ES2254658T3 - Proteina de fusion que comprende hirudina y proinsulina o insulina. - Google Patents
Proteina de fusion que comprende hirudina y proinsulina o insulina.Info
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Abstract
Un DNA que codifica una proteína de fusión de la forma: ¿F¿Asm¿Rn¿Y¿, en donde F es una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que permite la secreción de una proteína Y en un medio de fermentación, en donde F codifica una hirudina, As es un enlace químico o una secuencia de DNA que codifica un aminoácido codificable por el código genético, m es un número entero de 0 ¿ 10, R es un enlace químico o un codón de arginina, n es 0 ó 1, e Y es una secuencia de DNA que codifica una proteína de interés la cual, correctamente plegada, es parte de la proteína de fusión en el medio de fermentación, y que es una proinsulina.
Description
Proteína de fusión que comprende hirudina y
proinsulina o insulina.
La invención se refiere a proteínas de fusión que
comprenden una parte de fusión y una proteína de interés, llevando
la combinación de las dos proteínas a la proteína de fusión que es
segregada en el sobrenadante de un hospedante bacteriano y a la
proteína de interés que está presente en su correcta estructura
tridimensional. La secuencia génica de la proteína de fusión es
parte de una casete de expresión que permite la expresión en un
hospedante bacteriano. La invención se refiere a un procedimiento
para la fermentación, expresión y tratamiento de tal proteína de
fusión usando la casete de expresión, a un plásmido que contiene la
casete de expresión integrada en el cromosoma y/o como un replicón,
por ejemplo como un plásmido, a dicha proteína de fusión con
hirudina o uno de sus derivados como la parte de fusión, a un
procedimiento para producir insulina o un derivado de insulina y al
uso de la casete de expresión en los procedimientos para preparar
una proteína de fusión a partir de hirudina o sus derivados y para
producir insulina o un derivado de insulina.
El desarrollo de procedimientos optimizados para
preparar productos farmacéuticos basados en proteínas recombinantes
representa un objetivo que tiene que cumplir con dos puntos de
vista, si es posible. En primer lugar, un procedimiento tiene que
ser tan rentable como sea posible y, en segundo lugar, el producto
tiene que ser de la más alta pureza.
A este respecto, la elección del sistema de
expresión determina el curso del particular procedimiento de
producción, y es obvio para un trabajador experto que el desarrollo
de nuevas técnicas en la química de las proteínas y la amplia
variedad de posibilidades bioquímicas y nuevas combinaciones de
técnicas conocidas siempre hacen posible mejorar los procedimientos
existentes.
Las propiedades de una deseada proteína
determinan de forma decisiva la elección del sistema de célula
hospedante utilizado para la síntesis. Bacterias tales como E.
coli representan el sistema con la ayuda del cual es posible
producir rápidamente proteínas con rendimientos crudos de varios
gramos en medios baratos. El sistema es especialmente útil para las
proteínas que no necesitan ser modificadas y que pueden ser
renaturalizadas in vitro a su forma biológicamente activa.
Para las proteínas que se necesitan en grandes cantidades, tales
como la insulina por ejemplo, se aspira a tasas de expresión que
lleven a la acumulación intracelular de la proteína en forma de
cuerpos de inclusión. Después de la lisis celular, se disuelve la
proteína y después, en posteriores etapas del procedimiento, se
pliega. Sin embargo el proceso de plegamiento no es cuantitativo.
Las razones para esto pueden ser daños irreversibles durante la
formación de cuerpos de inclusión, los correspondientes daños
durante la lisis celular y los errores durante el plegamiento. Las
moléculas plegadas o modificadas "erróneamente" tienen que ser
eliminadas después en posteriores etapas de separación. Esto tiene
un efecto adverso sobre los costes de producción. Adicionalmente,
también reaparecen en el producto final trazas de dichas moléculas.
Puesto que los productos farmacéuticos están sometidos a altos
criterios de pureza, es necesaria una purificación apropiadamente
cuidadosa y de alto coste. Debido a la relación favorable
coste/rendimiento crudo, serían deseables los procedimientos que
permitan la exportación por E. coli de la proteína de interés
en forma correctamente plegada hasta el medio de cultivo. Sin
embargo, esto ha sido satisfactorio solamente en casos excepcionales
hasta ahora.
La solicitud de patente internacional
PCT/EP00/08537 describe tal excepción. La síntesis y exportación de
lepirudina, el ingrediente activo del producto farmacéutico
Refludan®, por E. coli en cantidades de gramos fueron
satisfactorias cuando se usaron secuencias señales específicas para
exportación. La solicitud de patente internacional PCT/EP01/07333
describe una proteína bifuncional compuesta de hirudina y derivados
de hirudina y de un inhibidor factor Xa procedente de las
garrapatas y sus derivados. Dicha proteína puede asimismo ser
sintetizada y exportada por E. coli con altos rendimientos.
Como una adición a este hallazgo, se encontró después
sorprendentemente que la hirudina es exportada con altos
rendimientos no sólo como una proteína de fusión con TAP sino
también como parte de una proteína de fusión con polipéptidos tales
como los derivados de proinsulina, que es biológicamente activa y
que, sorprendentemente, un copartícipe de fusión tal como la
proinsulina está presente en la correcta estructura tridimensional.
Este inesperado resultado lleva a la posibilidad de una producción
más rentable, por ejemplo, de insulina por los sistemas de
hospedante bacteriano/vector, puesto que se puede prescindir de la
etapa de replegamiento in vitro después de la expresión
intracelular, que se asocia con pérdidas de rendimiento que no son
despreciables, y de este modo resulta un procedimiento de
purificación de las proteínas más simple. Otra ventaja es que no se
requieren las ayudas que rompen la estructura (caotrópicas) que se
añaden para disolver la proteína de fusión en los procedimientos
tradicionales para la producción de insulina en E. coli.
Ecológicamente, esto lleva a menos polución ambiental al evitar los
correspondientes desechos.
Las sanguijuelas del tipo Hirudo han
desarrollado, por ejemplo, diferentes isoformas del inhibidor de la
trombina, hirudina. La hirudina ha sido optimizada para los
requerimientos farmacéuticos por variación artificial de la
molécula, por ejemplo cambio del aminoácido del N terminal (por
ejemplo EP-A 0 324 712).
La invención incluye el uso de hirudina y
variantes de hirudina para la formación de proteínas de fusión, por
ejemplo con proinsulina de simio o sus derivados. Realizaciones
particulares de la invención usan una de las isoformas de la
hirudina natural (las isoformas naturales se denominan en conjunto
"hirudina"). Las isoformas naturales son, por ejemplo,
Val-Val-hirudina o
Ile-Thr-hirudina. Otras
realizaciones de la invención usan una variante de una isoforma de
hirudina natural. Una variante se deriva de una isoforma de hirudina
natural pero contiene, por ejemplo, aminoácidos adicionales y/o
deleciones de aminoácidos y/o cambios de aminoácidos en comparación
con la isoforma natural. Una variante de hirudina puede contener
segmentos peptídicos alternantes de isoformas de hirudina natural y
nuevos aminoácidos. Las variantes de hirudina son conocidas y están
descritas, por ejemplo, en el documento DE 3 430 556. Las variantes
de hirudina están comercialmente disponibles en la forma de
proteínas (Calbiochem® Biochemicals, Cat. no.
377-853, -950-960).
La insulina es un polipéptido de 51 aminoácidos
que están distribuidos entre dos cadenas de aminoácidos: la cadena
A con 21 aminoácidos y la cadena B con 30 aminoácidos. Las cadenas
están conectadas una a otra con dos puentes disulfuro. Las
composiciones de insulina han sido usadas durante muchos años para
la terapia de la diabetes. Esto incluye el uso no solamente de
insulinas naturales sino también de derivados y análogos de
insulina.
Los derivados de insulina son derivados de
insulinas naturales, principalmente insulinas humanas o insulinas
animales, que difieren de la correspondiente insulina natural, por
lo demás idéntica, por la sustitución de al menos un resto
aminoácido natural y/o la adición de al menos un resto aminoácido
y/o un resto orgánico.
En general los derivados de insulina tienen una
acción ligeramente modificada en comparación con la insulina
humana.
Los derivados de insulina que tienen un comienzo
de acción acelerado están descritos en los documentos EP 0 214 826,
EP 0 375 437 y EP 0 678 522. El documento EP 0 214 826, se refiere,
entre otros, a las sustituciones de B27 y B28. El documento EP 0
678 522 describe derivados de insulina que tienen en la posición B29
diferentes aminoácidos, preferiblemente prolina, pero no ácido
glutámico. El documento EP 0 375 437, incluye derivados de insulina
con lisina o arginina en B28, que pueden ser adicionalmente
modificados en B3 y/o A21, cuando sea apropiado.
El documento EP 0 419 504 describe derivados de
insulina que están protegidos frente a modificaciones químicas por
la modificación de la asparagina en B3 y de al menos otro aminoácido
en las posiciones A5, A15, A18 o A21.
El documento WO 92/00321 describe derivados de
insulina en los cuales al menos un aminoácido en las posiciones
B1-B6 ha sido reemplazado por lisina o arginina. De
acuerdo con el documento WO 92/00321, las insulinas de este tipo
presentan una acción prolongada.
Cuando se produce insulina o derivados de
insulina por ingeniería genética, frecuentemente se expresa un
precursor de la insulina, "proinsulina", que comprende las
cadenas B, C y A. Dicha proinsulina se puede convertir en insulina
o un derivado de insulina por la separación enzimática o química de
la cadena C después de apropiado y correcto plegamiento y formación
de los puentes disulfuros. La proinsulina se expresa frecuentemente
en la forma de una proteína de fusión. El copartícipe de fusión
"no deseado" necesita asimismo ser separado química o
enzimáticamente.
Es obvio para un trabajador experto que la
elección de los sistemas recombinantes hospedante/vector determina
los métodos de cultivo, propagación y fermentación de las células
recombinantes. Esto es asimismo un objeto de la invención.
La proteína de fusión muestra sorprendentemente
buena solubilidad en medio ácido, y esto lleva a distintas ventajas
en relación con el tratamiento químico de la proteína. En primer
lugar, muchos componentes no deseados del sobrenadante se
precipitan en dichas condiciones y en segundo lugar, las peptidasas
o proteasas son inactivas. Por tanto, la acidificación del caldo de
fermentación al final de la operación hace posible separar
directamente de la proteína de fusión, las proteínas no deseadas
del sobrenadante junto con las células hospedantes y, en una etapa
adicional, concentrar dicha proteína de fusión. Esto es asimismo un
objeto de la invención.
Al final de la fermentación, el proceso de
plegamiento puede no estar todavía completo al 100%. La adición de
mercaptano o, por ejemplo, hidrocloruro de cisteína puede completar
el procedimiento. Éste es asimismo un objeto de la invención.
Si las dos proteínas se fusionan por medio de un
conector de aminoácidos que son específicamente reconocidos por las
endoproteasas que no escinden eficientemente la proteína de fusión
en ninguna otra posición, entonces la proteína de interés puede ser
escindida directamente en forma activa. En el caso de producción de
insulina, el conector entre la hirudina y la proinsulina contiene
preferiblemente arginina en el extremo de carboxi terminal. En un
proceso simultáneo es entonces posible por conversión con tripsina
escindir la parte de fusión y convertir la proinsulina en mono- o
di-Arg-insulina. Dicho conector debe
ser optimizado en relación al procesado de la insulina de tal modo
que la escisión de la parte de la hirudina no sea más lenta que las
escisiones de la secuencia del péptido C o uno de sus derivados que
unen las cadenas B y A de la insulina. Éste es asimismo un objeto
de la invención. Un ejemplo de un sistema de expresión que se puede
usar es el vector pJF118, descrito en la figura 1 de la patente
europea 0 468 539.
Los plásmidos que contienen las secuencias de DNA
que codifican la proinsulina o derivados de proinsulina están
descritos, por ejemplo, en las patentes EP-A 0 489
780 y PCT/EP00/08537.
El plásmido pK152 que contiene la secuencia de la
hirudina según el documento EP-A 0 324 712 se usa
como fuente de la secuencia de DNA de la hirudina.
La compatibilidad de exportación de la proteína
de interés al pasar a través de la membrana bacteriana interior es
importante para la secreción. A este respecto, la elección de la
secuencia señal que puede ser más o menos óptima para diferentes
proteínas es importante. La solicitud de patente PCT/EP00/08537
describe un sistema de rastreo de la secuencia señal basado en la
PCR. Este sistema se puede aplicar también a las proteínas de
fusión que tienen hirudina como la parte de fusión en el N terminal,
puesto que sorprendentemente la actividad de la hirudina permanece
intacta y por tanto se hace fácilmente detectable en el sobrenadante
por medio del ensayo de inhibición de la trombina.
Winter et al. (Journal of Biotechnology 84
(2000) 175-185) describen una producción
incrementada de proinsulina humana en el espacio periplásmico de
Escherichia coli mediante fusión a DsbA.
En la solicitud de patente internacional
PCT/GB90/01911 se describe que proteínas de fusión relativamente
inactivas son activables por parte de enzimas de la cascada de la
coagulación de modo que tengan una actividad de inhibición
fibrinolítica y/o de formación del coágulo. Por ejemplo, una
proteína de fusión que comprende dos moléculas de hirudina o
estreptoquinasa, enlazadas por una secuencia de unión escindible, se
puede escindir para proporcionar hirudina
anti-trombótica o estreptoquinasa fibrinolítica por
parte de trombina o factor Xa.
En el documento EP 0 158 564 A1 se describen
vectores para la expresión de hirudina.
La invención, por tanto, se refiere a un DNA
(término alternativo: casete de expresión) que codifica una proteína
de fusión de la forma
-F-As_{m}-R_{n}-Y-,
en
donde
- F
- es una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que
- \quad
- permite la secreción de una proteína Y en un medio de fermentación, en donde F codifica una hirudina,
- As
- es un enlace químico o una secuencia de DNA que codifica un aminoácido codificable por el código genético,
- m
- es un número entero de 0 - 10,
- R
- es un enlace químico o un codón de arginina,
- n
- es 0 ó 1, e
- Y
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína de interés la cual, correctamente plegada, es parte de la proteína de fusión en el medio de fermentación, y que es una proinsulina.
La invención se refiere, además, a una casete de
expresión (término alternativo: molécula de DNA) de la forma
P-S-F-As_{m}-R_{n}-Y-T,
en
donde
- P
- es un promotor,
- S
- es una secuencia de DNA que codifica una secuencia señal que permite rendimientos óptimos,
- T
- es una secuencia de DNA sin traducir que mejora la expresión.
La invención se refiere, además, a un plásmido
que contiene una casete de expresión descrita antes, y a una célula
hospedante que contiene dicho plásmido o a una célula hospedante que
preferiblemente contiene la casete de expresión integrada en el
genoma hospedante, siendo seleccionada la célula hospedante de un
grupo que comprende E. coli, B. subtilis y
Streptomyces.
La invención se refiere también a un
procedimiento para la producción fermentativa de una proteína de
fusión como se ha descrito antes, en cuyo procedimiento
- (a)
- una molécula de DNA como se ha descrito antes se expresa en una célula hospedante como se ha descrito antes, y
- (b)
- se aísla la proteína de fusión expresada;
en el cual, en particular, se
separa el sobrenadante de las células hospedantes para aislar la
proteína expresada, y la proteína expresada se aísla del
sobrenadante; y en el cual, una etapa del procedimiento para
concentrar la proteína expresada en el sobrenadante después de la
precipitación se selecciona de un grupo que comprende
microfiltración, cromatografía de interacción hidrófoba y
cromatografía de cambio iónico, y en el cual, una particular
realización es que el aislamiento de la proteína expresada incluye
una etapa en la que se precipitan los componentes del medio de
cultivo o el sobrenadante, mientras que la proteína expresada
permanece en solución; y en el cual, en otra realización preferida
de la invención, después de la fermentación, se añaden mercaptano o
hidrocloruro de cisteína al sobrenadante de fermentación a pH
6-9, dando como resultado una concentración de 0,05
a 2,5 M del grupo SH
libre.
Una realización particular de la invención
comprende separar el sobrenadante de fermentación de las células
hospedantes, después cultivar las células hospedantes en medio
fresco y aislar la proteína de fusión del sobrenadante. En otras
palabras, una realización adicional de la invención es un
procedimiento como se ha descrito antes, en cuyo procedimiento
después de separar el sobrenadante de la fermentación de las células
hospedantes, las células hospedantes se cultivan repetidamente en
medio fresco, y la proteína de fusión liberada se aísla de cada
sobrenadante obtenido durante el cultivo.
La invención se refiere adicionalmente a un
procedimiento para la producción de insulina, en cuyo
procedimiento
- (a)
- a partir de la proteína de fusión expresada, que se obtiene en un procedi miento como se ha descrito antes,
- (b)
- se libera insulina por escisión enzimática o química y
- (c)
- se aísla.
Los siguientes ejemplos que no se pretende que
sean restrictivos describen la invención en más detalle.
El ejemplo 2 de la solicitud de patente
PCT/EP00/08537 describió un vector de expresión que permite la
expresión y secreción de Refludan en el medio usado para E.
coli por medio de la secuencia señal del producto del gen oprF
de Pseudomonas fluorescens (De, E. et al. FEMS
Microbiol Lett. 127, 263-272,1995). Este vector
sirve para construir una proteína de fusión
Refludan-GNSAR-proinsulina de simio
(GNSAR=SEQ ID NO: 1) y se denomina pBpfu_hir.
Otros materiales de partida son los DNAs de los
plásmidos pJF118 (EP 0 468 539) y pK152 (PCT/EP00/08537). Se
requieren los siguientes oligonucleótidos:
Cebador
pfuf1
5'GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc
ttacgtatac tgactgca 3' (SEQ ID NO: 2)
Cebador
insu11hindIII
5'-TTTTTAAGCT TCATGTTTGA
CAGCTTATCA T - 3' (SEQ ID NO: 3)
Cebador
Hir_insf1
5'-ATCCCTGAGG AATACCTTCA
CGGAAATTCG GCACGATTTG TG - 3' (SEQ ID NO: 4)
Cebador
Hir_insrev1
5'-CACAAATCGT GCCGAATTTC CCTGAAGGTA
TTCCTCAGGG AT - 3' (SEQ ID NO: 5)
El cebador pfuf1 se hibrida con la región de DNA
que codifica la unión de la secuencia señal y la lepirudina en el
vector de expresión.
La parte del cebador Hir_insrev1 mostrada en
letra negrilla se hibrida con la región de DNA que codifica la
unión de las secuencias de la preproinsulina y proinsulina de simio
en el plásmido pINT90d y con las secuencias del extremo 3' de la
secuencia de la hirudina en el plásmido pK52. El cebador Hir_insrev1
es 100% complementario al cebador Hir_insf1. El cebador
Insu11HindIII marca el extremo 3' de la región de DNA clonada en
pINT90d y codifica la secuencia de proinsulina de simio y
adicionalmente lleva la secuencia del hexanucleótido para el
reconocimiento por la enzima de restricción HindIII.
Se realizan dos reacciones estándar en cadena de
la polimerasa usando el par de cebadores Hir_insf1/ Insu11HindIII
con el plásmido pINT90d como molde y el par de cebadores pfuf1/
Hir_insrev con el plásmido pBpfu como molde. Los productos de ambas
reacciones se reúnen y una alícuota se convierte en una tercera
reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores
pfuf1/Insu11HindIII. El resultado es un producto de DNA que contiene
la secuencia señal
(parcialmente)-lepirudina-GNSAR-proinsulina
de simio. El fragmento de DNA se convierte usando las enzimas de
restricción BamHI y HindIII, con escisión con la BamHI en la
secuencia de lepirudina y con la HindIII en el extremo 3' de la
secuencia que codifica la proinsulina.
En una reacción paralela, el vector pBpfu se
convierte usando las dos enzimas y se aísla el fragmento grande del
vector. Los productos aislados de ambas reacciones se convierten en
una reacción de T4-ligasa. Las células competentes
de la cepa K12 Mc1061 de E. coli (Sambrook et al.
"Molecular Cloning" (Cold Spring Habor Laboratory Press 1989)
se transforman con la mezcla de ligamiento y se ponen en placas NA
que contienen 25 mg/ml de ampicilina. El DNA del plásmido se aísla
de los transformantes para caracterización. Al mismo tiempo, se
produce una placa con los transformantes caracterizados en el
análisis del plásmido, con fines de mantenimiento. El DNA se
caracteriza por medio de análisis de restricción y análisis de
secuencia del DNA. Un plásmido identificado como correcto se
denominó pBpfuHir_Ins.
La construcción se lleva a cabo según el plan
descrito en el ejemplo 1.
El ejemplo 10 de la solicitud de patente
PCT/EP00/08537 describe la construcción de un vector para exportar
lepirudina por medio de la secuencia señal de la proteína de la
membrana exterior de S. typhimurium (Rioux, C.R., Friedrich,
M.J. y Kadner, R.J.; J. Bacteriol. 172 (11),
6217-6222 (1990)). El plásmido resultante se
denomina pBstyfim_hir para fines del laboratorio. Los DNA de los
plásmidos pK152 y pINT90d sirven en cada caso como moldes.
La construcción requiere 4 cebadores.
Los cebadores insu11hindIII, Hir_insf1 y
Hir_insrev1 se describen en el ejemplo 1.
El cebador styfim1ser se sintetiza desde sus
comienzos y tiene la siguiente secuencia:
- 5' CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC CTCTacgtat actgactgcaCTG 3' (SEQ ID NO: 6)
El triplete de DNA mostrado en letra negrilla
indica un codón de serina. Como resultado, se produce una hirudina
que lleva serina en lugar de leucina en la posición 1 de la
secuencia de aminoácidos.
De forma correspondiente al ejemplo 1, se
realizan dos reacciones estándar en cadena de la polimerasa usando
el par de cebadores Hir_insf1/ Insu11HindIII con el DNA de pINT90d
como molde y el par de cebadores styfim1ser/ Hir_insrev con el DNA
de pK152 como molde. Los productos de ambas reacciones se reúnen y
una alícuota se convierte en una tercera reacción en cadena de la
polimerasa con los cebadores styfim1ser/ Insu11HindIII. El resultado
es un producto de DNA que contiene la secuencia señal
(parcialmente)-Ser-hirudina-GNSAR-proinsulina
de simio. El fragmento de DNA se convierte usando las enzimas de
restricción BamHI y HindIII.
En una reacción paralela, el vector pBstyfim_Hir
se convierte usando las dos enzimas y se aísla el fragmento grande
del vector. Los productos aislados de ambas reacciones se convierten
en una reacción de T4-ligasa. Las células
competentes de la cepa K12 Mc1061 de E. coli se transforman
con la mezcla de ligamiento y el DNA del plásmido se aísla de los
transformantes para caracterización. Al mismo tiempo, se produce una
placa con los transformantes caracterizados en el análisis del
plásmido, con fines de mantenimiento. El DNA se caracteriza por
medio de análisis de restricción y análisis de secuencia del DNA. Un
plásmido identificado como correcto se denominó
pBstyfim_SerHir_Ins.
El precursor de la fosfatasa alcalina de E.
coli tiene la secuencia señal:
- MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A (SEQ ID NO: 7)
(Shuttleworth H., Taylor J., Minton
N.; Nucleic Acids Res. 14: 8689,
(1986)).
La secuencia de péptidos se traduce a DNA por el
programa Backtranslate de GCG (Wisconsin Package Version 10.1,
Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.) usando el criterio de
uso del codón alto en E. coli.
Esto da como resultado la secuencia:
- 5' ATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTCACCCCGGTACCAAAGCG 3' (SEQ ID NO: 8)
Para clonar y colgar esta secuencia a una
secuencia de DNA que codifica una hirudina que se caracteriza por
tener el aminoácido alanina en la posición 1 (documento
EP-A 0 448 093), dicha secuencia se extiende por la
secuencia mostrada en letra negrilla:
- 5' TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTTCACC CCGGTTACCAAAGCG \sneg{GCT}acgtat actgactgcaCTG (SEQ ID NO: 9)
Se derivan de la misma dos secuencias de
oligonucleótidos que se solapan parcialmente.
El cebador phoaf1 tiene la secuencia:
- 5' CTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAGCG GCTACG TATACTGACTGCACTG-3' (SEQ ID NO: 10)
El cebador phoaf2 tiene la secuencia:
- 5' TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 11)
La construcción del vector de expresión requiere
los cebadores insu11HindIII, Hir_insf2 y Hir_insrev2 y los DNA de
los plásmidos pK152, pINT90d y pJF118.
El cebador Hir_insf2 tiene la secuencia:
- 5'-ATCCCTGAGGAATACCTTCAG\sneg{cga}TTTGTGAACCAGCAC C -3' (SEQ ID NO: 12)
El cebador Hir_insrev2 tiene la secuencia:
- 5'-GGTGCTGGTTCACAAA\sneg{tcg}CTGAAGGTA TTCCTCAGGG AT -3' (SEQ ID NO: 13)
Las letras mayúsculas en letra negrilla indican
la secuencia que se hibrida con la proinsulina, mientras que las
letras mayúsculas en letra normal describen el solapamiento con el
extremo 3' de la secuencia de la hirudina. Las letras minúsculas
subrayadas y en letra negrilla representan el codón del conector
arginina.
De forma correspondiente al ejemplo 1, se
realizan dos reacciones estándar en cadena de la polimerasa usando
el par de cebadores Hir_insf1/ Insu11HindIII con el DNA de pINT90d
como molde y el par de cebadores phoaf1/ Hir_insrev con el DNA de
pK152 como molde. Los productos de ambas reacciones se reúnen y una
alícuota se convierte en una tercera reacción en cadena de la
polimerasa con los cebadores phoa/Insu11HindIII. El resultado es un
producto de DNA que contiene la secuencia
señal-Ala-hirudina-GNSAR-proinsulina
de simio. El fragmento de DNA se convierte usando las enzimas de
restricción BamHI y HindIII. En una reacción en paralelo, el vector
pjF118 se convierte usando las dos enzimas y se aísla el fragmento
grande del vector. Los productos aislados de ambas reacciones se
convierten en una reacción de T4-ligasa. Las células
competentes de la cepa K12 Mc1061 de E. coli se transforman
con la mezcla de ligamiento y se aísla el DNA del plásmido de los
transformantes para caracterización. Al mismo tiempo, se produce
una placa con los transformantes caracterizados en el análisis del
plásmido, con fines de mantenimiento. El DNA se caracteriza por
medio de análisis de restricción y análisis de secuencia del DNA.
Un plásmido identificado como correcto se denominó pNS22.
La concentración de hirudina se determina según
el método de GrieBbach et al. (Thrombosis Research 31, pp.
347 -350, 1985 ). Para este propósito, se incluyen en las medidas
cantidades específicas de un estándar de Refludan para establecer
una curva de calibración a partir de la cual se puede determinar
directamente el rendimiento en mg/l. La actividad biológica es
también una medida directa del solapamiento correcto del componente
proinsulina de la proteína de fusión. Alternativamente, es posible
utilizar una digestión proteolítica con S. aureus y
subsiguiente análisis en un sistema de RP-HPLC para
determinar la formación correcta del puente
S-S.
Las células recombinantes se cultivaron durante
la noche en medio 2YT (por litro: 16 g de triptona, 10 g de
extracto de levadura, 5 g de NaCl) que contiene 100 \mug/ml de
ampicilina. El cultivo de toda la noche se diluye 1:50 con medio
fresco y las células se cultivan hasta una densidad OD_{600} de
aproximadamente 0,8.
\newpage
Después se induce la expresión añadiendo IPTG de
tal modo que se establece una concentración 0,05-2
mM. Las células inducidas de este modo se incuban durante
3-26 h adicionales.
Después de tres horas, la acción antitrombina de
la hirudina es claramente medible en el sobrenadante. Dicha acción
se puede atribuir a la secreción de la deseada proteína de fusión,
ya que el análisis por SDS PAGE, después de tinción con azul
Co-omassie, revela solamente en las células
inducidas una nueva pista que reacciona en análisis de
transferencia Western con los anticuerpos policlonales
anti-insulina. En los experimentos de fermentación,
la inducción se comienza solamente después del cultivo hasta
densidades ópticas significativamente más altas. Se da preferenia
aquí a los medios sintéticos basados en un medio mínimo.
La productividad de las células se puede aumentar
usando el principio de ordeño bacteriano, esto es, separando
cuidadosamente las células del sobrenadante, después del tiempo de
inducción óptimo, e incubándolas después en medio fresco al cual se
puede añadir de nuevo el inductor. La insulina se prepara entonces
en paralelo a partir del sobrenadante recogido.
Una vez que ha terminado la inducción, el
sobrenadante celular se ajusta a pH 2,5 - 3 y las células y los
componentes del sobrenadante se separan por centrifugación o
filtración. El sobrenadante de la precipitación se aplica a una
columna de cambio catiónico (S-Hyper DF, Source 30S)
y se fracciona usando un gradiente lineal de 150 a 450 mM de NaCl a
pH 3,5 en presencia de 30% de 2-propanol. Las
fracciones individuales se analizan por medio de
RP-HPLC. La proteína de fusión
proinsulina-hirudina se eluye a una concentración de
NaCl de aproximadamente 300 mM. Las fracciones suficientemente
puras se reúnen, se diluyen con TFA al 0,1% y se aplican a una
columna RP (PLRP-S 7,5 x 50 mm) por bombeo. Se
lleva a cabo la elución usando un gradiente de
25-50% de acetonitrilo. Se reúnen dos grupos de
fracciones. Después de separar el disolvente, se liofiliza el
material. La pureza del material se verifica por medio de
electroforesis en SDS poliacrilamida. La proteína de fusión
purificada se analiza por espectrometría de masas (ESI). El peso
molecular de la proteína de fusión determinado experimentalmente
corresponde a su peso molecular esperado teóricamente después de la
separación del péptido señal.
La proteína de fusión se digiere con tripsina y
los fragmentos formados se analizan por medio de
RP-HPLC y posteriormente por espectrometría de
masas. Un fragmento que se reconoce como des-(B30)insulina,
debido a su masa de 5706 Da, se identifica satisfactoriamente. Este
producto se somete a una digestión con V8-proteasa
de S. aureus. El análisis por RP-HPLC muestra
el modelo peptídico esperado.
La escisión con tripsina se realiza como
sigue:
La proteína de fusión liofilizada se disuelve en
Tris-HCl 50 mM pH 8 (1 mg/ml) y se añade tripsina (1
\mug por mg de proteína de fusión). Se inactiva la tripsina a pH
3 al final de la reacción.
La digestión con S. aureus se realiza como
sigue:
La des-(B30)insulina aislada se disuelve
en agua a pH 8, se añade la proteasa de S. aureus (1/50 de la
cantidad de insulina), y la mezcla se incuba a 37ºC durante 5 horas
y después a temperatura ambiente durante toda la noche.
En contraste con la mayor parte de otros
polipéptidos encontrados en el sobrenadante debidos a la lisis
espontánea de las células hospedantes o a la secreción, la proteína
de fusión sorprendentemente no precipita a pH
2,5-3,5. El medio de cultivo se acidifica por tanto
apropiadamente y entonces, después de completar la precipitación,
el precipitado y las células se separan por centrifugación o por
microfiltración y se concentran.
Seguidamente, el medio se ajusta a pH 6,8 y se
determina en paralelo el contenido de la proteína de fusión por
ensayo con HPLC analítica. La determinación va seguida de adición de
tripsina al sobrenadante de modo que la tripsina está a
aproximadamente 1 \mug por 1-1,5 mg de proteína de
fusión. Después de incubación a temperatura ambiente durante
aproximadamente 4 horas, se realiza la purificación por
cromatografía de cambio catiónico a pH 3,5 en presencia de
2-propanol. Se lleva a cabo la elución en la
solución tampón aplicando un gradiente de 0,15 a
0,45 M.
0,45 M.
La
di-Arg-insulina se eluye a una
concentración aproximadamente 0,3 M. Después de dilución 1:1, se
precipita la di-Arg-insulina de las
fracciones que contienen insulina a pH 6,8 con la adición de una
solución de ZnCl_{2} al 10%. Se separa por filtración la insulina
y después se disuelve en Tris-HCl 0,05 M (pH 8,5)
dando como resultado una solución de 2 mg/ml:
Entonces se añade la cantidad de aproximadamente
1 unidad de carboxipeptidasa B por 100 ml de solución y se lleva a
cabo la reacción con agitación suave. Se ajusta entonces el pH a pH
5,5 con ácido cítrico, y se cristaliza la insulina en presencia de
ZnCl_{2}. Los cristales se separan, se disuelven y, después de
purificación por RP-HPLC, la insulina se purifica
de nuevo por cristalización.
Al final del periodo de expresión, el medio de
cultivo se ajusta a pH 6,8 y se añade después tripsina con
agitación de forma que se establece una concentración final de
4-8 mg por litro. Después de incubación durante
aproximadamente 4 horas, el caldo de fermentación tratado de este
modo se ajusta a pH 2,5-3. Después de
1-6 horas de precipitación, el pH se eleva a 3,5, y
la di-Arg-insulina formada se
purifica por cromatografía de cambio catiónico en presencia de 30%
de 2-propanol. Se realiza la elución por medio de un
gradiente de NaCl de 0,05-0,5 M de sal. Las
fracciones que contienen producto se diluyen 1:1 con H_{2}O y
después se añade ZnCl_{2}, de modo que se forma una solución de
ZnCl_{2} al 0,1%. La
di-Arg-insulina precipita a pH 6,8
y a modo de ejemplo se convierte en insulina según el ejemplo 8.
Usando la técnica descrita en la solicitud de
patente PCT/EP00/08537 se pudieron detectar otras secuencias
señales que llevan a la secreción de la proteína de fusión
hirudina-proinsulina:
Secuencia señal smompa derivada del gen
ompA de la principal proteína de la membrana exterior de Serratia
marcenscens (GenEMBL data base locus: SMOMPA, 1364 bp, DNA BCT
30-MAR-1995).
Secuencia señal ecoompc derivada del gen
ompC de E. coli que codifica la principal proteína de la
membrana exterior (GenEMBL data base locus: SMOMPA, 1364 bp, DNA
BCT 30-MAR-1995).
Secuencia señal af009352 derivada del
osmoprotector de Bacillus subtilis que se une al precursor de
la proteína (opuCC) (GenEMBL data base locus: AF009352, 4500 bp,
DNA BCT 23-JUL-1997).
Secuencia señal aeoxyna derivada del gen
xynA de Aeromonas caviae del precursor de xilanasa I (GenEMBL
data base locus: AEOXYNA, 1139 bp, DNA BCT
07-FEB-1999).
Secuencia señal stomps1 derivada del gen
de S. typhi de la proteína S1 de la membrana exterior
(GenEMBL data base locus: STOMPS1, 1938 bp, DNA BCT
24-AUG-1995).
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de fusión para la secreción
de una proteína de interés en sobrenadantes bacterianos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DEAV2001/0009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 10108212.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-02-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pBpfu_hir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Ser Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pfuf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gtttggcac ttacgtatac tgactgca
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: insu11hind111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttaagct tcatgtttga cagcttatca t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Hir_insf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccctgagg aataccttca gggaaattcg gcacgatttg tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Hir_insrev1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaaatcgt gccgaattcc cctgaaggta ttcctcaggg at
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: styfimf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fosfatasa alcalina (secuencia señal)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu
Pro Leu Leu Phe Thr}
\sac{Pro Val Thr Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fosfatasa alcalina (secuencia señal)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de clonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: phoaf1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctgccgc tgctgttcac cccggttacc aaagcggcta cgtatactga ctgcactg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: phoaf2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctg
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Hir_insf2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccctgagg aataccttca gcgatttgtg aaccagcacc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Hir_insrev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgctggtt cacaaatcgc tgaaggtatt cctcagggat
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Un DNA que codifica una proteína de fusión de
la forma:
-F-As_{m}-R_{n}-Y-,
en
donde
- F
- es una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que permite la secreción de una proteína Y en un medio de fermentación, en donde
- F
- codifica una hirudina,
- As
- es un enlace químico o una secuencia de DNA que codifica un aminoácido codificable por el código genético,
- m
- es un número entero de 0 - 10,
- R
- es un enlace químico o un codón de arginina,
- n
- es 0 ó 1, e
- Y
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína de interés la cual, correctamente plegada, es parte de la proteína de fusión en el medio de fermentación, y que es una proinsulina.
2. Un DNA según la reivindicación 1, en el que la
casete de expresión es de la forma
P-S-F-As_{m}-R_{n}-Y-T,
en
donde
- P
- es un promotor,
- S
- es una secuencia de DNA que codifica una secuencia señal que permite rendimientos óptimos,
- T
- es una secuencia de DNA sin traducir que mejora la expresión.
3. Un DNA según la reivindicación 2, en el que S
es el gen oprF de Pseudomonas fluorescens, el DNA que
codifica la secuencia señal de la proteína de la membrana exterior
de S. typhimurium (fimD), la secuencia de DNA que codifica
la secuencia señal de la proteína precursora de la fosfatasa
alcalina de E. coli, la secuencia de DNA que codifica la
secuencia señal smompa derivada del gen ompA de la principal
proteína de la membrana exterior de Serratia marcenscens, la
secuencia de DNA que codifica la secuencia señal ecoompc derivada
del gen ompC de E. coli que codifica la principal proteína
de la membrana exterior, la secuencia de DNA que codifica la
secuencia señal af009352 derivada del osmoprotector de Bacillus
subtilis que se une al precursor de la proteína (opuCC), la
secuencia de DNA que codifica la secuencia señal aeoxyna derivada
del gen xynA de Aeromonas caviae para el precursor de
xilanasa I, o la secuencia de DNA que codifica la secuencia señal
stomps1 derivada del gen de S. typhi de la proteína S1 de la
membrana exterior.
4. Un DNA según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3, en el que la secuencia F de DNA codifica
lepirudina o una hirudina que porta serina o alanina en lugar de
leucina en la posición 1 de la secuencia de aminoáci-
dos.
dos.
5. Una proteína de fusión codificada por un DNA
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un plásmido que comprende un DNA según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Una célula hospedante que comprende un
plásmido según la reivindicación 6.
8. Una célula hospedante que comprende un DNA
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Una célula hospedante según las
reivindicaciones 7 u 8, en donde la célula se selecciona del grupo
que comprende E. coli, B. subtilis y
Streptomyces.
10. Una célula hospedante según la reivindicación
9, en donde el plásmido según la reivindicación 6 o el DNA según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 está integrado en el genoma
de la célula hospedante.
11. Un procedimiento para la producción
fermentativa de una proteína de fusión, en cuyo procedimiento
- (a)
- una molécula de DNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 se expresa en una célula hospedante según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9; y
- (b)
- se aísla la proteína de fusión expresada.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que se separa el sobrenadante de la célula hospedante para
aislar la proteína expresada, y la proteína expresada se aísla del
sobrenadante.
13. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, en el que una etapa de procedimiento para
concentrar la proteína expresada en el sobrenadante después de la
precipitación se selecciona de un grupo que comprende
microfiltración, cromatografía de interacción hidrófoba y
cromatografía de intercambio iónico.
14. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que el aislamiento de la proteína
expresada incluye una etapa en la que se precipitan los componentes
del medio de cultivo o el sobrenadante, mientras que la proteína
expresada permanece en solución.
15. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que después de la fermentación, se
añaden al sobrenadante de la fermentación mercaptano o hidrocloruro
de cisteína a pH 6-9, dando como resultado una
concentración de 0,05 a 2,5 mM del grupo SH libre.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en cuyo procedimiento, después de separar
el sobrenadante de la fermentación de las células hospedantes, las
células hospedantes se cultivan repetidamente en medio fresco, y la
proteína de fusión liberada se aísla de cada sobrenadante obtenido
durante el cultivo.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en el que se añaden mercaptano o
hidrocloruro de cisteína al sobrenadante del cultivo celular a pH
6-9, de tal modo que se alcanza una concentración de
0,05 a 2,5 mM de los grupos libres SH.
18. Un procedimiento para la preparación de
insulina, en cuyo procedimiento
- (a)
- a partir de la proteína de fusión expresada que se obtiene en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17,
- (b)
- se libera insulina por escisión enzimática o química y
- (c)
- se aísla.
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