ES2258619T3 - Peptidos supersegregables, procedimientos para su produccion, y mejora paralela de la forma secretada de uno o mas de otros polipeptidos. - Google Patents
Peptidos supersegregables, procedimientos para su produccion, y mejora paralela de la forma secretada de uno o mas de otros polipeptidos.Info
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Abstract
Una molécula de DNA de la forma: PX¿SX¿Bn¿(ZR)¿péptido de transporte¿(Z1Z2)¿proteína (Y)¿(Z1Z2)¿proteína (Ym)¿T; donde la molécula de DNA codifica un péptido de transporte unido por medio de una secuencia Z1Z2 a una segunda proteína que a su vez está unida por medio de Z1Z2 a una proteína Y1 que o bien corresponde a Y o puede ser diferente de Y y el péptido de transporte mejora la tasa de secreción de Y y/o Ym, donde PX es cualquier secuencia de DNA promotora, seleccionada de tal modo que se pueden conseguir rendimientos óptimos de la proteína de interés; SX es cualquier DNA que, en consecuencia, codifica cualquier secuencia señal o líder que permite rendimientos óptimos; Bn es 1-15 aminoácidos codificables genéticamente o un enlace químico; Z es el codón de un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg; Z1 es el codón de un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg; Z2 es el codón de un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg; la proteínaYm es una secuencia de DNA que codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por una levadura (m = 1-5) o es un enlace químico (m = 0); R es un codón de arginina; el péptido de transporte es una secuencia de DNA que codifica hirudina o un derivado de hirudina; la proteína Y es una secuencia de DNA que codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por una levadura y cuya actividad biológica, cuando Ym no es un enlace químico, no está impedida por una extensión de un dipéptido básico o permite la degradación de la extensión por las carboxipeptidasas; T es una secuencia de DNA sin traducir ventajosa para la expresión.
Description
Péptidos supersegregables, procedimientos para
su producción, y mejora paralela de la forma secretada de uno o más
de otros polipéptidos.
Uso de péptidos supersegregables en
procedimientos para su producción y para la mejora en paralelo de
las formas exportadas de uno o más de otros péptidos de interés
Con vistas a la viabilidad económica, los
procedimientos para la producción de proteínas farmacéuticamente
relevantes deben llevar a productos biológicamente activos de la más
alta pureza posible. La expresión de tales proteínas relevantes en
levaduras es ampliamente usada aquí. La producción de proteínas
tales como insulina, GM-CSF (Leukine®) e hirudina
(Refludan®) es un ejemplo del desarrollo satisfactorio de los
procedimientos de ingeniería genética que se basan en la síntesis de
la particular proteína o de sus precursores en una levadura.
Generalmente, las levaduras pueden sintetizar directamente
particularmente hirudinas con buenos rendimientos que están en la
escala de los gramos cuando se usa Hansenula polymorpha
(Weydemann et al., Appl. Microbiol Biotechnol. 44:
377-385, 1995) o Pichia pastoris (Rosenfeld
et al., Protein Expr. Purif. 4: 476-82,
1996).
El documento EP-A 0 324 712
describe el derivado de hirudina (Refludan®) cuyo aminoácido en el N
terminal es leucina y su expresión constitutiva en la cepa Y79 de
Saccharomyces cerevisiae. El documento EP-A 0
347 781 describe una mini-proinsulina, y a modo de
ejemplo, su expresión en la levadura de cerveza. El Refludan y la
insulina se producen llevando a cabo dos expresiones separadas.
Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que
los derivados de hirudina y los derivados de
mini-proinsulina se pueden obtener a partir de una
proteína precursora común, por la fusión de la proteína precursora a
una secuencia señal o líder, que es reconocida por las levaduras
como una señal de secreción, a través de un dipéptido básico,
preferiblemente Lys-Arg, y asimismo por la
introducción, entre el derivado de hirudina del N terminal y el
derivado de mini-proinsulina, de un sitio de
escisión que es reconocido por una endoproteasa de levadura. También
aquí, se da preferencia a un dipéptido básico, por ejemplo
Lys-Arg. Después de la expresión, se encuentran en
el sobrenadante un derivado de hirudina extendido con
Lys-Arg y el derivado de
mini-proinsulina que empieza con el primer
aminoácido de la cadena B de insulina. Sorprendentemente, se ha
encontrado aquí que el rendimiento de
mini-proinsulina mejora marcadamente en comparación
con el rendimiento alcanzable por la expresión de
mini-proinsulina por señal directa, mientras que el
rendimiento del derivado de hirudina permanece casi el mismo.
Sorprendentemente, la hirudina actúa de este modo como un tipo de
péptido potenciador con respecto al rendimiento de la mini-
proinsulina.
proinsulina.
Los péptidos que pueden actuar como proteínas
potenciadoras son usualmente los que son relativamente pequeños y
que se segregan naturalmente en grandes cantidades durante un corto
periodo de tiempo, por ejemplo, a partir del tejido glandular. Los
péptidos de este tipo, que incluyen por ejemplo, el veneno de
serpiente o eglin C o TAP (péptido anticoagulante de garrapatas), se
distinguen por una compatibilidad de exportación extremadamente
buena. La invención se refiere también a tales proteínas.
Otra ventaja puede resultar del derivado de
hirudina que tiene iguales o mejores propiedades farmacéuticas en
comparación con la hirudina que ya se usa en los productos
farmacéuticos. En este caso, se hace posible producir dos o incluso
más productos farmacéuticos a partir de uno y la misma fermentación.
Como consecuencia, se requiere menos capacidad de fermentación. Esto
es directamente beneficioso para los costes de producción.
Sin embargo, la producción de una pluralidad de
productos es opcional. La cantidad que se necesita de Refludan, por
ejemplo, es menor que la de insulina, y esto puede dar como
resultado procedimientos en los que se desprecia una de las
sustancias farmacéuticamente interesantes.
Para mejorar el rendimiento, es posible, como se
indica en la solicitud de patente EP-A 0 200 655,
colocar una secuencia peptídica corta a través de
Lys-Arg N-terminalmente enfrente del
derivado de hirudina, como un conector con la secuencia señal o
líder. Es también obvio para un trabajador experto que la elección
de la secuencia señal o líder afecta directamente al rendimiento de
la proteína de interés. La selección de tal secuencia es el objeto
de posteriores optimizaciones. La secuencia localizada en el extremo
3' de la casete de expresión, también afecta directamente al
rendimiento por influir en la estabilidad del mRNA. También aquí, es
obvio para un trabajador experto que dicha secuencia puede ser
optimizada para cada proteína de interés a ser expresada. Esto es
también así para la elección de un promotor adecuado, que puede ser
inducible o constitutivamente activo. La elección del sistema vector
y del sistema hospedante es igualmente importante para el
rendimiento. Por tanto, en lugar de levadura de cerveza que se ha
usado a modo de ejemplo, es posible también usar las levaduras
Pichia pastoris, Hansenula polymorpha o K. lactis
junto con vectores o casetes de expresión que han sido optimizados
en cada caso para la diferente
fisiología.
fisiología.
Otra ventaja de los procedimientos que permiten
la secreción en el medio es el tratamiento químico proteínico más
simple de la proteína de interés. Sorprendentemente, se ha
encontrado que se puede concentrar la
mini-proinsulina en presencia de hirudina por
filtración a través de membranas que tienen un límite de exclusión
para las moléculas con un peso molecular mayor que 10 kDa. Las
moléculas se encuentran casi exclusivamente en el retenido. Es obvio
para un trabajador experto que el desarrollo de las nuevas técnicas
de separación y nuevas combinaciones de etapas del procedimiento
siempre hacen posible mejorar los procedimientos de purificación.
Esto es directamente beneficioso para el rendimiento y por tanto
para los costes de producción.
En Thim et al. 1986 : Secretrion
and processing of insulin precursors in yeast. PNAS, 83:
6766-6770 y el documento US 5677172 la secuencia
conductora del factor de apareamiento \alpha1 de levaduras y la
hsp150 de S. Cerevisiae, respectivamente, se describen como
péptidos que refuerzan la expresión y secreción de genes
heterólogos.
La invención se refiere, por tanto, a una
molécula de DNA (término alternativo: casete de expresión) de la
forma:
P_{X}-S_{X}-B_{n}-(ZR) -
\text{péptido de transporte} - (Z_{1}Z_{2}) - \text{proteína}\ (Y) -
(Z_{1}Z_{2}) - \text{proteína}\ (Y_{m}) -
T;
donde la casete de expresión
codifica un péptido de transporte unido por medio de una secuencia
Z_{1}Z_{2} a una segunda proteína que a su vez se une por medio
de Z_{1}Z_{2} a una proteína Y1 que o bien corresponde a Y o
puede ser diferente de Y y el péptido de transporte mejora la tasa
de secreción de Y y/o Y_{m},
donde
P_{X} es cualquier secuencia de DNA promotora,
seleccionada de tal modo que se pueden conseguir rendimientos
óptimos de la proteína de interés;
S_{X} es cualquier DNA que, en consecuencia,
codifica cualquier secuencia señal o líder que permite rendimientos
óptimos;
B_{n} es 1-15 aminoácidos
codificados genéticamente o un enlace químico;
Z es el codón de un aminoácido seleccionado del
grupo que comprende Lys y Arg;
Z_{1} es el codón de un aminoácido
seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg;
Z_{2} es el codón de un aminoácido
seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg;
R es un codón Arg;
el péptido de transporte es una secuencia de DNA
que codifica hirudina o un derivado de hirudina;
la proteína Y es una secuencia de DNA que
codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por
una levadura;
la proteína Y_{m} es una secuencia de DNA que
codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por
una levadura (m = 1-5) o es un enlace químico (m =
0);
T es una secuencia de DNA sin traducir ventajosa
para la expresión.
Otra realización de la invención es una proteína
de fusión codificada por cualquiera de las moléculas de DNA
mencionadas antes.
Una realización más de la invención es un vector
de copia múltiple y un plásmido que comprende la molécula de DNA
mencionada antes.
Una realización adicional de la invención es una
célula hospedante que comprende la molécula de DNA mencionada antes,
o el vector de copia múltiple mencionado antes o el plásmido
mencionado antes, como una parte de su cromosoma, como una parte de
un mini-cromosoma, o
extra-cromosómicamente, donde preferiblemente dicha
célula hospedante es una levadura, en particular seleccionada del
grupo constituido por S. cerevisiae, K. lactis, H. polimorpha y
P. pastoris.
Otra realización de la invención es un
procedimiento para fermentar las proteínas mencionadas antes, en el
cual
(a) la molécula de DNA mencionada antes, el
vector de copia múltiple mencionado antes, o el plásmido mencionado
antes, se expresan en una célula hospedante mencionada antes, y
(b) las proteínas expresadas se aislan del
sobrenadante del cultivo celular,
donde en particular después de
completar la fermentación, se ajusta el pH a 2,5-3,5
para precipitar las proteínas no deseadas y las proteínas expresadas
se aislan del sobrenadante de la
precipitación.
Otra realización de la invención es el
procedimiento mencionado antes, en cuyo procedimiento después de
separar el sobrenadante de la fermentación de las células
hospedantes, las células hospedantes se cultivan repetidamente en
medio fresco, y la proteína de fusión liberada se aislan de cada
sobrenadante obtenido durante el cultivo.
Otra realización de la invención es el
procedimiento mencionado antes, donde una etapa del procedimiento
para concentrar la proteína expresada en el sobrenadante después de
la precipitación se selecciona de un grupo que comprende
microfiltración, cromatografía de interacción hidrófoba y
cromatografía de cambio iónico.
Una realización adicional de la invención es un
procedimiento para preparar insulina, en el cual
(a) la proinsulina se expresa como la proteína
(Y) de la casete de expresión mencionada antes, en el procedimiento
mencionado antes;
(b) la proinsulina de la etapa (a) se aisla y se
trata con tripsina y carboxipeptidasa B; y
(c) la insulina se aisla de la mezcla de
reacción de la etapa (b).
en particular, donde el péptido de
transporte es hirudina o un derivado de hirudina que se destruye o
inactiva biológicamente después de la etapa (a) o
(b).
Una realización adicional de la invención es una
proteína donde la proteína es un derivado de hirudina con dos restos
aminoácidos básicos en su extremo del C terminal.
Las sanguijuelas del tipo Hirudo han
desarrollado, por ejemplo, diferentes isoformas del inhibidor de la
trombina, hirudina. La hirudina ha sido optimizada para los
requerimientos farmacéuticos por una variación artificial de la
molécula, por ejemplo cambio del aminoácido del N terminal (por
ejemplo EP-A 0 324 712). La invención incluye el uso
de hirudina y variantes de hirudina. Realizaciones particulares de
la invención usan una de las isoformas de la hirudina natural (las
isoformas naturales se denominan en conjunto "hirudina"). Una
isoforma natural es, por ejemplo,
Val-Val-hirudina o
Ile-Thr-hirudina. Otras
realizaciones de la invención usan una variante de una isoforma de
hirudina natural. Una variante se deriva de una isoforma de hirudina
natural pero contiene, por ejemplo, aminoácidos adicionales y/o
deleciones de aminoácidos y/o cambios de aminoácidos en comparación
con la isoforma natural. Una variante de hirudina puede contener
segmentos peptídicos alternantes de isoformas de hirudina natural y
nuevos aminoácidos. Las variantes de hirudina son conocidas y están
descritas, por ejemplo, en el documento DE 3 430 556. Las variantes
de hirudina están comercialmente disponibles en la forma de
proteínas (Calbiochem Biochemicals, Cat. no.
377-853, -950-960). El término
"derivado de hirudina" indica secuencias que tienen como mínimo
40% de homología con la hirudina natural.
La casete de expresión se introduce
preferiblemente en levaduras tales como S. cerevisiae, K. lactis,
H. polimorpha o P. pastoris. Dicha casete de expresión puede
tener una o más copias integradas establemente en el particular
genoma de la levadura o pueden estar presentes extracromosómicamente
sobre un vector de copia múltiple. Es obvio para un trabajador
experto que esta técnica es también aplicable a otros sistemas tales
como cultivos de células animales o células vegetales. Éste es
también un objeto de la invención.
El sistema de expresión descrito más adelante
sirve como un ejemplo. Es obvio para un trabajador experto que, para
introducir la casete de expresión en dicho sistema seleccionado, se
deben preparar las construcciones de DNA recombinante apropiadas
dependiendo del tipo de sistema hospedante seleccionado. Por tanto,
la fermentación industrial se puede optimizar en relación con el
sistema seleccionado hospedante/vector. Por consiguiente, los
ejemplos no son restrictivos.
Ejemplo
1
Los materiales de partida son los plásmidos
pK152 (PCT/EP00/08537), pSW3 (EP-A 0 347 781) y el
derivado recombinante de plásmido de levadura que codifica la
interleuquina 2 bovina (Price et al. Gene 55, 1987). El
plásmido de levadura se distingue por el hecho de llevar la
secuencia líder con factor \alpha bajo el control del promotor
ADH2 de levaduras. Esta secuencia va seguida por la secuencia de
cDNA de la interleuquina 2 bovina que se conecta a través de un
sitio de reconocimiento de la enzima de restricción KpnI y que
contiene, después de manipulación, un sitio de reconocimiento de la
enzima de restricción NcoI en el extremo 3' no traducido que es
único en el vector. Por tanto, la secuencia de cDNA se puede separar
fácilmente del plásmido a través de la escisión con KpnI/NcoI.
Puesto que se han informado buenos rendimientos de expresión, se
puede dar por hecho que la restante secuencia en 3' de la
interleuquina 2 (como T) tiene un efecto estabilizador sobre el mRNA
y por tanto no necesita ser eliminada o reemplazada por una
secuencia de terminación de las levaduras. El plásmido pK152 lleva
la secuencia de DNA que codifica la Leu-hirudina
(Refludan) y el plásmido pSW3 lleva la secuencia de DNA que
codifica la miniproinsulina. Se prepara primero la secuencia génica
que codifica hirudina-Lys
Arg-mini-proinsulina por medio de
tecnología de PCR. Para este propósito, se preparan 4 cebadores con
la ayuda del sistema de síntesis de DNA
Expedite™:
Expedite™:
El cebador hir_insfkr describe la unión entre
los codones de los aminoácidos terminales de hirudina (59 - 65) y la
secuencia B1 - B7 de insulina a través del conector
Lys-Arg. El cebador hir_insrevkr es 100%
complementario con el anterior. El cebador hirf1 codifica el
comienzo del gen de la hirudina que se extiende hasta el sitio de
escisión con Kpnl como se describe en el documento
EP-A 0 324 712. El cebador insncoirev marca el
extremo 3' de la mini-proinsulina sintética según el
documento EP-A 0 347 781. Se realizan dos reacciones
estándar en cadena de la polimerasa usando los pares de cebadores
hirf1/hir_insrevkr con el DNA del plásmido pK152 como molde y
hir_insfkr/insncoirev con el DNA del plásmido pSW3 como molde. Las
reacciones se llevan a cabo en 100 \mul de tampón de la PCR con
200 nmol de cebador, 1 \mul de polimerasa y 100 ng del vector, en
cada caso. La etapa 1 es una incubación de 2 minutos a 95ºC. Esto va
seguido después por 25 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a
55ºC y 30 segundos a 72ºC. El último ciclo va seguido por una
incubación a 72ºC durante 3 minutos, y a continuación se para
la
reacción.
reacción.
Puesto que los cebadores hir_insrevkr y hir_
insfkr son 100% complementarios, los productos de DNA de los dos
productos se solapan según dicha secuencia de modo que en una
tercera reacción, que usa los productos de las dos primeras
reacciones como moldes y los cebadores hirf1 e insncoirev, se forma
un fragmento de DNA, que codifica la hirudina y la
mini-proinsulina separadas por
Lys-Arg. El fragmento de la PCR se digiere por las
enzimas KpnI y NcoI y después, en una reacción de
T4-ligasa, se inserta en el vector p\alphaADH2
abierto por Kpn1/NcoI. Análogamente al ejemplo 7 del documento
EP-A 0 347 781, las células competentes de la cepa
MM294 de E. coli se transforman entonces con la mezcla de
ligamiento. El DNA del plásmido se aisla entonces de dos clones para
caracterización por medio de análisis de secuencia de DNA. Después
de confirmación de la secuencia de DNA insertada, se usa el DNA de
una preparación de un plásmido para transformar las células de la
cepa Y79 de levadura de cerveza, según dicho ejemplo. Sin embargo,
cuando se usa el vector p\alphaADH2, la introducción del vector va
seguida por la selección para la complementación de la mutación con
trp1-1, en contraste con dicho ejemplo. Para otro
control, el DNA del plásmido se aisla de nuevo de los transformantes
de levaduras y se analiza por medio de análisis de restricción. El
vector de expresión construido se denomina pADH2Hir_Ins. La
expresión se realiza según el
ejemplo 4.
ejemplo 4.
Ejemplo
2
La solicitud de patente EP-A 0
195 691 describe derivados de proinsulina que pueden contener el
dipéptido XY, donde X e Y corresponde cada uno a Lys o a Arg, como
conector entre las cadenas B y A de insulina. El siguiente ejemplo
describe la preparación de un vector de expresión para derivados de
proinsulina de este tipo. Una secuencia de DNA que codifica un
derivado de proinsulina de la forma cadena B- Lys - Arg - cadena A
se selecciona a modo de ejemplo y se sintetiza en consecuencia.
La síntesis del segmento génico se realiza según
el ejemplo 1. Las secuencias de oligonucleótidos usadas son hirf1 e
insncoirev. Los oligonucleótidos B_KR_Af1 y B_KR_Arev1 se sintetizan
desde sus comienzos.
B_KR_Af1 tiene la secuencia (SEQ ID NO: 7)
5'
CTTCTACACTCCAAAGACG AAA CGCGGTATCG-3'
y B_KR_Af1 tiene la secuencia (SEQ
ID NO:
8)
5'
CAACATTGTTCAACGATACCGCGTTTCGTCTTT-3'
La parte que se indica en letra negrilla de los
dos cebadores representados indica la secuencia que se solapa
parcialmente. Ambos cebadores coinciden exactamente con la secuencia
del gen de la miniproinsulina del documento EP-A 0
347 781, con la excepción de los 6 nucleótidos subrayados. La parte
subrayada corresponde a los codones de Lys y Arg. El DNA del
plásmido pADH2Hir_KR_Ins construido según el ejemplo 1 sirve como
molde en la PCR.
Como se describe en el ejemplo 1, se realizan
dos reacciones en cadena de la polimerasa usando los pares de
cebadores hirf1/B_KR_Arev e inscoirev/B_KR_Af1. El molde en cada
caso es el DNA del plásmido pADH2Hir_KR_Ins construido en el ejemplo
1. Los productos de ambas reacciones sirven como moldes en una
tercera PCR usando el par de cebadores hirf1 e insnco1. El producto
de reacción de la PCR3 se escinde con NcoI/SalI y se inserta en el
vector p\alphaADH2 abierto. Después de análisis de secuencia y
restricción, el plásmido correcto se denomina pADHHirKR_B_KR_A.
Ejemplo
3
La solicitud de patente EP-A 0
489 780 describe un plásmido, pINT90d, que contiene cDNA de
proinsulina de simio (Wetekam et al., Gene 19, p
179-183, 1982). El DNA de dicho plásmido y el DNA
del plásmido pK152 sirven como moldes. Se usa el cebador hirf1
descrito en el ejemplo 1 y se sintetizan tres cebadores más.
El cebador insncorev se une inversamente a la
región 3' del gen de insulina clonado en el pINT90d y tiene la
secuencia:
5'
-TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' (SEQ ID
NO:
9)
La secuencia subrayada indica el sitio de
reconocimiento para la enzima de restricción NcoI.
El cebador hir_insfkr tiene la secuencia:
5' -ATCCCTGAGG AATACCTTCA
GAAGCGATTT GTGAACCAGC ACCTGTGCGG C-3' (SEQ ID
NO:
10)
Aquí, los nucleótidos en letra negrilla indican
el conector Lys-Arg entre hirudina y
proinsulina.
El cebador hir_insrevkr es totalmente
complementario al cebador hir_insfkr y tiene la secuencia:
5'-GCCGCACAGG
TGCTGGTTCA CAAATCGCTT CTGAAGGTAT TCCTCAGGGA
T-3' (SEQ ID NO:
11)
De forma correspondiente al ejemplo 1, se
realizan dos reacciones en cadena de la polimerasa. El par de
cebadores hirf1/hir_insrevkr se hace reaccionar con el DNA del
plásmido pK152 y el par de cebadores hir_insfkr/insncorev se hace
reaccionar con el DNA del plásmido pINT91d. Como se ha descrito en
el ejemplo 1, los productos de ambas reacciones sirven como moldes
en una tercera PCR usando el par de cebadores hirf1/ insncorev. El
producto DNA de esta reacción incluye la secuencia de
hirudina_Lys-Arg_proinsulina. Posteriormente se
escinde con las enzimas NcoI y KpnI y, de forma correspondiente al
ejemplo 1, se inserta en el plásmido p\alphaADH2. De modo
correspondiente se puede construir el vector de expresión para
cualquier derivado de la proinsulina natural.
Ejemplo
4
La expresión se divide en dos fases. En primer
lugar, se realiza un precultivo en un medio mínimo con levadura. El
medio tiene la siguiente composición por litro:
| 6,7 g | - base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos) | |
| 5,0 g | - casaminoácidos (libres de vitaminas) | |
| 0,008% | - adenina | |
| 0,008% | - uracilo | |
| 2% | - glucosa |
El cultivo principal o de expresión se inocula
con una alícuota del precultivo.
El medio de cultivo principal contiene por
litro:
| 10 g | - extracto de levadura | |
| 20 g | - peptona | |
| 0,008% | - adenina | |
| 0,008% | - uracilo | |
| 4% | - glucosa |
Usando los medios descritos, se realiza la
expresión en un frasco en agitación del siguiente modo: 0,3 ml de un
precultivo que ha sido cultivado durante la noche se diluyen con 80
ml de medio precalentado y se incuban con agitación vigorosa a 30ºC
durante aproximadamente 24 h. En cada caso, se centrifuga después 1
ml del cultivo producido de este modo, y después de determinar la
densidad óptica y después de separar las células, se liofiliza el
sobrenadante y se analiza por medio de SDS -PAGE. El contenido de
hirudina biológicamente activa se determina realizando un ensayo de
inhibición de la trombina.
Un protocolo alternativo de fermentación dispone
que las células sean separadas por filtración o centrifugación
cuidadosa. A la vez que se aisla del medio la proteína de interés,
se proporciona a las células medio de cultivo principal fresco
precalentado que contiene alcohol y no más de 0,5% de glucosa como
fuente de carbono, y de este modo se continúa la fermentación sin
interrupción. Esta etapa se puede repetir hasta 5 veces.
Ejemplo
5
La concentración de hirudina se determina según
el método de GrieBbach et al. (Thrombosis Research 37, pp.
347 -350, 1985 ). Para este propósito, se incluyen en las medidas,
cantidades específicas de un estándar de Refludan para establecer
una curva de calibración a partir de la cual se puede determinar
directamente el rendimiento en mg/l.
Ejemplo
6
Invitrogen® vende un kit de clonación y
expresión para preparar proteínas recombinantes que usa P.
pastoris como sistema hospedante. Para esto, se proporciona un
detallado protocolo técnico en relación con la preparación y
subsiguiente expresión de un sistema de P. pastoris para la
producción de una proteína recombinante deseada de tal modo que
cuando se siguen dichos protocolos solamente tiene que ser descrita
la construcción del vector de expresión que codifica la proteína
deseada. Se usa el kit de expresión EasySelect™ Pichia (No. de
catálogo K1740-01 ).
El vector pPICZ\alphaA es parte del kit. La
abertura del vector por las enzimas de restricción XhoI y SaclI hace
posible, de forma similar al ejemplo 1, unir como un apéndice una
proteína de interés a la secuencia líder con factor alfa y analizar
la secreción en el sobrenadante. La clonación requiere dos
cebadores. El cebador pichia_H_If1 (SEQ ID NO: 10) tiene la
secuencia:
El molde usado es el DNA del plásmido
pADH2Hir_KR_Ins. Una PCR estándar con ambos cebadores produce un
producto de DNA que contiene la secuencia hirudina -
Lys-Arg - miniproinsulina extendida por los sitios
de integración de XhoI y SaclI. Si el producto de DNA se escinde
apropiadamente y se aisla el fragmento, dicho fragmento puede ser
insertado en el DNA del vector abierto en una reacción de
T4-DNA-ligasa. Como desviación del
protocolo del fabricante, la cepa MM294 de E. coli, descrita
en el ejemplo 1, se transforma con la mezcla de ligamiento y se hace
un cribado de las colonias recombinantes sobre placas de selección
de zeocina. El DNA del plásmido se aisla de nuevo de los clones y
después se caracteriza por medio de análisis de restricción y de
secuencia del DNA. Usando el plásmido construido de este modo, se
prepara entonces un clon de expresión de P. pastoris para la
producción de los péptidos, siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Ejemplo
7
La purificación requiere la separación de las
dos proteínas en una etapa inicial. Después de completar la
expresión, se analiza el medio por RP-HPLC
analítica. En contraste con la mayor parte de otros polipéptidos
encontrados en el sobrenadante debidos a la lisis espontánea de las
células de levadura o a la secreción, las dos proteínas, hirudina y
mini-proinsulina no precipitan a pH
2,5-3. El medio de cultivo se acidifica por tanto
apropiadamente y entonces, después de completar la precipitación, el
precipitado y las células se separan por centrifugación. Después de
la centrifugación, se ajusta el medio a pH 3,5-7 y
los dos componentes, hirudina y mini-proinsulina, se
separan uno de otro por medio de cromatografía de interacción
hidrófoba, por ejemplo usando una columna de cromatografía cargada
con material Diaion HP20®. Se puede aislar entonces la hirudina de
las fracciones que contienen hirudina según el documento
EP-A 0 549 915 y se puede aislar la insulina de las
fracciones que contienen mini-proinsulina según el
documento EP-A 0 347 781.
Ejemplo
8
Al final del periodo de expresión, el medio de
cultivo se ajusta a pH 6,8 y se añade después tripsina con agitación
de forma que se establece una concentración final de
4-8 mg por litro. Después de incubación durante
aproximadamente 4 horas, el caldo de fermentación tratado de este
modo se ajusta a pH 2,5-3. Después de
1-6 horas de precipitación, se separa el
precipitado. La mono-Arg-insulina
formada se aisla después por cromatografía de cambio iónico, a modo
de ejemplo, sobre S-Sepharose® en una solución
tampón de ácido láctico 50 mM y 30% de isopropanol (pH 3,5). Se
realiza la elución por medio de un gradiente de NaCI de
0,05-0,5 M de sal. Las fracciones que contienen
producto se diluyen 1:1 con H_{2}O y después se añade ZnCl_{2},
de modo que se forma una solución de ZnCl_{2} al 0,1%. La
mono-Arg-insulina precipita a pH 6,8
y a modo de ejemplo se convierte en insulina según el documento
EP-A 0324 712.
Ejemplo
9
Al final del periodo de expresión, se separan
las células y los componentes del sobrenadante por precipitación a
pH 2,5 a 3. Después se concentra el medio por filtración a través de
membranas que tienen un límite de exclusión de 10 kDa. Del mismo
modo que el derivado de hirudina, la
mini-proinsulina se encuentra cuantitativamente en
el retenido y por tanto puede ser procesada hasta insulina según el
ejemplo 8.
<110> Aventis Pharma Deutschland
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de péptidos supersegregables en
procedimientos para su producción y para la mejora en paralelo de
las formas exportadas de uno o más de otros péptidos de interés
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DEAV2001/0007
\vskip1.000000\baselineskip
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<140> 10108100.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-02-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: hir_insfkr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccctgagg aataccttca gaagcgattt gttaaccaac acttgtgtgg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína hir_insfkr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Lys Arg Phe Val
Asn Gln His Leu Gys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: hir_insrevkr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcacaagt gttggttaac aaatcgcttc tgaaggtatt cctcagggat
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: hirf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttgga tcctttggat aaaagactta cgtatactga ctgcac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína hirf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Tyr Thr Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: insnco1reiv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttccat gggtcgacta tcag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: B_KR_Af1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctacact ccaaagacga aacgcggtat cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: B_KR_Arev1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacattgtt caacgatacc gcgtttcgtc ttt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: insncorev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttccat ggtcatgttt gacagcttat cat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: hir_insfkr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccctgagg aataccttca gaagcgattt gtgaaccagc acctgtgcgg c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: hir_insrevkr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgcacagg tgctggttca caaatcgctt ctgaaggtat tcctcaggga t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: _H_If1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptttttttctc gagaaaagac ttacgtatac tgac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: _H_1rev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttggcgc cgaattcact attagttaca gtagttttcc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Una molécula de DNA de la forma:
P_{X}-S_{X}-B_{n}-(ZR)-
\text{péptido de transporte}-(Z_{1}Z_{2})-\text{proteína}\
(Y)-(Z_{1}Z_{2})-\text{proteína}\
(Y_{m})-T;
donde la molécula de DNA codifica
un péptido de transporte unido por medio de una secuencia
Z_{1}Z_{2} a una segunda proteína que a su vez está unida por
medio de Z_{1}Z_{2} a una proteína Y1 que o bien corresponde a Y
o puede ser diferente de Y y el péptido de transporte mejora la tasa
de secreción de Y y/o Y_{m},
donde
P_{X} es cualquier secuencia de DNA promotora,
seleccionada de tal modo que se pueden conseguir rendimientos
óptimos de la proteína de interés;
S_{X} es cualquier DNA que, en consecuencia,
codifica cualquier secuencia señal o líder que permite rendimientos
óptimos;
B_{n} es 1-15 aminoácidos
codificables genéticamente o un enlace químico;
Z es el codón de un aminoácido seleccionado del
grupo que comprende Lys y Arg;
Z_{1} es el codón de un aminoácido
seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg;
Z_{2} es el codón de un aminoácido
seleccionado del grupo que comprende Lys y Arg;
la proteína Y_{m} es una secuencia de DNA que
codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por
una levadura (m = 1-5) o es un enlace químico (m =
0);
R es un codón de arginina;
el péptido de transporte es una secuencia de DNA
que codifica hirudina o un derivado de hirudina;
la proteína Y es una secuencia de DNA que
codifica cualquier proteína que puede ser producida y segregada por
una levadura y cuya actividad biológica, cuando Y_{m} no es un
enlace químico, no está impedida por una extensión de un dipéptido
básico o permite la degradación de la extensión por las
carboxipeptidasas;
T es una secuencia de DNA sin traducir ventajosa
para la expresión.
2. Una molécula de DNA según la reivindicación
1, en la cual (Y) es una proteína farmacéuticamente relevante
seleccionada de un grupo que comprende proinsulina y sus derivados,
interleuquinas, linfoquinas, interferones y factores derivados de
los sistemas de coagulación sanguínea.
3. Proteínas codificadas por cualquiera de las
moléculas de DNA según las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Vector de copia múltiple que comprende la
molécula de DNA de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
5. Plásmido que comprende la molécula de DNA de
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
6. Célula hospedante que comprende una molécula
de DNA de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, un vector de
copia múltiple de la reivindicación 4 y/o un plásmido de la
reivindicación 5, como una parte de su cromosoma, como una parte de
un mini-cromosoma, o
extra-cromosómicamente.
7. Célula hospedante según la reivindicación 6,
donde dicha célula hospedante es una levadura.
8. Célula hospedante según la reivindicación 7,
seleccionada del grupo que comprende S. cerevisiae, K. lactis,
H. polimorpha y P. pastoris.
9. Procedimiento para fermentar proteínas según
la reivindicación 3, en el cual
- (a)
- una molécula de DNA de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, un vector de copia múltiple de la reivindicación 4, o un plásmido de la reivindicación 5, se expresan en una célula hospedante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8; y
- (b)
- las proteínas expresadas se aislan del sobrenadante del cultivo celular.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el cual después de completar la fermentación, se ajusta el pH a
2,5-3,5 para precipitar las proteínas no deseadas y
las proteínas expresadas se aislan del sobrenadante de la
precipitación.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
cuyo procedimiento, después de separar el sobrenadante de la
fermentación de las células hospedantes, las células hospedantes se
cultivan repetidamente en medio fresco, y la proteína de fusión
liberada se aisla de cada sobrenadante obtenido durante el
cultivo.
12. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el cual una etapa del procedimiento para
concentrar la proteína expresada en el sobrenadante después de la
precipitación se selecciona de un grupo que comprende
microfiltración, cromatografía de interacción hidrófoba y
cromatografía de cambio iónico.
13. Procedimiento para la preparación de
insulina, en el cual
- (a)
- la proinsulina se expresa como la proteína (Y) de la casete de expresión de la reivindicación 1, en un procedimiento según las reivindicaciones 9 ó 10;
- (b)
- la proinsulina de la etapa (a) se aisla y se trata con tripsina y carboxipeptidasa B; y
- (c)
- la insulina se aisla de la mezcla de reacción de la etapa (b).
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el cual el péptido de transporte es hirudina o un derivado de
hirudina que se destruye o se inactiva biológicamente después de la
etapa (a) o (b).
15. Proteína según la reivindicación 3, donde la
proteína es un derivado de hirudina con dos restos aminoácidos
básicos en su extremo del C terminal.
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