ES2258520T3

ES2258520T3 - Procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche.

Info

Publication number: ES2258520T3
Application number: ES01900100T
Authority: ES
Inventors: Esben Skipper Sorensen; Steen Ostersen; Dereck Chatterton; Hans Henrik Holst; Kristian Albertsen
Original assignee: Arla Foods AMBA
Current assignee: Arla Foods AMBA
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2001-01-04
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2021-01-04
Also published as: EP1244702A2; US7259243B2; DE60119077D1; AU784322B2; NZ519492A; DE60119077T2; NO20023057L; CA2396519C; JP4615173B2; RU2002118313A; ATE324378T1; PT1244702E; AU2352801A; WO2001049741A3; KR20020073159A; WO2001049741A2; DK1244702T3; JP2003519239A; NO20023057D0; NO330264B1

Abstract

Un procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche, caracterizado porque se mezclan un producto lácteo que contiene osteopontina y una fuente soluble de calcio para obtener una concentración de calcio de 0, 05 a 0, 3% por % de proteína y el pH se ajusta a un pH de 3, 5 a 5, 0 para mantener la osteopontina en disolución mientras precipitan otros constituyentes de la leche.

Description

Procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche.

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche.

La osteopontina (OPN) es una glicofosfoproteína adhesiva secretada que se aisló originariamente a partir la matriz extracelular de colágeno de hueso mineralizado (Franzén A, Heinegàrd, D. 1985. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem. J. 232: 715-724). En los últimos años se ha descubierto que la osteopontina se expresa mediante varios diferentes tipos de células incluyendo los osteoblastos, células del músculo liso arterial, leucocitos, varios tipos de células epiteliales y células transformadas de diferentes linajes (Denhardt DT, Butler WT, Chambers AF, Senger DR. (eds.). 1995. Osteopontin: role in cell signalling and adhesion. Ann. N.Y. Acad. Sci., 760). Por consiguiente, la OPN se ha detectado en muchos tejidos incluyendo riñón, placenta, epitelio y ganglios secretores del oído interno, y músculo liso del sistema vascular (Butler WT, Ridall AL, McKee MD. 1996. Osteopontin. En Bilezekian JP, Rai LG, Rodan GA (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, U.S.A., pp. 167-181. Además, la OPN está presente también en muchos líquidos corporales, particularmente en el plasma, orina, bilis, y leche, y muestra una expresión elevada en muchas células transformadas (Senger DR, Peruzzi CA, Gracey CF, Papadopoulos A, Tenen DG. 1988. Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res. 48: 5770-5774). La osteopontina es sumamente ácida siendo aproximadamente el 25% de los aminoácidos aspartato/ácido aspártico y glutamato/ácido glutámico así como un número significativo de aminoácidos fosforilados (S\varnothingrensen ES, Petersen TE. 1994 Identification of two phosphorylation motifs in bovine osteopontin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 198: 200-205; S\varnothingrensen, ES, H\varnothingjrup, P, Petersen, TE. 1995. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: Identification of twenty-eight phosphorylation and three O-glycosylation sites. Protein Sci. 4: 2040-2049).

La osteopontina contiene una secuencia de unión a integrina RGD (arginina, glicina, aspartato) y puede favorecer la unión de células de diversas superficies, por ejemplo la unión de osteoblastos al hueso durante la reestructuración ósea. Además de la capacidad de unión de células, la osteopontina puede actuar como una citocina. Otros usos o papeles propuestos para la osteopontina incluyen quimiotaxia e inhibición de la expresión de la óxido nítrico sintetasa.

De esta forma, se ha propuesto la osteopontina para uso como un agente farmacéutico. El documento EP 705842 propone el uso de osteopontina en el diagnóstico, profilaxis y terapia de osteoartritis y artritis reumatoide. También se cree que la osteopontina juega un papel en potenciar el crecimiento óseo y el sanado de heridas en mamíferos, compárese por ejemplo con los documentos EP 942452 y WO 9933415. Además, se ha propuesto la osteopontina para la inhibición del óxido nítrico, compárese el documento US 5695761. La osteopontina se ha propuesto también para la solubilización de iones de metales divalentes para adición a alimentos, compárese el resumen del documento JP 9173018.

La osteopontina se ha aislado en cantidades a escala de investigación (escala de microgramos a pocos miligramos) a partir de diversos tejidos y líquidos, incluyendo hueso mineralizado. Sin embargo, existe una demanda enorme de osteopontina para experimentación, así como para uso industrial. Todos los procedimientos conocidos para aislar osteopontina son a escala experimental proporcionando cantidades demasiado pequeñas para uso industrial.

S\varnothingrensen ES, Petersen T. 1993. Journal of Dairy Research 60,189-197, Purification and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk, describe un método que implica TCA, ácido tricloroacético, precipitación de proteínas. Este método no es compatible con la producción de ingredientes alimentarios, debido a que el TCA no está permitido en productos alimentarios. Además, el método incluye la filtración en gel, que no es adecuada para la producción a gran escala.

Bayless KJ, Davis GE, Meininger GA. 1997. Protein Expression and Purification 9, 309-314, Isolation and biological properties of osteopontin from bovine milk, describe un método que incluye intercambio iónico y dos etapas de cromatografía hidrofóbica en columnas de fenil-sefarosa. La complejidad del procedimiento, y especialmente la cromatografía hidrofóbica, convierten el método en inaplicable para purificación de osteopontina a gran escala.

Senger DR, Peruzzi CA, Papadopoulos A, Tenen DG. 1989. Biochimica et Biophysica Acta 996, 43-48. Purification of a human milk protein closely similar to tumor-secreted phosphoproteins and osteopontin, propone un método de purificación. El método de purificación descrito para leche humana implica afinidad a citrato de bario así como cromatografía en fase reversa, lo que lo convierte en inaplicable para purificación a gran escala.

La presente invención resuelve los problemas anteriores. La invención describe un procedimiento para purificación o aislamiento de osteopontina a gran escala a partir de leche de animales bovinos (y leche de otros mamíferos productores de leche domesticados, por ejemplo, cabra, oveja, búfalo, lama, camello, etc.). La osteopontina de la leche es muy preferida debido a que se da de forma natural en la leche de animales domésticos. Según la invención, la osteopontina se aísla por técnicas aprobadas para la producción de derivados lácteos. Esta osteopontina de grado alimentario se puede usar por lo tanto como un ingrediente en productos alimentarios para consumo humano sin ningún riesgo.

La presente invención propone un procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche, en el que se mezclan un producto lácteo que contiene osteopontina y un producto que contiene una fuente soluble de calcio para obtener una concentración de calcio de 0,05 a 0,3% por % de proteína y el pH se ajusta a un pH de 3,5 a 5,0 para mantener la osteopontina en disolución mientras precipitan otros constituyentes de la leche.

Es posible combinar las etapas de mantener la osteopontina en disolución con una posible etapa de unirla o agregarla.

En el procedimiento de la invención la materia prima se basa preferiblemente en leche que contiene osteopontina. El suero es una buena materia prima ya que se han eliminado las proteínas de caseína contenidas en él. Es especialmente adecuado el suero que se origina a partir de la acidulación química de la leche, debido a que su osteopontina está intacta. Por otra parte, la osteopontina que contiene el suero del queso puede estar parcialmente hidrolizada. Sin embargo, no se sabe aún si ésto reduce o destruye completamente las propiedades de la osteopontina.

La separación de osteopontina a partir de proteína precipitada y desnaturalizada puede realizarse por microfiltración o centrifugación como se realiza normalmente en la industria láctea.

El tamaño de poro puede ser de 0,1 a 1,4 \mum. Los filtros cerámicos están especialmente adecuados a causa de su estabilidad mecánica y larga vida. La separación puede tener lugar a temperaturas de 10 a 80ºC. 50-55ºC es especialmente adecuada debido a su gran capacidad y condiciones bacteriológicas estables.

Se pueden usar todos los tipos de intercambiadores aniónicos. En la presente invención se usa in intercambiador de Sefarosa DEAE de flujo rápido. Durante el intercambio iónico el pH puede variar de aproximadamente 3 a aproximadamente 6.

Las etapas que implican (A) disolución o solubilización de la osteopontina y (B) agregación o unión de la osteopontina pueden combinarse en un proceso. Las corrientes de producto se pueden tratar de formas diferentes antes y/o después de estas etapas para concentrar, separar, secar o realizar otros procesos que se usan comúnmente en la industria láctea. De esta forma se puede usar, por ejemplo, la microfiltración. El experto en la técnica láctea determinará fácilmente un filtro apropiado, compárese por ejemplo Tetra Paks "Dairy processing Handbook" (1995), páginas 123 132.

Normalmente se prefiere concentrar el suero antes de comenzar el procedimiento de la invención para reducir la cantidad de agua a tratar. Para la preconcentración de suero se puede usar cualquier sistema convencional de ultrafiltración: placa y marco; fibra hueca, tubular, cerámica y espiral, etc. Los sistemas espirales son especialmente adecuados hasta el momento desde un punto de vista económico. Cualquier membrana que no permita a la osteopontina pasar a través de ella es adecuada. El tamaño de poro de tales membranas es de 20.000 D o menor. Membranas adecuadas son, por ejemplo, Koch HFK131, Desal PW o membranas similares.

La fuente soluble de Ca puede ser cualquier compuesto soluble de calcio, como hidróxido de calcio, cloruro de calcio o acetato de calcio. También son usables el nitrito de calcio y el nitrato de calcio, pero normalmente no se recomendarán si la osteopontina es para usarse en la industria alimentaria.

Para agregar o unir osteopontina a una fuente insoluble de calcio según el procedimiento de la reivindicación 10, se puede hacer uso de Ca_{3}PO_{4} u otra fuente insoluble de calcio. El ajuste del pH para precipitar fosfato de calcio u otra sal insoluble con la osteopontina puede estar dentro del intervalo de 6,0-8,5. El intervalo de pH de 6,5-8,0 es especialmente adecuado. Especialmente, es adecuado un pH de aproximadamente 7,0. Se puede usar cualquier base: orgánica así como inorgánica, como agente ajustador del pH en este procedimiento. Son especialmente adecuadas las bases NaOH, KOH, Ca(OH)_{2}. Es especialmente apropiado el NaOH.

El ajuste de pH para mantener la osteopontina en disolución es de 3,5 a 5,0, preferentemente 4,0-4,6. El pH de 4,2 es el más preferido. Para el ajuste del pH se puede usar cualquier ácido orgánico o inorgánico. El ácido clorhídrico es especialmente apropiado debido a su fuerza y precio. Si la leche materia prima que contiene osteopontina contiene también calcio natural de la leche se debe añadir menos calcio o nada de calcio en absoluto. Además, el uso de Ca(OH)_{2} para el ajuste del pH puede minimizar la cantidad de otra fuente de calcio. Normalmente una cantidad adecuada será una en la que la concentración de calcio en disolución sea 0,2%. No existe límite inferior, pero menos de aproximadamente 0,05% por % de proteína dará un rendimiento reducido de osteopontina. 0,1% de calcio será eficaz, pero el rendimiento de osteopontina es reducido comparado con el uso de 0,2% de calcio. Se han probado concentraciones de calcio por encima de 0,4%. Sin embargo se obtienen sólo pequeños incrementos para concentraciones por encima de 0,2%. Por lo tanto se prefiere 0,2%, pero también se podría usar 0,3%.

La separación del fosfato de calcio precipitado u otra fuente sólida de calcio que contiene osteopontina del resto se puede realizar por cualquier método habitual, como microfiltración y centrifugación. El tamaño de poro puede ser de 0,1 a 1,4 \mum. Los filtros cerámicos son especialmente adecuados debido a su estabilidad mecánica y larga vida. La separación puede tener lugar a temperaturas de 10 a 80ºC. 50-55ºC son especialmente apropiadas a causa de su gran capacidad y condiciones bacteriológicas estables.

Para la separación de osteopontina de sales de calcio disueltas se puede usar cualquier sistema de ultrafiltración: placa y marco; fibra hueca, tubular, cerámica y espiral, etc. Los sistemas espirales son especialmente adecuados hasta el momento desde un punto de vista económico. Se puede usar cualquier membrana que no permita a la osteopontina pasar a través de la membrana. El tamaño nominal de poro de tales membranas es por regla general de 20.000 D o menor. Membranas adecuadas son, por ejemplo, Koch HFK328, Desal PV o membranas similares. Se pueden usar todos los tipos de intercambiadores aniónicos. En la presente invención se usó un intercambiador de Sefarosa DEAE de flujo rápido.

Durante el intercambio iónico el pH puede variar de aproximadamente 3 a aproximadamente 6.

La filtración Germ de concentrado de proteína del suero, WPC, retenido antes del ajuste del pH a 7,0 para precipitar el Ca_{3}PO_{4} u otro sólido con osteopontina produce un agregado más puro, que dará también un producto más puro para procesamiento adicional en el procedimiento y de esta forma productos de osteopontina un poco más puros.

Ejemplo 1

(Sólo para ilustración)

1.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,55, 0,53% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,50% de materia seca se concentraron en una planta de ultrafiltración espiral con membranas que tenían un tamaño nominal de poro para que las proteínas no pasaran a través de la membrana. El tamaño nominal de poro típico era de 10.000 D. La temperatura durante la filtración era de 50ºC y la presión media era 3,5 bares. La concentración se realizó hasta que se eliminaron 900 kg de permeado, que no contenía osteopontina. Durante la concentración el flujo medio fue de 45,6 litros/m^{2}/h. Quedaron 100 kg de retenido con un pH de 4,55, 3,86% de proteína, aproximadamente 200 ppm de osteopontina (0,02%) y 10,3% de materia seca.

Los 100 kg de retenido se pasteurizaron a 68ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 2 horas, se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 0,2 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 310 litros/m^{2}/h.

A partir de la microfiltración se recogieron 20,0 kg de retenido y se enfriaron a 8ºC en agua con hielo, con un pH de 7,0, 0,58% de proteína, aproximadamente 1.000 ppm de osteopontina (0,1%) y 4,1% de materia seca. El retenido se secó por pulverización en un secador de torre NIRO y se obtuvieron 0,7 kg de polvo con 13,6% de proteína, aproximadamente 2,3% de osteopontina, y 96,4% de materia seca. La materia seca consistía en 80% de cenizas, 27% de calcio y 13,8% de fósforo.

Ejemplo 2

(Sólo para ilustración)

2.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,55, 0,55% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,53% de materia seca se concentraron en una planta de UF espiral con membranas que tenían un tamaño nominal de poro para que las proteínas no pasaran a través de la membrana. El tamaño nominal de poro típico era de 10.000 D. La temperatura durante la filtración era de 12ºC y la presión media era 3,5 bares. La concentración se realizó hasta que se eliminaron 1.800 kg de permeado, que no contenía osteopontina. Durante la concentración el flujo medio fue de 27,6 litros/m^{2}/h. Quedaron 200 kg de retenido con un pH de 4,55, 3,97% de proteína, aproximadamente 200 ppm de osteopontina (0,02%) y 10,4% de materia seca.

Los 200 kg de retenido se pasteurizaron a 68ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 30 min., se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 0,2 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 310 litros/m^{2}/h. A partir de la microfiltración se recogieron 20,0 kg de retenido y se enfriaron a 8ºC en agua con hielo, con un pH de 7,0, 1,25% de proteína, aproximadamente 2.000 ppm de osteopontina (0,2%) y 8,3% de materia seca.

Se ajustó el pH del retenido a 3,0 con ácido clorhídrico al 28%, lo que produjo una disolución casi clara.

Esta disolución con el pH ajustado a 3,0 se ultrafiltró a 10ºC y la presión media a 4,0 bares en una membrana con un valor de corte de 5.000 D. El retenido se diafiltró con agua desmineralizada hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 0,1 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 17,8 litros/m^{2}/h. Se recogieron 10 kg de retenido con 2,42% de proteína, aproximadamente 4.000 ppm de osteopontina (0,4%) y 2,6% de materia seca.

El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 0,2 kg de polvo con 89,6% de proteína, aproximadamente 14,8% de osteopontina, y 96,4% de materia seca.

Ejemplo 3

(Sólo para ilustración)

1.000 kg de suero de caseína preconcentrado con un pH de 4,55, 3,76% de proteína, aproximadamente 200 ppm de osteopontina (0,02%) y 10,3% de materia seca se pasteurizaron a 67ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 60 min., se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 2,8 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 325 litros/m^{2}/h.

100 kg de retenido de la microfiltración con un pH de 7,0, 1,22% de proteína, aproximadamente 2.000 ppm de osteopontina (0,2%) y 8,3% de materia seca se recogieron y se enfriaron a 5ºC en una placa intercambiadora de calor.

Se ajustó el pH del retenido a 3,0 con ácido clorhídrico al 28%, lo que produjo una disolución casi clara. Esta disolución con el pH ajustado a 3,0 se ultrafiltró a 10ºC y la presión media a 4,0 bares en una membrana con un valor de corte de 5.000 D. El retenido se diafiltró con agua desmineralizada hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Entonces se realizó la diafiltración con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5 hasta que el pH fue de 4,5 en el retenido. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 15,9 litros/m^{2}/h. Se recogieron 10 kg de retenido con 12,1% de proteína, aproximadamente 20.000 ppm de osteopontina (2,0%) y 13,4% de materia seca.

El retenido se bombeó a través de una columna con un intercambiador aniónico que se equilibró con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5. De esta forma la osteopontina se unió a la columna mientras que la mayor parte de las otras proteínas del suero no se unieron. La columna se lavó con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0.

La osteopontina se eluyó del intercambiador aniónico con KH_{2}PO_{4} 0,7 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0, y se recogieron 5 litros de eluato que contenían 500 g de proteína de los cuales 40% eran osteopontina. El eluato se concentró y se diafiltró para eliminar sales en membranas de ultrafiltración que tenían un tamaño de poro de 5.000 D, a 10ºC y la presión media a 4,0 bares. Se recogieron 5,0 kg de retenido con 10,7% de materia seca, aproximadamente 4% de osteopontina y 9,6% de proteína. El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 0,5 kg de polvo con 86,0% de proteína, aproximadamente 36% de osteopontina, y 95,8% de materia seca.

Ejemplo 4

(Sólo para ilustración)

1.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,56, 0,52% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,50% de materia seca se pasteurizaron a 71ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 2 horas, se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 1,4 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 520 litros/m^{2}/h.

30,0 kg de retenido de la microfiltración con un pH de 7,0, 0,78% de proteína, aproximadamente 670 ppm de osteopontina (0,07%) y 16,1% de materia seca se recogieron y se enfriaron a 8ºC en agua con hielo. El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 4,5 kg de polvo con 4,7% de proteína, aproximadamente 0,4% de osteopontina y 96,4% de materia seca. La materia seca consistía en 85% de cenizas, 27% de calcio y 13,8% de fósforo.

Ejemplo 5

(Sólo para ilustración)

5.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,56, 0,51% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,50% de materia seca se pasteurizaron a 69ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 2 horas, se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 1,4 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 550 litros/m^{2}/h.

150 kg de retenido de la microfiltración con un pH de 7,0, 0,73% de proteína, aproximadamente 670 ppm de osteopontina (0,07%) y 16,4% de materia seca se recogieron y se enfriaron a 8ºC en agua con hielo.

Se ajustó el pH del retenido a 3,0 con ácido clorhídrico al 28%, lo que produjo una disolución casi clara. Esta disolución con el pH ajustado a 3,0 se ultrafiltró a 10ºC y la presión media a 4,0 bares en una membrana con un valor de corte de 10.000 D. El retenido se diafiltró con agua desmineralizada hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 25,3 litros/m^{2}/h. Se recogieron 10 kg de retenido con 11,0% de proteína, aproximadamente 10.000 ppm de osteopontina (1,0%) y 12,6% de materia seca.

El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 1,1 kg de polvo con 83,8% de proteína, aproximadamente 7,6% de osteopontina y 96,2% de materia seca.

Ejemplo 6

(Sólo para ilustración)

10.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,56, 0,54% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,50% de materia seca se pasteurizaron a 69ºC durante 15 seg. y se enfriaron a 50ºC. Después de esto el pH se ajustó a 7,0 con NaOH al 6%.

Después de dejarse estar durante 2 horas, se realizó la microfiltración en membranas de cerámica de 2,8 m^{2} y 1,4 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 7,0 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 570 litros/m^{2}/h.

300 kg de retenido de la microfiltración con un pH de 7,0, 0,76% de proteína, aproximadamente 670 ppm de osteopontina (0,07%) y 16,3% de materia seca se recogieron y se enfriaron a 8ºC en agua con hielo.

Se ajustó el pH del retenido a 3,0 con ácido clorhídrico al 28%, lo que produjo una disolución casi clara. Esta disolución con el pH ajustado a 3,0 se ultrafiltró a 10ºC y la presión media a 4,0 bares en una membrana con un valor de corte de 10.000 D. El retenido se diafiltró con agua desmineralizada hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 24,6 litros/m^{2}/h. Se recogieron 20 kg de retenido con 10,8% de proteína, aproximadamente 10.000 ppm de osteopontina (1,0%) y 12,3% de materia seca.

El retenido se bombeó a través de una columna con un intercambiador aniónico que se equilibró con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5. De esta forma la osteopontina se retuvo en la columna mientras que parte principal de las otras proteínas del suero no se retuvieron. La columna se lavó con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0.

La osteopontina se eluyó del intercambiador aniónico con KH_{2}PO_{4} 0,7 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0, y se recogieron 50 litros de eluato que contenían 560 g de proteína de los cuales 36% eran osteopontina. El eluato se concentró y se diafiltró para eliminar sales en membranas de ultrafiltración que tenían un tamaño de poro de 5.000 D, a 10ºC y la presión media a 4,0 bares. Se recogieron 5 kg de retenido con 12,3% de materia seca, aproximadamente 4% de osteopontina y 11,2% de proteína. El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 0,6 kg de polvo con 87,6% de proteína, aproximadamente 31% de osteopontina, y 96,2% de materia seca.

Ejemplo 7

10.000 kg de suero de caseína con un pH de 4,53, 0,55% de proteína, aproximadamente 20 ppm de osteopontina (0,002%) y 4,50% de materia seca se ultra/diafiltraron en una planta de UF espiral con membranas que tenían un tamaño nominal de poro para que las proteínas no pasaran a través de la membrana. El tamaño de poro típico era de 20.000 D. La temperatura durante la filtración era de 15ºC y la presión media era 3,5 bares. Una vez que la filtración hubo terminado, se recogieron 152 kg de retenido con un pH de 4,54, 23,1% de proteína, aproximadamente 1.300 ppm de osteopontina (0,13%) y 28,7% de materia seca. Durante la concentración el flujo medio fue de 25,6 litros/m^{2}/h. Los152 kg de retenido se diluyeron con 722 kg de agua desmineralizada de forma que el contenido de proteína fuera 4,0%. El pH se ajustó a 7,4 con NaOH al 6%. Entonces se realizaron un tratamiento térmico a 85ºC durante 30 minutos y un enfriamiento a 8ºC. Se añadieron 6,4 kg de CaCl_{2} 2H_{2}O al retenido tratado térmicamente y se ajustó el pH a 4,2 con ácido clorhídrico al 6%.

Después de dejarse estar durante al menos 2 horas (o hasta el día siguiente), se realizó un calentamiento a 50ºC y se llevó a cabo la microfiltración en membranas de cerámica de 1,4 m^{2} y 0,8 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 4,2 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante la filtración el flujo medio fue de 415 litros/m^{2}/h. Se recogieron un total d 2.000 litros de permeado que habían sido enfriados continuamente a 8ºC sobre una placa intercambiadora de calor (PVV), con un pH de 4,2, 0,16% de proteína, aproximadamente 100 ppm de osteopontina (0,01%) y 4,1% de materia seca.

Se ajustó el pH del permeado procedente de la microfiltración a 6,6 con NaOH al 6% y se ultra/diafiltró en una planta de UF espiral a 10ºC con una presión media de 4,0 bares hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 500 \muS. Se realizó una filtración con membranas que tenían un tamaño de poro de 5.000 D. Se recogieron 40 kg de retenido con un pH de 6,5, 7,9% de proteína, aproximadamente 5.000 ppm de osteopontina (0,5%) y 9,6% de materia seca.

El retenido se secó por pulverización en un secador de torre NIRO y se obtuvieron 3,5 kg de polvo con 79,2% de proteína, aproximadamente 5,0% de osteopontina, y 96,2% de materia seca.

Ejemplo 8

200 kg de retenido de suero de caseína con un pH de 4,55, 23,2% de proteína, aproximadamente 1.300 ppm de osteopontina (0,13%) y 29,1% de materia seca se diluyeron con 1.000 kg de agua desmineralizada y se ajustó el pH a 7,4 con NaOH al 6%. Entonces se llevó a cabo un tratamiento térmico a 85ºC durante 30 min. y se realizó un enfriamiento a 8ºC. Se añadieron 8,8 kg de CaCl_{2} 2H_{2}O al retenido tratado térmicamente; y el pH se ajustó a 4,1 con ácido clorhídrico al 6%.

Después de dejarse estar durante al menos 2 horas (o hasta el día siguiente), se realizó un calentamiento a 50ºC y se llevó a cabo la microfiltración en membranas de cerámica de 2,8 m^{2} y 0,8 \mum a 50ºC con una presión media de 4,0 bares. La diafiltración se realizó con agua desmineralizada caliente a 50ºC y un pH ajustado a 4,1 hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 100 \muS. Durante toda la filtración el flujo medio fue de 445 litros/m^{2}/h. Se recogieron un total d 2.800 litros de permeado que habían sido enfriados a 8ºC sobre una placa intercambiadora de calor (PVV), con un pH de 4,1, 0,16% de proteína, aproximadamente 100 ppm de osteopontina (0,01%) y 4,0% de materia seca.

Se ajustó el pH del permeado procedente de la microfiltración a 6,6 con NaOH al 6% y se ultra/diafiltró en una plante de UF espiral a 10ºC con una presión media de 4,0 bares hasta que la conductividad en el permeado estuvo por debajo de 500 \muS. Se realizó una filtración con membranas que tenían un tamaño de poro de 5.000 D. Se recogieron 40 kg de retenido con un pH de 6,5, 11,2% de proteína, aproximadamente 6.500 ppm de osteopontina (0,65%) y 12,4% de materia seca.

El retenido se bombeó a través de una columna con un intercambiador aniónico que se equilibró con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5. De esta forma la osteopontina se retuvo en la columna mientras que parte principal de las otras proteínas no se retuvieron. La columna se lavó con KH_{2}PO_{4} 0,45 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0.

La osteopontina se eluyó del intercambiador aniónico con KH_{2}PO_{4} 0,7 M con un pH = 4,5 hasta que la absorción a 280 nm fue 0, y se recogieron 50 litros de eluato que contenían 500 g de proteína de los cuales 50% eran osteopontina. El eluato se concentró y se diafiltró para eliminar sales en membranas de ultrafiltración que tenían un tamaño de poro de 5.000 D, a 10ºC y la presión media a 4,0 bares. Se recogieron 5 kg de retenido con 10,7% de materia seca, aproximadamente 5% de osteopontina y 9,6% de proteína. El retenido se secó por pulverización en secador de torre NIRO y se obtuvieron 0,5 kg de polvo con 86,0% de proteína, aproximadamente 45% de osteopontina y 95,8% de materia seca.

Claims

1. Un procedimiento para el aislamiento de osteopontina a partir de leche, caracterizado porque se mezclan un producto lácteo que contiene osteopontina y una fuente soluble de calcio para obtener una concentración de calcio de 0,05 a 0,3% por % de proteína y el pH se ajusta a un pH de 3,5 a 5,0 para mantener la osteopontina en disolución mientras precipitan otros constituyentes de la leche.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el pH se ajusta a un pH de 4,0 a 4,6.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el pH se ajusta a un pH de
4,2.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente soluble de calcio es cloruro de calcio.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el producto lácteo que contiene osteopontina es un producto sérico.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el producto lácteo que contiene osteopontina es un producto sérico concentrado.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el producto lácteo que contiene osteopontina es un producto sérico de la acidulación química de la leche.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el producto de la leche que contiene osteopontina y el producto que contiene calcio se mezclan de forma que la concentración de calcio es 0,2%.

9. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento se realiza por etapas.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque al menos una etapa implica la mezcla del producto lácteo con una sal soluble de Ca y pH de 3,5 a 5,0 y al menos otra etapa implica la mezcla del producto lácteo con una sal insoluble de calcio y el ajuste del pH a un pH de neutro a básico para unir o agregar la osteopontina mientras se precipita ésta, sin precipitar la parte principal de los otros constituyentes de la leche.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el pH se ajusta a un pH de 6,0 a 8,5.

12. Un procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el pH se ajusta a un pH de 6,5 a 8,0.

13. Un procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el pH se ajusta a un pH de 7.