JPH07503542A

JPH07503542A - 除去できる分離ゲル組成物を含有する毛管カラム及びその使用方法

Info

Publication number: JPH07503542A
Application number: JP5513374A
Authority: JP
Inventors: グットマン、アンドラス; シエ、チア−フイ; カージャー、バリー　エル; ペントニー、スティーブン　エル　ジュニア; コンラッド、ケニス　ディー; ランパル、サシュマ; ガンズラー、カタリン
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 1995-04-13
Also published as: DE69318008T2; WO1993015394A1; DE69318008D1; EP0624248B1; EP0624248A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】除去できる分離ゲル組成物を含有する毛管カラム及びその使用方法関連出願本出願はアンドラス・ガツトマン（Ａｎｄｒａｓ　Ｇｕｔｔｍａｎ）による１９９２年１月３１日出願の係属米国特許出願番号０７／８２９゜６３８号「動的架橋組成物を連続する毛管カラム及び使用法」の一部継続出願である。本出願は１９９２年３月２４日にチア・フィ・シー（Ｃｈｉａ−Ｈｕｉ　５ｈｉｅｈ）に付与された米国特許第５，０９８，５３９号「ミクロ毛管カラムを含有するゲル」及び１９９１年２月１日出願で現在放棄された米国特許出願番号０７／６４９，３４８号の係属出願である「毛管ゲル」のケネス・ディ・コンラッドとステフェン−ｘル・ペントネイ・ジュニア（Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｄ、　Ｋｏｎｒａｄ　ａｎｄ　５ｔｅｐｈｅｎ　Ｌ、　Ｐｅｎｔｎｅｙ、　Ｊｒ、）により１９９２年１月８日出願の米国特許出願番号０７／８１８／４９０号に関連する。

発明の分野本発明は一般に試料の分析、特に毛管電気泳動技術を用いる試料成分の分析に関する。好ましい態様において、本発明は二官能性試薬ゲル組成物親水性高分子層及び除去できる分離組成物を含んでなる毛管カラムに関する。除去できる分離組成物の好ましい態様にはなかんずく界面活性剤：蛋白質性物質複合体の分析に特に適した動的架橋組成物、なかんず（一本鎖及び二本鎖核酸の配列分析に特に適した変性組成物及び試料類の「開管」　（”ｏｐｅｎ　ｔｕｂｅ”）分析用緩衝剤溶液が含まれる。

見匪至１１毛管電気泳動は生物学関連科学で最も広く用いられる分離技術の一つである。毛管電気泳動は荷電物質の迅速かつ効果的な分離を可能にする技術である。一般に、毛管電気泳動には試料の毛管への導入と毛管への電場の適用が含まれる。電場の電位は試料を管中に押すともにそれをその成分部分に分離、すなわちそれら試料成分の相対的なサイズに基づいて試料の成分を分離する。その分離を連続的に監視し種々の成分についてのデータを提供するためにオンライン検出器が用いられる。毛管電気泳動は分離媒体に基づいて一般に２つの範躊、「開管」及び「ゲル」毛管電気泳動に分けられる。

「開管」毛管電気泳動においては、毛管は導電性緩衝剤溶液で充填される。毛管のイオン化によって負に荷電した内壁は緩衝剤から正イオンの層を引きつける。

これらのイオンは電位の影響下で陰極に向かって流れるから、バルク溶液（すなわち、緩衝剤溶液と分析されるべき試料）もまた電気中性を維持するためこの方向に流れるはずである。この電気浸透流は電荷に関係なく中性種及びイオン種の両方を陰極に向かって動かす一定した速度成分を与える。開管毛管電気泳動を利用する分離は典型的にカラム中を進む成分群の電荷−質量比に依存する。すなわち、（相対的）高電荷−質量比をもつ成分群は低電荷−質量比をもつ成分群よりも典型的に早くカラムを進む。

「ゲル」毛管電気泳動においては、毛管は適当な分離ゲル組成物で充填される。

蛋白質、ペプチド、核酸、及びオリゴヌクレオチドのような分子種はその種を電場の影響下で緩衝剤溶液中を移動させることによって分離される。緩衝剤溶液は通常、分離される種の混合の発生を低減するよう機能するアガロースまたはポリアクリルアミドのような低または中濃度のゲル組成物とともに使用される。２つの主要な分離機構、ａ）種の有効電荷の差に基づく分離及びｂ）分子サイズに基づく分離が存在する。

これらの内第−の機構は通常小さいオリゴヌクレオチド（長さ約１から約５０のヌクレオチド）のような低または中分子量物貰に限定される。これは高分子量物賀群の有効電荷間に有意の差がなく、分離の作業を困難ないし不可能にするからである。

分子サイズに基づく分離は通常分子「ふるい」と呼ばれる。分子ふるいは分離媒体として制御された細孔サイズをもつゲルマトリックスを利用する。分離は異なったサイズの分子種のゲルマトリックスを浸透する相対的な能力の結果であり、与えられた細孔サイズのゲル中をより小さい分子はより大きい分子より早（動く。

中から高分子量のオリゴヌクレオチド類（長さ約５０ヌクレオチド以上）、ポリペプチド類、及び蛋白質類は一般に分子ふるい電気泳動によって分離される。蛋白質は負に荷電した部分及び正に荷電した部分の両方を含んでなる。そのように、蛋白質はそれが電場の影響下で毛管カラムを通過する時に荷電した分子になる。したがって、蛋白質性物質をその分子サイズに基づいて分離するためにはこれらの物質はそれが毛管カラムを通る時同じ有効電荷−質量比を持っていなければならない。

同じ有効電荷−質量比をを得るには一般に蛋白質性物質をドデシル硫酸ナトリウム（ｒｓＤｓＪ）のような界面活性剤で処理しふるい媒体としてポリアクリルアミドを利用することにより行われる。

このような手順はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥＪ　）と呼ばれる。例えば、ｉ亘１１のゲル　゛　パ（第二版）　（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　（Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄ、）　Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｒｎｅｓ　＆Ｄ、　Ｒｉｃｋｖｏｏｄ、　Ｅｄｓ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９９０）を参照。また、　の　い　］　（Ｎｅｗ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｔ、　Ｗ、　Ｊｏｒｇｅｓｏｎ　＆　Ｍ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｅｄｓ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，１９８７）も参照。これら２つの文献はここに本発明を説明するものとしてすべて取り入れられる。

ＳＤＳのような界面活性剤は疎水性（嫌水）「テイル」　（尾）と親水性（汗水）「ヘッド」　（頭）を含んでなる。かくして、界面活性剤は、界面活性剤の疎水性テイルと蛋白質種の間の疎水性相互作用を通じて、蛋白質種と夏作用する。

イオン化によって蛋白賀種を取り囲む界面活性剤分子の親水性「ヘッド」は負に荷電されたり、正に荷電されたり、あるいは中性のままであり、イオン化によってＳＤＳは負に荷電される。したがって、ＳＤＳ　：蛋白質複合体は均一な電荷分布をもち、ついでその複合体はゲルマトリックス中の細孔サイズに比例したサイズに基づいて分離されることができる。

Ｐ／ＡＣＥ’″１高性能毛管電気泳動システム（ベックマン・インスツルメンツ社）　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、、　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡ、、Ｕ、Ｓ。

Ａ、）のような市販の毛管電気泳動装置は紫外線（ｒＵＶＪ　）光吸収に基づくシステムを利用する。ポリアクリルアミド充填毛管中の５ＤＳ−蛋白質複合体のＵＶ検出は可能であるけれども、そのような検出は約２５０　ｎｍ以上の特殊波長検出に制限される。これは架橋及び非架橋ポリアクリルアミドゲルの両方ともに高ＵＶ吸収が付随するからである。

そのような検出制限は特に蛋白質の分析に関して明白に不利である。これは蛋白質は蛋白質内のペプチド結合により２１４ｎｍで強く吸収するからである。しかしながら、ポリアクリルアミドゲルの使用によって生じた２５０ｎｍ以上の検出制限の故に、ポリアクリルアミド基準ゲルシステムを用いる蛋白質性物質のＵＶ検出の感度及び選択性が制限される。

したがって、界面活性剤：蛋白質性物質のＵＶ検出は、もしカラム上検出を低ＵＶ波長で行えるならば非常に改善されるであろう。

これは、前述の事情に鑑み、ポリアクリルアミドゲルの欠点に煩わされない分子ふるい物質を必要とする。

蛋白質類及びペプチド類とは異なり、ポリヌクレオチド類（すなわち、デオキシリボ核酸、ＤＮＡ、及びリボ核酸、ＲＮＡの巨大分子）は同じ電荷−質量比を持っている。そのように、例えばＤＮＡの分析は典型的に上述のような界面活性剤の利用を必要としない。

最も典型的には、ポリヌクレオチド類の分析にはそれらの配列、すなわち特定の核酸類のポリヌクレオチドに沿った決定された順序、または制限フラグメントの分析、例えば酵素分割に付されたポリヌクレオチド類の比較できるフラグメントに基づいた遺伝による遺伝変異の長さによる分析（「制限フラグメント長多形性」またはｒＲＥＬＰｓＪと呼ばれる）が含まれる。そのような配列情報は研究、商業上及び医学上の研究者に豊富な知識を提供する。例えば、ＲＦＬＰｓは特定の遺伝変異の外観と特定のポリヌクレオチドフラグメント長を相関づけるのに利用される。

ＤＮＡ及びＲＮＡは長い糸状の巨大分子であり、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド類の鎖を含んでなり、ＲＮＡはリボヌクレオチド類の鎖を含んでなる。１つのヌクレオチドはヌクレオシド及び１つまたはそれ以上のリン酸基からなり、ヌクレオシドはペントース糖に結合した窒素塩基からなる。典型的に、リン酸基はペントース糖の第五炭素（ｒＣ−５Ｊ）水酸基（ｒＯＨＪ　）に付着している。

したがって、その化合物は典型的にヌクレオシド５″　−リン酸塩または５゛　 −ヌクレオチドと呼ばれる。

ＤＮＡの分子中においてペントース糖はデオキシリポースであり、一方ＲＮＡの分子中においてペントース糖はリポースである。

ＤＮＡ中の窒素性塩基はアデニン（ｒＡＪ　）　、ソトシン（「Ｃ」）、グアニン（ｒＧＪ　”）またはチミン（ｒＴＪ　）である。これらの塩基項はＲＮＡにおいてウラシル（ｒＵＪ　）でチミンを置き換える以外同じである。したがって、集合的に「デオキシヌクレオチド三リン酸Ｊ　（ｒｄＮＴＰｓＪ）と呼ばれるＤＮＡの主要ヌクレオチド類は次のものである：デオキシアデノシン５′　−三リン酸（ｒｄＡＴＰＪ）、デオキシシチジン５゛−三リン酸（ｒｄｃＴｐ」）　、デオキシグアノシン５′　−三リン酸（ｒｄＧＴＰＪ）及びデオキシチミジン５゛−三リン酸（ｒｄＴＴＰＪ　）。ＲＮＡの主要ヌクレオチド類は次のものである：アデノシン５°　−三リン酸（ｒＡＴＰ」）、シシチジン５′　−三リン酸（ｒｃＴＰＪ　）　、グアノシン５゛　−三リン酸（ｒＧＴＰＪ　）及びウリジン５′　−三リン酸（ｒＵＴＰＪ）。便宜上、ヌクレオチド類の塩基の順序は５°から３の方向、すなわち、５’　−ＡＴＣＧ−３°　または単にＡＴＣＧと書く。

ヌクレオチド類の２本の相補−末鎖（ないし「ストランド」）はヌクレオチド間で（比較的）弱い水素結合によって保たれ、完全な二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ巨大分子を形成する。塩基間の結合の特異性はＡは常にＴ（またはＲＮＡの場合はＵ）に結合し、Ｃは常にＧと結合することである。そこで、配列５’　−ＡＴＣＧ−３’　では配列３’　−ＴＡＣＧ−５°はそれから直接交差して位置する。

この結合特異性のゆえにＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖鋳型の配列はその鋳型に結合する塩基を決めることにより決められる。これが、本質的にヌクレオチド配列の基礎である。

もう一つＮＴＰｓの独特かつ有用な形が存在する。これらは連鎖停止（読み終わり）ジデオキシヌクレオチド三リン酸、ｒｄｄＮＴＰｓＪと呼ばれる。ｄｄＮＴＰｓはそれらが３′　−ヒドロキシル基に欠ける点でｄＮＴＰｓと相違する。したがって、ｄｄＮＴＰｓはその５゛　−三リン酸部分を通じて成長プライマーストランド中に取り込まれ得るが、３゛　−ヒドロキシル基のないことが後続のｄＮＴＰ（またはｄｄＮＴＰ）とのリン酸ジエステル結合の形成をする。

したがって、ひとたびｄｄＮＴＰがプライマーストランド中に取り込まれると、そのストランドのそれ以上の延長は不可能である。

ＤＮＡ配列プロトコール類（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）　、特に自動ＤＮＡ配列計装形式に適したプロトコール類は、原理的に、サンガーら　（Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩｊＳＡ　７４：　５４６３− ５４６７　（１９７７））　ｌこより開発された方法（以下、サンガーらという）に依存する。一般に、サンガーらのプロトコールは４つの別々の合成を含み、そこで−末鎖の鋳型（すなわち、例えば二本鎖ＤＮＡの変性またはＤＮＡ鋳型の例えばバクテリオファージＭ１３ベクター中へのクローニングを経て得ることができる、決めるべき配列）にはプライマー（すなわち、その鋳型の一部に相補的な短いオリゴヌクレオチド）がそのプライマーの伸長がＤＮＡポリメラーゼ（成長プライマーストランドにそってｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす酵素）を経て進行するように与えられる。各反応は４つの塩基の１つ、すなわち、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧで、適当な連鎖停止剤の取り込みを経て（その反応に利用される適当なｄｄＮＴＰを経て）停止される。このように、もしその鋳型が５ °　−ＸＸＸＡＴＧＣＴＧＣＡ−３゛配列を持ちプライマーがＸＸｘに相補であるならば、ＤＮＡポリメラーゼとともにｄＧＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄｄＡＴＰの添加は鋳型に相補である２つのプライマー−伸長フラグメント：　５’−ＸＸＸＴＡ−３’及び５’　−ＸＸＸＴＡＣＧＡ−３゛の形成をもたらす。第二の合成において、プロトコールは例えばｄｄＴＴＰをｄｄＡＴＰの替わりに利用する以外同じで、５′−ＸＸＸＴ−３’　及び５’　−ＸＸＸＴＡＣＧＡＣＧＴ−３’　（７）形成をもたらす。第三の合成はｄｄＣＴＰを利用しく５’　−ＸＸＸＴＡＣ−３°及び５’−ＸＸＸＴＡＣＧＡＣ−３″）　、　ｉ四ｆ７１合成ハｄｄＧＴＰを利用する（５’　−ＸＸＸＴＡＣＧ−３°及び５’ 　−ＸＸＸＴＡＣＧＡＣＧ−３’　）ｏ標識り、たｄｄＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ＊たはプライマーを利用し、種々の伸長生成物をゲル電気泳動に付すことにより、得られるゲル上に、伸長フラグメントの種々の電気泳動移動性による種々の離散バンドが得られる。これらのバンドから鋳型の配列がそれから容易に決定されるように伸長フラグメントの配列を決定することができる。

ポリヌクレオチド類は同じ電荷−質量比を持つけれども、配列反応に必要な一本鎖ポリヌクレオチドは第二次構造形成、すなわち、−末鎖に沿った相補塩基類の内部塩基ベアリングを経る一本鎖の折りたたみに煩わされる。そのように、配列ゲルは典型的にその中に変性物質、すなわち、そのような二次構造形成を低減または防止する物質を取り込む。

上記のことから判るように、異なったプロトコールに異なった分離剤物質類を利用することができる。しかしながら、典型的には各々のプロトコールに異なった毛管カラムの使用を必要とする。これはそのような分離剤物質類（開管毛管電気泳動に使用される緩衝剤以外の）はカラム内で実質的に「固定」され得るからである。このように、現在までは、新しい材料が分離試料に必要とされるとか何らかの理由でカラムから分離剤物質を取り除く試みは実用的でなく、全く新しいカラムをめるか調製せねばならなかった。そのようなカラムは典型的に経費がかかり、その調製は煩雑で時間がかかり、その取り替え毛管電気泳動装置の操作停止を必要とし、そのため全効率を低下させ分析時間を増加させる。

そこでここに必要とされることは、種々の材料の分析に有用な毛管カラムであり、そこに用いられるカラムまたは塗布剤の性能に悪影響することなく、試料分析に用いられる分離剤物質がカラムから除去することができ、そこへ異なった分離剤物質を添加することができるよう異なった分離剤物質に合致する毛管カラムである。

主皿匝１羞ここに開示されるのは、例えば界面活性剤：蛋白賀性物質複合体頑及び−末鎖及び二本鎖ポリヌクレオチド類の毛管電気泳動分析に適用できる分離組成物を含有する毛管カラム類である。一つの態様において、本発明は内部表面をもつ壁で規定された内部の空洞をもつ毛管カラム、壁の内表面に吸収された二官能性試薬、二官能性試薬と共重合したゲル組成物、ゲル組成物中に吸収された親水性ポリマー、及び毛管カラムの残部を実質的に充填された分離組成物を含んでなる毛管カラムを志向する。分離組成物の例は動的架橋組成物、変性組成物及び開管緩衝剤溶液である。最も好ましくは二官能性試薬は少な（とも一つの正に荷電したアミン及び少な（とも一つの活性官能基を含んでなり、ゲル組成物はビスアクリルアミドと架橋したアクリルアミドであり、親水性ポリマーは１０％デキストランであり、動的架橋組成物は蛋白質とペプチドの分析に用いられ、約０．０１％と約１．　５％の間のポリエチレンオキシド、約０．０％と約２．００％未満の間のポリエチレングリコール、約０．０％と約２．０％の間の界面活性剤、約０．０％と約９９．０％の間のポリオール及び約０．０Ｍと１．０Ｍの間のｐＨ緩衝剤を含んでなり、その組成物のｐＨは約２．０と約１０．０の間であり、変性組成物はポリ槙酸の配列決定に用いられ、２０％デキストラン（ＭＷ＋２．ｏｏｏ、０００）　、７Ｍ尿素及びトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ホウ酸塩緩衝剤、ｐＨ８，３、を含んでなり、開管緩衝剤溶液は蛋白質性物質の分析に用いられ、分析すべき試料に適したイオン強度とｐＨをもつ。

・　の　を−号　日添付の図面は発明の好ましい態様の詳細な説明に関連して参考とするため提供される。

図１は本発明による二官能性試薬、ポリマーゲル、親水性ポリマー層及び分離組成物を含んでなる毛管カラムの端部の拡大想定図である。

図２は四級アルキルアミン三官能性試薬に共重合したポリアクリルアミド中に吸収させた１０％デキストラン上に層化した１、０％ＰＥＯ／１．０％ＰＥＧ／１．０％エチレングリコール動的架橋組成物を用いる分子量２９．０００〜２０５，０００の５ＤＳ−蛋白質標準混合物の第１番目及び第５０番目の分離の電気泳動図を重ねて示す図である。

図３は図２の材料を用いる標準混合物の第５０番目及び第１ＯＯ番目の分離の電気泳動図を重ねて示す図である。

図４は図２の材料を用いる標準混合物の第１５０番目及び第３００番目の分離の電気泳動図を重ねて示す図である。

図５Ａ及び５Ｂは２０％デキストラン（ＭＷ：２．ｏｏｏ、ｏ。

Ｏ）、７Ｍ尿素及びトリス−ホウ酸塩緩衝剤、ｐＨ８，３を用い、各分析間でカラムを再生したポリｄＡ、。−１゜の単一塩基分解を証明する電気泳動図結果である。

図６は二官能性試薬を含んでなるカラム中の図５の分離組成物を用いる位置８から位置３３を含んでなる鋳型Ｍ１３ｍｐ１８のセグメントの単一塩基分解配列分析を証明する電気泳動図結果である。

図７は二官能性試薬−ゲル組成物−親水性ポリマーを含んでなるカラム中の図５の分離組成物を用いる図６のＭ１３ｍｐ１８の部分の単一塩基分解配列分析を証明する電気泳動図結果である。

い　の−Ｉ′畳　日ここに開示されるのは下記の組み合わせを含んでなる毛管カラムである＝　（１）毛管カラムの内壁に吸収されている二官能性試薬、（２）二官能性試薬と共重合したゲル組成物、（３）ポリアクリルアミドゲル上（°こ吸収された親木性ポリマー、及び（４）カラムの残部にわたり実質的に散在した分離組成物。

ここで用いる用語「毛管カラム」は内部表面で壁を規定された内部空洞を含んでなる毛管を意味し、毛管の内径範囲は約２μｍと約２０００μｍの間にあり、最も好ましくは約１００μｍと約２００μｍの間にある。毛管電気泳動システムの検出システムがＵＶ吸光度に基づくものであれば、毛管は好ましくはＵＶ透透性性材料例えばガラスまたは溶融シリカ等で作られ、溶融シリカが最も好ましい。

毛管電気泳動システムの検出システムが例えば放射性検出または蛍光検出に基づくものであれば、毛管は好ましくはそのようなシステムに伝導性の材料で作られる。アルミナ、ベリリウム、テフロン（ＴＥＦＬＯＮＴゝ）−塗工材料、ガラス及び溶融シリカが代表的材料である。毛管カラムは適用される広い範囲の電気泳動電界、１センチメートル当たり約ｌＯボルト（ｒＶ／ｃｍＪ）から約１０００ｖ／ｃｍまでの電界に耐え得るものでなければならない。毛管カラムは取扱い易（するため外側を（例えば、ポリアミド材を用い）塗工されてもよい。

ここで用いられる用語「組合わせ」は下記の成分の１つまたはそれ以上が毛管カラム内部に含まれることを意味する：二官能性試薬、ゲル組成物、親水性ポリマー。それで、これら３成分全てが利用されるのが好ましいが、これは絶対的ではない。例えば、変性組成物については、その組成物は毛管カラムの内壁に吸収されたこ官能性試薬と個々に利用され得る。

米国特許第５，０９８，５３１号（ここに本発明を説明するものとして取り込まれる）によれば、「二官能性試薬」は毛管壁の内面に吸収された試薬であり、少なくとも１つの正に荷電したアミン及び少なくとも１つの活性官能基を含んでなる。二官能性試薬の特に好ましい態様は下記の化学構造を持つ：ここにＲ，、Ｒ，、Ｒ，の３つ及びＲ４は独立して下記のものからなる群から選ばれる・ここにｎはＯと１０の間の整数であり、ｍはＯと５の間の整数であり、ただし、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，及びＲ４の少なくとも１つは−ｃ＝ｃ、−ｃ＝ｃ−１ −Ｃ＝Ｎ、−Ｃ−Ｃ＝Ｃ−１−Ｏ−Ｃ＝Ｃ−及びｃ−ｏ−ｃ＝ｃからなる群から選ばれた部分を含んでなる活性官能基を含んでいなければならず、ｙはｌと５０００の間の、より好ましくはｌと２０００の間の、最も好ましくは１１の整数であり、又はフッ素、塩素、臭素、沃素及びアスクチンからなる群から選ばれる。

特に好ましい態様において、Ｒ，、Ｒ，及びＲ３はそれぞれ−（ＣＨ，）、−ＣＨ，で、ｎはＯ（すなわちｒＣＨ，Ｊ　）　、Ｒ。

は−ＣＨ，ＣＨ＝ＣＨ，であり、Ｘは沃素であり、ｙは１である。

したがって、二官能性試薬の特に好ましい態様は下記のように表すことができる：これは「沃化トリメチルアリルアンモニウム」ないし「ＴＡＡＩ」二官能性試薬と呼ばれる。土工の官能性基部分はゲル溶液と共重合できる。

好ましくは、「ゲル溶液」は少な（とも１つのモノマーと少な（とも１つの架橋剤を含んでなる高分子ゲルであり、反応条件とともにモノマーと架橋剤の量を変えることにより調整できる細孔構造を持っている。好ましい高分子ゲル材はモノマーがアクリルアミド及び架橋剤がＮ、Ｎ’　−メチレンビス−アクリルアミドに基づ（ものであり、毛管電気泳動ゲルの製造に用い得る他の七ツマ−及び架橋剤はよく知られまた変更されており、ここにその詳細は述べない。

他の材料、例えば触媒もまた溶液中に含まれる。

ポリアミドゲルの細孔サイズは全モノマー濃度（％Ｔ）及び架橋剤濃度（％Ｃ）に依存する。細孔サイズは％Ｃを固定して％Ｔを減らしていって漸次太き（することができるが、非常に希薄なゲルは機械的に不安定であり、８０ｎｍより大きい細孔サイズは得られない。ほかの方法は％Ｔを固定して％Ｃを段階的に増加する方法で、％Ｃは次式で誘導される：％Ｔ＝　リルアミ　゛　Ｘビス　リル　ミ　゛溶媒１００　ｍ　１％Ｃ＝　ビスア　１ルアミ　゛　ｘｌｏ。

ビスアクリルアミドｇｘアクリルアミドｇヒアテン（Ｈｊｅｒｔｅｎ、　Ｃｈｒｏｍｏ　ｒａ　ｈｉｃ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５９　：　１２２−２３１９　（１９６７）（これはここに本発明を説明するものとして取り込まれる）参照。好ましくは％Ｔは約１から約３０、より好ましくは約３から約１５、最も好ましくは約３である。好ましくは％Ｃは約０から約１５、より好ましくは約０．０１から約６、最も好ましくは杓０．　２である。

ここで用いられる用語「親水性ポリマー」は界面活性剤物質及び／または蛋白質性物質と物理的に相互作用せず、ゲル組成物に例えばフリーラジカルまたはファンデルワールス力相互作用によりそれぞれ化学的または物理的に付着することができるポリマーである。

例示親木性ポリマーにはデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、セルロース誘導体、ポビニルアルコール、アガロース及びそれらの変形物または混合物であるが、それらに限定されない。そのどの親水性ポリマーでも濃度範囲は好ましくは約０．１％から約４０％、より好ましくは約５％から約２０％、最も好ましくは約１０％である。上限はそのどの親水性ポリマーでも最高溶解濃度によって決められる。最も好ましくは、親水性ポリマーとして１０％デキストランを利用する。

ここで用いられる用語「分離組成物」は毛管カラム中に置くことができ、カラムから実質的に除去することができ、かつ毛管電気泳動技術を経る試料の分析に利用することができる組成物である。用語「分析」は種々の技術を包括するものであり、それらは試料の成分部分の相互の物理的分離、試料の例えば検量線などに基づく成分部分の定量、試料の例えばＤＮＡ配列における成分部分の順序の決定、試料の例えばＲＦＬＰｓでのサイズ及び長さに基づく成分部分の分離が含まれる。再度述べるが、試料の毛管電気泳動分析に有用で、ここに開示するカラム中に置きそこから実質的に除去できる「分離組成物」は広い定義範囲に入る「分離組成物」を意味する。

例示的な分離組成物は動的架橋組成物、変性組成物及び開管緩衝剤溶液類である。

ここで用いられる用語「動的架橋組成物」は互いに水素結合によって維持されたポリマー鎖の三次元網目を持ち、液相に分散したゲル様溶液を意味する。動的架橋組成物は分離すべき材料のサイズに基づいて、なかんずく、分子ふるいであり得る程度の剛性の十分な構造を持つ粘性の液体である。

特に好ましい態様において、動的架橋組成物は約１．０％のＰＥＧ、約１．０％のＰＥＧ、約１．０％のエチレングリコール、界面活性剤：蛋白質性物質複合体の形成に用いられるのと同じ約０．１％の界面活性剤、及びｌｏｏｍＭのｐＨ緩衝剤を含んでなり、その組成物は約８．０と約９．０の間のｐＨ及び約５００センチボイズ未満の粘度を持つ。組成物がＰＥＧを含有しないとそれは架橋組成物とは反対の線状組成物である。ＰＥＧは好ましくはＰＥＯを動的に架橋するために組成物に添加される。したがって、ここに成句として用いる「動的架橋組成物」は上述したようにＰＥＧを含有しない組成物のような線状組成物を含む。

ここで用いられる用語「ポリオール」は繰り返しｒｃＨＯＨＪ部分を含んでなる組成物で、例示ポリオールはエチレングリコールである。ポリオールの意義は、二官能性試薬、ゲル組成物及び／または親木性ポリマーのどれででも「塗工」されていない毛管の内壁のどの部分もポリオールで「塗工」されるよう動的架橋組成物内を「循環」することにある。

ここで用いられる用語「界面活性剤」は疎水性及び親水性を持ちイオン化により負電荷、正電荷または中性電荷のどれかを示す物質である。界面活性剤の疎水性部分は蛋白質性物質と疎水性相互作用により相互作用し、その物質が界面活性剤の親水性部分によって取り囲まれるように相互作用できる。代表的なアニオン界面活性剤類には例えばドデシル硫酸ナトリウム（ｒｓＤｓＪ　）　、デシル硫酸及びデオキシコラートが含まれる。代表的なカチオン界面活性剤類には例えばセチルトリメチルアンモニウムプロミド（１’−ＣＴＡＢｊ　）及びセチルピリジニウムクロリド（ｒｃＰｃＪ）が含まれる。代表的なノニオン界面活性剤類には例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　１００ＴＭやトリトンＤＦ１６”のようなポリオキシエチレンエーテル類、及びＢＲＩ　Ｊ−３５ＴＭ１ＴＷＥＥＮ”界面活性剤及びＬＵＢＲＯＬ−ｗＴ″のようなポリオキシエチレンソルビタン類が含まれる。上記商標つき界面活性剤はシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳｔＲｏｕｉｓ、　ＭＯ，）から入手できる。界面活性剤類のうち、アニオン界面活性剤類が未処理溶融シリカカラムとともに使用するのに好ましい。最も好ましくは界面活性剤はアニオン界面活性剤ＳＤＳである。

ここで用いられる用語「蛋白質性物賀」は蛋白賀類（天然及び組換え核酸技術により誘導された蛋白質の両方）、ペプチド類、ポリペプチド類、核酸類及びオリゴヌクレオチド類を意味する。ここに開示された動的架橋組成物は特に蛋白質性物質、特定の蛋白質の分析に有用性を見いだすが、開示はそれら物質に限定されないと理解されるべきである。このように開示した動的架橋組成物は毛管電気泳動技術により分析され得る他の物質の分析に利用できる。ここに規定する蛋白質性物質はイオン化により荷電され得るから、動的架橋組成物はそのなかに界面活性剤を取り込む必要はない。例えばデオキシリポ核酸分子類は同じ電荷−賀量比を持ち、それゆえこの結果を達成するのに界面活性剤は必要とされない。しかしながら、蛋白質性物質の分析にその組成物が界面活性剤を含有することは好ましい。

ここで用いられる用語「変性組成物」は毛管電気泳動プロトコルを用いて核酸類の分析、特に核酸配列決定及びＲＦＬＰｓの分析に利用できるどの組成物をも意味する。定義としては明白であるが、変性組成物は定義した動的架橋組成物のパラメーター内に入り、その逆も然りである。例示的な変性組成物は（ａ）少なくとも１つの前述の親水性ポリマーの約７％からその溶解度限度の間、好ましくは前述の親水性ポリマーの１５％から約５０％の間、より好ましくは前述の親水性ポリマーの約２０％、（ｂ）二次構造の生成を防止もしくは実賀的に低下させることができる少なくとも１つの変性剤、例えば約６Ｍと約８Ｍの間の尿素、約２０％と約４０％（容積）の間の非尿素変性剤とともに用いる約３Ｍと約８Ｍの間の尿素、及び約９８％までの非尿素変性剤、ここに非尿素変性剤は水素結合を分裂することができる少なくとも１つの部分と分子内の塩基の対合を減少させることができる少なくとも１つの部分を含んでなり、及び（ｃ）約１００と約１ＧＯＯＶ／ａｍの間の電位適用下で約５と約６０μＡ（マイクロアンペア）の変性組成物を通る電流を維持することができる少な（とも１つの緩衝剤、を含んでなる。好ましくは変性溶液の粘度は約３０００センチボイズ以上、より好ましくは約４０００センチポイズまたはそれ以上である。特に好ましい態様において、変性組成物は７Ｍ尿素、２０％デキストラン（重量／容積、ＭＷ：２．ｏｏｏ、０００）　、及びＯ，ＩＭトリス／、２５Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８，３を含んでなる。

最も好ましくは、親水性ポリマーは２０％デキストランである。

デキストランを利用する場合、その分子量は好ましくは約７５０゜０００より大きく、さらに好ましくは約１，５００，０００より大きく、最も好ましくは２．０００，０００またはそれ以上である。親水性ポリマーとして、その濃度はその分子量が大きくなるとともに低下でき、そこで、ある与えられた親水性ポリマーではその分子量が大きいと低い濃度を利用することができる。

最も好ましくは、変性剤は７Ｍ尿素である。好ましくは、単独もしくは尿素と組み合わせて利用される非尿素変性剤はアミド：であり、そのＮＨ２部分は好ましくは水素結合を分裂し、かつ水素、炭素原子数１〜約６のアルキル鎖、ベンゼン環及び置換ベンゼン環からなる群から選ばれるＲは好ましくは分子内塩基対合を減少また゛は防止するよう作用する。好ましいＲは、好ましい非尿素変性剤がホルムアミドになるように水素である。約３５％の非尿素変性剤が７Ｍ尿素とともに用いられるのが好ましい。

変性組成物の緩衝剤部分は原理的に組成物中を通る電流に応じて選択される。例えば、もし組成物があまりに抵抗性、すなわち低電流であると配列分解が有害な影響を受け、もし高電流だとその結果組成物中に移動する熱が核酸類に悪影響する。室温において、組成物中の電流は好ましくは約５−３０μＡ、最も好ましくは約１０μＡである。もし電流が好ましい値より少ないと緩衝剤のイオン強度を増加すべきで、もし電流が好ましい値より大きいと緩衝剤のイオン強度を減少すべきである。緩衝剤のイオン強度の増加は塩類、例えば塩化ナトリウムの緩衝剤への添加により行うことができ、一方イオン強度の減少は緩衝剤の希釈（ただし、好ましくは変性組成物は全く希釈しない）により達成することができる。組成物中の電流は容易に測定でき、またこの技術分野の当業者は緩衝剤のイオン強度を容易かつ有効に最適化できるから、有効に適切な緩衝剤組合せを選択することは当業者の技術範囲にあると考えられる。

ここで用いられる用語「開管緩衝剤溶液」は試料類の毛管電気泳動分析に使用することができる全ての緩衝剤溶液を包含する広い定義を意図する。再度述べると、試料類の開管毛管電気泳動分析（毛管カラムの内部壁を処理または塗工するかしないか）に利用することができる全ての緩衝剤溶液がこの定義の範囲内に入ることを意図する。そのような緩衝剤溶液はよく知られており、技術者の研究ニーズに基づいて変えられ、したがって、当業者は与えられた分析すべき試料に特に適した適切な緩衝剤溶液を容易に選ぶことができる。例えば、開管緩衝剤溶液のイオン強度は好ましくは約２００ｍＭ未満であるが、カラムが塗工されているからイオン強度は２００ｍＭ以上、例えば約１０００ｍＭの高さであってもよい。

しかしながら、イオン強度が増加するとジュール熱もまた増加し、試料がその熱でよ（ない影響を受けることがある。高イオン強度緩衝剤を利用する場合、カラムの内径はジュール熱を消散できるよう約５０μｍ未満、好ましくは約２５μｍ未満が良い。開管緩衝剤溶液のｐＨは好ましくは分析すべき試料に関して選択され、約２．０から杓１２．０の範囲にすることができる。典型的には蛋白質類の分析にはその蛋白質の変性を避けるためｐＨは約６．０と約８．０の間である。

当業者は研究すべき試料に最も効果的な、適当な開管骨ｍ暖衝剤を容易に選択できる。

ここで用いられる分離組成物に関係した用語「除去する」、「除去できる」及び「除去」は、毛管カラムが分離組成物をカラムから（二官能性試薬−ゲル溶液− 親水性ポリマー層を実買的にそのまま残して）取り出し、カラムを分離組成物で再充填することにより再。

生されることを意味する。そのように１本の毛管を、分離組成物の除去及び置換が必要とされるだけで多くの分析運転に利用することができる。分ｍ組成物の除去にはどのようなプロトコルも利用スルことができ、好ましくは、毛管カラムを試料導入に加圧注入様式を有する市販の毛管電気泳動装置と連結して使用する場合、組成物はその組成物に加えられる圧力により、すなわちその組成物をカラムから除去する手段として例えばガスまたは液体を用いてその組成物をカラムから「押す」ないし［吹く］ことにより除去される。

ここで毛管カラムに関係して用いられる用語「再生する」及び「再生される」とは、二官能性試薬−ポリマーゲルー親水性ポリマーの組合わせを含んでなるカラム及び分離組成物は、分離組成物を毛管が同じ分離組成物の異なった部分または全（異なった分離組成物で実質的に再充填されるように除去することができる技術に付され得ることを意味する。

毛管電気泳動システムの検出システムがＵＶ吸光度に基づくものである時、例えば親水性ポリマー、動的架橋組成物、変性組成物及び開管緩衝剤溶液とともに用いられるｐＨ緩衝剤及び緩衝剤類は好ましくはＵＶ透過性である。ここで用いる用語ｔ［ｖ透過性」は約１９５ｎｍから約３５０　ｎｍのＵＶ波長範囲を通じて無視できる吸光度を有することを意味する。ＵＶ透過性緩衝剤類の例は例えばいわゆる［グツドＪ　（Ｇｏｏｄ）緩衝剤群（グツドら「生物学研究用水素イオン緩衝剤」バイオ　；ス　１−５２：　４６７−４７７　（１９６６）　（Ｇｏｏｄ、　Ｎ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ　”Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　Ｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ″Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　５２）参照、これはここに本発明を説明するものとして組入られる）が含まれる。グツド緩衝剤は６．１５から８．７５のＰＫａ範囲にわたる双生イオン緩衝剤類であると記載することができ、２−　（Ｎ−、、モルホリン）エタンスルホン酸（ｒＭＥＳＪ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ｒＡＤＡＪ　）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸（ｒＰＩＰＥＳＪ）、ｎ− （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ｒＡＣＥＳＪ）、（２− アミノエチル）トリメチル−アンモニウムクロリド塩酸塩（ｒｃｈｏｌａｍｉｎｅ　Ｊ　）　、Ｎ、　Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ｒＴＥＳＪ）、Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ’−２ −エタンスルホン酸（ｒＨＥＰＥｓＪ）、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（ｒＴＲＩＳＪ）　、Ｎ−トリス（ヒドロキシ−メチル）メチルグリシン（ｒＴｒｉｃｉｎｅＪ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（ｒＢｉｃｉｎｅＪ）　、２−　（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタン−スルホン酸（ｒＣＨＥＳＪ　）及び前記の混合物が含まれる。ＵＶ検出目的に特に好ましいｐＨＩｔ衝剤はＴＲｌ５−ＣＨＥＳである。

前述の緩衝剤類はＵＶ検出に関連する使用に好ましいけれども、そのような緩衝剤類はまた例えば放射線検出または蛍光検出機器にも利用できると理解すべきである。その上、ＵＶ検出が利用されない場合、芳香族環またはペプチド結合を有する成分を含む緩衝剤類はｐＨ緩衝剤として利用することができる。ＴＲｌ５− ヒスチジンはそのような緩衝剤の例である。

動的架橋組成物と関連して用いられる緩衝剤のｐＨは主として利用される界面活性剤のタイプに関して選択される。カチオン界面活性剤では、緩衝剤のｐＨは酸性範囲（すなわち、約２．０と５．０の間）で、アニオン界面活性剤では、緩衝剤のｐＨはアルカリ範囲（すなわち、杓８．０と１０．０の間）であり、ノニオン界面活性剤では、緩衝剤のｐＨは約５，０と約８．０の間である。好ましいＳＤＳ界面活性剤については最も好ましいｐＨは約８．８である。

変性組成物に関連して使用される緩衝剤のｐＨは好ましくは約７と約９の間、より好ましくは約８，０と約８．５の間、最も好ましくは約８．３である。開管緩衝剤溶液のｐＨは第一に分析すべき試料に基づいて選択され、したがって、そのｐＨは約２．０と約１２．０の間にある。

上記に開示した分離組成物を使用する毛管電気泳動は、分離すべき成分を含有する試料のアリコートを本発明の毛管中へ導入し、少なくとも約１０Ｖ／ａｍの電場をカラムに適用し、杓１．０と約１００μＡの間の電流がカラム中に流れるようにし、試料の成分をそれらがオンライン検出器を通る時検出する工程を含む。

試料の導入は動電注入法または加圧注入によって行うことができる。電場は連続電場でもパルス電場でもよく、当業者はこれらの電場間の区別を認識しているであろう。好ましくは、連続電場が利用される。ここで用いられる「毛管電気泳動」は広く定義され、試料類の分離及び分析が試料を含む毛管カラムを適用電場に付すことによって達成されるようなプロトコルを含むと意図される。そのように毛管電気泳動は等電フォーカス及び等速電気泳動を含む。

毛管「ランニング緩衝剤」は第一に検出システムに依存する。

ＵＶ検出ではランニング緩衝剤はＵＶ透過性でなければならない。

好ましくは、ランニング緩衝剤は分離組成物とともに利用されるのと同じ緩衝剤である。分離組成物がｐＨ緩衝剤を含有しない場合、ランニング緩衝剤は、上述したように、検出システムに基づいて選定される。したがって、上記に開示したｐＨ緩衝剤はランニング緩衝剤に利用することができる。変性組成物については、ランニング緩衝剤は好ましくは変性組成物と同じである。例えば、変性組成物が７Ｍ尿素、２０％デキストラン、及びトリス−ホウ酸塩緩衝剤を含んでなる場合、ランニング緩衝剤は実質的に同じ成分を含んでなる。

蛋白質性物質類の分析は開示した動的架橋組成物を用い、２１４ｎｍのＵＶ波長で行うことができる。これはポリアクリルアミドゲル類に比し明白に有利である。その上、開示した動的架橋ポリマーは例えば蛋白質性物７ｊｔ類について大分子量範囲での定量分析に使用することができる。この技術分野で認識されているように、ポリアクリルアミドゲル類についての検量プロットはそれを行うのは全く困難で、そこで従来定量分析ははっきりしないものであった。

ＤＮＡの分析については、変性組成物を含んでなる開示のカラムは、一連の配列決定ランの後、全カラムを取り替える必要なしで配列決定に利用することができ、むしろ変性ゲルをカラムを機器においたままで取替えることができる。ＵＶ検出システムでは、分析は好ましくは２６０　ｎｍの波長で行われる。

試料類の開管分析については、開示されたカラムは特に毛管カラム中の電気浸透流を排除または減少することが望ましい分析事情によ（適合される。

下記の例は説明を目的としてのみ提示され、前述の開示または後記の請求の範囲を限定することを意図するものでなく、そのように解釈されるべきものではない。

透例１辻ＸＡ・　゛　Ｕｖ以下に示すサンプルの毛管電気泳動は、ベックンマンインストラメント社（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ。

）ＰＡＧＥ”高性能毛管電気泳動システムにより行った。このシステムは、オンライン検出用の内蔵の２００．２１４．２５４．２６０．２８０および４１５ｎｍの狭帯域フィルタを含んでいる。検出窓は、カラム出口から約７．０ｃｍカラム入口から４０ｃｍに位置していた。ＳＤＳたんばく賀分析について、検出は、２１４ｎｍ。

ＤＮＡ分析については、検出は、２６０ｎｍであった。

サンプルは、上記の毛管電気泳動システムの入口トレーに置いた。１−９０秒間圧力注入モードを用いて、動的架橋組成物にサンプルを自動的に注入した。サンプルは、１０秒間１０ｋＶを用いて動電学的注入により変性組成物中に注入した。

毛管カラムは、カラム長４７ｃｍ、有効カラム長４０ｃｍおよび内径１００μｍを有していた。ＳＤＳたんばく買の分析に対し、電界の強さは、３００ｖ／ａｍ　（４７ｃｍに対し１４．１ｋＶ）；使用電流は、２５−３０μＡであった。ＤＮＡの分析に対し、電界の強さは、３２０Ｖ／ｃｍ　（４７μｍに対し１５ｋＶ）、使用電流は、１０−１２μＡであった。

Ｂ、　し−−− ＤＮＡの配列決定は、高性能毛管電気誘導／レーザー誘導蛍光（ｒＨＰＣＥ／Ｌ　Ｉ　ＦＪ　）計装フォーマットを用いて達成した。

ＨＰＣＢ／ＬＩＦフォーマットについて、刃要素を有した熱ワイヤ−ストリッパー（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｍｏｄｅｌ　Ｇ）を用いて溶融シリカ毛管（すなわち２μｍ）の表面から長さの２ｍｍの保護ポリアミド皮膜を除去した。

毛管のこの部分は、２つの圧縮部品の間に支持した。分離毛管の端は、流動緩衝液（変性組成物と同じ成分を含んでなる）約４．７ｍｌを含む５ｍｌのバイアルに浸漬した。高電圧電源（たとえば、Ｂｅｒｔａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ｍｏｄｅ１２０５Ａ−３ＯＲ電源）への接続は、それぞれの緩衝液溜めに浸けたバリネーワイヤー（ｐａｌｉｎｅｙ　ｗｉｒｅｓ）により与えられた。高圧電源は、毛管の出口端を大地電位に保って、負極性構成により働かせた。

変性組成物を流れる電流は、回路の大地側に位置心のためプレキシグラスの容器の中に入れた。分離毛管の温度は、室温に保った。

計器へのサンプルの導入は、２つの分離毛管の入口端を、高電圧への電気的接続のためのパリネーワイヤーの短いストリップおよびサンプルを含むマイクロフユージ管に挿入することにより達成された。高電圧（約５−５０ｋＶ）を、約１０ −１５秒間かけた。

標識した２０のプライマーの検出は、レーザー誘導蛍光により達成された。ＢＯＤＩＰＹ丁Ｍ誘導体標識付はプライマー（ｉｎｆｒａ）は、ヘリウム−ネオンレーザ−を用いて、５４３．５ｎｍでの励起と５８０　ｎｍでの検出により用いた。蛍光発光は、２つの干渉フィルタ（Ｂａｒｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｗｅｓｔｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓ、製品番号Ｃｕｓｔｏｍ　５　Ｃａｖｉｔｙ；５５０ｎｍまたは５８０ｎｍ、１０ｎｍ帯域（ｂａｎｄ　ｐａｓｓ））を通してエンドオン光電子倍増管（ｒＰＭＴＪ　）（Ｈａｍａｍａ　ｔ　ｓ　ｕ、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ、製品番号Ｒ２２２８）の光電陰極に集めるように向けた。

例ＩＩ血！！ＩＡ、二　の炭酸ナトリウム（Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、　Ｎ、　Ｊ、、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　３６０４）１０６ｇ１アルキルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＭｉＩｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ、、Ｃａｔ、Ｎｏ、２４１０７−５）３７．５ｍｌおよびメタノール（Ｂ＆Ｊ、ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、Ｉ　１．、Ｃａｔ、Ｎｏ、２３０）２００ｍｌを１１丸底フラスコ中で攪拌した。エタノール５０　ｍ　ｌ中に含むようにしたヨードメタン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１−７７８−〇）１２４．５ｍｌを滴下ロートによりフラスコにゆっくりと加えた。反応混合物は、夜通しく１８時間）攪拌した。メタノールをロータリーエバポレータ（ｒｏｔａｖａｐ）により蒸発させた。次に、１５ｍ１のヨードメタンをフラスコに加えてから、１０分間振湯した。２００ｍ１の水と２０　ｍ　ｌのテトラヒドロフラン（Ｂ＆Ｊ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　３４０）を溶液に加え、２０分間攪拌した。次に、炭酸ナトリウムをろ過し、水性層を集め、０．２ミクロンの膜フィルタによりろ過した。

得られた溶液は、二官能性試薬トリメチルアリルアンモニウムヨーシトを含んでいた。

Ｂ６二官能性試薬の準備：・：１　１ル　ミ　−５，１マ一カーム毛管カラムをまずＩＮのＨＣＩで１５分間ゆすぎ、さらに１５分間ＩＮのＮａＯＨでゆすぎ、１５分間脱イオン水でゆすいで前処理段階とした。次に、例ＩＡのトリメチルアリルアンモニウムヨージドニ官能性試薬を、前処理したカラムに入れて、３０分間保持した。

前処理したカラムの内壁への二官能性試薬の吸着に続き、ポリアクリルアミド塗料をそれに加えた。ポリアクリルアミド塗料は、脱イオン水２ｍｌにビスアクリルアミド（ｒｃＮ　製品番号８００１７３）０．０００１２ｇと超純粋アクリルアミド（ＩＣＮ、　１ｒｖｉｎｅ、　ＣＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、８１４３２０）０．０６ｇを含むものを脱ガスすることにより得た（容量百分率で、アクリルアミド３％、ビスアクリルアミド０．２％）。この溶液を、ｏ。

２ミクロンナイロンフィルタを通してろ過した。アクリルアミド溶液に、１０μ ｌの１０％Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチレンジアミ　ン　（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、　Ｍｄ、　Ｃａｔ。

Ｎｏ、　５５２４）と１０％過硫酸アンモニウム（ＢＲＬ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、　５５２３）を加え、この溶液を、５ｐｓ　ｉのヘリウムガスを用いてカラム中に押し入れ、３分間かけて圧力を０まで徐々に下げた。さらに、２分間してから、毛管の端をシリコンプラグでふたをし、室温で４５分間保存した。その後、６０ｐｓ　ｉの窒素ガスの圧力の下で、ポリアクリルアミドゲルの層を残し、ポリアクリルアミドを水によりカラムから吸着された二官能性試薬へと押した。

さらに、ポリアクリルアミドに親水性の層を加えた。２　ｍ　ｌの１００ｍＭのＴＲｌ５−ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ８，８）　へ、０２ｇのデキストラン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，製品番号Ｄ−１３９０ＭＷ７０゜０００）を加え、デキストラン濃度（重量／容量）１０％とした。

このものへ、脱イオン水に含むようにした１０％硫酸セリウム４水和物（Ｆｌｕｋａ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ、製品番号２２４４０）４０μｍを加えた。次にこの溶液を、２０ｐｓ　ｉのヘリウムガスを用いて、毛管に迅速に押し込んだ１１０分後、圧力は、０ｐｓｉに徐々に下がった。次にカラムは、シリカプラグにより端をぶたし、２４時間室温で保存した。

Ｃ４肱妊且１皿底旦ｌｏｇのＰＥＯ（ＭＷ　９００．０００；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ、、製品番号１８．９４５−６）およびｌｏｇのＰＥＧ　（ｍｗ　３５．０００；　Ｆｌｕｋａ、　Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ、、製品番号８１３１０）を、１０　ｍ　ｌのエチレングリコール（ＶＷＲ。

製品番号ＥＭ−ＥＸＯ５６４−１）および５０ｍ１の脱イオン水と１．２１の広口フラスコ中で１０分間混合した。その後、これに、７００　ｍ　ｌの脱イオン水を加え、磁気棒により５０℃で３時間攪拌した。この後、２００ｍ１のランニング緩衝液（ＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）をこれに加え、１時間攪拌した。次に、１０％ＳＤＳ　（１，０ｇのＳＤＳをｌ　Ｏｍ　ｌの脱イオン水に完全に溶解させである）１０ｍｌを加え、これに脱イオン水を加えて最終容量が１０００　ｍ　ｌになるようにしてから、室温で夜通し攪拌した。使用に先立って、動的架橋組成物を、５分間、超音波処理にかけ空気の泡を除いた。

動的架橋組成物の粘度は、ＥＬＶ−８”粘度計（Ｃｏｌ−Ｐａｒｍｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　Ｉｌｌ、）を用いて、１００ｍ１の組成物で測定した。粘度は、２５℃で測定した同じ容量の脱イオン水（２０センチポアズ）およびグリセリン（１１００センチポアズ）と関連させ同温度で１５０センチポアズであると測２４２ｇの超純粋トリスヒドロキシメチルアミノウレタン（ＩＣＮ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｍａｎｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、製品番号８１９６２０）と３．０９ｇの硼酸（ＩＣＮ、Ｓｃｈ、ａｒｔｓ−Ｍａｎｎ、製品番号１９５０７４）とを−緒にし、ダブル脱イオン水１３５ｍ１をこれに加え、攪拌し、０．１Ｍ）リス／、２５Ｍ硼酸溶液を得た。その後、３４．０８ｇの超純粋尿素（ＩＣＮ、Ｓｃｈａｒｔｓ−Ｍａｎｎ、製品番号８２１５２７）を一定の攪拌の下で、それにゆっくりと加えた；これにより７Ｍの尿素を含む溶液が得られた。使用に先立って、この溶液を、０．２ミクロンのフィルターでろ過してから、脱ガスを行った。この溶液のｐＨは、８．３であった。２０％（重量／容量）のデキストランを達成するため、８．０ｇのデキストラン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、　ＭＯ，）製品番号Ｄ−５３７６、ＭＷ−２，０００，０００）に、十分な量の上記の溶液を加えて、全容量を４０ｍｌとした。

変性組成物の粘度は、ＥＬＶ−８７Ｍ粘度計を使用し、１００ｍ１の組成物を用いて測定した。粘度は、２％メチルセルロースに対して２５℃で４３００センチポアズと測定された（測定値は、１８００センチポアズであった；メチルセルロースの上述の粘度は、４０００センチポアズである）。

Ｅ、二官能性試薬の準備：ボＩ　１ル　；　−ポリマー−カームおり−ム例ＩＢのカラムへの例ＩＣおよびＩＤの分離組成物の添加に先立ち、カラムは、ＩＮのＨＣｌ０．５ｍｌによりゆすいだ。動的架橋組成物を１ｐｓｉのヘリウムを用いて圧力注入によりカラムに加えた。変性組成物は、ヘリウムを用いて約３０ｐｓ　ｉを使用して圧力注入でカラムに加えた。

二官能性試薬が、イオン力によりカラムに吸着されると推定され；ポリマーゲルが、二官能性試薬に架橋され；そして、親水性のポリマーが、ポリマーゲルに吸着されるので、これらの成分が、毛管カラムの内壁に「永久的に」つくように意図される。他方、分離組成物は、親水性ポリマーに「永久的にｊつ（ようには意図されない。したがって、これらの組成物は、カラムが、再生され得るようにカラムから取り出すことができる。よって、一連の分析試験の後、全カラムを交換するよりも、調査者は、カラムから分離組成物を除去し、他の分離組成物を用いて同じカラムを再生できる。

動的架橋組成物について、そのような除去は、１Ｏ−２０ｐｓｉのヘリウムを用い、さらに、ＩＮのＨＣＩを用いて２分間ゆすぐことにより達成した。その後、動的架橋組成物は、上記したようにしてカラムに加えた。同様なプロトコールを用いて、カラムが変性組成物を用いて計器に直接再補充されることを別として、カラムから変性組成物を除去するようにした。

例ＩＡ−Ｅで得た、毛管カラムの層の図解について図１を参照されたい、毛管１０は、活性化した内壁１５を含んでいる。正に帯電したアミノ化合物またはアミノポリマー２０ａと活性官能基２０ｂを含む二官能性試薬２０が、内壁１５に物理的に吸着している；活性官能基２０ｂは、ポリマーゲル３０と共重合していて、親水性ポリマー４０は、ポリマーゲル３０に吸着している。分離組成物５゜は、カラムの残り全体に実質的に散在している。

Ｆ、ニー　−−カームの毛管カラムに２９例ＩＡの二官能性試薬を塗布し、例１０の変性組成物を、約３０ｐｓ　ｉのヘリウムを用いてカラムの内部の残り全体に散在させた。

Ｇ、Ｌ監１１崖ま１００　ｍ　ｌの脱イオン水に１２．１ｇのＴＲｌ５　（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ；製品番号８１９６２０）を溶解させて０．５ＭのＴＲｌ５−ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ８，８）を準備した。固体のＣＨＥＳ　（ＩＣＮ、製品番号１０１４３４）を連続的に攪拌して加えｐＨが８．８になるようにした。脱イオン水を用いて最終容量が２００　ｍ　ｌになるようにした。

変性組成物を含んでなるコラム用の流動緩衝液は、７Ｍの２０％デキストラン、７Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス１０．２５はう酸塩、ｐ）（ｓ、３であった。

Ｈ，モデルたん　ン　ルの０．３ＭのＴＲｌ５サンプル緩衝液は、ｌ：ＩＨｃｌで調節してｐＨ６，６にし、以下に示すように１０％ＳＯ８を加えた。３６゜３ｇのＴＲｌ５を、５００　ｍ　ｌの脱イオン水に溶解させ、連続的に攪拌しなから１：ｌの希ＨＣＩ　（ＶＷＲｌ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉ５ｃｏ、　ＣＡ、製品番号ＶＷ３１１０−３）を加え、ｐＨをモニターしながら、ｐＨを６．６にした。１００ｇ（７）ＳＤＳ　（ＩＣＮ。

製品番号８１１０３４）を連続的に攪拌しながら加え、脱イオン水を用いて最終容量１０１００Ｏとした。

モデルたんば＜ｔｓＤｓ−たんばく買標準（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，製品番ｑＭＷ−５ＤＳ−２００）　は、分子量範囲２９．　０００　ｆｔイＬ、、約２０５．０００の６種のたんぽ（質からなる凍結乾燥した混合物を含んでなるものであった：ｌ）炭酸アンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅ）：ＭＷ−２９，０００２）オブアルブミン：ＭＷ−４５，０００３）ウシ血清アルブミン：ＭＷ−６６，０００４）ホスホリラーゼＢ二ＭＷ−９７，ｏｏ。

５）β−ガラクトシダーゼ：ＭＷ−１１６，０００６）ミオシン：ＭＷ−２０５，０００（数字の指示は、図２−４の番号をつけたピークに対応する）。オレンジＧ”（ｒ○　Ｇ、Ｊ）染料（７−ヒロドキシー８−フェニルアゾ−１，３−ナフタレンジスルホン酸；Ｓｉｇｍａ、製品番号０３７５６）を内部標準として用いた。脱イオン水に含むようにした０、１％溶液を例で用いた。

たんばく賞ジフルフィド結合は、２−メルカプトエタノール（■ＣＮ、製品番号１９０２４２）を用いて切断した。当業者が認めるように、界面活性剤および還元剤の存在下で、はとんどのマルチ鎖たんばく買は、界面活性剤を一定の値にさせ、ジスルフィド結合が、還元剤により切断される。かくて、たんぼ（買の二次構造が失われ、界面活性剤−たんばく賀複合体が、ランダムコイル構造を取る。

したがって、このように処理したたんばく買は、一定の形状および電荷比について同一の質量を有する。よって、いずれの還元剤（例えば、ジチオトレイット、（ＤＴＴ）およびメルカプトエタノール）も適用できることが認識されるべきである。

サンプルは、モデルたんばく質０．１−０．２ｍｇを混合することにより準備した。４０μｍのサンプル緩衝液：ｌｏμｌのオレンジＧ溶液：および５μｌの２ −メルカプトエタノール。脱イオン水を用いて最終溶液量１２５μｍとした。この最終混合物を密封マイクロ遠心分離バイアル中で、１５分間、湯浴（ＩＱＯ” Ｃ）により沸騰させ、毛管カラム中へ入れる前に、２分間水浴で冷却した。

１、ＥＦＬｆ　＼　ロ　コールＤＮＡ配列決定反応は、励起波長５４３ｎｍ、発光波長５８０ｎｍを有するＢＯＤＩＰＹ”誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｅｕｇｅｎｅ、　Ｏｒｅｇｏｎの所有）で標識付けしたプライマーを用いて行った。１ＭｇのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、製品番号２７−１５１６−１０）を、全量ｌｏμｌとした２μｍの５ｘ反応緩衝液（ＵＳＢ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ、　５ｅｑｕｅｎａｓｅ”ポリメラーゼキット製品番号７０７７５）および０，５ピコモルの上記のプライマーと混合した。この溶液を、６５°Ｃに加熱し、次に、３７ ℃に冷却してから、これに、１μｌのＤＴＴ溶液とｌμｌのＭｎ″４緩衝液（上記の５ｅｑｕｅｎａｓｅｆｌ″キツトから）を加えた。その後、９μｌの予め温めた終止ミックス（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍ１ｘ）をこれに加えてから〜未希釈のＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭポリメラーゼｌ−２μｌを加えた。終止ミックスは、４種のｄｄＮＴＰのうちの３種の１部に対し１種のｄＮＴＰｌｏｏ部とした濃度比混合物からなっていた。したがって、終止ミックスは、（ａ）２８８０μ Ｍの全ｄＮＴＰ（４種のｄＮＴＰＩ７１れぞれ５００　μＭ）　ト（ｂ）　３．　６　μｍｄｄＡＴｐ　＋　２．７μｍｄｄＡＴｐ　：　０．９０７ｚｍｄｄＣＴｐ　：　ＯｕｍｄｄＴＴｐ　（４：　３　：　１　：　Ｏ）の比の４種のｄｄＮＴＰの内の３種７．２μＭからなっていた。反応は、３０分間３７°Ｃに温室して、次に、それを氷上に置き、さらに、３．０Ｍの酢酸ナトリウム２μｍを添加してから、６０μｍの水冷エタノールを加えた。

ＤＮＡは、１２．ＯＯＯＲＰＭで１５分間遠心分離してペレットとしてから７０％エタノールで一度ゆすいだ。つぎにこのペレットを乾燥し、２．ｏμｔの８０％蟻酸アミド、ｌｏｍＭのＥＤＴＡ中に懸濁させた。サンプル（これは、分析されるまで、−２０’Ｃで暗所に保存できる）は、毛管への注入直前に１分間９５ ℃に加熱した。

泗二Ｌ１」− モデル５ＤＳ−たん（のモデル５ＤＳ−たんばく質の分析について、その６０ｎｌのアリコートを、例ＩＩＣの動的架橋組成物を含んでなる例ＩＩＢのカラムを用いて分析した。それぞれの分析の後、カラムを再生し、計器からカラムを除去することなく同じ組成物の異なる部分で置き換えた。

図２は、電気泳動図の結果と第１回と第５０回の分析試験を示している、すなわち、５０番目のアリコート（６０ｎｌ）の分析が得られた時点で、６０ｎｌのアリコートのサンプルを分析し、カラムは、５０回再生させた。明らかなように、モデルＳＤＳたんばく賀の優れた分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が、約２０分で効率的に迅速に得られた。ピークの相対的な位置が、１回目の試験と５０回目の試験についてほぼ同じであることがさらに観察される：このことは、二官能性試薬−ゲル組成物−親水性層が、５０回のカラム再生で実質的に損なわれないままであること、および該物賀が実買的に溶解しても、分析結果を異ならせる内浸透流れ、サンプル吸着などの可能性が増加することをとりわけ示している。

図３は、上記の再生プロトコールを用いたモデルＳＤＳたんばく質の５０回目と１００回目の分析試験の電気泳動図を示していて、これらの試験は前記したようにして行った。毛管の「永久的な」成分に有害な衝撃を与えることなく優れた分解が効果的に迅速に得られた。これらの同じ種類の結果が、１５０回目と３００回目の分析試験で証明される（図５）。

ＵＶ検出毛管電気泳動システムを用いるポリｄＡ、。−６゜の分析について、例ＩＩＣの変性組成物を含んでなる例ｒＩＢのカラムが用いられた。当業者が認めるように、ポリｄＡ、。−１゜のサンプルは、４０−６０のデオキシアデノシンヌクレオシドを含んでなるポリデオキシアデノシンの混合物を含む。したがって、たとえば、すべてのポリｄＡ、、は、その同一の長さに基づき、これらが「− 緒に」検出されるように実賀的に単−的にカラムを横断すると予期される。

よって、ｄＡ、、とｄＡｌ、との間の長さのちがいは、定義されたように分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）されるべきで、異なるピークである。

図５Ａおよび図５Ｂは、そのような分解を明示する。図５Ａは、ポリｄＡａａ− ｇｏ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓｏｌａ、　Ｓｗｅ　ｄ　ｅ　ｎ、製品番号２７−７９８８−０１）の１−５０　Ｉ）ユニットＡ１．。／　ｍ　＋アリコートの第１回の分析試験の電気泳動図の結果を与える：そののち、カラムは、計器からカラムを除去することなく、変性組成物の異なった部分で再生され、ポリｄＡ、。−２゜の第２のアリコート（１−５０ＤユニットＡ２．。／　ｍ　ｌ　）を分析した。これらの結果は、図５の電気泳動図に示しである。

ボ１ヌ　レオチ゛の　１′ ４ｄｄＡＴＰ　：　３ｄｄＧＴＰ　：　１ｄｄｃＴＰ　：　０ｄｄＴＴＰのｄｄＮＴＰ比を用いて、比に比例する各種の高さのピークをＨＰＣＥ／ＬＩＦについて使用した。テンプレートＭＰ　ｌ　３ｍｐ　１８の位置８−３２の配列決定を達成した：配列のこの部分は、次のようである・５’　−ＡＴＧ−ＣＣＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＧＡ−ＣＴＣ−ＴＡＧ−ＴＡＧ−Ａ−３゜よって、ｄｄＡＴＰによって終結されたフラグメントは、ｄｄＧＴＰにより終結されたフラグメントよりも電気泳動図で比例的に「より高いｊｏ２つの条件を調べた。第１の条件では、例１１Ａのカラムが、例ＩＩＤの変性組成物と関連して用いられ、第２の条件では、例ＩＩＢのカラムが、第１の条件と同じ変性組成物と関連して用いられた。これらの分析は、ダブルカラム分析フォーマットを用いて同時に行った。図６は、二官能性試薬−変性組成物（第１の条件）から得た指示された配列の電気泳動図結果を与えてあり、図７は、二官能性試薬−ゲル組成物−親水性ポリマー変性組成物（第２の条件）から得られるような指示された配列の電気泳動図結果を与えている。

図６および７は、開示された発明がポリヌクレオチドの配列のために用いられ得ることを特に証明している。

以上詳細に説明したが、詳細な説明および例に開示した具体例は、開示および次の請求の範囲を限定するものと解釈されるものでない。本発明は、自動化された計測器に限定されない；たとえば、動的架橋組成物および変性組成物は、いわゆる「スラブゲルｊ１１気泳動改造型に適用可能であり、当業者の認識範囲にある変更は、次の請求の範囲のうちに入るものである。

チャンネルＢ：吸光度チャンネルＢ：吸光度ＬＩＦ信号、　ｌ１ｌｓ　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１００６５０麺−一−−−−−岬ｅｊｋａＰ −−−−−−−一一−−−：＝＝；＝：：”＝二ｚ−工−−ｂｒｓｍ−ｄ−１２１０Ｓ／９３フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０８Ｌ　２９１０４　ＬＧＱ　９４５７−４Ｊ７１１０２　Ｌ　Ｑ　Ｅ　９１６７−４　ＪＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＪＰ（７２）発明者　カージャー、バリー　エルアメリカ合衆国　０２１１５　マサチューセッツ州　ニュートン　デポラ　ロード　６２（７２）発明者　ペントニー、ステイーブン　エル　ジュニアアメリカ合衆国　９２６８６　カリフォルニア州　ヨーバ　リンダ　レイクビュー　５１２６Ｉ２）発明者　コンラッド、ケニス　ディーアメリカ合衆国　９０８１４　カリフォルニア州　ロング　ビーチ　イー　フィフスストリート３７０６（７２）発明者　ランパル、サシュマアメリカ合衆国　９２６８７　カリフォルニア州　ヨーバ　リンダ　ヴイア　キャナリアズ２０４７０（７２）発明者　ガンズラー、カタリンアメリカ合衆国　０２１１５　マサチューセッツ州　メルローズ　レバノン　ストリート

Claims

【特許請求の範囲】１．毛管カラムであって、ａ）内部表面で壁によって規定された内部空洞を有する毛管カラム、ｂ）壁の内表面に吸収された少なくとも１つの二官能性試薬で、該試薬は少なくとも１つの正に荷電したアミンと少なくとも１つの活性官能基を含んでなり、ｃ）該試薬の活性官能基に結合した少なくとも１つのゲル組成物、ｄ）ゲル組成物と結合した少なくとも１つの親水性ポリマー、及びｅ）該内部空洞の残り中で内分散した少なくとも１つの分離組成物で、該分離組成物が該カラムから除去できるものを含んでなる毛管カラム。２．該試薬の活性官能基が二重結合によ，て第二の炭素原子に付着した少なくとも１つの炭素原子を含んでなる請求項１記載の毛管。３．該試薬の活性官能基が三重結合によって第二の炭素原子に付着した少なくとも１つの炭素原子を含んでなる請求項１記載の毛管。４．二官能試薬が下記の構造式によって表される請求項１記載の毛管： ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立に▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼ 及びＨからなる群から選ばれ、ここに、ｎは０と１０の間の整数であり、ｍは０と５の間の整数であり、Ｒは−（ＣＨ２）ｎ，−ＣＨ３及び▲数式、化学式、表等があります▼からなる群から選ばれ、及びＲ４は活性官能基であり、ｙは１と５０００の間の整数であり、そしてＸはフッ素、塩素、臭素、沃素及びアスタチンからなる群から選ばれる。５．該試薬のＲ１、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３である請求項４記載の毛管。６．ｎが０である請求項５記載の毛管。７．該試薬の活性官能基がからなる群から選ばれる部分を含んでなる請求項４記載の毛管。８．該試薬の活性官能基が−Ｃ＝Ｃ−部分を含んでなる請求項４記載の毛管。９．ｙが１と２０００の間の整数である請求項４記載の毛管。１０．ｙが１である請求項４記載の毛管。１１．Ｘが沃素である請求項４記載の毛管。１２．二官能試薬が下記の構造で表される請求項１記載の毛管。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １３．ゲル組成物がアクリルアミドと少なくとも１つの架橋剤との共重合体を含んでなる請求項１記載の毛管。１４．活性官能基がゲル組成物と共重合している請求項１記載の毛管カラム。１５．該親水性ポリマーがデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、セルロース誘導体、ポリビニールアルコール、アガロース、及びそれらの変形物または混合物からなる群から選ばれる請求項１記載の毛管カラム。１６．該親水性ポリマーの濃度が約０．１から約４０％である請求項１記載の毛管カラム。１７．該親水性ポリマーの濃度が約５％から約２０％である請求項１記載の毛管カラム。１８．該親水性ポリマーの濃度が約１０％である請求項９記載の毛管カラム。１９．該親水性ポリマーが約１０％の濃度で存在するデキストランである請求項１記載の毛管カラム。２０．該分離組成物が動的架橋組成物、変性組成物及び開管緩衝剤組成物からなる群から選ばれる請求項１記載の毛管カラム。２１．該分離組成物が、ｉ）約０．０１％と約１．５％の間のポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）、ｉｉ）約０．０％と約２．０％未満の間のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ｉｉｉ）約０．０％と約２．０％の間の界面活性剤、ｉｖ）約０．０％と約９９％の間のポリオール、及びｖ）約０．０Ｍと約１．０Ｍの間のｐＨ緩衝剤を含んでなる動的架橋組成物であり、その組成物が約２．０と約１０．０の間のｐＨを有し、その組成物の粘度が約４，０００センチポイズ未満である請求項２０記載の毛管カラム。２２．該組成物が約０．１％のポリエチレンオキシドを含んでなる請求項２１記載の毛管カラム。２３，該組成物が約１．０％のポリエチレングリコールを含んでなる請求項２１記載の毛管カラム。２４．ポロールが約１．０％のエチレングリコールである請求項２１記載の毛管カラム。２５．該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、デシル硫酸、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンンルビタン類、デオキシコラート、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及びセチルピリジニウムクロリドからなる群から選ばれる請求項２１記載の毛管カラム。２６．該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項２１記載の毛管カラム。２７．該組成物が約０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含んでなる請求項２６記載の毛管カラム。２８．該ｐＨ緩衝剤が紫外線透過性である請求項２１記載の毛管カラム。２９．該ｐＨ緩衝剤が双生イオン緩衝剤類を含んでなる請求項２８記載の毛管カラム。３０．該ｐＨ緩衝剤が２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、（２−アミノエチル）トリメチル−アンモニウムクロリド塩酸塩、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシ−メチル）メチルグリシン、Ｎ′Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸及び前記の混合物からなる群から選ばれる請求項２８記載の毛管カラム。３１．該ｐＨ緩衝剤がＴＲＩＳ−ＣＨＥＳ緩衝剤である請求項２８記載の毛管カラム。３２．該緩衝剤のモル濃度が１００ｍＭである請求項３１記載の毛管カラム。３３．該組成物のｐＨが約８．０と約９．０の間にある請求項２１記載の毛管カラム。３４．該分離組成物がａ）約１．０％のポリエチレンオキシド、ｂ）約１．０％のポリエチレングリコール、ｃ）約１．０％のドデシル硫酸ナトリウム、及びｄ）約１．０％のエチレングリコールを含んでなる動的架橋組成物であり、組成物のｐＨが約８．０と約９．０の間にあり、組成物の粘度が約５００センチポイズ未満である請求項２０記載の毛管カラム。３５．該組成物が変性組成物である請求項２０記載の毛管カラム。３６．該変性組成物が、ｉ）約７％からその溶解度限界までの少なくとも１つの親水性ポリマー、ｉｉ）少なくとも１つの変性剤、ｉｉｉ）少なくとも１つの緩衝剤、を含んでなる請求項３５記載の毛管カラム。３７．該親水性ポリマーがデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、セルロース誘導体、ポリビニルアルコールアガロース、前記の変性物及び前記の混合物からなる群から選ばれる請求項３６記載の毛管カラム。３８．該親水性ポリマーの濃度が約１５％から約５０％の間にある請求項３７記載の毛管カラム。３９．該親水性ポリマーの濃度が約２０％である請求項３７記載の毛管カラム。４０．該親水性ポリマーが少なくとも約７５０，０００の分子量を有するデキストランである請求項３９記載の毛管カラム。４１．該変性剤が、ｉ）６Ｍから約８Ｍの尿素、ｉｉ）約３Ｍと約８Ｍの間の尿素と約２０％と約４０％の間の非尿素変性剤との組合せ、及びｉｉｉ）約１％の間の非尿素変性剤からなる群から選ばれる請求項３６記載の毛管カラム。４２．該変性剤が７Ｍ尿素である請求項３６記載の毛管カラム。４３．カラム：非尿素変性剤が下記構造で表される請求項４１記載の毛管カラム： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは水素、炭素原子１から約６を有するアルキル鎖、ベンゼン環及び置換されたベンゼン環からなる群から選ばれる。４４．Ｒが水素である請求項４３記載の毛管カラム。４５．緩衝剤が約７．０と約９．０の間のｐＨを有する請求項３６記載の毛管カラム。４６．緩衝剤が約８．０と約８．５の間のｐＨを有する請求項３６記載の毛管カラム。４７．緩衝剤が約８．３のｐＨを有する請求項３６記載の毛管カラム。４８．緩衝剤がトリスーヒドロキシメチルアミノーメタンホウ酸塩である請求項４７記載の毛管カラム。４９．該変性組成物が約７Ｍ尿素、少なくとも約７５０，０００の分子量を有する約２０％のデキストラン、及び約８．０と約９．０の間のｐＨを有する緩衝剤を含んでなる請求項３５記載の毛管カラム。５０．該分離組成物が開管緩衝剤組成物である請求項２０記載の毛管カラム。５１．毛管電気泳動を行う方法であって、ａ）分離すべき成分を含有する試料のアリコートを１）内部表面で壁によって規定された内部空洞を有する毛管カラム、２）壁の内部表面に吸収された少なくとも１つの二官能性試薬、該試薬は少なくとも１つの正に荷電したアミン及び少なくとも１つの活性官能基を含んでなり、３）該試薬の活性官能基に結合した少なくとも１つのゲル組成物、４）ゲル組成物に結合した少なくとも１つの親水性ポリマー、及び５）該カラムから除去することができる少なくとも１つの分離組成物を含んでなる毛管カラムに導入し、ｂ）毛管カラムに１センチメートル当たり少なくとも約１０ボルトの電場をかけ、ｃ）試料をその成分部分に分離し、及びｄ）試料の成分を検出することを含んでなる方法。５２．試料が、ｉ）界面活性剤−蛋白質複合物；及びｉｉ）ポリヌクレオチド類からなる群から選ばれる請求項５１記載の方法。５３．該検出がＵＶ分光測光法、放射線検出、蛍光検出からなる群から選ばれる請求項５１記載の方法。５４．ミクロ毛管がガラス、アルミナ、ベリリア、溶融シリカ及びテフロン（ＴＥＦＬＯＮ）からなる群から選ばれる請求項５１記載の方法。５５．毛管が溶融シリカである請求項５１記載の方法。５６．該分離組成物が動的架橋組成物、変性組成物及び開管緩衝剤組成物からなる群から選ばれる請求項５１記載の方法。５７．該分離組成物が動的架橋組成物である請求項５１記載の方法。５８．該動的架橋組成物がａ）約１．０％のポリエチレンオキシド、ｂ）約１．０％のポリエチレングリコール、ｃ）約１．０％のドデシル硫酸ナトリウム、及びｄ）約１．０％のエチレングリコールを含んでなり、組成物のｐＨが約８．０と約９．０の間にあり、組成物の粘度が約５００センチポイズ未満である請求項５７記載の方法。５９．分離組成物が変性組成物である請求項５６記載の方法。６０．変性組成物が２０％デキストラン、７Ｍ尿素及び緩衝剤も含んでなり、該組成物のｐＨが約８．０から約９．０の間にある請求項５９記載の方法。６１．分離組成物が開管緩衝剤組成物である請求項５６記載の方法。６２．ポリヌクレオチド類の分析に有用で、ｉ）約７％からその溶解度限界までの少なくとも１つの親水性ポリマー、ｉｉ）少なくとも１つの変性剤、及びｉｉｉ）少なくとも１つの緩衝剤を含んでなる変性組成物。６３．該親水性ポリマーがデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、セルロース誘導体、ポリビニルアルコールアガロース、前記の変性物及び前記の混合物からなる群から選ばれる請求項３７記載の変性組成物。６４．該親水性ポリマーの濃度が約１５％から約５０％の間にある請求項３８記載の変性組成物。６５．該親水性ポリマーが少なくとも約７５０，０００の分子量を有するデキストランである請求項６４記載の変性組成物。６６．該変性剤がｉ）６Ｍから約８Ｍの尿素、ｉｉ）約３Ｍと約８Ｍの間の尿素と約２０％と約４０％の間の非尿素剤との組合せ、及びｉｉｉ）約１％の間の非尿素変性剤からなる群から選ばれる請求項６２記載の変性組成物。６７．該変性剤が７Ｍの尿素である請求項６２記載の変性組成物。６８．非尿素変性が下記載構造で表される請求項６６記載の変性組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは水素、炭素原子１から約６を有するアルキル鎖、ベンゼン環及び置換されたベンゼン環からなる群から選ばれる。６９．Ｒが水素である請求項６８記載の変性組成物。７０．緩衝剤が約７．０と約９．０の間のｐＨを有する請求項３７記載の変性組成物。７１．緩衝剤が約８．０と約８．５の間のｐＨを有する請求項３７記載の変性組成物。７２．緩衝剤が約８．３のｐＨを有する請求項３７記載の変性組成物。７３．緩衝剤がトリスーヒドロキシメチルアミノ−メタンホウ酸塩である請求項７２記載の変性組成物。７４．該変性組成物が約７Ｍ尿素、少なくとも約７５０，０００の分子量を有する約２０％のデキストラン及び約８．０と約９．０の間のｐＨを有する緩衝剤を含んでなる請求項６２記載変性組成物。７５．毛管カラムであって、ａ）内部表面で壁によって規定された内部空洞を有する毛管カラム、ｂ）壁の内部表面に吸収された少なくとも１つの二官能性試薬、該試薬は少なくとも１つの正に荷電したアミン及び少なくとも１つの活性官能基を含んでなり、及びｃ）空洞の残りの部分中を実質的に内分散した少なくとも１つの変性組成物、該変性組成物は約２０％デキストラン、約７Ｍの尿素及び緩衝剤を含んでなり、組成物のｐＨは約８．０と約９．０の間にあるを含んでなるカラム。