ES2258475T3 - Metodo de reconstitucion de un embrion de mamifero no humano mediante celulas diferenciadas. - Google Patents
Metodo de reconstitucion de un embrion de mamifero no humano mediante celulas diferenciadas.Info
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Abstract
Método de tratamiento del núcleo diploide de una célula donante somática previo a su transferencia en el citoplasma de un ovocito receptor, para reconstruir in vitro un embrión de mamífero no humano, caracterizado porque incluye: a) la proteolisis preparada de las proteínas no histonas, y b) la inducción del inflamiento isomorfo de dicho núcleo.
Description
Método de reconstitución de un embrión de
mamífero no humano mediante células diferenciadas.
La presente invención se refiere a la
reconstitución de embriones de mamíferos no humanos mediante
transferencia nuclear.
Las técnicas de producción de animales no
humanos, especialmente mamíferos, a partir de embriones
reconstituidos mediante transferencia del núcleo de una célula
donante somática al citoplasma de un ovocito receptor previamente
enucleado son actualmente objeto de un gran interés, debido a sus
aplicaciones potenciales. Entre éstas, se pueden mencionar
especialmente:
- -
- la transgénesis animal: la integración de un gen de interés en células en cultivo, seguida de la transferencia de los núcleos de las mismas en ovocitos receptores podría permitir incrementar la eficacia de la transgénesis;
- -
- la posibilidad de multiplicar animales que posean características genéticas particulares, ya sean éstas naturales o resultantes de la transgénesis;
- -
- la evaluación genética: el hecho de disponer de varios animales dotados de un patrimonio genético idéntico puede permitir evaluar la influencia respectiva de los factores genéticos y medioambientales sobre las cualidades de un animal;
- -
- la posibilidad de obtener linajes de células embrionarias que, a continuación, puede diferenciarse in vitro.
Los principales obstáculos encontrados para la
puesta a punto de técnicas de reconstitución de embriones mediante
transferencia nuclear proceden de la dificultad de coordinar las
interacciones núcleo donante/citoplasma receptor, de las que depende
el desarrollo futuro del embrión. Los métodos de transferencia
nuclear incluye por lo tanto clásicamente, previamente a la
transferencia del núcleo, la preparación de la célula donante y/o
del ovocito receptor.
Los ovocitos receptores generalmente utilizados
resultan de la enucleación de ovocitos en la etapa metafase II, tras
su maduración in vitro. En esta etapa del ciclo celular, el
citoplasma posee una actividad MPF (Maturation Promoting Factor)
importante, que decrece progresivamente desde el momento en que se
activa el citoplasma. Esta activación, que resulta de la entrada de
un espermatozoide en el caso de la fecundación natural, puede
inducirse artificialmente en el caso de la transferencia de
núcleo,
Cuando la transferencia del núcleo y la
activación del citoplasma receptor intervienen simultáneamente (lo
que se produce por ejemplo cuando la fusión del núcleo y del
citoplasma se efectúa mediante un impulso eléctrico suficiente para
estimular este último), la actividad MPF elevada induce la
degradación de la envuelta nuclear, exponiendo la condensación de la
cromatina, inmediatamente tras la fusión, el material nuclear a un
entorno citoplásmico metafísico. Se ha mencionado [CAMPBELL et
al., Reprod., 49, 933-942, (1993)] que dichos
fenómenos pueden implicar anomalías cromosómicas, especialmente en
el caso en que el núcleo donante se encuentra en fase G2 o S del
ciclo celular.
Con objeto de evitar la condensación prematura de
la cromatina y conservar la envuelta nuclear intacta, se ha
propuesto [BARNES et al., Mol. Reprod. Dev., 36,
33-41, (1993); STICE et al., Mol. Reprod.
Dev., 38, 61-68, (1994)] activar previamente el
citoplasma receptor, y efectuar la transferencia del núcleo
únicamente una vez obtenido un entorno citoplásmico del tipo
interfásico, lo que se traduce especialmente mediante un escaso
nivel de actividad MPF, o utilizar un citoplasma receptor procedente
de ovocitos de mayor edad [CHESNE et al., CRAS, 316,
487-492, (1993)], más sensibles a la activación y en
los que la transición hacia la interfase se produce con mayor
rapidez.
Este planteamiento permite mejorar la tasa de
éxito cuando se utilizan células embrionarias (blastómeros) como
células donantes. Por el contrario, especialmente en los bovinos, es
mucho menos eficaz en el caso de núcleos procedentes de núcleos de
células somáticas diferenciadas donde las tasas de desarrollo de los
embriones se mantienen muy bajas [VIGNON et al., c.r. Acad.
Sci. Paris, 321, 735-745, (1998); RENARD et
al., The Lancet, 353, 1489-1491, (1999)].
Según otro planteamiento, la exposición del
núcleo donante procedente de una célula diferenciada a los factores
del citoplasma receptor en metafase tendría por efecto permitir la
reprogramación del núcleo, y restaurar su totipotencia. La Solicitud
Internacional PCT WO 97/07668, a nombre del ROSLIN INSTITUTE
(Inventores: WILMUT et al.) propone activar los ovocitos
únicamente varias horas después de la fusión, con el fin de
prolongar el contacto entre el material nuclear procedente de la
célula donante y el citoplasma receptor. Para mantener una ploidía
correcta en estas condiciones, es necesario utilizar células
donantes en fase G0 o G1, y estabilizar o inhibir la formación de
los microtúbulos durante la activación.
La Solicitud Internacional PCT WO 97/07669, a
nombre del ROSLIN INSTITUTE (Inventores: WILMUT et al.)
preconiza la utilización de núcleos obtenidos a partir de células
previamente conducidas al estado de quiescencia (fase G0 del ciclo
celular) mediante un período de cultivo en la ausencia de suero;
este tratamiento facilitaría asimismo la reprogramación del núcleo
donante, haciéndolo más receptivo a factores citoplásmicos del
ovocito receptor. Este planteamiento ha permitido, especialmente en
los ovinos, mejorar la tasa de desarrollo de embriones obtenidos a
partir de núcleos de células diferenciadas.
En el ratón, WAKAMAYA et al. (Nature, 394,
369-374, 1998) explican el desarrollo de embriones
obtenidos a partir de núcleos en fase G0 o G1 de células de cúmulos
diferenciadas inyectados en el citoplasma de ovocitos en metafase
II activados entre 1 y 3 horas después de la inyección.
Ahora, los inventores han puesto apunto un nuevo
método de reconstitución in vitro de embriones de mamíferos
no humanos, que permite mejorar las tasas de obtención y desarrollo
de embriones viables a partir de núcleos de células somáticas
procedentes de distintos tejidos fetales o adultos.
En este marco, la presente invención tiene por
objeto un método de tratamiento del núcleo diploide de una célula
somática previamente a su transferencia en el citoplasma de un
ovocito receptor, incluyendo dicho tratamiento:
a) la proteolisis preparada de las proteínas
no histonas, y
b) la inducción de un inflamiento isomorfo de
dicho núcleo.
Este tratamiento tiene por efecto hacer el ADN
nuclear más accesible y más reactivo al entorno citoplásmico donde
se encuentran factores capaces de interactuar con las estructuras
del núcleo incluso cuando no existe ruptura de la envuelta nuclear
[ADENOT et al., Developement, 124, 4615-4625,
(1997); THOMPSON et al., Dev. Genetics, 42,
22-31, (1998)]. La preservación de la membrana del
núcleo permite mantener una ploidía correcta antes de la primera
división del embrión.
El núcleo diploide puede obtenerse especialmente
a partir de cultivos primarios de células fetales o células adultas
procedentes de distintos tejidos (por ejemplo, epitelios de glándula
mamaria o piel, células musculares, células hepáticas, etc.). Las
células pueden proceder indistintamente de un cultivo primario
fresco, o de un cultivo establecido en varias pasadas o reiniciado
a partir de células conservadas mediante congelación. Las células
pueden utilizarse cualquiera que sea la fase del ciclo celular en la
que se encuentran.
Los núcleos pueden extraerse a partir de dichas
células donantes, tratarse de conformidad con la invención y
transferirse a continuación mediante microinyección en el citoplasma
del ovocito receptor; sin embargo, es más cómodo, en la práctica,
tratar los núcleos contenidos en las células donantes y efectuar a
continuación la transferencia nuclear mediante fusión de la célula
donante y el citoplasma receptor.
En este último caso, el empleo del método de la
invención requiere una etapa previa de permeabilización de la
membrana citoplásmica de la célula donante, con objeto de que el
núcleo sea accesible a la acción de los tratamientos.
La permeabilización de las membranas plásmicas
puede obtenerse, por ejemplo, mediante incubación de la célula con
uno o varios agentes permeabilizantes suaves, tales como la
lisolecitina, la estreptolisina, la saponina y la digitonina, con el
requisito de que las condiciones de utilización no induzcan la lisis
de las células y preserven a la membrana plásmica un estado
compatible con la posterior operación de fusión con el ovocito
receptor. Las dosis utilizables y las condiciones de incubación
varían de una fuente de células a otra. Se determinan las
condiciones adecuadas probando previamente la permeabilización con
la ayuda de azul Trypan; las células permeabilizadas adoptan una
coloración azul fácil de observar por el microscopio. Las
condiciones adecuadas corresponden a las que ofrecen entre el 50 y
el 100% de células permeables. El tratamiento de proteolisis y
previamente a la inducción del inflamiento de los núcleos, que
requiere una incubación más larga.
Para la proteolisis preparada, se utilizará una
proteasa de serina, tal como la tripsina o la quimotripsina; la
acción de la proteasa debe limitarse a la degradación de proteínas
no histonas del núcleo, y de proteínas del citoesqueleto que rodea
el núcleo, y no debe conducir a la lisis de los núcleos.
Generalmente, se utilizarán concentraciones de proteasa muy bajas.
Por ejemplo, en el caso de una proteolisis efectuada en células
enteras (al mismo tiempo que la permeabilización o a continuación de
la misma), se pueden utilizar concentraciones de tripsina del orden
de 1 a 10 U/ml en la mezcla de incubación de las células, para un
tiempo de incubación que varía entre 1 y 10 min. A 37ºC. En el caso
del tratamiento de núcleos aislados, las dosis de proteasa y los
tiempos de incubación deberán reducirse aún más.
Además, la tripsina posee un efecto directo de
activación sobre ADN polimerasas en las células que están en fase
G1 o G0 durante el tratamiento [BROWN et al., Exp. Cell Res.,
104, 207-213, (1977)]. Esto permitiría facilitar el
reinicio del ciclo celular de los núcleos que se encuentran en fase
G0/G1 durante su incorporación en un citoplasma receptor como
interfase.
El inflamiento del núcleo puede inducirse
mediante un tratamiento con la ayuda de por lo menos un compuesto
polianiónico, tal como la heparina, el dextran sulfato, o los ácidos
poliaspárticos de peso molecular elevado (>20.000), como
describen KRAEMER y COFFEY [Biochim. Biophys. Acta., 224,
568-578, (1970)].
El tratamiento se efectúa, tras la proteolisis o
simultáneamente a la misma, mediante incubación de los núcleos o
las células que los contienen en presencia del polianión, hasta que
se observe un inflamiento del núcleo. Por ejemplo, en el caso de
las células enteras observado. Por ejemplo, en el caso de las
células enteras permeabilizadas, se pueden utilizar entre 50 y 200
\mug de polianión por ml de medio de incubación, para una
incubación de 30 a 60 min a temperatura ambiente (15 a 25ºC).
Al término de este tratamiento, se efectúa la
transferencia del núcleo en el citoplasma del ovocito receptor.
La transferencia de los núcleos tratados de
conformidad con la invención puede efectuarse cualquiera que sea la
etapa del ciclo celular de las células donantes, y cuando el
citoplasma del ovocito receptor está en metafase II o en interfase.
En el caso de fusión de los núcleos con ovocitos receptores en
metafase II (de 20 a 25 h después del inicio de la maduración),
habrá que realizar una activación de los embriones reconstituidos,
por ejemplo, mediante un procedimiento de activación química, como
se ha descrito por parte de LIU et al. [Mol. Reprod. Dev.,
49, 298-307, (1998)], o mediante cualquier otro
método.
Sin embargo, es especialmente interesante
utilizar citoplasmas de ovocitos receptores previamente preparados
de manera a llevarlos a interfase.
Se define como "citoplasma receptor en
interfase" un citoplasma en el que la tasa de MPF es inferior a
aquella en la que induce la degradación de la membrana nuclear y la
condensación de la cromatina.
Se puede obtener dicho citoplasma a partir de un
ovocito madurado in vivo o in vitro. Se retira el
material cromosómico mediante micromanipulación, mientras que el
ovocito es bloqueado en la etapa metafase II: El citoplasma
resultante es tratado a continuación para reducir la actividad MPF.
Por ejemplo, puede prepararse mediante un método de envejecimiento
in vitro y de enfriamiento antes de la fusión [CHESNE et
al., C. R. Acad. Sci., 316, 487-491, (1993)].
Asimismo, es posible obtener el mismo resultado con la ayuda de
drogas que inhiban las síntesis protéicas (cicloheximida) o de
drogas que inhiban las fosforilaciones (6-DMAP) o de
una mezcla de las 2 drogas. En este caso, el estado de interfase se
obtiene generalmente en 1 a 4 h de incubación.
La reconstitución del embrión puede efectuarse,
en el caso de núcleos aislados, mediante microinyección. Sin
embargo, es especialmente ventajoso utilizar directamente células
tratadas para fusionarlas con los citoplasmas de ovocitos
receptores. En este caso, la fusión se realiza preferiblemente
mediante choque eléctrico, o mediante cualquier otro método. No es
necesario operar en condiciones destinadas a inducir la activación
del citoplasma receptor.
Los embriones reconstituidos son directamente
cultivados in vitro sin otra activación tras la fusión, hasta
su desarrollo en la etapa blastocito.
Los núcleos donantes no sufren la destrucción de
su membrana nuclear, ni condensación de la cromatina (PCC) antes de
la primera división que interviene tras la fusión.
Cuando los embriones han alcanzado la etapa
blastocito, se transfieren a hembras receptoras, según las técnicas
clásicas conocidas en sí.
El método conforme a la invención permite, por
una parte, mejorar la reprogramación de los núcleos transferidos,
permitiendo el acceso de los factores citoplásmicos por parte de la
cromatina, gracias a una acción encimática moderada antes de la
fusión y, por otra parte, favorecer el mantenimiento de un ploidía
correcta de las células embrionarias, minimizando la condensación
de la cromatina e impidiendo su dispersión durante la remodelación
del núcleo introducido en el citoplasma receptor. Esta modificación
en las etapas iniciales de las relaciones entre el núcleo y el
citoplasma permite favorecer el desarrollo a término de los
embriones reconstituidos a partir de núcleos de células somáticas
diferenciadas, cualquiera que sea la fase del ciclo celular en la
que se encuentran dichas células.
Puede aplicarse a distintas especies de mamíferos
no humanos; sin embargo está más especialmente adaptada a la
reconstitución de embriones de mamíferos ungulados, especialmente
rumiantes, y especialmente ovinos, bovinos, caprinos o
porcinos.
La presente invención se entenderá mejor por
medio del complemento de descripción siguiente, que se refiere a
ejemplos no limitativos de empleo del procedimiento de la invención
para la reconstitución de embriones bovinos.
Las células donantes se obtienen a partir de
cultivos de células fetales de piel o de músculo, o de cultivos de
biopsia de oreja de animales adultos (células de piel) preparadas
como describen VIGNON et al., (C. R. Acad. Sci. París, 321,
735-745, 1998). En estas condiciones, se obtienen
células diferenciadas del tipo fibroblasto.
Las cajas de células se vacían del medio de
cultivo, se enjuagan mediante tampón PBS y se llenan de un medio de
permeabilización cuya composición es la siguiente: solución salina
equilibrada de HANKS sin calcio y sin magnesio, con 0,5 \mug/ml
de tripsina, y 20 a 30 \mug/ml de lisolecitina en el caso de las
células fetales de piel, y 15 a 20 \mug/ml de lisolecitina en el
caso de las células de piel de animales adultos. Después de una
incubación de 5 min a 37ºC, se vacían las cajas del medio de
incubación. Para detener la permeabilización y la proteolisis, se
enjuagan inmediatamente las cajas con una solución tampón (solución
salina equilibrada de HANKS sin calcio y sin magnesio, con 10 U/ml
de heparina). La incubación se lleva a cabo durante 30 a 60 min a
temperatura ambiente. A continuación, se recogen las células
mediante raspado del soporte de cultivo, se centrifugan a 1.200 g
durante 5 min, y se colocan de nuevo en medio de cultivo desprovisto
de suero previamente a la fusión con los ovocitos receptores.
Se enuclean los ovocitos receptores, y se llevan
a interfase según el protocolo descrito por VIGNON et al. [C.
R. Acad. Sci. París, 321, 735-745, (1998)].
La transferencia de núcleo se efectúa
introduciendo una célula donante aislada bajo la zona pelúcida del
citoplasma receptor, y efectuando la fusión en las siguientes
condiciones: 2 pulsaciones eléctricas de 2,2 kV/cm de una duración
de 20 \mus en medio TCM199 (LIFE TECHNOLOGIES, Cergy Pontoise,
Francia) al que se añaden 5 \mug/ml de citocalasina B.
La fusión se comprueba mediante observación con
microscopio binocular, y los embriones reconstituidos se colocan en
cultivo in vitro, y se implantan in vivo, como
describen VIGNON et al. [C. R. Acad. Sci. París, 321,
735-745, (1998)].
Se obtienen testigos según el protocolo descrito
anteriormente, pero sin permeabilización, ni tratamiento con
tripsina y heparina de las células donantes.
En el caso de las células fetales, de piel o de
músculo, se han obtenido 47 blastocitos tras haber reconstituido
663 embriones (7,1%) mediante células donantes a las que se ha
aplicado el tratamiento de la invención. En comparación, con las
células testigo, se han obtenido 13 blastocitos para 386 embriones
reconstituidos (3,37%).
Después del transplante de los embriones
obtenidos a partir de células donantes a las que se ha aplicado el
tratamiento de la invención, 27 vacas receptoras han dado 5
gestaciones de más de 90 días, y han nacido 4 animales viable. Para
las células testigo, 6 vacas receptoras fueron transplantadas y sólo
una gestación llegó más allá de los 90 días, pero sin llegar a
término (aborto tardío a los 8 meses de gestación).
En el caso de las células procedentes de biopsias
de oreja de animales adultos, se produjeron 23 blastocitos después
de 580 reconstituciones de embriones (4%) con células donantes a las
que se aplicó el tratamiento de la invención, mientras que se
obtuvieron 6 blastocitos de 250 reconstituciones (2,4%) con células
testigo. Se transplantaron todos los embriones y se obtuvo un
nacimiento a partir de la serie de embriones procedentes de células
tratadas.
Durante otra serie de experimentos, se
reconstituyeron embriones según el protocolo descrito en el ejemplo
1 anterior, a partir de células somáticas bovinas fetales o adultas
procedentes de cultivos en proliferación, o procedentes de cultivos
colocados en estado de quiescencia (mediante mantenimiento, durante
las 36 a 48 horas anteriores a su uso, en un medio desprovisto de
suero). También se reconstituyeron embriones testigo como se
describe en el ejemplo 1 anterior.
Los resultados se ilustran en las tablas I y II
siguientes. La tabla I representa los resultados obtenidos con las
células donantes procedentes de cultivos en proliferación.
| Células | Número de embriones | Número de | Número de | |
| donantes | Mórula (%) | Blastocitos (%) | ||
| Reconstituidos | Separados | |||
| (%) | (%) | |||
| Tratadas | 502 (56,5) | 256 (51,0) | 43 (8,6) | 28 (5,6) |
| Testigo | 221 (55,6) | 115 (52,0) | 10 (4,5) | 6 (2,7) |
La tabla II representa los resultados obtenidos
con las células donantes quiescentes.
| Células | Número de embriones | Número de | Número de | |
| donantes | Mórula (%) | Blastocitos (%) | ||
| Reconstituidos | Separados | |||
| (%) | (%) | |||
| Tratadas | 717 (58,9) | 337 (47,0) | 83 (11,6) | 48 (6,7) |
| Testigo | 280 (69,3) | 168 (60,0) | 13 (4,6) | 7 (2,5) |
Dichos resultados muestran que, en el marco del
uso de un citoplasma receptor en interfase, el estado inicial de las
células donantes (quiescencia o proliferación) no influye
significativamente en la tasa de desarrollo de los embriones; por el
contrario, el tratamiento de las células donantes de conformidad con
la invención incrementa significativamente dicha tasa de
desarrollo.
Los blastocitos obtenidos al término de los 2
experimentos anteriores se transfirieron a vacas receptoras. Los
resultados se ilustran en la tabla III siguiente.
| Células | Número de Blastocitos | Número de gestaciones/Número de | Nacimientos | ||
| transferidos | receptoras | ||||
| D 35 | D 60 | D>90 | |||
| Tratadas | 76 | 7/50 (14,0) | 6/50 (12,0) | 6/50 (12,0) | 5 (10,0) |
| No tratadas | 13 | 3/8 (37,5) | 1/8 (12,5) | 1/8 (12,5) | 0 (0,0) |
Estos resultados confirman que el tratamiento de
las células donantes de conformidad con la invención incrementa
significativamente la tasa de obtención de embriones que pueden dar
nacimiento a animales viables.
Las células donantes son fibroblastos en
proliferación procedentes de cultivo de células de piel de fetos
bovinos o adultos. Se preparan como en el ejemplo 1. La
permeabilización se realiza mediante incubación en presencia de 15 a
20 \mug/ml de lisolecitina.
Se enuclean los ovocitos tras 22 a 24 h de
maduración in vitro, y se fusionan a 24-25h
con las células donantes en las mismas condiciones que las
descritas en el ejemplo 1. A la fusión le sigue una activación
química según un protocolo descrito por LIU et al. [Mol.
Reprod. Dev., 49, 298-307, (1998)]: inmediatamente
después de la fusión, se incuban los embriones reconstituidos en
presencia de 10 \mug/ml de cicloheximida y 5 \mug/ml de
citocalasina B en medio TCM 199 (LIFE TECHNOLOGIES, Cergy Pontoise,
Francia) durante 5 h. A continuación, se colocan los embriones en
cultivo in vitro. Se reconstituyeron embriones testigo de la
misma manera, pero sin tratamiento de las células donantes
previamente a la fusión.
Los resultados se ilustran en las tablas IV y V
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Células | Embriones | Embriones | Mórula (%) | Blastocitos (%) |
| donantes | reconstituidos (%) | separados (%) | ||
| Tratadas | 365 (53,7) | 227 (62,2) | 101 (27,7) | 88 (24,1) |
| Testigo | 438 (59,2) | 271 (61,9) | 101 (21,1) | 70 (16,0) |
| Células | Blastocitos | Gestación/rec | Gestación/rec | Gestación | Nacimientos |
| donantes | transferidos | D35 | D60 | D90 | |
| Tratadas 60 | 60 | 18/40 | 17/40 | 9/40 | 4/40 |
| (45,0) | (42,5) | (22,5) | (10,0) | ||
| Testigo 55 | 55 | 10/38 | 8/38 | 4/38 | 2/38 |
| (26,3) | (21,0) | (10,5) | (5,3) + | ||
| + : estos dos animales murieron unas horas después de nacer |
Claims (13)
- Método de tratamiento del núcleo diploide de una célula donante somática previo a su transferencia en el citoplasma de un ovocito receptor, para reconstruir in vitro un embrión de mamífero no humano, caracterizado porque incluye:a) la proteolisis preparada de las proteínas no histonas, yb) la inducción del inflamiento isomorfo de dicho núcleo.
- 2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteolisis preparada se realiza mediante la acción de una proteasa de serina.
- 3. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha proteasa es la tripsina o la quimotripsina.
- 4. Método, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el inflamiento del núcleo se induce mediante un tratamiento con un polianión elegido entre la heparina, el dextran sulfato, o los ácidos poliaspárticos de peso molecular superior a 20.000.
- 5. Método, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el núcleo tratado está contenido en la célula donante, y porque dicho tratamiento incluye la permeabilización previa de la membrana citoplásmica de dicha célula.
- 6. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque la permeabilización de la membrana citoplásmica se efectúa con la ayuda de por lo menos un agente permeabilizante elegido entre la lisolecitina, la estreptolisina, la saponina, la digitonina.
- 7. Método de reconstitución in vitro de un embrión de mamífero no humano, caracterizado porque incluye:
- -
- el tratamiento del núcleo diploide de una célula donante somática mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
- -
- la transferencia del núcleo tratado en el citoplasma de un ovocito receptor en metafase II;
- -
- la activación del embrión reconstituido.
- 8. Método de reconstitución in vitro de un embrión de mamífero no humano, caracterizado porque incluye:
- -
- el tratamiento del núcleo diploide de una célula donante somática mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
- -
- la transferencia del núcleo tratado al citoplasma de un ovocito receptor en estado de interfase.
- 9. Método, según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el núcleo de la célula donante es tratado mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y la transferencia de dicho núcleo al citoplasma receptor se efectúa mediante microinyección.
- 10. Método, según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el núcleo de la célula donante es tratado mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, y la transferencia de dicho núcleo al citoplasma receptor se efectúa mediante fusión de la célula donante y el citoplasma receptor.
- 11. Método, según la reivindicación 10, caracterizado porque la fusión se efectúa mediante choque eléctrico.
- 12. Método, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dicho mamífero no humano es un ungulado.
- 13. Método, según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho ungulado se elige entre los bovinos, ovinos, caprinos y porcinos.
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