será máximo y ampliamente superior a los coeficientes de difusión aparentes de los otros compuestos, de forma que este compuesto se separará claramente de los demás por difusión en el medio.

Incluso cuando los compuestos presentes en la mezcla tengan sustancialmente el mismo comportamiento en el medio y no difieran los unos de los otros más que por las constantes cinéticas de interacción con un blanco previamente definido, el procedimiento según la invención permite definir una concentración de blanco en el medio y un período de tiempo del campo aplicado al medio para los cuales el coeficiente de difusión aparente en el medio del compuesto a separar es máximo como consecuencia de una resonancia estocástica entre las reacciones y el campo aplicado.

Por ejemplo, cuando una de las constantes cinéticas del compuesto C a separar difiere de las de los otros compuestos de la mezcla de un orden de magnitud, las demás características de los compuestos al ser idénticas o similares, el coeficiente de difusión aparente del compuesto C en el medio es al menos 3,5 veces superior al del de los otros compuestos de la mezcla, lo cual permite no solamente separarlo de los otros compuestos por difusión, sino igualmente extraerlo del medio con un rendimiento interesante y un grado de pureza relativamente elevado.

En un modo de realización preferido de la invención, el campo aplicado al medio es un campo eléctrico y el procedimiento se realiza en un dispositivo clásico de electroforesis, que comprende por ejemplo una cuba llena de electrolito y en la cual se coloca una placa de un gel apropiado, y electrodos situados en la cuba alrededor de la placa de gel y conectados a medios de alimentación eléctrica que permiten aplicar un campo eléctrico uniforme en el espacio y que varía periódicamente en el tiempo en la placa de gel.

En una variante, el campo anteriormente citado es un campo de velocidades en el medio y el procedimiento se realiza en un descriptivo de cromatografía por ejemplo del tipo HPLC (High Performance Liquid Chromatography) en el cual un campo de velocidades homogéneo de un fluido portador inerte se crea en el medio por medio de una o dos bombas.

La invención se comprenderá mejor y otras características, detalles y ventajas de esta aparecerán más claramente con la lectura de la descripción que sigue, realizada a título de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos en los cuales:

- la figura 1 representa esquemáticamente medios de realización de la invención en el modo de realización preferido donde el campo aplicado al medio es un campo eléctrico;

- la figura 2 es un gráfico que representa las variaciones de la relación de los coeficientes de difusión aparente e intrínseca de un compuesto C en función de un parámetro A correspondiente a la amplitud del campo, en las condiciones de la resonancia y en condiciones diferentes;

- la figura 3 es un gráfico que representa la variación de la relación de los coeficientes de difusión aparente e intrínseca en función de los valores de parámetros que corresponden a las constantes cinéticas de reacción del compuesto.

- la figura 4 es un gráfico que representa las variaciones de la pureza y del rendimiento en el caso de la difusión pura de una mezcla equimolar de dos compuestos con coeficientes de difusión diferentes, en función de un parámetro sin dimensión.

En la representación esquemática de la figura 1 que se refiere a un modo de realización de la invención en el cual el procedimiento se realiza por medio de un dispositivo de electroforesis, la referencia 10 designa una placa de un medio tal como gel, por ejemplo gel de agarosa, de un tipo utilizado corrientemente en electrofóresis.

La placa de gel 10 se coloca en una cuba de electroforesis 12 cuyo contorno está indicado con líneas de trazo interrumpido, y en la cual están dispuestas hileras de electrodos 14, formadas por ejemplo por hilos eléctricamente conductores que se extienden perpendicularmente al plano del dibujo.

Los electrodos 14 están por ejemplo colocados alrededor de los cuatro costados de la placa de gel 10 y están conectados con circuitos 16 de alimentación eléctrica, así mismo conectados con medios de control 18 eventualmente pilotados por ordenador.

Estos medios 16 de alimentación y 18 de control permiten aplicar a la placa de gel 10 un campo eléctrico que varía periódicamente con el tiempo y que es sustancialmente uniforme en el espacio, es decir que es el mismo en cualquier punto de la placa de gel 10, orientándose este campo eléctrico por ejemplo en el plano de la placa de gel, en el sentido indicado por las flechas E.

Esta técnica es conocida en electrofóresis y descrita en los documentos WO 84/02001 y US 5 084 157 a los cuales se podrá hacer referencia para más precisiones.

El procedimiento según la invención difiere de las técnicas conocidas de electrofóresis esencialmente en que la electrofóresis resultante de la aplicación de un campo eléctrico periódico a una mezcla de compuestos, tiene lugar en medio reactivo y en que el campo eléctrico varía periódicamente alrededor de un valor medio nulo.

Según la invención, se utiliza un medio 10 que contiene una concentración determinada de un componente P que reacciona con los compuestos contenidos en una mezcla inyectada en un punto del medio 10, reaccionando los compuestos C_{i} de esta mezcla con el componente P para formar productos Q_{i} que se descomponen ellos mismos en productos iniciales C_{i} y P, como se indica a continuación:

10

donde k_{1,i} y k_{2,i} son las constantes cinéticas de las reacciones en un sentido y en el sentido inverso y varían de un compuesto C_{i} a otro, siendo k_{1,i} un número de reacciones por unidad de concentración y por unidad de tiempo, siendo k_{2,i} un número de reacciones por unidad de tiempo.

En lo que sigue, situándose en el caso más difícil donde los compuestos C_{i} que forman la mezcla inyectada en el medio 10 se suponen que tienen la misma masa m, la misma carga eléctrica z, el mismo coeficiente de fricción g en el medio y el mismo coeficiente de difusión D en este medio. El componente P presente en el medio 10 se supone insensible al campo eléctrico e inmóvil o que puede difundirse débilmente en el medio 10, bien sea porque se fija por covalencia, o porque su dimensión limita su desplazamiento en el medio 10. Los compuestos Q_{i} pueden ser móviles con la condición de presentar una respuesta a la acción del campo distinta a la de los compuestos C_{i}.

Se supone igualmente que la concentración del componente P es sustancialmente uniforme en el medio 10 y se mantiene sustancialmente constante en este medio durante toda la separación.

Cuando el campo eléctrico aplicado al medio 10 es de variación sinusoidal en el tiempo y es por ejemplo de la forma E(t) = acos(\omegat), se puede calcular el valor medio \overline{x_{c}} (t) y la variante \sigma^{2}_{c} (t) de la posición x del compuesto C a lo largo de un eje paralelo al campo eléctrico aplicado al medio 10. Se obtiene entonces la fórmula siguiente:

\overline{x_{c}} (t) = \frac{A}{(c_{1} + c_{2})^{2} + \omega^{2}} \ \left[c_{1} (1 + cos \omega t) + \frac{c_{1}c_{2} + c^{2}_{2} + \omega^{2}}{\omega} sen \omega t\right]

y de igual modo:

\overline{x_{Q}} (t) = \frac{A}{(c_{1} + c_{2})^{2} + \omega^{2}} \ \left[c_{1} + \frac{c_{2}}{\omega} ((c_{1} + c_{2})sen \omega t - \omega cos \omega t)\right]

donde: A = \frac{z\alpha}{m\gamma} es una amplitud recalibrada del campo eléctrico,

c_{1} = k_{1} p, siendo p la concentración de P en el medio 10

c_{2} = k_{2}

expresándose c_{1} y c_{2} en s^{-1}.

Aunque el campo eléctrico aplicado sea nulo por término medio, la posición media de los compuestos C_{i} y Q_{i} oscila alrededor de un valor diferente del de origen en razón de la asimetría de las condiciones iniciales, manteniendo el sistema parcialmente en memoria la primera excursión del campo eléctrico. Si se desprecian los términos constantes y los términos oscilantes, y para los P y Q_{i} inmóviles, la variante de posición asociada con las distribuciones C_{i} (x,t) y Q_{i} (x,t) se reduce después de un régimen transitorio muy corto en:

\sigma^{2}_{c} (t) = \sigma^{2}_{Q} (t) = 2 \ D_{a} \ t

donde

D_{a} = \frac{c_{2}}{c_{1} + c_{2}} \ \left[D + A^{2} \frac{c_{1}}{2((c_{1} + c_{2})^{2} + \omega^{2})}\right]

siendo D_{a} el coeficiente de difusión aparente de un par C_{i}, Q_{i} y siendo D el coeficiente de difusión intrínseco del compuesto C_{i}.

Cuando la amplitud del campo eléctrico es suficiente para que la relación dada a continuación sea satisfactoria:

A^{2} >> \frac{2D}{c_{1}} ((c_{1} + c_{2})^{2} + \omega^{2}),

la difusión aparente no depende de D y es controlada únicamente por las reacciones químicas y el campo eléctrico, siendo dado el coeficiente de difusión aparente por la relación dada a continuación:

D_{a} = A^{2} \frac{c_{1}c_{2}}{2(c_{1} + c_{2})[(c_{1} + c_{2})^{2} + \omega^{2}]}.

En este caso, se tiene A = za/m\gamma cuando los Q_{i} son inmóviles, o A = za/m\gamma - z_{Q} a/m_{Q}\gamma_{Q} donde z_{Q} es la carga soportada por los Q_{i}, m_{Q} la masa de los Q_{i} y \gamma_{Q} el coeficiente de fricción de los Q_{i} cuando los Q_{i} son móviles.

Este coeficiente de difusión aparente puede tomar un valor arbitrariamente grande definido por el valor de la amplitud recalibrada A del campo eléctrico.

El coeficiente de difusión aparente es una función de c_{1} y c_{2} y comprende un solo máximo (cuando el campo eléctrico tiene una amplitud suficiente) que se obtiene para:

c^{R}_{1} = c^{R}_{2} = \omega /2

o, de forma equivalente: k^{R}_{1} \cdot p = k^{R}_{2} = \pi/T

donde el exponente R expresa una condición de resonancia y T es el periodo de tiempo del campo eléctrico.

En la figura 2, la curva con líneas de trazo continuo indica la variación de la relación de la relación D_{a}/D en función de A en la resonancia, la curva con línea de trazo largos indica la variación de esta relación en función de A para constantes cinéticas k^{R}_{1} y k^{R}_{2}/10, la curva con líneas de trazo corto indica la variación de esta relación en función de A para constantes cinéticas 10k^{R}_{1,} 10k^{R}_{2}, y la curva con líneas de puntos indica la variación de esta relación para constantes cinéticas iguales de 10k^{R}_{1} y k^{R}_{2}.

La figura 3 representa la variación de la relación D_{a}/D en función de los logaritmos de base 10 de c_{1} y c_{2}, correspondiendo el máximo de la variación a las condiciones de resonancia anteriormente citadas.

Si se consideran las reacciones químicas como acontecimientos aleatorios, las transiciones entre C_{i} y Q_{i} son acontecimientos estocásticos y el máximo del valor de D_{a} se obtiene para condiciones que corresponden a una resonancia estocástica entre las reacciones químicas y el campo eléctrico aplicado al medio 10.

Es esta resonancia, la que se traduce por un valor máximo del coeficiente de difusión aparente de un compuesto C, que permite separar este compuesto C de los demás componentes C_{i} presentes en la mezcla. Se puede calcular en particular que, si una de las constantes cinéticas de un compuesto C_{i} es igual a la constante cinética del compuesto C para el cual existe resonancia y que la otra constante cinética del compuesto C_{i} difiere de un factor 10 de la otra constante cinética del compuesto C, el coeficiente de difusión aparente del compuesto C_{i} será 3,5 veces más bajo aproximadamente que el del componente C.

Esta diferencia de difusión permite separar el compuesto C de los componentes C_{i} similares, incluso cuando estos últimos tienen sustancialmente la misma carga eléctrica, la misma masa y el mismo coeficiente de fricción que C, o bien sustancialmente la misma relación z/m.\gamma que C (siendo el valor de A sustancialmente el mismo para todos estos componentes) y diferentes los unos de los otros al menos por el valor de una constante cinética de reacción con el componente (P).

El campo eléctrico aplicado al medio 10 puede variar periódicamente con el tiempo de un modo cualquiera: la variación puede ser sinusoidal, en almena, u otra.

La mayor difusión del compuesto C correspondiente a las condiciones de resonancia permite separarlo de los demás compuestos C_{i} de la mezcla y recuperarlo, en parte, en los extremos del perfil de distribución en el medio 10. Se puede en el caso de la difusión pura de una mezcla de dos compuestos (C_{1}, C_{2}) que tienen la misma concentración y coeficientes de difusión intrínsecos diferentes, calcular una pureza y un rendimiento de la recuperación del compuesto C_{1} por las fórmulas siguientes:

pureza:

S(\alpha_{1}) = \frac{I(\alpha_{1})}{I(\alpha_{1}) + I(\alpha_{2})}

\vskip1.000000\baselineskip

rendimiento:

R(\alpha_{1}) = \frac{2I(\alpha_{1})}{N}

donde:

N es la cantidad del compuesto C_{1} inyectada en el medio 10 en el tiempo t = 0 en el punto x = 0,

I es la integral de la concentración C_{1} (x, t) entre x y el infinito,

\alpha_{1} = \frac{x}{2\sqrt{D_{1}t}}

\hskip2cm

y

\hskip2cm

\alpha_{2} = \frac{x}{2\sqrt{D_{2}t}}

En la figura 4 se ha representado la variación de la pureza S y del rendimiento R en función de \alpha. Se aprecia en esta figura que seleccionando una pureza deseada, se puede determinar el valor de \alpha y por consiguiente el de x a partir del cual se podrá recoger el compuesto C, y el rendimiento que se obtendrá. Cuando los coeficientes de difusión de los dos compuestos C_{1} y C_{2} difieren en una relación de 3,5, se puede recoger un 25% del compuesto C_{1}, con una pureza del 90%, para \alpha_{1} = 0,85.

Ahora se describirá brevemente un ejemplo de aplicación de la invención, que permite fijar las ideas. Este ejemplo se refiere a la reacción química de hibridación de muestras de ADN sobre el ARN en solución. En el caso de muestras de oligodesoxirribonucleótidos sobre un blanco ARN que comprende un emplazamiento de enlace primario de la transcriptasa inversa HIV-1, el proceso de unión se caracteriza por los valores siguientes:

3 \ x \ 10^{4} \ M^{-1} \ s^{-1} \leq k_{1} \leq 10^{6} \ M^{-1} \ s^{-1}

10^{-3} \ s^{-1} \leq k_{2} \leq 2,5 \cdot 10^{-2} \ s^{-1}

D = 3 \cdot 10^{-10} \ m^{2} \ s^{-1}

2,7 \cdot 10^{-18} C \leq z \leq 5,9 \cdot 10^{-18}C.

La primera condición de resonancia k_{1}.p = k_{2} proporciona concentraciones de ARN en el medio 10 comprendidas entre 10^{-9}M y 10^{-6}M, que se pueden obtener sin dificultades.

La segunda condición de resonancia \omega = 2k_{2} conduce a \omega comprendido entre 2.10^{-3} s^{-1} y 5.10^{-2} s^{-1} y es fácil de conseguir.

La última condición relativa a la amplitud del campo eléctrico es conseguida cuando esta amplitud es muy superior a 4.10^{-5}V\mum^{-1}, lo cual no plantea problema técnico alguno.

Reconociendo los valores de \omega y p con los valores de k_{1} y k_{2} de una muestra dada, se puede separar esta muestra de las demás colocándola en las condiciones de resonancia estocástica entre la reacción de fijación sobre el ARN y el campo eléctrico.

Según otro aspecto particularmente interesante de la invención, se puede utilizar igualmente un campo no eléctrico, capaz de actuar sobre compuestos independientemente de su carga eléctrica. Por ejemplo, se utiliza para este fin un dispositivo cromatográfico del tipo HPLC en el cual una o dos bombas crean en el medio un campo de velocidades homogéneo que se modifica de forma periódica con el tiempo, pudiendo estas velocidades ser comparables con las velocidades de desplazamiento que se obtienen por aplicación de un campo eléctrico. La magnitud A mencionada en la descripción que antecede es el valor de la velocidad creada en el medio por la bomba.

Por otro lado, no es necesario que el componente P y los productos Qi permanezcan inmóviles en el medio sometido al campo periódico, basta con que los productos Qi respondan a la aplicación de este campo de un modo diferente del de los componentes Ci.

De forma general, el procedimiento según la invención se aplica en la separación de moléculas de tamaño relativamente de poca importancia (que varían de 10 a 10^{6} Daltons aproximadamente), de proteínas, de oligonucleótidos, de oligosacáridos, resultando esta separación de la combinación en un medio de una reacción química y de un campo uniforme cualquiera de variación periódica en el tiempo.

Claims (14)

1. Procedimiento de separación de un compuesto químico o biológico presente en una mezcla de compuestos similares, por difusión en un medio (10) tal como un gel, comprendiendo este procedimiento una etapa de introducción de la mezcla de compuestos en el medio, caracterizado porque consiste:

- en hacer reaccionar en el medio (10) los compuestos (C_{i}) de la mezcla con un componente (P) presente en el medio para obtener productos (Q_{i}) siendo las reacciones de C_{i} + P \rightarrow Q_{i} reversibles y con constantes cinéticas (k_{1,i}) en el sentido de la obtención de los productos (Q_{i}) y (k_{2,i}) en sentido inverso, y

- en aplicar al medio (10) un campo que varía periódicamente en el tiempo y en el cual los compuestos (C_{i}) son sensibles, determinándose el período de tiempo del campo (T) y la concentración (p) del componente (P) en el medio (10) en función de las constantes cinéticas (k_{1}, k_{2}) del compuesto (C) a separar para establecer condiciones de resonancia entre las reacciones anteriormente citadas y el campo para las cuales el compuesto (C) tiene un coeficiente de difusión aparente (Da) en el medio (10) cuyo valor es máximo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la amplitud del campo es superior a un valor límite

a_{t} = \frac{m\gamma}{z} \sqrt{\frac{2D}{k_{1}p} \left((k_{1}p + k_{2})^{2} + \left(\frac{2\pi}{T}\right)^{2}\right)}

función de las constantes cinéticas anteriormente citadas y del coeficiente (D) de difusión intrínseca del compuesto (C), siendo (m) la masa, (z) la carga y (\gamma) el coeficiente de fricción del compuesto (C).

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los compuestos (C_{i}) en la mezcla difieren los unos de los otros al menos por el valor de una constante cinética de reacción con el componente (P).

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque una de las constantes cinéticas del compuestos (C) a separar difiere de las de los demás compuestos de la mezcla de al menos un orden de magnitud.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el periodo de tiempo del campo es sustancialmente igual a \pi/k_{2} y la concentración del componente (P) en el medio (10) es sustancialmente igual a k_{2}/k_{1}.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del componente (P) en el medio (10) se mantiene sustancialmente constante durante la separación.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la amplitud del campo varía alrededor de un valor medio nulo.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el campo es sustancialmente uniforme en el medio (10).

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el campo anteriormente citado es un campo eléctrico.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el campo anteriormente citado es un campo de velocidades en el medio.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el componente (P) y los productos (Qi) permanecen sustancialmente inmóviles en el medio (10) sometidos al campo anteriormente citado.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los productos (Qi) responden al campo aplicado al medio (10) de un modo diferente del de los compuestos (Ci).

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los compuestos a separar son moléculas de tamaño comprendido entre 10 y 10^{6} Daltons aproximadamente.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los compuestos a separar son proteínas, oligonucleótidos u oligosacáridos.