ES2258151T3 - Activadores para la sintesis de oligonucleotidos. - Google Patents

Activadores para la sintesis de oligonucleotidos.

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ES2258151T3 ES02748994T ES02748994T ES2258151T3 ES 2258151 T3 ES2258151 T3 ES 2258151T3 ES 02748994 T ES02748994 T ES 02748994T ES 02748994 T ES02748994 T ES 02748994T ES 2258151 T3 ES2258151 T3 ES 2258151T3
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Abstract

Un proceso para sintetizar un oligonucleótido utilizando química de fosforamidito que comprende acoplar un nucleósido o un oligonucleótido naciente que tiene un grupo hidroxi o tiol libre y un nucleósido-fosforamidito en presencia de un agente de acoplamiento, en el cual el agente de acoplamiento es una 1, 1-dioxo-1, 2-dihidro-1l6-benzo [d]isotiazol-3-ona representada por la fórmula estructural siguiente: (Ver fórmula) en la cual: p es 0 o un número entero de uno a cuatro; X7 es O o S; R para cada aparición es un sustituyente.

Description

Activadores para la síntesis de oligonucleótidos.
Antecedentes de la invención
Los oligonucleótidos sintéticos son herramientas de diagnóstico importantes para la detección de enfermedades genéticas y víricas. Adicionalmente, los oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados son interesantes como candidatos terapéuticos que inhiben la expresión de los genes o la función de las proteínas. La síntesis en gran escala de oligonucleótidos para uso como candidatos terapéuticos ha adquirido importancia creciente desde la aprobación por la FDA de un análogo de oligonucleótido para el tratamiento del citomegalovirus (CMV), y varios otros análogos de oligonucleótidos se encuentran actualmente en pruebas clínicas. Para cada prueba clínica son necesarias cantidades del orden de kilogramos de un análogo de oligonucleótido purificado.
La preparación de un oligonucleótido utilizando la metodología del fosforamidito implica la condensación de un nucleósido-fosforamidito y un nucleósido o un oligonucleótido naciente. La reacción de condensación (a la que se hace referencia también en esta memoria como la reacción de acoplamiento) requiere un activador (conocido alternativamente como agente de acoplamiento) que facilita la reacción. El activador utilizado más generalmente es el activador nucleófilo 1H-tetrazol. Sin embargo, el 1H-tetrazol es explosivo, y, por esta razón, su utilización en síntesis de gran escala puede ser peligrosa.
El 1H-tetrazol es un ácido débil que protoniza el fósforo trivalente del fosforamidito durante el primer paso de la activación. Un anión tetrazoluro desplaza luego el grupo dialquilamina (v.g., N,N-diisopropil-amina) del fosforamidito durante un segundo paso más lento para formar un compuesto intermedio de tetrazolilo que reacciona luego rápidamente con el grupo alcohol primario 5' de un nucleósido o un oligonucleótido naciente. Cuando se utilizan fosforamiditos estéricamente impedidos, tales como ribonucleósido-fosforamiditos o 2'-O-metil-nucleósido-fosforamiditos protegidos con t-butil-dimetilsililo para la síntesis de oligonucleótidos, a menudo son necesarios activadores alternativos para aumentar la velocidad de la reacción de acoplamiento. Los activadores alternativos, tales como 5-etiltio-1H-tetrazol, 5-(p-nitrofenil)-1H-tetrazol, y triflato de bencimidazolio, son a menudo más ácidos que el tetrazol y, por tanto, aceleran la velocidad de protonación del fósforo trivalente, aumentando con ello la velocidad de condensación.
Sin embargo, dado que tetrazol, 5-etiltio-1H-tetrazol, 5-(p-nitrofenil)-1H-tetrazol, y triflato de bencimidazolio tienen carácter ácido, pueden causar una desprotección prematura del grupo protector de 5'-hidroxi de un fosforamidito monómero que es típicamente un grupo lábil en medio ácido. La desprotección prematura puede producir impurezas de oligonucleótidos que son una base más largos que el producto deseado (a lo que se hace referencia en esta memoria como "impurezas N+1") y son difíciles de separar del producto deseado. Los tiempos de acoplamiento más largos necesarios generalmente para la síntesis de RNA y la síntesis en gran escala dan como resultado un aumento en la desprotección prematura de los fosforamiditos.
Por esta razón, se necesitan activadores no explosivos que promuevan la condensación de un nucleósido-fosforamidito con un nucleósido o un oligonucleótido naciente y que puedan emplearse sin aumento de productos secundarios a fin de producir oligonucleótidos disponibles más fácilmente para uso diagnóstico y terapéutico.
El documento WO99/62922 describe activadores para la síntesis de oligonucleótidos.
Sumario de la invención
Se ha descubierto que una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona promoverá la condensación de un nucleósido-fosforamidito y un monómero de nucleósido o un oligonucleótido naciente. La 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona puede representarse por la Fórmula Estructural I:
1
En la Fórmula Estructural I, p es 0 o un número entero de uno a cuatro. R es para cada aparición, un sustituyente, de modo preferible independientemente en cada caso, un grupo halo, un grupo alifático sustituido o insustituido, -NR^{11}R^{12}, -OR^{13}, -OC(O)R^{13}, -C(O)OR^{13}, ciano, un arilo sustituido o insustituido, un heterociclilo sustituido o insustituido, -CHO, -COR^{13}, -NHCOR^{13}, un aralquilo sustituido o insustituido, alquilo halogenado (v.g., trifluorometilo y triclorometilo), o -SR^{13}. Preferiblemente, R es halo, un grupo alifático sustituido o insustituido, -NR^{11}R^{12}, -OR^{13}, -OC(O)R^{13}, -C(O)OR^{13}, o ciano. Alternativamente, dos grupos R adyacentes considerados junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, forman un anillo de seis miembros saturado o insaturado. Preferiblemente, el anillo de seis miembros formado es un anillo aromático. R^{11} y R^{12} son cada uno, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo o insustituido; o junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo. R^{13} es un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, o un grupo aralquilo sustituido o insustituido. X^{7} es O o S. Preferiblemente, X^{7} es O. Se prefiere particularmente el caso en que X^{7} es O y p es 0.
En una realización preferida, un complejo salino de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y una base orgánica puede utilizarse para promover eficazmente la condensación de un nucleósido-fosforamidito y un monómero de nucleósido o un oligonucleótido naciente.
En presencia de una base orgánica, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona tiene una solubilidad satisfactoria particularmente en los disolventes orgánicos que se utilizan típicamente para síntesis de oligonucleótidos. Por esta razón, otra realización de la invención emplea una solución activadora que incluye un disolvente orgánico, una base orgánica y una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona representada por la Fórmula Estructural I. La concentración de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y la base orgánica en la solución activadora puede llegar hasta la solubilidad de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona en el disolvente de que se trate. En una realización preferida, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y la base orgánica están presenten en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 2 M, por ejemplo desde aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 0,5 M. Generalmente, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y la base orgánica están presentes en una concentración de hasta 0,25 M, por ejemplo desde aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,25 M. En una realización más preferida, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y la base orgánica están presentes en la misma concentración molar. En una realización preferida, el disolvente orgánico comprende acetonitrilo. En otra realización preferida, el disolvente orgánico comprende una amida orgánica, tal como dimetilformamida, 1-metil-2-pirrolidinona o 1,3-dimetil-2-imidazolidinona.
En otra realización, puede sintetizarse un oligonucleótido utilizando química de fosforamidito en la cual el agente de acoplamiento es una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona representada por la Fórmula Estructural I. El agente de acoplamiento promueve la condensación entre un nucleósido o un oligonucleótido naciente que tiene un grupo hidroxi o tiol libre y un fosforamidito. En una realización preferida, está presente una base orgánica con la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona durante la reacción de acoplamiento. En una realización más preferida, la base orgánica está presente en la misma concentración molar que la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona.
El nucleósido-fosforamidito puede ser un monómero o un oligómero, tal como un dímero o un trímero. Cuando el nucleósido-fosforamidito es un monómero, el mismo puede representarse por la Fórmula Estructural IIa:
2
En la Fórmula Estructural IIa, X^{1} es para cada aparición, independientemente, -O- o -S-. Preferiblemente, X^{1} es -O- en cada aparición. X^{2} es para cada aparición, independientemente, -O-, -S-, o -NR-. Preferiblemente, X^{2} es -O- en cada aparición. X^{3} es para cada aparición, independientemente, -O-, -S-, -CH_{2}, o -(CH_{2})_{2}-. Preferible-mente, X^{3} es -O- en cada aparición. En una realización más preferida, X^{1}, X^{2}, y X^{3} son todos ellos -O- en cada aparición. R^{1} es un grupo protector de alcohol o un grupo protector de tio. Preferiblemente, R^{1} es un grupo protector lábil en medio ácido. R^{2} es para cada aparición, independientemente, -H, -F, -OR^{8}, -NR^{7}R^{8}, -SR^{9}, o un grupo alifático sustituido o insustituido, tal como metilo o alilo. R^{3} es para cada aparición, independientemente, -OCH_{2}CH_{2}CN, -SCH_{2}CH_{2}CN, un grupo alifático sustituido o insustituido, -OR^{10}, -SR^{10}, -O-CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -O-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, -O-CH_{2}CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2}, -S-CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -S-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, o -S-CH_{2}-CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2}. R^{4} y R^{5} son cada uno, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, o un grupo aralquilo sustituido o insustituido. Alternativamente, R^{4} y R^{5}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo. R^{6} es para cada aparición, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido (v.g., metilo, etilo, metoxietilo o alilo), un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido, un grupo protector de alcohol, o -(CH_{2})_{q}-NR^{18}R^{19}. R^{7} y R^{8} son cada uno, en cada aparición, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o un grupo protector de amino. Alternativamente, R^{7} y R^{8}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, son un grupo heterociclilo. R^{9} es para cada aparición, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o un grupo protector de tio. R^{10} es, para cada aparición, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido o un grupo aralquilo sustituido o insustituido. R^{18} y R^{19} son cada uno, independientemente, -H, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo heteroarilo sustituido o insustituido, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido, un grupo heteroaralquilo sustituido o insustituido o un grupo protector de amino. Alternativamente, R^{18} y R^{19}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un grupo heterociclilo. q es un número entero de 1 a aproximadamente 6. B es -H, una nucleobase natural o no natural, nucleobase protegida, nucleobase protegida natural o no natural, heterociclo o un heterociclo protegido.
En otra realización, el fosforamidito puede ser un oligómero, tal como un dímero o trímero. Métodos de preparación y utilización de dímeros y trímeros de nucleósido-fosforamiditos en la síntesis de oligonucleótidos con fosforamidito se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO02/20543 (Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB01/0397).
El resto azúcar del nucleósido-fosforamidito puede tener una configuración D, como en el DNA y el RNA existentes naturalmente y como en la Formula Estructural IIa, o puede tener una configuración L. La Fórmula Estructural IIb representa un L-nucleósido-fosforamidito:
3
En la Fórmula Estructural IIb, X^{1}, X^{2}, X^{3}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y B son como se define arriba.
En otra realización, el grupo fosforamidito del nucleósido-fosforamidito puede estar unido a la posición 5' del anillo de azúcar. En esta realización, el nucleósido-fosforamidito puede representarse por las Fórmulas Estructurales IIIa y IIIb:
4
En las Fórmulas Estructurales IIIa y IIIb, X^{1}, X^{2}, X^{3}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, y B son como se define arriba.
En otra realización, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona puede utilizarse para promover la condensación de un oligonucleótido n-mero naciente (es decir, un oligonucleótido que tiene n nucleobases) y un nucleósido-fosforamidito para formar un (n+1)oligonucleótido-mero. Preferiblemente, el nucleósido-fosforamidito se puede representar por la Fórmula Estructural IIa. El oligonucleótido naciente se puede representar por la Fórmula Estructural IV:
5
En la Fórmula Estructural IV, X^{1}, X^{2}, X^{3}, R^{2}, R^{3}, y B son como se define arriba. Cada X^{4} es, para cada aparición, independientemente, O o S. X^{5} es para cada aparición, independientemente, -OH o -SH. Preferiblemente, X^{5} es -OH. R^{16} es un grupo protector de hidroxi, un grupo protector de tio, un grupo protector de amino, -(CH_{2})_{q}-NR^{18}R^{19}, un soporte sólido, o un enlazador escindible unido a un soporte sólido, tal como un grupo de la Fórmula -Y^{2}-L-Y^{2}-R^{15}. Y^{2} es, para cada aparición, independientemente, un enlace simple, -C(O)-, -C(O)NR^{17}-, -C(O)O-, -NR^{17}- o -O-. L es un enlazador que es preferiblemente un grupo alifático sustituido o insustituido o un grupo aromático sustituido o insustituido. De modo más preferible, L es un grupo etileno. R^{17} es -H, un grupo alifático sustituido o insustituido o un grupo aromático sustituido o insustituido. R^{15} es cualquier soporte sólido adecuado para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen vidrio de poros controlados, poliestireno, poliamida microporosa, tal como poli(dimetilacrilamida), y poliestireno recubierto con polietileno. En muchas realizaciones, R^{16} representa un enlazador escindible, tal como un enlazador succinilo u oxaloílo, unido a un soporte sólido. n es cero o un número entero positivo.
El oligonucleótido naciente se pone en contacto con el fosforamidito y una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]-isotiazol-3-ona representada por la Fórmula Estructural I. En una realización preferida, está presente también una base orgánica cuando el oligonucleótido naciente se pone en contacto con la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona. Más preferiblemente, la base orgánica está presente en la misma concentración molar que la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona. El oligonucleótido naciente reacciona con el fosforamidito para formar un (n+1)oligonucleótido que tiene un enlace de fósforo trivalente 5'-terminal representado por la Fórmula Estructural V:
6
En la Fórmula Estructural V, X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{16}, B y n son como se define arriba.
El oligonucleótido representado por la Fórmula Estructural V puede ponerse en contacto luego con un agente oxidante o un agente sulfurante para formar un oligonucleótido que tiene una cadena principal de fósforo pentavalente representada por la Fórmula Estructural VI:
7
En la Fórmula Estructural VI, X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{16}, B y n son como se define arriba.
Después de oxidar o sulfurar el (n+1)oligo-nucleótido, los grupos X^{5} que no han reaccionado con el fosforamidito pueden protegerse terminalmente por métodos convencionales de protección terminal conocidos en la técnica. Por ejemplo, los grupos X^{5} que no han reaccionado pueden hacerse reaccionar con un cloruro de ácido o un anhídrido en presencia de una base. Típicamente, los grupos X^{5} se protegen terminalmente con cloruro de acetilo o anhídrido acético en piridina.
Después del paso de oxidación o sulfuración o después del paso de protección terminal, el (n+1)oligonucleótido puede desprotegerse por reacción del mismo con un reactivo para eliminar R^{1}. Si R^{1} es un grupo protector lábil en medio ácido, el (n+1)oligonucleótido se trata con un ácido para eliminar R^{1}. Si R^{1} es un grupo trialquilsililo, tal como un grupo t-butildimetilsililo o un grupo triisopropilsililo, el (n+1)oligonucleótido puede tratarse con iones fluoruro para eliminar R^{1}. Típicamente, t-butildimetilsililo y triisopropilsililo se eliminan por tratamiento con una solución de fluoruro de tetrabutilamonio en THF o con fluoruro de hidrógeno y una base conjugada, tal como (C_{2}H_{5})_{3}N.3HF. Métodos para la eliminación de t-butildimetilsililo pueden encontrarse en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., páginas 77-83. Los pasos de reacción anteriores, o ciclo de reacción, pueden repetirse una o más veces para formar un oligonucleótido de la longitud deseada. Cuando se desea obtener un producto oligonucleotídico en el cual el grupo terminal 5' está protegido, el paso final del ciclo de reacción puede ser el paso de protección terminal, si se realiza un paso de protección terminal, o el paso final de la reacción puede ser un paso de oxidación o sulfuración si no se realiza un paso de protección terminal. Cuando el paso de oxidación o sulfuración o
el paso de protección terminal es el paso final, el oligonucleótido puede representarse por la Fórmula Estructural VII:
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En la Fórmula Estructural VII, X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{16}, y B son como se define anteriormente. m es un número entero positivo.
Alternativamente, el paso final del ciclo de reacción puede ser la eliminación de R^{1} si se desea obtener un oligonucleótido que no tenga un grupo protector 5'. Cuando la eliminación de R^{1} es el paso final de la reacción, el oligonucleótido puede representarse por la Fórmula Estructural VIII:
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En la Fórmula Estructural VIII, X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, X^{5}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{16}, B y m son como se define anteriormente.
Los oligonucleótidos producidos por el método de la presente invención pueden desprotegerse, y en caso apropiado escindirse de un soporte sólido, utilizando métodos conocidos en la técnica para los grupos protectores y/o el soporte sólido dados.
Las 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-onas en presencia de una base orgánica promueven reacciones de condensación de fosforamidito con una eficiencia al menos igual al tetrazol. Sin embargo, se forman menos productos indeseables cuando se utiliza una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona en lugar de tetrazol. Adicionalmente, los complejos de la invención no son explosivos y por consiguiente su utilización es más segura que la del tetrazol, particularmente en la síntesis de oligonucleótidos en gran escala.
Descripción detallada de la invención
Los grupos alifáticos, tal como se utilizan en esta memoria, incluyen hidrocarburos C_{1}-C_{18} de cadena lineal o ramificados que son totalmente saturados o que contienen uno o más enlaces dobles no conjugados, o hidrocarburos C_{3}-C_{18} cíclicos que son totalmente saturados o que contienen uno o más enlaces dobles no conjugados. Los grupos alquilo son hidrocarburos C_{1}-C_{8} de cadena lineal o ramificados o hidrocarburos cíclicos C_{3}-C_{8} que son totalmente saturados. Los grupos alifáticos son preferiblemente grupos alquilo.
Los grupos arilo incluyen sistemas de anillos aromáticos carbocíclicos (v.g., fenilo) y sistemas de anillos aromáticos carbocíclicos condensados con uno o más aromáticos carbocíclicos (v.g., naftilo y antracenilo) o un sistema de anillos aromáticos condensado con uno o más anillos no aromáticos (v.g., 1,2,3,4-tetrahidronaftilo).
Los grupos heterocíclicos, tal como se utilizan en esta memoria, incluyen grupos heteroarilo y grupos heteroaliciclilo. Los grupos heteroarilo, tal como se utilizan en esta memoria, incluyen sistemas de anillos aromáticos que tienen uno o más heteroátomos seleccionados de azufre, nitrógeno u oxígeno en el anillo aromático. Preferiblemente, los grupos heteroarilo son sistemas de anillos de cinco o seis miembros que tienen de uno a cuatro heteroátomos. Un grupo heteroalicíclico, tal como se utiliza en esta memoria, es un sistema de anillos no aromático que tiene preferiblemente cinco a seis átomos e incluye al menos un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, y azufre. Ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, pirrolidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrotienilo, azetidinilo, tetrahidrofurilo, dioxanilo y dioxepanilo, tienilo, piridilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, indazolilo, furanos, pirroles, imidazoles, pirazoles, triazoles, pirimidinas, pirazinas, tiazoles, isoxazoles, isotiazoles, tetrazoles, oxadiazoles, benzo(b)tienilo, bencimidazol, indol, tetrahidroindol, azaindol, indazol, quinolina, imidazopiridina, purina, pirrolo[2,3-d]pirimidina, y pirazolo[3,4-d]pirimidina.
Los compuestos de azaheterociclilo, tal como se utilizan en esta memoria, incluyen grupos heteroarilo que tienen uno o más átomos de nitrógeno en el anillo aromático y grupos heteroaliciclilo que tienen al menos un átomo de nitrógeno en el sistema de anillos no aromático. Preferiblemente, los compuestos de azaheteroarilo tienen anillos aromáticos de cinco o seis miembros con uno a tres nitrógenos en el anillo aromático. Preferiblemente, los compuestos de azaheteroaliciclilo son anillos de cinco o seis miembros que comprenden generalmente uno o dos nitrógenos en el anillo. Los compuestos de azaheterociclilo preferidos son bases orgánicas. Ejemplos de compuestos de azaheterociclilo que son bases orgánicas incluyen pirimidinas, 1-alquilpirazoles, especialmente 1-(alquil C_{1-4})pirazoles, 1-arilpirazoles, 1-bencilpira-zoles, pirazinas, N-alquilpurinas, especialmente N-(alquil C_{1-4})purinas, N-arilpurinas, N-bencilpurinas, N-alquilpirroles, especialmente N-(alquil C_{1-4})pirroles, N-arilpirroles, N-bencilpirroles, piridinas, N-alquil-imidazoles, especialmente N-(alquil C_{1-4})imidazoles, N-arilimidazoles, especialmente N-fenilimidazol, N-bencilimidazoles, quinolinas, isoquinolinas, quinoxalinas, quinazolinas, N-alquilindoles, especialmente N-(alquil C_{1-4})indoles, N-arilindoles, N-bencilindoles, N-alquilbencimidazoles, especialmente N-(alquil C_{1-4})-bencimidazoles, N-arilbencimidazoles, N-bencilbenci-midazoles, triazina, tiazol, 1-alquil-7-azaindoles, especialmente 1-(alquil C_{1-4})-7-azaindoles, 1-aril-7-azaindoles, 1-bencil-7-azaindoles, pirrolidinas, morfolinas, piperidinas, y piperazinas. Compuestos de azaheterociclilo especialmente preferidos son piridinas, tales como piridina y 3-metilpiridina, y N-(alquil C_{1-4}) imidazoles, tales como N-metilimidazol.
Un grupo aralquilo, tal como se utiliza en esta memoria, es un sustituyente aromático que está enlazado a un resto por un grupo alquilo. Grupos aralquilo preferidos incluyen grupos bencilo.
Un grupo heteroaralquilo, tal como se utiliza en esta memoria, es un sustituyente heteroarilo que está enlazado a un resto por un grupo alquilo.
Una base orgánica es un compuesto orgánico que tiene tendencia a aceptar protones a pH 7. Bases orgánicas preferidas son aminas secundarias, aminas terciarias o compuestos de azaheterociclilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido o insustituido con uno o más sustituyentes. Una base orgánica aprótica es una base orgánica que no tiene ningún protón formador de enlaces hidrógeno en su estructura química antes de aceptar un protón. Bases orgánicas apróticas tales como aminas terciarias y compuestos de azaheterociclilo apróticos se utilizan preferiblemente en asociación con 1,1-dioxo-1,2-dihidro-\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-onas, como se describen en esta memoria, para promover reacciones de condensación.
Las aminas terciarias son bases orgánicas que tienen un átomo de nitrógeno que está unido a tres átomos de carbono, a menudo a tres grupos arilo, generalmente fenilo, y/o alquilo, generalmente a tres grupos alquilo, que incluyen por ejemplo trialquilaminas tales como trimetil-amina, trietilamina, y diisopropiletilamina. Adicionalmente, las aminas terciarias pueden ser grupos azaheterociclilo en los cuales el átomo de nitrógeno es aprótico. Se prefieren aminas terciarias que son grupos azaheterociclilo. Ejemplos de aminas terciarias de azaheterociclilo son N-alquilpirrolidinas, N-arilpirrolidinas, N-alquilpirroles, N-arilpirroles, N-alquilmorfolinas, N-arilmorfolinas, N-alquilpiperidinas, N-arilpiperidinas, N,N-dialquilpiperazinas, N,N-diarilpiperazinas, N-alquil-N-aril-piperazinas, quinuclidinas, y 1,8-diazabiciclo-[5.4.0]undec-7-enos. Las aminas terciarias pueden ser también compuestos de azaheteroarilo o de azaheteroaliciclilo.
Las aminas secundarias son bases orgánicas que comprenden un nitrógeno unido a un solo átomo de hidrógeno y a dos átomos de carbono. Generalmente, el átomo de nitrógeno está unido a dos grupos alquilo o arilo o forma parte de un grupo azaheterocíclico. Ejemplos de compuestos amínicos secundarios incluyen dietilamina y diisopropilamina.
Sustituyentes adecuados para grupos alifáticos, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos heteroarilo, grupos azaheteroarilo y grupos heteroaliciclilo incluyen grupos arilo, grupos arilo halogenados, grupos alquilo, alquilo halogenado (v.g. trifluorometilo y triclorometilo), éteres alifáticos, éteres aromáticos, bencilo, bencilo sustituido, halógenos, particularmente grupos cloro y fluoro, ciano, nitro, -S-(grupo alifático o alifático sustituido), y -S-(aromático o aromático sustituido).
Los grupos protectores de amina, hidroxi y tiol son conocidos por los expertos en la técnica. Para ejemplos de grupos protectores de amino véase Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., páginas 309-405. Preferiblemente, las aminas se protegen como amidas o carbamatos. Para ejemplos de grupos protectores de hidroxi véase id., páginas 10-142. Un grupo protector de hidroxi preferido es el grupo t-butildimetilsililo. Para ejemplos de grupos protectores de tiol véase id., páginas 277-308.
Un grupo protector lábil en medio ácido es un grupo protector que puede eliminarse por puesta en contacto del grupo con un ácido de Bronsted o de Lewis. Grupos protectores lábiles en medio ácido son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de grupos protectores comunes lábiles en medio ácido incluyen grupos tritilo sustituidos o insustituidos (id., páginas 60-62), grupos tetrahidropiranilo sustituidos o insustituidos (id., páginas 31-34), grupos tetrahidrofuranilo sustituidos o insustituidos (id., páginas 36-37) o grupos pixilo (id., página 65). Los grupos tritilo están sustituidos generalmente con sustituyentes donantes de electrones tales como grupos alcoxi. Un grupo protector lábil en medio ácido preferido es un tritilo sustituido o insustituido, por ejemplo 4,4'-dimetoxitritilo (en lo sucesivo "DMT").
Las bases nucleosídicas incluyen bases existentes naturalmente, tales como adenina, guanina, citosina, timina, y uracilo, y bases modificadas tales como 7-desazaguanina, 7-desaza-8-azaguanina, 5-propinilcitosina, 5-propiniluracilo, 7-desazaadenina, 7-desaza-8-azaadeni-na, 7-desaza-6-oxopurina, 6-oxopurina, 3-desazaadenosina, 2-oxo-5-metilpirimidina, 2-oxo-4-metiltio-5-metilpirimi-dina, 2-tiocarbonil-4-oxo-5-metilpirimidina, 4-oxo-5-metilpirimidina, 2-aminopurina, 5-fluorouracilo, 2,6-diaminopurina, 8-aminopurina, 4-triazolo-5-metiltimina, y 4-triazolo-5-
\hbox{metiluracilo.}
Una base nucleosídica protegida es una base nucleosídica en la cual los grupos funcionales reactivos de la base están protegidos. Análogamente, un heterociclo protegido es un heterociclo en el cual los sustituyentes reactivos del heterociclo están protegidos. Típicamente, las bases nucleosídicas o heterociclos tienen grupos amino que pueden estar protegidos con un grupo protector de amino, tal como una amida o un carbamato. Por ejemplo, los grupos amina de la adenina y la citosina están protegidos típicamente con grupos protectores benzoílo, y los grupos amina de la guanina se protegen típicamente con un grupo isobutirilo, un grupo acetilo o grupo t-butilfenoxiacetilo. Sin embargo, pueden utilizarse otros esquemas de protección. Por ejemplo, para desprotección rápida, los grupos amino de la adenina y la guanina se protegen con grupos fenoxiacetilo y el grupo amino de la citosina se protege con un grupo isobutirilo o un grupo acetilo. Las condiciones para la eliminación del grupo protector de la nucleobase o el heterociclo dependerán del grupo protector utilizado. Cuando se utiliza un grupo protector amida, el mismo puede eliminarse por tratamiento del oligonucleótido con una solución básica, tal como una solución concentrada de hidróxido de amonio, solución de n-metilamina o una solución de t-butilamina en hidróxido de amonio.
El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en esta memoria, incluye oligonucleótidos existentes naturalmente, por ejemplo ácidos 2'-desoxirribonucleicos (en lo sucesivo "DNA") y ácidos ribonucleicos (en lo sucesivo "RNA") y ácidos nucleicos que contienen restos azúcar modificados, restos fosfato modificados, o nucleobases modificadas. La modificación en el resto azúcar incluye reemplazamiento del anillo de ribosa con un anillo de hexosa, ciclopentilo o ciclohexilo. Alternativamente, el anillo de D-ribosa de un ácido nucleico existente naturalmente puede reemplazarse con un anillo de L-ribosa o el b-anómero de un ácido nucleico existente naturalmente puede reemplazarse con el a-anómero. El oligonucleótido puede comprender también uno o más restos no básicos. Restos fosfato modificados incluyen fosforotioatos, fosforoditioatos, metil-fosfonatos, metil-fosfatos, y fosforamidatos. Tales análogos de ácido nucleico son conocidos por los expertos en la técnica. Pueden prepararse oligonucleótidos que comprenden mezclas de dos o más de los anteriores, por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden mezclas de desoxirribo- y ribonucleósidos, particularmente mezclas de desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos sustituidos en 2'-O-, tales como 2'-O-metil- o 2'-O-metoxietil-ribonucleósidos. Ejemplos de oligonucleótidos que comprenden mezclas de nucleósidos incluyen ribozimas.
Un oligonucleótido quimérico es un oligonucleótido que tiene a la vez eslabones fosfodiéster y fosforotioato.
Un oligonucleótido sintético tiene preferiblemente dos a aproximadamente 100 nucleobases. Más preferiblemente, un oligonucleótido sintético tiene 2 a aproximadamente 75 nucleobases. Muchos oligonucleótidos sintéticos de interés terapéutico actual comprenden de 8 a 40 nucleobases.
La síntesis del oligonucleótido puede realizarse en solución o sobre un soporte sólido. Cuando la síntesis se realiza en solución, R^{16} es un grupo protector de alcohol, amina o tiol. Después de la síntesis del oligonucleótido, el grupo protector de alcohol, amina o tiol puede eliminarse. Cuando el oligonucleótido se sintetiza sobre un soporte sólido, R^{16} representa un soporte sólido o preferiblemente un enlazador escindible unido a un soporte sólido, tal como un grupo de fórmula -Y_{2}-L-Y_{2}-R^{15}. En general, la síntesis en fase de solución o la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos utilizando un compuesto de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona en lugar de tetrazol para promover la condensación de un oligonucleótido naciente y un fosforamidito monómero se lleva a cabo de modo análogo a métodos que se han desarrollado para la síntesis de oligonucleótidos utilizando tetrazol como activador. Ejemplos de condiciones típicas para la síntesis en fase de solución y la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos utilizando un compuesto de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona para promover la reacción de condensación se exponen más adelante.
El primer paso de la preparación del oligonucleótido implica el acoplamiento de un nucleósido-fosforamidito, tal como el fosforamidito representado por la Fórmula Estructural IIa, con un nucleósido u oligonucleótido naciente que tiene un grupo hidroxi o tiol libre, tal como un nucleósido desprotegido en 5' u oligonucleótido naciente representado por la Fórmula Estructural IV. Durante la reacción de acoplamiento, el grupo hidroxi o tiol del nucleósido u oligonucleótido naciente reacciona con el nucleósido-fosforamidito por desplazamiento del grupo -NR^{4}R^{5}. Cuando la síntesis se realiza en solución, el nucleósido u oligonucleótido naciente está presente a menudo en una concentración de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 1,0 M, y preferiblemente el nucleósido u oligonucleótido naciente está presente en una concentración de aproximadamente 0,025 M a aproximadamente 0,5 M. El nucleósido-fosforamidito está presente preferiblemente en un concentración de aproximadamente 1,1 equivalentes a aproximadamente 2 equivalentes con respecto al nucleósido u oligonucleótido naciente. Se añaden desde aproximadamente 0,5 equivalentes, a menudo desde aproximadamente 2,5 equivalentes, a aproximadamente 5,0 equivalentes, con respecto al nucleósido u oligonucleótido naciente, de una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona para promover la reacción de condensación. Preferiblemente, la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona se añade como un complejo salino con una base orgánica, tal como una sal de piridinio, una sal de 3-picolinio o una sal de N-metilimidazolio. El tiempo de reacción es por lo general aproximadamente 20 min a aproximadamente 60 min, y se forma un (n+1)oligonucleótido naciente con un eslabón de fósforo trivalente terminal, tal como el oligonucleótido naciente representado por la Fórmula Estructural V.
Un segundo paso de preparación de un oligonucleótido implica la oxidación o sulfuración del grupo fosforoso trivalente terminal del oligonucleótido naciente. En una síntesis en fase de solución, la reacción de oxidación se lleva a cabo a menudo por tratamiento del oligonucleótido con un agente oxidante tal como I_{2} en presencia de agua o un peróxido tal como hidroperóxido de t-butilo en un disolvente orgánico. Cuando se utilizan I_{2} y agua, la solución oxidante contiene por lo general aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,8 equivalentes de I_{2} en presencia de una base y una cantidad traza de agua. La reacción se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico, tal como THF, combinado con una base, tal como una alquilamina terciaria y aproximadamente 1% de agua. La relación de disolvente aprótico a base es aproximadamente 4:1 (vol/vol) a aproximadamente 1:4 (vol/vol). Después de aproximadamente 5 min a aproximadamente 20 min, la mezcla de reacción se vierte en una solución acuosa de bisulfito de sodio para extinguir el exceso de yodo, y se extrae luego en un disolvente orgánico.
Alternativamente, el grupo fosforoso trivalente terminal puede sulfurarse utilizando cualquier reactivo de transferencia de azufre conocido por los expertos en la técnica de la síntesis de oligonucleótidos. Ejemplos de reactivos de transferencia de azufre incluyen 3H-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido (denominado también "reactivo de Beaucage"), tetrasulfuro de dibenzoílo, disulfuro de fenilacetilo, disulfuro de N,N,N',N'-tetraetiltiuram, azufre elemental, y 3-amino-[1,2,4]ditiazol-5-tiona (véase la patente U.S. No. 6.096.881). Las condiciones de reacción para la sulfuración de un oligonucleótido utilizando los reactivos anteriores pueden encontrarse en Beaucage, et al., Tetrahedron (1993), 49: 6123. Un reactivo de transferencia de azufre preferido es 3-amino-[1,2,4]ditiazol-5-tiona. Generalmente, se pone en contacto un oligonucleótido con una solución de 3-amino-[1,2,4]ditiazol-5-tiona en un disolvente orgánico, tal como una mezcla piridina/acetonitrilo (1:9) o piridina, que tiene una concentración de aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 0,2 M. La reacción de sulfuración se completa por lo general en aproximadamente 30 s a aproximadamente 2 min.
Después de la oxidación o sulfuración del oligonucleótido, cualesquiera grupos hidroxi o tiol libres que no han reaccionado pueden protegerse terminalmente a fin de que no puedan reaccionar en reacciones de acoplamiento subsiguientes. El fallo en la protección de las secuencias permiten que las mismas se separen más fácilmente del producto oligonucleotídico de longitud total. Cualquier reactivo que reaccione con un grupo hidroxi o tiol e impida que el mismo reaccione con un fosforamidito puede utilizarse como reactivo de protección terminal. Típicamente, se utiliza como reactivo de protección terminal un anhídrido, tal como anhídrido acético o anhídrido isobutírico, o un cloruro de ácido, tal como cloruro de acetilo o cloruro de isobutirilo, en presencia de una base.
Una vez que se ha completado la reacción de protección terminal, se elimina el grupo protector R^{1}. Cuando R^{1} es un grupo protector lábil en medio ácido, R^{1} se elimina por tratamiento del oligonucleótido con un ácido. Preferiblemente, R^{1} es un grupo tritilo, tal como 4,4'-dimetoxitritilo. Cuando R^{1} es un grupo tritilo, el mismo puede eliminarse por tratamiento del oligonucleótido con una solución de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un disolvente orgánico, tal como diclorometano o tolueno.
Una vez que se ha eliminado el grupo protector R^{1}, el ciclo de reacción (es decir, paso de acoplamiento, paso de oxidación o sulfuración, paso de protección terminal (opcional) y paso de desprotección) puede repetirse opcionalmente una o más veces para obtener un oligonucleótido de la longitud deseada.
Puede prepararse un oligonucleótido quimérico por oxidación del grupo fosforoso trivalente terminal en uno o más ciclos de reacción y sulfuración del grupo fosforoso trivalente terminal en uno o más ciclos de reacción diferentes. Alternativamente, se puede preparar un oligonucleótido quimérico por selección de monómeros de fosforamidito en los cuales algunos de los grupos R^{3} son grupos hidroxilo protegidos, tales como -OCH_{2}CH_{2}CN, y algunos de los grupos R^{3} son grupos tiol protegidos, tales como -SCH_{2}CH_{2}CN. En este método, el oligonucleótido se oxida después del paso de acoplamiento en cada ciclo de reacción.
Cuando se desea obtener un producto oligonucleotídico en el cual permanece el grupo R^{1}, el paso final del ciclo de reacción puede ser el paso de protección terminal, si se realiza un paso de protección terminal, o el paso final de la reacción puede ser un paso de oxidación o sulfuración si no se realiza un paso de protección terminal. Si se desea un oligonucleótido desprotegido en R^{1}, el ciclo de reacción puede terminar con el paso de desprotección. Usualmente, el producto deseado es un oligonucleótido protegido en R^{1} si el oligonucleótido debe purificarse por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC). Si el oligonucleótido debe purificarse por cromatografía de intercambio iónico o electroforesis, el producto deseado es usualmente un oligonucleótido desprotegido en R^{1}.
La síntesis en fase sólida de un oligonucleótido utilizando una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona y, preferiblemente, una base orgánica para promover la condensación de un nucleósido-fosforamidito con un nucleósido u oligonucleótido naciente unido a un soporte que tiene un grupo hidroxi o grupo tiol libre utiliza generalmente el mismo ciclo de reacción y los mismos reactivos que la síntesis en fase de solución. Generalmente, el nucleósido se carga en primer lugar sobre el soporte sólido hasta el máximo adecuado para la resina particular utilizada. Por ejemplo, la carga puede ser aproximadamente 50 \mumol a aproximadamente 700 \mumol por gramo de soporte. En el paso de condensación, una solución de nucleósido-fosforamidito, que tiene por lo general una concentración de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 1 M, con preferencia aproximadamente 0,1 M, en un disolvente orgánico, tal como acetonitrilo, se hace reaccionar con el nucleósido unido al soporte para formar un oligonucleótido naciente que tiene un eslabón fosforoso trivalente terminal. Sí se utiliza un nucleósido-fosforamidito representado por la Fórmula Estructural IIa o IIb, el oligonucleótido naciente tendrá un eslabón fosforoso trivalente terminal 5' después de la finalización de la reacción de acoplamiento. Si se utiliza un nucleósido-fosforamidito representado por la Fórmula Estructural IIIa o IIIb, el oligonucleótido naciente tendrá un eslabón fosforoso trivalente terminal 3' después de la finalización de la reacción de acoplamiento. Preferiblemente, los nucleósido-fosforamiditos utilizados pueden representarse por la Fórmula Estructural IIa. Una solución de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona que tiene una concentración de aproximadamente 0,015 M a aproximadamente 1,5 M, a menudo desde aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 0,5 M, con preferencia desde 0,1 a 0,25 M, se mezcla usualmente con la solución que contiene el fosforamidito monómero inmediatamente antes de o durante la reacción de condensación. Preferiblemente, está también presente en la solución una base orgánica en una concentración de aproximadamente 0,015 M a aproximadamente 1,5 M, a menudo desde aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 0,5 M, con preferencia desde 0,1 a 0,25 M. Preferiblemente, la base orgánica está presente en la misma concentración molar que la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona. La 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona se puede emplear en una relación molar a nucleósido-fosforamidito que es catalítica, es decir sub-estequiométrica, o en una relación molar que es estequiométrica o mayor que la estequiométrica. En muchas realizaciones, la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a nucleósido-fosforamidito está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,2:1 a 5:1, a menudo desde 0,25:1 a 4:1, con preferencia desde aproximadamente 0,3:1 a 2:1, por ejemplo aproximadamente 1:1. A continuación, el nucleósido desprotegido en 5' unido al soporte se pone en contacto con la mezcla durante aproximadamente 2 min a aproximadamente 10 min, con preferencia aproximadamente 5 min.
Si el eslabón fosforoso trivalente terminal debe oxidarse después que se ha completado la reacción de acoplamiento, el soporte sólido que contiene el oligonucleótido naciente se pone en contacto con un agente oxidante tal como una mezcla de I_{2} y agua o un peróxido tal como hidroperóxido de t-butilo en un disolvente orgánico tal como acetonitrilo o tolueno. Una mezcla de I_{2} y H_{2}O es un reactivo oxidante preferido. Cuando se utiliza una mezcla de I_{2} y agua, pueden estar presentes también otros disolventes orgánicos miscibles con el agua. Típicamente, el oligonucleótido unido al soporte sólido que contiene eslabones internucleotídicos de fósforo trivalente puede ponerse en contacto con una solución de I_{2} en un mezcla disolvente de agua, un disolvente aprótico miscible con el agua, y una base. Un ejemplo de una solución de oxidación típica es I_{2} aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 1,5 M en una solución de agua/tetrahidro-furano/lutidina 2:80:20 (vol/vol/vol). El soporte sólido se trata típicamente con la solución de I_{2} durante aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1,5 min.
Alternativamente, el oligonucleótido naciente unido al soporte sólido puede ponerse en contacto con una solución de un reactivo de transferencia de azufre en un disolvente orgánico para sulfurar los grupos fosforosos trivalentes. Por ejemplo, el oligonucleótido unido al soporte puede ponerse en contacto con una solución de 3-amino-[1,2,4]-ditiazol-5-tiona (aproximadamente 0,05 M-0,2 M) en un disolvente orgánico, tal como acetonitrilo o piridina, durante aproximadamente 30 s a aproximadamente 2 min.
En la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, el oligonucleótido naciente unido al soporte sólido puede ponerse en contacto opcionalmente con una solución del reactivo de protección terminal durante aproximadamente 30 s a aproximadamente 1 min. Después del paso de protección terminal, se realiza el paso de desprotección poniendo en contacto el oligonucleótido unido al soporte con una solución ácida durante aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min. El ciclo de reacción puede repetirse opcionalmente una o más veces hasta que se sintetiza un oligonucleótido de la longitud deseada. Como en la síntesis en fase de disolución, se obtiene un oligonucleótido protegido en R^{1} cuando el ciclo de reacción termina con el paso de protección terminal o el paso de oxidación o sulfuración. Se obtiene un oligonucleótido desprotegido en R^{1} cuando el ciclo de reacción termina con el paso de desprotección.
Cuando se completa la síntesis en fase sólida, el oligonucleótido puede separarse del soporte sólido por métodos estándar. Generalmente, el soporte sólido se trata con una solución de hidróxido de amonio concentrado a 25ºC-60ºC durante aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 16 horas o más dependiendo de la secuencia del oligonucleótido y de si se desea eliminar los grupos protectores de las nucleobases durante este paso. Los oligonucleótidos se purifican ventajosamente por métodos conocidos en la técnica, tales como uno o más de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa, y precipitación a partir de un disolvente apropiado. Puede emplearse también el procesamiento ulterior del producto, por ejemplo mediante ultrafiltración.
Un aspecto particularmente preferido de la presente invención comprende un método para la síntesis de un oligonucleótido que comprende acoplar un nucleósido-fosforamidito, preferiblemente un nucleósido-3'-fosforamidito, con un nucleósido u oligonucleótido naciente que comprende un grupo hidroxi libre, preferiblemente un grupo hidroxi 5' libre, en presencia de un activador, en el cual el activador comprende una mezcla de una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y un N-alquilimidazol, preferiblemente N-metilimidazol.
En esta realización particularmente preferida, el fosforamidito comprende generalmente un resto de fórmula -P(OCH_{2}CH_{2}CN)N(CH(CH_{3})_{2})_{2}. Generalmente, en esta realización, la concentración de cada uno de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y N-alquilimidazol es de 0,1 a 0,25 M, y con preferencia la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a N-alquilimidazol es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1,5:1, muy preferiblemente 1:1. En esta realización particularmente preferida, la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a fosforamidito es preferiblemente desde 0,5:1 a 2:1.
La presente invención se ilustra sin limitación por los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1 Preparación de un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y piridina
Se suspendió 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona en acetonitrilo, y se añadieron gota a gota a la suspensión 1,1 eq. de piridina con respecto a la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona. La solución se volvió clara al final de la adición, y se separó de la solución un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y piridina como un material cristalino fino. Los cristales se lavaron con éter o hexano para eliminar las trazas de piridina y acetonitrilo. ^{1}H NMR (DMSO), desplazamientos químicos en ppm: 8,8 (2H, s), 8,2 (1H, q), 8,0 (1H, q) y 7,6-7,9 (6H, m).
Ejemplo 2 Preparación de un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y 3-picolina
Se preparó un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y 3-picolina de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. ^{1}H NMR (DMSO), desplazamientos químicos en ppm: 8,8 (1H, s), 8,72 (1H, d), 8,27 (1H, d), 8,0 (2H, d), 7,77-7,93 (6H, m) y 2,45 (3H, s).
Ejemplo 3 Preparación de un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y N-metilimidazol
Se suspendió 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona en acetonitrilo, y se añadieron gota a gota a la suspensión 1,1 eq. de N-metilimidazol con respecto a la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para formar la sal cristalina que se lavó con éter o hexano para eliminar las trazas de N-metilimidazol y acetonitrilo. ^{1}H NMR (DMSO), desplazamientos químicos en ppm: 13,9 (1H, S), 9,03 (1H, s), 7,59-7,75 (6H, m) y 3,88 (3H, s).
Ejemplo 4 Síntesis de desoxirribo-oligonucleótidos utilizando un complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y una base orgánica
La síntesis del oligonucleótido se llevó a cabo en el sintetizador de DNA Oligo Pilot II (Amersham Pharmacia Biotech.). Se siguió el protocolo estándar de química de fosforamidito para la síntesis, con ligeras modificaciones. La concentración de monómeros de fosforamidito era 0,1 M en acetonitrilo. Se utilizó el complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y piridina, 3-picolina o N-metilimidazol en lugar de tetrazol como el activador durante el paso de condensación. La concentración del complejo salino era 0,25 M en acetonitrilo. El tiempo de acoplamiento utilizado para la elongación de la cadena utilizando el complejo salino de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona era similar a los tiempos de acoplamiento utilizados con tetrazol como activador. Después del paso de condensación, el eslabón triéster de fosfito se convirtió en un triéster estable de fosfato con solución de yodo o en un triéster estable de fosforotioato con reactivo de Beaucage o 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona. Al final de la síntesis, los soportes sólidos enlazados con el oligonucleótido totalmente protegido se trataron con t-butilamina al 10% en hidróxido de amonio concentrado durante 16-20 h a 50ºC a fin de liberar el oligonucleótido y eliminar los grupos protectores \beta-cianoetilo y los grupos protectores de las nucleobases. Los oligonucleótidos brutos se analizaron por HPLC de intercambio iónico, electroforesis capilar y espectrometría de masas MALDI-TOF y se compararon con oligonucleótidos preparados utilizando tetrazol como el activador. La Tabla 1 describe las condiciones utilizadas para sintetizar la secuencia del oligonucleótido-fosforotioato 5' TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 3' (SEQ ID NO 1), y la Tabla 2 describe los resultados obtenidos a partir de las diversas síntesis. El complejo salino ilustrado en las Tablas 1 y 2 es 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y N-metilimidazol.
TABLA 1 Parámetros de Synthesis para la Synthesis de SEQ ID NO 1
Soporte sólido Escala de Activador Equiv. molar Activador frente Equiv. de agente
síntesis de amidito a amidito de sulfuración
Cuentas de CPG 746 \mumoles Tetrazol 2,0 eq. 4,3 3,2
Cuentas de CPG 737 \mumoles Complejo 2,0 eq. 4,0 3,3
salino
Cuentas de CPG 737 \mumoles Complejo 1,5 eq. 3,3 3,3
salino
PS rígido 626 \mumoles Complejo 2,0 eq. 4,0 3,8
salino
PS rígido 600 \mumoles Tetrazol 2,0 eq. 4,3 4,0
TABLA 2 Análisis y resultados de SEQ ID NO 1
Soportes sólidos Escala Activador Eq. mol. de Unidades PLT por PLT por Peso
amidito totales OD CGE HPLC molec.
Cuentas de CPG 746 \mumol Tetrazol 2,0 eq. 84504 74% 77% 5688
Cuentas de CPG 737 \mumol Sal común 2,0 eq. 82134 77% 79% 5687
Cuentas de CPG 737 \mumol Sal común 1,5 eq. 82320 77% 79% 5689
PS rígido 626 \mumol Sal común 2,0 eq. 80712 76% 76% 5686
PS rígido 600 \mumol Tetrazol 2,0 eq. 75006 73% 71% 5687
PLT = producto de longitud total. CGE = electroforesis capilar en gel, HPLC = HPLC de intercambio iónico
<110> Avecia Biotechnology, Inc. et al 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inmovilización de oligonucleótidos sobre soportes sólidos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SMC 60474-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia preparada en el Ejemplo 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (37)

1. Un proceso para sintetizar un oligonucleótido utilizando química de fosforamidito que comprende acoplar un nucleósido o un oligonucleótido naciente que tiene un grupo hidroxi o tiol libre y un nucleósido-fosforamidito en presencia de un agente de acoplamiento, en el cual el agente de acoplamiento es una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona representada por la fórmula estructural siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual:
p
es 0 o un número entero de uno a cuatro;
X^{7}
es O o S;
R
para cada aparición es un sustituyente.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual cada R es independientemente halo, un grupo alifático sustituido o insustituido, -NR^{11}R^{12}, -OR^{13}, -OC(O)R^{13}, -C(O)OR^{13}, ciano, un grupo arilo sustituido o insustituido, un heterociclilo sustituido o insustituido, -CHO, -COR^{13}, -NHCOR^{13}, un aralquilo sustituido o insustituido, o -SR^{13}; o dos grupos R adyacentes, considerados junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, forman un anillo de seis miembros saturado o insaturado; en el cual:
R^{11} y R^{12} son cada uno, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido; o junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un grupo heterociclilo; y
R^{13} es un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, o un grupo aralquilo sustituido o insustituido.
3. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual está presente una base orgánica con el agente de acoplamiento durante la reacción de acoplamiento.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual la base orgánica es una amina.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la amina es una amina terciaria.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la amina terciaria se selecciona del grupo constituido por una trialquilamina, una N-alquilpirrolidina sustituida o insustituida, una arilpirrolidina sustituida o insustituida, un N-alquilpirrol sustituido o insustituido, un N-aril-pirrol sustituido o insustituido, una N-alquilmorfolina sustituida o insustituida, una N-arilmorfolina sustituida o insustituida, una N-alquilpiperidina sustituida o insustituida, una N-arilpiperidina sustituida o insustituida, una N,N-dialquilpiperazina sustituida o insustituida, una N,N-diarilpiperazina sustituida o insustituida, una N-alquil-N-arilpiperazina sustituida o insustituida, quinuclidina sustituida o insustituida, y un 1,8-diaza-biciclo[5.4.0]undec-7-eno sustituido o insustituido.
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la amina es un compuesto de azaheterociclilo sustituido o insustituido.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual el compuesto de azaheterociclilo se selecciona del grupo constituido por una pirimidina sustituida o insustituida, un 1-alquilpirazol sustituido o insustituido, un 1-arilpirazol sustituido o insustituido, una pirazina sustituida o insustituida, una N-alquilpurina sustituida o insustituida, una N-arilpurina sustituida o insustituida, un N-alquilpirrol sustituido o insustituido, un N-arilpirrol sustituido o insustituido, una piridina sustituida o insustituida, un N-alquilimidazol sustituido o insustituido, un N-arilimidazol sustituido o insustituido, una quinolina sustituida o insustituida, una isoquinolina sustituida o insustituida, una quinoxalina sustituida o insustituida, una quinazolina sustituida o insustituida, un N-alquilindol sustituido o insustituido, un N-arilindol sustituido o insustituido, un N-alquilbencimidazol sustituido o insustituido, un N-arilbencimidazol sustituido o insustituido, una triazina sustituida o insustituida, un tiazol sustituido o insustituido, un 1-alquil-7-azaindol sustituido o insustituido, un 1-aril-7-azaindol sustituido o insustituido, una pirrolidina sustituida o insustituida, una morfolina sustituida o insustituida, una piperidina sustituida o insustituida y una piperazina sustituida o insustituida.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el compuesto de azaheterociclilo es piridina, 3-metilpiridina o N-metilimidazol.
10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el nucleósido-fosforamidito es un monómero.
11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual el nucleósido-fosforamidito es un dímero.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el fosforamidito es un 3'-fosforamidito representado por una de las fórmulas estructurales siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
11
en la cual:
cada X^{1} es, independientemente, -O- o -S-;
cada X^{2} es, independientemente, -O-, -S-, o -NR^{14}-;
cada X^{3} es, independientemente, -O-, -S-, -CH_{2}-, o -(CH_{2})_{2}-;
R^{1} es un grupo protector de alcohol o un grupo protector de tio;
R^{2} es -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, -F, -OR^{6}, -NR^{7}R^{8}, o -SR^{9};
R^{3} es -OCH_{2}CH_{2}CN, -SCH_{2}CH_{2}CN, un grupo alifático sustituido o insustituido, -OR^{10}, -SR^{10}, -O-CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -O-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, -O-CH_{2}CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2}, -S-CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -S-CH_{2} CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, o -S-CH_{2}CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2};
R^{4} y R^{5} son cada uno, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido; o
R^{4} y R^{5}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo; y
R^{6} es -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido, un grupo protector de hidroxi o -(CH_{2})_{q}-NR^{18}R^{19};
R^{7} y R^{8} son cada uno, independientemente, H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o un grupo protector de amino; o
R^{7} y R^{8}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, son un grupo heterociclilo; y
R^{9} es H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o un grupo protector de tio;
R^{10} es, para cada aparición, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido o un grupo aralquilo sustituido o insustituido;
R^{14} es -H, un grupo alquilo, un grupo arilo o un grupo aralquilo;
R^{16} y R^{19} son cada uno, independientemente, -H, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo heteroarilo sustituido o insustituido, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido, un grupo heteroaralquilo sustituido o insustituido o un grupo protector de amino; o
R^{18} y R^{19}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo; y
q es un número entero de 1 a aproximadamente 6; y
cada B es, independientemente, -H, una nucleobase natural o no natural, una nucleobase protegida natural o no natural, un heterociclo, o un heterociclo protegido.
13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual X^{7} es O y p es 0.
14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a nucleósido-fosforamidito está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,2:1 a 5:1.
15. Un proceso para condensación de un oligonucleótido N-mero o un nucleósido representado por la fórmula estructural siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
12
en la cual:
cada
X^{1} es, independientemente, -O- o -S-;
cada
X^{2} es, independientemente, -O-, -S-, o -NR^{14}-;
cada
X^{3} es, independientemente, -O-, -S-, -CH_{2}-, o -(CH_{2})_{2}-;
cada
X^{4} es, independientemente, O o S;
\hskip0,4cm
X^{5} es -OH o -SH;
cada
R^{2} es, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, -F, -OR^{8}, -NR^{7}R^{8}, o -SR^{9};
cada
R^{3} es, independientemente, -OCH_{2}CH_{2}CN, -SCH_{2}CH_{2}CN, un grupo alifático sustituido o insustituido, -OR^{10}, -SR^{10}, -O-CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -O-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, -O-CH_{2}CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2}, -S-CH_{2}CH_{2}-Si (CH_{3})_{2}C_{6}H_{5}, -S-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{2}-CH_{2}CH_{3}, o -S-CH_{2}CH_{2}-C_{6}H_{4}-NO_{2};
cada
R^{6} es, independientemente, H, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un aralquilo sustituido o insustituido, un grupo protector de hidroxi o -(CH_{2})_{q}-NR^{18}R^{19};
R^{7} y R^{8} son cada uno, independientemente, H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o R^{7} y R^{8} considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, son un grupo heterociclilo; y
R^{9}
es H, un grupo alifático sustituido o insustituido, o un grupo protector de tio;
R^{10}
es, para cada aparición, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido o un grupo aralquilo sustituido o insustituido,
cada
R^{14} es, independientemente, -H, un grupo alquilo, un grupo arilo o un grupo aralquilo;
R^{16}
es un grupo protector de hidroxi, un grupo protector de tio, un grupo protector de amino, -(CH_{2})_{q}-NR^{18}R^{19}, un soporte sólido, o un enlazador escindible unido a un soporte sólido;
R^{18} y R^{19} son cada uno, independientemente, -H, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo heteroarilo sustituido o insustituido, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido, un grupo heteroaralquilo sustituido o insustituido, o un grupo protector de amino; o
R^{18} y R^{19} considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterocicliclo; y
\hskip0,4cm
q es un número entero de 1 a aproximadamente 6;
cada
B es, independientemente, -H, una nucleobase natural o no natural, una nucleobase protegida natural o no natural, un heterociclo, o un heterociclo protegido; y
\hskip0,4cm
n es cero o un número entero positivo;
con un nucleósido-fosforamidito representado por la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual R^{2}, R^{3}, X^{1}, X^{2}, X^{3} y B son como se define previamente:
R^{1}
es un grupo protector de alcohol o un grupo protector de tio; y
R^{4} y R^{5} son cada uno, independientemente, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido; o
R^{4} y R^{5}, considerados junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo; que comprende el paso de poner en contacto el oligonucleótido o nucleósido con el nucleósido-fosforamidito y una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona representada por la fórmula estructural siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual:
p
es 0 o un número entero de uno a cuatro;
X^{7}
es O y S;
R
es para cada aparición, un sustituyente;
formándose con ello un (n+1)oligonucleótido que tiene un eslabón de fósforo trivalente 5'-terminal representado por la fórmula estructural siguiente:
15 
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual cada R es independientemente halo, un grupo alifático sustituido o insustituido, -NR^{11}R^{12}, -OR^{13}, -OC(O)R^{13}, -C(O)OR^{13}, ciano, un grupo arilo sustituido o insustituido, un heterociclilo sustituido o insustituido, -CHO, -COR^{13}, -NHCOR^{13}, un aralquilo sustituido o insustituido, o -SR^{13}; o dos grupos R adyacentes considerados junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, forman un anillo saturado o insaturado de seis miembros; en el cual:
R^{11} y R^{12} son cada uno, independientemente, -H, un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, un grupo aralquilo sustituido o insustituido; o junto con el nitrógeno al cual están unidos, forman un grupo heterociclilo; y
R^{13} es un grupo alifático sustituido o insustituido, un grupo arilo sustituido o insustituido, o un grupo aralquilo sustituido o insustituido.
17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el cual está presente una base orgánica cuando el oligonucleótido o nucleósido se pone en contacto con el fosforamidito y la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona.
18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual la concentración de al base orgánica y la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona es aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 2 M.
19. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el cual la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a nucleósido-fosforamidito está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,2:1 a 5:1.
20. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que comprende adicionalmente los pasos de:
a)
poner en contacto el (n+1)oligonucleótido que tiene un eslabón fosforoso trivalente 5'-terminal con un agente oxidante o sulfurante, formándose con ello un oligonucleótido que tiene una cadena principal de fósforo pentavalente representada por la fórmula estructural siguiente:
16 
\vskip1.000000\baselineskip
b)
de manera opcional, proteger terminalmente los grupos X^{5} que no han reaccionado con el fosforamidito por reacción de los grupos X^{5} con un cloruro de ácido o un anhídrido;
c)
desproteger el (n+1)oligonucleótido que tiene una cadena principal de fósforo pentavalente por reacción del mismo con un reactivo para eliminar R^{1};
d)
repetir opcionalmente una o más veces el paso de acoplamiento, el paso de oxidación o de sulfuración, el paso de protección terminal y el paso de desprotección.
21. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el paso de oxidación o sulfuración es el paso final y el oligonucleótido se representa por la fórmula estructural siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual:
m
es un número entero mayor que n.
22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el paso de desprotección es el paso final y el oligonucleótido preparado se representa por la fórmula estructural siguiente:
18
en la cual:
m
es un número entero mayor que n.
23. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el cual R^{16} es un enlazador escindible unido a un soporte sólido.
24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual:
a)
el oligonucleótido se oxida después de cada paso de acoplamiento y el oligonucleótido es un oligonucleótido-fosfodiéster;
b)
el oligonucleótido se sulfura después de cada paso de acoplamiento y el oligonucleótido preparado es un oligonucleótido-fosforotioato; o
c)
el oligonucleótido se oxida después de al menos un paso de acoplamiento y se sulfura después de al menos un paso de acoplamiento, y el oligonucleótido preparado es un oligonucleótido quimérico.
25. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en el cual X^{7} es O y p es 0.
26. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el cual el oligonucleótido se purifica subsiguientemente.
27. Un proceso para la síntesis de un oligonucleótido que comprende acoplar un nucleósido-fosforamidito con un nucleósido u oligonucleótido naciente que comprende un grupo hidroxi libre, en presencia de un activador, en el cual el activador comprende una mezcla de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y un N-alquil-imidazol.
28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual el nucleósido-fosforamidito es un nucleósido-3'-fosforamidito, y el nucleósido u oligonucleótido naciente comprende un grupo hidroxi 5' libre.
29. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28, en el cual el N-alquilimidazol es N-metilimidazol.
30. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el cual el fosforamidito comprende un resto de fórmula -P(OCH_{2}CH_{2}CN)N(CH(CH_{3})_{2})_{2}.
31. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en el cual la concentración de cada uno de la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona y el N-alquilimidazol es desde 0,1 a 0,25 M.
32. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, en el cual la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a N-alquilimidazol es desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1,5:1.
33. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el cual la relación molar de 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona a fosforamidito es desde 0,5:1 a 2:1.
34. Un complejo salino que comprende un N-alquilimidazol y una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona representada por la fórmula estructural siguiente:
19
en la cual:
p
es 0 o un número entero de uno a cuatro;
X^{7}
es 0 o S; y
R
es para cada aparición, un sustituyente.
35. Un complejo salino de acuerdo con la reivindicación 34, en el cual p es 0, X^{7} es O y el N-alquilimidazol es N-metilimidazol.
36. Uso de una 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]iso-tiazol-3-ona representada por la fórmula estructural siguiente:
20
en la cual:
p
es 0 o un número entero de uno a cuatro;
X^{7}
es 0 o S; y
R
es para cada aparición, un sustituyente.
para la síntesis de un oligonucleótido por química de fosforamidito.
37. Uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el cual la 1,1-dioxo-1,2-dihidro-1\lambda^{6}-benzo[d]isotiazol-3-ona se emplea como un complejo salino que comprende un N-alquilimidazol, X^{7} es O y p es 0.
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